NO303226B1 - Monoklonalt antistoff mot Onkostatin M, samt DNA-molekyl, cellelinje og hybridom - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff mot Onkostatin M, eller fragment derav, for anvendelse i et in vitro system.

Oppfinnelsen vedrører også et DNA-molekyl, en cellelinje og en hybridomcellelinje.

Det monoklonale antistoff er kjennetegnet ved at det er 0M2, 0M3 eller 0M1 produsert av hybridomcellelinje med deponeringsnummer henholdsvis ATCC HB 10398, ATCC HB 10396 og ATCC HB 103 97.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedat de kan binde seg til Onkostatin M og inhibere Onkostatin M reseptorbinding og/eller inhibere Onkostatin M bioaktivitet.

De monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å detektere nærvær av Onkostatin M og/eller modulere den biologiske aktiviteten til Onkostatin M i et in vitro system.

Det er nå velkjent at somatiske cellehybrider er en viktig kilde for spesifikke cellulære produkter som ikke kan frembringes fra korttids primærkulturer. Det beste eksempel på dette er det system som er utviklet av Milstein m.fl. for å frembringe hybridmyelomer som danner et monoklonalt antistoff mot et gitt antigen (Kohler and Milstein, 1985, "Nature" (London), Vol. 256, p. 495, Galfre et al.,1977, "Nature" (London), Vol. 266, p. 550). Slike hybrider gir en konstant tilførsel av monoklonale antistoffer mot spesifikke antigener. Disse antistoffer kan anvendes som reagenser ved alle de metoder hvor det tidligere er anvendt antistoffer, men man oppnår som gunstig tilleggsvirkning høyere diskrimineringsnivåer, lavere bakgrunn, og en kontinuerlig tilgjengelig tilførsel av antistoffene.

Fremstilling av monoklonale antistoffer innbefatter generelt først immunisering, fjerning av immune responsceller, fusjon av disse cellene i for eksempel polyetylenglykol, med kontinuerlig delende tumorceller ("immortal") som er selektert for deres manglende evne til å utskille immunglobulin. De resulterende celler (hybridomer) skiller seg ut ved vekst i for eksempel HAT-medium (hypoksantin, aminoterin, tymidin). Hver hybridom er fusjonsproduktet av en enkelt antistoffdan-nende celle og en tumorcelle. Hybridomer har evnen til den førstnevnte idet de utskiller et enkelt spesies av antistoff, og immortabiliteten til den sistnevnte, slik at den formerer seg kontinuerlig og frembringer således en celledannelse som produserer en kontinuerlig tilførsel av antistoff med en enkelt spesifisitet.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse fremstilles og anvendes monoklonale antistoffer som er spesifikke for Onkostatin M, et nytt cytokin som oppviser pleiotropiske virkninger på et stort antall normale og transformerte celler. Et-hvert monoklonalt antistoff som har egenskapene til de heri beksrevne monoklonale antistoffer er innenfor rammen for den foreliggende oppfinnelse. For eksempel faller et monoklonalt eller kimært antistoff som kompetitivt inhiberer den immuno-spesifikke binding av de heri beskrevne antistoffer til deres onkostatin M epitoper og/eller som modulerer onkostatin M's biologiske aktivitet, innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse .

Oppfinnelsen skal beskrives ved hjelp av eksempler hvor hybridomteknologi anvendes til å danne anti-Onkostatin M antistoffene ifølge oppfinnelsen, men oppfinnelsens ramme skal ikke være begrenset til anvendelse av slike cellehybridiser-ingsteknikker. De eksemplifiserte antistoffer grupperes etter-som de danner immunpresipitater med enten nativt opprinnelig Onkostatin M, denaturert Onkostatin M, eller begge. Hver gruppe er viderekarakterisert veddens evne til å blokkere Onkostatin M formidlet vekstinhibering og/eller binding av Onkostatin M til dens celleoverflatereseptorer. Slike antistoffer anvendes til å kartlegge epitoper og funksjonelle

seter på nye onkostatin M proteiner.

De følgende betegnelser som anvendes har disse betydnin-ger : DDEIA dobbeltdeterminant enzymkoplet immunologisk test.

GIA vekstinnhiberingstest

HRP hesteperoksidase.

mikro-EIA mikroenzymkoplet immunotest MAb monoklonalt antistoff

OM Onkostatin M

RRA radioreseptortest

0M1 1R10F11 monoklonalt antistoff 0M2 11R2F8 monoklonalt antistoff 0M3 12R13D7 monoklonalt antistoff 0M4 4R12C7 monoklonalt antistoff 0M5 3R9D9 monoklonalt antistoff 0M6 3R13F4 monoklonalt antistoff 0M7 12R13B5 monoklonalt antistoff 0M8 12R19E3 monoklonalt antistoff

Fig. 1 viser immunopresipiteringen av<35>S-metionin og<35->cystein merket Onkostatin M fra supernatanter fra CHO-cellelinjen stabilt transfektert med cDNA som koder for Onkostatin M. Fig. IA viser reaktiviteten til en rekke anti-Onkostatin M monoklonale antistoffer med "nativt" metabolsk merket Onkostatin M (supernatant oppsamlet fra metabolisk merkede CHO-transfektanter). Fig. IB viser reaktiviteten til disse samme antistoffer med supernatant, oppsamlet fra metabolsk merkede CHO-celler som var denaturert med SDS, 2-merkaptoetanol, og kokt før inkuberingen med de monoklonale antistoffer. Bånd 1: negativ kontroll, bånd 2: 0M1, bånd 3: 0M5, bånd 4: 0M6, bånd 5: 0M4, bånd 6: 0M2, bånd 7: 0M7, bånd 8: 0M3, bånd 9 0M8. Fig. 2 viser data fra undersøkelsen av nøytralisasjons-aktiviteten til to ulike anti-Onkostatin M monoklonale antistoffer i en GIA-test på A375-melanomacellelinjen. Fig. 2A viser aktiviteten for ulike konsentrasjoner av 0M2, og fig. 2B viser aktiviteten for ulike konsentrasjoner av 0M1. Fig. 3 viser virkningene av ulike anti-Onkostatin-mono klonale antistoffer på bindingen av<125>I-Onkostatin M til H2981 lungekarsimonacellelinjen under radioreseptortesten. Fig. 4 viser bindingen, som detektert ved EIA, av to ulike anti-Onkostatin M monoklonale antistoffer til supernat anter utskilt av COS-celler transfektert med en rekke mutante Onkostatin M konstrukter inneholdende aminosyredelesjoner eller -alterasjoner. Data er presentert som totale absorpsjonsenheter ved OD460. Bakgrunnsbindingen er ikke subtrahert. I denne figur indikerer "del" den siste aminosyre som fjernes fra C-terminalen mens alfabetiske bokstaver indikerer den frembrakte aminosyreendring. Fig. 5 viser en sammenlikning av ulike anti-Onkostatin M monoklonale antistoffers evne til å immunopresipitere Onkostatin M utskilt av enten den parentale konstrukt "SPOM" eller delesjonsmutanten A44-47. Fig. 6 viser kartleggingen av epitopene detektert med to ulike anti-Onkostatin M monoklonale antistoffer, 0M3 og OM4. Den relative binding, gitt i absorpsjonsenheter, for 0M3 og 0M4 er sammenliknet med enheten for et negativt kontrollanti-stoff på OM fra serumfritt kondisjonert medium fra COS-celler transfektert med plasmidene A188-227, A188-227/L 1088, og GAG 104. Bindingsnivåene er sammenliknet med nivåene for OM utskilt fra COS-celler ("SPOM") (Linsley, et al., 1990, "Mol. Cell. Biol." Vol. 10, p. 1882-1890.) Figur 7 viser et skjematisk diagram av mutasjonene til Onkostatin M som påvirker bindingen av en rekke monoklonale antistoffer rettet mot Onkostatin M. Ledersekvensen til OM er lokalisert fra restene -25 til -1. Det ubehandlete molekyl utskilt fra COS-celler har en lengde på 227 aminosyrer, og spaltes til et modent 196 aminosyreprotein. (Lindsay, et al, 1990, "Mol. Cell. Biol." Vol. 10, p. 1882-1890). Delesjonen av C-terminale aminosyrer internt til og omfattende 184 (A) ødelegger bindingen til både OM1 og 0M2. Dessuten hindres 0M2-bindingen ved fraskillingen av restene 22-36 eller 44-47. Epitopen til antistoffet 0M3 kartlegges til en posisjon inneholdende resten 108 (pilen), idet en endring fra leucin til serin i denne rest ødelegger bindingen til mAB. Innsettelsen av tripeptidet glycin-alanin-glycin i resten 104 (V) opphever OM4-bindingen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonale antistoffer som er spesifikke for Onkostain M, et nytt cytokin som oppviser pleiotropiske virkninger på et stort antall normale og transformerte celler. Det beskrives også monoklonale antistoffer som bindes til Onkostatin M, inhiberer Onkostatin M reseptorbinding og/eller inhiberer bioaktiviteten til Onkostatin M.

De beskrevne monoklonale antistoffer kan anvendes til å kartlegge epitoper til Onkostatin M og til å definere struktur/funksjonsforholdet i dets domener. Slike antistoffer kan for eksempel anvendes i diagnostiske forsøk for å detektere nærværet av Onkostatin M eller mutante former av Onkostatin M. Oppfinnelsen skal beskrives i detalj i det etterfølgende.

Egenskaper til monoklonale antistoffer definert ved deres spesifisitet overfor Onkostatin M.

Det beskrives monoklonale antistoffer som definerer ulike epitoper av native og/eller denaturerte former av Onkostatin M. De monoklonale antistoffer klassifiseres videre ved deres evne til å blokkere Onkostatin M's biologiske aktivitet og/eller bindingen til celleoverflatereseptorer. Alle monoklonale antistoffer, omfattende primære antistoffer, som kompetitivt inhiberer den imunospesifikke binding av de beskrevne monoklonale antistoffer til deres Onkostatin M epitoper, er innenfor oppfinnelsens ramme.

Kjennetegn ved Onkostatin M antigen.

Onkostatin M som opprinnelig er identifisert for sine inhiberende virkninger på humane tumorcellelinjer, ble først isolert fra forbol 12-myristat 13-acetat ("PMA")-induserte humane histiosytiske lymfone celler, Zarling et al., 1986, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 83, p. 9739-9743 og fra aktiverte T-lymfosytter Brown et al., 1987, "J. Immunol", Vol. 139, p. 2977-2983. Molekylet er et varme- og syrestabilt protein som omfattes av en enkelt polypeptidkjede med Mr = 28.000. Som andre naturlig forekommende vekstregulatorer, oppviser Onkostatin M et stort antall biologiske aktiviteter. Således observeres vekstinhibering med enkelte, men ikke alle, humane tumorcellelinjer. I motsetning til dette stimuleres veksten av enkelte normale fibroblaster, såsom humane forhud-fibroblaster eller WI-38-celler, ved eksponering overfor Onkostatin M (Zarling et al., 1986, "Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA)", Vol. 83, p. 9739-9743). Genet for Onkostatin M har blitt klonet og sekvensert, og en aktiv form av rekombinant Onkostatin M er nylig blitt uttrykt i pattedyrceller. (Se US-patentsøknad 144.574, av 15. januar 1988 som tilsvarer EP-patentsøknad 0.2 90.948, publisert 17. november 1988, og som det heretter skal refereres til i sin helhet). Den prosesserte form er etter avspalting av signalpeptidet et glykoprotein som inneholder 227 aminosyrer hvorav 5 av disse omfatter cystein-residuer. Proteinet har et ekstremt hydrofilt karboksy-termi-nalområde. Selv om Onkostatin M strukturelt ikke er relatert til andre kjente cytokiner, inneholder dets mRNA et AU-rikt område ved dets 3' utranslaterte ende. Dette område i Onkostatin M mRNA er homologt med det tilsvarende for mange cytokiner, lymfokiner og andre vekstregulerende molekyler, noe som tyder på et felles regulerende gen-ekspressjon. En cellu-lær reseptor for Onkostatin M er funnet på et stort antall pattedyrceller. Hovedreseptormolekylet for Onkostatin M er et spesifikt protein med Mr = 150.000 - 160.000 (Linsley et al., 1989, "J. Biol. Chem.", Vol. 264, p. 4282-4289)'.

Onkostatin M kan frembringes ved velkjente teknikker fra et stort antall cellekilder som syntetiserer bioaktivt Onkostatin M, omfattende f.eks. celler som naturlig produserer Onkostatin M og celler som er tranfektert med rekombinante DNA-molekyler som kan styre syntesen av og/eller sekresjonen av Onkostatin M. Alternativt kan Onkostatin M syntetiseres ved kjemiske syntesernetoder som omfatter, men ikke er begrenset til, peptidsyntese i fast fase. Fremgangsmåter til fremstilling av Onkostatin M er beskrevet i ovennevnte US-patentsøknad-144.574, av 15. januar 1988 som tilsvarer den publiserte EP-patentsøknad 0.290.948, publisert 17. november 1988.

Monoklonale antistoffer med en affinitet overfor Onkostatin M kan utvelges ved å teste deres evne til å binde Onkostatin M idet det anvendes et av et stort antall immuno logiske tester, omfattende, men ikke begrenset til, testen som benevnes enzymbundet-immunosorbantprøve (ELISA) , immunopresipitering, "Western-blot"-analyser, radioimmunometriske prøver, samt kompetitive og ikke-kompititive immunotester. F.eks. kan mikroenzymtesten (mikroEIA) i fast fase som beskrevet nedenfor, lettvint anvendes. Kort beskrevet blir antistoffer som finnes i supernantanten til hybridene testet for deres evne til å binde til Onkostatin M som er belagt på en fast overflate i brønner. Etter tilsats av supernantant tilsettes peroksidase-konjugert F(ab')2geit anti-mus lg til prøveglasset. Etter at ubundet materialer er vasket bort frigjøres det bundne enzym ved tilsats av et substrat som gjennomgår en fargeforandring. Fargeforandringen indikerer indirekte dannelse av et kompleks av monoklonalt antistoff og Onkostatin M i prøveglasset.

Inhibering av aktiviteten til Onkostatin M.

Antistoffer som inhiberer den biologiske aktivitet til Onkostatin M kan identifiseres ved å anvende en metode som benevnes vekstinhiberingsforsøk ("GIA"). Kort beskrevet innebærer GIA et forsøkssystem for å teste et antistoffs evne til å nøytralisere de inhiberende virkninger til Onkostatin M på målcellenes vekst og proliferasjon.

Inhibering av binding til Onkostatin M- reseptor.

Reseptorer på celleoverflater har generelt en høy affinitet overfor deres ligander. Bindingen av liganden til den spesifikke celleoverflatereseptor initierer kontrollen/styrin-gen av ulike cellulære hendelser. Binding av Onkostatin M til en membranreseptor er blitt demonstrert under anvendelse av radioreseptortesten som beskrives nedenfor samt i ovennevnte US-patentsøknad 144.574. De humane tumorceller som ble testet omfattet A375 (melanoma), A875 (melanoma), Mell09 (melanoma), T24 (blærekarcinoma), A549 (lungeadenokarcinoma), H1477 (melanoma), Mel80 (melanoma), og MCF (bryst). Bindingen av<125>I-Onkostatin M var spesifikk og mettet, og ble ikke inhibert av andre kjente polypeptidvekstregulatorer. Scatchard-analyser av de frembrakte bindingsdata med ulike cellelinjer avdekket at<125>I-Onkostatin M var bundet til l-2xl0<4>bindingspunkter per celle med en K^, på tilnærmet IO"<9>M. De monoklonale antistoffer som var fremstilt med hybridcellelinjene ble under anvendelse av den nedenfor beskrevne radioreseptortest, testet for deres evne til å blokkere bindingen av onkostatin M til sin celleoverflatereseptor.

Fremgangsmåter til fremstilling av monoklonale antistoffer mot onkostatin M.

Onkostatin M antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å anvende et av et stort antall teknikker hvor Onkostatin M anvendes som et immunogen som injiseres i en pattedyrvert, f.eks. mus, ku, geit, sau, kanin, osv, særlig med en adjuvans, f.eks. en komplett Freunds-adjuvans, alumini-umhydroksidgel eller lignende. Verten kan deretter blodtappes og blodet anvendes for isolering av polyklonale antistoffer. Alternativt kan de perifere blodlymfocytter, miltlymfocytter (B-celler), eller lymfekjertel-lymfocytter, anvendes for fusjon med en egnet myelomacelle for å immortalisere kromoso-mene for monoklonal ekspresjon av antistoffer som er spesifikke for Onkostatin M.

Selv om oppfinnelsen er beskrevet ved hjelp av eksempler hvor det anvendes monoklonale antistoffer fra mus, skal oppfinnelsen ikke være begrenset til dette, og skal således omfatte anvendelse av f.eks. humane antistoffer. Slike antistoffer kan frembringes ved å anvende humane hybridomer (Cote et al., 1983, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 80, p. 2026-2030) eller ved å transformere humane B-celler med EBV (Epstein Barr Virus) in vitro (Cole et al., 1985, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, sider 77-96). Det kan også anvendes nylig utviklede teknikker for fremstilling av kimære antistoffer (Morrison et al., 1984, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 81, p. 6851-6855, Neuberger et al., 1984, "Nature", Vol. 312, p. 604-608, Takeda et al., 1985, "Nature", Vol. 314, p. 452-454). Disse sistnevnte teknikker involverer at gener fra et mus-antistoffmolekyl med egnet antigenspesifisitet, spleises med gener fra et humant antistoffmolekyl med et egnet biologisk aktivitet.

En nylig beskrevet teknikk kan anvendes til å generere et repertoar av monoklonale antistoffer som definerer Onkostatin M (se Sastry, et al., 1989, "Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA)", Vol. 86, p. 5728-5732, og Huse et al., 1989, "Science" Vol. 246, p. 1275-1281). Følgelig kan en cDNA-samling av Fab-fragmenter avledet fra milt-DNA til dyr som er preparert med Onkostatin M generes i en bakterievertscelle.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan modifiseres ved behandling med egnete proteaser, f.eks. pep-sin, papain og lignende for å generere Fab-, F(ab')2"eller Fv-fragmenter som immunospesifikt binder til Onkostatin M.

Dessuten kan hele antistoffmolekylet eller dets Fab-, F(ab')2~eller Fv-fragmentet konjugeres med hvilket som helst av et antall forbindelser som omfatter, uten at disse skal begrenses til, signalgenererende forbindelser såsom et fluorescerende stoff, en radiomarkør, en kromofor, et enzym, et kjemolumiserende- eller bioluminiserende molekyl, etc. Alternativt kan hele antistoffet eller dets Fab-, F(ab')2_ eller Fv-fragment konjugeres til en vekstfaktor som kan forsterke eller inhibere den biologiske aktivitet til Onkostatin M; eller til toksiner slik at celler som oppviser Onkostatin M forløpere (eng: precursor) på deres overflate, drepes selektivt. Fremgangsmåter som kan anvendes for konjugering av markører, proteiner, toksiner osv til antistoffer og antistoff-fragmen-ter, er velkjente innen teknikken. Se f.eks. US-patentskrifter 4.220-450. 4.235.869, 3.935.074 og 3.996.345.

En fremgangsmåte for fremstilling av det monoklonale antistoff, eller fragment derav, omfatter

a) at det dyrkes en cellelinje som kan produsere et antistoff mot Onkostatin M, eller fragment derav, hvoretter

det fremstilte produkt utvinnes, eller

b) at det fremstilles et fragment fra et intakt anti-Onkostatin M antistoff, og ved behov, c) at antistoffet eller antistoff-fragmentet fremstilt i a) eller b) konjugeres til en markør, en vekstfaktor eller

et toksin.

Anvendelse av monoklonale antistoffer mot Onkostatin M.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fortrinnsvis anvendes til å detektere native eller denaturerte former av naturlig eller rekombinant Onkostatin M eller til å detektere nærværet av Onkostatin M i serumprøver hvor disse kan forekomme i fri form eller tilknyttet sitt bindingsprotein. For detektering av Onkostatin M i en prøve, såsom celler eller fysiologiske fluider, f.eks. blod, kan det enten anvendes polyklonale eller monoklonale antistoffer. Detektering av Onkostatin M i et kroppsfluid kan også anvendes som en indikasjon på at det er tumorceller til stede. I denne sammenheng kan anti-Onkostatin M antistoffer være anvendelige under diagnosering og/eller under prognosefrembringelse ved kreft og/eller andre cellevekstrelaterte sykdommer. Antistoffene kan også anvendes ved affinitetskromotografi for å isolere og rense Onkostatin M fra naturlige eller syntetiske kilder. Antistoffene kan også finne anvendelse ved kontroll av mengden Onkostatin M i forbindelse med celler i kultur, idet celleveksten kan modifiseres ved dannelse av spesifikt antistoff/Onkostatin M-kompleks som resulterer i kompetitiv inhibering av Onkostatin M/Onkostatin M-reseptorbinding.

Dannelse av anti- idiotyper som etterligner virkningene til Onkostatin M.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til å generere anti-idiotypiske antistoffer som etterligner de biologiske virkninger til Onkostatin M. Anti-idiotype antistoffer eller anti-idiotyper er antistoffer rettet mot det antigene bindingsområde eller variable område (betegnet idiotyp) til et annet antistoffmolekyl. I teorien, basert på Jernes nettverkmodell av idiotype relasjoner (Jerne, N.K. et al., 1974, "Ann. Immunol." (Paris), Vol. 125, p. 373, Jerne, N.K. et al., 1982, "EMBO", p. 234), vil immunisering med et antistoffmolekyl som uttrykker en paratop (antigen-bindingspunkt) for et gitt antigen produsere en gruppe anti-idotype antistoffer hvorav noen deler med antigenet en komple-mentær struktur til paratopen. Immunisering med monoklonale antistoffer som inhiberer binding av Onkostatin M til dets reseptor skal deretter produsere anti-idiotyper som etterligner Onkostatin M og bindes til Onkostatin M-reseptoren. Således er det innenfor oppfinnelsens ramme at disse anti-idiotyper kan produseres av de monoklonale antistoffer rettet mot Onkostatin M og som vil etterligne virkningene til Onkostatin M. Tilsvarende skal anti-idiotypeantistoffer som bindes til Onkostatin M omfattes av definisjonen på monoklonale antistoffer som definerer Onkostatin M slik det her er anvendt.

Kartlegging av Onkostatin M- epitoper.

Strukturelle analyser av vekstregulatoren Onkostatin M, er vesentlig for innledningvis å bestemme den biologiske rolle som dette nye cytokin spiller under homoestase- eller patol-ogitilstander. I de eksempler som skal beskrives nedenfor er en rekke monoklonale antistoffer (0M1 til 0M8) som er fremstilt mot rekombinant Onkostatin M, blitt analysert for å bestemme deres strukturelle bindingskrav og epitope lokalisering. Disse antistoffer detekterer enten lineære (0M3 og 0M4) eller foldete epitoper (0M1 og 0M2). De lineære epitoper som detekteres med 0M3 og 0M4 er plassert nær hverandre. 0M3 hvis epitop omfatter residuet 108 reagerer både med foldet og denaturert Onkostatin M, mens Mab 0M4 hvis epitop splittes ved innsettelse av et tripeptid ved aminosyreresten 104, binder kun denaturert Onkostatin M.

Det monoklonale antistoff OM2 motvirket de funksjonelle virkninger av Onkostatin M under et vekstinhiberingsforsøk. De data som presenteres nedenfor indikerer at antistoffet OM2 motvirker effekten til OM ved at det hindrer OM i å binde seg til sin reseptor. Ved serologiske analyser er det bestemt at enkelte innførings-, delesjons- eller substitusjonsmutasjoner av aminosyrer påvirker bindingen til det nøytraliserende anti stoff. Resultatene av disse eksperimenter samsvarer godt med de som er oppnådd under analyser av GIA- og RRA-aktiviteten til disse mutante molekyler, og antyder at bindingssetet for det nøytraliserende antistoff ligger innenfor den tertiære struktur til OM-molekylet som krever en tilfredstillende folding for å gi biologisk aktivitet.

Sammenbruddet i både reseptor- og 0M2-binding i mutanter som har delesjon eller endringer i ikke-tilstøtende (C-terminal, A22-36, A44-47) aminosyrerester, styrker interpreteringen av at det funksjonelt viktige område (eller områdene) av Onkostatin M er sterkt avhengig av en tilfredstillende tertiær struktur. Disse data antyder dessuten at områder både i den N-terminale og C-terminale del av det prosesserte molekyl er vesentlig for den funksjonelle virkningen til Onkostatin M, enten direkte ved å danne reseptorbindingssetet eller inn-direkte ved å stabilisere den tertiære struktur som er nødven-dig for å frembringe aktivitet.

Tilsvarende observasjoner er gjort for interleukin-6, som deler enkelte funksjonelle egenskaper med Onkostatin M, omfattende in vitro vekstinhibering av enkelte tumorcelle-linj er og indusering av plasminogen aktivatorinhibitor (Brown, et al., 1990, i "Molecular Biology of the Cardiovascular System", Elsevier, Amsterdam, sider 195-206). Konkomitant delesjon av både de N-terminale aminosyrer etter resten 31 og de første fem karboksyterminale aminosyrer for 11-6 reduserer markert aktiviteten mens delesjon av de 16 C-terminale rester fullstendig opphever den funksjonelle aktivitet. En rekke nøytraliserende antistoffer til 11-6 synes å gjenkjenne epitoper dannet amino og karboksyterminale aminosyrer, og en o;-spiralstruktur er likedan foreslått for de 7 C-terminale aminosyrer for 11-6 (Brakenhoff, et al., 1990, "J. Immunol.", Vol. 145, p. 561-568). I motsetning til resultatene presentert for Onkostatin M, synes ikke intramolekylære disulfidbindinger å være vesentlige for den funksjonelle aktivitet til 11-6 (Jambou, et al., 1988, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 85, p. 9462-9430). Til a-interferon har blitt produsert nøy-traliserende monoklonale antistoffer (Cebrian, et al., 1987, "J. Immunol.", Vo. 138, p. 484-490) samt til /3-interferon (Redlich & Grossberg, 1989, "J. Immunol.", Vol 143. p. 1887-1893), og som for Onkostatin M, er disulfidkopling nødvendig for funksjonaliteten. Epitopkart over mutante interferonmole-kyler er hittil ikke publisert. Samling av struktur-funksjons-analyser for disse og andre cytokiner bør være en hjelp til å skissere hvordan tilsvarende tertiære strukturelle og funksjonelle trekk for disse molekylær kan tilpasses av forskjellige primære strukturer. En skjematisk modell over de funksjonelt viktige regioner av Onkostatin M molekylet bestemt sålangt med OM2, og over kartlegging av OM3- og 0M4-epitoper, er vist på fig. 7.

Data for de interne delesjonsmutanter avdekker at selv om det nøytraliserende antistoffbindingssete går tapt, blir epitopet som er detektert med det ikke nøytraliserende antistoff OM1, værende intakt. Tilsvarende resultater er oppnådd med alaninscannende mutagenese av det humane veksthormon hvori et stort antall mutasjoner kan påvirke reseptorbindingen uten å påvirke bindingen av disse monoklonale antistoffer rettet mot epitoper andre enn reseptorbindingsregionen (Cunningham & Wells, 1989, "Science", Vol. 244, p. 1081-1085). Disse data indikerer at lokal ødeleggelse av reseptorbindingssetet kan forekomme uten at det medfører omfattende ødeleggelse av den tertiære struktur av Onkostatin M. Kartlegging av OMl-epitop har så langt ikke vært mulig med anvendelse av mutanter som er generert. OMl-epitopene kan avhenge av den tertiære struktur stabilisert ved folding av C-terminalen.

Det er her og andre steder blitt beskrevet flere komple-mentere muligheter for å granske struktur-funksjonsrelasjonene for Onkostatin M. Som følge av at antistoffet OM2 synes å utøve sin nøytraliserende virkning ved å blokkere Onkostatin M-bindingen til sin reseptor, er det potensielt mulig å generere et anti-idiotypt antistoff rettet mot det interne bilde av det nøytraliserende antistoff som kan gjenkjenne Onkostatin M-reseptoren. Denne mulighet er utført med hell under dannelse av antistoffer rettet mot et stort antall ulike reseptorer, såsom insulinreseptoren (Sege & Peterson, 1978, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 75, p. 2443-2444) og den /3-adrenergiske reseptor (Schreober, et al., 1980, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 77, p. 7385-7389, Homey, et al., 1982, "J. Clin. Invest", Vol. 69, p. 1147-1154), blant andre (Gaulton & Green, 1986, "Ann. Rev. Immunol.", Vol. 4, p. 253-280, Vaux, et al., 1990, "Nature", Vol. 345, p. 495-502).

Lokalisering av epitoper detektert av de monoklonale antistoffer som her er beskrevet frembringer et vesentlig verktøy hvormed den biologiske funksjon og vevsfordelingen av Onkostatin M kan granskes.

De etterfølgende ikke begrensende eksempler og fremgangsmåter skal ytterligere illustrere oppfinnelsen.

FREMSTILLING AV MONOKLONALE ANTISTOFFER TIL ONKOSTATIN M.

MATERIALER OG METODER.

A. Immunisering og fusjon.

Det ble fremstilt hybridomer ved immunisering av fire Balb/c mus, med enten 5 fig eller 10 fig rekombinant Onkostatin M som uttrykt ved COH-celler transfektert med plasmidet pBOM Linsley, et al., 1989, "J. Biol. Chem.", Vol. 264, p. 4282-4289) og renset som beskrevet (Zarling, et al., 1986, "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", Vol. 83, p. 9739-9743). De transfekterte COH-celler utsondrer Onkostatin M som et modent/ prosessert molekyl med 196 aminosyrer som er prosessert fra et utgangsmolekyl med 227 rester (Linsley, et al., 1990, "Mol. Cell. Biol.", Vol. 10, p. 1882-1890).

Kortfattet ble Onkostatin M resuspendert i PBS emulgert i en lik volummengde fullstendig Freunds adjuvans, og 25 mg av emulsjonen ble injisert intradermalt i den ene bakre fotpute. To uker senere ble den samme immuniseringsprotokoll gjennomført i den samme bakre fotpute idet konsentrasjonene av Onkostatin M var de samme som under den første immunisering. To uker etter den andre immunisering ble musene injisert i den samme bakre fotpute med den tredje preparasjon av Onkostatin M, men denne gang emulgert i ufullstendig Freunds adjuvans. Tre dager etter denne siste immunisering ble lymfekjertelen i knehasen fjernet og lymfekjertelcellene ble fusjonert med murine myeloma 653/AG8-celler med et l:l-forhold mellom lymfe-kjertelceller og murinlomaceller under anvendelse av 40% polyetylenglykol som et fusjoneringsmiddel. Fusjonsprodukter i en konsentrasjon på 5 X 10<4>celler/brønn ble utplatert på plater med 96 brønner inneholdende hypoksantin-ammonoterin-tymodin som seleksjonsmiddel, i mediet benevnt "Iscoves Modification of Dulbecco's Modified Eagle's Medium" ("IDMEM") supplert med 10% bovinserum fra foster, natriumpyruvat, og L-glutamin. Etter en uke ble det opprinnelige medium erstattet med ferskt medium inneholdende seleksjonsmiddel. Hybridene ble kartlagt ved hjelp av mikroenzymbindingsforsøk (mikro EIA) i fast fase som beskrevet nedenfor, når hybridene var makroskopisk synlige.

B . Enzymbundet immunoforsøk.

De følgende mikro-EIA ble anvendt for å karakterisere

spesifisiteten til antistoffene til Onkostatin M fremstilt fra hybriddomene. Hybriddomsupernatantene ble kartlagt for aktivitet under anvendelse av fast fase-EIA tilpasset til anvendelse i mikrotestplater (Robins Scientific, San Fransico). Konsentrasjoner av renset Onkostatin M i området 2-4/ig/ml ble utplatet i volumer på 5/il i hver brønn og fikk lufttørke over natten. Etter en 1 times blokkering med 5% fettfri tørrmelk i PBS og 0,1% natriumazid, ble hybriddomsupernatantene tilsatt i volumer på 1/il, og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Platene ble vasket 6 ganger ved neddykning i PBS peroksidase konjugert F(ab')2geit anti-mus IgG (Pel-Freez, Rogers AK) i PBS + 2% BSA ved en konsentrasjon på 1:1500 ble tilsatt i volumer på 5/il til hver brønn. Etter inkubasjon på 1 time ble platene vasket 6 ganger som beskrevet tidligere, 10/il substrat, 2,2'-azino-bis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.), ble tilsatt og platene ble avlest ved OD = 660 nm etter 2 0 minutter. Positive brønner ble bestemt på basis av signal over bakgrunnen i forhold til signalet til et på forhånd generert kaninantiserum mot Onkostatin M. Positive hybrider ble klonet i myk agar.

En dobbel determinant EIA (DDEIA) ble anvendt for å evaluere evnen til de monoklonale antistoffer hvis epitoper har tertiær struktur, til å bindes til en rekke mutante Onkostatin M-molekyler. Disse mutanter omfattet insettelser, delesjoner eller substitusjoner i aminsyreresten i ulike seter/stillinger i molekylet. En direkte-EIA hvor det anvendes mAB 0M3, ble anvendt for å fastsette konsentrasjonen til de mutante molekyler i supernatantene før deres analyser i DDEIA. For DDEIA ble 100/il protein G (Farmacia) affinitetsrenset monoklonalt antistoff 0M3 ved en konsentrasjon på 10 /tg/ml i 0,05 M karbonatbuffer, pH 9,6, tilsatt til 96-brønns flatbunnete plater, og inkubert over natten ved 4°C. Antistoffet ble fjernet og etter 1 time blokkering med PBS, ble det tilsatt 1%BSA, 0,05% Tween 20, enten renset Onkostatin M ved definerte konsentrasjoner eller seriefortynninger av supernatanter fra COS-celler transfektert med plasmider som koder for mutante former av OM. Platene ble inkubert i 2 timer ved 37°C, vasket fem ganger med PBS, og inkubert på nytt i 1 time ved 37°C med 100/il biotinylert monoklonalt antistoff (OM1 eller OM2) med konsentrasjon 200 ng/ml. Etter 1 times inkubasjon ve 37°C ble platene vasket 5 ganger, 100/il av en 1:10000 fortynning av HRP-konjugert streptavidin (Vektor) ble tilsatt og platene inkubert i 3 0 minutter ved 3 7°C. Etter vasking ble reaksjonen utviklet med 3,3', 5,5' tetrametylbenzidin ("TMB"), stanset med 1 N svovelsyre, og A450ble avlest.

C. Immunopresipitering.

CHO-celler transfektert med DNA som koder for Onkostatin-M cDNA (Linsley, et al., 1989, "J. Biol. Chera.", Vol. 264, p. 4282-4289) ble inkubert i 4-8 timer med 200/iCi hver av<35>S-metionin og<3>SS-cystein i et volum på 4 ml i en petriskål på 60 x 15 cm. Supernatantene ble oppsamlet og filtrert, og 10 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 100 mM tosyl-lysin-klormetylketon (TLCK) ble tilsatt for å inhibere proteaser. For immunopresipiteringer ble 100- 200/il merket supernatant inkubert over natten ved 4°C med rotasjon med 2 00/il brukt supernatant fra de monoklonale antistoff utskillende hybrider. Antigen-antistoffkomplekset ble isolert ved inkubasjon med et monoklonalt rotte anti-muse k. lettkjedet monoklonalt antistoff kovalent bundet til "Reactigel"-legemer (Pierce Chemicals). Etter vasking ble antigen-antistoff-kompleksene oppslemmet ved koking i prøvebuffer inneholdende 1% SDS og 5% 2-merkaptoetanol. Det oppslemmete materiale ble elektroforisert i 15% SDS-PAGE. Gelene ble fluorografert med Amplify™ (Amersham Corp., Arlington Heignts, IL), tørket og autoradiografert med kodak X-AR5 x-røntgen film.

D. Vekstinhiberinqsforsøk.

Antistoffene ble testet for å bestemme om noen av disse kunne nøytralisere inhiberingseffektene til Onkostatin M i en vekstinhiberingstest ("GIA"). GIA anvender A375 melanoma celler (4X10<3>celler/50/il) som indikatorceller. A375 celler ble for-dyrket i fire timer på flatbunnete 96-brønns vevskul-turplater (Costar 3595, Cambridge, MA) i vekstmedium omfattende Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM), supplert med 10% varmeinaktivert serum fra bovint foster, og penicillin/- streptomycin. Onkostatin M ble fortynnet i vekstmedium og testet for vekstinhibiering tredobbelt ved tilsats av 50/il av den fortynnete prøve pr. brønn. Cellene ble deretter inkubert i 72 timer ved 37°C. Ved slutten av denne inkubasjonsperiode ble hver brønn behandlet i 24 timer med 100/il vekstmedium inneholdende [125I] - J-2'-deoksyuridin (0,05/iCi/brønn (Amersham Corp., Arlington Heights, IL)). Monosjiktene ble vasket med fosfatbuffret saltløsning (PBS), fiksert i 95% metanol og luf ttørket. [<12S>I] - jod-deoksyuridin inkorporert av cellene løseliggjøres med 2 00/il 1 N natriumhydroksid, og omfanget av celleveksten ble målt ved mengden [125I] -joddeoksyuridin inkorporert i DNA av aktivt voksende celler. En aktivitetsenhet ble definert som mengden Onkostatin M som var nødvendig for å gi 50% vekstinhibering av A375-celler i forhold til ubehandlete celler.

E . Onkostatin M radioreseptortest.

Antistoffene ble testet i en radiorespetortest for evnen til å inhibere binding av<125>I-merket Onkostatin M til celleoverflatereseptorer for Onkostatin M på den humane karci-monacellelinje H2981. H2981 cellene ble utplatet i 48-brønns plater med en densitet på 2 X IO<5>celler/brønn og holdt ved 37°C i 16 - 24 timer før starten på prøven. Monosjikt av celler ble deretter vasket en gang med "Bindings"-buffer (Linsley, et al., 1986, "Biochemistry", Vol. 25, p. 2978-2986) . For å måle den totale binding ble<125>I-Onkostatin M tilsatt ved konsentrasjoner i området 0,5 - 100 ng/ml. For å måle ikke-spesifikk binding ble umerket Onkostatin M tilsatt samtidig med<125>I-Onkostatin M til gjentatte plater ved en konsentrasjon på 2 0 - 100 ganger høyere enn konsentrasjonen av<125>I-Onkostatin M. Bindingen får fortsette i 2 - 5 timer ved 23°C, hvoretter monosjiktene vaskes fire ganger med bindings-buffer. Cellebundet radioaktivitet løseliggjøres med 1 N NaOH og telles i en gammateller. Den spesifikke binding kalkuleres ved å subtrahere den ikke-spesifikke binding fra totalbindin-gen. Dissosiasjonskonstanten (K^) og bindingskapasiteten ble bestemt ved hjelp av Scatchard-analyser (Scatchard, 1949, "Ann. N.Y. Acad. Sei." Vol. 51, p. 660).

F . Onkostatin M mutanter.

Anti-Onkostatin M monoklonale antistoffer ble testet mot en serie rekombinante Onkostatin M mutanter omfattende inser-sjoner, delesjoner eller substitusjoner generert i DNA-nivået. Antistoffene ble testet som brukte supernatanter i en EIA på medium fra COS-celler som var transfektert transient med ulike parentale og mutante konstrukter.

G. Detektering av Onkostatin M i serum med monoklonale antistoffer.

Nærværet av Onkostatin M i serum ble detektert som følger: humane serumprøver ble først overført til en S-300 stor kolonne for å separere serumproteiner basert på molekylvekt. Fraksjoner oppsamlet fra S-300 kolonnen ble gransket for GIA-aktivitet, både før og etter surgjøringen av serumprøvene. Før surgjøringen oppviser de fleste serumprøver ingen GIA-aktivitet i void-volumfraksjonene. Serumfraksjoner som imid-lertid var surgjort, deretter renøytralisert før tilsats til GIA, oppviste aktivitet i fraksjoner av molekylvekter høyere enn 200 kilodalton, noe som antyder at Onkostatin M i serum generelt assosieres med en bindingsfaktor på høyere enn 200 kd, og er inaktive i denne tilstand. De ulike serumfraksjoner ble gransket ved "Western"-blotting. Reaksjonen til de Onkostatin M-spesifikke monoklonale antistoffer med proteiner funnet i fraksjonene med høy molekylvekt korresponderende med molekylvekten til Onkostatin M bekreftet nærværet av Onkostatin M i disse fraksjoner. Onkonstatin M funnet i serumet er renset og N-terminal aminosyresekvensering antyder at det er identisk med det native og rekombinante Onkostatin M som tidligere er frembrakt.

RESULTATER.

H. Seleksjon av monoklonale antistoffer med spesifisitet for Onkostatin M.

Det ble gjennomført to serier fusjoner omfattende fire fusjoner i hver serie med en lymfekjertel fra hver mus anvendt per fusjon. Fra den første serie ble fire hybrider gransket mere omhyggelig. Fra den andre ble mere vellykkete serier av fusjoner (hva gjelder antall positive hybrider identifisert i mikroEIA), på minst 2 0 andre anti-Onkostatin M monoklonale antistoffer identifisert. Fra dette antall ble de følgende hybrider utvalgt for ytterligere studier basert på relative signaler i EIA og evnen til å immunopresipitere enten native eller denaturerte metabolisk merkete Onkostatin M: 0M2, 0M7, 0M3 og 0M8. Basert på immunopresipiteringsdata beskrevet nedenfor ble hybridene gruppert i en av tre katogerierer basert på deres reaktiviteter med enten nativt Onkostatin M, denaturert Onkostatin M eller begge (tabell I). Fem av disse monoklonale antistoffer ble deretter testet for å bestemme om noen av disse kunne nøytralisere de inhiberende virkninger til Onkostatin M i vekstinhiberingsprøven. Disse resultater er beskrevet nedenfor.

I. Monoklonale antistoffer immunopresipitert med Onkostatin

M.

Resultatene av immunopresipiteringsdata identifiserte tre monoklonale antistoffer (0M2, 0M2 og 0M7) som reagerte kun med<35>S-metionin-merket Onkostatin M i den form hvor det var ut-sondret fra CHO-transfektanten (gruppe 1 (bånd 2, 6, 7, fig.

1, se tabell I for identifisering av antistoffer)). Ytterligere tre monoklonale antistoffer (0M4, 0M5 og 0M6) reagerte kun med<35>S-metionin-merket Onkostatin M som først var redusert og denaturert ved behandling med SDS og reduserende midler, og deretter kokt ved 100°C; men ikke med nativt Onkostatin M (gruppe 2, bånd 3, 4, 5). To andre monoklonale antistoffer (OM3 og OM8) reagerte med biosyntetisk merket Onkostatin M hva enten dette var nativt eller denaturert (gruppe 3, bånd 8, 9).

J. Monoklonale antistoffer som nøytraliserer Onkostatin M

under vekstinhiberingsforsøket.

Renset antistoff fra hybridet OM2 nøytraliserte virkningene til Onkostatin M på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 2A). Antistoffet OM1 som er rettet mot nativt Onkostatin M viste ingen blokkering av vekstinhiberende virkninger til Onkostatin M (fig. 2B). Ingen av antistoffene som detekterte en denaturert determinant var i stand til å nøytralisere Onkostatin M som målt med GIA. Det nøytraliserende antistoff OM2 ble ytterligere testet for dets evne til å inhibere Onkostatin M-reseptorbinding, slik det skal beskrives nedenfor.

K. Monoklonale antistoffer som inhiberer bindingen av Onkostatin M under radioreseptortest.

OM2-antistoffet var i stand til å inhibere Onkostatin M-reseptorbinding på en konsentrasjonsavhengig måte, i motsetning til enten OM1-antistoff rettet mot et nativt, men ikke nøytraliserende sete, eller et tredje antistoff OM4 rettet mot en epitop på denaturert Onkostatin M (fig. 3). L. Analyser av funksjonelle seter og epitopkartlegging av Onkostatin M.

I de etterfølgende avsnitt beskrives egenskapene til monklonale antistoffer generert mot rekombinant OM renset fra supernatanter fra transfekterte CHO-celler (Linsley et al., 1989, "J. Biol. Chem.", Vol. 264, p. 4282-4289). Ved serologiske analyser av produkter utskilt av CHO-celler transfektert med plasmider som koder for en rekke mutante former av OM, er det kartlagt enkelte epitoper detektert med monoklonale antistoffer og bestemt enkelte av de tertiære strukturelle krav til både antistoffbinding og funksjonell aktivitet til 0M-molekylet.

Av de to antistoffer som detekterer foldete epitoper, ble 0M2, men ikke 0M1, identifisert som et nøytraliserende antistoff basert på dets evne til å oppheve OM-aktiviteten under vekstinhiberingsforsøket (GIA) og inhibere OM-bindingen i radioreseptortesten (RRA). Serologiske analyser av de mutante OM-molekyler viste at bindingssetet til 0M2 påvirkes av ikke-tilstøtende områder av OM, og at nærværet av én av de to bisulfidbindinger, (<C>49<_c>i67) er vesentlig for nøytralisering av antistoffbindingen. Dessuten opphever enkelte mutasjoner 0M2-binding uten å medføre total misfolding av OM-molekylet.

Disse data indikerer at epitopen definert av 0M2 er romlig relatert til bindingssetet til OM, mens de som detekteres av 0M1, 0M3 og 0M4 er distinkte. De heri beskrevne antistoffer representerer de immunologiske forsøk for detektering av OM i aktuelle vev og fluider og vil være nyttig under definisjon av den fysiologiske funksjon og fordeling av

OM.

M. Kartlegging av OM- epitoper med EIA på Onkostatin M-mutanter.

Vekstregulatoren Onkostatin M (OM) er et nytt cytokin som oppviser pleiotropiske virkninger på et stort antall normale og transformerte cellelinjer. For å bestemme enkelte av de fysiologiske funksjoner til OM er det utviklet og karak terisert en rekke monoklonale antistoffer (0M1, 0M2, 0M3 og 0M4) til det rekombinante molekyl som beskrevet i de etterføl-gende avsnitt.

Antistoffene 0M1 og 0M2 bandt nativt men ikke denaturert OM, noe som tyder på at de gjenkjenner epitoper med tertiær strukturell konformasjon. Et tredje antistoff, 0M3, bandt nativt eller denaturert OM, og antistoffet 0M4 bandt kun denaturert OM. Epitoper for disse monomklonale antistoffer (mAB) ble lokalisert ved å måle antistoffbindingen til et utvalg mutante former av OM. 0M3-bindingssetet inneholder resten 108 mens setet for OM4 brytes opp ved innsettelse av aminosyre i posisjon 104.

For å kartlegge epitopen detektert ved disse antistoffer ble deres binding til OM testet i serumfritt kondisjonert medium fra COS-celler transfektert med en serie plasmider som koder for OM-mutasjoner i aminosyrerester på ulike seter i molekylet. Antistoffene OM3 og 0M4 som detekterer lineære epitoper ble undersøkt i direkte EIA for binding til en serie mutante OM-proteiner hvorfra C-terminale aminosyrer ble fjernet, på sekvensiell måte, ved hjelp av "stopp-codon"-innset-telser (fig. 6). Mutant A188-227 ble bundet av OM3, mensA188-227/L108S, med en tilleggsendring fra leucin til serin ved resten 108 ikke ble bundet. Antistoffet OM4 ble kartlagt til et sete som ble oppbrutt ved innsettelse av en glucin-alanin-glycin-sekvens i posisjon 104 (fig. 6). Antistoffene OM5 og OM6 som også reagerte predominant med denaturert OM, reagerte ikke med denne samme epitop som 0M4 siden de reagerte med GAG104-mutanten som ikke bindes av 0M4. Ingen av de genererte serier av OM-mutanter var så langt informative under epitop-kartleggingen av disse mutanter. Antistoffet OM7 er sannsyn-ligvis identisk med antistoffet OM2, det nøytraliserende antistoff, siden det har samme IG-isotyp og OM-mutantbindings-mønster som OM2, mens antistoffene OM8 og OM3 sansynligvis er identiske av samme grunn.

N. Serologiske analyser av 0M1- og 0M2 epitoper.

For å analysere de OM-strukturelle krav for binding av antistoffene 0M1 og 0M2, hvor begge kun reagerte med foldete former av OM, er det utviklet en dobbelt determinant EIA. Under testen anvendes antistoffet 0M3 som binder enten nativt eller denaturert OM, for å innfange OM fra de COS-transfekt-ante mutante supernatanter. Konsentrasjonene av OM (fra de mutante molekyler) bundet av biotinylert og 0M1 eller 0M2 ble sammenlignet med en standard kurve for renset nativt OM bundet av de respektive antistoffer.

Resultatene er vist i tabell II som konsentrasjonen av OM-mutante molekyler bundet av disse antistoffer, i ng/ml, sammenliknet med deres binding av renset OM. Som følge av at denne prøve var mettet ved de tilstedeværende OM-konsentrasjoner i ufortynnet supernatanter av de mutante transfektanter, var seriefortynning nødvendig for å detektere OM i det lineære parti av DDEIA. I alle tilfeller hvor de ekstrapolerte verdier av detektert OM var større enn 2 00 ng/ml, hadde absorbsjons-verdiene til fortynningsseriene for de ulike mutanter på molekyler den samme helning, noe som indikerer at de biotinyl-erte antistoffer binder slike mutante molekyler med den samme relative aktivitet.

Strukturelle analyser av OM-molekylet indikerte nærværet av et sterkt amfipatisk/amfifilt område nær C-terminalen fra aminosyrene 168-196. 0M1- og 0M2-antistoffene ble testet for deres binding til en rekke mutanter som hadde sekvensiell C-terminal delesjoner. Både 0M1 og 0M2 kunne detektere OM med høy affinitet fra mutanter som hadde sekvensiell C-terminal aminosyredelesjoner opptil aminosyre 168 (som antydet med den høye konsentrasjon av proteinbinding). For A185-227 C-terminal delesjonmutant var både antistoffer bundet med lavere affinitet, bindingsnivået til 0M2 det nøytraliserende antistoff, lavere enn tilsvarende for 0M1. Bindingsaktiviteten til begge antistoffer ble fullstendig tapt i C-terminaldelesjon mutanten A184-227. En rekke mutanter i det amfifile område med residu-endringer fra enten hydrofob eller hydrofil til nøytrale aminosyrer oppviste et mere komplekst mønster for antistoffbinding. Av de tre endringer fra fenylalanin til glycin resul-terte kun den i posisjon 176 i et totalt bindingsbortfall for begge antistoffer mens endringen ved 184 reduserte bindingen av det nøytraliserende antistoff 0M2, men ikke 0M1. Substitu-sjonen fra fenylalanin til glycin ved resten 169 hadde ingen virkning på bindingen av de to antistoffer. To separate proteiner H174G og H1786 med endringer av hydrofile histidiner til glycin i posisjonene 174 hhv 178 ble bundet med høy affinitet av både 0M1 og 0M2.

Det eksisterer to intramolekylære disulfidbindinger i det native Onkostatin M molekylet.<C>g-<C>1<g>7-disulfidbindingen påvirker ikke den lokale tertiære struktur (eller strukturer) til 0M1- og 0M2-epitoper siden antistoffbindingen ikke ble nedsatt når cysteinet i posisjon 6 ble forandret til serin. Elimineringen av begge disulfidbindinger (C6S/C167S) ødela epitopene til begge antistoffer, antagelig som følge av at det medførte total misfolding av molekylet.

To mutante OM-molekyler A44-47 og A22-36 var informative ved at de diskriminerer bindingskravene til antistoffene 0M1 og 0M2. Disse delesjonsmutanter ble bundet av 0M1, det ikke-nøytraliserende antistoff, men ikke av 0M2, det nøytraliseren-de antistoff. En skjematisk modell av de funksjonelt viktige regioner i Onkostatin M-molekylet bestemt med 0M2, og med kartleggingen av 0M3- og 0M4-epitoper, er vist på fig. 7.

M. Deponering av mikroorganismer.

De følgende cellelinjer som er representative for den foreliggende oppfinnelse er blitt deponert ved "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, og er gitt de føl-gende opplistede aksessnummere:

Claims (9)

1. Monoklonalt antistoff mot Onkostatin M, eller fragment derav, for anvendelse i et in vitro system,karakterisert vedat det er 0M2, 0M3 eller 0M1 produsert av hybridomcellelinje med deponeringsnummer henholdsvis ATCC HB 10398, ATCC HB 10396 og ATCC HB 10397.

2 . Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med krav 1,karakterisert vedat det er et Fab-, F(ab')2~eller Fv-fragment.

3. Monoklonalt antistoff, eller fragment derav i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat det er konjugert med en markør som er i stand til å produsere et detekterbart signal.

4 . Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med krav 3,karakterisert vedat markøren omfatter et fluorescerende stoff, en radiomarkør, en kromofor eller et enzym.

5. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med et av kravene 1-4,karakterisert vedat det er et kimært antistoff eller et fragment derav.

6. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med et av kravene 1-5,karakterisert vedat det er for anvendelse til diagnostisering av en sykdomstil-stand som innebærer biologisk aktivitet av Onkostatin M.

7. DNA-molekyl,karakterisert vedat det koder for det kimære antistoff eller fragment derav ifølge krav 5.

8. Cellelinje,karakterisert vedat den er i stand til å produsere et monoklonalt antistoff eller fragment derav ifølge krav 1 eller 2.

9. Hybridomcellelinje,karakterisert vedat den har deponeringsnummer ATCC HB 103 98, ATCC HB 103 96 eller ATCC HB 10397.