JP3814291B2 - Luminescent lanthanide chelates and uses thereof - Google Patents

Description

本出願に関して行われた研究は、保健国民協会及びエネルギー研究所の許可によって一部援助されたものである。政府は、この出願の特許登録権を有する。
序論
発明の分野
本発明の分野は、発光ランタニドキレート化剤である。
背景
発光（蛍光及び燐光を含む）マーカーは、科学、医学及び工学において幅広い用途を持っている。多くの場合、それらのマーカーは、放射性ラベル、クロモゲン、放射性濃縮染料等と競合的に置換される。蛍光器具での改善は、達成可能な感度を増大させ、重量分析を可能とした。
発光マーカーの使用で唯一最も顕著な制約は、許容し得るシグナル／ノイズ比を発生する事である。吸収及び発光最大、ストークスシフト、量子生成等の様なマーカー依存性は、自動又はバックグラウンド蛍光からシグナルを容易に区別するのに有効である。それ故、改良された発光マーカー、特に、長期にわたり発光する発光マーカー及び／又は長波長発光を伴う大きなストークスシフトを用意する事が常に必要とされている。その他の有用且つ望ましい性質としては、容易且つ安価な合成；化学的安定性、特に水性環境における安定性；タンパク質及び核酸を含む広範囲の高分子に対する便利な付着性；通常のレーザーによる効率的励起性；強力な発光が出来る事；良好な発光共鳴−エネルギー移動ドナーとして行動する容量；１００Å以上の分子距離を決定出来る事；及びＸ−線鏡検法で、放射性硬化発蛍光団としての有用性が挙げられる。
関連文献
関連特許としては、米国特許第4,637,988号(1987年)及び第4,837,169号(1989年)が挙げられる。エネルギー移動ドナーとしてランタニドクリプテート(lanthanide cryptate)を使用する特許出願には、米国特許出願07/729,228(1991年7月21日出願）がある。
DTPA-pAS-Tbは、ベイリー等に報告されている(Bailey et al., (1984) Analyst 109, 1449-1450)。その他のランタニドキレート化剤に関するバックグラウンド論文としては、ディアマンディス(Diamandis（1992）Analyst 117, 1879-1884)、キャンフィー等(Canfi et al., 1989, Analyst 114, 1405-1406)、アンドウ等(Ando et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta. 1102, 186-194)、ジョージ及びギャザリアン(Georges and Ghazarian（1993）Analytica Chimica Acta, 276, 401-409)、マチス等(Mathis et al.,（1993）Clin. Chem. 39, 1953)及びデサイ等(Desai et al.,（1993）J. Am. Chem. Soc. 115, 11032)、セベアス等(Seveus et al.,（1992）13, 329-338)、サッベドラ及びピカッツア(Saavedra and Picazza（1989）Analyst 114, 835-838)、フォンブレンドルフ等(von Brenndorf et al.,（1993）in Proceedings, 4th Intnl Conf on X-ray Microscopy, Chernogolovoka, Moscow District, Russia)、クラーク等(Clark et al.,（1993）Analytical Biochemistry 210, 1-6)を参照。
最新の蛍光共鳴エネルギー移動に関しては、セルビン(Selvin（1994）Fluorescence Resonance Energy Transfer, in Biochemical Spectroscopy, a volume of Methods in Enzymology, Academic Press, Ed. Kenneth Sauer)を参照。
発明の要旨
本発明は、一般式、

（ここで、Ｘは周期律５又は６族の原子を含む）の多核異節環芳香族増感剤(sensitizer)に共有結合したランタニドキレート化剤を含むランタニドキレートを提供する。
好ましいキレートでは、増感剤は、二重共有結合を介して、酸素原子で置換された第１の位置２〜８炭素原子、増感剤がキレート化剤に共有的に結合される結合基で置換された、第１の位置２〜８炭素原子とは異なる第２の位置２〜８炭素原子、及び第１及び第２の位置２〜８炭素原子とは異なる置換した第３の位置２〜８炭素原子を有する。しばしば、第１の位置２〜８炭素原子は、位置２又は４炭素原子であり、第２の炭素原子は、位置７の炭素原子であり、増感剤及びキレート化剤はアミン又はカルボキシル基で結合され、及び／又は第３の位置２〜８炭素原子は、位置４炭素原子であり、炭化水素又はハロゲン置換炭化水素で置換される。増感剤の例としては、２又は４−キノロン、２又は４−クマリン、又はそれらの誘導体、例えばカルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）、クマリン１２０（７−アミノ−４−メチル−２−クマリン）、クマリン１２４（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−クマリン）、アミノメチルトリメチルプソラレン等が挙げられる。
キレートは、ランタニド、例えばテルビウム又はユーロピウムと、キレート化剤基、例えばＤＴＰＡを介して高親和性錯体を形成する事が出来る。一般に、キレート化剤は、複数の構造的に自由を制限されたアニオン性基、例えばカルボキシレート又はホスホネート基を含む。キレート−ランタニド錯体の溶液は、強い発光が出来る。キレートは広範囲の化合物と結合して、特定のラベル、プローブ、診断及び／又は治療剤等を形成してもよい。
キレート−ランタニド錯体は、広範囲の用途において、検出ラベルとして有用である。一般に、この方法は、試料部分を発光錯体と接触させる事；キレート中で第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長で、試料部分を光に曝露する事；及び第１の波長より長く、キレート中での第２の電子転移の結果である第２波長で、試料部分からの光の放出を検出する事を含む。試料でも、特別の被検体(analyte)は、被検体を選択的に結合できる試薬にキレートを結合させる事によって検出してもよい。
又、キレートは、キレート−ランタニド錯体と他の発光剤、通常、発光性非金族基体共鳴エネルギーアクセプターとの間の共鳴エネルギー移動でも使用出来る。例えば、キレート−ランタニド錯体ドナーを１つの原子に、そしてアクセプターを第２の原子に結合する事によって、２つの原子間の距離を測定する事ができる。一般に、ドナー発光とアクセプター吸収のスペクトル重複は、寿命のドナー発光強度の検出可能な消滅又はアクセプター発光での検出可能な増加で測定される様な、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を可能とするに十分なものである。
原子が同じ分子上にあれば、この方法は、分子の構造又は確定について有用な情報を提供する。例えば、この方法は、ドナー及びアクセプターを、診断オリゴヌクレオチドの分離された原子に結合する事によって、ポリメラーゼ連鎖反応の状況をモニターするのに使用される。ターゲットＤＮＡの濃度が増加するにつれて、ターゲットＤＮＡに交配又はハイブリダイズした診断オリゴヌクレオチドの割合は、ラベル化原子間の平均距離の増加と共に増加する。この増加した平均距離は、ドナー及びアクセプター間のエネルギー移動の減少として検出される。原子が、異なる分子上に存在する場合は、この方法は、２つの分子の相互反応又は相対的位置関係についての有用な情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＭＲ又はＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂのいずれかでラベル化されたＤＮＡのスペクトルである。点線及び実線は、それぞれＴＭＲの吸収及び発光スペクトルである。円の実線は、ＤＮＡ上のＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂの発光スペクトルである。上に示したＴＭＲ発光スペクトルは、定常状態の発光光度計で得られた。テルビウム発光とＴＭＲ吸収間のスペクトル重複は、エネルギー移動を引き起こす事を可能とする。
図２Ａは、ドナーだけでラベル化したｄｓＤＮＡ（円の実線曲線）、ドナー−アクセプターラベル化ｄｓＤＮＡ（実線曲線）、及び異なるスペクトルの発光スペクトル（点線曲線）である。ＤＮＡの長さは、全ての場合で１０ｂｐである。ドナーだけの曲線及びドナー−アクセプター曲線は、５４６ｎｍで正規化される。ドナー−アクセプター錯体では、ドナー−ストランドＤＮＡ／アクセプターストランドの比は、図３の曲線Ｃが、凡そ１２％のドナーストランドが非交配である事を示すが、１より僅かに大きい。シグナルは、９０ｍｓｅｃ遅れ後の、７．５ｍｓｅｃゲートで集められる。１５０ｍｓｅｃ遅れで集められたデータは、非常に類似していた。５７０ｎｍでのドナー−アクセプター曲線のシグナル／バックグラウンド５４：１は、５７０ｎｍでのドナーアクセプターシグナルを、５７０ｎｍでのドナーだけのシグナルで割る事によって計算される。後者は、５４６ｎｍでのドナーだけのシグナルを、２４０で割る事によって計算される。検波器のノイズによるバックグラウンド、直接アクセプター発光又は光子統計は顕著ではない。異なるスペクトルは増感化発光を表示する。期待通り、形状は、ＴＭＲだけでラベル化したＤＮＡ蛍光スペクトルの形状と略同じである。
図２Ｂは、ドナーだけでラベル化された１０ｍｅｒのｓｓＤＮＡに関する５４６ｎｍでのドナー寿命−消滅(quenching)（曲線Ａ）、一連の部分的に交配されたドナー−アクセプター１０ｍｅｒＤＮＡオリゴマー（曲線Ｂ及びＣ）、及び曲線Ｂに相当する５７０ｎｍでの増感化発光シグナル（曲線Ｄ）である。曲線Ｂ及びＣを作成する為に、シグナルストランドドナーだけのＤＮＡ（トップ曲線）を、アクセプター−ラベル化相補体の増加量で滴定し、アニールした。各曲線の実線は、データに適合する２次指数（４つのパラメーター）である。各成分の割合は、それらの偏角を表示し、例えば曲線Ｂは、５５％ドナー−アクセプター錯体及び４５％ドナーだけの錯体を示す、式：ｙ＝５５％ｅｘｐ（−ｔ／３３１ｍｓｅｃ）＋４５％ｅｘｐ（−ｔ／２１２３ｍｓｅｃ）に適合する。全ての場合で、>0.99であり、ドナー消滅曲線に対する残留ｒ²は、構造を示さなかった。増感化発光曲線は、多分、未消滅ドナー種から生起する少量（≦１％）のシグナルの為に、１．５ｍｓｅｃで残留構造を示した。
図３は、ＣＹ−５又はＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｅｕのいずれかでラベル化したＤＮＡのスペクトルである。点線及び実線は、それぞれ、ＣＹ−５の吸収と発光スペクトルである。円の実線は、ＤＮＡ上のＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｅｕの発光スペクトルである。５４８ｎｍでの小さなシグナルは、異物テルビウムによるものである。示された全てのデータは、５℃で、１０ｍＭTris-HCl、pH8.0、10mM MgCl₂、150mM NaCl、D₂O中の0.5mMドナーストランド濃度でのデータである。２及び４倍で減少させた濃度でも、同じ結果が出た。発光分光分析は、パルス窒素レーザー、光子含有検波器及び２ｍｓｅｃ時間−解像度を持つ多チャンネルスケーラーを利用する実験室内分光光度計で行った。上で示された、ＣＹ−５発光スペクトルは、定常状態のＳＰＥＸ蛍光光度計で得られた。
図４Ａは、凡そ１：０．６比での、ドナーストランドＤＮＡとアクセプターストランドの混合物の発光スペクトルである。シグナルは、９０ｍｓｅｃ遅れ後の、７．５ｍｓｅｃゲートで集められる。
図４Ｂは、２．５ｍｓｅｃのドナーだけの寿命を示している図３に相当する寿命データ、ドナーだけ及びドナー−アクセプター錯体の混合物に相当する２次指数ドナー消滅、及び殆ど単純指数の増感化発光シグナルである。後者のシグナルは、ドナーだけ又はアクセプターだけの種には不感応である。シグナルストランド及びダブルストランドＤＮＡについてのドナーだけの寿命は、５％未満で異なる。
特定の実施態様の説明
本発明者は、テルビウム及びユーロピウムを含むランタニド元素に結合し、それらを効率的に増感化、例えばそれらを効率的に励起し、次いで効率的に発光させる一連の新規な化学的化合物を合成した。又、この化合物は高分子に便利に結合出来る。本発明者は、これらの化合物を、ランタニドキレートと呼ぶ。
本発明の重要性は数倍である。第１に、本発明のランタニドキレートは、放射性ラベルに対する非アイソトープ代替として使用出来る。第２に、それらは、通常の蛍光染料、特に画像用途において、増加コントラストに対する可能性を伴なって、発光染料の代替物として使用出来る。この増加コントラストは、ランタニド発光が極端に長い（０．６〜２．３ｍｓｅｃ）為に生起する。パルス化励起源及びゲート（時間−解像）検出を使用する場合、強い自動蛍光（バックグラウンド）は、未だ発光するラベルと共に自然崩壊する。その様な自動蛍光は、多くの組織試料の蛍光像を通常防ぐ。第３に、キレートは同じスペクトル領域で全て励起されるので、２色画像が可能である。第４に、ランタニドキレートは、発光エネルギー移動分析で、極めて効率的ドナーとして使用できる。この使用は、通常の蛍光エネルギー移動技術では通常測定出来ない距離であるが、構造的生物学及び医学において重要な、１００Å以上の距離の測定を可能とする。
本発明のキレートは多くの重要な利点を有する：１．それらは、合成が容易であり高分子への付着が容易である；２．それらは、窒素レーザー（３３７ｎｍでの）により効率的に励起される；３．それらの幾つか（例えば、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４）は、テルビウム及びユーロピウム両方を増感化出来る；４．キレートからのランタニド発光は極めて強い；例えば、以下に例示のテルビウムキレートは、３３７ｎｍで励起されると、ＤＴＰＡパラアミノサリシレート（ＤＴＰＡ−ｐＡＳ）より、凡そ６５倍の強度の発光をする；５．それらは、化学的に安定である；６．それらは、自動合成装置（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ技術又はタンパク質技術でのホスホルアミダイトの合成）で使用される化学的条件下で核酸及びタンパク質をラベル化するのに使用出来る；７．それらは、極めて良好な共鳴エネルギー移動ドナーである。エネルギー移動において、本発明のキレートを有効ならしめている重要な要素は、増感剤の発光とランタニドの発光の間に、非常に僅かなスペクトル又は時間の重複が存在する事実である。反対に、ＤＴＰＡ−ｐＡＳは、非常に顕著な時間及びスペクトルの重複を有し、弱いエネルギー移動ドナーを用意する；そして、８．それらは、Ｘ−線鏡検法において、放射性硬化発蛍光団として有用である。
本発明のランタニドキレートは、一般式、

（ここで、Ｘは周期律５又は６族の原子を含む）の多核異節環芳香族増感剤を含む。
適当な増感剤は、上記一般式が、増感剤の構造的に少量部分を含む構造を含む、種々の付加的構造を含んでもよい。一般に、位置２〜８炭素原子の少なくとも１つ、好ましくは位置２又は４炭素原子は酸化され、好ましくはカルボニル（即ち酸素原子に対して二重結合した）に酸化される。位置は、位置１のヘテロ原子から反対時計回りに、通常通りに番号付けされる。しばしば、その他の位置２〜８炭素原子、好ましくは他の２又は４位置の炭素原子は、アルキル、ビニル、オキシ（ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシルを含む）、カルボニル又は置換窒素（例えば、ニトロ−、置換アミンを含むアミノ−等）、シアノ、アセテート等の基、又はそれらの誘導体、特にハライド誘導体を含む基で置換（即ち、水素原子が置き替えられる）される。増感剤の例としては、ローダミン５６０、５７５、及び５９０、フルオレスセイン、２又は４−キノロン、２又は４−クマリン、又はそれらの誘導体、例えば、クマリン４４５、４５０、４９０、５００及び５０３、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドリジド等、及び特にカルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）、クマリン１２０（７−アミノ−４−メチル−２−クマリン）、クマリン１２４（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−クマリン）、アミノメチルトリメチルプソラレンが挙げられる。

上記一般式の広範囲の誘導体は、得られるキレートが、必要とするランタニド結合及び発光増進を用意する限り、増感剤として使用してもよい。増進発光とは、ランタニドと錯体化したキレートの溶液が、或る波長の光に曝露された時に、錯体化ランタニドが、キレートが存在しない同様の試料よりも大きな強度又は寿命の光を発生する事を意味する。増進は、少なくとも１つの設定条件下で（例えば、特定の濃度、溶剤系等）、（例えば、ここに開示の条件を参照）、通常少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５００％、更に好ましくは少なくとも５０００％、最も好ましくは少なくとも５０，０００％の強度である。
内在するランタニドを効果的に励起する為に、キレートは、１５０〜７５０ｎｍ、通常２００〜６５０ｎｍ、更に通常は２５０〜５５０ｎｍ、最も通常的には３００〜４５０ｎｍで最大吸収を一般に用意する。一般に、検出される発光は、入射光よりも大きく、少なくとも５０ｎｍ、通常は少なくとも１００ｎｍ、更に通常は少なくとも１５０ｎｍである。例えば、テルビウム及びユーロピウムに対する好ましい検出発光は、それぞれ、４９２と５４６ｎｍ及び６１７と６９５ｎｍである。吸光係数は、一般に、５，０００を越え、通常８，０００、更に通常は１１，０００を越える。
特別のキレート化剤−増感剤の組合せの選択は、使用用途に依存する。選択基準としては、選択されるランタニド、可能なバックグラウンド蛍光源、消滅剤、入射光源等が挙げられる。機能的に、選ばれたランタニドに対する適当なキレートは、候補の増感剤を、ＤＴＰＡの様なキレート化剤に結合させ、ランタニドと錯体形成させ、増進されたランタニド発光の出来る錯体を同定する事によって同定される。アッセイの詳細は以下で述べられる。
キレートは、テルビウム又はユーロピウムの様なランタニドで、高い親和性の錯体を形成する事が出来る。キレートは少なくとも１つのランタニド、好ましくは少なくとも１つのテルビウム及びユーロピウムと、ここに開示される少なくとも１つの設定条件下で、少なくとも１０⁶Ｍ^-1、好ましくは少なくとも１０⁸Ｍ^-1、更に好ましくは少なくとも１０¹⁰Ｍ^-1の平衡定数で結合する。広範囲の構造部位は、得られるキレートが必要な発光を用意する限り、必要なランタニド結合親和力を用意する為に使用出来る。然しながら、ランタニドは、カルボキシレート又はホスフェート基の様なアニオン性基で通常イオン結合される。
しばしば、キレートは、１つ以上の構造的に区別されるキレート化剤部を含む。一般に、それらのキレート化剤部は、複数の構造的に自由を制限されたアニオン性基、例えば、カルボキシレート又はホスフェート基を含む。好ましい実施態様では、それらの部位は、それ自身が、前述の結合親和力を持つランタニドキレート化剤として機能する事の出来る化合物から選ばれる。例えば、その様なキレート化剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等、及び、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ等の様なそれらのホスホネート同族体が挙げられる。又、キレートのランタニド親和力は、複数の官能基の相互反応の共同（共働）的結果であってもよい。例えば、キレートの１つ以上のアミノ酸部位、例えば、グリシンは、全体の結合親和力を増進する為に、ランタニドの空いた同等部位に結合する為に、構造的に位置付けする事ができる。
キレートが構造的に区別されるキレート化剤部を含む所では、キレートは、通常、一般に結合基又は連結基を介して増感剤部に共有的に結合する。増感剤とキレート化剤を共有結合出来、必要なランタニド結合及び発光を妨げない結合基を使用してもよい。この様に、結合基は、広範囲の構造を含んでもよい。しばしば、結合基は、窒素、カルボキシル、カルボニル又はアルコール基又は窒素又はカルボキシルの誘導体を含んでもよく、一般式の位置２〜８炭素原子に共有結合する。結合基は、時に、上記の炭素原子、位置２〜８の１つ、しばしば位置７に共有結合する。通常の結合基は、脂肪族及び芳香族アミン（第一級又は第二級であってもよい）、カルボキシル及びスフヒドリルである。キレート化剤及び増感剤は、しばしば、アミド、無水物、ジスルフィド、チオ−尿素、チオエーテル等の結合を介して結合する。
キレートは通常の方法で合成してもよい。多くの開示された増感剤及びキレート化剤増感剤は、市販品として利用できる、その他は、通常の方法により、市販の出発物質から合成又は変性される。この２つは、それらが、ここに開示の官能基を介して、最もしばしば直接に結合されるけれども、通常の化学で結合されてもよい。例えば、幾つかの好ましいキレートは、無水物（例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、略してＤＴＰＡ）と増感剤（ＤＴＰＡが、ランタニドをしっかりと結合して、水による非放射性不活性化を防ぐキレート化剤として作用し、有機化合物が、ランタニドの効率的励起を許す増感剤として作用する）との間の反応に基づくものである。これらのキレートは、アミン含有増感剤がpASを置き替えるベイリー等の方法(Bailey et al.,（1984）Analyst 109, 1449-1450)の変更によって造られてもよい。ＤＴＰＡの無水物は、無水有機溶媒、一般に乾燥ジメチルスルホキシドに別々に溶解される。次いで、無水物及び選択された増感剤は混合され、ほぼ１時間反応させる。無水物は、増感剤のアミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。
所望ならば、キレートは、通常の方法で、被検体−特定試薬、有機重合体、高分子（特に、核酸及びタンパク質の様な生体分子）に結合させてもよい。例えば、タンパク質（又はその他のアミン含有高分子）への共有結合に対しては、キレートは、ＤＴＰＡの二無水物を使用して基本的に形成できる。増感剤への結合後、混合物は、次いで、有機溶媒又は水性溶媒中でアミン含有高分子に添加される。次いで、第２の二無水物が高分子上のアミンと反応し、別のアミド結合を形成する。アミンの反応性は、この反応が水性媒体中で行うことができる程に十分に大きい（水が無水物との反応と競合するとしても）。
別に、２官能性結合体が、キレート及び高分子を結合するのに使用出来る。例えば、適当な結合体は、チオール反応性基（例えば、マレイミド、アセチルハライド等）及びアミン反応性基（例えば、チオ尿素、イソチオシアネート等）の両方を含んでもよい。例えば、ＤＴＰＡの一無水物は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）との反応によってタンパク質に結合させてもよい。
キレート−ランタニド錯体は、広範囲の用途において、検出可能なラベルとして有用である。一般に、この方法は、試料部分を、キレートとランタニドの発光錯体と接触させる事；キレート中で第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長で、試料部分を光に曝露する事；及び第１の波長より長く、キレート中での第２の電子転移の結果である第２波長で、試料部分からの光の発光を、好適には、短い寿命のバックグラウンド発光の検出を最小限とする時間遅れで検出する事を含む。試料部分の特定の被検体は、被検体を選択的に結合できる試薬にキレートを結合させる事によって検出してもよい。
この方法は、生物学的試料及び抽出物（生理学的液体、核酸及び／又はタンパク質溶液、微生物培養等）、環境試料（水源の様な）、工業的、特に化学試薬、生成物及び廃棄物等を含む広範囲の試料に適用出来る。キレートは、溶液中で遊離であってもよく、或いは種々の方法で抑制されていてもよい。例えば、キレートは、固体表面又は膜上に吸着される様に或いはビーズ内に拘束される様にして、１つの相、固体又は液体中に又はその上に、選択的に区分されてもよい。この様に、この方法は、分類（例えば、細胞分類）、クロマトグラフィー、電気泳動、浸透及び遠心分離と共に有用である。熱及び有機安定性キレートは、高温（例えば、蒸留、燃焼等）及び有機抽出を含む用途の為に選択される。
第１の波長（入射光のそれ）は、ランタニド発光の究極のシグナル／ノイズ比を最適にする為に選ばれる。しばしば、入射光は、バックグラウンド吸収を最少とする形態で用意される。有用な光源としては、レーザー（例えば、窒素、ヘリウム−カドミウム、染料レーザー等）及びアークランプ（例えば、高圧、水銀、キセノン、石英等）が挙げられる。窒素レーザーは、それらの３３７ｎｍ発光周波数がランタニド吸収最大に近いので、特に好ましい。同様に、第２の波長は、シグナル／ノイズ比を最適にする為及び利用できる器具の観点から選ばれる。
目的のキレートは、広範囲の化合物に結合させて、特定のラベル、プローブ、診断及び／又は治療剤等を造ってもよい。例としては、タンパク質（抗体、酵素、レセプター等）、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、等）、生物活性分子（薬、トキシン等）の様な生体分子；ガラス又は重合性ビーズ、シート、繊維、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えば、ガラス、石英）及びプローブ等の固体基体が挙げられる。
本発明のキレートの多くは、本発明者が、発光共鳴エネルギー移動（Luminescence Resonance Energy Transfer）又はＬＲＥＴと名付けるものに特に受入れられるものである。ＬＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescent Resonance Energy Transfer)又はＦＲＥＴの普及版であり、ポリマー科学、生化学及び構造生物学で広く使用される技術である。ＦＲＥＴは、蛍光染料でラベル化された、凡そ１０〜７５Å離れた２点間の距離を測定するのに使用出来る。この技術は、生理学的（又はその他の）条件下で、オングトロームに近い解像度と蛍光測定の鋭敏な感度でもって測定が出来るので、価値あるものである。ＦＲＥＴは、１つの蛍光染料（ドナー）から他の吸収又は蛍光染料（アクセプター）へのエネルギーの距離依存性移動に依存する。ドナー及びアクセプターは、その間の距離を測定しようとする２点間に、部位特定的に配置される。ランタニドは蛍光を発しないが、本発明のキレートの使用は、それらを効率的に励起させる。ランタニドの非蛍光量子転移は、適当にして適切に離れているアクセプターへの非放射性エネルギー移動を効果的にする事が出来る。移動を効果的に行う為には、アクセプター吸収は、ランタニド発光と重複しなければならない。キレート−アクセプターペアーは、最適な重複の為に選ばれる。長い距離測定の為には、大きな重複が好ましい。ランタニドは、ミリセカンドのオーダーの寿命を有するので、ＬＲＥＴでのアクセプターの増感化発光のシグナル／ノイズ比は、時間解像(time resolution)(パルス遅れ)又は相変化(phase modulation)による発光検出で改善される。エネルギー移動は、ドナー消滅又は好ましくはアクセプター発光によって検出出来る。
ドナーとして発光ランタニドキレート化剤（通常の染料に代えて）及びアクセプターとして通常の蛍光染料を使用する事によって、本発明者は、凡そ１００倍まで、ＬＲＥＴのシグナル／バックグラウンドを改善した。この改善は、小さな通常の染料を使用しては普通測定出来ない距離の１００Å以上の測定を可能にする。この距離管理方式は、多くの生物学的問題で重要なものである。又、ドナーとしてランタニドキレート化剤を使用する事は、キレート化剤が、エネルギー移動の方向依存性の不確定性を最少にするので、より正確な距離測定とする。又本発明者は、アクセプターの増感化発光の最初の寿命測定、即ち、非特定又は不完全ラベリングに関する問題を無くするＬＲＥＴ測定を証明した。
広範囲のアクセプターが、本発明のキレートドナーと共に有用である。一般に、選ばれるアクセプターは、ドナーキレートの波長より長い、２５ｎｍ〜２５０ｎｍの波長で、吸光度最大を有する。アクセプターの例としては、フルオレスセイン及びローダミンの様なキサンテン染料、クマリン、ベンツイミド染料、フェナンスリジン染料、エチジウム染料、アクリジン染料、チアゾールオレンジ、チアゾールブルー、Cy5、Cy5.5、Cy3等のシアニン染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、キノロン染料、ピコビリックタンパク質(pycobillyc protein)、例えば、アロフィコシアニン(allophycocyanin)、Ｒ−フィコエリスリン(phycoerythrin)、Ｂ−フィコエリスリン、ボディピー染料(Bodipy dye)等が挙げられる。アクセプターは、一般に、可視又は赤外範囲で発光する。
ＬＲＥＴは、溶液中の高分子についての構造及び動力学情報を、即時に得るのに特に有用である。例えば、二重末端ラベル化オリゴヌクレオチドは、核酸でタンパク質、例えば、転写因子を結合した時は、検出可能なシグナルを用意する。従って、この方法は、生体分子の構造又は相互反応を変更する可能な治療をスクリーンするのに使用される。例えば、抗ウイルス剤は、ウイルス転写因子−核酸形成で誘発された変質を変更する能力に対してスクリーンされる。
試料部分の第１の位置と第２の位置の間の距離を検出する為の、一般的ＬＲＥＴベースの方法は、第１の位置に配置されたドナーランタニド−キレート錯体と、第２の位置に配置されたアクセプターを含む試料部分を、ドナー中の第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長で光に曝露する事を含む。ドナー発光とアクセプター吸収のスペクトル重複は、ドナー発光強度又は寿命の検出可能な消滅又はアクセプター発光強度又は寿命の検出可能な増加で測定される様な、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を可能とするに十分なものである。次いで、第２の波長での試料部分からの光の第１の発光の強度は、第２の波長が第１の波長よりも長く、ドナー中での第２の電子転移の結果であり、光の第１発光の強度が、第１及び第２の位置間の距離と相関関係を示す所で検出される。換言すれば、位置が近ければ近い程、エネルギー移動は大きくなり、ドナー消滅は大きくなる。別に、第３の波長で、試料部分からの光の第２の発光の強度を検出できる。第３の波長は、第１の波長よりも長く、アクセプター中での電子転移から得られ、光の第２の発光の強度が、試料部分の第１及び第２位置間の距離と相関関係を示す。換言すれば、位置が近ければ近い程、エネルギー移動は大きくなり、アクセプター発光は大きくなる。
この一般的方法は、位置の間の、例えば、２つの原子又は分子の間の静的又は動的距離が重要な場合に広い用途を有する。１つの特定の実施態様では、この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の状況を観察するのに使用される。ここでは、試料部分は、一端の近位にアクセプターで、そして他端の近位にドナーでラベル化された第一ストランド部及び診断核酸ストランドを含むターゲット核酸ストランドを含む（即ち、ドナーに共有結合した第一原子とアクセプターに共有結合した第二原子を含み、第一及び第二原子が、第二ストランド部で分離されている）。
第一及び第二ストランド部は、アニーリング条件下で交配するのに十分に相補的であり、第二ストランド部は、第一及び第二ストランド部が交配されない時の、ドナーからアクセプターへの総エネルギー移動に比べて、第一及び第二ストランド部が交配される時の、ドナーからアクセプターへの総エネルギー移動での検出可能な差を用意するのに十分な長さである。検出可能な差は、少なくとも１つのドナー発光の検出可能な消滅又はアクセプター発光の検出可能な増加として測定され、第一及び第二原子間の距離は、核酸ストランドが交配されたかどうかを示す。この様に、反応が進行するにつれて、ターゲット核酸の量の段階的増加は、エネルギー移動での段階的減少として反映される。
以下の実施例は、例示の為に提供されるものであり、限定の為に提供されるものではない。
実施例
実施例１
この実施例では、本発明者は、ドナーとして発光テルビウムキレート、及びアクセプターとして有機染料、テトラメチルローダミンを導入する事によって、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）の技術を例示する。結果は、適切なパラメーターが使用される、エネルギー移動のフェルスター理論(Forster theory)と一致する。ランタニドドナーの使用は、一般に、そしてそのペアーは、特に、唯一有機染料に依存する通常のＦＲＥＴペアーよりも多くの利点を有する。５０％のエネルギー移動が起こる距離（Ｒ₀）は、大きく、６５Åである；ドナー寿命は、単純指数で、長く（ミリセカンド）、寿命測定をたやすく且つ正確なものとする；測定距離での不確定性を造り出す配向因子(κ²)の不確定性は、ドナーの多重電子転移及び長い寿命によって最少化される；アクセプターの増感化発光は、殆ど或いは全く障害のないバックグラウンドで測定でき、通常のドナー−アクセプターペアーより、シグナル／バックグラウンドで、＞２５倍の改善を生む。これらの改善は、１００Åより大きい距離の測定が、ＬＲＥＴを介して可能とする事を期待させる。又、本発明者は、全濃度及び不完全なラベリングに対して完全に不感応な測定である、増感化発光寿命の測定を報告する。
ＦＲＥＴでは、蛍光ドナー分子は、非放射性双極子−双極子相互反応を介して、アクセプター分子（通常、蛍光分子である）へエネルギーを移動する。ＦＲＥＴは、１０〜７０Åの範囲の距離を測定する為の標準分光分析技術である。ドナー及びアクセプター間の距離Ｒ^-6に依存するエネルギー移動によって、ドナーの寿命及び量子の生成は減少し、アクセプター蛍光は増加又は増感化される（１）。ＦＲＥＴは、しばしば、ポリマー科学及び構造生物学の両方で使用され、近年、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の高分子錯体の研究に使用されてきた（２−４）。
それらの成功にも拘わらず、ＦＲＥＴは、その実用性を制限する多くの重大な欠点を有していた。第１に、測定出来る最大距離が、多くの生物学的用途にとって最適なものではなかった。第２に、通常使用されるドナー発蛍光団の寿命が短く(一般に、２〜３ナノセカンド)、高次指数であり、寿命測定を困難とし、精度に限界があった。第３に、増感化発光のシグナル／バックグラウンドが、ドナー及びアクセプターの直接励起からの蛍光障害によって低かった。第４に、エネルギー移動の効率が、ドナーとアクセプター間の距離Ｒ^-6に依存するばかりでなく、κ²因子で表される様な、それらの相対配向にも依存するので、正確な距離を決定する事が困難であった。（エネルギー移動効率＝１／（１＋Ｒ⁶/Ｒ₀ ⁶）、ここで、Ｒ₀は、κ²の関数である：付録参照）。
発光ランタニド元素、テルビウム及びユーロピウムは、それらが、これらの問題の多くを、可能的に解消するので、魅力的なＦＲＥＴドナーである。ランタニド発光は、一量状態から一量状態への転移を引き起こさないから、ランタニドドナーを使用するエネルギー移動は、より正確に、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）と呼ばれる。ランタニドは、主に、拡散増進ＦＲＥＴ（５）(difusion-enhanced FRET)で、カルシウム結合タンパク質での等晶形置換として使用されてきた。更に、マチス(Mathis)は、ユーロピウムクリプテート（cryptate）を、マルチクロモフォリックアロフィコカニン(multichromophoric Allophycocanin)と共に使用して、極めて大きな90ÅのＲ₀を達成した（９）。本発明者は、最近、アクセプターとしてＣＹ−５の様な有機染料との関連において、ドナーとしてユーロピウムのポリカルボキシレート−キレートを使用する事の多数の利点を示す結果を提出した（１０）。ここでは、本発明者は、これらの結果を、ドナーとしてテルビウムの使用にまで拡げる。
モデル系として、本発明者は、ドナー及びアクセプターを、種々の長さの、一連のダブルストランドＤＮＡオリゴマーの５′末端に共有的に結合する。その様なモデル系のＤＮＡの使用は、以前に、有機染料間のエネルギー移動測定にとって有効である事が示されている（１１）。
材料及び方法
ラベル化ＤＮＡオリゴマーの合成。長さが１０、１２、１４ベースの相補的ＤＮＡを、標準ホスホルアミダイト法(standard phosphoramidite procedure)を使用して合成した。６つの炭素結合体(Glen Research)を介して結合されるアミノ基は、５′末端に導入された。アクセプター配列は、クレッグ等(Clegg et al.)(11)によって使用されたものである：５′−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＴＡＧ−Ｇ−３′（１０ｂｐ）；５′−ＣＣＡ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＡＧＧ−３′（１２ｂｐ）；５′−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＣＴＡ−ＧＧ−３′（１４ｂｐ）。テトラメチルローダミン−イソチオシアネートの５−異性体（分子プローブ。Ｔ−１４８０：略称：ＴＭＲ）は、標準法で結合され、逆転相ＨＰＬＣで精製された。ＤＮＡに結合したＴＭＲの吸光係数は、ｅ₂₆₀=33mM^-1cm^-1及びｅ₅₅₆=93mM^-1cm^-1と決められた。ドナーストランドは、テルビウムキレートで５′末端でラベル化された相補的ＤＮＡから構成された。キレートは、レーザー染料、カルボスチリル１２４（ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４）に結合されたジエチレントリアミンペンタ酢酸である。ドナーキレート合成の詳細は、どこにででも示される。又、非ラベル化ＤＮＡオリゴマーも合成した。
交配条件：ドナー及びアクセプターストランドは、所望の比で、10mMTris、pH8.0、10mM MgCl₂、150mM NaClを含むD₂O-ベースバッファー中で混合された。又、実験は、H₂Oベースバッファー中でも行った。ドナーストランド濃度は凡そ200nMであった。オリゴマーは、75℃に加熱してアニールし、15分で、最終温度(22℃又は５℃)まで冷却された。
分光分析：吸収測定は、ヒューレットパッカード８４５２Ａ分光分析器で行った。定常状態蛍光測定は、ＳＰＥＸフルオロログ(Fluorolog)蛍光計で行った。時間-解像及びゲート発光測定は、パルスレーザーホトニクスナイトロジェンレーザー(pulsed Laser-Photonics Nitrogen laser)(5nsecパルス幅、40Hz繰り返し速度)で直角検出を利用する実験室内分光計、ガリウム−砒素光子含有検波器Gallium-arsenide photon-counting detector)、ゲート識別器(gated discriminator)(Ortec 584)及び２μｓｅｃの時間−解像の多チャンネルスケーラー(multichannnel scalar)で行った。又、分析器なしで行ったエネルギー移動実験は、分析器を使用するのと同じ結果を与えたが、偏光分析も行った。それ故、分析器は、通常は削除した。温度調節キュベットホルダー及び石英３mm x 3mmキュベットを使用した。寿命は、テーブルカーブソフトウエアー(TableCurve software)(Jandel Scientific)を使用して適合させた。
結果及び検討
ドナーキレート、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂの構造、及びエネルギー移動の為に使用されたモデル系を以下に示す。

ドナーキレートは幾つかの重要な特徴を有する。第１に、キレートは、テルビウム（及びユーロピウム）に極めてしっかりと結合する。１００倍を越えるＥＤＴＡでの滴定(K_b≦10¹⁷M^-1)は、テルビウムの測定可能な量を置き替える事ができない。これは、他のＤＴＰＡベースキレート化剤と一致するものであり（１２）、遊離のテルビウムが存在しない事を確証するものである。第２に、キレートは、高分子に対するテルビウムの部位特定付着を許す。第３に、D₂Oにおけるテルビウム発光の略単一体に対する量子生成の結果となる非放射性脱励起メカニズムからテルビウムを保護する（付録Ｉ参照）。最後に、レーザー染料、カルボスチリル１２４の共有結合は、テルビウムの極めて低い吸収断面(<1M^-1cm^-1)を解消する。cs124は、光(ε₃₂₈=11,000M^-1cm^-1；ε₃₃₈=8,000M^-1cm^-1)を吸収し、そして、テルビウムの極めて近い位置の故に、エネルギーをランタニドに移動する（１３、１４）。
図１は、テルビウムキレートと、効率的なエネルギー移動とD₂O中で６５Å(H₂O中では60Å）の大きなＲ₀へ導くテトラメチルローダミンのスペクトル特性を示す。Ｒ₀は、標準式（付録参照）から計算される。ここでは、本発明者は、ドナーとしてランタニドキレートを使用する事について２つの独特の観点を述べる：１）エネルギー移動効率は調整が出来るので、Ｒ₀は、測定されている特定の系に対して、単純に、溶媒中でH₂O/D₂Oの比を変える事によって最適化される。H₂O/D₂O比は、本発明のキレートにおけるランタニド量子生成(q_D)(D₂O中ではq_D≒1、H₂O中ではq_D≒0.6、付録I参照)を変更する事によってエネルギー移動効率に影響を及ぼす(15)。２）エネルギー移動過程の配向依存性は、テルビウムが、多重、変質電子転移を有し、従って、たとえ不動であっても等方性ドナーである為に最少化される。これは、悪い場合で＋／−１２％の配向効果により、測定される距離での不確定性を最少にする（１６）。
又、図１は、テルビウム発光の高いスパイク性(spike)を示す。ドナー消滅は、４９２ｎｍ及び５４６ｎｍで、アクセプター発光からの妨害なしに測定出来る。同様に、アクセプターの増感化発光は、テルビウムが、５７０ｎｍ近辺では殆ど静かであり、ここではＴＭＲが、その発光最大の７０％にあるので、ドナー発光からの顕著な妨害なしに測定出来る。５７０ｎｍでのテルビウムシグナルは、その最大、５４６ｎｍにおけるより少ない２４０ｘである。
増感化発光を測定する場合、又、本発明者は、一時的な識別によってアクセプターの直接蛍光を分離出来る。本発明者は、パルス励起を使用し、その間に、ローダミンの時間直接蛍光が衰退してしまう、９０μｓｅｃ遅れ後だけのデータを集める。（２〜３ナノセカンドの寿命を持つアクセプター蛍光は、急速に衰退する；又、本発明者は、多分、遅延蛍光か検波器人工物で、９０μｓｅｃ遅れ中に衰退する小さな成分を見出す）。ドナーは、そのミリセカンド寿命の故に、励起されて留まり、遅れ期間の最後でエネルギー移動ができる。従って、遅れ後の５７０ｎｍ付近で生起するシグナルは、増感化発光にのみ依存する、即ちアクセプターの蛍光はエネルギー移動に依存する。
図２Ａは、部分的に交配された１０ｍｅｒＤＮＡのエネルギー移動実験の結果を示す。平均エネルギー移動は７７％である。５７０ｎｍでの増感化発光のシグナル／バックグラウンドは、５４：１である。比較として、同じＤＮＡについてエネルギー移動ペアーとしてフルオレスセイン−ローダミンを使用する時の増感化発光に対するシグナル／バックグラウンドは、凡そ１である。バックグラウンドは、本発明の場合はその様に小さいので、小さなシグナルが測定可能となり、それ故、Ｒ₀より大きな距離が可能となる事が期待される。例えば、ホロックス及びブルーノ(Horrocks and Bruno)は、テルビウムエネルギー移動に対して、チロシンのダークバックグラウンド増感化発光を利用して４Ｒ₀（Ｒ₀＝３．１Å）の距離を測定する能力を示した（６）。
本発明者は、ドナー発光が顕著な領域でさえも、ドナー発光から増感化発光シグナルを単離できる。クレッグ等によって使用されたそれに類似の方法で（１１）、本発明者は、増感化発光シグナルを残しながら、全ての波長において、ドナー発光を減じる事が出来る。移動されるエネルギーの効率は、単純に、全集合面積で割られる集合増感化発光の面積である：
エネルギー移動効率＝(f_A/q_A)/(f_A/q_A＋f_D) （１）
ここで、f_Aは、増感化発光曲線の下の面積、q_Aは、アクセプターの蛍光量子生成、そしてf_Dは、ドナー発光曲線の下の面積である。ドナー消滅データとの比較で、アクセプターの量子生成を決める事が出来る。ＴＭＲに対する量子生成を０．１７４として、式（１）は、７７％の平均エネルギー移動となる。
図２Ｂは、一連の１０ｍｅｒＤＮＡオリゴマーについての寿命データを示す。ドナーだけ（シングルストランドＤＮＡ）のシグナルは、２．１４ｍｓｅｃの寿命の単純指数である。（その相補体に交配されたテルビウムラベル化ＤＮＡオリゴマーは、２．８０ｍｓｅｃの寿命の単純指数である。ダブルストランドとシングルストランドテルビウムだけのＤＮＡ間の寿命の相違は、同様に、異なる量子生成よりもむしろ、テルビウムを取り囲んでいる異なる対称から生起する、異なる放射速度に依存する）。アクセプターストランドの増加量での滴定は、２次指数ドナー消滅を示す（曲線Ｂ及びＣ）。長寿命成分は、非交配の、ドナーだけのストランドＤＮＡに相当する；短い成分は、アクセプターストランドで交配されたテルビウムストランドＤＮＡに相当する。期待通りに、アクセプターストランドの量の増加は、それらの寿命を変える事なく、短い成分の幅を増加し、長い成分の幅を減少する（曲線Ｂ及びＣを比較）。長時間成分がドナーだけのシグナルに等しいという事は、分子間エネルギー移動が顕著でない事を示す重要な内部調節である。短い成分の寿命は、ドナー−アクセプター錯体の８８％でのエベルギー移動に相当する（１〜３３１μｓｅｃ／２８０９μｓｅｃ）。比較として、フルオレスセイン−ＴＭＲペアーを使用する、同じ６つの炭素結合体の同じ１０ｍｅｒＤＮＡについてのエネルギー移動は、２３％である（１１）。
増感化発光曲線を基にしたエネルギー移動効率の計算では、これが、アクセプターの直接蛍光から生起する残存シグナルに依存するので、本発明者は、短時間成分を無視する。（このデータに対してゲートは使用されなかった）。多数の実験は、長時間成分が、悪い場合で、１０％以内、通常は、２〜３％以内で繰り返し可能である事を示す。然しながら、短時間成分は、解像出来ない直接蛍光に依る非常に大きく、非常に短いスパイクが存在するので、極めて変化しやすい。
アクセプターストランドの２倍過剰では、未だ１０〜１２％の非交配成分が存在する。類似の現象は、染料ラベル化オリゴマーで見られ（１７）、及び本発明のキレートにおいて置換されたユーロピウムでのＦＲＥＴ実験でも見られる（１０）。本発明の場合では、それは、５℃及び２２℃の両方で存在するので、それが単純溶融温度現象であるかは明らかではない。この理由は研究中である。この残存非消滅ドナーシグナルは、これが、非結合磁気双極子転移、つまり全てのテルビウム（及びユーロピウム）発光が同じ励起状態から生起する為に存在しない状態を必要とするので、基本的ランタニド写真物理現象によるものではなさそうである（１８、１９）。
又、図２Ｂは、２次指数ドナー消滅（曲線Ｂ）に相当する、５７０ｎｍでの増感化発光の寿命を示す。増感化発光の衰退は、式：
ｙ＝３３％ｅｘｐ（−ｔ／４５μｓｅｃ）＋６７％ｅｘｐ（−ｔ／３２６μｓｅｃ）
に正確に適合出来る。４５ｍｓｅｃ成分は、アクセプター又は検波器人工物（ゲートによって分離できる）からの直接蛍光に相当する。３２６μｓｅｃ成分は、ドナー−アクセプター錯体においてはエネルギー移動に依存し、３２９〜３３１μｓｅｃのドナー消滅成分と極めて良く一致する。凡そ９０μｓｅｃ後には、増感化発光に貢献する唯一の種は、ドナー−アクセプター錯体であって、ドナーだけ又はアクセプターだけでは貢献しない事に注意されたい。これは、不完全なラベリングの問題を顕著に最少化する。又、増感化発光の寿命シグナルな、全濃度、量子生成、及びドナー消滅の原因となる非エネルギー移動効果に対して不感応である。
表Ｉは、１０、１２、及び１４ｂｐ長のドナー−アクセプターラベル化ＤＮＡ二重型についての寿命及びエネルギー移動データを纏めたものである。

種々の実験からのデータは、与えられた長さのＤＮＡのドナー消滅及び増感化発光寿命が１０％以内、通常は２〜３％以内で一致する事を示す。期待通り、距離の増加に伴うエネルギー移動の減少が存在する。比較として、本発明者は、フルオレセイン−ＴＭＲを使用するクレッグ等によって決定された距離（１１）を例示する。両方の結果は、異なる塩状態とドナー寿命が、異なる染料位置、それ故、異なる測定距離へと導くものの、ＤＮＡ二重螺旋形状と一致する。本発明者は、ＤＮＡ螺旋のクレッグ等のモデルを使用して本発明の距離を適合させ、染料を結合した。三点のデータだけでは、そのモデルにおいて、全てのパラメーターを、独特のものに解像する事は不可能であるが、それでも、テルビウムキレート及び／又はアクセプターが、ＤＮＡ螺旋に明らかに接近していると仮定すれば、それらのモデルへの良好な適合は達成される。これは、ＤＮＡの螺旋形状と、それらのドナー及びアクセプターが螺旋から広がっている（それぞれ１９Å及び１３Å）事実の故に生起する、それらのＦＲＥＴデータで見られる変調を減少させる。この相違は、本発明のドナーの長時間寿命が、６つの炭素結合体によって設定された制限内でのドナー及びアクセプターの自由を制限された拡散を許すと期待されるので、そして、電荷反撥作用を最少にする、ここで使用される大きなイオン強度の故に、定性的に合理的である。
要するに、データは、エネルギー移動データが、双極子−双極子フォレスター型メカニズムを基に導かれるならば、二重螺旋ＤＮＡの形状と一致する。発光共鳴エネルギー移動の多くの技術的利点は、これを、生物学的に関心のある高分子についての測定に適合した良好な技術とする。
付録Ｉ
Ｒ₀の計算：ドナーの励起状態エネルギーの５０％がアクセプターへ転移される点の距離、Ｒ₀は、標準式（１）からの計算される：
Ｒ₀＝(8.79 x 10^-5J κ²n^-4q_D)^1/6Å （２）
ここで、ｑ_Dは、アクセプターが存在しない場合のドナー発光に対する発光量子生成であり、Ｊは、ドナー発光（ｆ_D）とアクセプター吸収(e_A)(J=∫f_Dε_Aλ⁴dλ)のスペクトル重複、ｎは、反射率及びκ²は、２つの双極子の相対角度に関する形状因子である。ここに、本発明者は、式(２)の各項を評価しそれらの不確定性を検討する。
反射率、ｎは、水の１．３３〜多くの有機分子の１．３９に変化する。数値積分は、３．８ｘ１０¹⁵nm⁴M^-1のＪ重複積分となる。これは、テルビウムの５４６ｎｍピークが、磁気双極子同様に電子双極子転移から生起するかも知れないので、Ｊに対する上限であり（１９）、前者は、エネルギーを顕著に移動しない（１８）。磁気双極子寄与の部分は、理論的に計算出来（２０、２１）、或いはこの問題は、単独に電子双極子転移として知られるテルビウムの４９２ｎｍ線を使用する事によって避けた（２０）。
ＦＲＥＴで有機染料を使用する場合は、κ²は、しばしば不確定性の顕著な元であり、悪い場合には、０〜４に変化する（２２）。然しながら、テルビウムでは、発光は、κ²を制限する（１／３＜κ²＜４／３）多重電子転移から生起する。更に、アクセプターは、ミリセカンドドナー寿命中において回転運動を受ける事が出来る様に思われる。これは、更にκ²を制限し、ドナー寿命内で、急速に回転するランダム配向に相当する、κ²＝２／３と推定する。
テルビウムの発光量子生成、ｑ_Dは、テルビウムの本質的に低い吸光度の故に、正確に決定する事が困難である。然しながら、ｑ_Dは、D₂Oでは１に非常に近いように思われる（以下参照）。Ｒ₀を計算する場合には、全体のキレートの量子生成ではなく、テルビウム量子生成(D₂Oでは、≒１)を使用する事が重要である点に留意されたい。全体のキレートの量子生成は、ランタニド量子生成が、ランタニドへ移動されるcs124によって吸収されたエネルギー部分を定めるのに等しい。
ランタニド発光の量子生成：D₂Oでは、ｑ_D≒１とさせる（直接的）証明についての幾つかの線が存在する。第１に、発光は、溶媒及びキレートによる非放射性脱励起のその他の源から保護されている４ｆ−４ｆ内核電子から生起する。本発明のキレート中のテルビウムの主たる配位球面における１．２H₂O分子は、非放射性脱励起の主たる源であるが、それらは、テルビウムを顕著に不活性化しないD₂Oによって置き替えられる（１５、２３）。水でないリガンド、カルボキシレート基及びアミン窒素は、励起状態のテルビウムを不活性化する点では極めて非効率的である（２３）。温度の研究を介して（２４）、又本発明者は、ｃｓ１２４の消滅効果を探索し、何も見出さなかった。
D₂Oで、ｑ_D≒１を支持する証明の第２の線は、H_DO中で、テルビウム：ＥＤＴＡが１：３の混合物の量子生成を直接測定し、０．５４の値を見出したエルバノウスキー及びその共同研究者(Elbanowski and coworker)の研究から得られる（２５）。この測定は、困難であり、精度が未知であるが、それでも、H₂O中でさえも高い量子生成を暗示し、D₂Oでの量子生成は、顕著に高い事が期待される。（多分、それらの錯体中のテルビウムに配位した２つの水分子が存在する（２３））。
証明の第３の線は、テルモリシン(thermolysin)ではドナーとして、そして、無脊椎動物のカルモデュリン(invertebrate calmodulin)ではアクセプターとしてテルビウムを使用するエネルギー移動実験からのものであり（８、２６）、この実験では、D₂Oでの単一量子生成の仮定（時に、暗示的）が、Ｘ−線結晶学データとの良好な一致を与える。
付録ＩＩ
アクセプターの蛍光量子生成の計算：ドナー消滅寿命データと面積との比較及び式（１）を使用する事により、アクセプターの量子生成を測定する事が可能である。これは、その吸収が、テルビウム（又はユーロピウム）の発光と重複する染料の量子生成を測定する為の一般的且新しい方法である。これは、その試料の対照を比較するというよりもむしろ１つの試料、即ち対象物の正確な試料しか含まない測定である通常の量子生成測定方法より多くの利点を有する。
ＴＭＲの量子生成を評価する為に、本発明者は、式（１）での未知数は、q_Aであり、そしてエネルギー移動の平均効率は、曲線Ｃ（上の）から７７．６％と仮定する。積分面積（ｆ_Aに対しては６２０、ｆ_Dに対しては１０３２、任意の単位）を基準として、これは、q_A＝０．１７４となる。比較として、ホスフェート−バッファー食塩水中での遊離テトラメチルローダミンは、標準測定法で測定して、０．２５の量子生成を有する（２７）。
実施例１の括弧内の引用文献

実施例２
この実施例では、本発明者は、ドナーとしてユーロピウムキレート、及びアクセプターとして有機染料、ＣＹ−５を導入する事によって、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の技術を提示する。ランタニドドナーの使用は、一般に、そしてそのペアーの使用は、特に、唯一有機染料に依存する通常のＦＲＥＴペアーよりも多くの利点を有する。Ｒ₀は、大きく、７０Åである；このドナー寿命は、単純指数で、長い（D₂O中で、2.5ｍｓｅｃ）；測定距離での不確定性を造りだす配向因子は、ドナーの多重電子転移及び長寿命によって最少化される；アクセプターの増感化発光は、殆ど或いは全く障害のないバックグラウンドで測定でき、通常のドナー−アクセプターペアーより、シグナル／バックグラウンドで、＞５０倍の改善を行う。シグナル／バックグラウンドでのこの改善は、１００Åより大きい距離の測定を可能とする事を期待させる。又、本発明者は、全濃度及び不完全なラベリングについて独立的な測定である、増感化発光寿命を測定する。
本発明者は、ドナーとして発光ユーロピウムキレート及びアクセプターとして有機染料のＣＹ−５を使用した。この発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）は、通常のＦＲＥＴより幾つかの利点を有する²。エネルギーの５０％が移動する点での距離（Ｒ₀）は、大きく７０Åである；ドナー寿命は、単純指数で、長く（H₂O中で、0.63ｍｓｅｃ;D₂O中で、2.5ｍｓｅｃ）、寿命測定を容易且つ高い精度のものとする；エネルギー移動の配向依存性（κ²）は、悪い場合で＋／−１２％で、配向効果による測定距離での不確定性を限定する、ドナーの多重電子転移及び長寿命によって最少化される³；アクセプターの増感化発光は、殆ど或いは全く障害のないバックグラウンドで測定でき、通常のドナー−アクセプターペアーより、シグナル／バックグラウンドで、＞５０倍の改善を行い、Ｒ₀の数倍の距離の測定を可能とする⁴。又、本発明者は、全濃度及び不完全なラベリングについて独立的である、増感化発光寿命を測定する。
本発明者は、ドナーとしてテルビウム⁵及びユーロピウムの両方を使用し、ユーロピウムの結果をここに報告する。１つの５′末端にユーロピウムキレートを持ち、他端の５′末端にＣＹ−５を持つダブルストランドＤＮＡを含むドナー−アクセプターモデル系の模式図を以下に示す：

ユーロピウムキレート、（ジエチレントリアミンペンタ酢酸−カルボスチリル１２４−Ｅｕ：一般名、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｅｕ）を、ＤＴＰＡの二無水物（シグマ）、カルボスチリル１２４（アルドリッチ）及び塩基保護された合成ＤＮＡを出発として、そしてラベル化が５′アミノ基でのみ起こる事を確保する為に、カラム上で、ベイリー¹²の方法で変更によって造った。ｃｓ１２４は、ドナーが、パルス窒素レーザーで励起された337nmで、ユーロピウムの吸収断面を、凡そ８０００Ｍ^-1cm^-1まで効果的に増加する。ＥＤＴＡの１００倍過剰は、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４キレート化剤から、ユーロピウムの顕著な量を除去しなかった。アクセプターは、標準方法を介してＣＹ−５¹³(Biological Detection System)で５′ラベル化された。非ラベル化相補的ＤＮＡオリゴマーを対照として造った。全てのＤＮＡは、逆転相ＨＰＬＣで精製を行った。この系では、ダブルストランドＤＮＡオリゴマーは、ユーロピウムドナーとＣＹ−５アクセプター間の定義された距離を確立する為に、硬いつなぎ鎖として働く。ドナー及びアクセプターの結合点は、染料位置が、結合の為に使用される、柔軟な６つの炭素結合体によって限定された変動性を維持するが、４２Åまで分けられる。^6,7
図３は、D₂O中で、７０Å（H₂O中で５６Å）以上に大きなＲ₀となるスペクトル特性を示す。Ｒ₀は、計算されたスペクトル重複(Ｊ)の6.55 x 10¹⁵M^-1nm⁴、配向係数(κ²)の2/3、反射率の1.33、及び１つのD₂O中でのユーロピウム発光の量子生成（H₂O中で０．２５）⁸を基準として、標準式¹から決定される。Ｒ₀を計算するに当っては、全体のキレートの量子生成ではなく、ランタニド発光の量子生成を使用し、そして、スペクトル重複（Ｊ）計算に、電子双極子であるそれらの転移だけを含ませる事が重要である。ここでは、エネルギー移動の為に使用される６１７ｎｍでのユーロピウム発光は、“強化された”電子双極子⁹として知られており、従って、エネルギー移動のフェルスター理論が適用可能である。５９６ｎｍでのユーロピウム発光は、それが磁気双極子転移であり、従ってスペクトル重複計算には含まれないので、アクセプターに結合出来ない¹⁰。
本発明者は、ドナー発光或いは直接アクセプター蛍光からの顕著な妨害なしにアクセプターの増感化発光を測定出来る。６６８ｎｍでは、ユーロピウムは、殆ど静かであり（６６８ｎｍでのユーロピウム発光は、その６１７ｎｍ最大より１２０倍少ない）、パルス励起を使用する事により、そして検波器を９０ｍｓｅｃ間ゲート開放する事によって、ドナー錯体でのカルボスチリル増感剤及びＣＹ−５の直接蛍光は、ユーロピウムが、励起状態で且つエネルギー移動の出来る状態に留まったままで、完全に分離される¹¹。
図４Ａは、ダークバックグラウンドの増感化発光実験を示す。ここでは、ドナー／アクセプターストランド比は凡そ１：０．６である；本発明者は、異種シグナルを解析するための本発明系の能力を示す為に、ドナーより少ないアクセプターを意識的に添加する。図４Ａでのエネルギー移動の平均部分は５７％である。６６８ｎｍでのシグナルは、ＣＹ−５の増感化発光、即ち、エネルギー移動にのみ依存する蛍光から生起する。本発明者は、６６８ｎｍでのシグナル／バックグラウンドを９４：１と計算する（ここでは、バックグラウンドは、少量のユーロピウム発光による）。これは、同じ１０ｍｅｒに結合した、最良のドナー−アクセプターペアーの１つであるフルオレセイン−ローダミンからの増感化発光よりも、シグナル／バックグラウンドにおいて５０〜１００の改善要因である。
図４Ｂは、図４Ａに相当する寿命データを示す。ドナーだけのシグナルは、２．５２ｍｓｅｃの寿命の単純指数である。ドナー消滅は、極めて良く２次指数に適合する（r²＝0.998）：ｙ＝63％exp(-t/0.22msec)＋37％exp(-t/2.40msec)。長時間成分は、ドナーだけの種に相当する。長時間成分が、ドナーだけの寿命にほぼ等しいということは、分子間エネルギー移動が、多くて５％である事を示す内部調節である。短時間成分は、交配ドナー−アクセプター錯体において、分子間エネルギー移動から生起し、９１％消滅に相当し（１〜０．２２ｍｓｅｃ／２．５２ｍｓｅｃ）、ドナー−アクセプター距離の４６Åに相当する。（Ｃ−６結合体を持つ同じＤＮＡ上のフルオレセイン−ローダミンは、２２％のエネルギー移動を生成する⁷）。アクセプター濃度を増加しての滴定は、短時間成分の部分を増加するが、期待通り、その寿命を変化させない。アクセプターストランドの２倍過剰では、多分、未交配ドナーストランドにより、ドナーだけのシグナルに相当する成分の１０％が残る。
又、図４Ｂは、増感化発光の寿命を示す。増感化発光の寿命シグナルは、２次指数に適合する（ｒ²=0.999）：ｙ＝40％exp(-t/59μsec)＋60％exp(-t/0.25msec)。短時間成分は、アクセプターの直接蛍光に依存し、検波器をゲートする事によって分離出来る。0.25msec成分は、ドナー消滅の短時間成分と優れて一致し、90％のエネルギー移動に依存する（１〜０．２５ｍｓｅｃ／２．５２ｍｓｅｃ）。非常に小さな短時間成分（≒１％）は、直接ドナー蛍光によって見る事が出来る。
要するに、発光エネルギー移動は、適当なパラメーターが使用される事を仮定するフェルター理論と一致する結果を生む。大きなＲ₀を基準に、本発明の寿命測定の容易性及び再現性、及び優れたシグナル／バックグラウンド、１００Åより著しく大きな距離が測定可能である。
実施例２での脚注文献
（１）Cantor and Schimmel, (1980) Biophysical Chemistry, W. H. Freeman and Co., San Francisco, Vol. 2；（２）エネルギー移動でのランタニドが、拡散増加ＦＲＥＴで使用された（Stryer, L., Thomas, D. D., Meares, Ed., C. F. (1982) In Annual Review of Biophysics and Bioengineering, L. J. Mullins, Ed., Annual Reviews, Inc., Palo Alto, CA, 11:203-222）。又、彼等は、マルチクロモフォリックアロフィコカニンを（Mathis, (1993) Clin. Chem. 39:1953）そして、カルシウム結合タンパク質での等晶形置換として使用した（Horrocks et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1975), 72:4764;Cronce and Horrocks, (1992) Biochem, 31:7963）；（３）Stryer, (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:819-846；（４）増感化発光を使用してＲ₀以上のエネルギー移動を測定する能力は、Bruno and Horrocksによって示され。彼等は、アクセプターとしてテルビウムを、ドナーとしてチロシンを使用した。３ÅのＲ₀で、彼等は12Åまで測定した。（Bruno et al., (1992) Biochem. 31:7016）；（５）Selvin and Hearst, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA（提出済），（６）Cardullo et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8780；（７）Clegg et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2994；（８）長い寿命及び非放射性脱活性メカニズムの欠如が、量子生成は、D₂Oでの生成に近いと思われる様にするけれど、正確な量子生成は、決定する事が困難である。この仮定は、Ｘ−線結晶学研究と一致する距離を与えた（文献４参照）。H₂Oでは、本発明のキレートの主たる配位球面上には、1.3H₂O分子が存在するので、量子生成は減少する（Horrocks and Sudnick, (1979) J. Am. Chem. Soc. 101:334）；（９）Bunzli, J. C. G. (1989) In Lanthanide Probes on life, Chemical and Earth Sciences, Theory and Practice Luminesent Probes; Bunzli J. C. G. & Choppin, G. R. Ed., Elsevier, New York, pp. 219-293；（10）Dexter, (1953) J. Chem. Phys. 21:836；（11）モリソン（Morrison）は、シグナルを、有機染料で増感化発光のバックグラウンドまで増加する為に、ゲートインテグレイションを使用した（Morrison, (1988) Anal. Biochem. 174:101；（12）Bailey et al., (1984) Analyst 109:1449；（13）Mujumdar et al., (1993) Bioconj. Chem. 4:105。
実施例３：テルビウム−フルオレセインエネルギー移動。
この実施例は、エネルギーをフルオレセインに移動するテルビウムキレート（テルビウム−ジエチレントリアミンペンタ酢酸）を使用した。ドナー及びアクセプターは、５′末端の第１級アミンで変性した。８ｍｅｒＤＮＡ二重オリゴヌクレオチドで分離した。アクセプターは、相補的オリゴヌクレオチドの５′末端に結合された。増感化発光は、５２０ｎｍ近辺で、バックグラウンド無しで測定した。更に、４９２ｎｍドナー発光線とフルオレセイン吸光度との間には、大きなＲ₀へと導く、優れた重複が存在する。パルス励起源を使用し、５２０ｎｍでモニターする事によって、任意のシグナルが、増感化発光からのみ生起する。８ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、ドナー及びアクセプターを、動かない様に分離する為に使用し、オリゴヌクレオチド濃度が約０．２５μＭ以下に維持される時は、スクロース溶液は、一般には、必要ないが、錯体を、分子間相互反応を分離する為に粘稠なスクロース溶液に浸漬した。５２０ｎｍにおける増感化発光のシグナル／バックグラウンド比は、凡そ４００：１である。ドナー強度消滅及び積分増感化発光面積の両方を基準としたエネルギー移動の範囲は、７０％である。アクセプター無しでの消滅ドナー寿命（１．５ｍｓｅｃ）、及びドナー−アクセプター錯体での増感化発光の寿命（寿命２５０μｓｅｃ）の測定は８５％の消滅を示す。７０％と８５％の間の差は、エネルギーを移動出来ない未交配ドナーラベル化ＤＮＡの少量画分に依存する。
実施例４−酵素（タンパク質加水分解的）活性の為のアッセイ
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、２つのラベル化点間の距離が、活性の関数として変化する様な酵素活性の研究に使用されてきた。一般に、ＦＲＥＴが使用される所では、しばしば顕著な改善を伴ってＬＲＥＴも又使用出来る。例えば、マタヨシ等（Mayayoshi et al., (1990) Science 247:954-958))は、基体ペプチドを、プロテアーゼ結合／切断部位の両側でドナー及びアクセプターでラベル化する事によって、ＨＩＶプロテアーゼ活性を測定する為にＦＲＥＴを使用した。ドナー及びアクセプターの極近位の故に、完全なままのペプチドでのドナー蛍光は、大いに消滅された。プロテアーゼの添加によって、ペプチドは開裂され、ドナー及びアクセプターは互いに拡散分離し、ドナー蛍光は、凡そ４０倍増加した。アッセイの感度は、主に、完全なままのペプチドでのドナー消滅の範囲によって決定される。１００％消滅の欠如は、たとえタンパク質加水分解的活性が存在しなくても、バックグラウンド蛍光の原因となる。著者は、これがそのままのペプチドの、ドナー消滅の増加を助けるので、彼等が、比較的長い寿命（10ナノセカンド）のドナーを使用した事に注目する。（この理由は、ペプチドが柔軟であり、長い寿命が、ペプチド時間を、ドナー及びアクセプターが一緒に近づき、ドナー消滅となる様に柔軟にさせるからである）。
標準の蛍光ドナーをランタニドキレートで置き替える事は、顕著に減少したバックグラウンドを用意し、従って、より良い感度を用意する。ランタニドキレートは、ペプチドの柔軟性により、大きなドナー消滅へと導く有機発蛍光団より長い>10⁵倍の寿命を有する。さらに、任意の残留ドナー発光は、パルス励起を使用する事により、そして検波器の回転により、パルス後のミリセカンドの幾つかの画分に対して分離出来る。ドナーが完全なままのペプチドで、９０％まで消滅されると、例えば、残る１０％の発光は、未消滅のキレートの１／１０、或いは凡そ１００μｓｅｃの寿命を有する。２〜３００ミリセカンドの為の検波器」をゲート開放する事によって、この残留ドナー発光は、検波器への到達を妨げられ、一方、タンパク質加水分解後に生起し、凡そミリセカンド寿命を有する未消滅発光は、ゲートによっては、相対的に影響を受けない。
最後に、ランタニドキレートからアクセプターへのエネルギー移動の格別な効率は、ドナー及びアクセプターの結合点を、標準染料で可能であるよりも、ペプチド上で更に離れて位置付ける事を許す。これは、酵素の結合部位が大きい時には、重要な要件である。
実施例５−遺伝子及びＤＮＡ配列の検出
ＦＲＥＴは、特定のＤＮＡ配列の検出に使用されてきた（Morrison et al., (19899 Analytical Biochemistry 183:231-244, and Lee et al., (1993) Nuclei Acids Research 21:3761-3766）。この用途でＦＲＥＴを使用する主たる利点は、この技術が極めて敏感であり（即ち、１つ又は２〜３の“ターゲット”ＤＮＡ配列を検出出来る）、均質フォーマットで行う事ができる点である。リー等（Lee et al.）が開示する同じ技術は、“Taq-Man”として知られる、アプライドバイオシステム（Applied Biosystem）から市販されている製品である。この適用で、ターゲットＤＮＡ配列に対するＤＡＮプローブ相補体は、結合したドナー及びアクセプターで造られる。プローブがそのままで、シングルストランドである場合は、ドナーは、アクセプターが極めて接近しているので、素早く消滅する。プローブがターゲットＤＡＮに交配すると、プローブは、特定の内部又は外部ヌクレアーゼによって分解される。次いで、ドナーは、アクセプターから拡散分離する為に、遊離し、ドナー蛍光が増加する。ターゲットＤＮＡが存在しないと、特定の分解が起こらず、ドナー蛍光での特定の増加が起こらない。
又、このシステムは、増幅を開発出来る：多くのプローブＤＡＮＡ分子と時間単位毎の結合が存在し、ダブルストランド生成物中のプローブは、ヌクレアーゼで加水分解され、蛍光が増加する。１つのプローブ分子が分解すやいなや、別のプローブが結合し、酵素はこの過程を繰り返す。それ故、１つのターゲットだけに対して、多くのプローブ分子からの蛍光が発生出来る。種々の外部ヌクレアーゼ及び内部ヌクレアーゼが、増幅に適合する；例えば、アプライドバイオシステムは、５′外部ヌクレアーゼ活性を有するTaq-ポリメラーゼを利用する。プローブがＲＮＡを含む場合は、ＲＮＡａｓｅＨは、増幅を開発するのに使用してもよい。
ＤＮＡ検出の為のこれらのＦＲＥＴベースシステムのいずれにおいても、有機染料ドナーをランタニドキレートで置き替える事が、アッセイを改善する。そのままのシングル−ストランドプローブでのドナー消滅の範囲は、ランタニドの長い寿命と、効率的なエネルギー移動の故に、著しく大きい。いかなる残留ドナー発光も、時間−ゲートで識別出来る。結果は、著しいバックグラウンドの減少である（正確には、上に示したプロテアーゼ実験に類似している）。
実施例６：寿命−仕立て上げ染料
上述の如く、ランタニドは、検鏡及び、一般に検出で、発光ラベルとして使用出来る。パルス励起及び時間−遅れ検出の使用で、ランタニドの長い励起状態寿命（ミリセカンド）は、シグナルを、ナノセカンド期間となる傾向のあるバックグラウンド蛍光からの単離を可能とする。然しながら、長い寿命は、分子当りのシグナル強度が必然的に弱いという欠点を有する：１ｍｓｅｃの励起状態寿命の分子は、多くて１０００光子／秒を発生する。これは、遅い発光分子が飽和する、高い発光速度で、特に顕著である。低い発光速度では、長い寿命は、いずれのランタニドも、寿命の逆数より少ない速度で励起されるので、有害ではない。理想的には、寿命が、最適な時間スケール（バックグラウンドが識別されるに十分長く、シグナル強度が顕著に弱められない程に十分短い）に仕立て上げられる発光ラベルを有する。バックグラウンドは、ナノセカンド寿命を有する傾向があるので、例えば、マイクロセカンドのプローブは、シグナルの時間−識別を可能とする。１０００倍長い寿命を有するが、ミリセカンドランタニドより１０００倍以上の光子／秒の発生を、可能的に出来る。その様な、寿命−仕立て上げ染料は、ランタニドキレート（ドナーとして）と、蛍光アクセプターとの間の発光エネルギー移動を利用する事によって造る事が出来る。シグナルは、エネルギー移動によるアクセプターの発光である。この発光の寿命（τ）は、消滅ドナーの寿命に等しく、
τ＝τ₀（1-E） （１）
である（ここで、τ₀は、アクセプターが存在しないときのランタニドキレートの寿命であり、Ｅは、エネルギー移動係数（又は、移動エネルギー効率とも呼ばれる）。与えられたτを達成する為のドナー及びアクセプター間の距離（Ｒ）は、ＬＲＥＴに適用可能である事が示された式で（Selvin et al. (1994) PNAS USA 91: 10024-10028; Selvin et al. J. Amer. Chem. Soc. 116:6029-6030; Selvin et al. (19949 Methods in Enzymology, K Sauer, ed., Academic Press, Orlando）、ＦＲＥＴに対する標準式を使用して容易に計算できる（Cantor et al., (1980) Biophysical Chemistry, WH Freeman and Co. SF）：
Ｅ＝１／［1+（R/R₀）⁶］ （２）
ここで、Ｒ₀は、ドナー及びアクセプターのスペクトル特性から計算出来る。式（1）及び（2）を組合せると、ドナー及びアクセプター間の距離の関数としての寿命が得られる：
τ＝τ₀/［1+（R₀/R）⁶］ （３）
τ₀が１．５ｍｓｅｃとすると、９０％エネルギー移動では、増感化発光は、１５０μｓｅｃの寿命で衰退する。９９％のエネルギー移動では、寿命は１５μｓｅｃである。１５μｓｅｃの寿命の発光ラベルが所望であれば、ドナー及びアクセプターを、９９％のエネルギー移動が起こる様に位置付けるべきである。これは、０．４６５ｘＲ₀の距離に相当する。ドナーとしてのＴｂ−キレート及びアクセプターとしてのテトラメチルローダミンに対しては（Selvin et al. 1995,上の）、Ｒ₀が60Åで、これは28Åに相当する。1.5μsec寿命のプローブは、99.9%のエネルギー移動に対しては、0.316Ｒ₀、又はＴｂ−キレートとテトラメチルローダミンに対しては１９Å離してドナーとアクセプターを置く事によって達成出来る。
寿命仕立て上げ染料は、多くの異なる色を発生する事が出来る点に留意されたい。発光ランタニドキレートからエネルギーを取る事の出来るアクセプターであれば、可能である。アクセプター吸収は、ランタニドの主たる発光線と重複する必要はない；より強度の弱い発光線の重複は、アクセプターが十分近くに置かれる限り、非常に効率的エネルギー移動を生む。３０ÅだけのＲ₀を持つドナー／アクセプターペアーは、距離９．５Åで99.9％のエネルギー移動を与える。更に、ドナーランタニドは、発光に対して、比較的少ない量子生成を有するものの、効率的エネルギー移動は生起出来る点に留意されたい。テルビウム及びユーロピウム量子生成は、適当なキレートでは明らかに高くなる傾向にあるが、その他のランタニド及び、顕著に低い量子生成の遷移元素、例えば、Pr、Nd、Sm、Dy、Ho、Er、Tm及びRu、Os及びSmは、同様に、有用なドナーとなる。最後に、エネルギー移動の効率は、一般に、ランタニドから発生された光子、或いはアクセプターで、短時間に発生され補足する、殆どの光子で高い（>90%）。光子において、唯一顕著な損失は、アクセプターの非単一量子生成から生起する。これは、高い量子生成を伴うアクセプターを選択する事によって最少化できる。
広範囲の異なる結合分子は、これらの寿命−仕立て上げ染料を造るのに使用してもよい。一般に、目的とする結合体は、約４〜６０の、好ましくは約９〜約３０Åの隔離距離を用意する。結合体の組成は、用途、例えば、疎水性重合性結合体が、膜浸透性染料を用意する為に使用してもよい様な用途の必要性に基づいて選ばれる。ペプチドは、有用な長さに容易に合成され、それらのＮ−及びＣ−末端は、ドナー及びアクセプターを結合するのに使用できる。内部アミノフェニルアラニン（又はリシン）を導入する事によって、反応性イソチオシアネートが、生体（又はその他の）高分子へ、錯体を結合させる為に発生する。又、ペプチドは、ペプチドの性質が、特定の用途を最適化出来る利点を有する；例えば、ポリプロリンは非常に硬く、疎水性である；ポリリシンは親水性であり、高度に陽性帯電されている；一方、ポリグルタメート又はポリアスパルテートは親水性であり、陰性に帯電されている。その他の結合体としては、優れた溶解性及び反応性を有する多糖、ポリイミド及び核酸が挙げられる。ポリマーは、改善された結合部位、例えば、第１級アミンが、核酸ストランドに挿入出来、高分子への結合の為に、イソチオシアネート基へ転換出来る部位を用意する為に誘導されてもよい。
本明細書に引用される全ての文献及び特許出願は、参照の為に導入されるべく、特別に、そして個々に示される。前述の発明は、理解の明瞭化の目的で、例示及び実施例で幾分詳細に記述されたが、本発明の教示に沿って、或る種の変化及び変更は、添付のクレームの精神又は範囲から逸脱する事なく為される事は、当業者にとって極めて明らかである。The work done on this application was supported in part by permission from the Health and National Association and the Energy Institute. The government has patent registration rights for this application.
Introduction
Field of Invention
The field of the invention is luminescent lanthanide chelators.
background
Luminescent (including fluorescent and phosphorescent) markers have a wide range of applications in science, medicine and engineering. In many cases, these markers are competitively replaced with radioactive labels, chromogens, radioactive concentrated dyes, and the like. Improvements in fluorescent instruments increased the achievable sensitivity and allowed gravimetric analysis.
The only most significant limitation of using luminescent markers is to generate an acceptable signal / noise ratio. Marker dependencies such as absorption and emission maxima, Stokes shift, quantum generation, etc. are useful for easily distinguishing signals from auto or background fluorescence. Therefore, there is always a need to provide improved luminescent markers, in particular luminescent markers that emit light over time and / or large Stokes shifts with long wavelength emission. Other useful and desirable properties include easy and inexpensive synthesis; chemical stability, especially in an aqueous environment; convenient adhesion to a wide range of polymers including proteins and nucleic acids; efficient excitation by conventional lasers Capable of strong emission; good emission resonance-capacity to act as an energy transfer donor; can determine molecular distances greater than 100 mm; and X-ray microscopy has utility as a radiation-curable fluorophore; Can be mentioned.
Related literature
Related patents include US Pat. Nos. 4,637,988 (1987) and 4,837,169 (1989). Patent applications that use lanthanide cryptate as an energy transfer donor include US patent application 07 / 729,228 (filed July 21, 1991).
DTPA-pAS-Tb has been reported to Bailey et al. (Bailey et al., (1984) Analyst 109, 1449-1450). Background papers on other lanthanide chelating agents include Diamandis (Diamandis (1992) Analyst 117, 1879-1884), Canfy et al. (Canfi et al., 1989, Analyst 114, 1405-1406), Ando et al. ( Ando et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta. 1102, 186-194), Georges and Ghazarian (1993) Analytica Chimica Acta, 276, 401-409, Mathis et al., ( 1993) Clin. Chem. 39, 1953) and Desai et al., (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 11032), Seveus et al. (Seveus et al., (1992) 13, 329- 338), Saavedra and Picazza (1989) Analyst 114, 835-838, von Brenndorf et al., (1993) in Proceedings, 4th Intnl Conf on X-ray Microscopy, Chernogolovoka, Moscow District, Russia), Clark et al., (1993) Analytical Biochemistry 210, 1-6.
For the latest fluorescence resonance energy transfer see Selvin (1994) Fluorescence Resonance Energy Transfer, in Biochemical Spectroscopy, a volume of Methods in Enzymology, Academic Press, Ed. Kenneth Sauer.
Summary of the Invention
The present invention has the general formula:

Provided is a lanthanide chelate comprising a lanthanide chelator covalently bound to a polynuclear heterocyclic aromatic sensitizer (wherein X comprises a group 5 or 6 atom).
In preferred chelates, the sensitizer is a linking group to which the sensitizer is covalently bound to the chelator, in a first position 2-8 carbon atoms substituted with an oxygen atom via a double covalent bond. A substituted second position 2-8 carbon atom different from the first position 2-8 carbon atoms, and a substituted third position 2-8 different from the first and second positions 2-8 carbon atom. Has 8 carbon atoms. Often, the first position 2-8 carbon atoms are position 2 or 4 carbon atoms, the second carbon atom is the carbon atom at position 7, and the sensitizer and chelator are amine or carboxyl groups. The bonded and / or third position 2-8 carbon atoms are position 4 carbon atoms and are substituted with a hydrocarbon or halogen-substituted hydrocarbon. Examples of sensitizers include 2 or 4-quinolone, 2 or 4-coumarin, or derivatives thereof such as carbostyril 124 (7-amino-4-methyl-2-quinolone), coumarin 120 (7-amino- 4-methyl-2-coumarin), coumarin 124 (7-amino-4- (trifluoromethyl) -2-coumarin), aminomethyltrimethylpsoralen and the like.
The chelate can form a high affinity complex with a lanthanide, such as terbium or europium, via a chelator group, such as DTPA. In general, chelating agents contain a plurality of structurally limited anionic groups, such as carboxylate or phosphonate groups. The chelate-lanthanide complex solution can emit strong light. Chelates may bind to a wide range of compounds to form specific labels, probes, diagnostic and / or therapeutic agents, and the like.
Chelate-lanthanide complexes are useful as detection labels in a wide range of applications. In general, the method involves contacting a sample portion with a luminescent complex; exposing the sample portion to light at a first wavelength capable of inducing a first electron transfer in the chelate; and a first wavelength. Detecting the emission of light from the sample portion at a second wavelength that is longer and is the result of a second electron transfer in the chelate. Even in a sample, a special analyte may be detected by binding a chelate to a reagent that can selectively bind the analyte.
Chelates can also be used in resonance energy transfer between a chelate-lanthanide complex and another luminescent agent, usually a luminescent non-metallic substrate resonance energy acceptor. For example, the distance between two atoms can be measured by attaching a chelate-lanthanide complex donor to one atom and an acceptor to a second atom. In general, spectral overlap between donor emission and acceptor absorption allows for energy transfer from donor to acceptor, as measured by detectable extinction of lifetime donor emission intensity or a detectable increase in acceptor emission. It is enough.
If the atoms are on the same molecule, this method provides useful information about the structure or determination of the molecule. For example, this method is used to monitor the status of the polymerase chain reaction by binding donors and acceptors to separated atoms of a diagnostic oligonucleotide. As the concentration of target DNA increases, the percentage of diagnostic oligonucleotides that are mated or hybridized to the target DNA increases with increasing average distance between labeled atoms. This increased average distance is detected as a decrease in energy transfer between the donor and acceptor. If the atoms are on different molecules, this method provides useful information about the interaction or relative position of the two molecules.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a spectrum of DNA labeled with either TMR or DTPA-cs124-Tb. The dotted and solid lines are the TMR absorption and emission spectra, respectively. The solid line of the circle is the emission spectrum of DTPA-cs124-Tb on DNA. The TMR emission spectrum shown above was obtained with a steady state emission photometer. Spectral overlap between terbium emission and TMR absorption makes it possible to cause energy transfer.
FIG. 2A is a donor-only labeled dsDNA (circle solid line curve), donor-acceptor labeled dsDNA (solid line curve), and emission spectra of different spectra (dotted curve). The length of the DNA is 10 bp in all cases. Donor-only curves and donor-acceptor curves are normalized at 546 nm. For the donor-acceptor complex, the donor-strand DNA / acceptor strand ratio is slightly greater than 1 although curve C in FIG. 3 shows that approximately 12% of the donor strands are uncrossed. The signal is collected with a 7.5 msec gate after 90 msec delay. Data collected with a 150 msec delay was very similar. The signal / background 54: 1 of the donor-acceptor curve at 570 nm is calculated by dividing the donor acceptor signal at 570 nm by the donor-only signal at 570 nm. The latter is calculated by dividing the donor-only signal at 546 nm by 240. Background due to detector noise, direct acceptor emission or photon statistics is not significant. Different spectra display sensitized emission. As expected, the shape is almost the same as the shape of the DNA fluorescence spectrum labeled with TMR alone.
FIG. 2B shows donor lifetime-quenching at 546 nm (curve A) for a 10-mer ssDNA labeled with donor only, a series of partially crossed donor-acceptor 10-mer DNA oligomers (curves B and C), And the sensitized luminescence signal at 570 nm (curve D) corresponding to curve B. To create curves B and C, the signal strand donor-only DNA (top curve) was titrated with increasing amounts of acceptor-labeled complement and annealed. The solid line of each curve is a quadratic index (4 parameters) that fits the data. The proportion of each component indicates their declination, for example curve B shows a 55% donor-acceptor complex and a 45% donor only complex, formula: y = 55% exp (−t / 331 msec) + 45% Exp (−t / 2123 msec) is satisfied. In all cases> 0.99, the residual r for the donor annihilation curve²Showed no structure. The sensitized luminescence curve showed a residual structure at 1.5 msec, possibly due to a small amount (≦ 1%) of the signal arising from the non-annihilated donor species.
FIG. 3 is the spectrum of DNA labeled with either CY-5 or DTPA-cs124-Eu. The dotted line and the solid line are the absorption and emission spectra of CY-5, respectively. The solid line of the circle is the emission spectrum of DTPA-cs124-Eu on DNA. The small signal at 548 nm is due to the foreign terbium. All data shown is 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl at 5 ° C.₂, 150 mM NaCl, D₂Data at 0.5 mM donor strand concentration in O. The same results were obtained with concentrations reduced by 2 and 4 fold. Emission spectroscopic analysis was performed with a laboratory spectrophotometer using a pulsed nitrogen laser, a photon containing detector and a multi-channel scaler with 2 msec time-resolution. The CY-5 emission spectrum shown above was obtained with a steady state SPEX fluorimeter.
FIG. 4A is an emission spectrum of a mixture of donor strand DNA and acceptor strands at a ratio of approximately 1: 0.6. The signal is collected with a 7.5 msec gate after 90 msec delay.
FIG. 4B shows lifetime data corresponding to FIG. 3 showing lifetime of only 2.5 msec donor, second-index donor annihilation corresponding to donor-only and donor-acceptor complex mixture, and almost simple index-sensitized emission. It is a signal. The latter signal is insensitive to donor-only or acceptor-only species. The lifetime of only the donor for signal strand and double strand DNA varies by less than 5%.
Description of specific embodiments
The inventor has synthesized a series of novel chemical compounds that bind to lanthanide elements including terbium and europium and efficiently sensitize them, for example, to excite them efficiently and then to emit light efficiently. This compound can also be conveniently bound to a polymer. The inventors refer to these compounds as lanthanide chelates.
The importance of the present invention is several times. First, the lanthanide chelates of the present invention can be used as a non-isotopic alternative to radioactive labels. Second, they can be used as replacements for luminescent dyes with the potential for increased contrast in conventional fluorescent dyes, especially imaging applications. This increased contrast occurs because the lanthanide emission is extremely long (0.6 to 2.3 msec). When using a pulsed excitation source and gated (time-resolution) detection, strong autofluorescence (background) decays spontaneously with the label still emitting. Such autofluorescence usually prevents fluorescence images of many tissue samples. Third, since the chelate is all excited in the same spectral region, a two-color image is possible. Fourth, lanthanide chelates can be used as highly efficient donors in luminescence energy transfer analysis. This use is a distance that is not usually measurable with conventional fluorescence energy transfer techniques, but allows distances of 100 mm or more, which are important in structural biology and medicine.
The chelates of the present invention have many important advantages: They are easy to synthesize and attach to polymers; They are efficiently excited by a nitrogen laser (at 337 nm); Some of them (eg DTPA-cs124) can sensitize both terbium and europium; 4. The lanthanide emission from the chelate is very strong; for example, the terbium chelate exemplified below emits about 65 times more intense than DTPA paraamino salicylate (DTPA-pAS) when excited at 337 nm; They are chemically stable; They can be used to label nucleic acids and proteins under chemical conditions used in automated synthesizers (eg, synthesis of phosphoramidites with DNA / RNA technology or protein technology); They are very good resonance energy transfer donors. An important factor that makes the chelate of the present invention effective in energy transfer is the fact that there is very little spectral or time overlap between the sensitizer emission and the lanthanide emission. Conversely, DTPA-pAS has very significant time and spectral overlap, providing a weak energy transfer donor; They are useful as radiocured fluorophores in X-ray microscopy.
The lanthanide chelate of the present invention has the general formula:

A polynuclear heterocyclic aromatic sensitizer (where X contains a group 5 or 6 atom of the periodic rule) is included.
Suitable sensitizers may include a variety of additional structures, including structures where the general formula includes structurally minor portions of the sensitizer. Generally, at least one of the 2 to 8 carbon atoms, preferably the 2 or 4 carbon atoms, is oxidized, preferably oxidized to a carbonyl (ie, double bonded to an oxygen atom). Positions are numbered normally counterclockwise from the heteroatom at position 1. Often, the other 2-8 carbon atoms, preferably the other 2 or 4 carbon atoms, are alkyl, vinyl, oxy (including hydroxyl, alkoxy, carboxyl), carbonyl or substituted nitrogen (eg, nitro-, substituted Amino-containing amines, etc.), groups such as cyano, acetate, etc., or derivatives thereof, especially groups containing halide derivatives (ie, hydrogen atoms are replaced). Examples of sensitizers include rhodamines 560, 575, and 590, fluorescein, 2 or 4-quinolone, 2 or 4-coumarin, or derivatives thereof such as coumarin 445, 450, 490, 500 and 503, 4-trifluoromethylcoumarin (TFC), 7-diethyl-amino-coumarin-3-carbohydridide and the like, and especially carbostyril 124 (7-amino-4-methyl-2-quinolone), coumarin 120 (7-amino-4) -Methyl-2-coumarin), coumarin 124 (7-amino-4- (trifluoromethyl) -2-coumarin), aminomethyltrimethylpsoralen.

A wide range of derivatives of the above general formula may be used as sensitizers as long as the resulting chelate provides the required lanthanide linkage and emission enhancement. Enhanced luminescence means that when a solution of a chelate complexed with a lanthanide is exposed to light of a certain wavelength, the complexed lanthanide generates light of a greater intensity or lifetime than a similar sample in which no chelate is present. Means. Enhancement is usually at least 50%, preferably at least 500%, more preferably at least 5000 under at least one set condition (eg, specific concentration, solvent system, etc.) (eg, see conditions disclosed herein). %, Most preferably at least 50,000% strength.
In order to effectively excite the underlying lanthanides, chelates generally provide maximum absorption at 150-750 nm, usually 200-650 nm, more usually 250-550 nm, most usually 300-450 nm. In general, the detected emission is greater than incident light and is at least 50 nm, usually at least 100 nm, more usually at least 150 nm. For example, the preferred detected emissions for terbium and europium are 492 and 546 nm and 617 and 695 nm, respectively. The extinction coefficient is generally greater than 5,000, usually greater than 8,000, and usually greater than 11,000.
The selection of a particular chelator-sensitizer combination depends on the intended use. Selection criteria include selected lanthanides, possible background fluorescent sources, quenchers, incident light sources, and the like. Functionally, an appropriate chelate for a selected lanthanide is to identify a complex capable of enhancing lanthanide emission by binding a candidate sensitizer to a chelator such as DTPA and complexing with the lanthanide. Identified by Details of the assay are described below.
The chelate is a lanthanide such as terbium or europium and can form a high affinity complex. The chelate is at least 10 lanthanides, preferably at least 10 terbium and europium, and at least 10 setting conditions disclosed herein.⁶M^-1, Preferably at least 10⁸M^-1More preferably at least 10^TenM^-1It binds with the equilibrium constant of A wide range of structural sites can be used to provide the necessary lanthanide binding affinity as long as the resulting chelate provides the necessary luminescence. However, lanthanides are usually ionically bonded with anionic groups such as carboxylate or phosphate groups.
Often the chelate comprises one or more structurally distinct chelator moieties. In general, these chelator moieties comprise a plurality of structurally limited anionic groups, such as carboxylate or phosphate groups. In a preferred embodiment, these sites are selected from compounds that themselves can function as lanthanide chelators with the aforementioned binding affinities. For example, such chelating agents include EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, and the like, and their phosphonate analogs such as DTPP, EDTP, HDTP, NTP, and the like. Also, the lanthanide affinity of the chelate may be a cooperative (cooperative) result of the interaction of multiple functional groups. For example, one or more amino acid sites of the chelate, such as glycine, can be structurally positioned to bind to vacant equivalent sites of lanthanides in order to increase overall binding affinity.
Where the chelate includes a chelator part that is structurally distinct, the chelate is typically covalently attached to the sensitizer part, generally via a linking group or linking group. A sensitizer and a chelating agent can be covalently bonded, and a necessary lanthanide bond and a linking group that does not prevent light emission may be used. Thus, the linking group may include a wide range of structures. Often, the linking group may comprise a nitrogen, carboxyl, carbonyl or alcohol group or a derivative of nitrogen or carboxyl and is covalently bonded to position 2-8 carbon atoms of the general formula. The linking group is sometimes covalently bonded to the above carbon atom, one of positions 2-8, often position 7. Common linking groups are aliphatic and aromatic amines (which may be primary or secondary), carboxyls and sulfhydryls. Chelating agents and sensitizers are often linked via bonds such as amides, anhydrides, disulfides, thio-ureas, thioethers, and the like.
The chelate may be synthesized by a usual method. Many of the disclosed sensitizers and chelator sensitizers are available commercially, others are synthesized or modified from commercially available starting materials by conventional methods. The two may be coupled with conventional chemistry, although they are most often directly coupled through the functional groups disclosed herein. For example, some preferred chelates are anhydrides (eg, diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA for short) and sensitizers (DTPA binds lanthanides tightly to prevent non-radioactive inactivation by water. And the organic compound acts as a sensitizer that allows efficient excitation of the lanthanide). These chelates may be made by modification of Bailey et al. (Bailey et al., (1984) Analyst 109, 1449-1450) in which amine-containing sensitizers replace pAS. The anhydride of DTPA is dissolved separately in an anhydrous organic solvent, generally dry dimethyl sulfoxide. The anhydride and selected sensitizer are then mixed and allowed to react for approximately 1 hour. The anhydride reacts with the sensitizer amine to form a stable amide bond.
If desired, chelates may be conjugated to analyte-specific reagents, organic polymers, macromolecules (particularly biomolecules such as nucleic acids and proteins) in the usual manner. For example, for covalent bonds to proteins (or other amine-containing polymers), chelates can be formed essentially using DTPA dianhydrides. After coupling to the sensitizer, the mixture is then added to the amine-containing polymer in an organic or aqueous solvent. The second dianhydride then reacts with the amine on the polymer to form another amide bond. The reactivity of the amine is large enough that this reaction can be carried out in an aqueous medium (even if water competes with the reaction with the anhydride).
Alternatively, bifunctional conjugates can be used to bind chelates and macromolecules. For example, suitable conjugates may include both thiol reactive groups (eg, maleimide, acetyl halide, etc.) and amine reactive groups (eg, thiourea, isothiocyanate, etc.). For example, DTPA monoanhydride may be conjugated to a protein by reaction with 3- (2-pyridyldithio) propionyl hydrazide (PDPH).
Chelate-lanthanide complexes are useful as detectable labels in a wide range of applications. In general, this method involves contacting a sample portion with a chelate and lanthanide luminescent complex; exposing the sample portion to light at a first wavelength capable of inducing a first electron transfer in the chelate; And at a second wavelength longer than the first wavelength and as a result of the second electron transfer in the chelate, light emission from the sample portion is preferably minimized, preferably detection of short-lived background emission. This includes detecting with time delay. A specific analyte in the sample portion may be detected by binding a chelate to a reagent that can selectively bind the analyte.
This method can be used for biological samples and extracts (physiological fluids, nucleic acid and / or protein solutions, microbial cultures, etc.), environmental samples (such as water sources), industrial, especially chemical reagents, products and wastes, etc. It can be applied to a wide range of samples including The chelate may be free in solution or may be suppressed in various ways. For example, chelates may be selectively partitioned in or on a single phase, solid or liquid, either adsorbed on a solid surface or membrane or constrained within a bead. Thus, this method is useful with classification (eg, cell classification), chromatography, electrophoresis, permeation and centrifugation. Thermal and organic stable chelates are selected for applications involving high temperatures (eg, distillation, combustion, etc.) and organic extraction.
The first wavelength (that of the incident light) is chosen to optimize the ultimate signal / noise ratio of the lanthanide emission. Often, incident light is provided in a form that minimizes background absorption. Useful light sources include lasers (eg, nitrogen, helium-cadmium, dye lasers, etc.) and arc lamps (eg, high pressure, mercury, xenon, quartz, etc.). Nitrogen lasers are particularly preferred because their 337 nm emission frequency is close to the lanthanide absorption maximum. Similarly, the second wavelength is chosen in order to optimize the signal / noise ratio and from the perspective of available instruments.
The target chelate may be conjugated to a wide range of compounds to create specific labels, probes, diagnostic and / or therapeutic agents, and the like. Examples include biomolecules such as proteins (antibodies, enzymes, receptors, etc.), nucleic acids (RNA, DNA, etc.), bioactive molecules (drugs, toxins, etc.); glass or polymerizable beads, sheets, fibers, membranes ( Examples thereof include solid substrates such as nylon and nitrocellulose), slides (for example, glass and quartz), and probes.
Many of the chelates of the present invention are particularly acceptable to what the inventors have named Luminescence Resonance Energy Transfer or LRET. LRET is a popular version of Fluorescent Resonance Energy Transfer or FRET, a technique widely used in polymer science, biochemistry and structural biology. FRET can be used to measure the distance between two points approximately 10-75 cm apart labeled with a fluorescent dye. This technique is valuable because it can be measured under physiological (or other) conditions with near-angstrom resolution and sensitive fluorescence sensitivity. FRET relies on distance-dependent transfer of energy from one fluorescent dye (donor) to another absorbing or fluorescent dye (acceptor). The donor and acceptor are site-specifically placed between two points where the distance between them is to be measured. Lanthanides do not fluoresce, but the use of the chelates of the present invention excites them efficiently. The non-fluorescent quantum transition of lanthanides can effectively transfer non-radiative energy to appropriately and appropriately spaced acceptors. For effective migration, acceptor absorption must overlap with lanthanide emission. Chelate-acceptor pairs are chosen for optimal duplication. A large overlap is preferred for long distance measurements. Since lanthanides have lifetimes on the order of milliseconds, the signal / noise ratio of the acceptor-sensitized luminescence in LRET can be determined by luminescence detection by time resolution (pulse delay) or phase modulation. Improved. Energy transfer can be detected by donor annihilation or preferably acceptor emission.
By using a luminescent lanthanide chelator (instead of a normal dye) as a donor and a normal fluorescent dye as an acceptor, the inventor has improved the signal / background of LRET by approximately 100 times. This improvement allows measurements over 100 km of distances that are not normally measurable using small ordinary dyes. This distance management scheme is important for many biological problems. Also, the use of a lanthanide chelator as a donor makes the distance measurement more accurate because the chelator minimizes the uncertainty of the direction dependence of energy transfer. The inventor has also demonstrated an initial lifetime measurement of the sensitized luminescence of the acceptor, ie an LRET measurement that eliminates the problem with non-specific or incomplete labeling.
A wide range of acceptors are useful with the chelating donors of the present invention. In general, the acceptor chosen has an absorbance maximum at a wavelength between 25 nm and 250 nm, which is longer than the wavelength of the donor chelate. Examples of acceptors are xanthene dyes such as fluorescein and rhodamine, coumarins, benzimide dyes, phenanthridine dyes, ethidium dyes, acridine dyes, cyanine dyes such as thiazole orange, thiazole blue, Cy5, Cy5.5, and Cy3. Carbazole dyes, phenoxazine dyes, porphyrin dyes, quinolone dyes, pycobillyc proteins such as allophycocyanin, R-phycoerythrin, B-phycoerythrin, body pea dyes (Bodipy) dye) and the like. Acceptors generally emit in the visible or infrared range.
LRET is particularly useful for obtaining instant structural and kinetic information about macromolecules in solution. For example, a double-end labeled oligonucleotide provides a detectable signal when a protein, such as a transcription factor, is bound by a nucleic acid. This method is therefore used to screen possible therapies that alter the structure or interaction of biomolecules. For example, antiviral agents are screened for the ability to alter alterations induced by viral transcription factor-nucleic acid formation.
A general LRET-based method for detecting a distance between a first position and a second position of a sample portion includes a donor lanthanide-chelate complex disposed at a first position and a second position. Exposing the sample portion containing the disposed acceptor to light at a first wavelength capable of inducing a first electron transfer in the donor. Spectral overlap between donor emission and acceptor absorption allows energy transfer from donor to acceptor, as measured by a detectable extinction of donor emission intensity or lifetime or a detectable increase in acceptor emission intensity or lifetime. It is enough. The intensity of the first emission of light from the sample portion at the second wavelength is then a result of the second electron transfer in the donor, where the second wavelength is longer than the first wavelength, and the light The intensity of the first light emission is detected at a location showing a correlation with the distance between the first and second positions. In other words, the closer the position, the greater the energy transfer and the greater the donor annihilation. Separately, the intensity of the second emission of light from the sample portion can be detected at the third wavelength. The third wavelength is longer than the first wavelength, obtained from electron transfer in the acceptor, and the intensity of the second emission of light correlates with the distance between the first and second positions of the sample portion. Show. In other words, the closer the position, the greater the energy transfer and the greater the acceptor emission.
This general method has wide application where a static or dynamic distance between positions, for example between two atoms or molecules, is important. In one particular embodiment, the method is used to observe the status of the polymerase chain reaction. Here, the sample portion comprises a target nucleic acid strand comprising a first strand portion and a diagnostic nucleic acid strand labeled with an acceptor proximal to one end and a donor proximal to the other end (ie, covalently bound to the donor). A first atom and a second atom covalently bonded to the acceptor, the first and second atoms being separated at the second strand portion).
The first and second strand portions are sufficiently complementary to mate under annealing conditions, and the second strand portion is the total energy from the donor to the acceptor when the first and second strand portions are not bred. Compared to transfer, it is long enough to provide a detectable difference in total energy transfer from donor to acceptor when the first and second strand sections are mated. The detectable difference is measured as a detectable extinction of at least one donor emission or a detectable increase in acceptor emission, and the distance between the first and second atoms indicates whether the nucleic acid strands have been crossed. Thus, as the reaction proceeds, a gradual increase in the amount of target nucleic acid is reflected as a gradual decrease in energy transfer.
The following examples are provided for purposes of illustration and not for limitation.
Example
Example 1
In this example, the inventors exemplify the technique of luminescence resonance energy transfer (LRET) by introducing a luminescent terbium chelate as a donor and an organic dye, tetramethylrhodamine as an acceptor. The results are consistent with the Forster theory of energy transfer, where appropriate parameters are used. The use of lanthanide donors generally has many advantages over conventional FRET pairs, especially those pairs that rely solely on organic dyes. Distance at which 50% energy transfer occurs (R₀) Is large and 65 mm; donor lifetime is simple exponential, long (milliseconds), making lifetime measurements easy and accurate; orientation factor (κ) that creates uncertainty at the measurement distance²) Uncertainty is minimized by multiple electron transitions and long lifetimes of the donor; the sensitized luminescence of the acceptor can be measured in the background with little or no obstruction, and the signal from the normal donor-acceptor pair / In the background, it produces> 25 times improvement. These improvements make it possible to measure distances greater than 100 mm via LRET. The inventor also reports a measurement of the sensitized luminescence lifetime, which is a measurement completely insensitive to total concentration and incomplete labeling.
In FRET, a fluorescent donor molecule transfers energy to an acceptor molecule (usually a fluorescent molecule) via a non-radioactive dipole-dipole interaction. FRET is a standard spectroscopic analysis technique for measuring distances in the range of 10 to 70 mm. R between donor and acceptor R^-6Depending on the energy transfer, donor lifetime and quantum generation are reduced and acceptor fluorescence is increased or sensitized (1). FRET is often used in both polymer science and structural biology, and has recently been used in the study of macromolecular complexes of DNA, RNA, and proteins (2-4).
Despite their success, FRET had a number of significant drawbacks that limited its utility. First, the maximum distance that can be measured was not optimal for many biological applications. Second, the lifetime of commonly used donor fluorophores is short (generally 2 to 3 nanoseconds), high order index, making lifetime measurements difficult, and limited accuracy. Third, the signal / background of the sensitized emission was low due to fluorescence interference from direct excitation of the donor and acceptor. Fourth, the efficiency of energy transfer depends on the distance R between the donor and acceptor.^-6Not only depends on κ²Because it depends on their relative orientation as expressed by factors, it was difficult to determine the exact distance. (Energy transfer efficiency = 1 / (1 + R⁶/ R₀ ⁶) Where R₀Is κ²Function: see appendix).
The luminescent lanthanide elements, terbium and europium are attractive FRET donors because they potentially eliminate many of these problems. Since lanthanide emission does not cause a transition from a single state to a single state, energy transfer using a lanthanide donor is more accurately referred to as emission resonance energy transfer (LRET). Lanthanides have been used primarily as diffusion-enhanced FRET (difusion-enhanced FRET) as an isomorphous replacement with calcium binding proteins. In addition, Mathis uses Europium cryptate in conjunction with multichromophoric Allophycocanin to produce an extremely large 90 Ｒ R₀(9). The inventor has recently presented results showing the numerous advantages of using europium polycarboxylate-chelates as donors in the context of organic dyes such as CY-5 as acceptors (10). Here, we extend these results to the use of terbium as a donor.
As a model system, the inventors covalently link donors and acceptors to the 5 'end of a series of double-stranded DNA oligomers of various lengths. The use of such model system DNA has previously been shown to be effective for energy transfer measurements between organic dyes (11).
Materials and methods
Synthesis of labeled DNA oligomers. Complementary DNAs of length 10, 12, 14 bases were synthesized using the standard phosphoramidite procedure. An amino group attached via 6 carbon conjugates (Glen Research) was introduced at the 5 'end. The acceptor sequence is that used by Clegg et al. (11): 5'-CCA-CTA-TAG-G-3 '(10 bp); 5'-CCA-CTC-GCT-AGG −3 ′ (12 bp); 5′-CCA-CTG-CTG-CTA-GG-3 ′ (14 bp). Tetramethylrhodamine-isothiocyanate 5-isomer (molecular probe. T-1480: abbreviation: TMR) was coupled by standard methods and purified by reverse phase HPLC. The extinction coefficient of TMR bound to DNA is e₂₆₀= 33mM^-1cm^-1And e₅₅₆= 93mM^-1cm^-1It was decided. The donor strand consisted of complementary DNA labeled at the 5 'end with a terbium chelate. The chelate is diethylenetriaminepentaacetic acid coupled to the laser dye, carbostyril 124 (DTPA-cs124). Details of donor chelate synthesis are given everywhere. An unlabeled DNA oligomer was also synthesized.
Mating conditions: Donor and acceptor strands in the desired ratio, 10 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl₂D with 150 mM NaCl₂Mixed in O-base buffer. Also, the experiment₂This was also done in O-base buffer. The donor strand concentration was approximately 200 nM. The oligomer was annealed by heating to 75 ° C. and cooled to the final temperature (22 ° C. or 5 ° C.) in 15 minutes.
Spectral analysis: Absorption measurements were performed on a Hewlett Packard 8452A spectroanalyzer. Steady state fluorescence measurements were performed with a SPEX Fluorolog fluorometer. Time-resolution and gate emission measurements were performed using a pulsed laser-photonics nitrogen laser (5nsec pulse width, 40Hz repetition rate), laboratory spectrometer using right angle detection, gallium-arsenide photon detection. A Gallium-arsenide photon-counting detector, a gated discriminator (Ortec 584) and a 2 μsec time-resolution multi-channel scalar. Also, energy transfer experiments performed without an analyzer gave the same results as using the analyzer, but also performed polarization analysis. Therefore, the analyzer was usually deleted. A temperature controlled cuvette holder and a quartz 3 mm x 3 mm cuvette were used. Lifespan was adapted using TableCurve software (Jandel Scientific).
Results and examination
The donor chelate, the structure of DTPA-cs124-Tb, and the model system used for energy transfer are shown below.

Donor chelates have several important characteristics. First, the chelate binds very tightly to terbium (and europium). Titration with EDTA exceeding 100 times (K_b≦ 10¹⁷M^-1) Cannot replace measurable amounts of terbium. This is consistent with other DTPA-based chelating agents (12) and confirms the absence of free terbium. Second, chelates allow site specific attachment of terbium to macromolecules. Third, D₂Protects terbium from non-radiative deexcitation mechanisms that result in quantum generation for nearly a single body of terbium emission in O (see Appendix I). Finally, the covalent bond of the laser dye, carbostyril 124, has a very low absorption cross section of terbium (<1M^-1cm^-1). cs124 is light (ε₃₂₈= 11,000M^-1cm^-1Ε₃₃₈= 8,000M^-1cm^-1) And transfer energy to the lanthanides because of the very close position of terbium (13, 14).
Figure 1 shows terbium chelate, efficient energy transfer and D₂65 Å in H (H₂60mm) large R in O₀The spectral characteristics of tetramethylrhodamine leading to R₀Is calculated from the standard formula (see appendix). Here we describe two unique aspects of using lanthanide chelates as donors: 1) Since energy transfer efficiency can be adjusted, R₀Is simply H in a solvent for the particular system being measured.₂O / D₂Optimized by changing the O ratio. H₂O / D₂The O ratio is the lanthanide quantum production (q_D) (D₂Q in O_D≒ 1, H₂Q in O_DBy changing ≒ 0.6, see Appendix I), energy transfer efficiency is affected (15). 2) The orientation dependence of the energy transfer process is minimized because terbium has multiple, altered electron transitions and is therefore an isotropic donor even if it is immobile. This minimizes uncertainty at the distance measured (16) due to the +/− 12% orientation effect in the worst case.
FIG. 1 also shows high spike of terbium emission. Donor annihilation can be measured at 492 nm and 546 nm without interference from acceptor emission. Similarly, the sensitized emission of the acceptor can be measured without noticeable interference from the donor emission, since terbium is almost silent near 570 nm, where the TMR is at 70% of its emission maximum. The terbium signal at 570 nm is its maximum 240x less than at 546 nm.
When measuring sensitized emission, the inventor can also separate the acceptor's direct fluorescence by temporary identification. The inventor uses pulsed excitation, during which time data is collected only after a 90 μsec delay in which the rhodamine time direct fluorescence decays. (Acceptor fluorescence with a lifetime of 2-3 nanoseconds decays rapidly; we also find a small component that decays with a delay of 90 μsec, probably delayed fluorescence or detector artifacts). Because of its millisecond lifetime, the donor remains excited and can transfer energy at the end of the delay period. Therefore, the signal occurring around 570 nm after the delay depends only on the sensitized emission, that is, the acceptor fluorescence depends on the energy transfer.
FIG. 2A shows the results of an energy transfer experiment with 10-mer DNA partially crossed. The average energy transfer is 77%. The signal / background of sensitized emission at 570 nm is 54: 1. For comparison, the signal / background for sensitized luminescence when using fluorescein-rhodamine as an energy transfer pair for the same DNA is approximately unity. The background is so small in the case of the present invention so that a small signal can be measured and hence R₀Larger distances are expected to be possible. For example, Horrocks and Bruno have used 4R for the terbium energy transfer by utilizing the dark background-sensitized luminescence of tyrosine.₀(R₀= 3.1 Å) showed the ability to measure distances (6).
The inventor can isolate the sensitized emission signal from the donor emission, even in regions where the donor emission is significant. In a manner similar to that used by Klegg et al. (11), the inventor can reduce donor emission at all wavelengths while leaving a sensitized emission signal. The efficiency of the transferred energy is simply the area of collective sensitized emission divided by the total collective area:
Energy transfer efficiency = (f_A/ q_A) / (f_A/ q_A+ F_D(1)
Where f_AIs the area under the sensitized emission curve, q_AAcceptor fluorescence quantum generation, and f_DIs the area under the donor emission curve. By comparing with the donor annihilation data, the quantum generation of the acceptor can be determined. Assuming that the quantum generation for TMR is 0.174, Equation (1) has an average energy transfer of 77%.
FIG. 2B shows lifetime data for a series of 10-mer DNA oligomers. The donor-only (single-stranded DNA) signal is a simple index of 2.14 msec lifetime. (Terbium-labeled DNA oligomers hybridized to its complement are a simple index of lifetime of 2.80 msec. The difference in lifetime between double-strand and single-strand terbium-only DNA is also better than different quantum production. Rather, it depends on different radiation velocities arising from the different symmetry surrounding terbium). Titration with increasing amounts of acceptor strands indicates second order donor annihilation (curves B and C). The long-lived component corresponds to non-mating donor-only strand DNA; the short component corresponds to terbium strand DNA mated with acceptor strands. As expected, increasing the amount of acceptor strands increases the width of short components and decreases the width of long components without changing their lifetime (compare curves B and C). The fact that the component for a long time is equal to the signal of the donor alone is an important internal regulation indicating that intermolecular energy transfer is not significant. The short component lifetime corresponds to an ebelian migration at 88% of the donor-acceptor complex (1-331 μsec / 2809 μsec). As a comparison, the energy transfer for the same 10-mer DNA of the same 6 carbon conjugates using a fluorescein-TMR pair is 23% (11).
In calculating the energy transfer efficiency based on the sensitized emission curve, the inventor ignores the short-time component since this depends on the residual signal arising from the direct fluorescence of the acceptor. (The gate was not used for this data). Numerous experiments show that long-term components can be repeated within 10%, usually 2-3%, in the worst case. However, the short-time component is very variable due to very large spikes due to direct fluorescence that cannot be resolved and very short spikes.
With a 2-fold excess of acceptor strands, there are still 10-12% non-mating components. A similar phenomenon is seen with dye-labeled oligomers (17) and in FRET experiments with europium substituted in the chelates of the invention (10). In the case of the present invention, it exists at both 5 ° C. and 22 ° C., so it is not clear whether it is a simple melting temperature phenomenon. The reason for this is under study. This residual non-annihilation donor signal is a fundamental lanthanide photographic physics phenomenon because it requires a non-bonded magnetic dipole transition, a state that does not exist because all terbium (and europium) emissions originate from the same excited state. (18, 19).
FIG. 2B also shows the lifetime of sensitized emission at 570 nm, which corresponds to second order donor annihilation (curve B). The decay of sensitized luminescence is the formula:
y = 33% exp (−t / 45 μsec) + 67% exp (−t / 326 μsec)
Can be accurately matched. The 45 msec component corresponds to direct fluorescence from an acceptor or detector artifact (which can be separated by a gate). The 326 [mu] sec component depends on energy transfer in the donor-acceptor complex and is in very good agreement with the 329-331 [mu] sec donor annihilation component. Note that after approximately 90 μsec, the only species that contributes to sensitized emission is the donor-acceptor complex, not the donor alone or the acceptor alone. This significantly minimizes the problem of incomplete labeling. It is also insensitive to non-energy transfer effects that contribute to the lifetime signal of sensitized emission, total concentration, quantum generation, and donor annihilation.
Table I summarizes lifetime and energy transfer data for 10, 12, and 14 bp long donor-acceptor labeled DNA duplexes.

Data from various experiments show that donor annihilation and sensitized luminescence lifetime for a given length of DNA agree within 10%, usually within 2-3%. As expected, there is a decrease in energy transfer with increasing distance. As a comparison, the inventor illustrates the distance (11) determined by Clegg et al. Using fluorescein-TMR. Both results are consistent with the DNA double helix shape, although different salt states and donor lifetimes lead to different dye positions and hence different measurement distances. The inventor used a model such as a DNA helix cleg to fit the distance of the present invention and bind the dye. With only three points of data, it is impossible to resolve all parameters to unique in the model, but terbium chelates and / or acceptors are still clearly close to the DNA helix. Assuming that good fit to those models is achieved. This reduces the modulation seen in their FRET data, which arises due to the helical shape of the DNA and the fact that their donors and acceptors extend from the helix (19 and 13 respectively). This difference is expected because the long lifetime of the donor of the present invention is expected to allow limited diffusion of donor and acceptor freedom within the limits set by the six carbon conjugates, and charge repulsion Is qualitatively reasonable because of the large ionic strength used here.
In short, the data is consistent with the shape of the double helix DNA if the energy transfer data is derived based on a dipole-dipole forester type mechanism. The many technical advantages of luminescence resonance energy transfer make it a good technique adapted for measurements on biologically interesting macromolecules.
Appendix I
R₀Calculation: distance of the point where 50% of the excited state energy of the donor is transferred to the acceptor, R₀Is calculated from the standard equation (1):
R₀= (8.79 x 10^-FiveJ κ²n^-Fourq_D)^1/6Å (2)
Where q_DIs emission quantum generation for donor emission in the absence of acceptor, and J is donor emission (f_D) And acceptor absorption (e_A) (J = ∫f_Dε_Aλ^Fourdλ) spectral overlap, n is the reflectance and κ²Is the form factor for the relative angle of the two dipoles. Here, the inventor evaluates each term of the formula (2) and examines the uncertainty thereof.
The reflectance, n, varies from 1.33 to 1.39 of many organic molecules in water. Numerical integration is 3.8x10¹⁵nm^FourM^-1J overlap integral. This is an upper limit for J because the 546 nm peak of terbium may arise from an electronic dipole transition as well as a magnetic dipole (19), and the former does not transfer energy significantly (18). The portion of the magnetic dipole contribution can be calculated theoretically (20, 21), or this problem was avoided by using the terbium 492 nm line, known solely as the electron dipole transition (20).
When using organic dyes in FRET,²Is often a significant source of uncertainty, and in the worst case changes from 0 to 4 (22). However, in terbium, the emission is κ²(1/3 <κ²<4/3) arises from multiple electron transitions. Furthermore, the acceptor appears to be able to undergo rotational motion during the millisecond donor lifetime. This is further κ², Corresponding to a rapidly rotating random orientation within the donor lifetime, κ²= 2/3.
Terbium emission quantum production, q_DIs difficult to determine accurately due to the inherently low absorbance of terbium. However, q_DD₂In O it seems very close to 1 (see below). R₀Terbium quantum generation (D₂Note that for O, it is important to use ≈1). The overall chelate quantum production is equivalent to the lanthanide quantum production defining the fraction of energy absorbed by cs 124 that is transferred to the lanthanide.
Quantum generation of lanthanide emission: D₂In O, q_DThere are several lines for a (direct) proof that makes ≈1. First, light emission originates from 4f-4f inner core electrons that are protected from solvents and other sources of non-radiative deexcitation by chelates. 1.2H in the main coordination sphere of terbium in the chelate of the present invention₂O molecules are the main source of non-radiative deexcitation, but they do not inactivate terbium significantly₂Replaced by O (15, 23). Non-water ligands, carboxylate groups and amine nitrogens are very inefficient in inactivating excited terbium (23). Through temperature studies (24), the inventor also searched for the disappearance effect of cs124 and found nothing.
D₂O, q_DThe second line of proof supporting ≒ 1 is H_DObtained from a study by Elbanowski and coworker who directly measured the quantum production of a 1: 3 mixture of terbium: EDTA in O and found a value of 0.54 (25) . This measurement is difficult and the accuracy is unknown, but the H₂Imply high quantum production even in O, D₂Quantum generation in O is expected to be significantly higher. (Maybe there are two water molecules coordinated to terbium in their complexes (23)).
The third line of proof is from an energy transfer experiment using terbium as a donor in thermolysin and as an acceptor in invertebrate calmodulin (8, 26). Then D₂The assumption of single quantum generation at O (sometimes implicit) gives good agreement with X-ray crystallography data.
Appendix II
Calculation of acceptor fluorescence quantum generation: By comparing the donor annihilation lifetime data with the area and using equation (1), it is possible to measure the acceptor quantum generation. This is a general and new method for measuring the quantum production of dyes whose absorption overlaps with the emission of terbium (or europium). This has many advantages over the conventional quantum generation measurement method, which is a measurement that involves only one sample, ie, an accurate sample of the object, rather than comparing its sample controls.
In order to evaluate the TMR quantum generation, the inventor has determined that the unknown in equation (1) is q_AAnd the average efficiency of energy transfer is assumed to be 77.6% from curve C (top). Integration area (f_AFor 620, f_D1032 (arbitrary units)), this is q_A= 0.174. As a comparison, free tetramethylrhodamine in phosphate-buffered saline has a quantum production of 0.25 as measured by standard assays (27).
References in parentheses in Example 1

Example 2
In this example, the inventor presents a technique for fluorescence resonance energy transfer (FRET) by introducing europium chelate as a donor and an organic dye, CY-5, as an acceptor. The use of lanthanide donors in general, and the use of the pair, in particular, has many advantages over conventional FRET pairs that rely solely on organic dyes. R₀Is large and 70 ；; this donor lifetime is a simple exponent and long (D₂The orientation factor that creates uncertainty at the measurement distance is minimized by the multiple electron transition and long lifetime of the donor; the sensitized emission of the acceptor has little or no hindrance in the back It can be measured in the ground and is> 50 times better in signal / background than a normal donor-acceptor pair. This improvement in signal / background is expected to allow measurement of distances greater than 100 mm. The inventor also measures the sensitized emission lifetime, which is an independent measurement for total concentration and incomplete labeling.
The inventor used the luminescent europium chelate as a donor and the organic dye CY-5 as an acceptor. This emission resonance energy transfer (LRET) has several advantages over conventional FRET.². The distance (R at which 50% of the energy travels)₀) Is large 70 ；; the donor lifetime is a simple exponent and long (H₂O, 0.63msec; D₂In O, 2.5 msec), making lifetime measurement easy and accurate; orientation dependence of energy transfer (κ²) Is +/− 12% in the worst case, and is minimized by multiple electron transitions and long lifetimes of the donor, limiting uncertainty at the measurement distance due to orientation effects^ThreeThe sensitized luminescence of the acceptor can be measured in the background with little or no obstacles, with a> 50-fold improvement in signal / background over normal donor-acceptor pairs, and R₀Can measure distances several times^Four. The inventor also measures the sensitized luminescence lifetime, which is independent of total concentration and incomplete labeling.
The inventor has terbium as a donor^FiveAnd europium results are reported here. A schematic diagram of a donor-acceptor model system containing double stranded DNA with a europium chelate at one 5 'end and CY-5 at the other 5' end is shown below:

Starting with europium chelate (diethylenetriaminepentaacetic acid-carbostyril 124-Eu: generic name, DTPA-cs124-Eu), DTPA dianhydride (Sigma), carbostyril 124 (Aldrich) and base protected synthetic DNA And Bailey on the column to ensure that labeling occurs only at the 5 'amino group¹²Built by change in the way. cs124 shows the absorption cross section of europium at about 8000 M at 337 nm when the donor was excited with a pulsed nitrogen laser.^-1cm^-1Effectively increases up to. A 100-fold excess of EDTA did not remove a significant amount of europium from the DTPA-cs124 chelator. The acceptor is CY-5 via standard methods.¹³(Biological Detection System). An unlabeled complementary DNA oligomer was made as a control. All DNA was purified by reversed phase HPLC. In this system, double-stranded DNA oligomers act as stiff strands to establish a defined distance between the europium donor and the CY-5 acceptor. Donor and acceptor attachment points are divided up to 42 が, while the dye position maintains variability limited by the flexible six carbon bonds used for attachment.^6,7
Figure 3 shows D₂In O, 70 Å (H₂R greater than 56mm) in O₀The spectral characteristics are as follows. R₀Is the calculated spectral overlap (J) of 6.55 x 10¹⁵M^-1nm^Four, Orientation coefficient (κ²) 2/3, reflectivity 1.33, and one D₂Quantum generation of europium emission in O (H₂0.25 in O)⁸Based on the standard formula¹Determined from. R₀To calculate the quantification of lanthanide emission rather than the overall chelate quantum generation, and include only those transitions that are electron dipoles in the spectral overlap (J) calculation. is important. Here, the europium emission at 617 nm used for energy transfer is the “enhanced” electron dipole.⁹Therefore, the Forster theory of energy transfer is applicable. Europium emission at 596 nm cannot be coupled to an acceptor because it is a magnetic dipole transition and is therefore not included in the spectral overlap calculation^Ten.
The inventor can measure the sensitized emission of the acceptor without significant interference from donor emission or direct acceptor fluorescence. At 668 nm, europium is almost quiet (europium emission at 668 nm is 120 times less than its 617 nm maximum), and by using pulsed excitation and by opening the detector for 90 msec, the donor complex The direct fluorescence of carbostyril sensitizer and CY-5 is completely separated while the europium remains excited and capable of energy transfer¹¹.
FIG. 4A shows a dark background sensitized luminescence experiment. Here, the donor / acceptor strand ratio is approximately 1: 0.6; we intentionally add fewer acceptors than the donor to show the ability of the system to analyze heterogeneous signals. To do. The average portion of energy transfer in FIG. 4A is 57%. The signal at 668 nm arises from the sensitized emission of CY-5, ie fluorescence that depends only on energy transfer. The inventor calculates the signal / background at 668 nm as 94: 1 (where the background is due to a small amount of europium emission). This is a 50-100 improvement in signal / background over sensitized emission from fluorescein-rhodamine, one of the best donor-acceptor pairs bound to the same 10mer.
FIG. 4B shows life data corresponding to FIG. 4A. The donor-only signal is a simple exponent with a lifetime of 2.52 msec. Donor annihilation fits well to the quadratic exponent (r²= 0.998): y = 63% exp (-t / 0.22 msec) + 37% exp (-t / 2.40 msec). Long-term components correspond to donor-only species. The fact that the long-time component is approximately equal to the lifetime of the donor alone is an internal adjustment indicating that intermolecular energy transfer is at most 5%. The short-time component arises from intermolecular energy transfer in the mating donor-acceptor complex, corresponds to 91% annihilation (1 to 0.22 msec / 2.52 msec), and corresponds to a donor-acceptor distance of 46 mm. (Fluorescein-rhodamine on the same DNA with C-6 conjugate produces 22% energy transfer.⁷). Titration with increasing acceptor concentration increases the short-time component but does not change its lifetime as expected. A 2-fold excess of acceptor strands probably leaves 10% of the component corresponding to the donor-only signal, due to unmated donor strands.
FIG. 4B also shows the lifetime of sensitized emission. The lifetime signal of sensitized luminescence fits the second order index (r²= 0.999): y = 40% exp (-t / 59 μsec) + 60% exp (-t / 0.25 msec). The short time component depends on the direct fluorescence of the acceptor and can be separated by gating the detector. The 0.25 msec component is in good agreement with the short-term component of donor annihilation and depends on 90% energy transfer (1-0.25 msec / 2.52 msec). Very small short time components (≈1%) can be seen directly by donor fluorescence.
In short, luminescence energy transfer yields results that are consistent with Felter's theory assuming that appropriate parameters are used. Big R₀Based on the above, it is possible to measure the easiness and reproducibility of the lifetime measurement of the present invention, excellent signal / background, and a distance significantly larger than 100 mm.
Footnotes in Example 2
(1) Cantor and Schimmel, (1980) Biophysical Chemistry, WH Freeman and Co., San Francisco, Vol. 2; (2) Lanthanides in energy transfer were used in diffusion-enhanced FRET (Stryer, L., Thomas , DD, Meares, Ed., CF (1982) In Annual Review of Biophysics and Bioengineering, LJ Mullins, Ed., Annual Reviews, Inc., Palo Alto, CA, 11: 203-222). They also used multichromophoric allophycocanin (Mathis, (1993) Clin. Chem. 39: 1953) and as an isomorphous substitution with calcium binding proteins (Horrocks et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA (1975), 72: 4764; Cronce and Horrocks, (1992) Biochem, 31: 7963); (3) Stryer, (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846; ) R using sensitized luminescence₀The ability to measure these energy transfers has been demonstrated by Bruno and Horrocks. They used terbium as an acceptor and tyrosine as a donor. 3cm R₀And they measured up to 12cm. (Bruno et al., (1992) Biochem. 31: 7016); (5) Selvin and Hearst, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA (submitted), (6) Cardullo et al., ( 1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 8780; (7) Clegg et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2994; (8) Long lifespan and non-radioactive deactivation. Lack of mechanism, quantum generation is D₂Although it seems to be close to the generation in O, accurate quantum generation is difficult to determine. This assumption gave a distance consistent with X-ray crystallographic studies (see reference 4). H₂In O, 1.3H is present on the main coordination sphere of the chelate of the present invention.₂Quantum production is reduced because of the presence of O molecules (Horrocks and Sudnick, (1979) J. Am. Chem. Soc. 101: 334); (9) Bunzli, JCG (1989) In Lanthanide Probes on life, Chemical and Earth Sciences, Theory and Practice Luminesent Probes; Bunzli JCG & Choppin, GR Ed., Elsevier, New York, pp. 219-293; (10) Dexter, (1953) J. Chem. Phys. 21: 836; (11) Morrison used gate integration to increase the signal to the background of sensitized luminescence with organic dyes (Morrison, (1988) Anal. Biochem. 174: 101; (12) Bailey et al. (1984) Analyst 109: 1449; (13) Mujumdar et al., (1993) Bioconj. Chem. 4: 105.
Example 3: Terbium-fluorescein energy transfer.
This example used a terbium chelate (terbium-diethylenetriaminepentaacetic acid) that transfers energy to fluorescein. The donor and acceptor were modified with a primary amine at the 5 'end. Separated with 8mer DNA double oligonucleotide. The acceptor was attached to the 5 'end of the complementary oligonucleotide. Sensitized luminescence was measured around 520 nm and without background. Furthermore, there is a large R between the 492 nm donor emission line and the fluorescein absorbance.₀There is an excellent duplication that leads to By using a pulsed excitation source and monitoring at 520 nm, any signal arises only from the sensitized emission. 8mer oligonucleotides are used to separate donors and acceptors so that they do not move, and when the oligonucleotide concentration is maintained below about 0.25 μM, sucrose solutions are generally not required, but complex In order to separate the intermolecular interaction, it was immersed in a viscous sucrose solution. The signal / background ratio of sensitized emission at 520 nm is approximately 400: 1. The range of energy transfer based on both donor intensity annihilation and integrated sensitized emission area is 70%. Measurement of the annihilation donor lifetime without acceptor (1.5 msec) and the lifetime of the sensitized emission with the donor-acceptor complex (lifetime 250 μsec) show 85% annihilation. The difference between 70% and 85% depends on the small fraction of unmated donor labeled DNA that cannot transfer energy.
Example 4-Assay for enzyme (proteolytic) activity
Fluorescence resonance energy transfer (FRET) has been used to study enzyme activity such that the distance between two labeled points varies as a function of activity. In general, where FRET is used, LRET can also be used, often with significant improvements. For example, Matsuyoshi et al. (Mayayoshi et al., (1990) Science 247: 954-958) measured HIV protease activity by labeling a substrate peptide with a donor and acceptor on both sides of the protease binding / cleavage site. FRET was used to do this. Because of the close proximity of the donor and acceptor, donor fluorescence with the intact peptide was greatly extinguished. Upon addition of the protease, the peptide was cleaved, the donor and acceptor were diffusely separated from each other, and the donor fluorescence increased approximately 40-fold. The sensitivity of the assay is mainly determined by the extent of donor annihilation with the intact peptide. The lack of 100% extinction causes background fluorescence even in the absence of proteolytic activity. The authors note that they used relatively long-lived (10 nanosecond) donors because this helps increase donor annihilation of the intact peptide. (The reason for this is that the peptide is flexible and the long lifetime makes the peptide time flexible so that the donor and acceptor come close together and the donor disappears).
Replacing the standard fluorescent donor with a lanthanide chelate provides a significantly reduced background and therefore better sensitivity. Lanthanide chelates are> 10 longer than organic fluorophores leading to large donor annihilation due to peptide flexibility^FiveHas double lifespan. Furthermore, any residual donor emission can be separated for several fractions of milliseconds after the pulse by using pulsed excitation and by rotating the detector. When the donor is intact peptide and is extinguished to 90%, for example, the remaining 10% of luminescence has a lifetime of 1/10 of the unannihilated chelate, or approximately 100 μsec. By opening the "detector for 2 to 300 milliseconds", this residual donor emission is prevented from reaching the detector, whereas it occurs after proteolysis and has a lifetime of approximately milliseconds. Light emission is relatively unaffected by the gate.
Finally, the exceptional efficiency of energy transfer from lanthanide chelates to acceptors allows the donor and acceptor attachment points to be located further on the peptide than is possible with standard dyes. This is an important requirement when the enzyme binding site is large.
Example 5-Detection of genes and DNA sequences
FRET has been used to detect specific DNA sequences (Morrison et al., (19899 Analytical Biochemistry 183: 231-244, and Lee et al., (1993) Nuclei Acids Research 21: 3761-3766). The main advantage of using FRET in the application is that this technique is very sensitive (ie can detect one or a few “target” DNA sequences) and can be performed in a homogeneous format. The same technology disclosed by (Lee et al.) Is a product available from Applied Biosystem, known as “Taq-Man.” In this application, the DAN probe complement to the target DNA sequence. Is made with bound donor and acceptor If the probe is intact and single stranded, the donor disappears quickly because the acceptor is in close proximity. When the lobe is mated to the target DAN, the probe is degraded by certain internal or external nucleases, and the donor is then released for diffusive separation from the acceptor, increasing donor fluorescence. No specific degradation occurs and no specific increase in donor fluorescence occurs.
This system can also develop amplification: there are many probe DANA molecules and time unit bindings, and the probes in the double-stranded product are hydrolyzed by nucleases and fluorescence increases. As soon as one probe molecule is degraded, another probe binds and the enzyme repeats this process. Therefore, fluorescence from many probe molecules can be generated for only one target. A variety of external and internal nucleases are compatible for amplification; for example, Applied Biosystems utilize Taq-polymerase with 5 'external nuclease activity. If the probe contains RNA, RNAase H may be used to develop amplification.
In any of these FRET-based systems for DNA detection, replacing the organic dye donor with a lanthanide chelate improves the assay. The extent of donor annihilation with an intact single-strand probe is significantly greater due to the long lifetime of lanthanides and efficient energy transfer. Any residual donor emission can be distinguished by time-gate. The result is a significant background reduction (exactly similar to the protease experiment shown above).
Example 6 Life-Tailored Dye
As mentioned above, lanthanides can be used as luminescent labels in speculum and in general detection. With the use of pulsed excitation and time-delayed detection, the long excited state lifetime (milliseconds) of lanthanides allows the signal to be isolated from background fluorescence that tends to be nanosecond periods. However, the long lifetime has the disadvantage that the signal intensity per molecule is inevitably weak: molecules with an excited state lifetime of 1 msec generate at most 1000 photons / second. This is particularly noticeable at high emission rates, where slow luminescent molecules are saturated. At low emission rates, long lifetimes are not detrimental because any lanthanide is excited at a rate less than the inverse of lifetime. Ideally, it has a light emitting label whose lifetime is tailored to an optimal time scale (long enough for the background to be identified and short enough that the signal intensity is not significantly attenuated). The background tends to have a nanosecond lifetime, for example, microsecond probes allow time-discrimination of signals. Although it has a lifetime 1000 times longer, it is possible to generate more than 1000 times more photons / second than millisecond lanthanides. Such lifetime-tailored dyes can be made by utilizing the luminescence energy transfer between a lanthanide chelate (as a donor) and a fluorescent acceptor. The signal is the emission of the acceptor by energy transfer. This emission lifetime (τ) is equal to the lifetime of the annihilation donor,
τ = τ₀(1-E) (1)
(Where τ₀Is the lifetime of the lanthanide chelate in the absence of an acceptor, and E is the energy transfer coefficient (also called transfer energy efficiency). The distance (R) between the donor and acceptor to achieve a given τ is a formula that has been shown to be applicable to LRET (Selvin et al. (1994) PNAS USA 91: 10024-10028; Selvin et al. J. Amer. Chem. Soc. 116: 6029-6030; Selvin et al. (19949 Methods in Enzymology, K Sauer, ed., Academic Press, Orlando), easily calculated using standard formulas for FRET. Can (Cantor et al., (1980) Biophysical Chemistry, WH Freeman and Co. SF):
E = 1 / [1+ (R / R₀)⁶] (2)
Where R₀Can be calculated from the spectral characteristics of the donor and acceptor. Combining equations (1) and (2) gives the lifetime as a function of the distance between the donor and acceptor:
τ = τ₀/ [1+ (R₀/ R)⁶] (3)
τ₀Is 1.5 msec, at 90% energy transfer, the sensitized emission decays with a lifetime of 150 μsec. With 99% energy transfer, the lifetime is 15 μsec. If a 15 μsec lifetime luminescent label is desired, donors and acceptors should be positioned such that 99% energy transfer occurs. This is 0.465xR₀It corresponds to the distance. For Tb-chelates as donors and tetramethylrhodamine as acceptors (Selvin et al. 1995, above), R₀Is 60Å, which is equivalent to 28Å. The 1.5 μsec lifetime probe is 0.316R for 99.9% energy transfer₀Or, for Tb-chelates and tetramethylrhodamine, this can be achieved by placing a donor and an acceptor at 19 ° apart.
Note that lifetime tailored dyes can generate many different colors. Any acceptor that can take energy from a luminescent lanthanide chelate is possible. Acceptor absorption need not overlap with the main emission line of the lanthanide; the overlap of the weaker emission lines produces very efficient energy transfer as long as the acceptor is placed close enough. R of only 30cm₀A donor / acceptor pair with 99.9% energy transfer at a distance of 9.5 mm. Furthermore, it should be noted that although donor lanthanides have relatively little quantum production for light emission, efficient energy transfer can occur. Terbium and europium quantum production tends to be clearly higher with suitable chelates, but other lanthanides and significantly lower quantum-generated transition elements such as Pr, Nd, Sm, Dy, Ho, Er, Tm and Ru, Os and Sm are also useful donors. Finally, the efficiency of energy transfer is generally high (> 90%) for most photons generated and supplemented in a short time with lanthanides-generated photons or acceptors. In photons, the only significant loss arises from the non-single quantum production of the acceptor. This can be minimized by selecting an acceptor with high quantum generation.
A wide range of different binding molecules may be used to make these lifetime-tailored dyes. In general, the intended conjugate provides an isolation distance of about 4 to 60, preferably about 9 to about 30 mm. The composition of the conjugate is selected based on the needs of the application, for example, the hydrophobic polymerizable conjugate may be used to prepare a membrane permeable dye. Peptides are readily synthesized to useful lengths and their N- and C-termini can be used to join donors and acceptors. By introducing internal aminophenylalanine (or lysine), a reactive isothiocyanate is generated to bind the complex to a biological (or other) polymer. Peptides also have the advantage that the nature of the peptide can be optimized for specific applications; for example, polyproline is very hard and hydrophobic; polylysine is hydrophilic and highly positively charged; On the other hand, polyglutamate or polyaspartate is hydrophilic and negatively charged. Other conjugates include polysaccharides, polyimides and nucleic acids having excellent solubility and reactivity. The polymer may be derivatized to provide an improved binding site, eg, a site where a primary amine can be inserted into a nucleic acid strand and converted to an isothiocyanate group for binding to a macromolecule.
All references and patent applications cited herein are specifically and individually indicated to be incorporated by reference. Although the foregoing invention has been described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, certain changes and modifications may be practiced in the spirit or scope of the appended claims in accordance with the teachings of the invention. What is done without departing from the scope is quite apparent to those skilled in the art.

Claims (15)

増感剤に共有結合したランタニドキレート化剤を含むランタニドキレートであって、該キレートが、少なくとも１０⁶Ｍ^-1の平衡定数でランタニドと結合出来、該キレートと該ランタニドとの錯体が、ランタニド発光を高める事が出来、前記増感剤が、一般式、

（ここで、Ｘは窒素原子である。）
で示され、前記増感剤の第１の位置２又は４の炭素原子が、二重共有結合を介して酸素原子で置換され、第２の位置７の炭素原子が、該増感剤と該キレート化剤とを共有結合する連結基で置換され、
該キレートと、少なくとも１０⁶Ｍ^-1の平衡定数で該キレートと結合出来該ランタニドとの錯体が、該ランタニドである場合よりも、少なくとも５００％大きい発光強度を達成でき、
前記連結基が、アミン基又はカルボキシル基であり、
前記キレート化剤が、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、及び対応するホスホネート同族体ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ及びＮＴＰからなる群から選択されることを特徴とするランタニドキレート。A lanthanide chelate comprising a lanthanide chelator covalently bound to a sensitizer, wherein the chelate can bind to the lanthanide with an equilibrium constant of at least 10 ⁶ M ⁻¹ , and the complex of the chelate and the lanthanide emits lanthanide luminescence The sensitizer has a general formula:

(Here, X is a nitrogen atom. )
The carbon atom at the first position 2 or 4 of the sensitizer is substituted with an oxygen atom via a double covalent bond, and the carbon atom at the second position 7 is Substituted with a linking group that covalently bonds to the chelator;
The chelant can bind to the chelate with an equilibrium constant of at least 10 ⁶ M ⁻¹ , and the lanthanide complex can achieve a luminescence intensity that is at least 500% greater than that of the lanthanide .
The linking group is an amine group or a carboxyl group;
A lanthanide chelate wherein the chelating agent is selected from the group consisting of EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, and the corresponding phosphonate analogs DTPP, EDTP, HDTP, and NTP . 前記第１の位置及び第２の位置と異なる第３の位置が置換されている請求項１に記載のランタニドキレート。The lanthanide chelate according to claim 1, wherein a third position different from the first position and the second position is substituted. 該第３の位置の炭素原子が、位置４炭素原子であり、炭化水素又はハロゲン置換炭化水素で置換されている、請求項２記載のキレート。The chelate of claim 2 , wherein the carbon atom at the third position is a position 4 carbon atom and is substituted with a hydrocarbon or halogen-substituted hydrocarbon. 該増感剤が、２又は４−キノロンである、請求項１記載のキレート。Sensitizer is a 2 or 4-quinolone, chelate of claim 1, wherein. 該増感剤が、カルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）である、請求項１記載のランタニドキレート。Sensitizer is a carbostyril 124 (7-amino-4-methyl-2-quinolone), lanthanide chelates according to claim 1, wherein. 前記キレートと、少なくとも１０ ⁸ Ｍ ^-1 の平衡定数で該キレートと結合出来るランタニドとの錯体が、前記ランタニドである場合よりも、少なくとも５００％の大きい発光強度を達成できる請求項１に記載のランタニドキレート。The lanthanide according to claim 1, wherein a complex of the chelate and a lanthanide capable of binding to the chelate with an equilibrium constant of at least 10 ⁸ M ^-1 can achieve a luminescence intensity of at least 500% higher than that of the lanthanide. Chelate. 前記キレートと、少なくとも１０ ⁸ Ｍ ^-1 の平衡定数で該キレートと結合出来るランタニドとの錯体を含む第一の溶液が、ランタニドを含む第二の溶液よりも、少なくとも５０００％大きい発光強度を達成でき、前記第一及び第二の溶液が、前記第一の溶液における前記キレートの存在と、前記第二の溶液における前記キレートの不存在とを除いて、同一である、請求項１に記載のランタニドキレート。A first solution comprising a complex of the chelate with a lanthanide capable of binding to the chelate with an equilibrium constant of at least 10 ⁸ M ⁻¹ can achieve a luminescence intensity that is at least 5000% greater than a second solution containing lanthanide. The lanthanide of claim 1, wherein the first and second solutions are identical except for the presence of the chelate in the first solution and the absence of the chelate in the second solution. Chelate. 前記ランタニドが、テルビウム又はユーロピウムである、請求項１に記載のランタニドキレート。The lanthanide chelate according to claim 1, wherein the lanthanide is terbium or europium. 前記キレート化剤が、少なくとも１０¹⁰Ｍ^-1の平衡定数で前記ランタニドと結合出来る、請求項１に記載のランタニドキレート。The lanthanide chelate according to claim 1, wherein the chelator is capable of binding to the lanthanide with an equilibrium constant of at least 10 ¹⁰ M ⁻¹ . 前記キレート化剤が、ＤＴＰＡである、請求項１に記載のランタニドキレート。The chelating agent is DTPA, lanthanide chelate according to claim 1. 前記キレートが、高分子に共有結合されている請求項１に記載のランタニドキレート。The lanthanide chelate according to claim 1, wherein the chelate is covalently bonded to a polymer. ランタニドの発光を増強する方法であって、請求項１記載のランタニドキレートと、少なくとも１０ ⁸ Ｍ ^-1 の平衡定数で該キレートと結合する事の出来るランタニドとの混合物を形成し、もって、発光ランタニドキレート−ランタニド錯体を形成することを特徴とする方法。A method for enhancing the luminescence of a lanthanide, comprising forming a mixture of a lanthanide chelate according to claim 1 and a lanthanide capable of binding to the chelate with an equilibrium constant of at least 10 ⁸ M ^-1 Forming a chelate-lanthanide complex. 試料部分に存在するかも知れない被検体を、発光で検出する方法であって、以下の工程、
（１）試料部分を、請求項１記載のランタニドキレートと、少なくとも１０ ⁸ Ｍ ^-1 の平衡定数で該キレートと結合する事の出来るランタニドとの発光錯体と接触させる工程であって、該キレートが、該被検体と選択的に結合する事のできる試薬に共有結合されている工程、
（２）該試薬が該被検体と選択的に結合出来る条件下で、該試料部分を培養する工程、
（３）該試料部分を、該キレートに第一の電子転移を誘発する事のできる第１の波長の光に曝露する工程、
（４）該試料部分からの光の発光を、第２の波長で検出する工程であって、該第２の波長が、該第１の波長より長く且つ該キレートでの第２の電子転移から得られる工程、
を含み、光の該発光の検出が、該被検体試料部分の存在と相関関係にあることを特徴とする方法。A method for detecting an analyte that may be present in a sample portion by luminescence, comprising the following steps:
(1) contacting the sample portion with a luminescent complex of the lanthanide chelate according to claim 1 and a lanthanide capable of binding to the chelate with an equilibrium constant of at least 10 ⁸ M ⁻¹ , A process covalently bound to a reagent capable of selectively binding to the analyte,
(2) culturing the sample portion under conditions that allow the reagent to selectively bind to the analyte;
(3) exposing the sample portion to light of a first wavelength capable of inducing a first electron transfer to the chelate;
(4) detecting light emission from the sample portion at a second wavelength, wherein the second wavelength is longer than the first wavelength and from the second electron transfer at the chelate. The resulting process,
And the detection of the emission of light is correlated with the presence of the analyte sample portion. 試料部分において、第１の位置と第２の位置との間の距離を、発光ランタニドキレートドナーと、有機共鳴エネルギーアクセプターとを使用して共鳴エネルギー移動で検出する方法であって、以下の工程、
（１）該第１の位置に配置された該ドナー及び該第２の位置に配置された該アクセプターを含む試料部分を、該ドナーでの第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長の光に曝露する工程であって、該ドナーが、請求項１記載のランタニドキレートと、少なくとも１０ ⁸ Ｍ ^-1 の平衡定数で該キレートと結合する事の出来るランタニドとの錯体を含み、該ドナーの発光とアクセプターの吸収とのスペクトル重複が、ドナー発光強度又は寿命の検出可能な消滅、又はアクセプター発光強度又は寿命の検出可能な増加によって測定した場合に、該ドナーから該アクセプターへのエネルギー移動を可能とするのに十分である工程、
（２）第２の波長での該試料部分からの光の第１の発光強度であって、該第２の波長が、該第１の波長より長く、該ドナーでの第２の電子転移から得られるものであり、光の該第１の発光強度が、該試料部分の該第１及び第２の位置の間の距離と逆の相関関係にある強度、及び
第３の波長での該試料部分からの光の第２の発光強度であって、該第３の波長が、該第１の波長より長く、該アクセプターでの電子転移から得られるものであり、光の該第２の発光強度が、該試料部分の該第１及び第２の位置の間の距離と相関関係にある強度、の少なくとも１つを検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。A method for detecting a distance between a first position and a second position in a sample portion by resonance energy transfer using a luminescent lanthanide chelate donor and an organic resonance energy acceptor, comprising: ,
(1) A first portion capable of inducing a first electron transfer at the donor using a sample portion including the donor disposed at the first position and the acceptor disposed at the second position. Exposing to a wavelength of light, wherein the donor comprises a complex of a lanthanide chelate according to claim 1 and a lanthanide capable of binding to the chelate with an equilibrium constant of at least 10 ⁸ M ⁻¹ , Energy transfer from donor to acceptor when spectral overlap between donor emission and acceptor absorption is measured by a detectable extinction of donor emission intensity or lifetime, or a detectable increase in acceptor emission intensity or lifetime. A process that is sufficient to enable
(2) a first emission intensity of light from the sample portion at a second wavelength, wherein the second wavelength is longer than the first wavelength and from a second electron transition at the donor The intensity at which the first emission intensity of light is inversely correlated with the distance between the first and second positions of the sample portion, and the sample at a third wavelength. A second emission intensity of the light from the portion, wherein the third wavelength is longer than the first wavelength and obtained from electron transfer at the acceptor, and the second emission intensity of the light Detecting at least one of the intensities correlated with the distance between the first and second positions of the sample portion;
A method comprising the steps of: ポリメラーゼ連鎖反応の状況を監視するために使用される請求項１４に記載の方法であって、
前記試料部が、（１）第一のストランド部分を有するターゲット核酸ストランドと、（２）前記ドナーに共有結合した第一の原子及び前記アクセプターと共有結合した第二の原子を有する診断核酸ストランドとを有し、前記第一及び第二原子が、第二ストランド部分によって分離されており、前記第一及び第二ストランド部分が、アニーリング条件でハイブリダイズするに十分相補性であり、前記第二ストランド部分が、第一及び第二ストランド部がハイブリダイズしない場合の前記ドナーから前記アクセプターへの総エネルギー移動に比べて、前記第一及び第二ストランド部がハイブリダイズする場合の前記ドナーから前記アクセプターへの総エネルギー移動に検出可能な差を提供するのに十分な長さであり、
前記検出可能な差が、ドナー発光の検出可能な消滅又はアクセプター発光の検出可能な増加の少なくとも１つとして測定され、前記第一及び第二原子間の距離が、前記核酸ストランドがハイブリダイズされたかどうかを示す、
方法。15. The method of claim 14 , used to monitor the status of a polymerase chain reaction,
The sample part is (1) a target nucleic acid strand having a first strand portion, and (2) a diagnostic nucleic acid strand having a first atom covalently bonded to the donor and a second atom covalently bonded to the acceptor. Wherein the first and second atoms are separated by a second strand portion, and the first and second strand portions are sufficiently complementary to hybridize under annealing conditions, and the second strand Compared to the total energy transfer from the donor to the acceptor when the first and second strand portions do not hybridize, the portion from the donor to the acceptor when the first and second strand portions hybridize. Is long enough to provide a detectable difference in the total energy transfer of
The detectable difference was measured as at least one of a detectable extinction of donor emission or a detectable increase in acceptor emission, and the distance between the first and second atoms was determined by whether the nucleic acid strand was hybridized. Indicate whether
Method.