請求の範囲
１ ａ 水和コラーゲン格子を形成し、
ｂ 脱イオン骨粉を前記格子中に組込み、
ｃ 前記水和コラーゲン格子を線維芽細胞と接触
さて、そして
ｄ 前記線維芽細胞が前記コラーゲン格子を収縮
させて骨同等物を形成するために十分な条件下
に、前記格子および前記線維芽細胞を維持す
る、
ことにより製造された骨同等物。
技術分野
本発明は、生物学の分野に関し、とくに皮膚の
代わりに使用することができ、あるいは人工器管
の製作に使用できる生きている組織の材料に関す
る。
背景技術
人間の皮膚のかなりの区域の損傷を含む多くの
傷、とくにひどい火傷の場合において、皮膚の機
能のあるものを提供する材料で傷をおおうことが
直ちに必要である。これらの機能は、体液損失の
減少、感染の防止、および潜在的傷跡の区域の減
少を包含する。
この問題を解決するとき用いられてきたアプロ
ーチは、同種移植、変性皮膚異種移植、合成構造
物、または再構成したコラーゲンフイルムの使用
を包含する。これらのアプローチの各々は部分的
成功を提供するが、各々はまた解決されなつた重
大な問題を多くもつ。これらのアプローチの多く
においてとくに重大な問題は、とくに免疫抑制剤
の不存在における、皮膚代替物の拒絶、あるいは
宿主酵素による移植物の破壊であつた。
発明の開示
本発明は、生きている組織を形成できるという
発見に関する。この生きている組織は、水和コラ
ーゲン格子を生体外で形成することにより生成さ
れる。収縮剤の例は、線維芽細胞および血小板で
ある。
皮膚同等物は、この生きている結合組織の基体
（substration）から、その上にケラチノサイト
（keratinocyte）細胞を置き、そしてそれを生育
させることにより生産されうる。この皮膚同等物
は前述の人工皮膚と独特に異なる。なぜなら、そ
の基本的組織化は皮膚のそれに類似し、そして生
きている構成成分の細胞は潜在的移植受容体から
供与されうるからである。
小さい脈管同等物は、ガラス棒または他のマン
ドレルのまわりに平滑筋を含有するコラゲーン格
子を注形し、引き続いて線維芽細胞の外層を注形
し、次いで内皮細胞の内層を配置することによ
り、形成することができる。小さい脈管同等物の
製作における本発明により生産された生きている
組織同等物を用いている特定の手順は、1981年５
月８日出願の同時係属米国特許出願第261928号に
記載されている。
ここに記載する収縮水和コラーゲン格子から、
線／器同等物を形成することもできる。たとえ
ば、小線細縫たとえばパンクレアチンβ細胞をコ
ラーゲン格子上で成長させて、受容体の血流への
インジユリン供給を促進できるすい臓同等物を生
成させることができる。同様に、肝細胞を収縮水
和コラーゲン格子上で成長させて肝同等物を生成
させることができるであろう。
骨同等物を収縮水和コラーゲン格子から形成で
きる。骨同等物は、線維芽細胞で収縮させた水和
コラーゲン格子中へ、脱イオン
（demineralized）骨粉を組込むことによつて製造
される。こうして、分化する骨の究極の形状は型
の形状によつて前もつて決定することができ、こ
の型内で水和コラーゲン格子を形成する材料を注
形する。
こうして、本発明により製造される生きている
組織同等物は、多くの種類および機能の生きてい
る組織、腺および器管の同等物を製造するという
可能性を提供する。このような同等物は、製作
し、そして使用する必要性が生ずるまで在庫品と
して貯蔵することさえできる。
このような組織同等物の主な利点の１つは、期
待されうる拒絶の重大な問題に悩まされないで、
組織同等物の製造に使用した細胞の供与体以外の
宿主においてその組織同等物を使用できるという
ことである。この理由は、生きている組織の製作
に使用する細胞が本発明に従い増殖するとき、受
容体の免疫系による拒絶の原因となる細胞に対し
て選択が行われるからである。さらに、ある種の
細胞は、最近の研究の報告に従うある条件下で組
織培地中に保存されるとき、拒絶を刺激する能力
を失なう。
本発明の他の面において、免疫の受容または拒
絶の測定は前述の組織同等物に基づくことができ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、水和コラーゲン格子の線維芽細胞に
よる収縮を示すデータのプロツトである。第２図
は、コラーゲン含量が異なる水和コラーゲン格子
の線維芽細胞による収縮を示すデータのプロツト
である。第３図は、異なる数の線維芽細胞を含有
する水和コラーゲン格子の線維芽細胞による収縮
を示すデータのプロツトである。第４図は、異な
る集団倍加レベルの細胞を用いる水和コラーゲン
格子への線維芽細胞の収縮能力を示すデータのプ
ロツトである。第５図は、水和コラーゲン格子を
収縮させる線維芽細胞の能力への10.0μｇ／mlの
阻害剤サイトカラシンＢの作用を示すデータのプ
ロツトである。第６図は、水和コラーゲン格子を
収縮させる線維芽細胞の能力への0.36μｇ／mlの
阻害剤コルセミド（colcemid）の作用を示すデー
タのプロツトである。第７図は、水和コラーゲン
格子を収縮させる線維芽細胞の能力へのシトシン
アラビノシドの作用を示すデータのプロツトであ
る。第８図は、4.0単位／mlのトロンビン濃度に
おけるコラーゲン格子の血小板による収縮へのト
ロンビンの作用を示すプロツトである。第９図は
血小板濃度および4.0単位／mlの濃度におけるト
ロンビンの存在の関数としてのコラーゲン格子の
収縮を示すプロツトである。第１０Ａ〜１０Ｄ
は、使用したコラーゲンの種類および濃度の関数
としてコラーゲン格子の格子収縮を示すプロツト
である。第１１図は、血小板による水和コラーゲ
ン格子の収縮への阻害剤サイトカラシンＢおよび
コルセミドの作用を示すプロツトである。
発明を実施する最良の方法
水和コラーゲン格子は、ラツトの尾の腱および
子牛の皮膚のコラーゲンから誘導されたコラーゲ
ンを用いて製造できる。ヒトの胎児の皮膚を包含
するコラーゲンの他の源を使用し、そしてなお他
の源も適当であろう。コラーゲンの溶液を調製
し、わずかに酸性の条件下に維持する。格子は、
線維芽細胞を加え、栄養培地および溶液からコラ
ーゲンのフイブリルを沈澱させるために十分なPH
を上昇させる塩基を用いて、形成する。水和され
たコラーゲン格子の製造は次の文献に詳述されて
おり、それらの教示を引用によつて加える：
Elsdale，T.およびBard，J.，“Collagen
Substrata Far Studies On Cell Blhavior”，J.
Cell Biol．54，626―637（1972）；Ehrmann，
R.L.およびGey，G.O.，“Fhe Growth of Cells
on Ａ Transparent Gel of Reconstituted Rat
―Tail Collagen”，J.Natl. Cancer Inst．，16，
1375〜1403（1956）；Emermann，J.T.および
Pitelka，D.R.，“Hormonal Effects on
Intracellular and Secreted、Casein in
Cultures of Mouse Mammary EPilhelial Cells
on Floating Collagen Membranes，”In Vitro，
13，316―328（1977）；Michalopovlons，G.お
よびPitot，H.C.，“Primary Culture of
Parenchymal Liver Cells on Collaqen
Memfranes，“Exp.Cell Res．94，70―78
（1975）；Gey，G.O.Svotelis，M.，Foord，M.
およびBang，F.B.，“Long―Term Growth of
Chicken Fibroflasts on Ａ Collagen
Substrate，”ExP.Cell Res.，84，63―71
（1974）；およびHillis，W.D.およびBand，F.B.
，“The Cultivation of Human
EmbroyonicLiver Cells，”Exp.Cell Res.，26，
９―36（1962）。
収縮剤としてここに記載する実験において実際
に使用した線維芽細胞は、ヒトの***線維芽細胞
およびモルモツトの皮膚線維芽細胞であつた。他
の源からの線維芽細胞も使用し、そして、事実、
脊椎動物からの線維細胞は水和コラーゲン格子を
収縮するために適当であろう。同時に格子を形成
しかつその中に細胞を配置する便利な技術は、線
維芽細胞を含有する栄養培地を有する培養皿内に
維持された酸性コラーゲン溶液を中和することを
包含する。中和すると、コラーゲンのフイブリル
は溶液から沈澱して、線維芽細胞が均質に全体に
分散した格子を形成する。次いで、細胞をコラー
ゲン格子へ取付けかつそれをもとの大きさの数分
の１に収縮させる条件のもとに、細胞およびコラ
ーゲン格子を維持し、これにより生きている組織
を得る。
水和コラーゲン格子中に線維芽細胞を組込む
と、格子は収縮し、このとき捕捉されていた水は
絞り出される。格子をその上に形成した表面が水
にぬれないとき、たとえば、疎水性の板であると
き、得られる組織は規則正しい形状寸法をもつ。
組織培養板上で、細胞のあるものは格子から移動
し、そして格子の収縮は常に規則正しいというわ
けではない。非湿潤性表面、たとえば、細菌学的
ペトリ皿を使用するとき、格子は、細胞によりそ
の半径が減少するとき、ほとんど完全な円板にと
どまる。
線維芽細胞はコラーゲン格子全体に均質に分散
し、単に格子表面上に存在しないことがわかつ
た。それゆえ、これは人間および他の哺乳動物の
皮膚層をシミユレートする。
細胞の不存在では、格子は半径を変化させな
い。たとえば、栄養培地中で１×106個のヒト包
皮線維芽細胞を５日間成長させることにより調製
した、コンデイシヨニングされた培地は、細胞が
存在しなかつたとき、収縮しなかつた。
細胞を有する収縮したコラーゲン格子は皮膚に
類似する。部分的に収縮したときでさえ、格子は
合理的な密度を有し、容易に取り扱うことができ
る。細胞を用いて構成されると、格子はほとんど
透明であるが、水が排除されかつ直径が減少する
につれて不透明となる。格子面積が20〜30培減少
した後、格子はかたいゴムのコンシステンシー、
白味がかつたピンク色の着色をもち、多少延伸す
ることができ、その時裂けたり、変形することは
ない。
格子の初期直径は、材料の使用量およびそれを
形成するとき用いる板によつて決定される。こう
して、最大の収縮は任意の程度であるが、細胞の
数およびタンパク質の濃度に関係する。
大部分の収縮水和コラーゲン格子はシートとし
て形成したが、他の造形物を形成することができ
る。たとえば、管は環状型内で収縮された格子を
形成することができ、あるいは皮膚の手袋を適当
な型内で製造できるであろう。
生検において得られた、人間の皮膚のケラチノ
サイトを収縮した水和コラーゲン格子上へ付養さ
せた。これは生体外で培養したケラチノサイトを
用いて実施した。ケラチノサイトの配置
（Plating）は、マトリツクスのゲルが形成する
時、格子の収縮の期間中、あるいは収縮が完結し
たいずれの時においても、実施できる。解離した
ケラチノサイトの懸濁液の配置後３日以内に、細
胞は格子表面上に合流層を形成し、そして角化の
過程は角質化層を形成し始め、これにより組織の
流体の損失は防止されるであろう。
線維芽細胞に加えて、他の細胞の収縮剤が存在
する。これらのうちには、平滑筋の細胞、横絞筋
の細胞および心筋の細胞が存在する。
他の収縮剤は血小板であり、これは多くの場合
において、潜在的移植受容体から得ることができ
る。血小板は全血から遠心分離、あるいは全血か
ら血液成分を分離する他の技術により、分離され
る。
血小板による収縮は非常に急速であり、ほとん
どの場合において血小板を含有するコラーゲン格
子の注形後３時間目の終りまでに、流体の約80〜
90％の圧出は完結する。約６時間までに、反応は
通常完結するように見え、平衡に到達し、そして
100％の湿度の条件下にそれ以上の流体の解放は
起こらない。この時点において、典型的には、出
発流体の体積の20〜80％がコラーゲン格子から圧
出されてしまい、精確な量は血小板およびコラー
ゲンの濃度およびある種の他の注形媒質の変数に
依存する。
血小板による格子の収縮速度は、使用するコラ
ーゲンの種類に対して独立であるように思われ
る。血小板濃度を増大すると、収縮速度は加速さ
れ、そして格子の流体は比例して少なくなる。こ
れに関して、血小板の収縮は生きている線維芽細
胞を使用して達成される収縮に種似する。
コントロールされた実験において、阻害剤のサ
イトカラシンＢは格子の収縮が起こらないように
血小板を不活性化することが決定された。サイト
カラシンＢは血小板の円板形を安定化し、偽足の
形成を防止することが知られている。サイトカラ
シンＢの存在下に、血小板を用いないであるいは
用いて格子を注形したとき、格子は収縮しなかつ
た。
他方において、阻害剤のコルセミドは格子の収
縮に対して作用を及ぼさなかつた。これは、コル
セミドがヒト血小板のフイブリン凝固物を収縮さ
せる能力に作用を及ぼさないので、期待された。
十分な数の血小板を有する注形混合物中にトロ
ンビンを含有させると、組織同等物は形成され、
それから流体が急速に排除される。このようにし
て急速に形成した組織同等物は、血小板単独を用
いて、よりゆつくり形成したものと多小異なる性
質をもつ。たとえば、トロンビンを用いないで形
成した対応する組織よりも、その引張り強さは多
少大きくかつその流体含量は多少低い。急速に形
成した組織は、その形成が、血小板濃度および、
コラーゲンに加えて、トロンビンまたはいくつか
の他の血小板解放因子に依存するように思われ
る。他の血小板解放因子は、脂肪酸、ADP、お
よびガンマグロブリンを包含する。
線維芽細胞または血小板のような収縮剤による
格子の収縮は、収縮剤を用いないコラーゲン格子
注形物を比べて、両者を100％の相対湿度の条件
下に維持したとき、コラーゲン格子を比較的高い
引張り強さの組織同等物に転化する。収縮剤を用
いないで注形すると、コラーゲン格子は新鮮なゼ
ラチンのンシステンシーを有し、取り扱うとき分
離して落下する。血小板または細胞により収縮さ
れた格子は、損傷せずに、取り扱い、延伸しかつ
縫伸しかつ縫合することができる。
引張り強さは、所定時間収縮された格子につる
すことができる最大の重りを測定することによ
り、試験した。１つの実施例において、５mlの体
積の格子を直径5.3cmの皿中で形成し、そして線
維芽細胞で約２cmの直径に収縮させた格子は3.5
ｇを７分間支持した。直径5.3cmの皿中で５mlの
体積の他の格子を、血小板により、直径を変化さ
せないで、高さ0.23cmから高さ0.09cmに収縮させ
た格子は11ｇを10分間支持した。
引張り強および他の性質は、使用するコラーゲ
ンおよび収縮剤および他の添加剤の種類および量
を包含する多くのパラメーターの関数であること
が、認められた。ここに記載する研究において、
たとえば、型コラーゲンを用いた。しかしなが
ら、型コラーゲンは追加の引張り強さを皮膚お
よび血管に付与することが知られているので、こ
こに記載するコラーゲン格子に型コラーゲンを
使用すると、引張り強さは増大することが予測さ
れるであろう。同様に、グリコサミノグリカン
類、たとえば、ヒアウロン酸、コンドロイチン４
―サルフエートおよびデルマタン硫酸塩を添加す
ると、引張り強さおよび水程特性が改良されるこ
とがわかつた。
抗生物質、たとえば、ペニシリン、ストレプト
マイシンおよびフアンジゾン（fungizone）を、
必要に応じて、加えて微生物の感染を防止でき
る。
きわめてすぐれた凝着性の大きいならびに小さ
い組織同等物は、血小板単独を用いて、あるいは
血小板および外部から供給される血小板解放因子
を用いるより急速な方法により、形成することが
できる。なぜなら、コラーゲンそれ自体は解放因
子として作用できるからである。血小板による格
子の収縮は厚さの次元においてのみ起こるように
見えるので、最終の大きさおよび形状は注形容器
の形状寸法により決定される。流体含量の平衡時
の厚さは、注形媒質の初期体積によりならびに前
述の、他の変数により決定される。
ここで説明する動物への実験的移植は、オート
ロガス血小板を用いた。血小板はかなりの抗原性
を示すので、異型移植は免疫反応を喚起するであ
ろう。
ここに記載する研究の大部分は収縮されたコラ
ーゲン格子上のケラチノサイト（keratinocyte）
の成長による皮膚同等物の形成に関するが、他の
種類の細胞を格子の上でまたは中で成長させるこ
とができるであろう。例は平滑筋および横絞筋の
細胞、軟骨、骨の細胞、すい臓の細胞、肝細胞な
どである。
骨同等物は、前述にように線維芽細胞で収縮さ
せて調製された水和コラーゲン格子中へ、脱イオ
ン骨粉を組込むことによつて製造できる。皮下に
移植された脱イオン骨粉間の相互作用は、従来記
載されている。Reddi，A.H，およびHuggins，
C.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，69，1601―５
（1972）、その教示を引用によつてここに加える、
参照。骨同等物は、線維芽細胞で収縮させた組織
同等物中に脱イオン骨粉を組込むことによつて製
造できる。これによりこのような組織同等物は任
意の形状に注形することができ、そして組織同等
物は脱イオン骨粉を軟骨および骨に転換させる因
子となる線維芽細胞を全体に含有する。こうし
て、分化する骨および軟骨の究極の形状は、この
ような材料を注形するとき用いる型の形状により
前もつて決定することができる。
詳述すると、従来用いられている酸抽出法によ
り調製された脱イオン骨粉を、ホルモン「カクテ
ル」に加えて、皮膚同等物格子の構成に用いられ
る標準成分と組み合わせる。添加前に、骨粉を70
％のエタノール中で滅菌し、1Xマツコイ
（McCoy）5A媒質で洗浄しかつ一夜ソーキングし
て、それをこの媒質で飽和させる。
人間の皮膚の線維芽胞と、コラーゲン、血清、
およびインシユリン10-8モル、T3（チロキシ
ン）10-7モル、テストステロン１〜２μｇ／mlお
よびソマトメジン（somatomedin）1.0〜10.0μ
ｇ／mlから成るホルモンカクテルを含有する媒質
と組み合わせると、注形用混合物が構成され、こ
れに骨粉を加える。
注形用混合物は、固化および収縮後、形状寸法
が所望のものになる型に注入することができる。
コラーゲンおよび細胞の収縮剤に依存して、５〜
20倍の体積減少が起こる。
ホルモン混合物、経過時間、細胞密度および骨
粉濃度についての要件を試験するために実験を実
施した。変数の各組み合わせから得られる組織同
等物を、組織学的検査のために固定し、準備し
た。線維芽細胞、すなわち、出発細胞の種類は、
軟骨芽細胞、軟骨細胞および鉱化組織の細胞と形
態学的に容易に区別することができ、かつ軟骨細
胞の分泌生産物は適当な着色法により証明するこ
とができるので、組織学単独により実験結果を分
析しかつ評価することが可能であつた。
主要な観察は、線維芽細胞が化生し、かつ軟骨
のマトリツクス特性の分泌において活性である、
軟骨芽細胞および軟骨細胞、すなわち、軟骨表現
型の細胞に分化することであつた。化生の事象の
前に、広範な細胞増殖の波が先行に、脱イオン骨
粉と初め隣接するゾーンにおける細胞密度は非常
に高くなつた。
成分の最適な組み合わせおよび「硬化」時間
は、次ぎの通りである：マツコイ5A組織培地中
において骨粉４〜８mg／／５ml、106細胞／５
ml、3.5mg／mlの型コラーゲン、10％の血清。
最適な培養期間は、試験生成物を１，２および３
週間培養した後、１月である。
観測された分化の段階は、骨の形成に導びく前
駆物質である。この発見の主な実用性は、要求す
る形状に主形された予備骨組織が損傷部分または
疾患部分の代替物の役目をすることができるであ
ろうということである。これらの組織同等物は、
供与体から宿主へ移植される細胞が異型的であつ
てさえ、免疫学的に中性である。また、それら
は、生物学的不凍剤たとえばDMSOを浸潤させた
後、凍結し、貯蔵することができる。
収縮させたコラーゲン格子をコントロール可能
な寸法および／または種々の形状のシートに注形
することを促進するために、ある種の方法および
装置を開発した。収縮剤として線維芽細胞を用い
るとき、拘束しないコラーゲン格子は典型的には
すべての次元に収縮する。しかしながら、ヘリを
固定して保持するシートは厚さの次元においての
み収縮する。
ヘリを拘束するために適当な装置は、ある形状
のステンレス鋼の網から作ることができる。注形
すべき所望の形状物をステンレス鋼の網の中央か
ら切り、次いで過剰のシートをトリミングして除
去し、形状物のまわりの網のほぼ0.5インチ
（1.27cm）をヘリを残す。これはステンレス鋼の
鋼のフレームを形成し、これを非粘着性材料、テ
フロン（Teflon）ポリテトフルオロエチレンで
コーテイングされたパン中へ横たえることがで
き、次いで格子を形成するために使用する成分を
導入する。成分を注入しかつ格子が形成すると
き、格子はステレス鋼の間隙を充填し、それへ定
着されるようになる。格子の細胞要素がコラーゲ
ンのフイブリルを一緒に引くことによりそれを圧
縮するとき格子の体積は減少するが、周辺は固定
されて保持されるので、減少する次元は厚さであ
る。この方法において、格子は流体を失なう。
鋼のフームの特別の利点は、組織同等物の最終
大きさがフレームの内寸法の大きさに精確に相当
しそしてとくに、拘束フレームにより付与された
細胞の配向のため、格子が追加の強さを獲得する
ということである。さらに、格子を長方形のフレ
ーム中で注形する場合、格子をフレームから切り
取つた後でさえ、格子の次元は幅および長さにお
いて変化しないので、注形後１日程度に早い時期
に皮膚同等物の表皮成分を皮膚同等物へ適用し、
こうして患者により提供された生検から皮膚同等
物の移植物を調製するために要する時間を少なく
とも４目短縮することが可能である。
格子の成分をコーテイングされたパン中に注い
で拘束用網をおおうことができる。格子が固化す
るにつれて、それは網中に定着されるので、収縮
時に、長さと幅は末変化にとどまる。長さのみが
減少する。厚さの究極寸法は、(1)格子の初期体
積、(2)細胞濃度および(3)コラーゲン含量の関数で
ある。プロテオグリカン類、たとえば、ヒアルロ
ン酸およびコンドロイチン硫酸塩が存在すると、
収縮は増大しかつ格子の厚さは減少する。皮膚細
胞を上に接種する格子または皮膚同等物を保持す
る長方形の網は、皮膚を必要とする傷へ無傷で適
用することができる。所定位置にあるとき、網の
存在は移植物の一体性を維持することを促進する
ことができるので、網は直ちにあるいはある時間
の経過後に網の内周辺から切ることができる。
皮膚同等物の調製物の皮膚同等物上の表皮の定
着を促進する他の技術および方法は、次のおりで
ある。皮膚同等物をまず注形し、そして針の先端
を通過させかつ長方形のパターンを維持すること
ができるプラスチツクシート、たとえば、テフロ
ン（Teflon）ポリテトラフルオロエチレンのシ
ートを新らしい注形物の上へ横たえる。このプラ
スチツクシートおよび針の先端を１〜４日後に除
去し、次いで注形物に皮膚細胞を接種する。これ
により表皮細胞が流入する穴が形成し、これによ
り表皮と皮膚同等物との間のより大きい表面接触
が提供される。
酵素の解離技術により単離することができる濾
胞細胞および小腺細胞は、表皮細胞の懸濁を接種
して、このような穴を満たすことができるであろ
う。
ここに記載する生きている組織の主要な利点
は、受容体が組織同等物の製造に使用する細胞の
供与体と異なるとき直面する拒絶が存在しないと
いうことである。たとえば、皮膚同等物の移植物
を移植物の受容体の細胞以外の細胞から製作し、
動物の宿主に移植した。前述のように製作した
が、スプレイグ―ダウリー（Sprague―
Dawley）系統のラツトの雌動物からの細胞で組
み立てた皮膚同等物の移植物を、雄のフイツシヤ
ー（Fischer）ラツトの宿主へ移植し、所定位置
へ種々の期間とどまらせた。移植物を取り出す
と、表皮細胞は角化しており〔染色体は表現され
かつカタロクグ化（Catalogue）されている〕そ
して性は決定されている。雌細胞は２つのＸ染色
体の存在により同定されるので、移植された細胞
の存在または不存在は積極的に確証することがで
きる。この手順を用いて、初めに移植された細胞
は異質性にかかわらず皮膚同等物の移植物を居住
させ続け、正常の皮膚の異型移植を行うとき、線
維芽細胞が免疫反応を誘発する細胞ではないこと
を示すことが、決定された。同種異種の拒絶反応
を開始させる種類の細胞は何であつても、それら
は皮膚同等物の移植物中には存在しない。このた
め、移植受容体以外の源からの細胞を用いて皮膚
同等物を製作すること、および臨床的使用または
危急の使用のために移植をいつでも行うことが可
能となる。
自然の組織中に遍在する特殊化された免疫細胞
を用いないで製作される種類の同等移植物は、移
植拒絶の原因である抗原決定因子が同等移植物中
に組み込まれた細胞の表面上に表現されないの
で、拒絶されないであろうと、一般化することが
できる。その不存在のため、宿主の免疫細胞は異
種細胞を感知することができない。これにより、
受容体が必要とする種類の細胞、組織または器管
は、受容体自体がとれらに欠乏するがあるいはそ
れらが存在しないため、変換しあるいは加える機
会が提供される。
ここに記載する組織同等物は、ある供与体から
の所定の細胞の種類が受容体において免疫反応を
誘発するかどうかを決定するための検定に、使用
することもできる。前述のように、種間または種
内の移植においてしばしば直面する型の免疫応答
を引き出す抗原決定因子を、線維芽細胞が含有し
ないという証拠が存在する。前述のように製造さ
れた組織同等物は、免疫応答を誘発する能力が未
知である供与体からの試験細胞を組込むことによ
り用いられるであろう。次いで、このような組織
同等物を供与体に適用して、試験細胞の種類につ
いて免疫応答が起こるかどうかを決定することが
できる。こうして、数百種類の哺乳動物の器管
を、このような検定に組織同等物を用いて、試験
することができるであろう。
次の実施例により、本発明をさらに詳しく説明
する。
実施例 １
組織同等物の製造ｂ線維芽細胞を接種したコラ
ーゲン格子の収縮
粗製コラーゲン溶液を次のようにして調製し
た。体重450ｇのラツトからの凍結したラツトの
尾を、70％のEtOH中で20分間解凍した。腱の束
を70％のEtOH中で層状流のフード内で切除し
た。個の腱をそのさやから引き出し、細かく切
り、希酢酸（１：1000）中に250ml／尾を用いて
入れた。この溶液を４℃において48時間静置し、
その時点で細かく切つた腱は膨潤して全体積を満
たした。この粘稠な溶液を23krpmでベツクマン
（Beckman）Ｌ型超遠心分離器によりSW25ロー
ター内で１時間遠心した。上澄みを抜き出し、４
℃において粗製コラーゲン溶液（タンパク質
“Ｃ”）として貯蔵した。
この粗製コラーゲン溶液を0.1モルのNaOHと
６：１の比で混合して酢酸を中和し、これにより
コラーゲンを沈澱させることによつて、精製され
たコラーゲン溶液を調製した。この溶液を
1500rpmで５分間臨床用遠心分離器で遠心分離し
た。上澄みを廃棄し、等体積の新らしい酢酸
（１：1000）を導入してコラーゲンを可溶化し
た。この溶液を４℃で精製されたコラーゲン溶液
（タンパク質“Ｒ”）として貯蔵した。
タンパク質濃度は、Lowry et alの方法により
測定した。Lowry，O.H.，Rcsebrong，N.J.，
Farr，N.J.およびRandall，R.J.，J.Biol.
Chem．，193，265―314（1956）参照。
タンパク質格子を、線維芽細胞が接着性に劣る
60mmフアルコン（Falcon）細菌学的皿中で調製
した。各皿は次ぎの成分を含有した：1.0mlの5X
マツコイ（McCoy）の5a培地、1.0mlの牛の胎児
の血清、0.25mlの0.1モルのNaOH、1.5mlのコラ
ーゲン溶液、および1.0mlの1Xマツコイの培地中
に懸濁させた線維芽細胞。皿にまず上の体積のマ
ツコインの培地、血清およびNaOHを充填し、次
いで線維芽細胞の懸濁液を調製するまで、横に置
いた。ゲルが直ちに固化し始めるので、コラーゲ
ン溶液および線維芽細胞の同時添加の速度は重要
である。皿をインキユベーターに37℃において５
％のCO2雰囲気のもとに100％の相対湿度で入れ
た。線維芽細胞を組込んだゲルは10分後完全に固
化した。
使用した線維芽細胞は、ヒトの***の線維芽細
胞（系統1519、the Human Genetic Cell
Repository，the Institute for Medical
Research，Camden，New Jerseyから入手し
た）であつた。これらの細胞は、20％の血清、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンで変性したマ
ツコイの5a培地中で成長させかつ維持した。培養
物はマイコピラズマを含有しなかつた。MIT細
胞カルチヤー・センター（Tulture Center）
は、第10の集団倍化レベル（（population
doubling level）（PDL）ごとの細胞を調製しか
つ凍結した。
格子の直径を測定するために、皿を暗色のバツ
クグラウンドにおいて透明なメートル定規の上に
置いた。ゲルのヘリの最適な可視性は、皿のヘリ
に対して水平に白色光を当てることにより得た。
収縮したゲルは良好に形成した円板であつた。こ
れらは種々の点において直径の非常にわずかの差
を示した。長軸および短軸の平均を直径として採
用した
実施例 ２
水和コラーゲン格子の線維芽細胞による収縮の
測定
実施例１の手順に従つて調製かつ570μｇ／ml
のタンパク質“Ｃ”を含有する水和コラーゲン格
子の7.5×106個のヒト***線維芽細胞、株1519、
第19のPDLによる収縮を、測定した。培地は皿に
おいて第１日、第４日および第８日に変えた。得
られたデータを第１図にプロツトする。第１図は
７日をわずかに超る日数における格子面積の112
倍の減少を示す。１日以内で、７倍の収縮が超こ
つた。
実施例 ３
異なるタンパク質濃度の水和コラーゲン格子の
収縮
水和コラーゲン格子中のタンパク質濃度の格子
の収縮への効果を、次のようにして測定した。３
種類のコラーゲン格子を実施例１の手順に従い調
製し、ただし各格子は異なる濃度のタンパク質
“Ｒ”を含有した。ヒト***線維芽細胞、系統
1519、第19のPDLを使用し、そして培地を第４日
に変えた。
得られたデータを第２図に示す。第２図におい
て、格子収縮速度はゲルタンパク質濃度に逆に変
化することがわかる。格子の面積は時間経過とと
もに減少した。
実施例 ４
水和コラーゲン格子の収縮への細胞の数の効果
水和コラーゲン格子の収縮への細胞の数の効果
を、次のようにして測定した。727μｇ／mlのタ
ンパク質“Ｒ”を含有する水和コラーゲン格子の
ある数を、実施例１の手順に従つて調製した。ヒ
ト***線維芽細胞、系統1519を使用し、そして各
培養における培地を第３日、第７日および第10日
に変えた。
細胞を加えない対照を用いた。さらに、４系列
の実験を、異なる数の細胞を加えて、実施した。
得られたデータを第３図に示す。各点は３または
４つの格子の収縮の平均を表わす。偏りはすべて
非常に小さい（＜±1.0mm）ので示さない。
明らかなように、細胞の数か格子の収縮速度へ
ある効果を事実示したが、収縮におけること差は
時間経過とともに有意差が小さくなつた。格子の
直径はある最小値より上の濃度について共通の小
さい数に近づいた。最小値より下において、格子
の収縮速度と細胞の数との間の関係は明確に非直
線であつた。8.1×104個の細胞をもつ格子は、24
時間の間収縮し始めなかつた。これらの希薄に集
団を形成する格子は、実験期間を通じてより密に
集団を形成した格子よりかなり後に遅延した。
実施例 ５
水和コラーゲン格子における異なるPDLの細胞
の収縮能力
集団倍化レベル（PDL）が異なる細胞、すなわ
ち、異なる数の細胞分割を行う細胞、の水和コラ
ーゲン格子を収縮させる能力を、次のように測定
した。実施例１の手順に従つて調製しかつ720μ
ｇ／mlのタンパク質“Ｒ”を含有する水和コラー
ゲン格子から培養物を形成した。培地を第３日、
第７日および第10日に変えた。
対照の培養物は細胞を含有しなかつた。さら
に、異なるPDLの細胞を用いて一系列の実験を実
施した。
収集したデータを第４図にプロツトする。各点
は３または４の格子収縮の平均である。偏りは＜
±1.0mmであつた。明らかなように、第35のPDL
の細胞は第19のPDLの細胞と同じようにすぐれた
能力を有したが、第50のPDLの細胞は釣り合いが
取れた速度で格子を収縮させることができなかつ
た。
実施例 ６
水和コラーゲン格子を収縮させる細胞の能力へ
のサイトカラシンＢの効果
水和コラーゲン格子を収縮させる細胞の能力へ
の阻害剤サイトカランＢの効果を、次のように測
定した。570μｇ／mlのタンパク質“Ｃ”を含有
する水和コラーゲル格子を、実施例１の手順に従
つて調製した。培養物中の線維芽細胞（ヒト包
皮、系統1519、第19のPDL）濃度は、5.0×105で
あつた。10.0μｇ／mlのサイトカラシンＢを各培
養物に加え、そして培地を第４日および第８日に
変えた。
得られたデータを第５図にプロツトする。明ら
かなように、この濃度のサイトカラシンＢは、比
較的高い濃度の細胞を用いたときでさえ、格子の
収縮を完全に遮断した。
実施例 ７
コラーゲン格子の収縮へのコルセミドの効果
タンパク質格子の収縮への阻害剤コルセミドの
効果を、次のように測定した。570μｇ／mlのタ
ンパク質“Ｃ”を含む水和コラーゲン格子含有培
養物を、実施例１の手順に従つて調製した。0.36
μｇ／mlのコルセミドをこれらの各々に加えた
が、ただし対照はコルセミドを含有しなかつた。
同一数の細胞を試験培養物および対照培養物の両
者に加え、そして得られたデータを第６図にプロ
ツトする。この図から明らかなように、第45の
PDL細胞は第19のPDL細胞よりも性能にすぐれた
が、第45のPDL未処理細胞は第19のPDL未処理細
胞よりも遅れた。コルセミドは格子の収縮の速度
および程度を調整するために使用できることが、
明らかである。
実施例 ８
異なるPDLの細胞によるコラーゲン格子の収縮
へのシトシンアラビノシドの効果
異なるPDLレベルの細胞によるタンパク質格子
の収縮への1.0μｇ／mlのシトシンアラビノシド
の効果を、次のように測定した。タンパク質
“Ｃ”を570μｇ／mlの濃度で含有する水和コラー
ゲン格子を含む培養物を、調製した。第19のPDL
または第47のPDLのヒト***線維芽細胞、系統
1519を、シトシンアラビノシドを含有しない対照
とシトシンアラビノシドを含有する試験培養物の
両者に加えた。得られたデータを第７図にプロツ
トする。ここで第47のPDL細胞は低いPDLの細胞
よりも、数が少なくてさえ、性能にすぐれること
が理解できる。これら実験において、シトシンア
ラビノシドを使用してDNA合成をブロツクし、
これにより格子中の細胞の数を一定に保つた。
実施例 ９
ヒト***線維芽細胞およびケラチノサイトを用
いる皮膚同等物の形成
500μｇ／mlのタンパク質“Ｃ”を含有する水
和コラーゲン格子を、実施例１の手順に従つて調
製した。生検において得られたヒト***線維芽細
胞を、EDTAおよびトリプシンを用いて培養板か
ら取り出した。単一細胞の懸濁液を遠心して細胞
を沈降させ、その後細胞も培地中に再懸濁させ、
次いで線維芽細胞を導入した後７日目に水和コラ
ーゲンマトリツクスの上部へ堆積させた。３日以
内に、ケラチノサイト（keratinocyte）細胞は格
子基体へ付着し、そして角化のプロセスが開始し
て、不透過性角質層の形成に導びいた。電子顕微
鏡観察により、形態学的観察を行つた。
実施例 10
モルモツトの皮膚線維芽細胞およびケラチノサ
イトを用いる皮膚同等物を用いる生体内研究
皮膚のバイオプシーをモルモツトについて行
い、そして真皮を表皮から外科的に分離した。真
皮を酵素的に構成細胞に解離し、この細胞を組織
培養皿上へ配置し、増殖させた。各実験動物から
の細胞を別々の皿中に成長させ、こうして同一性
が保存されるようにした。モルモツトからの線維
芽細胞を用いる以外、実施例１の手順に従い、収
縮させた水和コラーゲン格子を形成することによ
り、組織を生体外で構成した。格子のいくつか
を、収縮後、第２バイオプシーから得た表皮細胞
またはケラチノサイトを用いて配置した。ここで
各移植中のケラチノサイトならびに線維芽細胞
は、移植物の受容体となるべき動物からのもので
あつた。
これらの皮膚同等物の移植は実験動物（モルモ
ツト）の背に行い、そしてこのような移植物はす
べてのレベルにおいて１週間以内に一体化したこ
とがわかつた。下から、それらは脈管化した。真
皮のレベルにおいて、移植物のコラーゲンフイブ
リルは取り巻く宿主組織のそれと相互にからみ合
つた。形態学的切片において、移植物は、偏光顕
微鏡で見たとき、取り巻く皮膚のものに比べて、
高い線維芽胞密度および復屈析度の減少により区
別することができた。表皮をもたない移植物は表
皮細胞層（ケラチノサイト）で完全にはおおわれ
ていなかつたが、なお多くの細胞は深かつた。層
は隣接する宿主細胞の層と連続であつた。また、
真皮の傷の収縮は、ちようど自己移植を行つたと
きのように、皮膚同等物の移植物の存在により、
阻止された。
実施例 11
ラツトの皮膚線維芽細胞、真皮細胞および表皮
細胞を用いた、皮膚同等物を用いる生体内研究
真皮同等物の形成
潜在的移植受容体から小さいバイオプシーを
1.0mm2の断片に切つた。線維芽細胞を断片から成
長させ、ラツクス（Lux）組織培養皿で集団形成
させ、そして４〜７日後、断片を取り出し、廃棄
するか、あるいは新らしい板へ移した。１または
２以上の板上の細胞を、ほとんど合流するように
なるまで、増殖させ、次いで細胞をトリプシンの
処理により取り出し、洗浄し、その後組織培養フ
ラスコ内で増殖させた。約５×104個の細胞を各
１cm2の真皮同等物に必要とし、そして適当な数の
細胞を次のようにして注形した。細胞を基質から
トリプシンで取り出し、その後コラーゲン溶液、
ラツトの血清、および組織培養基中に懸濁しかつ
一緒にした。コラーゲンは、ラツトの尾の腱を
0.02モルの酢酸中に抽出しかつ遠心により精製す
ることにより、得た。ある酸性PHおよび1.5mg／
mlのタンパク質濃度を保持すると、コラーゲンは
粘稠なわずかに不透明の溶液であつた。それはコ
ラーゲン型のみから成り、汚染するタンパク質
類はSDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動によ
り検出できなかつた。コラーゲンを細胞および他
の成分と一緒にする時、PHをNaOHで7.2に調整
し、これによりコラーゲンを溶液からフイブリル
の形で析出させた。これが起こるとき、流体を捕
捉したゲルすなわち格子が形成した。格子中の細
胞は格子全体に多少不均一に分布された。細胞に
よるコーゲンフイブリルの活性的圧縮法により、
格子はかたいコンシステンシーの組織に転換され
た。その結果、捕捉された流体は失なわれ、そし
てもとの格子の体積は多数倍減少した。真皮同等
物（DE）を構成する組織が得られた。
表皮の付加
トリプシンによりバイオプシー断片から解離さ
れた表皮細胞を、懸濁液として真皮同等物上へ分
布させた。２〜４日以内に、表皮細胞は真皮下層
をおおう連続シートを形成した。この時間内に、
細胞の合流シートは分化しはじめた。橋小体の結
合、張原線維およびケラトヒアアリン顆粒が現わ
れ、そして角質化の過程が進行し、不透過性角質
層の形成に導びく。全過程は、許されるならば
DE上に生体外で起こるであろう。しかしなが
ら、この研究において、生きている２層の組織
は、皮膚同等物（SE）として作用する合流シー
トを表皮細胞が形成するとすぐに、移植に使用で
きると考えられた。
皮膚同等物を多数のラツトへ移植して、次の結
果が得られた。第１に、移植後３〜５日までに、
移植物の脈管化が始まり、かつ急速に連続し、壊
死や虚血は起こらなかつた。第２に、わずかの例
外を除いて、阻外された移植物は収縮してであろ
う。移植を行うとき、移植物に隣接する正常な皮
膚に刺青して移植物の限界にしるしをした。この
方法により、移植物の経時的寸法を監視すること
ができる。傷の収縮の阻止に対する例外は、表皮
による真皮の不適切な初期のおおい、動物による
移植物の分離、またはコラーゲン調製物の使用量
の関数である不適切な格子の形成を原因としたも
のであろう。
包帯を除去した時（９〜14日）検査した３１の
このような移植物の１つの研究において、７つは
傷の収縮を完全に阻止し、１５は傷の収縮を75％
以上ブロツクしそして23はそれを50％以上ブロツ
クした。
５２の移植物の他の研究において、傷の収縮は
移植物の少なくとも75〜85％においてブロツクさ
れた。
ある数の移植物は時間とともに大きさの減少を
示したが、大部分は60日までに安定化され、そし
て拒絶されたものはなかつた。すぐれた表皮のお
おいを有する大きい大きさ（ほぼ８×12cm）の移
植物は、収縮を効果的にブロツクし（75％以上）
そして火傷した皮膚のすぐれた代替物として作用
した。
移植物は長期間存続しつづけ、最長のものは２
年間にわたつて所定位置に存在した。
良好に脈管化することに加えて、真皮同等物の
マトリツクスは移植後最初の数カ月間かなりの改
造を行つた。その構造の変化を形態学的切片の複
屈析の研究により研究した。この研究から、マト
リツクスは移植後１週間まで複屈析を示すことが
明らかにされ、この現象は匹敵する年令の顆粒組
織においては観測されなかつた。複屈析は時間と
ともに強さが増加したが、パターンは、一般に、
正常の真皮に特徴的なバスケツトウイーブの形状
の１つではなかつた。しかしながら、移植物が正
常組織と出合う遷移区域において10週までに、バ
スケツトウイーブのパターンは発現し始めた。
生体内において、表皮は肥大であり、そして移
植後10週後でさえ、隣接する正常組織よりかなり
厚かつた。舌またはペク（peg）または表皮が真
皮同等物を浸透していることが見られた。外部的
に、数か月の間、表面の出現は多少まれであり、
そして移植物は赤味がかつた着色を有した。約３
か月までに、移植物はなめらかでありかつピンク
色がかり、白ラツトの正常の皮膚に類似したが、
毛をもつていなかつた。ある程度の落屑は７か月
まで持続したが、これは皮脂腺の不存在によるも
のであつたであろう。
実施例 12
血小板によるコラーゲン格子の収縮による組織
同等物の製造
古くなつた血小板濃縮物を赤十字血液センター
（Red Cross Blood Center，Boston，
Massachusetts）から入手した。ラツトおよびブ
タの尾の腱のコラーゲンを実施例１に記載するよ
うにして抽出した。ブタの皮のコラーゲンは、パ
ウル・エールリツヒ博士（Dr.Paul Ehrlich，the
Shriners′ Burns Institute of Boston）から供給
を受けた。ウシのコラーゲンはコラゲン・コーポ
レーシヨン（Collagen Corporation，Palo
Alto，California）から入手した。コラーゲンの
濃度は、Waddel法の修正法により測定した。
Waddel，W.J.，J.Lab and Clin.Med．48，311
―14（1956）参照。次式を使用した：
μｇ／mg＝O.D.214―O.D.225／64.6。
赤十字から入手したとき60Xに濃縮した血小板
濃縮物を、４℃において253ロータを用いるIEC
PR―２遠心機により500rpmで50分間遠心して赤
血球を除去することにより、さらに濃縮した。次
いで、上澄みを同じローターを用いて1500rpmに
おいてさらに50分間遠心して、血小板を濃縮し
た。上澄みを抜き出し、得られた血小板の再懸濁
に使用した。絶対血小板濃度は、供与体の血液中
の血小板濃度に依存して、実験ごとに変化した
が、各実験内のすべての濃度の値は、濃縮し、次
いで希釈した１つ試料またはプールした試料の使
用に基づく。1X血小板濃度は、1.0mlの血液中の
血液中の血小板濃度に等しい。
血小板格子は、次の成分を順番に結合すること
によつて注形した：2.3mlのDMEM、1.76X培地
（Elow Laboratories）、1.5mlのラツトの尾の腱コ
ラーゲン、0.25mlの0.1NのNaOH（コラーゲンを
中和するために要する濃度は、使用したコラーゲ
ン調製物の酸度に依存してわずかに変化した）、
および0.45mlのFBS（Flow Laboratories）。この
混合物を60mmのフアルコン（Falcon）1007ペト
リ皿中に注ぎ、0.5mlの5X血小板濃縮物を小さい
滴で血表面へ適用した。あるいは、すべての成分
を別の容器内で一緒にし、空のペトリ皿中へ注い
だ。得られる格子を37℃および100％の温度にお
いて90％の空気／10％CO2の雰囲気中で培養し
た。格子の厚さは、注形する合計の格子体積を増
減することにより、コントロールした。格子の収
縮速度は、注形手順の関数として差が観測されな
かつた。
収縮速度は次のようにして測定した。格子によ
り解放される流体をまず１mlのピペツト中に抜き
出し、その後大きいものに抜き出し、次いで抜き
出された流体を記録し、その後抜き出された流体
を皿へもどした。これらの測定は格子が最大限に
収縮するまで続けた。1X以下の血小板濃度を有
する格子において、格子のヘリを小さいメスで皿
からまず分離し、格子の下に捕捉された流体を測
定のために遊離させた。格子は裂けるとき追加の
流体を解放するので、格子を損傷しないように注
意して、血小板の収縮だけにより解放された流体
を測定した。また、結合したDMEMコラーゲ
ン、NaOHおよびFBSの添加前に、トロンビンお
よび血小板濃縮物をペトリ皿上へ離散した滴とし
て供給することにより、トロンビン（Sigma
Chemicals）の添加の効果を決定するために、実
験を行つた。
第８図は、トロンビン濃度が4.0単位／mlであ
るときの、コラーゲン格子の血小板による収縮に
対するトロンビンの効果を示す、得られたデータ
のプロツトである。第９図は、血小板濃度および
4.0単位／mlの濃度のトロンビンの存在の関数と
して得られた格子収縮を示すプロツトである。
明らかなように、この反応は非常に急速であ
る。1Xの血小板濃度において、合計の流体の80
〜90％は格子の注形後第３時間までに圧出されて
しまうであろう。６時間までに、反応は本質的に
完結し、かつ平衡が達成される。すなわち、100
％の湿度の条件下で、それ以上の流体の解放は観
察されない。この時点において、初期流体体積の
20〜80％が格子から圧出され、精確な量は血小板
およびコラーゲンの濃度と他の注形媒質の変数に
依存する。血小板の格子収縮のこのプロセスは、
血小板を用いないコラーゲン格子注形物に比べ
て、比較的高い引張り強さの組織同等物を形成す
る。
十分な数の血小板を有する注形混合物にトロン
ビンを含めると、組織同等物は第１図に示すより
も急速に形成するであろう。トロンビンを含有す
る組織同等物は、それを含まない注形物と多少異
なる性質をもち、その引張り強さは多少低くかつ
その流体含量は多少低い。引張り強さは、注形後
組織同等物にグラム重りを結びつけ、破壊時間を
測定することにより測定した。
血小板の格子の収縮速度は、血小板の濃度に関
係する。血小板濃度を増加すると、格子の収縮速
度は加速され、そして比例して少ない流体を有す
る格子が得られ、この事実は、第９図から理解す
ることができる。
実施例 13
血小板による収縮へのタンパク質の濃度および
種類の効果
血小板による格子の収縮へのタンパク質の濃度
および源の効果は、異なる源からのコラーゲンを
異なる濃度で使用するが、それ以外実施例12の手
順に従つて測定した。得られたデータを第１０Ａ
〜１０Ｄ図にプロツトする。
明らかなように、注形媒質のコラーゲン含量を
増加すると、収縮速度および圧出される流体の量
は減少する。これらの結果は、線維芽細胞を収縮
として使用したとき得られた結果に一般に相当す
る。
使用した４種の異なる源からのコラーゲンは同
様に機能したが、ただしテロゲン（telogen）は
他の３種の源からのコラーゲンよりも収縮に対し
てかなり少ない抵抗を提供した。
実施例 14
血小板によるコラーゲン格子の収縮に対する阻
害剤サイトカラシンＢおよびコルセミドの効果
水和コラーゲン格子をを収縮させる血小板の能
力に対する阻害剤サイトカラシンＢおよびコルセ
ミドの効果を、以下の例外を除いて、実施例12の
一般手順に従つて測定した。
サイトカラシンＢ（Sigma Chemicals）およ
びコルセミド（CIBA Pharmaceutical
Company）を濃縮されたDMEM媒質に直接加え
て、５mlの格子体積中の最終濃をそれぞれ10μ
ｇ／mlおよび0.5μｇ／mlとした。得られたデー
タを第１１図にプロツトする。
明らかなように、サイトカラシンＢの存在下に
血小板を有する格子注形物は収縮しなかつた。こ
れに対して、コルセミドは格子収縮に対して見掛
けの効果を示さなかつた。コルセミドはヒト血小
板のフイブリン凝固物を収縮させる能力に対して
作用しないことが知られているので、上の事実は
予測された。他方において、サイトカラシンＢ
は、血小板の円板形の安定化し、かつ偽足の形成
を防止する。
実施例 15
ウサギの移植物
血小板により収縮させた水和コラーゲン格子か
ら形成しかつウサギの耳への移植に適する組織同
等物を、次のようにして製造した。潜在的移植受
容体から心臓穿刺により採取したウサギの血液の
10mlから血小板を集め、そして実施例12に記載す
るように分画遠心分離により濃縮した。ウサギの
血小板を、また実施例12の手順に従い、注形し
た。収縮後、格子に、実施例11の手順に従い同一
ウサギからのバイオプシーにより誘導された表皮
細胞を接種した。
麻酔したウサギを、クラフト部位の毛を切り取
ることによつて、移植のために準備した。移植床
の輪郭を画き、そして輪郭の周辺のちようど外側
に刺青でしるしをした。その部位を70％のエタノ
ールで洗浄し、そして軟骨の上に横たわる筋膜へ
下方に到るすべての組織を除去した。組織同等物
を皿から取り出し、移植床上へ配置し、ここで移
植物のヘリを移植床のヘリとわずかに重なるよう
にした。テルフア（Telfa）パツドをワセリンで
含浸させることにより調製たパラフイン（tulle
gras）で、移植物をおおつた。アール（Earle）
の塩溶液中でソーキングしたテルフアパツドをパ
ラフインの上に配置した。フオームのパツドを耳
において使用して、耳をその形状なホ持し、そし
て耳を３インチ（7.62cm）のエラストプラスト
（Elastplast）包帯をした。ウサギが包帯を除去
することを防ぐために、両方の耳を３インチ
（7.62cm）のエラストプラストで一緒にテープ止
めした。包帯を移植後７日に除去した。ウサギに
エリザベス（Elizabethan）カラーを取り付け
て、さらに２日間引つかきを防止した。
正常な皮膚のヘリと一緒に移植区域を単一片と
してウサギの耳から切除し、0.03モルのリン酸塩
緩衝液中の10％のホルマリン中に浸漬した。皮膚
を一夜固定し、蒸留水ですすぎエタノール中で脱
水し、酢酸アミル中で、次いでトルエン中で清浄
し、パラプラスト（Paraplast）ｔ中に埋め込ん
だ。７ミクロンの切片を回転ミクロトームで切
り、これらをヘマトキシリンおよびエオシンで着
色した。
移植物は、すべての実験において許容されうる
ものであり、傷の収縮を阻止した。全体的に、移
植物は取り巻く皮膚よりも白く見え、表面は多少
ほぼろ落ち、毛をもたなかつた。６週後でさえ、
小さい中央に位置するかさぶたが残つた。
所定位置に６週間存在した移植物を一部分形態
学的に検査し、移植物に取り巻く組織から線維細
胞が浸透する程度を決定した。移植物中の線維芽
細胞の密度は、隣接する組織よりもかなり大きか
つた。移植物は、取り巻く組織から、光学顕微鏡
で見て、複屈析の減少により区別された。移植物
中の脈管化は、隣接組織よりも大きいように見え
た。移植物は二次誘導体、すなわち、毛包および
皮脂腺の不存在により、囲りの組織からさらに区
別された。移植物をおおう表皮は、著しく肥大し
ていた。
実施例 16
ラツトにおける皮膚同等物拒絶の生体内研究皮
膚同等物の形成
皮膚の小片を雌のフイツシヤー（Fischer）―
344ラツト（Charles River Breeding Labs）の
背から取つた。これらのバイオプシーを異質組織
からトリミングし、２〜３mm３片に切り、そして
乾燥してラツクス（Lux）組織培養皿上へ置い
た。バイオプシーから成長した線維芽細胞を、10
％の牛の胎児の血清、ペニシリン、ストレプトマ
イシンおよびフアンジゾン（fungizone）（Flow
Laboratories）を補充したイーグル（Eagle）の
最小必須培地（DMEM）のタルベコ
（Dulbecco）の変性培地中で10％のCO2の雰囲気
のもとに37℃で培養した。
コラーゲン格子を実施例11の手順に従い調製し
た。簡単に述べると、２〜８×105個の線維芽細
胞を、100mmのプラスチツク皿中で、１：1000の
水中酢酸希釈溶液中の濃DMEMプラス10％の牛
胎児血清、抗生物質および６mgのラツトの尾の腱
コラーゲンを一緒にした。１週間以内で、線維芽
細胞はコラーゲン格子を収縮させ、そして新らし
いバイオプシーから解離した表皮細胞の懸濁液を
格子上へ層状に配置した。10-10モルのコレラ毒
素、20μｇ／mlの表皮成長因子および0.4μｇ／
mlのヒドロコルチソンを培地へ加えて、表皮細胞
の成長を促進させ、そして皿を５％のCO2の雰囲
気中へ動かした。１週以内で、表皮細胞はコラー
ゲン格子の表面上に合流するシートを形成し、そ
して皮膚同等物はすぐに移植できる状態であつ
た。
アログラフトを試験するために、格子を雌のス
プレイグ―ダウリイ（Sprague―Dawley）ラツ
トからの細胞を用いて調製し、そして雄のフイツ
シヤー（Fisher）ラツトへ移植した。
移植手順
体重ほぼ350〜400ｇの雄のフイツシヤー・ラツ
トをナトリウムフエノバルビタールで麻酔した。
格子とほぼ同じ大きさの移植床を、各動物の背か
ら全厚さの皮膚を切除することにより準備した。
格子をこの傷中に配置し、ワセリン含浸テルフア
（Telfa）パツドでおおり、そしてテルフア・パツ
ドをアール（Earle）の塩溶液でソーキングし
た。これらの包帯を、体を数層のエラスプラスト
で包装することにより、おおつた。移植を初めに
適用した後９日から13か月の期間において、動物
を再び麻酔し、移植物全体を切除した。移植物の
半分をリン酸塩緩衝ホルマリン中で固定し、エタ
ノール中で脱水し、パラフイン中に埋め込んだ。
移植物の他の半分の中央部分を下層の脂肪組織か
らトリミングし、２〜３mm３片に切り、そして組
織培養基中に入れ、存在する線維芽細胞を成長さ
せた。
核型の調製
移植物から成長した線維芽細胞の集団を継代培
養して急速に分割する細胞の３〜６のＴ―150フ
ラスコを得た。線維芽細胞を２μｇ／mlのコルヒ
チンで４時間処理し、フラスコを振とうし、低張
性媒質（１部のDMEM対３部の蒸留H2O）中で
膨潤させ、ガラススライド上へ空気乾燥させ、そ
してアセト―オルセイン（aceto―orcein）で着
色した。各時点における20〜30の完全な染色体広
がりを写真撮影し、核型（kayrotype）を調製し
て線維芽細胞の合計の集団中の雌細胞比率を決定
した。
スプレイグ―ダウリーの雌細胞を有するドラフ
ト（draft）は、移植１〜２月後に雌細胞の存在
により決定して、雄のフイツシヤー宿主により受
容されかつ保持された。
工業的応用
ここに記載する皮膚同等物は、人間または他の
動物の皮膚の傷の処置に適する。それはとくに広
範囲の火傷に適する。
線維芽細胞による水和コラーゲン格子の収縮
は、収縮力を包含する、線維芽細胞の機能を測定
する検定として用いることもできる。
皮膚同等物、傷の包帯などに加えて、組織同等
物は他の用途のために修正することができる。た
とえば、収縮されたコラーゲン格子は、他の種類
の細胞、たとえば、すい臓の小島細胞の担体とし
て、すい臓機能を有する組織、とくに潜在的受容
体から得られた細胞から製造したもの、の製造に
おいて使用することができるであろう。
さらに、管の他の造形品を、線維芽細胞、心筋
細胞などの細胞を含有する収縮された格子から製
造して、生きている人工器管を形成できるであろ
う。このような人工器管は、たとえば、照射線に
よりまたは化学薬品でさらに処理して、生きてい
ないが、生物分解性人工器管とすることさえでき
るであろう。
同等物
この明細書に記載された特定の反応成分、触
媒、工程、技術などの他の同等物を、日常実験に
より、認識し、あるいは確認することは、当業者
にとつて可能であろう。このような同等物は、以
下の請求の範囲内に包含される。 Claim 1: a forming a hydrated collagen lattice, b incorporating deionized bone powder into said lattice, c contacting said hydrated collagen lattice with fibroblasts, and d said fibroblasts contracting said collagen lattice. maintaining said lattice and said fibroblasts under conditions sufficient to allow the formation of a bone equivalent. TECHNICAL FIELD The present invention relates to the field of biology, and in particular to living tissue materials that can be used in place of skin or for the construction of artificial tubes. BACKGROUND OF THE INVENTION In many wounds involving damage to a significant area of human skin, especially in the case of severe burns, there is an immediate need to cover the wound with a material that provides the functionality of the skin. These functions include reducing body fluid loss, preventing infection, and reducing potential scar area. Approaches that have been used in solving this problem include the use of allografts, modified skin xenografts, synthetic constructs, or reconstituted collagen films. Although each of these approaches has provided partial success, each also has a number of significant problems that remain unresolved. A particularly serious problem with many of these approaches has been rejection of the skin substitute or destruction of the implant by host enzymes, especially in the absence of immunosuppressants. DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to the discovery that living tissue can be formed. This living tissue is produced by forming a hydrated collagen lattice in vitro. Examples of contractile agents are fibroblasts and platelets. A skin equivalent can be produced from this living connective tissue substration by placing and growing keratinocyte cells thereon. This skin equivalent is uniquely different from the artificial skin described above. Because its basic organization is similar to that of the skin, and the cells of the living component can be donated from potential transplant recipients. Small vascular equivalents are created by casting a collagen lattice containing smooth muscle around a glass rod or other mandrel, followed by casting an outer layer of fibroblasts, and then placing an inner layer of endothelial cells. , can be formed. A specific procedure using living tissue equivalents produced according to the present invention in the fabrication of small vascular equivalents was published in May 1981.
No. 261,928, filed May 8th. From the contracted hydrated collagen lattice described here,
Line/vessel equivalents can also be formed. For example, pancreatin beta cells can be grown on a collagen lattice to generate a pancreatic equivalent that can promote receptor indulin delivery to the bloodstream. Similarly, hepatocytes could be grown on contracted hydrated collagen lattices to produce liver equivalents. Bone equivalents can be formed from contracted hydrated collagen lattices. Bone equivalents are produced by incorporating demineralized bone powder into a hydrated collagen lattice contracted with fibroblasts. Thus, the ultimate shape of the differentiated bone can be predetermined by the shape of the mold, within which the material forming the hydrated collagen lattice is cast. The living tissue equivalents produced according to the invention thus offer the possibility of producing equivalents of living tissues, glands and organs of many types and functions. Such equivalents can even be manufactured and stored in inventory until the need for use arises. One of the main advantages of such tissue equivalents is that they do not suffer from the serious problems of rejection that can be expected;
This means that the tissue equivalent can be used in a host other than the donor of the cells used to produce the tissue equivalent. The reason for this is that when the cells used to produce living tissue are grown according to the invention, selection is made against cells that are responsible for rejection by the immune system of the receptor. Additionally, certain cells lose the ability to stimulate rejection when stored in tissue culture under certain conditions in accordance with recent studies reporting. In other aspects of the invention, measurements of immune acceptance or rejection can be based on tissue equivalents as described above. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a plot of data showing the contraction of hydrated collagen lattices by fibroblasts. FIG. 2 is a plot of data showing fibroblast contraction of hydrated collagen lattices with different collagen contents. FIG. 3 is a plot of data showing fibroblast-induced contraction of hydrated collagen lattices containing different numbers of fibroblasts. FIG. 4 is a plot of data showing the ability of fibroblasts to contract into hydrated collagen lattices using cells at different population doubling levels. FIG. 5 is a plot of data showing the effect of the inhibitor cytochalasin B at 10.0 μg/ml on the ability of fibroblasts to contract the hydrated collagen lattice. FIG. 6 is a plot of data showing the effect of the inhibitor colcemid at 0.36 μg/ml on the ability of fibroblasts to contract the hydrated collagen lattice. FIG. 7 is a plot of data showing the effect of cytosine arabinoside on the ability of fibroblasts to contract hydrated collagen lattices. FIG. 8 is a plot showing the effect of thrombin on platelet-induced contraction of collagen lattices at a thrombin concentration of 4.0 units/ml. FIG. 9 is a plot showing collagen lattice contraction as a function of platelet concentration and the presence of thrombin at a concentration of 4.0 units/ml. 10A-10D
is a plot showing the lattice contraction of the collagen lattice as a function of the type and concentration of collagen used. FIG. 11 is a plot showing the effect of the inhibitors cytochalasin B and colcemid on the contraction of hydrated collagen lattices by platelets. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hydrated collagen lattices can be manufactured using collagen derived from rat tail tendon and calf skin collagen. Other sources of collagen may be used, including human fetal skin, and still other sources may be suitable. Prepare a solution of collagen and maintain it under slightly acidic conditions. The grid is
Add fibroblasts, nutrient medium and pH sufficient to precipitate collagen fibrils from the solution.
is formed using a base that raises the The preparation of hydrated collagen lattices is detailed in the following references, the teachings of which are incorporated by reference:
Elsdale, T. and Bard, J., “Collagen
Substrata Far Studies On Cell Blhavior”, J.
Cell Biol. 54 , 626–637 (1972); Ehrmann,
RL and Gey, GO, “Fhe Growth of Cells
on A Transparent Gel of Reconstituted Rat
―Tail Collagen”, J. Natl. Cancer Inst ., 16 ,
1375-1403 (1956); Emermann, J.T. and
Pitelka, DR, “Hormonal Effects on
Intracellular and Secreted, Casein in
Cultures of Mouse Mammary EPilhelial Cells
on Floating Collagen Membranes，” In Vitro ，
13 , 316–328 (1977); Michalopovlons, G. and Pitot, HC, “Primary Culture of
Parenchymal Liver Cells on Collaqen
Memfranes, “ Exp.Cell Res . 94 , 70–78.
(1975); Gey, GOSvotelis, M., Foord, M.
and Bang, F.B., “Long-Term Growth of
Chicken Fibroflasts on A Collagen
Substrate,” ExP.Cell Res. , 84 , 63―71
(1974); and Hillis, W.D. and Band, F.B.
, “The Cultivation of Human
Embroyonic Liver Cells,” Exp.Cell Res. , 26 ,
9-36 (1962). The fibroblasts actually used in the experiments described herein as constrictors were human foreskin fibroblasts and guinea pig skin fibroblasts. Fibroblasts from other sources are also used and, in fact,
Fibrocytes from vertebrates may be suitable for contracting hydrated collagen lattices. A convenient technique to simultaneously form a lattice and place cells therein involves neutralizing an acidic collagen solution maintained in a culture dish with a nutrient medium containing fibroblasts. Upon neutralization, the collagen fibrils precipitate out of solution forming a lattice with fibroblasts homogeneously distributed throughout. The cells and collagen lattice are then maintained under conditions that attach the cells to the collagen lattice and cause it to shrink to a fraction of its original size, thereby yielding living tissue. Incorporation of fibroblasts into a hydrated collagen lattice causes the lattice to contract, squeezing out the trapped water. When the surface on which the lattice is formed is not wettable by water, for example a hydrophobic plate, the resulting structure has a regular geometry.
On tissue culture plates, some of the cells migrate from the lattice, and the contraction of the lattice is not always regular. When using a non-wettable surface, for example a bacteriological Petri dish, the lattice remains almost a complete disc as its radius is reduced by the cells. Fibroblasts were found to be homogeneously distributed throughout the collagen lattice and not simply present on the lattice surface. Therefore, it simulates the skin layers of humans and other mammals. In the absence of cells, the lattice does not change radius. For example, conditioned media prepared by growing 1×10 6 human foreskin fibroblasts for 5 days in nutrient media did not shrink when the cells were absent. A contracted collagen lattice with cells resembles skin. Even when partially deflated, the grid has a reasonable density and can be easily handled. When constructed with cells, the lattice is almost transparent, but becomes opaque as water is excluded and the diameter decreases. After the lattice area decreases by 20-30 times, the lattice becomes a hard rubber consistency,
It has a whitish pink color and can be stretched to some extent without tearing or deforming. The initial diameter of the grid is determined by the amount of material used and the plates used to form it. Thus, the maximum shrinkage is of arbitrary magnitude, but is related to the number of cells and the concentration of protein. Although most contracted hydrated collagen lattices were formed as sheets, other shapes can be formed. For example, the tube could form a contracted lattice within an annular mold, or a skin glove could be manufactured within a suitable mold. Human skin keratinocytes obtained in biopsies were grown onto contracted hydrated collagen lattices. This was performed using keratinocytes cultured in vitro. Plating of keratinocytes can be performed either as the matrix gel forms, during lattice contraction, or when contraction is complete. Within 3 days after placement of a suspension of dissociated keratinocytes, the cells form a confluent layer on the lattice surface, and the cornification process begins to form a cornified layer, which prevents tissue fluid loss. will be done. In addition to fibroblasts, other cellular constrictors exist. Among these there are cells of smooth muscle, cells of the transverse strangles muscle and cells of myocardium. Other contractile agents are platelets, which in many cases can be obtained from potential transplant recipients. Platelets are separated from whole blood by centrifugation or other techniques that separate blood components from whole blood. Contraction by platelets is very rapid, in most cases by the end of the third hour after casting of the platelet-containing collagen lattice, about 80 to 80% of the fluid
90% extrusion is completed. By about 6 hours, the reaction usually appears to be complete, equilibrium has been reached, and
No further fluid release occurs under conditions of 100% humidity. At this point, typically 20-80% of the starting fluid volume has been squeezed out of the collagen lattice, with the exact amount depending on platelet and collagen concentrations and certain other casting medium variables. do. The rate of contraction of the lattice by platelets appears to be independent of the type of collagen used. Increasing the platelet concentration accelerates the rate of contraction and proportionally less fluid in the lattice. In this regard, platelet contraction resembles that achieved using living fibroblasts. In controlled experiments, it was determined that the inhibitor cytochalasin B inactivates platelets such that lattice contraction does not occur. Cytochalasin B is known to stabilize the disc shape of platelets and prevent the formation of pseudopodia. When the lattices were cast in the presence of cytochalasin B, without or with platelets, they did not shrink. On the other hand, the inhibitor colcemid had no effect on lattice contraction. This was expected since colcemid has no effect on the ability of human platelets to contract fibrin clots. Upon inclusion of thrombin in the casting mixture with a sufficient number of platelets, tissue equivalents are formed;
The fluid is then rapidly expelled. Tissue equivalents formed rapidly in this manner have slightly different properties than those formed more slowly using platelets alone. For example, its tensile strength is somewhat greater and its fluid content is somewhat lower than a corresponding tissue formed without thrombin. Rapidly formed tissue, whose formation is associated with platelet concentration and
In addition to collagen, it appears to depend on thrombin or some other platelet-releasing factors. Other platelet releasing factors include fatty acids, ADP, and gamma globulin. Contraction of the lattice by constricting agents such as fibroblasts or platelets can cause the collagen lattice to relatively decrease when both are maintained under conditions of 100% relative humidity compared to collagen lattice casts without the constricting agent. Converted to a high tensile strength tissue equivalent. When cast without shrinkage agents, the collagen lattice has the consistency of fresh gelatin and will separate and fall off when handled. The platelet or cell-contracted lattice can be handled, stretched and sewn and sutured without damage. Tensile strength was tested by measuring the maximum weight that could be suspended from a grid that was contracted for a given period of time. In one example, a lattice with a volume of 5 ml was formed in a 5.3 cm diameter dish, and the lattice contracted with fibroblasts to a diameter of approximately 2 cm was 3.5 ml.
g was supported for 7 minutes. Another grid with a volume of 5 ml in a 5.3 cm diameter dish was shrunk by the platelets from a height of 0.23 cm to a height of 0.09 cm without changing the diameter.The grid supported 11 g for 10 minutes. It has been recognized that tensile strength and other properties are a function of many parameters, including the type and amount of collagen and contracting agents and other additives used. In the research described here,
For example, type collagen was used. However, the use of type collagen in the collagen lattice described here would be expected to increase tensile strength, as type collagen is known to impart additional tensile strength to skin and blood vessels. Probably. Similarly, glycosaminoglycans such as hyauronic acid, chondroitin-4
- Addition of sulfate and dermatan sulfate was found to improve tensile strength and hydraulic properties. Antibiotics, such as penicillin, streptomycin and fungizone,
In addition, microbial infection can be prevented if necessary. Highly cohesive large and small tissue equivalents can be formed using platelets alone or by a more rapid method using platelets and externally supplied platelet release factors. This is because collagen itself can act as a releasing factor. Since contraction of the lattice by platelets appears to occur only in the thickness dimension, the final size and shape are determined by the geometry of the casting container. The thickness at equilibrium fluid content is determined by the initial volume of the casting medium as well as by other variables mentioned above. The experimental transplantation into animals described here used autologous platelets. Since platelets exhibit considerable antigenicity, allogeneic transplants will elicit an immune response. Most of the studies described here focused on keratinocytes on contracted collagen lattices.
However, other types of cells could be grown on or within the lattice. Examples are smooth muscle and transverse strangled muscle cells, cartilage, bone cells, pancreatic cells, liver cells, etc. Bone equivalents can be produced by incorporating deionized bone powder into a hydrated collagen lattice prepared by contraction with fibroblasts as described above. Interactions between subcutaneously implanted deionized bone powder have been previously described. Reddi, A.H., and Huggins,
C., Proc.Nat.Acad.Sci.USA , 69 , 1601-5
(1972), whose teachings are incorporated herein by reference.
reference. Bone equivalents can be produced by incorporating deionized bone powder into fibroblast-contracted tissue equivalents. Such tissue equivalents can thereby be cast into any shape and contain fibroblasts throughout which are responsible for converting deionized bone powder into cartilage and bone. Thus, the ultimate shape of the differentiated bone and cartilage can be predetermined by the shape of the mold used when casting such materials. Specifically, deionized bone meal, prepared by conventional acid extraction methods, is combined with standard ingredients used in the construction of the skin equivalent lattice, in addition to the hormone "cocktail." Bone meal before adding 70
% ethanol, washed with 1X McCoy 5A medium and soaked overnight to saturate it with this medium. Human skin fibrospores, collagen, serum,
and insulin 10 -8 mol, T 3 (thyroxine) 10 -7 mol, testosterone 1-2 μg/ml and somatomedin 1.0-10.0 μg/ml.
When combined with a medium containing a hormone cocktail of g/ml, a casting mixture is formed, to which bone meal is added. After solidification and shrinkage, the casting mixture can be poured into molds of the desired geometry.
Depending on the collagen and cell contracting agent, 5 to
A 20-fold volume reduction occurs. Experiments were conducted to test the requirements for hormone mixture, elapsed time, cell density and bone powder concentration. Tissue equivalents from each combination of variables were fixed and prepared for histological examination. Fibroblasts, i.e. the starting cell type, are
Because chondroblasts, chondrocytes, and cells of mineralized tissue can be easily distinguished morphologically, and the secreted products of chondrocytes can be demonstrated by appropriate staining methods, experiments using histology alone are not possible. It was possible to analyze and evaluate the results. The main observation is that fibroblasts are metaplastic and active in secreting cartilage matrix properties.
They were to differentiate into chondroblasts and chondrocytes, ie, cells of cartilage phenotype. The metaplastic event was preceded by an extensive wave of cell proliferation, and the cell density in the zone initially adjacent to the deionized bone powder became very high. The optimal combination of ingredients and "hardening" time is as follows: 4-8 mg//5 ml of bone powder in Matsukoi 5A tissue medium, 10 6 cells/5
ml, 3.5 mg/ml type collagen, 10% serum.
The optimal incubation period is to incubate the test product at 1, 2 and 3
After culturing for a week, it is January. The observed stages of differentiation are precursors that lead to bone formation. The main practicality of this discovery is that spare bone tissue, shaped to the desired shape, could serve as a replacement for damaged or diseased areas. These tissue equivalents are
Even if the cells transplanted from the donor to the host are atypical, they are immunologically neutral. They can also be frozen and stored after being impregnated with biological antifreeze agents such as DMSO. Certain methods and devices have been developed to facilitate casting contracted collagen lattices into sheets of controllable dimensions and/or shapes. When using fibroblasts as the contracting agent, the unconstrained collagen lattice typically contracts in all dimensions. However, the sheet that holds the edges fixed will only shrink in the thickness dimension. A suitable device for restraining the heli can be made from some form of stainless steel mesh. The desired shape to be cast is cut from the center of the stainless steel mesh, and the excess sheet is then trimmed away, leaving approximately a half inch (1.27 cm) of mesh around the shape. This forms a stainless steel frame that can be laid in a pan coated with a non-stick material, Teflon polytetrafluoroethylene, and then the ingredients used to form the grid. Introduce. When the ingredients are injected and the grid is formed, the grid fills the interstices of the stainless steel and becomes anchored thereto. When the cellular elements of the lattice compress the collagen fibrils by pulling them together, the volume of the lattice decreases, but the periphery remains fixed, so the dimension that is reduced is the thickness. In this way, the grid loses fluid. A particular advantage of steel frames is that the final size of the tissue equivalent corresponds exactly to the size of the internal dimensions of the frame and, in particular, because of the orientation of the cells imparted by the restraining frame, the lattice provides additional strength. This means obtaining the following. Additionally, if the grid is cast in a rectangular frame, the dimensions of the grid do not change in width and length even after the grid is cut from the frame, so that the skin equivalent can be removed as early as one day after casting. applying the epidermal components of to the skin equivalent,
It is thus possible to reduce the time required to prepare a skin equivalent graft from a biopsy provided by a patient by at least 4 orders of magnitude. The ingredients of the grid can be poured into the coated pan and covered with a restraining screen. As the lattice solidifies, it becomes entrenched in the mesh so that upon contraction, the length and width remain unchanged. Only the length decreases. The ultimate dimension of thickness is a function of (1) the initial volume of the lattice, (2) cell concentration, and (3) collagen content. The presence of proteoglycans, such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate,
The shrinkage increases and the grid thickness decreases. A grid or rectangular mesh holding a skin equivalent on which skin cells are seeded can be applied intact to the wound in need of skin. When in place, the presence of the mesh can help maintain the integrity of the implant so that the mesh can be cut from the inner periphery of the mesh immediately or after a period of time. Other techniques and methods for promoting epidermal colonization of skin equivalent preparations on skin equivalents are as follows. The skin equivalent is first cast, and a sheet of plastic, such as Teflon polytetrafluoroethylene, that can be passed through the needle tip and maintain a rectangular pattern is placed over the new cast. Lay down. The plastic sheet and needle tip are removed after 1-4 days and the cast is then inoculated with skin cells. This creates holes into which the epidermal cells flow, thereby providing greater surface contact between the epidermis and the skin equivalent. Follicular cells and glandular cells, which can be isolated by enzymatic dissociation techniques, could be seeded with a suspension of epidermal cells to fill such holes. A major advantage of the living tissue described here is that there is no rejection encountered when the receptor is different from the donor of the cells used to produce the tissue equivalent. For example, a skin equivalent implant is made from cells other than those of the recipient of the implant;
transplanted into an animal host. It was made as described above, but the Sprague dowry
Skin equivalent grafts constructed with cells from female Dawley strain rats were transplanted into male Fischer rat hosts and remained in place for various periods of time. When the implant is removed, the epidermal cells are keratinized (chromosomes are expressed and cataloged) and sex has been determined. Since female cells are identified by the presence of two X chromosomes, the presence or absence of transplanted cells can be positively confirmed. Using this procedure, the initially transplanted cells continue to populate the skin equivalent graft regardless of its heterogeneity, and when performing xenografts of normal skin, fibroblasts are the cells that elicit an immune response. It was decided to show that there was no such thing. Whatever cell types initiate allogeneic rejection, they are not present in the skin equivalent implant. This makes it possible to create skin equivalents using cells from sources other than the transplant recipient and to perform transplants at any time for clinical or emergency use. The type of equivalent implant that is produced without specialized immune cells that are ubiquitous in natural tissues is that the antigenic determinants responsible for transplant rejection are present on the surface of the cells that are incorporated into the equivalent implant. Since it is not expressed in , it can be generalized even though it will not be rejected. Due to its absence, the host's immune cells are unable to sense foreign cells. This results in
Cells, tissues or organs of the type required by the receptors are themselves deficient or absent, providing an opportunity for conversion or addition. The tissue equivalents described herein can also be used in assays to determine whether a given cell type from a donor elicits an immune response in the recipient. As mentioned above, there is evidence that fibroblasts do not contain antigenic determinants that elicit the type of immune response often encountered in interspecies or intraspecies transplants. Tissue equivalents produced as described above will be used by incorporating test cells from a donor whose ability to elicit an immune response is unknown. Such tissue equivalents can then be applied to the donor to determine whether an immune response occurs for the test cell type. Thus, hundreds of mammalian organs could be tested using tissue equivalents in such assays. The following examples further illustrate the invention. Example 1 Production of Tissue Equivalents b Contraction of Collagen Lattice Seeded with Fibroblasts A crude collagen solution was prepared as follows. Frozen rat tails from rats weighing 450 g were thawed in 70% EtOH for 20 minutes. Tendon bundles were excised in a laminar flow hood in 70% EtOH. Individual tendons were pulled from their sheaths, cut into pieces, and placed in dilute acetic acid (1:1000) using 250 ml/tail. This solution was allowed to stand at 4°C for 48 hours,
At that point, the minced tendon swelled to fill the entire volume. This viscous solution was centrifuged for 1 hour at 23 krpm in a Beckman L-type ultracentrifuge in an SW25 rotor. Remove the supernatant, 4
It was stored as a crude collagen solution (Protein "C") at .degree. A purified collagen solution was prepared by mixing this crude collagen solution with 0.1 molar NaOH in a 6:1 ratio to neutralize the acetic acid, thereby precipitating the collagen. This solution
Centrifugation was performed in a clinical centrifuge at 1500 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and an equal volume of fresh acetic acid (1:1000) was introduced to solubilize the collagen. This solution was stored at 4°C as a purified collagen solution (Protein "R"). Protein concentration was measured by the method of Lowry et al. Lowry, OH, Rcsebrong, NJ,
Farr, N.J. and Randall, R.J., J.Biol.
Chem. , 193 , 265–314 (1956). Fibroblasts have poor adhesion to protein lattices.
Prepared in 60 mm Falcon bacteriological dishes. Each dish contained the following ingredients: 1.0 ml of 5X
Fibroblasts were suspended in McCoy's 5a medium, 1.0 ml fetal bovine serum, 0.25 ml 0.1 M NaOH, 1.5 ml collagen solution, and 1.0 ml 1X McCoy's medium. The dish was first filled with the upper volume of pine coin's medium, serum and NaOH and then set aside until the fibroblast suspension was prepared. The speed of simultaneous addition of collagen solution and fibroblasts is important as the gel begins to solidify immediately. Place the dish in an incubator at 37℃ for 5 minutes.
% CO2 atmosphere at 100% relative humidity. The gel incorporating fibroblasts completely solidified after 10 minutes. The fibroblasts used were human foreskin fibroblasts (lineage 1519, the Human Genetic Cell
Repository，the Institute for Medical
Research, Camden, New Jersey). These cells were grown and maintained in Matsukoi's 5a medium modified with 20% serum, penicillin and streptomycin. The culture was free of mycopylasma. MIT Cell Culture Center
is the 10th population doubling level ((population
Cells per doubling level (PDL) were prepared and frozen. To measure the diameter of the grid, the dish was placed on a transparent metric ruler in a dark background. Optimal visibility of the gel edges was obtained by shining a white light horizontally onto the edges of the dish.
The shrunken gel was a well-formed disc. These showed very slight differences in diameter at various points. Example 2 Measurement of contraction by fibroblasts of hydrated collagen lattices, prepared according to the procedure of Example 1 and with a diameter of 570 μg/ml, taking the average of the long and short axes as the diameter
7.5 x 106 human foreskin fibroblasts, strain 1519, in a hydrated collagen lattice containing protein “C” of
Contraction due to the 19th PDL was measured. Media was changed in dishes on days 1, 4 and 8. The data obtained are plotted in FIG. Figure 1 shows the grid area of 112 days for slightly more than 7 days.
Showing a fold decrease. Within one day, the contraction was 7 times greater. Example 3 Contraction of Hydrated Collagen Lattice with Different Protein Concentrations The effect of protein concentration in a hydrated collagen lattice on the contraction of the lattice was determined as follows. 3
Different types of collagen lattices were prepared according to the procedure of Example 1, with each lattice containing a different concentration of protein "R". Human foreskin fibroblasts, lineage
1519, the 19th PDL was used and the medium was changed on the fourth day. The data obtained are shown in FIG. In Figure 2 it can be seen that the lattice contraction rate varies inversely with gel protein concentration. The area of the grid decreased over time. Example 4 Effect of cell number on the contraction of hydrated collagen lattices The effect of cell number on the contraction of hydrated collagen lattices was determined as follows. A number of hydrated collagen lattices containing 727 μg/ml of protein "R" were prepared according to the procedure of Example 1. Human foreskin fibroblasts, line 1519, were used and the medium in each culture was changed on days 3, 7, and 10. A control without added cells was used. Additionally, four series of experiments were performed with different numbers of cells added.
The data obtained are shown in FIG. Each point represents the average of contractions of 3 or 4 grids. All deviations are very small (<±1.0 mm) and are not shown. As can be seen, although there was some effect on the number of cells or the rate of contraction of the lattice, the difference in contraction became less significant over time. The grid diameter approaches a common small number for concentrations above a certain minimum value. Below the minimum, the relationship between lattice contraction rate and cell number was clearly non-linear. A grid with 8.1×10 4 cells has 24
It didn't start to shrink for hours. These sparsely clustered lattices lagged much later than the more densely clustered lattices throughout the experimental period. Example 5 Contraction Capacity of Cells with Different PDLs in a Hydrated Collagen Lattice The ability of cells with different population doubling levels (PDLs), i.e. cells undergoing different numbers of cell divisions, to contract a hydrated collagen lattice was determined as follows: It was measured as follows. Prepared according to the procedure of Example 1 and 720μ
Cultures were formed from hydrated collagen lattices containing g/ml of protein "R". medium on the third day,
Changed on days 7 and 10. Control cultures contained no cells. Additionally, a series of experiments was performed using cells of different PDL. The collected data are plotted in Figure 4. Each point is the average of 3 or 4 grid contractions. The bias is <
It was ±1.0mm. As is clear, the 35th PDL
The cells in the 19th PDL had the same excellent ability as the cells in the 19th PDL, but the cells in the 50th PDL were unable to contract the lattice at a commensurate rate. Example 6 Effect of Cytochalasin B on the Ability of Cells to Contract the Hydrated Collagen Lattice The effect of the inhibitor cytochalasin B on the ability of cells to contract the hydrated collagen lattice was determined as follows. A hydrated collagen gel grid containing 570 μg/ml of protein "C" was prepared according to the procedure of Example 1. The concentration of fibroblasts (human foreskin, line 1519, PDL 19) in the culture was 5.0×10 5 . 10.0 μg/ml cytochalasin B was added to each culture and the medium was changed on days 4 and 8. The data obtained are plotted in FIG. As can be seen, this concentration of cytochalasin B completely blocked lattice contraction even when relatively high concentrations of cells were used. Example 7 Effect of colcemid on contraction of collagen lattice The effect of the inhibitor colcemid on contraction of protein lattice was determined as follows. A hydrated collagen lattice-containing culture containing 570 μg/ml protein “C” was prepared according to the procedure of Example 1. 0.36
μg/ml colcemid was added to each of these, except for the control, which contained no colcemid.
Identical numbers of cells are added to both test and control cultures and the data obtained is plotted in FIG. As is clear from this figure, the 45th
The PDL cells outperformed the 19th PDL cells, but the 45th PDL-untreated cells lagged behind the 19th PDL-untreated cells. Colcemid can be used to adjust the rate and degree of lattice contraction;
it is obvious. Example 8 Effect of Cytosine Arabinoside on the Contraction of Collagen Lattice by Cells with Different PDLs The effect of 1.0 μg/ml cytosine arabinoside on the contraction of protein lattices by cells with different PDL levels was determined as follows. did. Cultures containing hydrated collagen lattices containing protein "C" at a concentration of 570 μg/ml were prepared. 19th PDL
or 47th PDL human foreskin fibroblasts, lineage
1519 was added to both control cultures containing no cytosine arabinoside and test cultures containing cytosine arabinoside. The data obtained are plotted in FIG. Here, it can be seen that the 47th PDL cells have better performance than cells with a lower PDL, even though they are fewer in number. In these experiments, cytosine arabinoside was used to block DNA synthesis and
This kept the number of cells in the lattice constant. Example 9 Formation of a skin equivalent using human foreskin fibroblasts and keratinocytes A hydrated collagen lattice containing 500 μg/ml protein “C” was prepared according to the procedure of Example 1. Human foreskin fibroblasts obtained in biopsies were removed from culture plates using EDTA and trypsin. The single cell suspension was centrifuged to sediment the cells, after which the cells were also resuspended in the medium;
Fibroblasts were then deposited on top of the hydrated collagen matrix 7 days after introduction. Within 3 days, keratinocyte cells attached to the lattice substrate and the process of cornification began, leading to the formation of an impermeable stratum corneum. Morphological observations were made by electron microscopy. Example 10 In Vivo Studies Using Skin Equivalents Using Guinea Pig Dermal Fibroblasts and Keratinocytes Skin biopsies were performed on guinea pigs and the dermis was surgically separated from the epidermis. The dermis was enzymatically dissociated into constituent cells, which were placed onto tissue culture dishes and allowed to grow. Cells from each experimental animal were grown in separate dishes, thus preserving identity. Tissue was constructed ex vivo by forming a contracted hydrated collagen lattice following the procedure of Example 1, except that fibroblasts from guinea pigs were used. Some of the grids were placed with epidermal cells or keratinocytes obtained from a second biopsy after deflation. The keratinocytes as well as fibroblasts in each transplant were from the animal that was to become the recipient of the transplant. Implants of these skin equivalents were performed on the backs of experimental animals (guinea pigs) and such implants were found to integrate within one week at all levels. From below they were vascularized. At the level of the dermis, the collagen fibrils of the implant were intertwined with those of the surrounding host tissue. In morphological sections, the implants were compared to that of the surrounding skin when viewed under a polarized light microscope.
It could be distinguished by high fibrospore density and decreased degree of bifurcation. Implants without epidermis were not completely covered with a layer of epidermal cells (keratinocytes), but many cells were still deep. The layer was continuous with the adjacent host cell layer. Also,
The shrinkage of the dermal wound is due to the presence of the skin equivalent graft, just as in the case of autografting.
blocked. Example 11 In Vivo Studies Using Skin Equivalents Using Rat Dermal Fibroblasts, Dermal Cells, and Epidermal Cells Formation of Dermal Equivalents Small biopsies were taken from potential transplant recipients.
Cut into 1.0 mm 2 pieces. Fibroblasts were grown from the fragments and clustered in Lux tissue culture dishes, and after 4-7 days the fragments were removed and either discarded or transferred to new plates. Cells on one or more plates were allowed to grow until nearly confluent, then the cells were removed by treatment with trypsin, washed, and then grown in tissue culture flasks. Approximately 5×10 4 cells were required for each 1 cm 2 dermal equivalent, and the appropriate number of cells were cast as follows. Cells were removed from the matrix with trypsin, followed by collagen solution,
Rat serum, and tissue culture medium were suspended and combined. Collagen makes rat tail tendons
Obtained by extraction into 0.02 molar acetic acid and purification by centrifugation. A certain acidic PH and 1.5mg/
ml protein concentration, the collagen was a viscous, slightly opaque solution. It consisted only of collagen types, and no contaminating proteins could be detected by electrophoresis on SDS polyacrylamide gels. When the collagen was combined with cells and other components, the pH was adjusted to 7.2 with NaOH, which caused the collagen to precipitate out of solution in the form of fibrils. When this occurred, a gel or lattice formed that trapped the fluid. Cells in the grid were distributed somewhat unevenly throughout the grid. Through active compaction of cogen fibrils by cells,
The lattice was converted into a tissue of hard consistency. As a result, the trapped fluid was lost and the original lattice volume was reduced many times. Tissue constituting the dermal equivalent (DE) was obtained. Addition of the epidermis Epidermal cells dissociated from the biopsy fragments with trypsin were distributed onto the dermal equivalent as a suspension. Within 2-4 days, epidermal cells formed a continuous sheet covering the subdermal layer. Within this time,
The confluent sheet of cells began to differentiate. Connections of pontine bodies, tension fibrils and keratohyaline granules appear, and the process of keratinization proceeds, leading to the formation of an impermeable stratum corneum. The whole process, if allowed
would occur in vitro on DE. However, in this study, living bilayer tissue was considered available for transplantation as soon as the epidermal cells form a confluent sheet that acts as a skin equivalent (SE). Skin equivalents were transplanted into a large number of rats and the following results were obtained. First, by 3 to 5 days after transplantation,
Vascularization of the graft began and continued rapidly, without necrosis or ischemia. Second, with few exceptions, blocked implants will shrink. When the graft was performed, the limits of the graft were marked by tattooing on the normal skin adjacent to the graft. This method allows for monitoring the dimensions of the implant over time. Exceptions to prevention of wound contraction are due to inadequate initial covering of the dermis by the epidermis, detachment of the implant by the animal, or inadequate lattice formation as a function of the amount of collagen preparation used. Probably. In one study of 31 such implants tested when the dressing was removed (9-14 days), 7 completely prevented wound contraction and 15 inhibited wound contraction by 75%.
and 23 blocked it by more than 50%. In another study of 52 implants, wound contraction was blocked in at least 75-85% of the implants. Although some implants showed a decrease in size over time, most were stabilized by 60 days and none were rejected. Large size (approximately 8 x 12 cm) implants with excellent epidermal covering effectively blocked shrinkage (more than 75%).
and acted as an excellent substitute for burnt skin. Implants persist for long periods of time, the longest being 2
It remained in place for many years. In addition to being well vascularized, the dermal equivalent matrix underwent considerable remodeling during the first few months after implantation. Its structural changes were studied by birefringence study of morphological sections. This study revealed that the matrix exhibits birefringence up to one week after implantation, a phenomenon that was not observed in granular tissues of comparable age. Although the birefringence increased in strength over time, the pattern generally
It did not have one of the basket weave shapes characteristic of normal dermis. However, by week 10, a basketweave pattern began to develop in the transition zone where the implant meets normal tissue. In vivo, the epidermis was hypertrophic and was significantly thicker than adjacent normal tissue even 10 weeks after implantation. The tongue or peg or epidermis was seen penetrating the dermal equivalent. Externally, for several months the appearance of the surface is somewhat rare,
The implant had a reddish coloration. Approximately 3
By months, the implants were smooth and pinkish, resembling the normal skin of albino rats;
It had no hair. Some desquamation persisted for up to 7 months, but this may have been due to the absence of sebaceous glands. Example 12 Production of Tissue Equivalents by Contraction of Collagen Lattice by Platelets Aged platelet concentrates were collected at the Red Cross Blood Center, Boston.
Obtained from Massachusetts. Collagen from rat and pig tail tendons was extracted as described in Example 1. Collagen from pig skin is produced by Dr. Paul Ehrlich, the
Shriners' Burns Institute of Boston). Bovine collagen is produced by Collagen Corporation (Palo
Alto, California). Collagen concentration was measured by a modified Waddel method.
Waddel, WJ, J.Lab and Clin.Med . 48 , 311
-14 (1956). The following formula was used: μg/mg=OD214−OD225/64.6. Platelet concentrate, concentrated 60X when obtained from the Red Cross, was subjected to IEC using a 253 rotor at 4°C.
It was further concentrated by centrifugation at 500 rpm for 50 minutes in a PR-2 centrifuge to remove red blood cells. The supernatant was then centrifuged for an additional 50 minutes at 1500 rpm using the same rotor to concentrate platelets. The supernatant was removed and used to resuspend the platelets. Absolute platelet concentrations varied from experiment to experiment, depending on the platelet concentration in the donor's blood, but all concentration values within each experiment were calculated using concentrated and then diluted single samples or pooled samples. Based on use. 1X platelet concentration is equal to the concentration of platelets in blood in 1.0 ml of blood. Platelet lattices were cast by combining the following components in sequence: 2.3 ml DMEM, 1.76X medium (Elow Laboratories), 1.5 ml rat tail tendon collagen, 0.25 ml 0.1N NaOH. (The concentration required to neutralize collagen varied slightly depending on the acidity of the collagen preparation used).
and 0.45 ml FBS (Flow Laboratories). The mixture was poured into a 60 mm Falcon 1007 Petri dish and 0.5 ml of 5X platelet concentrate was applied in small drops to the blood surface. Alternatively, all ingredients were combined in a separate container and poured into an empty Petri dish. The resulting grids were incubated in an atmosphere of 90% air/10% CO 2 at 37° C. and 100% temperature. The thickness of the lattice was controlled by increasing or decreasing the total lattice volume cast. No differences in the shrinkage rate of the lattice were observed as a function of casting procedure. The shrinkage rate was measured as follows. The fluid released by the grid was first withdrawn into a 1 ml pipette and then into a larger pipette, then the fluid withdrawn was recorded, and then the withdrawn fluid was returned to the dish. These measurements continued until the lattice was maximally contracted. For grids with platelet concentrations below 1X, the edges of the grid were first separated from the dish with a small scalpel to free the fluid trapped under the grid for measurement. Since the lattice releases additional fluid when it ruptures, care was taken not to damage the lattice and the fluid released by platelet contraction alone was measured. Additionally, thrombin (Sigma
Experiments were conducted to determine the effect of adding chemicals. FIG. 8 is a plot of the data obtained showing the effect of thrombin on platelet-induced contraction of the collagen lattice when the thrombin concentration was 4.0 units/ml. Figure 9 shows platelet concentration and
Figure 2 is a plot showing the resulting lattice contraction as a function of the presence of thrombin at a concentration of 4.0 units/ml. As can be seen, this reaction is very rapid. At 1X platelet concentration, 80 of the total fluid
~90% will have been squeezed out by the third hour after casting the grid. By 6 hours, the reaction is essentially complete and equilibrium is achieved. i.e. 100
% humidity, no further fluid release is observed. At this point, the initial fluid volume is
20-80% is expressed through the lattice, the exact amount depending on platelet and collagen concentrations and other casting medium variables. This process of platelet lattice contraction is
Forms tissue equivalents with relatively high tensile strength compared to collagen lattice castings without platelets. When thrombin is included in the casting mixture with a sufficient number of platelets, tissue equivalents will form more rapidly than shown in FIG. Tissue equivalents containing thrombin have somewhat different properties than casts that do not contain thrombin, with their tensile strength being somewhat lower and their fluid content being somewhat lower. Tensile strength was measured by tying a gram weight to the tissue equivalent after casting and measuring the time to failure. The rate of contraction of the platelet lattice is related to the platelet concentration. Increasing the platelet concentration accelerates the rate of contraction of the lattice and results in a lattice with proportionally less fluid, a fact that can be seen from FIG. Example 13 Effect of protein concentration and type on contraction of platelets by platelets The effect of protein concentration and type on contraction of lattices by platelets was demonstrated using collagen from different sources at different concentrations, but otherwise as described in Example 12. Measurements were made according to the procedure. The obtained data is 10A
- Plot on Figure 10D. As can be seen, increasing the collagen content of the casting medium decreases the rate of contraction and the amount of fluid expressed. These results generally correspond to those obtained when fibroblasts were used as contractiles. Collagen from the four different sources used performed similarly, although telogen provided significantly less resistance to contraction than collagen from the other three sources. Example 14 Effect of the inhibitors cytochalasin B and colcemid on the contraction of the collagen lattice by platelets The effect of the inhibitors cytochalasin B and colcemid on the ability of platelets to contract the hydrated collagen lattice was investigated with the following exceptions: Measurements were made according to the general procedure of Example 12. Cytochalasin B (Sigma Chemicals) and colcemid (CIBA Pharmaceutical)
Company) directly to the concentrated DMEM medium to give a final concentration of 10 μl each in a 5 ml grid volume.
g/ml and 0.5 μg/ml. The data obtained are plotted in FIG. As can be seen, the lattice casts with platelets in the presence of cytochalasin B did not shrink. In contrast, colcemid had no apparent effect on lattice contraction. The above fact was expected since colcemid is known to have no effect on the ability of human platelets to contract fibrin clots. On the other hand, cytochalasin B
stabilizes the platelet disc shape and prevents pseudopodia formation. Example 15 Rabbit Implants Tissue equivalents formed from hydrated collagen lattices contracted by platelets and suitable for implantation into rabbit ears were prepared as follows. of rabbit blood collected by cardiac puncture from potential transplant recipients.
Platelets were collected from 10 ml and concentrated by differential centrifugation as described in Example 12. Rabbit platelets were also cast according to the procedure of Example 12. After deflation, the grids were inoculated with biopsy-derived epidermal cells from the same rabbit according to the procedure of Example 11. Anesthetized rabbits were prepared for transplantation by clipping the hair at the craft site. The outline of the transplant bed was drawn, and then a marking was made with a tattoo on the outside of the periphery of the outline. The site was cleaned with 70% ethanol and all tissue down to the fascia overlying the cartilage was removed. The tissue equivalent was removed from the dish and placed onto the implant bed, with the edges of the implant slightly overlapping the edges of the implant bed. Paraffin (tulle) prepared by impregnating Telfa pads with petrolatum
Grass) was used to cover the transplant. Earle
A telpha pad soaked in a saline solution was placed on top of the paraffin. A foam pad was used on the ear to hold it in its shape, and a 3 inch (7.62 cm) Elastplast bandage was applied to the ear. Both ears were taped together with 3 inches (7.62 cm) of elastoplast to prevent the rabbit from removing the bandage. The dressing was removed 7 days after implantation. The rabbit was fitted with an Elizabethan collar to prevent attracting for an additional 2 days. The graft area along with the normal skin edge was excised from the rabbit ear as a single piece and immersed in 10% formalin in 0.03 molar phosphate buffer. The skin was fixed overnight, rinsed with distilled water, dehydrated in ethanol, cleaned in amyl acetate then toluene, and embedded in Paraplast t. Seven micron sections were cut on a rotating microtome and these were stained with hematoxylin and eosin. The implants were acceptable and prevented wound contraction in all experiments. Overall, the implant appeared whiter than the surrounding skin, and the surface was more or less sloughed and hairless. Even after 6 weeks
A small centrally located scab remained. Implants that had been in place for 6 weeks were partially examined morphologically to determine the extent of infiltration of fibrocytes from the tissue surrounding the implant. The density of fibroblasts in the implant was significantly greater than in the adjacent tissue. The implants were distinguished from the surrounding tissue by reduced birefringence as seen under light microscopy. Vascularization within the implant appeared to be greater than the adjacent tissue. The implants were further distinguished from the surrounding tissue by the absence of secondary derivatives, namely hair follicles and sebaceous glands. The epidermis covering the implant was significantly enlarged. Example 16 In Vivo Study of Skin Equivalent Rejection in Rats Formation of Skin Equivalents Small pieces of skin were collected from female Fischer.
Taken from the back of a 344 rat (Charles River Breeding Labs). These biopsies were trimmed from foreign tissue, cut into three 2-3 mm pieces, and dried and placed onto Lux tissue culture dishes. Fibroblasts grown from biopsies were
% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin and fungizone (Flow
The cells were cultured at 37°C in Dulbecco's modified medium of Eagle's Minimum Essential Medium (DMEM) supplemented with 100% CO2 in an atmosphere of 10% CO2 . A collagen lattice was prepared according to the procedure of Example 11. Briefly, 2-8 x 10 5 fibroblasts were cultured in 100 mm plastic dishes in concentrated DMEM plus 10% fetal bovine serum, antibiotics and 6 mg of acetic acid in water. Rat tail tendon collagen was combined. Within a week, the fibroblasts contracted the collagen lattice and layered a suspension of dissociated epidermal cells from a fresh biopsy onto the lattice. 10 -10 mol cholera toxin, 20 μg/ml epidermal growth factor and 0.4 μg/ml
ml of hydrocortisone was added to the medium to promote epidermal cell growth and the dishes were moved into an atmosphere of 5% CO2 . Within one week, epidermal cells formed a confluent sheet on the surface of the collagen lattice, and the skin equivalent was ready for implantation. To test allografts, lattices were prepared using cells from female Sprague-Dawley rats and transplanted into male Fisher rats. Implantation Procedure Male Fisher rats weighing approximately 350-400 g were anesthetized with sodium phenobarbital.
A graft bed approximately the same size as the grid was prepared by excising full thickness skin from the back of each animal.
A grid was placed in the wound, covered with Vaseline-impregnated Telfa pad, and the Telfa pad soaked in Earle's salt solution. These bandages were applied by wrapping the body with several layers of Elasplast. At a period of 9 days to 13 months after the initial application of the implant, the animals were again anesthetized and the entire implant was excised. Half of the implants were fixed in phosphate-buffered formalin, dehydrated in ethanol, and embedded in paraffin.
The central portion of the other half of the implant was trimmed from the underlying adipose tissue, cut into three 2-3 mm pieces, and placed in tissue culture medium to allow the growth of any fibroblasts present. Karyotype Preparation The population of fibroblasts grown from the implants was subcultured to yield 3-6 T-150 flasks of rapidly dividing cells. Fibroblasts were treated with 2 μg/ml colchicine for 4 hours, the flasks were shaken, swollen in hypotonic medium (1 part DMEM to 3 parts distilled H2O ), and air dried onto glass slides. and colored with aceto-orcein. Twenty to thirty complete chromosome spreads at each time point were photographed and kayrotypes were prepared to determine the proportion of female cells in the total population of fibroblasts. Drafts with female cells of Sprague Dawley were accepted and retained by male Fischer hosts, as determined by the presence of female cells one to two months after transplantation. Industrial Applications The skin equivalents described herein are suitable for the treatment of human or other animal skin wounds. It is particularly suitable for extensive burns. Contraction of hydrated collagen lattices by fibroblasts can also be used as an assay to measure fibroblast function, including contractile force. In addition to skin equivalents, wound dressings, etc., tissue equivalents can be modified for other uses. For example, contracted collagen lattices are used as carriers for other cell types, such as islet cells of the pancreas, in the production of tissues with pancreatic function, especially those produced from cells obtained from potential receptors. would be able to do so. Additionally, other shapes of tubes could be fabricated from contracted lattices containing cells such as fibroblasts, cardiomyocytes, etc. to form living prosthetic tubes. Such a prosthetic tube could even be further treated, for example with radiation or with chemicals, to become a non-living, but biodegradable, prosthetic tube. Equivalents Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, other equivalents to the specific reaction components, catalysts, processes, techniques, etc. described herein. Such equivalents are included within the scope of the following claims.