WO2018092247A1

WO2018092247A1 - 標本形状測定方法及び標本形状測定装置

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Publication number: WO2018092247A1
Application number: PCT/JP2016/084154
Authority: WO
Inventors: 大平まゆみ; 鈴木良政
Original assignee: オリンパス株式会社
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2018-05-24
Also published as: US20190265024A1; JPWO2018092247A1; US10697764B2

Abstract

表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、標本面の傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置を提供する。　標本形状測定方法は、所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップＳ１０と、照明光を標本に照射するステップＳ２０と、所定の処理ステップＳ３０と、を有し、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定され、照明光は標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、所定の処理ステップＳ３０は、観察光学系から出射した光を受光するステップＳ３１と、受光した光の光量を求めるステップＳ３２と、光量と基準の光量との差又は比を算出するステップＳ３３と、差又は比から、標本の表面における傾き量を算出するステップＳ３４と、を有する。

Description

標本形状測定方法及び標本形状測定装置

　本発明は、標本の表面における傾きや形状を測定する方法及び装置に関する。

　標本の３次元形状を測定する装置として、特許文献１に開示された装置や、特許文献２に開示された装置がある。

　特許文献１の装置では、縞投影法によって標本の３次元形状を測定している。特許文献１の装置では、撮像手段は、投光部、受光部、照明光出力部、ステージ及び測定制御部を含む。投光部はパターン生成部を有し、パターン生成部で生成されたパターンが標本に照射される。標本に照射されたパターンは受光部で撮像され、これにより縞画像が得られる。特許文献１の装置では、縞画像を用いて、標本の３次元形状を測定している。

　特許文献２の装置では、像のコントラストが、合焦点位置よりも合焦点位置の前後で高くなる現象を利用している。この現象は、非回折光と回折光との干渉によって生じる。特許文献２の装置では、合焦点位置の前後の画像から差分画像を取得する。そして、差分画像のコントラスト値を算出し、コントラスト値が最大となる位置を合焦点位置としている。特許文献２の装置では、標本面の各位置について合焦点位置を検出することで、標本の３次元形状を測定することができる。

特開２０１４－１０９４９２号公報特開２００８－２０４９８号公報

　特許文献１の装置では、標本から反射した光を検出している。そのため、透明で表面の反射率の低い標本、例えば、細胞については、高い精度で形状を測定することが困難である。

　特許文献２の装置では、非回折光と回折光との干渉を利用している。ここで、表面形状が滑らかな標本、例えば、細胞では、非回折光の光強度に比べて回折光の光強度が小さくなる。そのため、表面形状が滑らかになっている標本に対して、合焦点位置を正確に求めることは難しい。このようなことから、表面形状が滑らかな標本については、高い精度で形状を測定することが困難である。

　本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本面の傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置を提供することを目的とする。

　上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本形状測定方法は、
　所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップと、
　照明光を標本に照射するステップと、
　所定の処理ステップと、を有し、
　所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含むように設定され、
　照明光は標本を透過し、
　標本から出射した光は観察光学系に入射し、
　観察光学系に入射した光は、観察光学系の瞳位置に設定された透過部、又は、観察光学系の瞳の共役像の位置に設定された透過部を通過し、
　透過部は、観察光学系の瞳に到達した光の一部、又は、共役像に到達した光の一部を透過するように設定され、
　所定の処理ステップは、
　観察光学系から出射した光を受光するステップと、
　受光した光の光量を求めるステップと、
　光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出するステップと、
　差及び比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出するステップと、を有することを特徴とする。

　また、本発明の標本形状測定装置は、
　照明光学系と、観察光学系と、検出素子と、処理装置と、を備え、
　照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、を有し、
　観察光学系は、対物レンズと、開口部材と、結像レンズと、を有し、
　照明光学系と観察光学系との間に標本は配置され、
　照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、
　標本から出射した光は観察光学系に入射し、
　検出素子は、観察光学系から出射した光を受光し、
　処理装置は、
　受光した光に基づく光量を求め、
　光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、
　差又は比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出し、
　傾き量から標本の形状を計算することを特徴とする。

　本発明によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本面の傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置を提供することができる。

第１の状態における照明光の様子と結像光の様子を示す図である。第１の状態における照明光の様子を示す図である。第１の状態における結像光の様子を示す図である。第２の状態における照明光の様子と結像光の様子を示す図である。第２の状態における照明光の様子を示す図である。第２の状態における結像光の様子を示す図である。第３の状態における照明光の様子と結像光の様子を示す図である。第３の状態における照明光の様子を示す図である。第３の状態における結像光の様子を示す図である。３つの状態における光量の違いを示すグラフである。本実施形態の測定方法のフローチャートである。本実施形態の標本形状測定装置の構成を示す図である。別の標本形状測定装置を示す図である。具体例１の開口部材を示す図である。具体例１の開口部材の配置を示す図である。具体例１の開口部材における光量の変化を示すグラフである。具体例２の開口部材を示す図である。具体例２の開口部材の配置を示す図である。具体例２の開口部材における光量の変化を示すグラフである。具体例２の開口部材を示す図である。具体例２の開口部材の配置を示す図である。開口部材の例を示す図である。開口部材の別の例を示す図である。開口部材の別の例を示す図である。照明光の様子を示す図である。照明光の様子を示す図である。本実施形態の別の標本形状測定装置の構成を示す図である。第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。光量がゼロのときの状態を示す図である。開口部材を交換した様子を示す図である。対物レンズを交換した様子を示す図である。本実施形態の測定方法のフローチャートである。保持部の面積が小さい場合の光学系を示す図である。標本部を平凹レンズに置き換えたときの光学系を示す図である。標本が存在しない状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。培養液のみが存在する状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。平行平板が配置されていない場合の液体の様子を示す図である。平行平板が配置されている場合の液体の様子を示す図である。開口部材に到達する照明光の光強度分布を示す図である。開口部材に到達する照明光の光強度分布を示す図である。ルックアップテーブルの例である。本実施形態の別の標本形状測定装置の構成を示す図である。標本の体積や細胞の数を算出する方法のフローチャートである。変形例１の絞りを示す図である。変形例２の絞りを示す図である。変形例１の開口部材を示す図である。変形例２の開口部材を示す図である。変形例３の開口部材を示す図である。変形例４の開口部材を示す図である。

　以下に、本発明に係る標本形状測定方法及び標本形状測定装置の実施形態及び実施例を、図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態及び実施例によりこの発明が限定されるものではない。

　まず、本実施形態の標本形状測定方法における測定原理について説明する。本実施形態の標本形状測定方法では、標本からの光の一部を遮光している。そのために、観察光学系の瞳位置、又は観察光学系の瞳位置と共役な位置に、結像光の一部を遮光する遮光部材を配置している。

　まず、第１の状態における照明光と結像光の関係について説明する。第１の状態における照明光の様子と結像光の様子を、図１に示す。第１の状態では、標本の表面が平坦で、標本の表面の法線（以下、「面の法線」という）が光軸と平行になっている。

　図１に示すように、照明光学系１と観察光学系２が、ステージ３を挟んで対向するように配置されている。照明光学系１は、絞り４とコンデンサレンズ５とを有する。観察光学系２は対物レンズ６を有する。対物レンズ６は開口部材７を有する。ステージ３は、標本８を保持している。

　絞り４は、遮光部４ａと透過部４ｂとを有する。絞り４には、例えば、円形状の金属板や透明板が用いられる。絞り４に金属板が用いられた場合、遮光部４ａは金属板で形成されている。透過部４ｂには金属板が存在しないので、単なる空間になっている。絞り４に透明板が用いられた場合、遮光塗料の塗布や、遮光部材の貼付によって、遮光部４ａが形成される。透過部４ｂには透明板のみが存在する。

　絞り４の外形形状や透過部４ｂの形状は円形で無くても良い。これらの形状は、例えば、矩形、楕円形、多角形であっても良い。また、絞り４の位置は、コンデンサレンズ５の瞳位置と一致している。

　絞り４には照明光Ｌ_IL1が入射する。照明光Ｌ_IL1は平行な光束であって、光束中に光軸１０が含まれるように形成されている。よって、明視野照明とほぼ同じような照明が行われる。照明光Ｌ_IL1の大きさを、透過部４ｂの大きさにすることができる場合、絞り４は照明光学系１の光路中に配置されていなくても良い。

　照明光Ｌ_IL1は、照明光学系１の光路を標本８に向かって進行する。照明光学系１の光路中には、コンデンサレンズ５が配置されている。透過部４ｂを通過した照明光Ｌ_IL1は、コンデンサレンズ５に入射する。照明光Ｌ_IL1は、コンデンサレンズ５で集光される。集光された照明光Ｌ_IL2は、ステージ３に到達する。

　ステージ３の上には、標本８が載置されている。標本８と対物レンズ６との間は、液浸媒質９（以下「浸液９」という）で満たされている。ここでは、標本８は屈折率がｎの液体、浸液９は屈折率がｎ’の液体としている。また、ｎ＞ｎ’である。

　照明光Ｌ_IL2は標本８上の観察点１１に入射し、これにより観察点１１が照明される。照明光Ｌ_IL2は、標本８を透過する。標本８から出射した光（以下、「結像光」という）は、対物レンズ６に到達する。結像光Ｌ_SP1は、対物レンズ６に入射する。対物レンズ６には、開口部材７が設けられている。結像光Ｌ_SP1は、開口部材７に到達する。

　開口部材７には、例えば、円形の金属板が用いられる。開口部材７は、遮光部７ａと透過部７ｂとで構成されている。遮光部７ａは金属板で形成されている。透過部７ｂには何も存在しない。図１では、透過部７ｂを示すために、透過部７ｂの右側にも遮光部７ａ’を図示している。しかしながら、遮光部７ａ’は必ずしも必要ではない。

　開口部材７は、光軸１０を含むように配置されている。よって、遮光部７ａには光軸１０が含まれるが、透過部７ｂには光軸１０は含まれない。透過部７ｂは、光軸１０から離れた位置に形成される。

　開口部材７が光路中に配置されることで、結像光Ｌ_SP1は、遮光部７ａで遮光される結像光Ｌ_SP2と、透過部７ｂを通過する結像光Ｌ_SP3とに分かれる。

　開口部材７に、透明板が用いられても良い。この場合、例えば、遮光塗料の塗布や、遮光部材の貼付によって、遮光部７ａが形成される。一方、透過部７ｂには、遮光塗料の塗布や遮光部材の貼付は行わない。よって、透過部７ｂには、透明板のみが存在することになる。

　開口部材７の外形形状は円形で無くても良い。例えば、開口部材７の外形形状は矩形、楕円形、多角形であっても良い。また、開口部材７の位置は、対物レンズ６の瞳位置と一致している。

　コンデンサレンズ５の瞳位置と対物レンズ６の瞳位置は共役である。よって、絞り４の位置と開口部材７の位置も共役である。

　第１の状態における照明光の様子を、図２Ａに示す。上述のように、絞り４の位置と開口部材７の位置は共役である。よって、開口部材７の位置には、透過部４ｂの像が形成される。

　図２Ａでは、透過部４ｂの像の外縁が破線の円で示されている。絞り４では、透過部４ｂを照明光Ｌ_IL1が通過する。よって、図２Ａに示す破線の円は、開口部材７の位置における照明光Ｌ_IL1の外縁を示しているということができる。実線の円は、対物レンズ６の瞳の縁１２である。

　図２Ａに示すように、破線で示す円は、実線で示す円よりも小さい。これは、対物レンズ６の瞳の内側で、且つ、対物レンズ６の瞳よりも狭い範囲を照明光Ｌ_IL1が通過するように、照明光Ｌ_IL1の光束径や位置が設定されていることを意味している。

　照明光Ｌ_IL1の光束径や位置は、透過部４ｂの大きさや位置によって決まる。透過部４ｂの大きさは、照明光Ｌ_IL1の面積が、対物レンズ６の瞳位置にて瞳の面積よりも小さくなるように設定されている。

　このように、透過部４ｂの位置は、照明光Ｌ_IL1が、対物レンズ６の瞳位置にて瞳の内側に位置するように設定されている。よって、透過部４ｂを対物レンズ６の瞳位置に投影したとき、透過部４ｂの像は対物レンズ６の瞳の内側のみに形成され、対物レンズ６の瞳の外側には形成されない。

　標本８から出射した結像光Ｌ_SP1は、対物レンズ６に到達する。上述のように、対物レンズ６の瞳の内側の狭い範囲を照明光Ｌ_IL1が通過するように、照明光Ｌ_IL1の光束径や位置が設定されている。よって、対物レンズ６に到達した結像光Ｌ_SP1は、全て対物レンズ６に入射する。

　対物レンズ６に入射した結像光Ｌ_SP1のうち、結像光Ｌ_SP2は遮光部７ａに到達する。よって、結像光Ｌ_SP2は遮光部７ａで遮光される。結像光Ｌ_SP1のうち、結像光Ｌ_SP3が透過部７ｂを通過する。開口部材７からは、結像光Ｌ_SP3が出射する。

　第１の状態における結像光の様子を、図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、結像光Ｌ_SP3を示す領域の形状は弓形である。図２Ｂでは、遮光部７ａ’の図示は省略している。

　図２Ｂにおいて、Ｒは、透過部４ｂの像の半径を示している。透過部４ｂの像の半径は、開口部材７の位置における照明光Ｌ_IL1の半径に置き換えることができる。Ｌは光軸１０から遮光部７ａの外縁までの距離のうち、最も短い距離を示している。

　第１の状態では、２つの最外光線について、以下の式（１）が成立する。観察側の最外光線は、観察光学系に入射する光線のうち、最も外側に位置する光線である。照明側の最外光線は、照明光学系から出射した光線のうち、最も外側に位置する光線である。

　ここで、
　θ’_max1は、第１の状態における観察側の最外光線と光軸とのなす角、
　θ_maxは、照明側の最外光線と光軸とのなす角、
　ｎは標本の屈折率、
　ｎ’は浸液の屈折率、
である。

　このとき、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓは、以下の式（２）で表される。

　また、ＲとＬは、各々以下の式（３）、（４）で表される。

　ここで、
　ｆは対物レンズの焦点距離、
である。

　次に、第２の状態における照明光と結像光の関係について説明する。第２の状態における照明光の様子と結像光の様子を図３に示す。第２の状態では、標本の表面は平坦であるが、面の法線が光軸と非平行になっている。

　面の法線が光軸と非平行な状態では、標本の表面が傾斜している。図３に示すように、面の法線１３と光軸１０とのなす角はθ_sであるので、標本８の表面は傾斜角θ_sで傾斜していることになる。角度の正負は、光軸１０を基準にして、反時計周りの方向に面の法線１３が位置する場合を正、時計周りの方向に面の法線１３が位置する場合を負とする。第２の状態では、θ_sは正の値である。

　標本８から出射した結像光Ｌ_SP1は、対物レンズ６に到達する。上述のように、対物レンズ６の瞳の内側で、対物レンズ６の瞳よりも狭い範囲を照明光Ｌ_IL1が通過するように、照明光Ｌ_IL1の光束径や位置が設定されている。よって、対物レンズ６に到達した結像光Ｌ_SP1は、全て対物レンズ６に入射する。

　ここで、第２の状態では、標本８の表面が傾斜角＋θ_sで傾斜している。この場合、標本８の表面における屈折角が大きくなる。そのため、対物レンズ６に入射する結像光Ｌ_SP1の位置は、第１の状態と比べてより紙面内の左方向にシフトする。

　そのため、第１の状態で透過部７ｂに到達していた結像光Ｌ_SP3の一部が、第２の状態では、遮光部７ａに到達する。その結果、第２の状態における結像光Ｌ_SP3の光束の大きさは、第１の状態と比べて小さくなる。

　第２の状態における結像光の様子を、図４Ａに示す。また、比較のために、第１の状態における結像光の様子を、図４Ｂに示す。図４Ａに示すように、結像光Ｌ_SP3を示す領域の形状は弓形である。

　図４Ａと図４Ｂを比較して分かるように、第２の状態における結像光Ｌ_SP1の中心は、第１の状態における結像光Ｌ_SP1の中心の位置よりも、紙面内の左方向にΔＳだけシフトした状態になっている。そのため、第２の状態における結像光Ｌ_SP3の光束の大きさは、第１の状態と比べて小さくなる。よって、第２の状態では、光透過部７ｂを通過する光量が第１の状態から減少する。

　第２の状態では、２つの最外光線について、以下の式（５）が成立する。

　ここで、
　θ’_max2は、第２の状態における観察側の最外光線と光軸とのなす角、
　θ_sは、標本の表面の法線と光軸とのなす角、
　θ_maxは、照明側の最外光線と光軸とのなす角、
　ｎは標本の屈折率、
　ｎ’は浸液の屈折率、
　角度の正負は、光軸を基準にして、反時計周りの方向に標本の表面の法線が位置する場合が正、時計周りの方向に標本の表面の法線が位置する場合が負、
である。

　例えば、図３に示した方向に標本が傾斜している場合、面の法線の回転方向は正方向となり、θsは正の値をとる。

　このとき、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓは、以下の式（６）で表される。

　また、Ｄ₂、Ｌ₂及びΔsは、各々以下の式（７）、（８）、（９）で表される。

　ここで、
　ｆは対物レンズの焦点距離、
　Δsは、対物レンズの瞳の中心と、コンデンサレンズの瞳の像の中心との差、
である。

　次に、第３の状態における照明光と結像光の関係について説明する。第３の状態における照明光の様子と結像光の様子を図５に示す。第３の状態では、標本の表面は平坦であるが、面の法線が光軸と非平行になっている。

　第３の状態でも、面の法線が光軸と非平行な状態になっている。図５に示すように、法線１３と光軸１０とのなす角はθ_sであるので、標本８の表面は傾斜角θ_sで傾斜している面のことになる。ただし、第２の状態とは異なり、第３の状態ではθ_sは負の値になっている。

　ここで、第３の状態では、標本８の表面が傾斜角－θ_sで傾斜している。この場合、標本８の表面における屈折角が小さくなる。そのため、対物レンズ６に入射する結像光Ｌ_SP1の位置は、第１の状態と比べてより紙面内の右方向にシフトする。

　そのため、第１の状態で遮光部７ａに到達していた結像光Ｌ_SP2の一部が、第３の状態では、透過部７ｂに到達する。その結果、第３の状態における結像光Ｌ_SP3の光束の大きさは、第１の状態と比べて大きくなる。

　第３の状態における結像光の様子を、図６Ａに示す。また、比較のために、第１の状態における結像光の様子を、図６Ｂに示す。図６Ａに示すように、結像光Ｌ_SP3を示す領域の形状は弓形である。

　図６Ａと図６Ｂを比較して分かるように、第３の状態における結像光Ｌ_SP1の中心は、第１の状態における結像光Ｌ_SP1の中心の位置よりも、紙面内の右方向にΔＳだけシフトした状態になっている。そのため、第３の状態における結像光Ｌ_SP3の光束の大きさは、第１の状態と比べて大きくなる。よって、第３の状態では、透過部７ｂを通過する光量が第１の状態から増加する。

　第３の状態では、２つの最外光線について、以下の式（１０）が成立する。

　ここで、
　θ’_max3は、第３の状態における観察側の最外光線と光軸とのなす角、
　θ_sは、標本の表面の法線と光軸とのなす角、
　θ_maxは、照明側の最外光線と光軸とのなす角、
　ｎは標本の屈折率、
　ｎ’は浸液の屈折率、
　角度の正負は、光軸を基準にして、反時計周りの方向に標本の表面の法線が位置する場合が正、時計周りの方向に標本の表面の法線が位置する場合が負、
である。

　例えば、図５に示した方向に標本が傾斜している場合、面の法線の回転方向は負方向となり、θsは負の値をとる。

　このとき、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓは、以下の式（１１）で表される。

　また、Ｄ₃、Ｌ₃及びΔsは、各々以下の式（１２）、（１３）、（１４）で表される。

　面積Ｓは、透過部７ｂを通過した結像光Ｌ_SP3の光量を表している。３つの状態における光量の違いを示すグラフを図７に示す。図７に示すように、第１の状態ＳＴ１における光量ＱＬ１、第２の状態ＳＴ２における光量ＱＬ２及び第３の状態ＳＴ３における光量ＱＬ３は異なる。また、第２の状態ＳＴ２、第１の状態ＳＴ１、第３の状態ＳＴ３の順で、光量は大きくなる。

　上記の例では、対物レンズの瞳の内側で、対物レンズの瞳よりも狭い範囲を照明光が通過するように、照明光の光束径や位置が設定されている。しかしながら、対物レンズの瞳の全範囲を照明光が通過するように、照明光の光束径や位置が設定されていても良い。

　また、開口部材は、対物レンズの瞳の共役像の位置に配置しても良い。開口部材の位置は、対物レンズの瞳位置や共役像の位置と完全に一致している必要はない。開口部材は、対物レンズの瞳の近傍や共役像の近傍に位置していれば良い。

　このように、本実施形態の標本形状測定方法における測定原理では、明視野照明とほぼ同じ照明を行うと共に、観察光学系の瞳に到達した光の一部、又は、観察光学系の瞳の共役像に到達した光の一部を透過するようにしているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の標本形状測定方法によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定方法について説明する。以下の説明では、開口部材７の代わりに、対物レンズの瞳７を用いている。

　本実施形態の標本形状測定方法は、所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップと、照明光を標本に照射するステップと、所定の処理ステップと、を有し、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含むように設定され、照明光は標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、観察光学系に入射した光は、観察光学系の瞳位置に設定された透過部、又は、観察光学系の瞳の共役像の位置に設定された透過部を通過し、透過部は、観察光学系の瞳に到達した光の一部、又は、共役像に到達した光の一部を透過するように設定され、所定の処理ステップは、観察光学系から出射した光を受光するステップと、受光した光の光量を求めるステップと、光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出するステップと、差及び比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出するステップと、を有することを特徴とする。

　本実施形態の標本形状測定方法（以下、「本実施形態の測定方法」という）について説明する。図８は、本実施形態の測定方法のフローチャートである。本実施形態の測定方法は、照明光を準備するステップＳ１０と、照明光を照射するステップＳ２０と、所定の処理ステップＳ３０と、を有し、所定の処理ステップＳ３０は、結像光を受光するステップＳ３１と、結像光の光量を求めるステップＳ３２と、差又は比を算出するステップＳ３３と、傾き量を算出するステップＳ３４と、を有する。

　本実施形態の測定方法では、まず、ステップＳ１０が実行される。ステップＳ１０は、照明光を準備するステップである。ステップＳ１０では、照明光学系内に、所定の照明領域が設定される。所定の照明領域は、照明光が通過する領域である。所定の照明領域は、図１に示す透過部４ｂによって決まる領域である。照明光学系１の光路に絞り４を配置することで、所定の照明領域の設定が行われる。このとき、光軸１０を含むように、絞り４が配置される。よって、本実施形態の測定方法では、明視野照明が行われる。

　また、絞り４は、照明光学系１の瞳位置、具体的には、コンデンサレンズ５の瞳位置に配置されている。コンデンサレンズ５の瞳の位置は、観察光学系２の瞳位置、具体的には、対物レンズの瞳７の位置と共役になっている。よって、対物レンズの瞳７の位置に、所定の照明領域の像が形成される。このとき、所定の照明領域の像は、対物レンズの瞳７の内側のみに形成される。

　また、所定の照明領域の像の面積が対物レンズの瞳７の面積よりも小さくなるように、所定の照明領域の像が形成される。ただし、所定の照明領域の像の面積が対物レンズの瞳７の面積と等しくなるように、所定の照明領域の像が形成されていても良い。

　所定の照明領域の像の面積は、対物レンズの瞳７の位置における照明光の光束径と見なすことができる。光束径が、対物レンズの瞳径よりも小さい場合、照明光の移動に伴って光強度が変化する。このとき、照明光の移動方向が光軸に近づく方向と、光軸から離れる方向の両方で、光強度は変化する。

　一方、対物レンズの瞳位置における照明光の光束径が、対物レンズの瞳径と同じ場合、光軸に近づく場合では光強度は変化する。しかしながら、光軸から離れる方向では光強度は変化しない。この場合、所定の照明領域を、光軸の周りに１８０度回転させることで、光軸から離れる方向でも光強度が変化する。

　このように、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含むように設定されると共に、照明光の面積が観察光学系の瞳位置にて該瞳の面積よりも小さくなるように設定される。所定の照明領域は、観察光学系の瞳の全範囲を照明光が通過するように設定されていても良い。

　ステップＳ１０が終わると、ステップＳ２０が実行される。ステップＳ２０は、照明光を照射するステップである。ステップＳ２０では、照明光が標本に照射される。標本に照射された照明光は、標本を透過する。標本が照明されることで、標本から結像光が出射する。標本から出射した光は、観察光学系に入射する。

　観察光学系に入射した光は、観察光学系の瞳位置に設定された透過部を通過する。透過部は、観察光学系の瞳に到達した光の一部を透過するように設定されている。透過部は、観察光学系の瞳位置と共役な位置に設定しても良い。

　ステップＳ２０が終わると、ステップＳ３０が実行される。ステップＳ３０は、所定の処理を行うステップである。ステップＳ３０では、ステップＳ３１、ステップＳ３２、ステップＳ３３及びステップＳ３４が実行される。

　ステップＳ３０では、まず、ステップＳ３１が実行される。ステップＳ３１は、結像光を受光するステップである。結像光は、観察光学系から出射した光である。

　ステップＳ３１が終わると、ステップＳ３２が実行される。ステップＳ３２は、結像光の光量を求めるステップである。結像光の光量は、ステップＳ３１で受光した光の光量である。

　ステップＳ３２が終わると、ステップＳ３３が実行される。ステップＳ３３は、差又は比を算出するステップである。ステップＳ３３では、ステップＳ３１で受光した光の光量、すなわち、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。

　ステップＳ３３が終わると、ステップＳ３４が実行される。ステップＳ３４は、傾き量を算出するステップである。ステップＳ３４では、ステップＳ３３で算出された結果から、標本の表面における傾き量が算出される。

　ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方が算出されれば良い。

　このように、本実施形態の測定方法では、明視野照明とほぼ同じ照明を行うと共に、観察光学系の瞳位置に到達した光の一部、又は、観察光学系の瞳の共役像に到達した光の一部を透過するように一部、又は、観察光学系の瞳の共役像に到達した光の一部を透過するようにしているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の測定方法によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置は、照明光学系と、観察光学系と、検出素子と、処理装置と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、を有し、観察光学系は、対物レンズと、開口部材と、結像レンズと、を有し、照明光学系と観察光学系との間に標本は配置され、照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、検出素子は、観察光学系から出射した光を受光し、処理装置は、受光した光に基づく光量を求め、光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、差又は比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出し、傾き量から標本の形状を計算することを特徴とする。

　本実施形態の標本形状測定装置について、図９を用いて説明する。図９は本実施形態の標本形状測定装置の構成を示す図である。

　標本形状測定装置２０は、例えば、正立型顕微鏡であって、照明光学系と観察光学系とを備える。照明光学系は、光源２１と、コンデンサレンズ２４と、絞り２５とを有する。なお、必要に応じて、照明光学系は、レンズ２２やレンズ２３を有する。一方、観察光学系は、対物レンズ２８と、開口部材３０と、結像レンズ３１と、を有する。開口部材３０は、対物レンズの瞳２９の位置に配置されている。開口部材３０は、図１における開口部材７に該当する。

　光源２１から出射した光は、レンズ２２とレンズ２３を通過して、コンデンサレンズ２４に到達する。コンデンサレンズ２４には、絞り２５が設けられている。ここでは、コンデンサレンズ２４と絞り２５とが、一体で構成されている。しかしながら、絞り２５とコンデンサレンズ２４とを、それぞれ別体で構成しても良い。絞り２５には、金属板が用いられている。

　また、コンデンサレンズ２４の代わりに、反射面を有するコンデンサ部を用いても良い。コンデンサ部は、例えば、円錐ミラーと凹面ミラーとで構成できる。円錐ミラーは光軸上に配置されている。凹面ミラーは円環状の反射面を有し、円錐ミラーを取り囲むように配置されている。

　絞り２５と光源２１とは共役になっている。よって、光源２１から出射した照明光は、絞り２５の位置で集光する。すなわち、絞り２５の位置に光源２１の像が形成される。

　絞り２５の開口部から出射した照明光は、コンデンサレンズ２４に入射する。ここで、絞り２５の位置は、コンデンサレンズ２４の焦点位置（あるいは、コンデンサレンズ２４の瞳位置）と一致している。そのため、コンデンサレンズ２４から出射する照明光は、平行光になる。

　絞り２５は透過部を有する。図９に示すように、透過部は光軸３５を含んでいる。よって、標本形状測定装置２０では、明視野照明とほぼ同じ照明が行われる。

　コンデンサレンズ２４から出射した照明光は、標本２７に到達する。標本２７は保持部材２６上に載置されている。標本２７は、例えば細胞であって、無色透明である。保持部材２６は、保持部を有する。スライドガラスでは、スライドガラスの表面が保持部に該当する。シャーレでは、シャーレの凹部が保持部に該当する。マイクロウェルプレートでは、各ウェルの凹部が保持部に該当する。

　標本２７を透過した光、すなわち、結像光は顕微鏡対物レンズ２８（以下、「対物レンズ」という）に入射する。この対物レンズ２８は、例えば、明視野観察用の顕微鏡対物レンズである。よって、対物レンズ２８の光路中には、位相板や変調板のように光の強度や位相を変化させる光学部材は存在していない。

　図９に示すように、標本２７を透過した平行光は、対物レンズの瞳２９に集光する。このように、対物レンズの瞳２９と絞り２５とは共役になっている。よって、対物レンズの瞳２９の位置に、絞り２５の像が形成される。

　上述のように、絞り２５は透過部を有する。この透過部を照明光が通過する。よって、対物レンズの瞳２９の位置に形成された絞り２５の像は、照明光の像になる。図９に示すように、透過部の縁の近くを通過した照明光は、対物レンズの瞳２９の内側で、且つ、対物レンズの瞳２９よりも狭い範囲を通過する。

　このように、透過部の位置は、照明光が、対物レンズの瞳２９の位置にて瞳の内側に位置するように設定されている。よって、透過部を対物レンズの瞳２９の位置に投影したとき、透過部の像は対物レンズの瞳２９の内側のみに形成され、対物レンズの瞳２９の外側には形成されない。

　対物レンズの瞳２９の位置には、開口部材３０が配置されている。図９では、対物レンズの瞳２９の位置を明確に示すために、対物レンズの瞳２９と開口部材３０とが分離して描かれている。

　開口部材３０には、遮光部と透過部が設けられている。透過部は、観察光学系の瞳に到達した光の一部を透過するように、設定されている。図９では、観察光学系の瞳位置は、対物レンズの瞳２９の位置である。開口部材３０の具体的な構造は、後述する。

　対物レンズ２８から出射した結像光は、結像レンズ３１に入射する。そして、結像レンズ３１を出射した結像光によって、像位置３２に標本２７の光学像が形成される。

　像位置３２には、検出素子３３が配置されている。検出素子３３は光電変換素子である。検出素子３３としては、例えば、フォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＯＭＳ等がある。

　光学像の光強度は、検出素子３３によって電気信号に変換される。変換された電気信号は、標本２７の画像データとして処理装置３４に送信される。画像データは、光学像の光量を表している。

　処理装置３４では、図８に示すフローチャートに従って処理が実行される。すなわち処理装置３４では、結像光の光量を求め（ステップＳ３２）、光量と基準の光量との差又は比を算出し（ステップＳ３３）、算出結果から、標本の表面における傾き量を算出する（ステップＳ３４）。

　図１０は、別の標本形状測定装置を示す図である。図１０では、照明光学系の図示を省略している。標本形状測定装置２０’では、対物レンズの瞳２９の共役像３６（以下、「共役像３６」という）の位置に、開口部材３０が配置されている。図１０では、共役像３６の位置を明確に示すために、共役像３６の位置と開口部材３０とが分離して描かれている。

　対物レンズの瞳２９が対物レンズ２８の内部に位置している場合、対物レンズ２８の内部に、開口部材３０を配置しなくてはならない。このとき、開口部材３０を、問題なく対物レンズ２８の内部に配置できれば良い。しかしながら、対物レンズの瞳２９の位置によっては、対物レンズ２８の内部に開口部材３０を配置できない場合もある。

　標本形状測定装置２０’では、結像レンズ３１と像位置３２との間に、レンズ３７が配置されている。これにより、共役像３６が、対物レンズ２８の外部に形成される。そのため、対物レンズ２８の内部に、開口部材３０を配置しなくても良くなる。その結果、明視野観察用の対物レンズを、そのまま、本実施形態の標本形状測定装置に用いることができる。

　標本形状測定装置２０’では、標本２７の光学像を形成するために、レンズ３７と検出素子３３との間に、レンズ３８が配置されている。これにより、共役像３６に到達した光の一部が、検出素子３３で検出される。

　図８や図９に示す開口部材３０の具体例を示す。図１１Ａは、具体例１の開口部材を示す図、図１１Ｂは、具体例１の開口部材の配置を示す図である。

　具体例１の開口部材４０は、遮光部４０ａと透過部４０ｂとを有する。開口部材４０の形状は、円形の部材の一部を切り取った形状になっている。切り取られた部分が、透過部４０ｂである。遮光部４０ａの形状は弓形である。

　標本の表面における傾き量に応じて、対物レンズ２８に対する結像光Ｌ_SP1の入射位置が変化する。この変化に伴い、透過部４０ｂを通過する結像光Ｌ_SP3の光量が変化する。具体例１の開口部材における光量の変化を示すグラフを図１２に示す。図１２には、光量とΔｖ／２ｒの関係を表す曲線（以下、「特性曲線」という）が示されている。

　図１２において、グラフの横軸は、対物レンズ２８に対する結像光Ｌ_SP1の入射位置のずれ量を表している。このずれ量は、結像光Ｌ_SP3を円と仮定したときの中心と光軸３５との差ΔＶから求まる。図１２では、ΔＶを２ｒで規格化している。ｒは、結像光Ｌ_SP3を円と仮定したときの半径である。

　開口部材４０では、透過部４０ｂの面積が遮光部４０ａの面積に比べて、非常に大きい。この場合、ΔＶ＝０のときの光量に対する結像光Ｌ_SP3の変化量は小さい。そのため、特性曲線の傾きが小さくなる。

　図１３Ａは、具体例２の開口部材を示す図、図１３Ｂは、具体例２の開口部材の配置を示す図である。

　具体例２の開口部材４１は、遮光部４１ａと透過部４１ｂとを有する。開口部材４１の形状は、円形の部材の一部を切り取った形状になっている。切り取られた部分が、透過部４１ｂである。透過部４１ｂの形状は弓形である。

　具体例２の開口部材における光量の変化を示すグラフを図１４に示す。開口部材４１では、透過部４１ｂの面積が遮光部４１ａの面積に比べて、非常に小さい。この場合、ΔＶ＝０のときの光量に対する結像光Ｌ_SP3の変化量は大きい。そのため、特性曲線の傾きが大きくなる。

　図１５Ａは、具体例３の開口部材を示す図、図１５Ｂは、具体例３の開口部材の配置を示す図である。

　具体例３の開口部材４２は、遮光部４２ａと透過部４２ｂとを有する。開口部材４２の形状は円で、円の直径は対物レンズの瞳２９の直径よりも小さくなっている。円形の部分が遮光部４２ａである。

　このように、本実施形態の標本形状測定装置では、明視野照明とほぼ同じ照明を行うと共に、観察光学系の瞳に到達した光の一部、又は、観察光学系の瞳の共役像に到達した光の一部を透過するようにしているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、遮光部は、対物レンズの光軸を含むように設けられ、透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように設けられることが好ましい。

　上述のように、開口部材４１は、遮光部４１ａと透過部４１ｂとを有する。遮光部４１ａは、光軸３５を含むように設けられている。透過部４１ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分を含むように設けられている。

　同様に、開口部材４２は、遮光部４２ａと透過部４２ｂとを有する。遮光部４２ａは、光軸３５を含むように設けられている。透過部４２ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側全てを含むように設けられている。

　このように、本実施形態の標本形状測定装置では、透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分とを、少なくとも含むように設けられている。

　開口部材４１や開口部材４２を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、遮光部は、対物レンズの光軸を含むように設けられ、透過部は、光軸に対して偏心しており、照明光学系の瞳の像の縁の一部を含むように設けられていることが好ましい。

　上述のように、開口部材４１は、遮光部４１ａと透過部４１ｂとを有する。遮光部４１ａは、光軸３５を含むように設けられている。透過部４１ｂは、光軸３５に対して偏心した場所に設けられている。また、透過部４１ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように設けられている。

　開口部材４１を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、遮光部は、対物レンズの光軸を含むように設けられ、透過部は、光軸を含まず、照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように設けられていることが好ましい。

　上述のように、開口部材４２は、遮光部４２ａと透過部４２ｂとを有する。遮光部４２ａは、光軸３５を含むように設けられている。透過部４２ｂは、光軸を含まない場所に設けられている。透過部４２ｂは、照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように設けられている。

　開口部材４２を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置は、以下の条件式を満たすことが好ましい。
　Ｒ０＜Ｒill×β＜Ｒ１
ここで、
　Ｒ０は、対物レンズの光軸から所定の位置までの長さ、
　Ｒ１は、対物レンズの光軸から透過部の外縁までの長さであって、対物レンズの光軸と所定の位置とを結ぶ線上における長さ、
　所定の位置は、遮光部の内縁上の位置のうち、対物レンズの光軸からの長さが最小となる位置、
　Ｒillは、照明光学系の瞳の半径、
　βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。

　条件式を満足することで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、観察光学系の瞳を通過する光を検出している。そのため、開口部材の透過部は、観察光学系の瞳の内側に位置している。また、照明光学系の瞳の像の縁が、透過部に含まれるようになっている。これは、照明光学系の瞳の像の縁が、観察光学系の瞳の内側に位置していることを意味している。

　本実施形態の標本形状測定装置では、顕微鏡の光学系を利用することができる。顕微鏡の光学系では、観察光学系として顕微鏡対物レンズが用いられ、照明光学系としてコンデンサレンズが用いられる。また、顕微鏡の光学系では、複数の顕微鏡対物レンズと複数のコンデンサレンズが使用可能である。よって、照明光学系の開口数と観察光学系の開口数の組み合わせは、多数存在する。

　照明光学系の瞳の像の大きさは、照明光学系の開口数と観察光学系の開口数とで決まる。そのため、照明光学系と観察光学系の組み合わせによっては、照明光学系の瞳の像が、観察光学系の瞳よりも大きくなる可能性がある。この場合、照明光学系の瞳の像の縁が、観察光学系の瞳の内側に位置しない状態になる。

　このような状態の場合は、例えば、光源２１から出射する光の光束径を細くする。このようにすると、観察光学系の瞳位置において、照明光の光束径が透過部に含まれるようになる。照明光の光束の位置は、標本の表面における傾き量に応じて変化するので、標本の表面における傾き量の変化を、明るさの変化として検出することができる。

　以上のように、照明光学系の瞳の像は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束に置き換えることができる。よって、以下の言い替えが可能になる。

　「透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含む」は、「透過部は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の内側の一部分と外側を含む」と言い換えることができる。

　「透過部は、照明光学系の瞳の像の縁の一部を含む」は、「透過部は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の縁の一部を含む」と言い換えることができる。

　「透過部は、照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように設けられている」は「透過部は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の縁の全てを含むように設けられている」と言い換えることができる。

　「Ｒillは、照明光学系の瞳の半径」は「Ｒillは、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の半径」と言い換えることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と透過部とを区分する境界線を有し、境界線は光軸と直交する一本の直線と平行な線で構成されていることが好ましい。

　このようにすることで、開口部材を容易に作製することができる。

　図１６は、開口部材の例を示す図である。図１６には、対物レンズの瞳２９の位置に配置された開口部材５０の様子が示されている。開口部材５０は、遮光部５０ａと透過部５０ｂとを有する。開口部材５０の形状は、円形の部材の一部を切り取った形状になっている。切り取られた部分が、透過部５０ｂである。

　遮光部５０ａと透過部５０ｂとの間には、境界線５１が形成されている。境界線５１によって、遮光部５０ａと透過部５０ｂとが区分されている。境界線５１は、光軸３５と直交する一本の直線と平行な線である。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と透過部とを区分する境界線を有し、所定の２点を結ぶ直線が、境界線と光軸との間に位置することが好ましい。ここで、所定の２点は、開口部材に照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。

　このようにすることで、より大きな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。

　図１７は、開口部材の別の例を示す図である。図１７には、対物レンズの瞳２９の位置に配置された開口部材６０の様子が示されている。開口部材６０は、遮光部６０ａと透過部６０ｂとを有する。開口部材６０の形状は、円形の部材の一部を切り取った形状になっている。切り取られた部分が、透過部６０ｂである。

　遮光部６０ａと透過部６０ｂとの間には、境界線６１が形成されている。境界線６１によって、遮光部６０ａと透過部６０ｂとが区分されている。

　開口部材６０に対物レンズの瞳２９を重ねたとき、境界線６１と対物レンズの瞳２９の外縁とが、点６２と点６３で交わっている。点６２と点６３は所定の２点である。直線６４は、点６２と点６３とを通過する直線（所定の線）である。

　境界線６１は、円弧で構成されている。円弧は、遮光部６０ａから透過部６０ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材６０では、直線６４が、境界線６１と光軸３５との間に位置する。

　開口部材６０では、境界線６１は、１本の曲線で構成された線である。しかしながら、境界線６１は、複数の直線で構成された線、複数の曲線で構成された線、あるいは曲線と直線とで構成された線のいずれでも良い。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と透過部とを区分する境界線を有し、境界線が、所定の２点を結ぶ直線と光軸との間に位置することが好ましい。ここで、所定の２点は、開口部材に照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。

　このようにすることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。

　図１８は、開口部材の別の例を示す図である。図１８には、対物レンズの瞳２９の位置に配置された開口部材７０の様子が示されている。開口部材７０は、遮光部７０ａと透過部７０ｂとを有する。開口部材７０の形状は、円形の部材の一部を切り取った形状になっている。切り取られた部分が、透過部７０ｂである。

　遮光部７０ａと透過部７０ｂとの間には、境界線７１が形成されている。境界線７１によって、遮光部７０ａと透過部７０ｂとが区分されている。

　開口部材７０に対物レンズの瞳２９を重ねたとき、境界線７１と対物レンズの瞳２９の外縁とが、点７２と点７３とで交わっている。点７２と点７３は所定の２点である。直線７４は、点７２と点７３とを通過する直線（所定の線）である。

　境界線７１は、円弧で構成されている。円弧は、透過部７０ｂから遮光部７０ａに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材７０では、境界線７１が、直線７４と光軸３５との間に位置する。

　開口部材７０では、境界線７１は、１本の曲線で構成された線である。しかしながら、境界線７１は、複数の直線で構成された線、複数の曲線で構成された線、あるいは曲線と直線とで構成された線のいずれでも良い。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系は所定の照明領域を有し、所定の照明領域に、面光源が配置されるか、又は面光源の像が形成され、観察光学系から出射した光を受光することが好ましい。

　図１９は、照明光の様子を示す図である。図１９に示す照明光学系では、所定の照明領域に、面光源８０が配置されている。所定の領域は、絞り２５の透過部である。図１９では、面光源８０の一方の側に位置する一部の領域（以下、「領域Ａ」という）から出射した照明光が示されている。領域Ａの一端から出射した照明光は点線で示され、領域Ａの他端から出射した照明光は破線で示されている。

　図１９に示すように、絞り２５の透過部は光軸を含んでいる。よって、面光源８０は、例えば、光軸を含む円形領域に配置されている。

　点線で示す照明光と破線で示す照明光は、共に、コンデンサレンズ２４から平行光束となって出射する。よって、標本２７は、広がりを持った照明光で照明される。

　図示は省略するが、面光源８０の他方の側からも、領域Ａと同様の光線が出射する。他方の側から出射した光線は、コンデンサレンズ２４から平行光束となって出射する。他方の側から出射した光線も、標本２７に照射される。

　照明された標本２７からは、結像光が出射する。図１９では、標本２７の点Ｐ１と点Ｐ２から特定の方向に向かう結像光が、実線と２点鎖線で示されている。しかしながら、実際には、標本２７の点Ｐ１と点Ｐ２からは、様々な方向に向かう結像光が出射する。

　例えば、図２０には、様々な方向に向かう結像光が点Ｐ３から出射している様子が示されている。標本２７の点Ｐ１と点Ｐ２からも、点Ｐ３から出射する結像光と同様に、様々な方向に向かう結像光が出射する。

　標本２７の点Ｐ１から出射した結像光のうち、一部の結像光は、開口部材４１の遮光部で遮光されてしまう。標本２７の点Ｐ２から出射した結像光のうち、一部の結像光も、開口部材４１の遮光部で遮光されてしまう。

　一方、標本２７の点Ｐ１から出射した結像光のうち、残りの結像光は、対物レンズ２８と結像レンズ３１とによって、像位置に集光される。像位置には、点Ｐ１の像Ｐ１’が形成される。標本２７の点Ｐ２から出射した結像のうち、残りの光も、対物レンズ２８と結像レンズ３１とによって、像位置に集光される。像位置には、点Ｐ２の像Ｐ２’が形成される。このように、像位置には、２次元の像が形成される。

　ステップＳ３１では、複数の微小領域で結像光の受光が行われる。微小領域は２次元に配列されている。よって、２次元の像が複数の微小領域に分割され、各微小領域で受光が行われることになる。その結果、標本の表面の形状を、広い範囲にわたって１回で測定することができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、所定の照明領域を通過する照明光が平行光束であることが好ましい。

　図２０は、照明光の様子を示す図である。図２０では、絞り２５に対して平行光束が照射されている。よって、所定の照明領域を通過する照明光も、平行光束になる。

　図２０に示すように、絞り２５の透過部は光軸を含んでいる。よって、平行光束は、例えば、光軸を含む円形領域を通過する。

　照明光はコンデンサレンズ２４に入射する。コンデンサレンズ２４に入射した照明光は、標本２７の位置に集光する。よって、標本２７は点状の照明光で照明される。

　照明された標本２７からは、結像光が出射する。標本２７の点Ｐ３から出射した結像光のうち、一部の結像光は、開口部材４１の遮光部で遮光されてしまう。一方、標本２７の点Ｐ３から出射した結像光のうち、残りの結像光は、対物レンズ２８と結像レンズ３１とによって、像位置に集光される。像位置には、点Ｐ３の像Ｐ３’が形成される。

　このように、所定の照明領域を通過する照明光が平行光束の場合、標本２７の１点にしか照明光は照射されない。この場合、結像光も、標本２７の１点からの光のみになる。そのため、ステップＳ３０が実行されると、算出されるのは、標本２７の１点における傾き量のみになる。

　所定の照明領域を通過する照明光が平行光束の場合、光軸と直交する面内で、照明光と標本とを相対移動させることが好ましい。

　上述のように、所定の照明領域を通過する照明光が平行光束の場合、標本２７の１点における傾き量のみしか算出されない。そこで、光軸と直交する面内で、照明光と標本とを相対移動させる。これにより、標本２７の複数の位置における傾き量を算出することができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、光路に挿入離脱する第１の開口部材と第２の開口部材とを有し、第１の開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第１の透過部を有し、第２の開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第２の透過部を有し、第１の開口部材を光路に挿入したときの光軸と第１の透過部重心を結ぶ方向と、第２の開口部材を光路に挿入したときの光軸と第２の透過部重心を結ぶ方向と、は交差することが好ましい。

　図２１は、本実施形態の別の標本形状測定装置の構成を示す図である。なお、図１０と同じ構成については同じ番号を付し、説明は省略する。

　標本形状測定装置９０は、第１の開口部材９１と第２の開口部材９２とを備えている。第１の開口部材９１と第２の開口部材９２には、透明板が用いられている。

　第１の開口部材９１と第２の開口部材９２は、共に、移動機構９３に保持されている。移動機構９３としては、例えば、スライダーやターレットがある。移動機構９３がスライダーの場合、第１の開口部材９１と第２の開口部材９２は、光軸３５と直交する方向に移動する。移動機構９３がターレットの場合、第１の開口部材９１と第２の開口部材９２は、光軸３５と平行な軸を中心に回転する。

　図２２Ａは、第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。図２２Ｂは、第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。

　第１の開口部材９１は、遮光部９１ａと第１の透過部９１ｂとを有する。第１の開口部材９１では、光軸３５を含む箇所が遮光部９１ａになっている。第１の開口部材９１は、光軸３５に対して偏心した位置に第１の透過部９１ｂを有している。

　第２の開口部材９２は、遮光部９２ａと第２の透過部９２ｂとを有する。第２の開口部材９２では、光軸３５を含む箇所が遮光部９２ａになっている。第２の開口部材９２は、光軸３５に対して偏心した位置に第２の透過部９２ｂを有している。

　そして、光軸３５と第１の透過部９１ｂの重心を結ぶ方向と、光軸３５と第２の透過部９２ｂの重心を結ぶ方向とは、第１の開口部材９１を光路に挿入したときと第２の開口部材９２を光路に挿入したときとで交差する。図２２Ａや図２２Ｂでは、直交する２つの直線のうちの一方の直線上に第１の透過部９１ｂが位置し、他方の直線上に第２の透過部９２ｂが位置している。

　第１の透過部９１ｂを通過する照明光の面積は、第２の透過部９２ｂを通過する照明光の面積と等しい。よって、標本の傾斜角を変化させたときの、照明光の面積の変化の様子は、第１の開口部材９１を光路に挿入したときと、第２の開口部材９２を光路に挿入したときとで同じになる。

　第１の透過部９１ｂにおける分光透過率特性は、第２の透過部９２ｂにおける分光透過率特性と等しい。この場合、１つの光源を用いて測定を行うことができる。光源から出射する光の波長域は、広くても良く、狭くても良い。

　第１の透過部９１ｂにおける分光透過率特性を、第２の透過部９２ｂにおける分光透過率特性と異ならせても良い。この場合、測定方法としては、照明光の波長を変えずに測定を行う方法と、照明光の波長を変えて測定を行う方法とがある。

　照明光の波長を変えずに測定を行う方法では、光源には、出射光の波長域が広い光源を用いる。出射光の波長域が広い光源としては、白色光源がある。また、検出素子には、複数の光電変換素子を使用する。複数の光電変換素子で構成された検出素子としては、例えば、三板式のカメラがある。

　三板式のカメラは、３つのＣＣＤを備えている。第１のＣＣＤには赤色のフィルタが配置され、第２のＣＣＤには緑色のフィルタが配置され、第３のＣＣＤには青色のフィルタが配置されている。

　そこで、例えば、第１の透過部９１ｂにおける分光透過率特性を、赤色のフィルタの分光透過率特性と一致させ、第２の透過部９２ｂにおける分光透過率特性を、緑色のフィルタの分光透過率特性と一致させておく。

　そして、測定では、白色光源を光路中に配置し、第１の開口部材９１を光路に挿入したときは、第１のＣＣＤで測定を行い、第２の開口部材９２を光路に挿入したときは、第２のＣＣＤで測定を行えば良い。

　照明光の波長を変えて測定を行う方法では、複数の光源を用いる場合と１つの光源を用いる場合とがある。

　複数の光源を用いる場合は、例えば、第１の光源とは別に、第２の光源を用意しておく。そして、第１の光源から出射する光の波長域と、第２の光源から出射する光の波長域とを異ならせておく。更に、第１の透過部９１ｂにおける分光透過率特性を、第１の光源から出射する光の波長域と一致させ、第２の透過部９２ｂにおける分光透過率特性を、第２の光源から出射する光の波長域と一致させておく。

　そして、測定では、第１の開口部材９１を光路に挿入したときは、第１の光源を用いて測定を行い、第２の開口部材９２を光路に挿入したときは、第２の光源を用いて測定を行えば良い。

　１つの光源を用いる場合は、光学フィルタを複数用意しておく。例えば、第１の光学フィルタと第２の光学フィルタとを用意しておく。また、第１の透過部９１ｂにおける分光透過率特性を、第１の光学フィルタの分光透過率特性と一致させ、第２の透過部９２ｂにおける分光透過率特性を、第２の光学フィルタの分光透過率特性と一致させておく。

　そして、測定では、第１の開口部材９１を光路に挿入したときは、第１の光学フィルタを用いて測定を行い、第２の開口部材９２を光路に挿入したときは、第２の光学フィルタを用いて測定を行えば良い。

　本実施形態の標本形状測定装置では、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第１の透過部と第２の透過部とを有し、開口部材を光路に挿入したときの光軸と第１の透過部重心を結ぶ方向と、光軸と第２の透過部重心を結ぶ方向と、は交差することが好ましい。

　図２３は、開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材１００は、遮光部１００ａと、第１の透過部１００ｂと、第２の透過部１００ｃを有する。開口部材１００では、光軸３５を含む箇所が遮光部１００ａになっている。開口部材１００は、光軸３５に対して偏心した位置に第１の透過部１００ｂと第２の透過部１００ｃとを有している。

　そして、光軸３５と第１の透過部１００ｂの重心を結ぶ方向と、光軸３５と第２の透過部１００ｃの重心を結ぶ方向とは、交差する。図２３では、直交する２つの直線のうちの一方の直線上に第１の透過部１００ｂが位置し、他方の直線上に第２の透過部１００ｃが位置している。

　第１の透過部１００ｂを通過する照明光の面積は、第２の透過部１００ｃを通過する照明光の面積と等しい。よって、傾斜角θ_sを変化させたときの、面積Ｓの変化の様子は、第１の透過部１００ｂを照明光が通過したときと、第２の透過部１００ｃを照明光が通過したときとで同じになる。

　第１の透過部１００ｂにおける分光透過率特性は、第２の透過部１００ｃにおける分光透過率特性と異ならせておく必要がある。検出素子に複数の光電変換素子を使用するか、又は、照明光の波長を変えることで、開口部材１００を、常に光路中に配置したままで測定を行うことができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材を移動させることなく、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に透過部を有し、光軸と透過部重心を結ぶ方向を変更可能であることが好ましい。

　図２４は、開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材１１０は、遮光部１１０ａを有する。開口部材１１０では、光軸３５を含む箇所が遮光部１１０ａになっている。開口部材１１０は、光軸３５に対して偏心した位置に透過部１００ｂを有している。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材１１０を実線で示す位置から、一点鎖線で示す位置に回転可能になっている。すなわち、光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能になっている。

　開口部材１１０を実線で示す位置に移動させることで、図２２Ａと同じ状態を実現できる。また、開口部材１１０を一点鎖線で示す位置に移動させることで、図２２Ｂと同じ状態を実現できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、遮光部の大きさと対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方が変更可能であることが好ましい。

　図１４に示すように、開口部材４１では、光量は、ΔＶ／２ｒ＝－０．１のときにゼロになる。図２５Ａは、光量がゼロのときの状態を示す図である。この状態では、図２５Ａに示すように、全ての結像光は、遮光部４１ａで遮光されてしまう。そのため、この場合、対物レンズの瞳２９を通過する光束は存在しないので、傾き量の測定はできない。

　ΔＨ／２ｒ＝－０．１よりもマイナス側で傾き量の測定をできるようにするためには、ΔＨ／２ｒ＝－０．１よりもマイナス側でも、結像光Ｌ_SP3が開口部材４１から出射する状態になっている必要がある。

　結像光Ｌ_SP3が開口部材４１から出射する状態を実現する方法としては、遮光部又は透過部の大きさを変更する方法がある。遮光部又は透過部の大きさを変更するには、開口部材を交換すれば良い。図２５Ｂは、開口部材を交換した様子を示す図である。

　開口部材１２０は、遮光部１２０ａと透過部１２０ｂとを有する。遮光部１２０ａの大きさは、遮光部４１ａの大きさよりも小さい。すなわち、透過部１２０ｂの大きさは、透過部４１ｂの大きさよりも大きい。

　そこで、対物レンズはそのままで、開口部材４１を開口部材１２０に交換する。このようにすることで、結像光Ｌ_SP3が透過部１２０ｂに到達するようになる。すなわち、結像光Ｌ_SP3が開口部材１２０から出射する状態になる。その結果、傾き量の測定可能な範囲を広げることができる。

　開口部材４１は、対物レンズの瞳位置に配置されている。対物レンズの瞳が対物レンズの内部に位置している場合、開口部材４１も対物レンズの内部に配置されている。このような状態であっても、開口部材４１を開口部材１２０に交換することが可能であれば、交換を行えば良い。開口部材４１を開口部材１２０に交換することが困難な場合、対物レンズの瞳の共役像な位置で、開口部材４１と開口部材１２０との交換を行えば良い。

　結像光Ｌ_SP3が開口部材４１から出射する状態を実現する別の方法としては、対物レンズの標本側開口数を変更する方法がある。対物レンズの標本側開口数を変更するには、対物レンズを交換すれば良い。図２５Ｃは、対物レンズを交換した様子を示す図である。

　開口部材４１を有する対物レンズを対物レンズＡとし、開口部材１３０を有する対物レンズを対物レンズＢとする。対物レンズＡと対物レンズＢとでは、標本側開口数が異なる。

　開口部材１３０は、遮光部１３０ａと透過部１３０ｂとを有する。遮光部１３０ａの大きさは、遮光部４１ａの大きさと異なる。すなわち、透過部１３０ｂの大きさは、透過部４１ｂの大きさと異なる。

　上述のように、対物レンズＡと対物レンズＢとでは、標本側開口数が異なる。そのため、対物レンズＡの瞳１４０の径は、対物レンズＢの瞳２９の径と異なる。また、対物レンズの瞳位置における結像光の大きさも、対物レンズＡと対物レンズＢとで異なる。

　よって、対物レンズＡを対物レンズＢに交換することで、結像光Ｌ_SP3が透過部１３０ｂに到達する。すなわち、結像光Ｌ_SP3が開口部材１３０から出射する状態になる。その結果、傾き量の測定可能な範囲を広げることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの標本側開口数の変更は、一つの対物レンズで行うことが好ましい。

　このようにすることで、様々な傾き量を持つ標本を、スムーズに測定することができる。対物レンズの標本側開口数の変更は、例えば、ズーム対物レンズを使用すれば良い。ズーム対物レンズでは、倍率の変化に応じて標本側開口数が変化するようにしておけば良い。あるいは、対物レンズの瞳位置に液晶を配置し、透過領域を変化させて対物レンズの標本側開口数を変更しても良い。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの標本側開口数の変更は、複数の対物レンズを切り替えて行うことが好ましい。

　このようにすることで、様々な傾き量を持つ標本を測定することができる。複数の対物レンズとしては、例えば、倍率が同じで標本側開口数が異なる対物レンズがある。このような複数の対物レンズを使用すれば、対物レンズを切り替えることで、倍率を変更せずに、測定範囲と測定感度を変えることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、瞳倍率は、照明光学系における瞳の径と観察光学系における瞳の径との比であって、瞳倍率の変化は、標本によって生じ、瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップを有することが好ましい。

　図２６は、本実施形態の測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定装置は、誤差を補正するステップＳ９０を有する。

　本実施形態の測定方法では、ステップＳ３４が終わると、ステップＳ９０が実行される。ステップＳ９０は、瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップである。瞳倍率は、照明光学系における瞳の径と観察光学系における瞳の径との比である。この瞳倍率の変化は、標本によって生じる。

　以下、倒立顕微鏡の光学系を用いて説明する。図２７Ａは、保持部の面積が小さい場合の光学系を示す図である。ここでは、照明光学系をコンデンサレンズ２４に置き換え、観察光学系を対物レンズ２８に置き換えて説明する。コンデンサレンズの瞳１５０と、対物レンズの瞳１５１は共役になっている。瞳倍率は、瞳１５０の径と瞳１５１の径との比で求まる。

　上述のように、細胞１５２の観察では、培養液や保存液のような液体１５３に細胞１５２を、保持部１５４で保持した状態で観察が行われる。保持部１５４の面積が大きい場合は、液体１５３の液面は平坦になる。この場合、標本部１５５は平行平板とみなすことができる。よって、保持部１５４の面積が大きい場合は、コンデンサレンズ２４と対物レンズ２８との間に、平行平板が配置された状態になる。

　ここで、コンデンサレンズ２４や対物レンズ２８を薄肉レンズとみなす。そうすると、コンデンサレンズ２４と対物レンズ２８とで構成される光学系の倍率が、瞳１５０の径と瞳１５１の径との比を表している。よって、瞳倍率β_pは以下の式（Ａ）で表される。
　β_p＝ｆ_ob／ｆ_c　　　（Ａ）
　ここで、
　ｆ_obは対物レンズの焦点距離、
　ｆ_cはコンデンサレンズの焦点距離、
である。

　一方、保持部１５４の面積が小さい場合は、液体１５３のコンデンサレンズ２４側の液面は凹面になる。この場合、標本部１５５は平凹レンズとみなすことができる。図２７Ｂは、標本部を平凹レンズに置き換えたときの光学系を示す図である。図２７Ｂに示すように、保持部１５４の面積が小さい場合は、コンデンサレンズ２４と対物レンズ２８との間に、平凹レンズ１５６が配置された状態になる。

　平凹レンズ１５６の焦点距離は、液体１５３の凹面における曲率半径と、液体１５３の屈折率によって決まる。また、液体１５３がほぼ水と同じ親水性を持つので、保持部１５４の面積が小さい程凹面の曲率半径が小さくなる。そのため、保持部１５４を複数持つマイクロウェルプレートでは、凹面の曲率半径がとても小さい。

　対物レンズ２８と平凹レンズ１５６との合成焦点距離ｆ_len-obは、以下の式（Ｂ）で表される。
　ｆ_len-ob＝（ｆ_len×ｆ_ob）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ）　　　（Ｂ）
　ここで、
　ｆ_lenは平凹レンズの焦点距離、
　ｆ_obは対物レンズの焦点距離、
　ｄは対物レンズと平凹レンズとの間隔、
である。

　図２７Ｂに示す光学系では、コンデンサレンズ２４、平凹レンズ１５６及び対物レンズ２８とで構成される光学系の倍率が、瞳１５０の径と瞳１５１の径との比を表している。よって、瞳倍率β_p’は以下の式（Ｃ）で表される。
　β_p’＝ｆ_len-ob／ｆ_c
　　　＝｛（ｆ_len×ｆ_ob）／（ｆ_len＋ｆ_ob－ｄ）｝／ｆ_c
　　　＝（ｆ_len×ｆ_ob）／｛ｆ_c×（ｆ_len＋ｆ_ob－ｄ）｝
　　　＝（β_p×ｆ_len）／（ｆ_len＋ｆ_ob－ｄ）
　　　＝β_p／（１＋（ｆ_ob－ｄ）／ｆ_len）　　　（Ｃ）

　上述のように、対物レンズ２８や平凹レンズ１５６を薄肉レンズとみなしているので、レンズの厚みは無いものとなる。そうすると、間隔ｄは、対物レンズ２８の主点と平凹レンズ１５６の主点との間隔になる。通常の観察では、液体１５３の凹面よりも対物レンズ２８側を観察するのでｆ_ob＜ｄであり、また、液体１５３の凹面は負の屈折力を持つのでｆ_len＜０である。つまり、（（ｆ_ob－ｄ）／ｆ_len）＞０になる。

　これを式（Ｃ）に代入すると、瞳倍率β_p’は以下の式に示すように、瞳倍率β_pに比べて小さくなる。
　β_p’＝β_p／（１＋（ｆ_ob－ｄ)／ｆ_len）＜β_p

　例えば、倒立顕微鏡の光学系では、ｆ_ob＝２０ｍｍ、ｆ_len＝－４ｍｍ、ｄ＝２１ｍｍとすると、以下のように、瞳倍率β_p’は瞳倍率β_pに比べて倍率が小さくなる。
　β_p’＝β_p／（１＋（ｆ_ob－ｄ）／ｆ_len）＝０．８０β_p

　標本部１５５が平凹レンズとみなせる場合、正立顕微鏡においても瞳倍率が変化する。ただし、正立顕微鏡の光学系では、瞳倍率β_p’は瞳倍率β_pに比べて大きくなる。

　このように、瞳倍率の変化は、平凹レンズ１５６の負の屈折力の作用、すなわち、標本によって生じる。瞳倍率が変化すると、対物レンズの瞳１５１を通過する結像光の光量が変化する。この光量の変化は、標本の表面における傾きによって生じたものではないので、測定誤差になる。

　瞳倍率β_p’を求めるには、式（Ｃ）に示すように、平凹レンズ１５６の焦点距離が必要である。平凹レンズ１５６の焦点距離は、上述のように、液体１５３の凹面における曲率半径と、液体１５３の屈折率によって決まる。このうち、液体１５３の凹面における曲率半径を求めることは難しい。そのため、平凹レンズ１５６の焦点距離を求めることは容易ではない。よって、式（Ｃ）を用いて瞳倍率β_p’を求めることは困難である。

　しかしながら、瞳倍率β_p’は、別の方法で求めることができる。例えば、対物レンズの瞳の情報を、標本が存在しない状態と培養液のみが存在する状態とから取得することができる。対物レンズの瞳の情報は、例えば、ベルトランレンズを用いて取得することができる。標本が存在しない状態とは、標本部１５５自体が存在しない状態である。培養液のみが存在する状態とは、標本部１５５において、液体１５３のみが存在している状態である。

　対物レンズと結像レンズとの間は、平行光束になっている。この平行光路内にベルトランレンズを配置する。これにより、対物レンズと結像レンズとで形成される像位置に、対物レンズの瞳の像を形成させることができる。

　図２８Ａは、標本が存在しない状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。図２８Ｂは、培養液のみが存在する状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。

　図２８Ａと図２８Ｂを比較すると分かるように、標本が存在しない状態と培養液のみが存在する状態とでは、結像光１５７と遮光部１５８との境界の位置が異なる。そこで、この境界の位置の違いを利用して、瞳倍率β_p’を求めることができる。

　標本が存在しない状態では、瞳倍率β_pは上記の式（Ａ）で求めることができる。コンデンサレンズの焦点距離と対物レンズの焦点距離は容易に求めることができる。よって、瞳倍率β_pは容易に求めることができる。

　一方、培養液のみが存在する状態では、瞳倍率β_p’は以下の式（Ｄ）で求めることができる。
　β_p’＝ＬＢ／ＬＡ×β_p　　　（Ｄ）
　ここで、
　ＬＡは、標本が存在しない状態での、光軸から所定の境界までの距離、
　ＬＢは、培養液のみが存在する状態での、光軸から所定の境界までの距離、
　所定の境界は、結像光と遮光部との境界、
である。

　瞳倍率β_p、距離ＬＡ及び距離ＬＢは容易に求めることができる。このように、ベルトランレンズを用いることで、瞳倍率β_p’も容易に求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、保持部材と、透明な平行平板と、を有し、保持部材は、液体を保持する保持部を有し、透明な平行平板は、液体の液面と接するように配置されていることが好ましい。

　標本の保持は、保持部材で行われる。標本が生細胞の場合、標本は液体と共に保持部材で保持される。この場合、液体を保持するために、保持部材は保持部を有する。

　図２９Ａは、平行平板が配置されていない場合の液体の様子を示す図である。図２９Ｂは、平行平板が配置されている場合の液体の様子を示す図である。

　図２９Ａに示すように、保持部材１６０は、保持部１６１を有する。保持部１６１は、透明な側面１６０ａと透明な底面１６０ｂとで囲まれた空間である。保持部１６１には、液体１６２が保持されている。

　保持部１６１の面積が小さくなっていくと、図２９Ａに示すように、液面１６３は凹面になる。この場合、液体１６２は負レンズとして作用する。そのため、液体１６２に入射した平行光束１６４は、実線で示すように、発散光束１６５となって底面１６０ｂから出射する。

　これに対して、保持部１６１の面積が大きくなると、液面１６３は平面になる（不図示）。この場合、液体１６２は平行平板とみなせるので、液体１６２ではレンズとしての作用が生じない。そのため、液体１６２に入射した平行光束１６４は、破線で示すように、平行光束１６６となって底面１６０ｂから出射する。

　底面１６０ｂから出射する光束の一部は、光束透過領域の面積に対応している。底面１６０ｂから出射する光束が平行光束１６６の場合、光束透過領域の面積は、図２８Ａに示す結像光１５７の領域になる。底面１６０ｂから出射する光束が発散光束１６５の場合、光束透過領域の面積は、図２８Ｂに示す結像光１５７の領域になる。

　底面１６０ｂから出射する光束の形状は、標本の表面における傾き量に応じて変化する。しかしながら、上述のように、標本が無い場合であっても、底面１６０ｂから出射する光束の形状は常に同じではなく、液面１６３の形状によって変化することがある。また、上述のように、底面１６０ｂから出射する光束の一部は、光束透過領域の面積に対応している。そのため、光束透過領域の面積も、液面１６３の形状によって変化することがある。

　上述のように、光束透過領域の面積は、標本の表面における傾き量を表している。よって、標本の表面における傾き量が同じであっても、例えば、液面１６３の形状が平面の場合と凹面の場合とでは測定結果が異なってしまう。すなわち、液面１６３の形状によっては、測定結果に誤差が生じる可能性がある。

　そこで、図２９Ｂに示すように、透明な平行平板１６７を、液体１６２の液面１６３と接するように配置する。このようにすることで、凹面であった液面１６３の形状が平面になる。その結果、実線で示すように、標本が無い場合であっても、液体１６２に入射した平行光束１６４は、常に平行光束１６６となって底面１６０ｂから出射する。すなわち、液面１６３の形状によって誤差が生じない。

　傾き量の算出では、上述のように、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルや、光量と傾き量とをパラメータとする式が用いられる。本実施形態の標本形状測定装置では、液面１６３の形状によって誤差が生じないので、ルックアップテーブルを用いる場合や、式を用いる場合であっても、液面１６３の形状の影響を考慮する必要がない。

　本実施形態の標本形状測定装置では、透過部を通過する照明光の光強度は、中央と周辺とで異なることが好ましい。

　上述のように、透過部には結像光が到達する。ただし、標本が存在しない場合、透過部には照明光が到達する。ここでは、標本が存在しないものとして説明する。

　透過部を通過する照明光の光強度が中央と周辺とで異なる場合、開口部材に到達する照明光の光強度も、中央と周辺とで異なっている。

　多くの光源では、光源から出射した光の光強度は、中央と周辺とで異なる。光源から出射した光は、照明光学系によって、所望の光束径を持つ照明光に変換される。開口部材に到達する照明光の光強度を中央と周辺とで異なるようにすることで、照明光学系を、基本的にレンズのみで構成することができる。その結果、照明光を簡単に準備することができる。

　このように、透過部を通過する照明光の光強度を中央と周辺とで異なるようにすることで、照明光を簡単に準備することができる。

　開口部材に到達する照明光の光強度分布は、軸対称に分布していることが好ましい。

　開口部材に到達する照明光の光強度分布を軸対称にすることで、透過部が円周上のどこに位置しても、透過部を通過する光強度分布は同じになる。そのため、透過部が円周上のどこに位置していても、同じ測定結果が得られる。その結果、標本の表面の傾き量を素早く、高い再現性で測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、標本の表面形状を素早く、高い再現性で測定できる。

　軸対称な光強度分布は、光軸を含む断面における光強度分布を、光軸を回転軸として回転させたときに得られる分布である。この場合、透過部を通過する照明光における光強度分布は、透過部が円周上のどこに位置しても同じになる。よって、透過部が円周上のどこに位置しても、同じ測定結果が得られる。

　また、上述のルックアップテーブルを用いて、標本の表面における傾き量を求める場合、ルックアップテーブルの数を１つにすることができる。

　透過部に到達する照明光の光強度は、光束の中央から周辺に向かって小さくなっていることが好ましい。

　図３０は、開口部材に到達する照明光の光強度分布を示す図である。照明光１７０は、光強度が不均一に分布している照明光である。開口部材に入射する直前では、照明光１７０の形状は円である。

　照明光１７０では、光束の中央１７１と光束の周辺１７２とで光強度が異なる。中央１７１における光強度は、周辺１７２における光強度よりも大きい。また、光強度は、中央１７１から周辺１７２に向かって小さくなっている。

　開口部材に到達する照明光の光強度は、光束の中央から周辺に向かって大きくなっていることが好ましい。

　図３１は、開口部材に到達する照明光の光強度分布を示す図である。照明光１８０は、光強度が不均一に分布している照明光である。開口部材に入射する直前では、照明光１８０の形状は円である。

　照明光１８０では、光束の中央１８１と光束の周辺１８２とで光強度が異なる。中央１８１における光強度は、周辺１８２における光強度よりも小さい。また、光強度は、中央１８２から周辺１８２に向かって大きくなっている。

　本実施形態の標本形状測定装置では、透過部を通過する照明光の光強度は、透過部の全ての位置で略等しいことが好ましい。

　このようにすると、透過部の形状を変えることで、測定範囲と測定感度を変化させることができる。その結果、様々な傾き量を持つ標本を簡単に測定することができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、傾き量の算出では、予め求めておいた対応関係に基づいて傾き量を算出することが好ましい。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定方法では、結像光の光量に基づいて、傾き量を算出する。そこで、結像光の光量と傾き量との対応関係を、予め求めておく。このようにしておくと、対応関係に基づいて、求めた結像光の光量から、傾き量を迅速に算出することができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルで表わされていることが好ましい。

　図３２は、ルックアップテーブルの例である。図３２に示すように、ルックアップテーブルは、輝度と傾斜角とをパラメータとして有する。輝度は結像光の光量を表し、傾斜角は標本の表面における傾き量を表している。

　ルックアップテーブルを作成するためには、標本の屈折率が必要になる。標本が細胞の場合、細胞内には様々な物質が存在する。そのため、細胞全体の屈折率は、これらの物質の屈折率を平均したときの屈折率（以下、「細胞の平均屈折率ｎ_AVE」という）になる。細胞の平均屈折率ｎ_AVEは、細胞内に存在する物質の種類によって変化する。よって、細胞の平均屈折率ｎ_AVEの値は１つに限られない。

　また、例えば、標本が細胞の場合、細胞の周囲には培養液や保存液が存在することもある。そのため、ルックアップテーブルを作成するためには、培養液の屈折率や保存液の屈折率が必要になる。

　図３２に示すルックアップテーブルは、標本が細胞の場合のルックアップテーブルである。このルックアップテーブルでは、培養液の屈折率又は保存液の屈折率を１．３３としてテーブルを作成している。また、細胞の平均屈折率ｎ_AVEについては、３通り（１．３４、１．３５、１．３６）の屈折率を想定し、各屈折率から求めた結果を１つのテーブルにまとめている。

　ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。算出された値は、結像光の光量を表している。そこで、算出された値と一致する値を、ルックアップテーブルの輝度の中から探す。算出された値と一致した値があれば、その値に対応する傾斜角を、ルックアップテーブルから求める。これにより、標本の表面における傾き量を迅速に求めることができる。

　一方、算出された値と一致する値が、ルックアップテーブルの中に存在しない場合もある。この場合、算出された値に対して最も近い２つの値を、ルックアップテーブルの輝度の中から抽出する。そして、抽出した２つの値を用いて、傾斜角を求めればよい。これにより、標本の表面における傾き量を求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとする式で表わされていることが好ましい。

　上述のように、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓと傾斜角θ_sは式（５）～（１４）で表される。面積Ｓは結像光の光量を表し、傾斜角θ_sは標本の表面における傾き量を表している。

　ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。算出された値は、結像光の光量を表している。そこで、算出された値を面積Ｓに代入して、傾斜角θ_sを求める。このようにすることで、標本の表面における傾き量を求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置は、第二の光源と、光スポットを標本上で走査する走査手段と、瞳投影光学系と、光線分離手段と、共焦点レンズと、共焦点ピンホールと、共焦点検出器と、を備え、第二の光源から出射した光は、瞳投影光学系と対物レンズを通過して標本に入射し、標本からの光の一部は、対物レンズと、瞳投影光学系と、走査手段と、光線分離手段と、共焦点レンズと、を通過し、共焦点レンズを出射した光の一部は、共焦点ピンホールを通過し、共焦点検出器は、共焦点ピンホールを出射した光を受光することが好ましい。

　図３３は本実施形態の別の標本形状測定装置の構成を示す図である。標本形状測定装置２００は、光源２０１と、光線分離素子２０２と、走査ユニット２０３と、瞳投影光学系２０４と、対物レンズ２０７と、瞳投影レンズ２０９と、開口部材２１０と、レンズ２１１と、レンズ２１２と、検出器２１３と、共焦点レンズ２１４と、共焦点ピンホール２１５と、共焦点検出素子２１６と、を有する。

　更に、標本形状測定装置２００は、開口部材２１８と、結像レンズ２１９と、検出素子２２０と、を有する。標本形状測定装置２００では、光源２０１から検出素子２２０までの光路における構成が、図９に示す標本形状測定装置２０の構成と同じになっている。

　よって、標本形状測定装置２００によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　また、標本形状測定装置２００では、光源２０１から対物レンズ２０７までの光路が形成されている。光源２０１は、第二の光源である。光源２０１から照明光が出射する。光源２０１には、レーザのような点光源が用いられる。光源自体が点光源である必要は無い。例えば、面光源とピンホールを組み合わせることで、点光源を実現することができる。

　光源２０１から出射した照明光は、光線分離素子２０２に入射する。光線分離素子２０２では、入射した照明光が、透過光と反射光とに分かれて出射する。２つの光に分ける方法としては、光強度による分割、偏光方向の違いによる分割、波長の違いによる分割がある。

　光線分離素子２０２で反射された照明光は、走査ユニット２０３に入射する。走査ユニット２０３は、２つの光偏向素子で構成されている。偏光素子としては、ガルバノメータスキャナ、ポリゴンスキャナ、音響光偏向素子がある。

　走査ユニット２０３から出射した照明光は、瞳投影光学系２０４に入射する。瞳投影光学系２０４は、レンズ２０５とレンズ２０６で構成されている。瞳投影光学系２０４から出射した照明光は、対物レンズ２０７に入射する。対物レンズ２０７から出射した照明光は、標本２０８上に集光する。標本２０８上には、光スポットが生成される。

　走査ユニット２０３では、走査ユニット２０３に入射した光が、直交する２方向に偏向される。すなわち、走査パターンが生成される。また、瞳投影光学系２０４によって、対物レンズ２０７の瞳と走査ユニット２０３が共役になっている。

　よって、走査ユニット２０３で生成された走査パターンが、対物レンズ２０７の瞳に投影される。そして、この走査パターンに基づいて、光スポットが標本２０８上を移動していく。

　標本２０８が蛍光色素で染色されている場合、標本２０８からは結像光に加えて、蛍光が発生する。発生した蛍光のうち、一部は対物レンズ２０７に入射する。対物レンズ２０７に入射した蛍光は、瞳投影光学系２０４、走査ユニット２０３及び光線分離素子２０２を通過して、共焦点レンズ２１４に入射する。

　蛍光は共焦点レンズ２１４によって、共焦点ピンホール２１５上に集光される。共焦点ピンホール２１５を通過した蛍光は、共焦点検出素子２１６に入射する。これにより、標本の蛍光画像が得られる。この蛍光画像は、焦点深度が非常に狭い画像、いわゆる、共焦点画像である。

　標本形状測定装置２００では、走査ユニット２０３と対物レンズ２０７の間に、光線分離素子２１７が配置されている。光源２０１側から標本２０８を照明すると、標本２０８からの結像光が、光線分離素子２１７に入射する。光線分離素子２１７に入射した結像光の一部は、光線分離素子２１７で反射される。

　反射した結像光を結像レンズ２１９で集光することで、標本２０８の光学像が形成される。また、光学像を受光する検出素子２２０を配置しているので、標本２０８の画像を取得することができる。標本形状測定装置２００では、対物レンズ２０７の瞳位置に、開口部材２１８が配置されている。よって、標本の表面における傾き量の測定を行うことができる。

　このように、本実施形態の標本形状測定装置によれば、共焦点画像の取得と、標本の表面における傾き量の測定と、が行える。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。よって、共焦点画像の取得、傾き量の測定及び表面形状の測定が行える。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定装置では、標本の表面における傾き量の測定や、標本の表面形状の測定が行える。この測定結果を用いて、標本の体積や標本に含まれる細胞の数を算出することができる。

　図３４は、標本の体積や細胞の数を算出する方法のフローチャートである。この方法では、図８に示すステップが用いられる。図８と同じステップについては、説明を省略する。

　標本の体積の算出や、標本に含まれる細胞の数の算出の処理では、図８に示すステップに、測定条件を設定するステップＳ１００と、変数Ｎの値を初期化するステップＳ１０１と、形状を算出ステップＳ１０２と、体積を算出するステップＳ１０３と、細胞の数を算出するステップＳ１０４と、測定回数を確認するステップＳ１０５と、変数Ｎの値を増加するステップＳ１０６と、測定間隔を確認するステップＳ１０７と、変数Ｔの値を初期化するステップＳ１０８と、が加わる。

　ステップＳ２０が終わると、ステップＳ１００が実行される。ステップＳ１００は、測定条件を設定するステップである。ステップＳ１００では、測定間隔Δｔの設定と測定回数ｎの設定が行われる。

　ステップＳ１００が終わると、ステップＳ１０１が実行される。ステップＳ１０１は、変数Ｎの値を初期化するステップである。ステップＳ１０１では、変数Ｎの値が１に設定される。変数Ｎは、測定を実行した回数を表す変数である。ステップＳ１０１が終わると、ステップＳ３１～ステップＳ３４が実行される。

　ステップＳ３４が終わると、ステップＳ１０２が実行される。ステップＳ１０２は、形状を算出ステップである。ステップＳ１０２では、傾き量から標本の形状の算出が行われる。

　ステップＳ１０２が終わると、ステップＳ１０３が実行される。ステップＳ１０３は、体積を算出するステップである。ステップＳ１０３では、標本の形状から体積の算出が行われる。体積の算出は、例えば、標本の形状を積分すれば良い。

　ステップＳ１０３が終わると、ステップＳ１０４が実行される。ステップＳ１０４は、細胞の数を算出するステップである。ステップＳ１０４では、標本の体積から標本に含まれる細胞の数の算出が行われる。

　コロニーは、複数の細胞の集合体である。標本がコロニーの場合、１つの細胞の体積を仮定することで、標本の体積と１つの細胞の体積の比から、標本に含まれる細胞の数の算出することができる。

　コロニーの構造が単層構造の場合、複数の細胞は、例えば、レンズアレイのように分布している。レンズアレイでは、各レンズが凸レンズの場合、底面からの高さは、レンズの面頂で最大となる。よって、レンズ面頂の数から、レンズの数を求めることができる。

　そこで、コロニーの構造が単層構造の場合、全体の形状から最大となる高さの数を求める。このようにすることで、標本に含まれる細胞の数の算出することができる。

　ステップＳ１０４が終わると、ステップＳ１０５が実行される。ステップＳ１０５は、測定回数を確認するステップである。ステップＳ１００では、測定回数ｎが設定されている。ステップＳ１０５では、変数Ｎの値と測定回数ｎとの比較が行われる。

　変数Ｎの値と測定回数ｎが等しい場合、予定していた回数だけ測定が行われたことになる。よって、測定を終了する。

　変数Ｎの値と測定回数ｎが等しくない場合、予定していた回数だけ測定が行われていないことになる。この場合、ステップＳ１０６が実行される。ステップＳ１０６は、変数Ｎの値を増加するステップである。ステップＳ１０６では、変数Ｎの値に１が加算される。

　ステップＳ１０６が終わると、ステップＳ１０７が実行される。ステップＳ１０７は、測定間隔を確認するステップである。ステップＳ１０７では、変数Ｔの値と測定間隔Δｔとの比較が行われる。変数Ｔは、前回の測定が終了してから経過した時間を表す変数である。

　変数Ｔの値と測定間隔Δｔが等しい場合、予定していた間隔だけ時間が経過したことになる。この場合、ステップＳ１０８が実行される。ステップＳ１０８は、変数Ｔの値を初期化するステップである。ステップＳ１０８では、変数Ｔの値に０が設定される。ステップＳ１０８が終わると、ステップＳ３１が実行される。

　変数Ｔの値と測定間隔Δｔが等しくない場合、予定していた間隔だけ時間が経過していないことになる。この場合、ステップＳ１０７が実行される。

　ステップＳ１０７が繰り返し実行されることで、時間が経過する。時間の計測は処理装置で行うことができる。変数Ｔの値は、処理装置で計測した時間の値が常時入力されている。よって、ステップＳ１０７が繰り返し実行されることで、変数Ｔの値は増加する。

　図３４に示すフローチャートでは、測定間隔Δｔで測定がおこなわれている。時間の経過と共に、標本の体積が変化する様子や、標本に含まれる細胞の数が変化する様子を把握することができる。これらの変化をグラフにして表すことができる。

　照明光学系に配置された絞りについて説明する。図３５は、変形例１の絞りを示す図、図３６は、変形例２の絞りを示す図である。

　変形例１の絞り３００は、遮光部３００ａと透過部３００ｂとを有する。遮光部３００ａの形状は円で、透過部３００ｂの形状は円環である。照明光学系１に配置された状態では、遮光部３００ａは光軸を含むように位置している。

　変形例２の絞り３１０は、遮光部３１０ａと透過部３１０ｂとを有する。透過部３００ｂの形状は任意である。照明光学系１に配置された状態では、遮光部３１０ａは光軸を含むように位置している。

　開口部材の変形例について説明する。変形例１の開口部材を図３７Ａに示す。変形例１の開口部材４００は、開口部材６０の変形例である。

　図３７Ａに示すように、開口部材４００は、遮光部４００ａと透過部４００ｂとを有する。開口部材４００が観察光学系の光路に挿入された場合、開口部材４００は、遮光部４００ａが光軸３５を含むように配置される。透過部４００ｂは、光軸３５に対して偏心した場所に位置している。

　遮光部４００ａと透過部４００ｂとの間には、境界線４０１が形成されている。境界線４０１によって、遮光部４００ａと透過部４００ｂとが区分されている。

　開口部材４００に対物レンズの瞳２９を重ねたとき、境界線４０１と対物レンズの瞳２９の外縁とが、点４０２と点４０３とで交わっている。点４０２と点４０３は所定の２点である。直線４０４は、点４０２と点４０３とを通過する直線である。

　境界線４０１は、２本の直線で構成されている。２本の直線は、遮光部４００ａから透過部４００ｂに向かって境界線４０１が凸となるように形成されている。よって、開口部材４００では、直線４０４が、境界線４０１と光軸３５との間に位置する。

　開口部材４００を用いることで、より大きな表面の傾き量を持つ標本を測定することができる。

変形例２の開口部材を図３７Ｂに示す。変形例２の開口部材４１０は、開口部材６０の変形例である。

　図３７Ｂに示すように、開口部材４１０は、遮光部４１０ａと透過部４１０ｂとを有する。開口部材４１０が観察光学系の光路に挿入された場合、開口部材４１０は、遮光部４１０ａが光軸３５を含むように配置される。透過部４１０ｂは、光軸３５に対して偏心した場所に位置している。

　遮光部４１０ａと透過部４１０ｂとの間には、境界線４１１が形成されている。境界線４１１によって、遮光部４１０ａと透過部４１０ｂとが区分されている。

　開口部材４１０に対物レンズの瞳２９を重ねたとき、境界線４１１と対物レンズの瞳２９の外縁とが、点４１２と点４１３とで交わっている。点４１２と点４１３は所定の２点である。直線４１４は、点４１２と点４１３とを通過する直線である。

　境界線４１１は、３本の直線で構成されている。３本の直線は、遮光部４１０ａから透過部４１０ｂに向かって境界線４１１が凸となるように形成されている。よって、開口部材４１０では、直線４１４が、境界線４１１と光軸３５との間に位置する。

　開口部材４１０を用いることで、より大きな表面の傾き量を持つ標本を測定することができる。

変形例３の開口部材を図３８Ａに示す。変形例３の開口部材４２０は、開口部材７０の変形例である。

　図３８Ａに示すように、開口部材４２０は、遮光部４２０ａと透過部４２０ｂとを有する。開口部材４２０が観察光学系の光路に挿入された場合、開口部材４２０は、遮光部４２０ａが光軸３５を含むように配置される。透過部４２０ｂは、光軸３５に対して偏心した場所に位置している。

　遮光部４２０ａと透過部４２０ｂとの間には、境界線４２１が形成されている。境界線４２１によって、遮光部４２０ａと透過部４２０ｂとが区分されている。

　開口部材４２０に対物レンズの瞳２９を重ねたとき、境界線４２１と対物レンズの瞳２９の外縁とが、点４２２と点４２３とで交わっている。点４２２と点４２３は所定の２点である。直線４２４は、点４２２と点４２３とを通過する直線である。

　境界線４２１は、２本の直線で構成されている。２本の直線は、遮光部４２０ａから透過部４２０ｂに向かって境界線４２１が凹となるように形成されている。よって、開口部材４２０では、境界線４２１が、直線４２４と光軸３５との間に位置する。

　開口部材４２０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。

　変形例４の開口部材を図３８Ｂに示す。変形例４の開口部材４３０は、開口部材７０の変形例である。

　図３８Ｂに示すように、開口部材４３０は、遮光部４３０ａと透過部４３０ｂとを有する。開口部材４３０が観察光学系の光路に挿入された場合、開口部材４３０は、遮光部４３０ａが光軸３５を含むように配置される。透過部４３０ｂは、光軸３５に対して偏心した場所に位置している。

　遮光部４３０ａと透過部４３０ｂとの間には、境界線４３１が形成されている。境界線４３１によって、遮光部４３０ａと透過部４３０ｂとが区分されている。

　開口部材４３０に対物レンズの瞳２９を重ねたとき、境界線４３１と対物レンズの瞳２９の外縁とが、点４３２と点４３３とで交わっている。点４３２と点４３３は所定の２点である。直線４３４は、点４３２と点４３３とを通過する直線である。

　境界線４３１は、３本の直線で構成されている。３本の直線は、遮光部４３０ａから透過部４３０ｂに向かって境界線４３１が凹となるように形成されている。よって、開口部材４３０では、境界線４３１が、直線４３４と光軸３５との間に位置する。

　開口部材４３０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。

　以上のように、本発明は、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置に適している。

　１　照明光学系
　２　観察光学系
　３　ステージ
　４　絞り
　４ａ　遮光部
　４ｂ　透過部
　５　コンデンサレンズ
　６　対物レンズ
　７　開口部材（対物レンズの瞳）
　７ａ　遮光部
　７ｂ　透過部
　８　標本
　９　液浸媒質（浸液）
　１０　光軸
　１１　観察点
　１２　対物レンズの瞳の縁
　１３　面の法線
　２０　標本形状測定装置
　２１　光源
　２２、２３　レンズ
　２４　コンデンサレンズ
　２５　絞り
　２６　保持部材
　２７　標本
　２８　対物レンズ
　２９　対物レンズの瞳
　３０　開口部材
　３１　結像レンズ
　３２　像位置
　３３　検出素子
　３４　処理装置
　３５　光軸
　３６　対物レンズの瞳の共役像
　３７、３８　レンズ
　４０、４１、４２　開口部材
　４０ａ、４１ａ、４２ａ　遮光部
　４０ｂ、４１ｂ、４２ｂ　透過部
　５０、６０、７０　開口部材
　５０ａ、６０ａ、７０ａ、　遮光部
　５０ｂ、６０ｂ、７０ｂ、　透過部
　５１、６１、７１　境界線
　６２、６３、７２、７３　所定の２点
　６４、７４　直線（２点を結ぶ直線）
　８０　面光源
　９０　標本形状測定装置
　９１　第１の開口部材
　９１ａ　遮光部
　９１ｂ　第１の透過部
　９２　第２の開口部材
　９２ａ　遮光部
　９２ｂ　第２の透過部
　９３　移動機構
　１００　開口部材
　１００ａ　遮光部
　１００ｂ　第１の透過部
　１００ｃ　第２の透過部
　１１０　開口部材
　１１０ａ　遮光部
　１１０ｂ　透過部
　１２０、１３０　開口部材
　１２０ａ、１３０ａ、　遮光部
　１２０ｂ、１３０ｂ　透過部
　１４０　対物レンズＡの瞳
　１５０　コンデンサレンズの瞳
　１５１　対物レンズの瞳
　１５２　細胞
　１５３　液体
　１５４　保持部
　１５５　標本部
　１５６　平凹レンズ
　１５７　結像光
　１５８　遮光部
　１６０　保持部材
　１６０ａ　透明な側面
　１６０ｂ　透明な底面
　１６１　保持部
　１６２　液体
　１６３　液面
　１６４、１６６　平行光束
　１６５　発散光束
　１６７　透明な平行平板
　１７０、１８０　照明光
　１７１、１８１　光束の中央
　１７２、１８２　光束の周辺
　２００　標本形状測定装置
　２０１　光源
　２０２　光線分離素子
　２０３　走査ユニット
　２０４　瞳投影光学系
　２０５、２０６　レンズ
　２０７　対物レンズ
　２０８　標本
　２０９　瞳投影レンズ
　２１０　開口部材
　２１１、２１２　レンズ
　２１３　検出器
　２１４　共焦点レンズ
　２１５　共焦点ピンホール
　２１６　共焦点検出素子
　２１７　光線分離素子
　２１８　開口部材
　２１９　結像レンズ
　２２０　検出素子
　３００、３１０　絞り
　３００ａ、３１０ａ　遮光部
　３００ｂ、３１０ｂ　透過部
　４００、４１０、４２０、４３０　開口部材
　４００ａ、４１０ａ、４２０ａ、４３０ａ　遮光部
　４００ｂ、４１０ｂ、４２０ｂ、４３０ｂ　透過部
　４０１、４１１、４２１、４３１　境界線
　４０２、４０３、４１２、４１３、４２２、４２３、４３２、４３３　所定の２点
　４０４、４１４、４２４、４３４　直線（２点を結ぶ直線）
　Ｌ_IL1、Ｌ_IL2　照明光
　Ｌ_SP1、Ｌ_SP2、Ｌ_SP3　結像光

Claims

　所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップと、
　前記照明光を標本に照射するステップと、
　所定の処理ステップと、を有し、
　前記所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含むように設定され、
　前記照明光は前記標本を透過し、
　前記標本から出射した光は観察光学系に入射し、
　前記観察光学系に入射した光は、前記観察光学系の瞳位置に設定された透過部、又は、前記観察光学系の瞳の共役像の位置に設定された透過部を通過し、
　前記透過部は、前記観察光学系の瞳に到達した光の一部、又は、前記共役像に到達した光の一部を透過するように設定され、
　前記所定の処理ステップは、
　前記観察光学系から出射した光を受光するステップと、
　前記受光した光の光量を求めるステップと、
　前記光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出するステップと、
　前記差及び比の少なくとも一方から、前記標本の表面における傾き量を算出するステップと、を有することを特徴とする標本形状測定方法。
　照明光学系と、観察光学系と、検出素子と、処理装置と、を備え、
　前記照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、を有し、
　前記観察光学系は、対物レンズと、開口部材と、結像レンズと、を有し、
　前記照明光学系と前記観察光学系との間に標本は配置され、
　前記照明光学系により前記標本に照射された照明光は、前記標本を透過し、
　前記標本から出射した光は前記観察光学系に入射し、
　前記検出素子は、前記観察光学系から出射した光を受光し、
　前記処理装置は、
　前記受光した光に基づく光量を求め、
　前記光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、
　前記差及び比の少なくとも一方から、前記標本の表面における傾き量を算出し、
　前記傾き量から前記標本の形状を計算することを特徴とする標本形状測定装置。
　前記開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、
　前記遮光部は、前記対物レンズの光軸を含むように設けられ、
　前記透過部は、前記照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように設けられることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、
　前記遮光部は、前記対物レンズの光軸を含むように設けられ、
　前記透過部は、前記光軸に対して偏心しており、前記照明光学系の瞳の像の縁の一部を含むように設けられていることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、
　前記遮光部は、前記対物レンズの光軸を含むように設けられ、
　前記透過部は、前記光軸を含まず、前記照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように設けられていることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　以下の条件式を満たすことを特徴とする請求項４に記載の標本形状測定装置。
　Ｒ０＜Ｒill×β＜Ｒ１
ここで、
　Ｒ０は、前記対物レンズの光軸から所定の位置までの長さ、
　Ｒ１は、前記対物レンズの光軸から前記透過部の外縁までの長さであって、前記対物レンズの光軸と前記所定の位置とを結ぶ線上における長さ、
　前記所定の位置は、前記遮光部の内縁上の位置のうち、前記対物レンズの光軸からの長さが最小となる位置、
　Ｒillは、前記照明光学系の瞳の半径、
　βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。
　前記開口部材は、前記遮光部と前記透過部とを区分する境界線を有し、
　前記境界線は、前記光軸と直交する１本の直線と平行な線で構成されていることを特徴とする請求項４に記載の標本形状測定装置。
　前記開口部材は、前記遮光部と前記透過部とを区分する境界線を有し、
　所定の２点を結ぶ直線が、前記境界線と前記光軸との間に位置することを特徴とする請求項４に記載の標本形状測定装置。
　ここで、前記所定の２点は、前記開口部材に前記照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と前記照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。
　前記開口部材は、前記遮光部と前記透過部とを区分する境界線を有し、
　前記境界線が、所定の２点を結ぶ直線と前記光軸との間に位置することを特徴とする請求項４に記載の標本形状測定装置。
　ここで、前記所定の２点は、前記開口部材に前記照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と前記照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。
　前記照明光学系は前記所定の照明領域を有し、
　前記所定の照明領域に、面光源が配置されるか、又は前記面光源の像が形成され、
　前記観察光学系から出射した光を受光することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記所定の照明領域を通過する照明光が平行光束であることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　光路に挿入離脱する第１の開口部材と第２の開口部材とを有し、
　前記第１の開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第１の透過部を有し、
　前記第２の開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第２の透過部を有し、
　前記第１の開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第１の透過部重心を結ぶ方向と、前記第２の開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第２の透過部重心を結ぶ方向と、は交差することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、
　前記光軸に対して偏心した位置に第１の透過部と第２の透過部とを有し、
　前記開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第１の透過部重心を結ぶ方向と、前記光軸と第２の透過部重心を結ぶ方向と、は交差することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、
　前記光軸に対して偏心した位置に透過部を有し、
　前記光軸と透過部重心を結ぶ方向を変更可能であることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記遮光部の大きさと前記対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方が変更可能であることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記対物レンズの標本側開口数の変更は、一つの対物レンズで行うことを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記対物レンズの標本側開口数の変更は、複数の対物レンズを切り替えて行うことを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　瞳倍率は、前記照明光学系における瞳の径と前記観察光学系における瞳の径との比であって、
　前記瞳倍率の変化は、標本によって生じ、
　前記瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップを有することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記保持部材と、透明な平行平板と、を有し、
　前記保持部材は、液体を保持する保持部を有し、
　前記透明な平行平板は、前記液体の液面と接するように配置されていることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記透過部を通過する照明光の光強度は、中央と周辺とで異なることを特徴とする請求項２から１９のいずれか１項に記載の標本形状測定装置。
　前記透過部を通過する照明光の光強度は、前記透過部の全ての位置で略等しいことを特徴とする請求項２から１９のいずれか１項に記載の標本形状測定装置。
　前記傾き量の算出では、予め求めておいた対応関係に基づいて前記傾き量を算出することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。
　前記対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルで表わされていることを特徴とする請求項２２に記載の標本形状測定装置。
　前記対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとする式で表わされていることを特徴とする請求項２２に記載の標本形状測定装置。
　第二の光源と、光スポットを前記標本上で走査する走査手段と、瞳投影光学系と、光線分離手段と、共焦点レンズと、共焦点ピンホールと、共焦点検出器と、を備え、
　前記第二の光源から出射した光は、前記瞳投影光学系と前記対物レンズを通過して前記標本に入射し、
　前記標本からの光の一部は、前記対物レンズと、前記瞳投影光学系と、前記走査手段と、前記光線分離手段と、前記共焦点レンズと、を通過し、
　前記共焦点レンズを出射した光の一部は、前記共焦点ピンホールを通過し、
　前記共焦点検出器は、前記共焦点ピンホールを出射した光を受光することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定装置。