JP3721437B2 - 単離チロシナーゼ由来ペプチド抗原とその利用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、1992年12月22日に出願された同時係属の米国特許出願第994,928号の一部継続出願である1993年4月28日出願の同時係属の米国特許出願第054,714号の一部継続出願である1993年6月23日に出願された同時係属の米国特許第08/081,673号の一部継続出願である1994年2月28日に出願された同時係属の米国特許第08/203,054号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、HLA−A2及びHLA−B44分子によって提示されるチロシナーゼ由来の単離ペプチドと、その利用方法に関する。加えて、本発明は、その異常細胞がこれらのペプチドとHLA−A2及びHLA−B44との複合体を提示する細胞異常によって特徴付けられる症状を有すると診断される個体の同定の可能性と、その提示ペプチド、更にこれらから導かれる応用とに関する。
発明の背景
ほ乳類の免疫システムが外来物質又は異物を認識しこれらに対して反応するプロセスは複雑なものである。このシステムの重要な側面は、T細胞反応である。この反応の為には、T細胞が、ヒト白血球抗原(HLA)又は主要組織適合性抗原複合体(MHC)と称される細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これらに対して反応する必要がある。これらペプチドは、前記HLA/MHC分子も提示する細胞によってプロセシングされるより大きな分子から由来するものである。この点に関しては、メール(Male)他のAdvanced Immunology(ジェイ・ピー・ルピンコット・カンパニー(J.P.Lipincott Company),1987)、特にその第6〜10章参照。T細胞とHLA/ペプチド複合体との間の相互反応は、特定のHLA分子とペプチドとの複合体に対して特定のT細胞が必要であるという意味において制限されている。即ち、もし特定のT細胞が存在しないならば、たとえそのパートナー複合体が存在してもT細胞反応は起こらない。同様に、もし特定の複合体が存在していなければ、対応するT細胞が存在していても反応は起こらない。このメカニズムが、異物に対する免疫システムの反応、及び自己免疫疾患や種々の細胞異常に対する免疫システムの反応に関与している。最近、タンパク質がHLA結合ペプチドとプロセシングされるメカニズムに関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ(Barinaga),Science257:880(1992);フリーモント(Fremont)他,Science257:919(1992);マツムラ(Matsumura)他,Science257:927(1992);ラトロン(Latron)他,Science257:964(1992)参照。
T細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、癌にも関係している。例えば、ここに参考文献として添付する、1992年5月22日に出願され1992年11月26日に公開されたPCT出願PCT/US92/04354において、1つの遺伝子ファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、ペプチドとプロセシングされ、これらのペプチドが細胞表面に発現することによって、特定のCTLによる腫瘍細胞のリーシス(細胞溶解)が可能となる。これらの遺伝子は、”腫瘍拒絶抗原先駆体”、略称”TRAP”分子をコードするものであると言われており、これらに由来するペプチドは、”腫瘍拒絶抗原”即ち”TRA”と称される。この遺伝子ファミリーに関する更に詳しい情報については、トラヴァーサリ(Traversari)他,Immunogenetics 35:145(1992);ファン・デア・ブルッゲン(van der Bruggen)他,Science254:164 3(1991)参照。
ここに参考文献として添付した米国特許出願第938,334号には、前記HLA−A1分子に結合するノナペプチドが教示されている。この文献によれば、特定のHLA分子に対する特定のペプチドの特異性が判っていれば、ひとつの特定のペプチドは1つのHLAにのみ結合し、他のHLAには結合しないと予測出来るとされている。これは重要である。というのは、HLAの表現型は個々人によって異なっているからである。その結果、特定のペプチドが特定のHLA分子に対するパートナーであることの同定が、そこから導かれる診断的及び治療的効果を有していても、これらはその特定のHLA表現型を有する個体にしか適用できない。従って、細胞異常は1つの特定のHLA表現型に限られていないので、この領域において更なる研究が必要であり、標的療法の為には問題の異常細胞の表現型に関するなんらかの知識が必要である。
酵素チロシナーゼは、チロシンをジハイドロキシフェニールアラニン即ち”DOPA”へ変換する反応に対して触媒作用を及ぼし、これは専らメラノサイト(黒色素胞)に発現されると思われる(ミュラー(Muller)他,EMBOJ 7:2715(1988))。ヒト酵素のcDNAに関する比較的初期の報告はクウォン(Kwon)の米国特許第4,898,814号に見られる。そして、ブーチャード(Bouchard)他,J.Exp.Med.169:2029(1989)によるより最近の報告には、僅かに異なった配列が提示されている。この酵素に対するインヒビタの同定に関して非常に多くの研究が行われてきた。というのは、それが色素形成疾患に関係していたからである。この点に関する参考文献としては、例えば、ジンバウ(Jinbow),WO9116302;ミシマ(Mishima)他,米国特許第5,077,059号、ナッツァロポール(Nazzaropor)米国特許第4,818,768号が挙げられるが、これらに類似の参考文献も当業者にとっては周知であろう。
1993年6月23日に出願されここに参考文献として添付する米国特許出願第08/081,673号は、チロシナーゼが外来抗原又はTRAP分子に類似の方法でプロセシングされうることを教示している。即ち、メラノーマ(黒色腫)等のある種の細胞異常において、チロシナーゼがプロセシングされ、そこから派生するペプチドがある種の異常細胞上においてHLA分子と複合体を形成することが判ったのである。これらの複合体は、細胞傷害性T細胞(”CTLs”)によって認識されることが判り、その後、CTLが提示細胞を溶解する。この驚くべき、かつ意外な現象から導かれる応用が記載された。今回、同様にHLA−A2分子によって提示される腫瘍拒絶抗原として作用する更に別のペプチドが発見された。これらは、1994年2月28日に出願され、ここに参考文献として添付する出願番号第08/203,054号に記載されている。
今回、チロシナーゼから派生する更に別のペプチドが、MHC分子HLA−B44によって提示され、細胞傷害性T細胞によって溶解される腫瘍拒絶抗原であることが判った。
【図面の簡単な説明】
図1は、すべて細胞溶解に関する研究を説明するものであり、ここで、
図1Aは、細胞系LB24−MELの溶解を示し、
図1Bは、細胞系SK29−MELの溶解を示し、
図1Cは、細胞系LB4.MELの溶解を示し、
図1Dは、細胞系SK23.MELの溶解を示し、
図1Eは、細胞系LE516.MELの溶解を示し、
図1Fは、HLA−A2発現を喪失した細胞系SK29−MEL.1.22の溶解を示し、
図1Gは、MZ2−MELの溶解の欠如を示し、
図1Hは、NK標的K562に関する溶解の研究を示し、
図1Iは、HLA−A2に対する遺伝子のトランスフェクション後における図1Fの喪失変異体(lossvariant)の溶解を示し、
図1Jは、患者SK29からの自己由来EBV形質転換B細胞の溶解を示し、
図2は、CTL IVSBのTNF放出の研究を示し、
図3は、CTL 210/9のTNF放出の研究を示し、
図4は、ペプチドYMNGTMSQVが細胞傷害性T細胞クローンCTL−IVSBによって認識されるが細胞傷害性T細胞クローンCTL2/9によっては認識されないことを示し、
図5は、ペプチドYMNGTMSQVが細胞傷害性T細胞クローンCTL210/9によっては認識されないことを示し、
図6は、その表面にHLA−B44を提示する細胞を含む種々の細胞に対してTNF放出アッセイを行うことによって得られた結果を示し、
図7は、すべて、3種類の細胞系に対する、本出願に記載されたペプチドを使用した一連のクロム放出アッセイを示し、
図7Aは、配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドが使用された実験を示し、
図7Bは、配列認識番号(SEQ ID NO):5のペプチドが使用された実験を示し、
図7Cは、配列認識番号(SEQ ID NO):2を使用して得られた結果を示す。
図7において、記号”○”が細胞系T2に対して使用され、”■”がHLA−A2を提示しないMZ2−MELに対して使用され、”●”がトランスフェクションされてHLA−A2を提示するMZ2−MELに対して使用されている。例12はこれらのテストについて詳述している。
図8A及び8Bは、MHC分子HLA−B44を提示する細胞系、及び細胞傷害性T細胞クローン22/21(以下”CTL23/31”)を使用した研究を示す。図8Aにおいて、前記細胞系(”Rosi EBV”)は、モノクローナル抗体W6/32の存在下にて前培養され、これに対して図8Bにおいて、このような前培養は行われなかった。
好適実施例の詳細な説明
例 1
以下の実験において、研究者にとって古くから入手可能であったメラノーマ細胞系SK 29−MEL(文献においてはSK MEL−29とも称される)とLB24−MELとを使用した。
患者のSK29(AV)及びLB24から(これらの患者から、それぞれ、SK29−MELとLB24−MELも採取した)、単核血液細胞を含むサンプルを採取した。これらの単核血液細胞を含むサンプルに、メラノーマ細胞系を接触させた。この混合物のメラノーマの溶解を観察したところ、サンプル中に、メラノーマ細胞によって提示されたペプチドとHLA分子との複合体に対して特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)が存在していることが判った。
使用した溶解アッセイは、その開示内容をここに参考文献として添付するヘリン(Herin)他,Int.J.Cancer39:390〜396(1987)によるクロム放出アッセイであった。
しかし、このアッセイについてはここにおいても説明しておく。標的メラノーマ細胞をインビトロで成育させ、次に、これを10mMのHEPESと30%のFCSとを添加したDMEM中で107セル/mlの密度で再懸濁させ、200μCi/mlのNa(51Cr)O4と共に37℃で45分間培養した。標識化した細胞を、10mMのHepesを添加したDMEMで3回洗浄した。次に、これらを、10mMのHepesと10%のFCSとを添加したDMEM中で再懸濁させ、その後、それぞれ103の細胞を含む懸濁液100ulずつを96ウェルのマイクロプレートに分けた。100ulの同じ培養液にPBLのサンプルを添加し、同様にアッセイを行った。プレートを100gで4分間遠心分離にかけ、5.5%の二酸化炭素を含有する雰囲気中にて37℃で4時間培養した。
プレートを再び遠心分離にかけ、100ulの上清液を収集し、放射線をカウントした。51Cr放出の割合は以下の式によって表される。
ここで、ERは、観察された実験51Cr放出量、SRは103の標識化細胞を200ulの培養液だけの中で培養することによって測定された自然放出量、そしてMRは、標的細胞に100ulの0.3% TritonX−100を添加することによって得られた最大放出量である。
高いCTL活性を示したこれらの単核血液サンプルを、拡張(expanded)して制限希釈によってクローン化し、前述と同じ方法によって再度スクリーニングした。
標的K562細胞のテストも同じ方法で行った。
EBV−形質転換B細胞(EBV−B)を使用した時の唯一の相違点は、DMEM培養液の代わりに、5%のFCSを添加したハンク(Hank)培地を使用したことであった。
これらの実験によって、患者SK29(AV)からCTLクローン”IVSB”と、患者LB24からCTLクローン210/9とがそれぞれ単離された。
図1のA,B,G及びIは、それぞれ、これらのアッセイの結果を示している。これらから、両方のCTLが両方のメラノーマ細胞系を溶解したことと、K562及びEBV−B細胞系は溶解されなかったこと、とが判る。
例 2
前述のCTLを他のメラノーマ細胞系に対してもテストし、これらのCTLが他のメラノーマ細胞系をも標的とすることが出来るかどうかを調べた。細胞系LB4.MEL,SK23.MEL(SK MEL−23としても知られている)及びLE516.MELに対して例1に記載した溶解を調べた。図1のC,D及びEは、前記クローンがこれらの細胞系をも溶解したことを示している。
テストした細胞系はHLA−A2型であることが知られており、その実験結果は、前記CTLがペプチドとHLA−A2との複合体に対して特異性を有していることを示唆している。更に、この示唆は、HLA−A2発現を喪失したSK29−MELの変異体をテストすることによって事実であることが確かめられた。図1Fはその結果を示す。即ち、どちらのクローンもこのHLA−喪失変異体は溶解しなかったのである。但し、この変異体をSK29−MELのHLA−A2遺伝子でトランスフェクションし、再テストした場合には、溶解が観察された。従って、前記提示分子はHLA−A2であると結論付けることができる。
例 3
提示分子としてHLA分子が同定されたところで、提示されたペプチドの源である、以下の記載において”腫瘍拒絶抗原先駆体”即ち”TRAP”分子と呼称される分子を同定するための研究を行った。
この目的のために、SK29−MELのサブクローンである細胞系SK29−MEL.1からその全RNAを単離した。このRNAの単離は、オリゴ−dT結合キットを使用し、周知の技術に従って行った。全RNAを得た後、これを、再び標準方法を使用して、cDNAに転写した。このcDNAを、製造業者の指示に従って、EcoRIアダプタに結合し、プラスミドpcDNA−I/AmpのEcoRIサイトにクローン化した。次に、これらの組替えプラスミドをE.coli JM101にエレクトロポレーションした(エレクトロポレーション条件:25μファラドで1パルス、2500V)。
トランスフェクションしたバクテリアをアンピシリン(50μg/ml)によって選抜し、次に、それぞれ200のクローンを有する700のプールに分割した。分析したところ約50%のプラスミドがインサートを有していたので、各プールは、約100種類のcDNAを示したことになる。各プールを増殖させて飽和させ、プラスミドDNAを、マニアティス(Maniatis)他,in Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,N.Y.,1982)に従い、アルカリ溶解、酢酸カリウム沈澱、フェノール抽出によって単離した。セシウム勾配遠心分離は使用しなかった。
例 4
増幅したプラスミドを真核細胞にトランスフェクションした。COS−7細胞のサンプルを、組織培養平底マイクロウェルに15,000セル/ウェルの割合で10%の胎児ウシ血清を添加したDulbeco’s Modified Eagles培地(DMEM)中に播種(seed)した。これらの細胞を、37℃で一晩培養し、培地を除去し、これを、10%のNu血清、400μg/mlのDEAE−デキストラン、100μMのクロロギン、100ngのプラスミドpcDNA−I/Amp−A2、及び前述のcDNAライブラリのプールの100ngのDNAを含有する30μl/ウェルのDMEM培地によって置換した。プラスミドpcDNA−I/Amp−A2は、SK29−MEL由来のHLA−A2遺伝子を含有している。37℃での4時間の培養後、前記培地を除去し、10%のDMSOを含有する50μlのPBSによって置換した。この培地を2分後に除去し、10%のFCSを添加した200μlのDMEMによって置換した。
この培地の変更後、COS細胞を37℃で48時間培養した。次に、培地を捨て、2000細胞の前述のCTLクローンのいずれかを、10%のプールされたヒト血清を含有するアイスコーブ(Iscove)培地100μl中に添加した。クローン210/9が使用された場合には、培地に25U/mlのIL−2を添加した。24時間後、上清を除去し、この文献の開示内容を参考文献として添付したトラヴァーサリ(Traversari)他,Immunogenetics 35:145−152(1992)に記載されているように、WEHI細胞上のアッセイによってTNF含有率を測定した。
IVSBでテストされた700のウェルの内、696のウェルが1ミリリットル当り0.6ないし4pgのTNFを示した。残りの4つのウェルは、1ミリリットル当り10ないし20pgのTNFを含有していた。CTL210/9でテストした同一のウェルも、類似の、明らかにより高い値を示した。図2及び3にこれらのデータを示す。
例 5
高生成プールとして同定された4つのプールの内の3つ(番号”123”,”181”及び”384”)を選択して更に実験を行った。具体的には、バクテリアをクローン化し、各プールから570のバクテリアをテストした。そこからプラスミドDNAを抽出し、前述と同じ方法により、COS細胞の新しいサンプルにトランスフェクションし、これらの細胞のCTL210/9及びCTL IVSBの活性化に対して再度テストした。1つの陽性クローンがプール123に見つかり(”p123.B2”)、もう1つがプール384に見つかった(”p384.C6”)。cDNAとHLA−A2遺伝子とでトランスフェクションしたCOS細胞と、HLA−A2のみでトランスフェクションしたCOS細胞との比較テストをすることによって、トランスフェクションされた細胞がCTLによって認識されたという確証が得られた。CTL上清中のTNFの放出量を、WEHI細胞上のテストによって測定した。生存WEHI細胞の吸光度(OD)をMTTを使用して測定した。その結果を表1に示す。
WEHIのODの値は、cDNAプラスHLA−2Aについては24pg/mlのTNFに対応し、一方、コントロールに対しては2.3pg/mlであった。
前記陽性クローンからのプラスミドを取り出し、公知の技術によって配列決定した。その配列調査(シーケンスサーチ)の結果、そのプラスミドインサートは、その開示内容を参考文献として添付するブーチャード(Bouchard)他,J.Exp.Med.169:2029(1989)に記載されているように、ヒトのチロシナーゼのcDNA配列とほとんど同一であることが判った。従って、正常に存在する分子(即ち、チロシナーゼ)が、腫瘍拒絶抗原先駆体として作用し、これがプロセシングされて、HLA−2Aとともに細胞の表面に提示されるペプチド腫瘍拒絶抗原を形成し、これによってCTLクローンによる溶解を活性化するものと推測される。同定された分子の塩基配列は配列認識番号(SEQ ID NO):1として示されている。
例 6
チョメス(Chomez)他,Immunogenetics 35:241(1992)によって報告されている先行研究は、抗原的ペプチドをコードする配列を含む小さな遺伝子フラグメントによって該ペプチドの発現が生じることを示した。その全部を参考文献としてここに添付するこの研究は、前述し、配列認識番号(SEQ ID NO):1に示したヒトチロシナーゼcDNAの小部分のクローン化を示唆している。前述の例1〜5に記載した方法を使用して、このcDNAの様々なフラグメントをCOS−7細胞にHLA−A2の遺伝子と共移入(コトランスフェクション)し、TNF放出アッセイを行った。これらの実験によって、共移入実験に使用された時に、HLA−A2提示細胞に対する特異性を有することが示された前述の細胞溶解T細胞クローンCTL IVBSからのTNF放出を活性化する約400塩基対のフラグメントが同定された。使用した約400基本対のフラグメントは、配列認識番号(SEQ ID NO):1の塩基711〜1152に対応していた。このフラグメントがコードするアミノ酸配列が導かれ、次にこのアミノ酸配列をハント(Hunt)他,Science 255:1261(1992)及びフォーク(Falk)他,Nature 351:290(1991)によって提供された情報と比較した。これらの文献の開示内容の全体を参考資料としてここに添付する。これらの文献は、HLA−A2提示ペプチドのコンセンサス配列について記載している。具体的には、ハント(Hunt)は、ノナペプチドについて、Leu又はIleのいずれかが、常に第2残基に見られ、ここでLeuが”優勢残基”であると述べている。又、第9の残基は必ず脂肪族炭化水素側鎖を備えた残基であると記載されている。Valがこの位置の優勢残基である。ハント(Hunt)は、第2残基においてLeuに対する強力なシグナルとMetに対して中程度のシグナルが存在し、第6残基においてはVal,Leu,IleまたはThrのいずれか1つに対するシグナル、第9残基においてはVal又はLeuのいずれかに対するシグナルが存在し、Valが特に強力であると述べている。前記比較をベースとして、ノナペプチドを合成し、次に、これらがHLA−A2提示細胞を抗原に対して敏感にさせることが出来るかどうかをテストした。この目的のために、チロシナーゼ喪失変異体細胞系SK29−MEL 1.218及びT202LBを使用した。これらの細胞系に対して、細胞傷害性T細胞クローンCTL IVSB又は細胞傷害性T細胞クローンCTL2/9とともに、テストするペプチドを様々な濃度で添加した。前述した従来の研究によって、前者のクローンは、HLA−2Aを提示するチロシナーゼ発現細胞を溶解したが、後者のクローンはこれを溶解しないことが示された。
上記チロシナーゼ喪失変異体を、空の(empty)HLA−A2分子を安定化させるために使用する抗HLA−A2抗体MA2.1を添加、又は無添加の51Crを含有する溶解中にて37℃で1時間培養した。これらのテストにおいて、細胞は4回洗浄され、100μMから0.01μMまでの種々の希釈度のペプチドとともに培養した。30分後、エフェクター(effector)細胞を40/1のE/T比で添加し、100λの上清を収集し、放射能カウントを行った。
図4は、ノナペプチドTyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(配列認識番号(SEQ ID NO):2)で得られた結果を示している。
以下、配列認識番号(SEQ ID NO):2と称するこのペプチドは、配列認識番号(SEQ ID NO):1に表されたチロシナーゼのcDNA配列の塩基1129〜1155に対応している。HLA−A2とこのペプチドとの複合体はCTLクローンCTL IVSBによって認識される。
平行して行った実験において、患者LB24からのCTLクローンCTL210/9は、HLA−A2とチロシナーゼ由来のある一つのペプチドとの複合体は認識するが、HLA−A2とこの配列認識番号(SEQ ID NO):2のペプチドとの複合体は認識しないことが判った。従って、チロシナーゼは、HLA−A2分子によって提示された時にCTLクローンによって認識される少なくとも1つの別のペプチドにプロセシングされる。
例 7
追跡実験において、配列認識番号(SEQ ID NO):2のペプチドをコードしない第2の遺伝子フラグメントを使用した。このフラグメントは、配列認識番号(SEQ ID NO):1の塩基1に始まり、塩基1101で終端していた(即ち、EcoRI−SphIフラグメント)。前述の細胞傷害性T細胞クローンCTL210/9を、前述の方法で、このフラグメントでトランスフェクションしたCOS−7細胞に対してテストした。CTL IVSBもテストした。これらの結果、LB24−CTL210/9は、このフラグメントでトランスフェクションしたHLA−A2を発現している細胞の表現上の抗原は認識するが、CTL IVSBはこれを認識しないことが判った。従って、第2の腫瘍拒絶抗原ペプチドがチロシナーゼから導かれる。
例 8
LB24−CTL 210/9によって認識される前記腫瘍拒絶抗原を更に明確化するために、以下の実験を行った。
配列認識番号(SEQ ID NO):1の塩基451〜1158に対応する第2のフラグメントを、HLA−A2の遺伝子と共にCOS細胞にトランスフェクションし、TNF放出アッセイを行った。この配列は、クローンSK29−CTL IVSBからのTNFの放出を活性化したが(20pg/ml)、LB24−CTL 210/9からの放出を活性化しなかった(3.8pg/ml)。これらの結果により、これら2つのCTLクローンはそれぞれ別のペプチドを認識し、LB24−CTL 210/9によって認識されるペプチドは、領域1〜451によってコードされるはずであることが確認された。
例 9
cDNAフラグメント1−451によってコード化されるチロシナーゼ由来ペプチドのHLA−A2に結合することが知られているコンセンサス配列を分析した。これらのコンセンサス配列に対応するペプチドを合成し、そのHLA−A2提示細胞を抗原に対して敏感化させる能力についてテストした。この目的のために、サルター(Salter)他,Immunogenetics 21:235〜246(1985)に記載されているように、2つのチロシナーゼ陰性メラノーマ細胞系(即ち、NA8−MELと、HLA−A2によってトランスフェクションしたMZ2−MEL 2.2)と、細胞系T2とを使用した。
これらの細胞を51Crと、HLA−A2に対して特異的なモノクローナル抗体MA.2.1と共に37℃で50分間培養し、その後、洗浄した(ボドマー(Bodmer)他,Nature 342:443〜446(1989)この文献の開示内容全部をここに参考資料として添付する)。標的細胞を、様々な濃度のペプチドと、LB24−CTLクローン210/5又は210/9のいずれかとともに培養した。4時間の培養後、クロム放出率を測定した。
ペプチドMet Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu (配列認識番号(SEQ ID NO):3)は活性を有することが判った。
ここに要約する更に別の実験において、前の実験でYMNGTMSQVを認識することが判ったCTL−IVSBは、配列認識番号(SEQ ID NO):3のペプチドは認識しなかった。
この結果が次の表2〜4にまとめられている。
例 10
CTLクローン22/31を使用して更に別の実験を行った。このクローンは、前の実験で自己由来メラノーマ細胞系MZ2−MELからのサブラインMZ2−MEL.43は溶解するが、MZ2−MEL3.0やMZ2−MEL61.2等の他のサブライン、あるいは、自己由来EBV形質転換B細胞やキラー細胞系K562は溶解しないこと示されていたものである(ファン・デア・エインデ(Van den Eynde)他,Int.J.Cancer 44:634〜640(1989)参照)。MZ2−MEL.43によって提示される抗原を抗原Cと称する。
本出願の親出願に報告されているものを含めた過去の研究において、チロシナーゼ遺伝子が、大半のHLA−A2を発現するメラノーマ細胞上の自己由来CTLによって認識される抗原をコードすることが判った。この遺伝子の細胞系MZ2−MELのサブライン内における発現を、PCR増幅によってテストした。その結果、クローンMZ2−MEL.43は、陽性であることが判った。一方、MZ2−MEL.3.0等の他のMZ2−MELクローンは陰性であった。チロシナーゼ遺伝子の発現と抗原MZ2−Cとの相関関係は、MZ2−Cがチロシナーゼ由来の腫瘍拒絶抗原であり、MZ2−MELによって発現されるHLA分子によって提示されるものであるかもしれないことを示唆した。この細胞系は、HLA−A2を発現せず、これは、チロシナーゼ由来のペプチドがTRAとして提示されるのであれば、第2のHLA分子が関係しているということを示すものである。
どのHLA分子がCTL22/31に抗原Cを提示したかを同定する研究を行った。これを調べるために、細胞表面上に存在することが知られているHLA分子のcDNAクローン、即ち、HLA−A29,HLA−B37,HLA−B44.02及びHLA−Cクローン10、をMZ2−MEL.43cDNAライブラリから単離し、次に、これらを発現ベクターpcDNAI/Ampにクローン化した。その後、受容体COS7細胞に、これらのコンストラクトの1つ、又はHLA−A1を含むコンストラクトと共に、チロシナーゼをコードするcDNA(配列認識番号(SEQ ID NO):1)とをコトランスフェクションした。このコトランスフェクションは前述の方法で行った。1日間後、CTL 22/31を添加し、その24時間後、前述のトラヴァーサリ(Traversari)他の方法に従って、WEHI−164−13上の細胞毒性をテストすることによってTNF放出量を測定した。図6は、HLA−B44とチロシナーゼとの両方をトランスフェクションした細胞が存在するときにのみCTL 22/31によってTNFが放出されたことを示している。このことから、HLA−B44がチロシナーゼ由来腫瘍拒絶抗原を提示するものであると結論される。
例 11
上述した諸実験は、とりわけ、デカマーMLLAVLYCLLが、HLA−A2提示細胞の溶解を効果的に誘発させることを示すものであった。MHC分子がノナペプチドを提示するということはかなり受け入れられている。この目的のために、実験を行い、ここで、2つのノナマー(nonamer)をテストしたが、これらは陽性の結果を出したデカペプチドに基づくものであった。具体的には、第1又は第10のアミノ酸を除去して2つのペプチドと作った。即ち、
Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu (配列認識番号(SEQ ID NO):4)
Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu (配列認識番号(SEQ ID NO:5)
これらのペプチドを、10μM〜1nMの範囲の濃度での前述した例において記載したように、前記デカペプチドをテストした時と同じ方法でテストした。3つの提示細胞を使用した。後記の表5に要約されているように、”T2”は、サルター(Salter),Immunogenetics 21:235(1985)によって記載されている突然変異体ヒト細胞系”CEMX 721.174T2”である。この系は、HLA−A2を提示する。”G2.2”は、前記細胞系MZ2−MELの変異体である。この変異体は、HLA−A2をコードする遺伝子でトランスフェクションされている。略称”G2.2.5”は、HLA−A2を発現しない変異体を示す。全ての細胞を、細胞傷害性T細胞クローンとの接触の前に、モノクローナル抗体MA2.1と共に培養した。この手続きは、いわゆる”empty”なMHC分子を安定化する。但し、これが起こるメカニズムはよく理解されておらず、エフェクターCTL210/5と210/9との両方を使用した。その結果が、後記の表5に示されている。これらの結果は、10μMの濃度において、配列認識番号(SEQ ID NO):4のノナマーが、CTLクローン210/5と使用されたには2倍効果的であり、クローン210/9と使用された時には4倍効果的であるのに対して、配列認識番号(SEQ ID NO):5のノナマーは、溶解の誘発において効果が無いことを示している。
例 12
更に別の実験において、配列認識番号(SEQ ID NO):4及び5、更に、配列認識番号(SEQ ID NO):2のペプチドを使用してクロム放出アッセイを行った。標的細胞は、同種異系のメラノーマ細胞、即ち予めHLA−A2でトランスフェクションしておいたMZ2−MELとHLA−A2を提示するが、外来ペプチドを提示する能力の増大の原因となる抗原プロセシング欠陥を有する細胞系T2であった(セルンドーロ(Cerundolo)他,Nature 345:449(1990)。すべての細胞を、50分間、モノクローナル抗体MA2.1で前処理した。これらの細胞を、種々の濃度で、30分間、選択したペプチドと培養した。次に、CTLクローン210/9とIVSBの1つを、エフェクター:標的比60で添加した。4時間後、クロム放出を前述した方法で測定した。
その結果を、図7、即ち、図7A〜7Cに示す。配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドは細胞を、CTL210/9に対して敏感化したが、配列認識番号(SEQ ID NO):5は敏感化しなかった。
配列認識番号(SEQ ID NO):6は、前述の例で既に述べたように、細胞をCTL IVSBに対して敏感化した。
例 13
HLA−B44によって提示される抗原的ペプチドを明確にするべく、次に例10で説明した実験をフォローアップする作業を行った。これを行うために、前記チロシナーゼcDNA配列のフラグメントに対応するcDNA配列を、HLA−B44をコードする遺伝子とともに、COS−7細胞にコトランスフェクションした。そのプロトコルは、実質的には、前述の例6において記載したものである。前述した細胞溶解T細胞クローン22/31を、使用した。TNF放出を測定した。2つのフラグメント、即ち、フラグメント塩基1〜611と、427〜1134とがTNF放出を誘発した。これは、提示されたペプチドが重複領域に存在することを示唆するものであった。この知見の結果、より短いフラグメントをテストした。位置385,442,514及び574から始まるフラグメントは、TNF放出を誘発することが出来たのに対して、位置579及び585から始まるフラグメントは誘発出来なかった。これらの知見は、13アミノ酸ペプチドの、標準方法に従った合成が位置574から始まることを示唆した。
次に、このペプチドを、それがCTL22/31による溶解を誘発したのか否かを判定する実験に使用した。後述の表6は、13量体がHLA−B44を発現する2つのEBVトランスフェクション細胞系を溶解に対して敏感にさせたことを示している。
フォローアップとして、更に短いペプチドをテストした。核酸塩基574〜604に対応する10量体、即ち、
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala (配列認識番号(SEQ ID NO:7)
は、ペプチド、
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe (配列認識番号(SEQ ID NO:8)
と同様に溶解を誘発した。
これに対して、9量体、
Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala (配列認識番号(SEQ ID NO:9)は認識されなかった。次の表7は、これらの結果を要約しており、これらは更に図8にも示されている。
HLA−B44に結合することが報告されている他の唯一のペプチドは、バローズ(Burrowa)他,J.Virol 64:3974(1990)によって報告されている。
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe (配列認識番号(SEQ ID NO):10)
である。上述したデータは、第2位置のGluと第9位置のPheとがHLA−B44に対するアンカー残基を表している可能性があることを示唆している。
前述の諸実験は、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆物質としてプロセシングされ、その結果得られる腫瘍拒絶抗原と少なくともいくつかの異常細胞上、例えば、例えば、HLA−A2やHLA−B44等の表現型を有するメラノーマ細胞上、の分子との複合体が形成されるものであるということを示している。そして、この複合体がCTLによって認識可能であり、その結果、提示細胞が溶解されるのである。この知見を様々な形で治療的及び診断的に利用することが可能であり、これらの応用が本発明の特徴を構成するものである。治療に関しては、上述の複合体を提示する異常細胞に対して特異的なCTLが生成されるという知見から、様々な治療アプローチが示唆される。1つのそのようなアプローチは、問題の表現型の異常細胞を有する患者に対して、その複合体に対して特異的なCTLを投与することである。尚、このようなCTLをインビトロで開発することは当業者にとって容易であろう。具体的には、血液細胞等の細胞のサンプルを、前記複合体を提示する細胞と接触させ、特異的なCTLの増殖を活性化することができる。標的細胞は、前述のタイプのCOS細胞等の移入体(transfectants)であってよい。これらの移入体は、その表面に所望の複合体を提示するものであり、問題のCTLと結合した時に、その増殖を活性化するものである。当業者のこれらのCTLの製造を可能にするために、問題の遺伝子を含むベクター、即ち、pcNDA−1/Ampl(HLA−A2)及びp123.B2(ヒトチロシナーゼ)を、ブタペスト条約に基づいてパスツール研究所に寄託し、これらは、それぞれ承認番号I1275及びI1276を与えられている。ここに使用されているようなCOS細胞は広範囲に入手可能であり、他の適当なホスト細胞も同様である。
養子移入(adoptive transfer)(グリーンバーグ(Greenberg),J.Immunol.136(5):1917(1986);レッデル(Reddel)他,Science 257:238(7−10−92);リンチ(Lynch)他,Eur.J.Immunol.21:1403−1410(1991);カスト(Kast)他,Cell 59:603−614(11−17−89))と称される治療方法について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞を、CTLと結合させ、それに対して特異的なCTLを増殖させる。次に、この増殖したCTLを、前記特定の複合体を提示する異常細胞のいくつかによって特徴付けられる細胞異常を有する患者に投与する。すると、CTLがこれらの異常細胞を溶解し、その結果、所望の治療目的が達成される。
上記治療方法は、被験体の異常細胞の内の少なくともいくつかの細胞が前記HLA/チロシナーゼ由来ペプチド複合体の内の1つまたはいくつかを提示することを前提としている。これは容易に判定することができる。例えば、前述した移入体を使用してCTLを同定し、単離後、これらCTLを被験体の異常細胞のサンプルとともに使用してインビトロで溶解を調べることができる。溶解が観察された場合には、そのような治療方法において特定CTLを使用することによって、その異常細胞に関連する症状を軽減することができる。より簡単な方法は、標準的アッセイを使用してHLAの異常細胞の表現型を調べ、PCR等を利用した増幅によってチロシナーゼの発現を判定する方法である。種々の複数のHLA分子がチロシナーゼ由来のTRAを提示するので、ここに記載した治療方法によって適切に治療される患者の数は多い。
養子移入のみが本発明において可能な治療方法ではない。多数のアプローチを使用してCTLをインビボで活性化することができる。その内の1つのアプローチ、即ち、前記複合体を提示する非増殖的細胞の使用については既に記載した。このアプローチに使用される細胞は、放射線照射メラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前記遺伝子の1つ又は両方をトランスフェクションした細胞等の、該複合体を正常時に発現する細胞であってよい。チェン(Chen)他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:110〜114(1991年1月)には、このアプローチの一例が記載されており、ここでは、治療領域にHPVE7ペプチドを提示するトランスフェクション細胞が使用されている。細胞のタイプも様々なものを使用することができる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を有するベクターを使用することができる。ウィルス性又はバクテリア性ベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいて、問題の遺伝子は、例えばワクシニアウィルスやバクテリアBCG等によって運搬され、これらの材料は、実質上ホスト細胞に”感染”する。その結果、これらの細胞は問題の複合体を提示し、これらが自己由来CTLによって認識され、次にそのCTLが増殖するのである。チロシナーゼ自身と、HLA−A2提示細胞への組み込みを促進するアジュバントとを結合することによっても類似の効果を達成することができる。次に、該酵素がプロセシングされてHLA分子のペプチドパートナーを作る。
以上の記載において、”異常細胞”及び”細胞異常”という表現が使用されている。これらの表現はここではその最も広い意味に解釈されるべきものであり、これらは、問題の細胞が、この細胞と同じタイプの正常な細胞と異なっていることを示す少なくとも1つの特性を示しているようなすべての状況を指している。異常特性の例としては、形態上の変化や、生化学的変化があり、細胞異常としては、メラノーマ等の腫瘍、自己免疫障害、等が含まれる。
本発明は、更に、CTL標的への先駆物質を同定する方法を提供する。これらの先駆物質は、標的細胞が腫瘍である場合には、腫瘍拒絶抗原と呼ばれるが、但し、異常によって特徴付けられるその細胞が腫瘍ではなない場合には、この分子を腫瘍拒絶抗原と呼ぶことは誤解を招くことを指摘しなければならない。本質的に、該方法は、前述したタイプの細胞傷害性T細胞の標的である細胞を同定することに関する。そのような細胞が同定されると、その全RNAをcDNAライブラリに転換し、次にこれを、関連するHLA分子と複合体を形成する抗原を提示可能な細胞サンプルにトランスフェクションする。これら移入体を前述のCTLに接触させ、再び、CTLによる標的化を観察する(溶解及び/又はTNF生成)。次に溶解されたこれらの移入体を処理してcDNAを単離し、配列決定する。このようにして、腫瘍拒絶抗原先駆物質等の、異常状態の先駆物質を同定することができる。
本発明のその他の側面は当業者にとって明白であろう。従って、ここで繰り返すことは避ける。
尚、ここに使用した用語及び表面は記載のためのものであって限定のためのものではなく、これらの用語及び表現の使用においてここに図示及び記載した特徴構成の均等物を排除する意図は無く、本発明の範囲内においてその他様々な改変が可能である。
(1)一般情報:
(i) 出願人: ヴォルフェル,トーマス;
ファン・ペル,アリーネ;
ブリチャード,ヴィンセント;
ブーン-ファラー,ティエリー
(ii) 発明の名称:単離チロシナーゼ由来ペプチド抗原とその利用方法
(iii)配列の数: 10
(iv) 連絡先:
(A) 宛名 : フェルフェ・アンド・リンチ
(B) 通り名 : サード・アベニュー 805
(C) 都市名 : ニューヨーク・シティ
(D) 州名 : ニューヨーク
(E) 国名 : アメリカ合衆国
(F) 郵便番号: 10022
(V) コンピュータ読み取り可能フォーム
(A) 媒体型式: 5.25 インチ フロッピーディスク,360 kb メモリ
(B) コンピュータ: IBM PS/2
(C) オペレーティング・システム: PC-DOS
(D) ソフトウェア: ワードパーフェクト(Wordperfect)
(vi) 現在の出願データ:
(A) 出願番号: 08/233,305
(B) 出願日 : 1994年4月26日
(C) 分類 : 514
(vi) 現在の出願データ:
(A) 出願番号: 08/203,054
(B) 出願日 : 1994年2月28日
(vii)先の出願データ:
(A) 出願番号: 08/081,673
(B) 出願日 :1993年6月23日
(vii)先の出願データ:
(A) 出願番号: 08/054,714
(B) 出願日 : 1993年4月28日
(vii)先の出願データ:
(A) 出願番号: 07/994,928
(B) 出願日 : 1992年12月22日
(viii)弁理士/代理人情報:
(A) 氏名 : ハンソン,ノーマン,ディ
(B) 登録番号: 30,946
(C) 参照/書類番号: LUD 5360.1
(ix) 通信情報:
(A) 電話 : (212)688-9200
(B) ファックス: (212)838-3884
(2)配列認識番号1の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 1894 基本ペア
(B) タイプ: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号1:
(2)配列認識番号2の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 9アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 一本鎖
(xi) 配列の記述: 配列認識番号2:
(2)配列認識番号3の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 10アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 一本鎖
(xi) 配列の記述: 配列認識番号3:
(2)配列認識番号4の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 9アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号4:
(2)配列認識番号5の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 9アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号5:
(2)配列認識番号6の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 13アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号6:
(2)配列認識番号7の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 10アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号7:
(2)配列認識番号8の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 9アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号8:
(2)配列認識番号9の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 9アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号9:
(2)配列認識番号10の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 長さ: 10アミノ酸残基
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列の記述: 配列認識番号10:
Claims (10)
- HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドとの複合体に対して特異的な治療薬によって治療される対象体を同定する方法であって、配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドであり、そして、
(i)対象体から採取された異常細胞サンプルを、前記複合体に対して特異的な細胞傷害性T細胞に接触させる工程、及び
(ii)前記異常細胞サンプルの少なくとも一部分の溶解を、前記治療の対象体の同定として検出する工程、を有する方法。 - 細胞異常を有する対象体を治療するための薬剤であって、前記薬剤は、HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体を提示する細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を活性化するものであって、そして、前記薬剤は、ヒトチロシナーゼをコードする発現ベクターを、前記細胞異常に対する細胞傷害性T細胞反応を活性化するのに十分な量、含む薬剤。
- HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドとの複合体をその表面に提示する細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を活性化するものであり、更に、HLA−A2をコードする第2ベクターを有する、請求項2の薬剤。
- HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドとの複合体をその表面に提示する細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を活性化するものであり、そして、前記ベクターが、HLA−A2をもコードする、請求項2の薬剤。
- 細胞異常を有する対象体を治療するための薬剤であって、前記薬剤は、HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体を提示する細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を活性化するものであって、そして、前記薬剤は、前記複合体をその表面に提示する非増殖性細胞のサンプルを、前記細胞異常に対する細胞傷害性T細胞反応を活性化するのに十分な量、含む薬剤。
- 細胞異常を治療するための薬剤であって、前記薬剤は、異常細胞表面上におけるHLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドとの複合体に対して特異的な細胞傷害性T細胞を有し、配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドであり、そして、前記複合体の提示によって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に前記異常細胞の溶解に十分な量投与する、薬剤。
- 前記細胞傷害性T細胞は自己由来細胞である、請求項6の薬剤。
- HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドとの複合体に対して特異的な単離細胞傷害性T細胞であって、配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドである、単離細胞傷害性T細胞。
- その表面に、HLA−A2分子と配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドとの複合体を提示する異常細胞を同定する方法であって、配列認識番号(SEQ ID NO):4のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドであり、そして、
(i)異常細胞のサンプルを前記複合体に対して特異的な細胞傷害性T細胞に接触させる工程と、
(ii)前記異常細胞サンプルの少なくとも一部分の溶解を、前記複合体を提示する細胞の同定として検出する工程を、有する方法。 - 配列認識番号(SEQ ID NO):4の単離ペプチド。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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