JP3713522B2 - バイオセンサ - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、バイオセンサに関する。
背景技術
従来、特定の測定対象物を含む試料について、例えば、試料の希釈や攪拌等を行わずに、簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバイオセンサが広く使用されている。このようなバイオセンサは、例えば、特許第２５１７１５３号公報等に開示されているように、通常、電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷等の方法により作用極（測定極ともいう）と対極とを有する電極系を形成し、その上に、前記測定対象物と反応する酸化還元酵素および電子受容物質等を含む反応層を形成することにより作製できる。この反応層に、前記測定対象物を含む試料を接触させると、前記酸化還元酵素の触媒作用により、前記測定対象物が酸化され、同時に前記電子受容物質が還元される。前記還元された電子受容物質を電気化学的手法により再酸化し、これにより得られた酸化電流値から前記試料中の測定対象物の濃度が算出できる。
しかし、このようなバイオセンサによると、試料の物性等によって測定誤差を生じる場合がある。例えば、試料が全血の場合、血液中に含まれる血球等の固形成分、脂質、タンパク質、糖質等の可溶成分や不溶成分等がバイオセンサの電極表面に吸着するため、正確な測定が困難であった。また、全血に対する赤血球の容積比であるヘマトクリット（Ｈｃｔ）値は、個人差が大きいため、検体によってバイオセンサに対する前述のような影響にも差が見られた。このような不純物による影響は、例えば、前記試料を希釈してからバイオセンサに供すること等により緩和できるが、これでは手間がかかり操作が煩雑になる。
そこで、前記不純物による影響を回避するために、以下に示すような方法が提案されている。例えば、電極上に吸水性高分子層を形成する方法（特公平６−５４３０４号公報）、反応層上に非水溶性高分子および水溶性高分子を含有する層を形成する方法（特開平６−２１３８５８号公報）、電極上に脂溶性高分子と両親媒性高分子との混合物からなる高分子膜を形成する方法（特開平９−３１８５８８号公報）、反応層に固形成分の透過を抑制するアニオン性フィルターを形成する方法（特開平１０−２２１２９３号公報）、クエン酸ナトリウム水溶液を封入したマイクロカプセルを、グルコースオキシダーゼを固定化した電極上に固定し、これを作用極とする方法（特開平５−１３３９２９号公報）等がある。
発明の開示
しかしながら、前記アニオン性フィルターを用いる方法では、固形成分のみに有効であり、例えば、タンパク質等の試料中の可溶成分に対しては効果が見られないという問題があった。また、前述のその他の方法では、水溶性高分子等を用いるため吸水性が高く、湿度の影響を受けやすくなり、酵素反応が遅くなる等の問題があった。
そこで、本発明の目的は、試料中の不純物や湿度の影響を受けることなく、前記試料中の測定対象物を高精度で測定できるバイオセンサの提供である。
前記課題を解決するため、本発明のバイオセンサは、基板、試薬を含有する試薬層、および作用極と対極とを含む電極系を備え、前記基板上に電極系が配置され、前記電極系の上に前記試薬層が形成されているバイオセンサであって、前記試薬層がさらに微粒子を含有することを特徴とする。
本発明のバイオセンサは、このように前記電極系上に形成された試薬層が前記微粒子を含むことにより、試料中の不純物が前記電極表面に付着することを防止できる。また、前述のような水溶性高分子等を使用する必要がないため、湿度の影響も受けない。このため、前述のような試料の物性に関らず、感度の低下が防止され、測定対象物を高精度で測定することができる。なお、前記微粒子により電極表面への不純物の付着を防止できる理由は不明であるが、前記不純物の前記微粒子への物理的吸着等によると考えられる。
本発明のバイオセンサにおいて、前記試薬層は単層であってもよいし、前記試薬を含有する試薬含有層と前記微粒子を含有する微粒子含有層とを含む積層体であってもよい。
前記試薬層が前記積層体の場合、前記電極上に前記微粒子含有層を介して前記試薬含有層が形成されてもよいが、例えば、より一層、不純物の電極への吸着を排除でき、前記試料中の測定対象物と試薬とが反応し易いことから、前記電極上に前記試薬含有層を介して前記微粒子含有層が形成されることが好ましい。
本発明のバイオセンサにおいて、前記微粒子の平均粒径は、例えば、０．１〜４５μｍの範囲であり、好ましくは０．５〜３０μｍの範囲、より好ましくは１〜２０μｍの範囲、特に好ましくは３〜１５μｍの範囲である。前記平均粒子径が０．１μｍ以上であれば、前記試薬層に試料が十分に浸透し易くなり、バイオセンサの感度を向上できる。また、平均粒子径が４５μｍ以下であれば、前記試料中の不純物の影響を十分に排除することができる。
前記平均粒径は、例えば、電子顕微鏡を用いて前記微粒子を直接観察し、その粒径を測定して平均値を算出することにより求めることができる。この際、前記微粒子の測定個数は特に制限されないが、例えば、１００個以上、好ましくは１００〜３００個の範囲である。
また、前記微粒子の粒度分布は、特に限定されないが、０．０１〜１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．０５〜６０μｍの範囲であり、特に好ましくは平均粒径０．１〜４０μｍの範囲である。
前記微粒子の形態は、例えば、球状、扁球状でもよいし、微粒子が固まって球状になったもの等も使用できるが、前記微粒子を含む層が、均一かつ適度な疎密性を保持できることから、球状であることが好ましい。
また、前記微粒子は、高分子化合物から形成されることが好ましく、より好ましくは、電解を起こす不純物を含まず、電気化学的に不活性である高分子化合物である。また、前記高分子化合物は、非水溶性であることが好ましい。前記高分子化合物の具体例としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体等があげられる。前記スチレン誘導体ポリマーとしては、例えば、スチレン、アルキルスチレン等があげられる。また、例えば、ポリウレタン、ポリウレア等のウレタン化合物、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン系高分子化合物、ポリ塩化ビニル等のポリオレフィン誘導体、およびポリアミド化合物等も使用できる。また、高分子化合物以外に、例えば、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、アパタイト、ガラスやエーライト等に代表されるセラミックス等の無機化合物から形成されてもよい。これらの中でも、電気化学的に不活性であることから、より好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体、またはポリアミド系高分子化合物である。具体的には、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリアミド（ＰＡ）等が特に好ましい。
このような微粒子としては、例えば、市販の商品名テックポリマーｂｍｘ−５（積水化成品工業社製、ＰＭＭＡ、球状、粒径５μｍ）、商品名ガンツパールＧＭ−０６００（ガンツ化成社製、ＰＭＭＡ、球状、粒径６μｍ）、商品名ガンツパールＧＳ−０８０５（ガンツ化成社製、架橋ＰＳ、球状、粒径８μｍ）、商品名ガンツパールＰＳ−８Ｆ（ガンツ化成社製、ＰＭＭＡ、球状、粒径０．４μｍ）、商品名オーガゾル２００２ＥＸＤ ＮＡＴ ＣＯＳ ＴｙｐｅＳ（エルファトケム社製、ナイロン、扁球状、サイズ１０μｍ）、商品名トレフィルＥ−５０６Ｃ（東レダウコーニングシリコーン社製、架橋シリコーン末、球状、粒径１０μｍ）、商品名サラミックス末ＳＮ−Ｅ−０２（宇部興産社製、窒化ケイ素、球状、粒径１μｍ）、商品名ゴットボール（鈴木油脂社製、シリカ、球状、粒径１０μｍ）、商品名ガラスビーズ（ポリサイエンス社製、ライムガラス、球状、粒径３〜１０μｍ）等が使用できる。
また、前記微粒子は、電気的に不活性であり、試料中の除去しようとする不純物に応じて粒径を変化させるとともに、微粒子表面の特性を変化させることが望ましい。例えば、微粒子表面の特性を疎水性に設定したい場合は、ＰＳから形成された微粒子が好ましく、ＰＳよりも親水性に設定したい場合は、ＰＭＭＡやＰＡ等から形成された微粒子が好ましい。また、前記特性を負電荷を帯びるように設定したい場合は、カルボキシル基を導入したＰＳ等から形成された微粒子が好ましく、正電荷を帯びるように設定したい場合は、アミノ基を導入したＰＳ等から形成された微粒子が好ましい。
また、具体的には、全血中の血球除去を目的とする場合、血球成分の大部分を占める赤血球は、平均直径が約７μｍであるため、例えば、平均粒径約７μｍ以下の大きさの微粒子を選択すれば、効率よく赤血球の分離を行うことができる。また、全血中の複数のタンパク質除去を目的とする場合、例えば、ＰＳ、カルボキシル基を導入したＰＳ、およびアミノ基を導入したＰＳ等を適宜混合して用いることによって、不特定多数のタンパク質を吸着除去できる。なお、これらの方法には制限されない。
本発明のバイオセンサにおいて、前記試薬層がさらに無機ゲルを含んでいることが好ましい。前記無機ゲルを含むことにより、不純物の電極への吸着をより一層防止でき、さらに、試料の拡散を防止できることから、狭い範囲で酵素反応が起こるため、速やかに試薬と測定対象物とが反応できる。
また、同様の理由から、前記電極と、前記試薬層との間に、別途、無機ゲルを含有する無機ゲル含有層が形成されてもよい。
前記無機ゲルとしては、粘土鉱物が好ましく、例えば、膨潤性層状ケイ酸塩等があげられる。前記膨潤性層状ケイ酸塩としては、例えば、スメクタイト、膨潤性雲母等が好ましい。前記スメクタイトとしては、例えば、ヘクトライト、サポナイト、モンモリロナイト等が好ましく、前記膨潤性雲母としては、例えば、ナトリウムフッ化四ケイ素雲母、テニオライト等が好ましい。これらは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
スメクタイトとしては、例えば、市販の合成ヘクトライトである、商品名ラボナイトＸＬＧおよび商品名ラボナイトＸＬＳ（それぞれラボートインダストリー社製）、商品名ルーセンタイトＳＷＮおよび商品名ルーセンタイトＳＷＦ（コープケミカル社製）ならびに商品名チキソピーＷ（協和化学工業社製）等、市販の合成サポナイトである商品名スメクトンＳＡ（クニミネ工業社製）、市販の天然モンモリロナイト精製物である商品名クニピアＦ（クニミネ工業社製）等が使用できる。
また、膨潤性雲母としては、例えば、市販のナトリウムフッ化四ケイ素雲母である商品名Ｎａ−ＴＳ（トピー工業製）、市販のテニオライトである商品名Ｌｉ−ＴＮ（トピー工業製）等があげられる。
本発明のバイオセンサにおいて、さらに、前記試薬層の上に界面活性剤を含む界面活性剤含有層が形成されていることが好ましい。このように前記界面活性剤含有層を設ければ、前記試薬層表面に親水化膜が形成されるため、試料と試薬とが素早くかつ均一に混和する。このため、反応が迅速に進み、再現性も向上する。
また、前述のような積層体の場合、前記微粒子含有層上に界面活性剤を含む界面活性剤含有層が形成されていることが好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤等があげられ、この中でも好ましくは、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤であり、より好ましくは非イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤である。前記天然型界面活性剤としては、例えば、リン脂質があげられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチン等のレシチン等が使用できる。また、非イオン性界面活性剤としては、例えば、商品名Ｔｗｅｅｎ２０等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、商品名ＴｒｉｒｏｎＸ−１００等のポリオキシエチレンアルキルエーテル、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５等のポリオキシエチレンフェニルアルキルエーテル等があげられる。これらの中でも特に好ましくはリン脂質であり、最も好ましくは、高純度レシチン等のレシチンである。
本発明のバイオセンサにおいて、前記電極としては、測定対象物と試料との反応を電気化学的に検出するのに使用できればよく、例えば、金電極、カーボン電極、銀電極等があげられる。この中でも、電気伝導性および化学的安定性に優れることから、金電極、カーボン電極が好ましく、より好ましくはカーボン電極である。
本発明のバイオセンサにおいて、前記試薬は、測定対象物と反応し、その反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されないが、例えば、酵素を含むことが好ましい。前記酵素としては、例えば、酸化還元酵素等があげられる。
前記酸化還元酵素は、例えば、前記測定対象物の種類により適宜決定でき、具体的には、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ等があげられる。
また、前記酵素が酸化還元酵素の場合、さらに前記酵素の反応における電子受容体を含むことが好ましい。
前記電子受容体としては、例えば、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、インドフェノールおよびその誘導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体、オスニウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ⁺、ＮＡＤＰ⁺、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）等が使用できる。この中でも好ましくはフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスニウム錯体、ＮＡＤ⁺、ＮＡＤＰ⁺等である。
本発明のバイオセンサにおいて、前記測定試料は特に制限されないが、例えば、前記可溶性成分、不溶性成分、固形成分等の不純物を含む試料に対して有用である。前記不純物としては、例えば、タンパク質、脂質、糖質、血球等があげられる。具体的な測定試料としては、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等、排水、雨水、プール用水等が使用でき、この中でも好ましくは全血、血漿、血清、唾液、髄液等であり、より好ましくは全血である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のバイオセンサの一例を示す図であり、（Ａ）は、その平面図であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、その断面図である。
図２は、本発明のバイオセンサのその他の例を示す図であり、（Ａ）は、その平面図であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、その断面図である。
図３は、本発明のバイオセンサのさらにその他の例を示す断面図である。
図４は、本発明の一実施例における、電流値と開回路時間との相関を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
（実施形態１）
図１に本発明のバイオセンサの一例を示す。同図（Ａ）は前記バイオセンサの平面図であり、同図（Ｂ）は前記同図（Ａ）のＩ−Ｉ方向断面図であり、同図（Ｃ）は前記同図（Ａ）のII−II方向断面図である。図示のように、このバイオセンサ１では、基板１１上に作用極１２および対極１３から構成される電極系が配置され、この一方の端部上（同図１（Ａ）において右側、図１（Ｂ）において右上）に、試薬および微粒子を含む単層の試薬層１６が形成されている。２つの対極１３は基板１１の幅方向（矢印ｂ方向）両端にそれぞれ配置され、作用極１２は基板１１の幅方向中央に配置され、これらの電極１２、１３は、基板１１の長手方向（矢印ａ方向）に沿って延びている。また、作用極１２と対極１３との間には、絶縁部１４が形成されている。この電極系の一端の上において、スペーサー１５ａ、１５ｂが、前記電極系と垂直になるように配置され、このスペーサー１５ａ、１５ｂの間に試薬層１６が配置されている。そして、試薬層１６の上部を覆うようにしてカバー１７がスペーサー１５ａ、１５ｂ上に配置され、カバー１７と試薬層１６との間に、幅方向に貫通する孔が形成され、これが試料供給用孔１８となる。
このバイオセンサ１の大きさは、特に制限されず、供給する試料の量等により適宜設定できるが、例えば、全体長さ５０〜１０ｍｍ、全体幅２０〜２ｍｍ、最大厚み１５００〜５００μｍ、最小厚み５００〜３００μｍであり、好ましくは、全体長さ３０〜１０ｍｍの範囲、全体幅１０〜２ｍｍ、最大厚み１０００〜５００μｍ、最小厚み４００〜３００μｍである。
試薬層１６の大きさは、例えば、長さ１０〜０．２ｍｍ、幅２０〜２ｍｍ、厚み４００〜５μｍであり、好ましくは、長さ５〜０．２ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、厚み２００〜１０μｍである。基板１１の大きさは、例えば、長さ５０〜１０ｍｍ、幅２０〜２ｍｍ、厚み１０００〜５０μｍであり、好ましくは、長さ３０〜１０ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、厚み５００〜５０μｍである。スペーサー１５ａ、１５ｂの大きさは、例えば、長さ２０〜１ｍｍ、幅２０〜２ｍｍ、厚み５００〜１０μｍであり、好ましくは、長さ１０〜２ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、厚み３００〜２０μｍである。カバー１７の大きさは、例えば、長さ５０〜１０ｍｍ、幅２０〜２ｍｍ、厚み１０００〜５０μｍであり、好ましくは、長さ３０〜１０ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、厚み５００〜５０μｍである。孔１８の大きさは、例えば、長さ１０〜０．２ｍｍ、幅２０〜０．２ｍｍ、高さ５００〜５μｍであり、好ましくは、長さ５〜０．２ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、高さ３００〜１０μｍである。なお、各部位の「長さ」とは、バイオセンサの長手方向の長さをいい、「幅」とは、幅方向の長さをいう。
具体的には、試料約２μＬを供給する場合、試薬層１６の大きさは、例えば、長さ２〜０．２ｍｍ、幅２０〜２ｍｍ、厚み４００〜５μｍであり、好ましくは、長さ１〜０．４ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、厚み２００〜１０μｍである。孔１８の大きさは、例えば、長さ２〜０．２ｍｍ、幅２０〜２ｍｍ、高さ５００〜５０μｍであり、好ましくは、長さ１〜０．４ｍｍ、幅１０〜２ｍｍ、高さ３００〜１００μｍである。
前記試薬層１６における微粒子の含有量は、供給する試料の種類やその量等に応じて適宜決定できるが、試料約２μＬに対して、例えば、１〜０．０１ｍｇの範囲であり、好ましくは、０．５〜０．０５ｍｇの範囲である。
また、前記試薬層１６における試薬の含有量は、特に制限されず、試薬の種類、試料の種類やその量等に応じて適宜決定できる。例えば、試薬として酵素を使用する場合、その含有量は、試料約２μＬに対して、５０〜０．０５Ｕが好ましく、より好ましくは２０〜０．１Ｕである。さらに電子受容体を使用する場合、その含有量は、試料約２μＬに対して、１００〜０．０１μｍｏｌが好ましく、より好ましくは５０〜０．０５μｍｏｌである。具体的に、酵素としてＧＯＤ、電子受容体としてフェリシアン化カリウムを使用する場合、試料約２μＬに対して、ＧＯＤ２０〜０．１Ｕ、フェリシアン化カリウム５０〜０．０５μｍｏｌであることが好ましく、より好ましくはＧＯＤ１０〜０．２Ｕ、フェリシアン化カリウム１０〜０．１μｍｏｌである。
このようなバイオセンサは、例えば、以下に示すようにして製造できる。まず、前記電極等を形成するための基板１１を準備する。基板１１の材料としては、電気絶縁性であることが好ましく、例えば、プラスチック、ガラス、紙、セラミックス等があげられる。前記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ＰＳ、ＰＭＭＡ、ポリプロピレン（ＰＰ）等があげられる。
つぎに、前記基板１１上に、作用極１２および対極１３からなる電極系を形成する。前記電極としては、前述のように、金電極やカーボン電極等が好ましく、その種類に応じた公知の方法により形成できる。
前記金電極は、例えば、蒸着法、メッキ法、金箔貼付法等により形成できる。前記蒸着法は、例えば、真空度１．３３×１０^-4Ｐａ、入力パワー３００Ｗ、レート５Å／秒、時間２分の条件でイオンプレーティング法により行うことができる。これは、例えば、ＰＥＴなどのプラスチックシート上に金を蒸着して、さらにキスカット装置を用いて、前記シート上に蒸着された金箔層に切れ目を入れる方法である。これにより、切れ目部分が絶縁部となり、作用極および対極が形成できる。
また、カーボン電極の場合は、例えば、カーボンインキを前記基板１１上にスクリーン印刷する手段、コーティングする手段、メッキ手段等により形成できる。
前記電極上に後述する試薬層１６を形成する前に、前記電極表面を親水化処理することが好ましい。これにより電極表面が疎水性であっても、前記処理によって親水化されるため、後述するように試薬溶液を用いて試薬層を形成する場合に、前記試薬層を均一に形成し易くなる。
前記親水化処理は、電極の種類に応じて適宜決定できる。前記電極が金電極の場合、例えば、メルカプトエタノール溶液、メルカプトエタノールアミン溶液等の親水化溶液に前記電極を浸漬後、洗浄・乾燥すればよい。
前記親水化溶液の溶媒としては、例えば、エタノール、ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン等の有機溶剤等があげられる。また、前記親水化溶液の濃度は、例えば、１００〜０．０１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５０〜０．０５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、洗浄には、例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン等の有機溶剤、精製水等の洗浄液が使用できる。
また、電極がカーボン電極の場合は、例えば、界面活性剤に浸漬してから精製水で洗浄する方法等により親水化処理できる。
次に、前記電極系を形成した基板１１上にスペーサー１５ａ、１５ｂを配置する。図示のように、二つのスペーサ１５ａ、１５ｂを、一定間隔おいて幅方向に平行に配置することによって、後述する試薬層１６の形成部を確保できる。前記スペーサー１５の材料としては、例えば、樹脂製フィルムやテープ等が使用できる。また、両面テープであれば、後述するカバーを容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスペーサーを形成できる。
つぎに、前記スペーサー１５ａ、１５ｂの間隙部分に、試薬および微粒子を含む単層の試薬層１６を形成する。
前記微粒子および前記試薬としては、前述のようなものが使用できる。この試薬層は、前記微粒子および各種試薬を含有する溶液を調製し、これを前記スペーサー１５の間隙に注入することにより形成できる。
前記溶液は、例えば、試薬を十分に溶解させてから、さらに前記微粒子を分散させて調製することが好ましい。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液、エタノール、メタノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびテトラヒドロフラン等の有機溶剤等が使用できる。前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等があげられ、そのｐＨは、４〜９の範囲が好ましく、より好ましくは５〜８の範囲である。また、水としては、例えば、精製水、蒸留水、超純水等があげられ、この中でも不純物が極めて少なく高精度のバイオセンサが作製可能であることから超純水が好ましい。
前記溶液中の微粒子の濃度は、特に制限されないが、１０００〜１０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは５００〜５０ｇ／Ｌの範囲である。
前記溶液中の試薬の濃度は、特に制限されないが、例えば、酵素の場合、１０，０００〜１０ＫＵ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは５０００〜５０ＫＵ／Ｌの範囲である。さらに、電子受容体を含む場合、１０〜０．０１ｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌの範囲である。
前記溶液を調製後、この溶液を前記スペーサー１５ａ、１５ｂの間隙に注入する。前記注入は、特に制限されず、例えば、自動駆動式分注機等を用いて行うことができる。なお、微粒子の沈殿を防ぐため、前記溶液を攪拌しながら注入することが好ましい。
前記溶液の注入量は、形成する試薬層の大きさ、微粒子および試薬の含有量等により適宜決定できるが、形成する面積１０ｍｍ²当たり１０〜０．１μＬの範囲が好ましく、より好ましくは５〜０．２μＬの範囲である。
前記注入後、これを乾燥させて試薬層を形成する。乾燥の手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。また、これらの手段を組合わせてもよい。
温風乾燥の場合、その条件としては、例えば、温度１０〜６０℃の範囲、相対湿度ＲＨ５〜４０％の範囲、時間１〜３０分の範囲である。
つぎに、前記スペーサー１５ａ、１５ｂ上に前記試薬層１６を覆う状態でカバー１７を配置する。これにより、試薬層１６とカバー１７との間に形成された細孔が試料供給用の孔１８となる。
前記カバー１７の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用できる。
このようにして作製したバイオセンサ１は、長期間保存する場合、湿気の影響を防ぐため、例えば、モレキュラーシーブ、シリカゲル、酸化カルシウム等の乾燥剤と共に密封保存することが好ましい。
前記バイオセンサ１は、例えば、ある一定の時間で所定の電圧を加える手段、バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、前記電気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測定機器と組み合せて使用できる。
このバイオセンサ１の使用方法について、試料が全血、測定対象物がグルコース、試薬がＧＯＤおよびフェリシアン化カリウムである例をあげて説明する、
まず、全血試料をバイオセンサ１の孔１８に毛管現象等により吸引させる。すると、前記微粒子の存在により、血球等の全血中の不純物が、電極へ付着することが防止される。一方、全血中のグルコースは、試薬層１６のＧＯＤにより酸化され、その酸化反応により移動した電子によってフェリシアン化カリウムが還元されてフェロシアン化カリウムが生成される。そして、全血試料の供給から一定時間経過後、前記電圧を加える手段により対極１３と作用極１２との間に電圧を印加して、前記還元型のフェロシアン化カリウムを電気化学的にフェリシアン化カリウムに酸化し、その際の酸化電流を、前記電気信号を測定する手段等により検出する。この酸化電流のピークの値は、試料中のグルコース濃度に比例するため、この値を前記演算手段によりグルコース濃度に演算すれば、試料中のグルコース濃度を求めることができる。このようなバイオセンサによれば、前述のように試料中の不純物が電極に吸着することがないため、感度の低下が防止され、高精度に測定できる。また、湿度による影響も受けない。
このバイオセンサ１は、例えば、前記試薬層がさらに無機ゲルを含有してもよい。前記無機ゲルとしては前述のようなものが使用できる。前記試薬層における無機ゲルの含有量は、無機ゲルの種類、試料の種類やその量等に応じて適宜決定できるが、試料約２μＬに対して、例えば、１００〜０．１μｇの範囲であり、好ましくは、５０〜０．５μｇの範囲である。このような無機ゲルを含む試薬層の形成は、前記試薬、微粒子および無機ゲルを含む溶液を調製して、前述と同様にして形成すればよい。
（実施形態２）
図２に本発明のバイオセンサその他の例を示す。同図（Ａ）は前記バイオセンサの平面図であり、同図（Ｂ）は前記同図（Ａ）のIII−III方向断面図であり、同図（Ｃ）は前記同図（Ａ）のIV-IV方向断面図である。同図において、図１と同一箇所には同一符号を付した。
図示のように、このバイオセンサ２では、基板１１上に作用極１２および対極１３から構成される電極系が配置され、この一方の端部（同図（Ａ）、（Ｂ）において右上）に、無機ゲル含有層２１と試薬層１６と界面活性剤含有層２２とがこの順序で積層された積層体が形成されている。前記試薬層１６は、試薬および微粒子を含んでいる。２つの対極１３は、基板１１の幅方向（矢印ｂ方向）両端にそれぞれ配置され、作用極１２は基板１１の幅方向中央に配置され、これらの電極１２、１３は、基板１１の長手方向（矢印ａ方向）に沿って延びている。また、作用極１２と対極１３との間には、絶縁部１４が形成されている。この電極系の一端の上において、第１のスペーサー１５ａ、１５ｂが、電極系と垂直になるように配置され、このスペーサー１５ａ、１５ｂの間に前記積層体２１、１６、２２が配置されている。第１のスペーサー１５ａ、１５ｂの上には、さらに第２のスペーサー２３ａ、２３ｂが配置されている。そして、第２のスペーサー２３ａ、２３ｂ上に、前記積層体２１、１６、２２の上部を覆うようにしてカバー２４が配置され、カバー２４と積層体２１、１６、２２と間に、幅方向に沿って貫通する孔が形成され、これが試料供給用孔１８となる。なお、このバイオセンサ２は、特に示さない限り、前記実施形態１のバイオセンサと同様の形態である。
前記無機ゲル含有層２１における無機ゲルの含有量は、供給する試料の種類やその量、無機ゲルの種類等に応じて適宜決定できるが、試料約２μＬに対して、例えば、１０００〜０．１μｇの範囲であり、好ましくは、５００〜０．５μｇの範囲である。
前記界面活性剤含有層２２における界面活性剤の含有量は、供給する試料の種類やその量、界面活性剤の種類等に応じて適宜決定できるが、試料約２μＬに対して、例えば、１００〜０．０１μｇの範囲であり、好ましくは、５０〜０．０５μｇの範囲である。
このように、無機ゲル含有層２１、試薬層１６および界面活性剤含有層２２が積層されたバイオセンサ２は、例えば、以下に示すようにして製造できる。なお、特に示さない限り、前記実施形態１と同様に製造できる。
電極が配置された基板１１上に第１のスペーサー１５ａ、１５ｂを配置してから、無機ゲルを含む溶液を調製して前記スペーサー１５ａ、１５ｂの間隙に注入・乾燥する。続いて、同様にして、試薬および微粒子を含む溶液、界面活性剤を含む溶液をそれぞれ注入・乾燥して、無機ゲル含有層２１、試薬層１６および界面活性剤含有層２２を順次積層していく。さらに、前記第１のスペーサー１５ａ、１５ｂの上に第２のスペーサー２３ａ、２３ｂを積層し、この第２のスペーサー２３ａ、２３ｂ上に、界面活性剤含有層２２の上面を覆うようにしてカバー２４を配置する。これにより、界面活性剤含有層２２とカバー２４との間に形成された細孔が試料供給用の孔１８となる。
このように、第２のスペーサーを形成すれば、これにより孔１８の高さを調節することもできる。第２のスペーサーは、前記第１のスペーサーと同様の材料が使用でき、同様にして形成できる。
前記無機ゲルを含む溶液は、無機ゲルの沈降を防ぐために、１時間以上攪拌することが好ましく、より好ましくは５時間以上である。また、同様の理由から、使用時に攪拌を続けることが好ましい。前記溶液中の無機ゲルの濃度は、特に制限されないが、例えば、１０〜０．０１重量％の範囲であり、好ましくは５〜０．０５重量％の範囲である。
（実施形態３）
この実施形態は、試薬層が、前記試薬含有層と微粒子含有層との積層体である本発明のバイオセンサの一例である。このバイオセンサを図３の断面図に示す。同図において、図１と同一部分には同一符号を付している。
図示のように、このバイオセンサ３は、電極を配置した基板１１上に試薬含有層３１を介して微粒子含有層３２が積層されている以外は、前記実施形態１と同様の構成である。試薬含有層３１および微粒子含有層３２は、例えば、試薬を含む溶液と、微粒子を含む溶液とをそれぞれ調製し、スペーサーの間隙に前記試薬を含む溶液を注入・乾燥した後、この上に前記微粒子を含む溶液を注入・乾燥することにより形成できる。
このバイオセンサ３は、前記実施形態２のバイオセンサと同じように、試薬層（本実施形態では試薬含有層および微粒子含有層）を形成する前に、電極上に無機ゲル含有層を別途形成し、それから前記無機ゲル層上に前記試薬含有層等を形成してもよいし、微粒子含有層の上に、さらに界面活性剤含有層を積層してもよい。
本発明のバイオセンサは、前記各実施形態にはなんら制限されず、例えば、全ての層が微粒子、無機ゲルまたはこれら双方を含有してもよい。
実施例
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。
（実施例１）
以下に示すようにして、前記図２と同様の金電極バイオセンサを作製した。まず、支持体として、長さ３０ｃｍ、幅３０ｃｍ、厚み２５０μｍの透明ＰＥＴシート（以下、同じ）を準備し、その一方の表面に金蒸着を行った。蒸着条件は、前述と同様である。使用した金の純度は、９９．９５％以上である。
キスカット装置を用いて、前記ＰＥＴシートの金蒸着面に深さ０．１ｍｍ、幅０．１ｍｍの直線の切れ目を、一方向に１ｍｍと５ｍｍの間隔で交互に入れた（以下、「ハーフカット」という）。この切れ目部分が絶縁部１４となり、蒸着した金が、作用極１２と対極１３とに分割される。なお、最終的に、このＰＥＴシートを切断してバイオセンサを作成するため、バイオセンサの作用極１２の幅は１ｍｍ、対極１３の幅は２．５ｍｍ、絶縁部１４の幅は０．１ｍｍとなる。
さらに、前記ＰＥＴシートを、裁断用機器（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣ社製、商品名Ｍａｔｒｉｘ２３６０）を用いて、長さ２０ｍｍ、幅１７０ｍｍになるように裁断した。この裁断したシートを、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール溶液（溶媒：エタノール）に３０分間浸漬後、まずエタノール、ついで精製水で洗浄し、これをクリーンベンチ内で室温乾燥することにより、前記金蒸着表面の親水化を行った。
続いて、第１のスペーサー１５ａ、１５ｂとなる２枚のポリアミド製の片面テープ（住友スリーエム社製、商品名Ｙ−５５７９、厚み４２μｍ）を、前記金蒸着表面の所定位置に貼付した。このとき、スペーサー１５ａとスペーサー１５ｂとの間隔が１ｍｍ、前記スペーサー１５ａ、１５ｂの長さが５ｍｍ、幅が１７０ｍｍとなるようにした。
つぎに、前記スペーサー１５ａ、１５ｂの間隙に無機ゲル含有層２１を形成した。まず、無機ゲル（コープケミカル社製、商品名ルーセンタイトＳＷＮ）１５０ｍｇと精製水５０．０ｇとをシリコーン処理した広口ビンに入れ、室温下で一晩攪拌（１０時間以上、５００ｒｐｍ））することにより、無機ゲル含有層２１の原料液（以下「Ａ液」という。）を調製した。前記Ａ液は、無機ゲルの沈殿を防ぐために使用直前に調製し、後述の分注時にも前記攪拌を継続した。
前記ＰＥＴシートの第１のスペーサー１５ａ、１５ｂの間隙部分に、シリンジを用いて前記Ａ液を分注した。前記Ａ液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍ（バイオセンサ１個相当）に対し、１．７４μＬとした。前記分注後、これをクリーンベンチまたはデシケータ内において、室温で３０分以上静置乾燥させた。さらに、乾燥機を用いて、３５℃、相対湿度１０％以下の雰囲気中で３０分間乾燥することにより（以下、「ハニードライ乾燥」という）、無機ゲル含有層２１を形成した。
続いて、前記無機ゲル含有層２１上に微粒子、無機ゲルおよび試薬を含む単層の試薬層１６を形成した。まず、試薬層１６の原料液（以下、「Ｂ液」という。）を調製した。無機ゲル（前記ルーセンタイトＳＷＮ）４００ｍｇと精製水５０．０ｇとを、シリコーン処理した広口ビンに入れ、室温下で攪拌（１０時間以上、５００ｒｐｍ）した。褐色ビン中に、前記無機ゲル溶液１．０ｍＬ、精製水３．０ｍＬおよびフェリシアン化カリウム（ナカライテスク社製）３２０ｍｇを入れて室温で攪拌し、フェリシアン化カリウムを完全に溶解させることにより、フェリシアン化カリウム溶液を調製した。つぎに、別の褐色ビンに、グルコースオキシダーゼ（天野製薬社製）２．４０ＫＵおよび微粒子（積水化成社製、商品名ＢＭＸ−５、平均粒径５μｍ、原料化合物名ＰＭＭＡ）５００ｍｇを加え、さらに前記フェリシアン化カリウム溶液２．０ｍＬを加えて、溶液が均一になるまで十分に攪拌し、これをＢ液とした。攪拌時には、溶液中に気泡が生じないよう十分に注意した。また、前記Ｂ液は、微粒子の沈降を防ぐため、攪拌しながら下記分注を行った。
前記シート上の無機ゲル含有層２１表面に、分注用機器（Ｂｉｏ Ｄｏｔ社製、商品名Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて前記Ｂ液を分注した。前記Ｂ液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍ（バイオセンサ１個相当）に対し、１．３０μＬとした。分注後、これを、オーブン中、５０℃、無風状態で１０分間乾燥し、さらに、前記ハニードライ乾燥を同様にして１０分間行い、試薬層１６を形成した。
つぎに、前記試薬層１６上に界面活性剤含有層２２を形成した。まず、高純度卵黄レシチン（キューピー食品社製）２５０ｍｇとエタノール５０．０ｍＬとを褐色ビンに入れ、室温下、均一になるまで攪拌して、界面活性剤含有層２２の原料液（以下、「Ｃ液」という。）を調製した。
そして、前記シート１１の試薬層１６表面に、前記分注用機器を用いて前記Ｃ液を分注した。前記Ｃ液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍ（バイオセンサ１個相当）に対し、０．３０μＬとした。分注後、これを前記ハニードライ乾燥（乾燥時間１５分間）して界面活性剤含有層２２を形成した。ついで、このシートを、モレキュラーシーブと共に減圧保存容器に入れ、室温、圧力約１００Ｐａの条件下で一晩減圧乾燥した。
次に、第２のスペーサーとして、ＰＥＴフィルム中芯両面テープ（大日本インキ社製、商品名ダイダック両面接着テープ、厚み１５０μｍ）を、第１のスペーサー１５ａ、１５ｂ上に配置した。一方の第２のスペーサー２３ａは、長さ５ｍｍ、幅１６０ｍｍであり、他方の第２のスペーサー２３ｂは、長さ５ｍｍ、幅１６０ｍｍである。そして、さらに、前記第２のスペーサー２３ａ、２３ｂおよびその間隙部分を覆うように長さ１５ｍｍ、幅１６０ｍｍ、厚み１８８μｍのＰＥＴ製フィルムを貼付し、これをカバー２４とした。
得られたこの積層体を、前記裁断用機器により、幅６ｍｍとなるように裁断して、長さ２０ｍｍ、幅６ｍｍの目的のバイオセンサを作製した。なお、このバイオセンサは、使用時まで、褐色ピン中、３ｇ以上のモレキュラーシーブと共に保存した。
（実施例２）
前記Ｂ液の調製において、無機ゲルとして、前記ルーセンタイトＳＷＮの代わりに、商品名ラポナイトＸＬＳ（ラポルテ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、バイオセンサを作製した。
（実施例３）
前記Ｂ液の調製において、前記無機ゲル溶液１．０ｍＬの代わりに、精製水１．０ｍＬを用いる以外は、実施例１と同様にしてバイオセンサを作製した。
（実施例４）
前記Ａ液の調製において、無機ゲルとして、前記ルーセンタイトＳＷＮの代わりに、前記ラポナイトＸＬＳを用い、また、前記Ｂ液の調製において、前記無機ゲル溶液１．０ｍＬの代わりに精製水１．０ｍＬを用いる以外は、実施例１と同様にしてバイオセンサを作製した。
（実施例５）
以下に示すようにして、前記図２と同様のカーボン電極バイオセンサを作製した。なお、特に示さないかぎり、前記実施例１と同様である。
カーボンインキにより、基板１１となる前記透明ＰＥＴシートの一方の表面にカーボン印刷を施して、作用極１２および対極１３を形成した。印刷は、スクリーン印刷機を用い、その条件は、ＳＵＳ・３００メッシュ、スキージ圧３〜５ＭＰａ、プリントスピード０．５ｍ/ｓ、コートスピード０．５ｍ／Ｓ、クラリアンス２．０ｍｍ、オフコンタクト１５度とした。前記シートを、９０℃で３０分間乾燥した。
つぎに、前記ＰＥＴシートの電極側表面に、絶縁性ＵＶ硬化樹脂を主成分とするレジストインキによりレジスト印刷を行い、これを乾燥して第１のスペーサー１５ａ、１５ｂを形成した。このレジスト印刷は、スクリーン印刷機を用い、その条件は、ポリエステル・２５０メッシュ、スキージ圧３〜５ＭＰａ、プリントスピード０．１５ｍ／ｓ、コートスピード０．１５ｍ/ｓ、クリアランス４．０ｍｍ、オフコンタクト１５度とした。なお、第１のスペーサーの大きさ等は、前記実施例１と同様に設定し、その厚みは、後述する乾燥後の厚みが１０μｍとなるように調整した。また、前記乾燥は、ＵＶ乾燥機を用いて３．７ｍ/ｓの条件で行った。
次に、前記スペーサー１５ａ、１５ｂの間隙に無機ゲル含有層２１を形成した。前記Ａ液の調製には、無機ゲルとして前記ルーセンタイトＳＷＭの代わりに前記ラポナイトＸＬＳ１５０ｍｇを用い、前記Ａ液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍ（センサ１個相当）に対し、１．４５μＬとした。
次に、前記無機ゲル含有層２１上に試薬層１６を形成した。原料となるＢ液は以下のように調製した。褐色ビン中に、精製水３．０ｍＬ、前記微粒子７５０ｍｇおよび前記フェリシアン化カリウム２４０ｍｇを入れて攪拌し、フェリシアン化カリウムを完全に溶解させることにより、フェリシアン化カリウム溶液を調製した。続いて、別の褐色ビンに前記グルコースオキシダーゼ２．４０ＫＵおよび前記フェリシアン化カリウム溶液２．０ｍＬを入れて均一になるまで十分に攪拌し、これをＢ液とした。前記Ｂ液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍ（センサ１個相当）に対し、１．０８μＬとした。
以後、前記実施例１と同様にして、界面活性剤含有層２２の形成、第２のスペーサー２３ａ、２３ｂおよびカバー２４の配置を行うことにより積層体を作製し、これを裁断して、目的のバイオセンサを得た。
（実施例６）
無機ゲル含有層２１を形成しない以外は、実施例５と同様にしてバイオセンサを作製した。
（比較例１）
以下のようにして、従来のバイオセンサを作製した。まず、前記ＰＥＴシート上に実施例５と同様にしてカーボン電極を形成し、さらに実施例１と同様にしてスペーサーを形成した。そして、３重量％カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を調製してから、これを前記ＰＥＴシートの電極系上に分注して乾燥し、ＣＭＣ層を形成した。前記ＣＭＣ溶液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍに対して３μＬとした。つぎに、精製水４．０ｍＬにフェリシアン化カリウム３２０ｍｇを入れて攪拌し、完全に溶解させてから、このフェリシアン化カリウム水溶液２ｍＬにグルコースオキシダーゼ２．４０ＫＵを加え、均一になるまで十分に攪拌した。この試薬液を、前記ＣＭＣ層上に分注して前記実施例１と同様にして乾燥することにより、試薬層を形成した。前記試薬液の分注量は、分注表面面積６ｍｍ×１ｍｍに対して１．３０μＬとした。そして、前記実施例１と同様にして、第２のスペーサーを配置し、カバーを貼付した。
前述のようにして得られた各実施例および比較例１のバイオセンサについて、以下に示す各種試験を行った。
（金電極バイオセンサに対するＨｃｔの影響）
前記実施例１〜４の各バイオセンサおよび比較例のバイオセンサについて、それぞれ電流値を測定した。試料としては、前記実施例１〜４のバイオセンサに対しては、生理食塩水（以下、「Ｓａｌ」という）、グルコース添加（濃度１０００ｍｇ／Ｌ）生理食塩水（以下、「ＧＳａｌ」という）、ヒト全血（以下、「ＷＢ」という）およびヒト血漿（以下、「Ｐ」という）をそれぞれ用い、比較例のバイオセンサに対しては前記ヒト全血（ＷＢ）およびヒト血漿（Ｐ）を用いた。前記ヒト全血（ＷＢ）のＨｃｔは４６％であり、ヒト全血（ＷＢ）およびヒト血漿（Ｐ）の血漿中グルコース濃度は、１２７０ｍｇ／Ｌであった。
まず、各バイオセンサをポテンシオスタット（ＢＡＳ社製、商品名ＣＶ１００Ｗ）に接続し、室温で前記試料をバイオセンサ内に吸引した後、開回路状態を２５秒間保持した。そして、電圧を５秒間印加した時点における電流値を測定した。電圧は、実施例１〜４のセンサに対しては２５０ｍＶ、比較例のバイオセンサに対しては５００ｍＶに設定した。各バイオセンサおよび各試料について、同条件で前記電流値を３回ずつ測定し、その平均値を求めた。また、各バイオセンサについて、乖離率Ａ（％）および乖離率Ｂ（％）を、それぞれ下記式（１）および式（２）により求めた。ここで、Ｅ_SaJ、Ｅ_GSal、Ｅ_WBおよびＥ_Pとは、前記各試料を用いて測定したときの前記電流値の平均値である。前記乖離率Ａおよび乖離率Ｂは、いずれも試料中の不純物の影響の程度を示す値であり、前記乖離率Ａは主として血球の影響に係る値、前記乖離率Ｂは、それに加えて塩類の影響に係る値である。これらの絶対値が小さいほど、前記不純物の影響が小さいと判断できる。
乖離率Ａ（％）＝［（Ｅ_WB−Ｅ_P）／Ｅ_P］×１００ ・・・（１）
乖離率Ｂ（％）＝［（Ｅ_WB−Ｅ_P）／（Ｅ_P−Ｅ_Sal）］×１００・・・（２）
前記電流値の平均値、および前記平均値を用いて前記式（１）と式（２）から算出した乖離率Ａと乖離率Ｂを下記の表１に示す。

前記表１に示すように、実施例のバイオセンサにおける乖離率Ａの絶対値は、比較例のバイオセンサにおける乖離率Ａの絶対値と比較して小さかった。また、実施例の乖離率Ｂの絶対値も、実施例の乖離率Ａの絶対値とほぼ同様であった。これは、実施例のバイオセンサによれば、Ｈｃｔによる影響が小さく、血液中の成分を正確に測定できることを示している。
（開回路時間の影響確認）
前記実施例４の金電極バイオセンサを用いて、開回路時間の影響を調べるために電流値測定を行った。なお、試料としては、グルコース添加（濃度５０００ｍｇ／Ｌ）生理食塩水を使用した。
まず、実施例４のバイオセンサを前記ポテンシオスタットに接続し、前記バイオセンサに前記試料を吸引させた後、開回路状態を所定の時間（０、５、１０、１５、２５秒）保持した。そして、２５０ｍＶの電圧を５秒間印加後の時点における電流値を測定した。この結果を図４に示す。同図は、開回路時間と電流値との相関関係を示すグラフである。
図４に示すように、電流値は開回路時間による影響をほとんど受けなかった。これは、実施例４のバイオセンサでは、酵素反応が試料を吸引してから短い時間に速やかに進行したことを示している。これから、本発明のバイオセンサは、迅速な測定が可能であり、優れた操作性を有するといえる。
（カーボン電極センサに対するＨｃｔの影響確認）
前記実施例５のカーボン電極バイオセンサおよび実施例４の金電極バイオセンサ、ならびに比較例のバイオセンサについて、それぞれ電流値を測定した。試料としては、実施例４および５のバイオセンサに対しては生理食塩水（Ｓａｌ）、ヒト全血（ＷＢ）、ヒト血漿（Ｐ）をそれぞれ用い、比較例のバイオセンサに対しては前記ヒト全血（ＷＢ）、ヒト血漿（Ｐ）を用いた。前記ヒト全血（ＷＢ）のＨｃｔは４９％であり、ヒト全血（ＷＢ）およびヒト血漿（Ｐ）の血漿中グルコース濃度は１１１０ｍｇ／Ｌであった。
まず、実施例４の金電極バイオセンサおよび実施例５のカーボン電極バイオセンサを、それぞれ前記ポテンシオスタットに接続した。そして、前記試料をバイオセンサ内に吸引した後、電圧を２０秒間印加した時点における電流値を測定した。電圧は、金電極センサに対しては２５０ｍＶ、カーボン電極センサに対しては３５０ｍＶとした。また、比較例のバイオセンサについては、前記ポテンシオスタットに接続して前記試料をバイオセンサ内に吸引した後、回路状態を２５秒間保持し、電圧を５秒間印加した時点における電流値を測定した。各バイオセンサについて、同条件で前記電流値を４回ずつ測定し、その平均値を求めた。なお、乖離率Ａ（％）および乖離率Ｂ（％）は前述と同様にして求めた。
前記電流値の平均値、および乖離率Ａと乖離率Ｂの結果を下記表２に示す。

前記表２からわかるように、両実施例のバイオセンサにおける乖離率Ａの絶対値は、比較例のバイオセンサにおける乖離率Ａの絶対値と比較して小さかった。また、両実施例の乖離率Ｂの絶対値も、それぞれ乖離率Ａの絶対値とほぼ同様であった。これは、実施例のバイオセンサによれば、Ｈｃｔによる影響が小さく、血液中の成分を正確に測定できることを示している。また、このＨｃｔによる影響の回避に関しては、実施例４の金電極バイオセンサでも比較例の従来品より優れた効果が得られるが、実施例５のカーボン電極バイオセンサによると、より一層の効果を示すことがわかる。
（湿度による影響）
前記実施例４の金電極バイオセンサと、実施例５および実施例６のカーボン電極バイオセンサと、比較例のバイオセンサについて、湿度による影響を調べるため、以下の方法により電流値を測定した。
まず、十分に乾燥した未使用のバイオセンサを用いて電流値を測定した。試料としては、生理食塩水（Ｓａｌ）およびグルコース（濃度１００ｍｇ／Ｌ）添加生理食塩水（ＧＳａｌ）をそれぞれ用いた。バイオセンサを前記ポテンシオスタットに接続し、前記試料をバイオセンサ内に吸引した後、開回路状態を２５秒間保持した。そして、電圧を５秒間印加した時点における電流値を測定した。前記電圧は、実施例４の金電極バイオセンサに対しては２５０ｍＶ、実施例５および６のカーボン電極バイオセンサに対しては３５０ｍＶ、比較例のバイオセンサに対しては５００ｍＶに設定した。各バイオセンサについて、同条件で前記電流値を２回ずつ測定し、その平均値を求めた。他方、温度を４０℃、相対湿度を８５％に保った密閉容器（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、商品名ＡＥ−２１５）中に、十分に乾燥した未使用のバイオセンサを３０分間放置した。その後、これらのバイオセンサを用いて、前述と同じ条件で前記電流値を２回ずつ測定し、その平均値を求めた。
ここで、前記放置前のバイオセンサにおける電流値の平均値を¹Ｅ_Sal、¹Ｅ_GSalとし、放置後のバイオセンサにおける電流値の平均値を²Ｅ_Sal、²Ｅ_GSalとした。また、前記放置後の電流値の平均値と前記放置前の電流値の平均値との比Ｒ_Sal（％）およびＲ_GSal（％）は、それぞれ下記式（３）および式（４）により求めた。Ｒ_Sal（％）およびＲ_GSal（％）の値は、１００に近いほど、湿度の影響が小さいと判断できる。前記各バイオセンサについて測定した結果を下記表３に示す。
Ｒ_Sal（％）＝（²Ｅ_Sal／¹Ｅ_Sal）×１００ ・・・（３）
Ｒ_GSal（％）＝（²Ｅ_GSal／¹Ｅ_GSal）×１００ ・・・（４）

前記表３に示すように、実施例のバイオセンサは、比較例のバイオセンサと比較して、Ｒ_Sal（％）およびＲ_GSal（％）が１００に近い結果が得られた。これは、湿度による影響が小さいことを示し、本発明のバイオセンサによれば、湿度の影響をうけていないことがわかる。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明のバイオセンサは、試料中の固形成分や可溶性分、不溶性分等の、測定対象物以外の物質の影響や、湿度の影響を受けにくく、測定対象物を高精度で測定することが可能である。また、酵素反応が速やかに進行するため、操作性にも優れる。

Claims (19)

1. 基板、試薬を含有する試薬層、および作用極と対極とを含む電極系を備え、前記基板上に電極系が配置され、前記電極系の上に前記試薬層が形成されているバイオセンサであって、前記試薬層がさらに微粒子を含有し、かつ、前記電極系と前記試薬層との間に無機ゲルを含有する無機ゲル含有層が形成されていることを特徴とするバイオセンサ。
2. 試薬層が単層である請求項１記載のバイオセンサ。
3. 試薬層が、前記試薬を含有する試薬含有層と前記微粒子を含有する微粒子含有層とを含む積層体である請求項１記載のバイオセンサ。
4. 電極系上に試薬含有層を介して微粒子含有層が形成されている請求項３記載のバイオセンサ。
5. 試薬層が、さらに無機ゲルを含んでいる請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
6. さらに、試薬層の上に界面活性剤を含む界面活性剤含有層が形成されている請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
7. 微粒子の平均粒径が、０．１〜４５μｍの範囲である請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
8. 微粒子の粒度分布が０．０１〜１００μｍの範囲である請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
9. 微粒子が、球状である請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
10. 微粒子が、高分子化合物である請求項１〜９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
11. 高分子化合物が、電解を起す不純物を含まず、電気化学的に不活性である請求項１０記載のバイオセンサ。
12. 高分子化合物が、非水溶性である請求項１０または１１記載のバイオセンサ。
13. 高分子化合物が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体、またはポリアミド系高分子化合物である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
14. 無機ゲルが、粘土鉱物である請求項１〜１３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
15. 粘土鉱物が、膨潤性層状ケイ酸塩である請求項１４記載のバイオセンサ。
16. 電極が、金電極、カーボン電極および銀電極からなる群から選択された少なくとも一つの電極である請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
17. 試薬が、酸化還元酵素を含む請求項１〜１６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
18. 試薬が、酸化還元酵素および前記酵素の反応における電子受容体を含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
19. 測定試料が、血液である請求項１〜１８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。

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