JP3701675B2 - ＩＦＮ−β液体製剤 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリオール、非還元糖又はアミノ酸で安定化されたインターフェロン−ベータ（IFN−β）の液体製剤に関する。特に、本発明はマンニトール、ヒトアルブミンおよびアセタート緩衝液を含有する液体製剤に関する。
インターフェロン（アルファー、ベータ、ガンマー）は、誘発物質の刺激により脊椎動物の細胞内で生産される糖タンパク質である。最も伝統的な誘発物質は、ウイルスであるが、しかし他の微生物薬剤、他の天然物質および合成化合物は、同様の挙動を有する。
インターフェロン−βは、ヒト線維芽細胞内で誘発され、抗ウイルス活性を有するが、しかし幾つかの腫瘍形の治療において他の活性が抗ウイルス活性、例えば抗増殖細胞活性および免疫調節作用と共に利用できる。
ヒト線維芽細胞の培養から、そして特に組換えDNA工学からの生産から、産業的量のインターフェロン−ベータを今や得ることが可能である。
次の内容は公知である；すなわち、精製された形のタンパク質は、大気中の作用因子の通常の活性に起因して、分解に特に影響されやすい。この特徴は、組換えDNA工学に従って生産されるタンパク質に対してさえより明白である。
高精製タンパク質は特に変性を受けやすいという事実の直接の結果として、生成物に対し最も長い可能なライフサイクルを確保せしめる安定な製剤を得ることが好ましいものとなる。
高精製タンパク質を含有する製剤の安定化は、活性素の分解を阻害するか又は遅延する１種以上の賦形剤の添加により行うことができる。
インターフェロン−ベータを含有する医薬組成物は、周知である。ヨーロッパ特許出願89245（INTER-YEDA社）は、マンニトール、ヒトアルブミンおよびポリビニルピロリドンを含有するインターフェロン−ベータの凍結組成物を記載しており、後者は安定剤として記載される。また、他のインターフェロンを含有する医薬液体組成物も公知である。
国際公開WO89／04177（ジエネンテック：優先日1987年11月３日）は、4.0〜6.0の範囲内にpHを維持する緩衝液、安定剤としてポリヒドロキシラート糖および非イオン性洗剤を含んでなるガンマーインターフェロンの液体医薬製剤を記載する。
ヨーロッパ特許出願270799は、可溶化剤／安定剤として１種以上の非イオン高分子洗剤を含んでなる、液体形又は凍結乾燥されたIFN−β医薬組成物を記載する。
凍結乾燥製剤の再構成を避けそして使用容易可能とするためそのような液体製剤を得ることは、非常に望ましい。
今や驚くべきことに次の内容が見出された；すなわち、適当な緩衝液中でポリオール、非還元糖又はアミノ酸で安定化されたインターフェロン−ベータを含んでなる液体医薬製剤は、特に安定性をもたらしそして長期間生物学的活性を維持する。
本発明の主目的は、インターフェロン−ベータ並びに安定剤としてポリオール、非還元糖又はアミノ酸を含んでなる液体医薬製剤を提供することにある。
好ましくは、安定剤はマンニトール、サッカロースおよびグリシンから選ばれ；より好ましくは安定剤はマンニトールである。
好ましくは、液体医薬製剤は３〜４のpHを有する緩衝液を含んでなり；より好ましくはアセタート緩衝液を含んでなる。
本発明の別の目的は、賦形剤の溶液を用いIFN−βを希釈する工程を含んでなる、そのような液体医薬製剤の製造方法に関する。
さらに、本発明の別の目的は、使用前貯蔵に対し適当な容器中で無菌条件下密封された、先に言及された製剤を含んでなる液体医薬製剤の提示形態を提供することにある。
IFN−βの液体製剤の安定性を研究するため、種々の製剤を、pHを変えた種々の緩衝液中にバルクのIFN−βを希釈し、次いで種々の温度で試料を保存し次いで定められた時間間隔で免疫学的試験を用いて分析を行った。
より大きな安定性が得られる、緩衝液および好ましいpHが一度得られると、本発明の安定化された製剤は、また賦形剤を含有する緩衝液を用いてインターフェロンバルク溶液を希釈することによって調製される。種々の製剤の安定性は、50℃，37℃および25℃の温度で溶液を貯蔵後、一定の時間間隔時に残留活性を測定することにより測定される。
免疫学的試験は、封入された指示書において記載されている手続に従い、TORAYキット（ヒトIFN−ベータELISAキット、TORAY INDUSTRIES社）を用いて行った。
生物学的投薬は、アームストロングJ.A.(1981),Cytopathic effect inhibition assay for Interferon,in Methods in Enzymology73 381-387により記載されている如く行った。
活性の程度は、１mlの溶液当たりの国際単位（IU／ml）又は１mlの溶液当たりメガ国際単位（１ MIU／ml＝1,000,000IU／ml）で表わされる。
国際単位は、標準として用いられるHuIFN−ベータNIH標準品Gb23-902-531に対し、National In of Health,ベセスダ、メリーランドにより発行されたReseach Reference Reagent Note No.35に記載されている如く計算される。
測定は、時間零において試料の活性を100％に等しいものとし、種々の製剤中のインターフェロン−ベータの試料の残留活性のパーセンテージとしてここにおいて報告される。
活性成分の安定性に関するpHの効果を評価するため、種々の緩衝液、すなわちアセタート緩衝液、シトラート緩衝液、アスコルベート緩衝液、スクシナート緩衝液を用い、0.6および１ MIU／mlを含有する組換え体IFN−βの種々の製剤を調製した。
緩衝液と共に組換え体IFN−βを含有する製剤を調製し次いで50℃，37℃および25℃の温度で貯蔵し、次いで定められた時間間隔で免疫学的試験のもとで分析した。製剤を3.0〜4.0のpHおよび5.0〜6.0のpHを有するように調製し、全て0.01Ｍの濃度で緩衝液を用いて調製した。
表１、表２および表３は、種々の温度で１〜42日間定められた時間間隔で行なわれた試験結果を報告している。
前記表中に含まれるデータは、5.0〜6.0のpHを有する製剤が、力価の直ちの損失を示すことを現わしている。しかし、3.4〜4.0を有する製剤は、特にアセタート緩衝液の存在下高い安定性を示す。
活性素の安定性に関する賦形剤の効果を評価するため、マンニトール、サッカロース又はアミノ酸の如き種々の賦形剤並びにインターフェロン−ベータバルク溶液中にすでに部分的に含まれているヒトアルブミンを用い、組換え体IFN−βの１ MIU／mlを含有する種々の製剤を調製した。
用いたマンニトール、サッカロース又はグリシンの量は、IFN−βの等張溶液を得るための如きものであった。
これらの製剤に関する安定性の研究を、50℃，37℃，25℃および４℃で試料を維持しそして表４および表５に報告した時間における残留活性を測定することによって行った。
表４および表５中に報告されるデータは、マンニトールのようなポリオールを含有する製剤における分解が、サッカロース又はグリシンを含有するこれらの製剤に関しはるかにより低いことを示している。
幅広い研究に対し選択された製剤は、pH3.5の0.01Ｍアセタート緩衝液中に含有するものであり、これはイオン力（ionic force）およびアルブミンの安定性に関する効果を更に評価するため更に試験に委ねられた。
pH3.5の0.01Ｍのアセタート緩衝液中のIFN−βの溶液を、種々の浸透圧モル濃度：150,300および400で、そして種々の誘電定数で、５％，10％および20％のプロピレングリコールを用いて調製した。研究によれば、浸透圧モル濃度の増加およびプロピレングリコール含量の増加は、IFN−βの液体製剤の安定性を減少した。
バルクIFN−βはアルブミンを含有するので、インターフェロン−β液体製剤の安定性に関するアルブミンの効果の評価に対する研究を続けることが決定された。IFN−β（１ MIU／ml）およびpH3.5のアセタート緩衝液を含有する試料を、１mlのヒトアルブミン当たり１mg，３mg，６mgおよび９mgに添加し次いで50℃，37℃および25℃の温度で試験した。
その結果は、アルブミンが増加すると、試料の安定性が減少することを示す。試料当たりのアルブミン含量を、種々のバルク中に含まれるものと匹敵する最少量を有するような方法で定められ；１ MIU／mlのIFN−βを含有する製剤中に、0.5mg／mlの均一含量が維持される。
医薬製造の例
原料：マンニトール（メルク）；ヒトアルブミン（ベーリンガー）；0.01Ｍのアセタート緩衝液（メルク）；NaOH １Ｍ（メルク）。Pharmagummiゴム、ブチル混合物、およびアルミニウム環のストッパーを有するDIN 2Rガラスビン（ガラスタイプＩホウケイ酸ガラス）を、容器として用いた。
γ−IFN−β溶液の製造例
Ａ）１ MIU／MLの溶液
１ｌの完成品のバッチの製造に対し、次の量を用いる：
γ−インターフェロン−β 1000MIU
マンニトール 54.6ｇ
ヒトアルブミン 0.5ｇ−Ｐ
0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液 適量ないし１ｌ。
Ｐ＝バルクインターフェロン中に存在するヒトアルブミンの量。
Ｂ）12MIU／MLの溶液
１ｌの完成品のバッチの製造に対し、次の量を用いる：
γ−インターフェロン−β 12000MIU
マンニトール 54.6ｇ
ヒトアルブミン 4.0ｇ−Ｐ
0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液 適量ないし１ｌ。
Ｐ＝バルクインターフェロン中に存在するヒトアルブミンの量。
Ｃ）24MIU／MLの溶液
１ｌの完成品のバッチの製造に対し、次の量を用いる：
γ−インターフェロン−β 24000MIU
マンニトール 54.6ｇ
ヒトアルブミン 8.0ｇ−Ｐ
0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液 適量ないし１ｌ。
Ｐ＝バルクインターフェロン中に存在するヒトアルブミンの量。
製造方法
要求量のマンニトールおよびヒトアルブミン（バルク中に存在するアルブミンの量を考慮した）を、0.01ＭのpH3.5アセタート緩衝液約500ｇ中に溶解する。pHを検査し次いで、必要により、希釈（１：２）酢酸を用い又は１Ｍ NaOHを用い3.5±0.2の値に調節する。
溶液を、0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液を用い最終重量１kgに至らしめる。
γ−インターフェロン−ベータの必要量を、ビーカー中に釈量し次いで賦形剤の溶液を用い500ｇの最終重量に至らしめる。
別のビーカー中、500ｇの賦形剤の溶液を釈量する。インターフェロン−ベータを含有する500ｇの溶液を、1.5atmを超えない圧力で0.22μｍ（DURAPORE）の無菌膜上で濾過する。無菌溶液をガラスエルレンマイヤーフラスコ中に集める。その後直ちに500ｇの賦形剤溶液を、1.5atmの圧力で同じ膜上で濾過し次いで同じエルレンマイヤーフラスコ中に集める。得られた溶液をゆっくり混合する。
インターフェロン（アルファー、ベータ、ガンマー）は、誘発物質の刺激により脊椎動物の細胞内で生産される糖タンパク質である。最も伝統的な誘発物質は、ウイルスであるが、しかし他の微生物薬剤、他の天然物質および合成化合物は、同様の挙動を有する。
インターフェロン−βは、ヒト線維芽細胞内で誘発され、抗ウイルス活性を有するが、しかし幾つかの腫瘍形の治療において他の活性が抗ウイルス活性、例えば抗増殖細胞活性および免疫調節作用と共に利用できる。
ヒト線維芽細胞の培養から、そして特に組換えDNA工学からの生産から、産業的量のインターフェロン−ベータを今や得ることが可能である。
次の内容は公知である；すなわち、精製された形のタンパク質は、大気中の作用因子の通常の活性に起因して、分解に特に影響されやすい。この特徴は、組換えDNA工学に従って生産されるタンパク質に対してさえより明白である。
高精製タンパク質は特に変性を受けやすいという事実の直接の結果として、生成物に対し最も長い可能なライフサイクルを確保せしめる安定な製剤を得ることが好ましいものとなる。
高精製タンパク質を含有する製剤の安定化は、活性素の分解を阻害するか又は遅延する１種以上の賦形剤の添加により行うことができる。
インターフェロン−ベータを含有する医薬組成物は、周知である。ヨーロッパ特許出願89245（INTER-YEDA社）は、マンニトール、ヒトアルブミンおよびポリビニルピロリドンを含有するインターフェロン−ベータの凍結組成物を記載しており、後者は安定剤として記載される。また、他のインターフェロンを含有する医薬液体組成物も公知である。
国際公開WO89／04177（ジエネンテック：優先日1987年11月３日）は、4.0〜6.0の範囲内にpHを維持する緩衝液、安定剤としてポリヒドロキシラート糖および非イオン性洗剤を含んでなるガンマーインターフェロンの液体医薬製剤を記載する。
ヨーロッパ特許出願270799は、可溶化剤／安定剤として１種以上の非イオン高分子洗剤を含んでなる、液体形又は凍結乾燥されたIFN−β医薬組成物を記載する。
凍結乾燥製剤の再構成を避けそして使用容易可能とするためそのような液体製剤を得ることは、非常に望ましい。
今や驚くべきことに次の内容が見出された；すなわち、適当な緩衝液中でポリオール、非還元糖又はアミノ酸で安定化されたインターフェロン−ベータを含んでなる液体医薬製剤は、特に安定性をもたらしそして長期間生物学的活性を維持する。
本発明の主目的は、インターフェロン−ベータ並びに安定剤としてポリオール、非還元糖又はアミノ酸を含んでなる液体医薬製剤を提供することにある。
好ましくは、安定剤はマンニトール、サッカロースおよびグリシンから選ばれ；より好ましくは安定剤はマンニトールである。
好ましくは、液体医薬製剤は３〜４のpHを有する緩衝液を含んでなり；より好ましくはアセタート緩衝液を含んでなる。
本発明の別の目的は、賦形剤の溶液を用いIFN−βを希釈する工程を含んでなる、そのような液体医薬製剤の製造方法に関する。
さらに、本発明の別の目的は、使用前貯蔵に対し適当な容器中で無菌条件下密封された、先に言及された製剤を含んでなる液体医薬製剤の提示形態を提供することにある。
IFN−βの液体製剤の安定性を研究するため、種々の製剤を、pHを変えた種々の緩衝液中にバルクのIFN−βを希釈し、次いで種々の温度で試料を保存し次いで定められた時間間隔で免疫学的試験を用いて分析を行った。
より大きな安定性が得られる、緩衝液および好ましいpHが一度得られると、本発明の安定化された製剤は、また賦形剤を含有する緩衝液を用いてインターフェロンバルク溶液を希釈することによって調製される。種々の製剤の安定性は、50℃，37℃および25℃の温度で溶液を貯蔵後、一定の時間間隔時に残留活性を測定することにより測定される。
免疫学的試験は、封入された指示書において記載されている手続に従い、TORAYキット（ヒトIFN−ベータELISAキット、TORAY INDUSTRIES社）を用いて行った。
生物学的投薬は、アームストロングJ.A.(1981),Cytopathic effect inhibition assay for Interferon,in Methods in Enzymology73 381-387により記載されている如く行った。
活性の程度は、１mlの溶液当たりの国際単位（IU／ml）又は１mlの溶液当たりメガ国際単位（１ MIU／ml＝1,000,000IU／ml）で表わされる。
国際単位は、標準として用いられるHuIFN−ベータNIH標準品Gb23-902-531に対し、National In of Health,ベセスダ、メリーランドにより発行されたReseach Reference Reagent Note No.35に記載されている如く計算される。
測定は、時間零において試料の活性を100％に等しいものとし、種々の製剤中のインターフェロン−ベータの試料の残留活性のパーセンテージとしてここにおいて報告される。
活性成分の安定性に関するpHの効果を評価するため、種々の緩衝液、すなわちアセタート緩衝液、シトラート緩衝液、アスコルベート緩衝液、スクシナート緩衝液を用い、0.6および１ MIU／mlを含有する組換え体IFN−βの種々の製剤を調製した。
緩衝液と共に組換え体IFN−βを含有する製剤を調製し次いで50℃，37℃および25℃の温度で貯蔵し、次いで定められた時間間隔で免疫学的試験のもとで分析した。製剤を3.0〜4.0のpHおよび5.0〜6.0のpHを有するように調製し、全て0.01Ｍの濃度で緩衝液を用いて調製した。
表１、表２および表３は、種々の温度で１〜42日間定められた時間間隔で行なわれた試験結果を報告している。
前記表中に含まれるデータは、5.0〜6.0のpHを有する製剤が、力価の直ちの損失を示すことを現わしている。しかし、3.4〜4.0を有する製剤は、特にアセタート緩衝液の存在下高い安定性を示す。
活性素の安定性に関する賦形剤の効果を評価するため、マンニトール、サッカロース又はアミノ酸の如き種々の賦形剤並びにインターフェロン−ベータバルク溶液中にすでに部分的に含まれているヒトアルブミンを用い、組換え体IFN−βの１ MIU／mlを含有する種々の製剤を調製した。
用いたマンニトール、サッカロース又はグリシンの量は、IFN−βの等張溶液を得るための如きものであった。
これらの製剤に関する安定性の研究を、50℃，37℃，25℃および４℃で試料を維持しそして表４および表５に報告した時間における残留活性を測定することによって行った。
表４および表５中に報告されるデータは、マンニトールのようなポリオールを含有する製剤における分解が、サッカロース又はグリシンを含有するこれらの製剤に関しはるかにより低いことを示している。
幅広い研究に対し選択された製剤は、pH3.5の0.01Ｍアセタート緩衝液中に含有するものであり、これはイオン力（ionic force）およびアルブミンの安定性に関する効果を更に評価するため更に試験に委ねられた。
pH3.5の0.01Ｍのアセタート緩衝液中のIFN−βの溶液を、種々の浸透圧モル濃度：150,300および400で、そして種々の誘電定数で、５％，10％および20％のプロピレングリコールを用いて調製した。研究によれば、浸透圧モル濃度の増加およびプロピレングリコール含量の増加は、IFN−βの液体製剤の安定性を減少した。
バルクIFN−βはアルブミンを含有するので、インターフェロン−β液体製剤の安定性に関するアルブミンの効果の評価に対する研究を続けることが決定された。IFN−β（１ MIU／ml）およびpH3.5のアセタート緩衝液を含有する試料を、１mlのヒトアルブミン当たり１mg，３mg，６mgおよび９mgに添加し次いで50℃，37℃および25℃の温度で試験した。
その結果は、アルブミンが増加すると、試料の安定性が減少することを示す。試料当たりのアルブミン含量を、種々のバルク中に含まれるものと匹敵する最少量を有するような方法で定められ；１ MIU／mlのIFN−βを含有する製剤中に、0.5mg／mlの均一含量が維持される。
医薬製造の例
原料：マンニトール（メルク）；ヒトアルブミン（ベーリンガー）；0.01Ｍのアセタート緩衝液（メルク）；NaOH １Ｍ（メルク）。Pharmagummiゴム、ブチル混合物、およびアルミニウム環のストッパーを有するDIN 2Rガラスビン（ガラスタイプＩホウケイ酸ガラス）を、容器として用いた。
γ−IFN−β溶液の製造例
Ａ）１ MIU／MLの溶液
１ｌの完成品のバッチの製造に対し、次の量を用いる：
γ−インターフェロン−β 1000MIU
マンニトール 54.6ｇ
ヒトアルブミン 0.5ｇ−Ｐ
0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液 適量ないし１ｌ。
Ｐ＝バルクインターフェロン中に存在するヒトアルブミンの量。
Ｂ）12MIU／MLの溶液
１ｌの完成品のバッチの製造に対し、次の量を用いる：
γ−インターフェロン−β 12000MIU
マンニトール 54.6ｇ
ヒトアルブミン 4.0ｇ−Ｐ
0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液 適量ないし１ｌ。
Ｐ＝バルクインターフェロン中に存在するヒトアルブミンの量。
Ｃ）24MIU／MLの溶液
１ｌの完成品のバッチの製造に対し、次の量を用いる：
γ−インターフェロン−β 24000MIU
マンニトール 54.6ｇ
ヒトアルブミン 8.0ｇ−Ｐ
0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液 適量ないし１ｌ。
Ｐ＝バルクインターフェロン中に存在するヒトアルブミンの量。
製造方法
要求量のマンニトールおよびヒトアルブミン（バルク中に存在するアルブミンの量を考慮した）を、0.01ＭのpH3.5アセタート緩衝液約500ｇ中に溶解する。pHを検査し次いで、必要により、希釈（１：２）酢酸を用い又は１Ｍ NaOHを用い3.5±0.2の値に調節する。
溶液を、0.01ＭのpH3.5のアセタート緩衝液を用い最終重量１kgに至らしめる。
γ−インターフェロン−ベータの必要量を、ビーカー中に釈量し次いで賦形剤の溶液を用い500ｇの最終重量に至らしめる。
別のビーカー中、500ｇの賦形剤の溶液を釈量する。インターフェロン−ベータを含有する500ｇの溶液を、1.5atmを超えない圧力で0.22μｍ（DURAPORE）の無菌膜上で濾過する。無菌溶液をガラスエルレンマイヤーフラスコ中に集める。その後直ちに500ｇの賦形剤溶液を、1.5atmの圧力で同じ膜上で濾過し次いで同じエルレンマイヤーフラスコ中に集める。得られた溶液をゆっくり混合する。
Claims (10)
- 安定な液体医薬製剤であって、インターフェロン−ベータ、安定量のマンニトール若しくはサッカロースから選択されるポリオール又はグリシン、および3.0〜4.0の値に該製剤のpHを維持することのできる緩衝液を含んでなる、前記安定な液体医薬製剤。
- ポリオールが、マンニトールである、請求の範囲第１項記載の液体医薬製剤。
- インターフェロン−ベータが組換え体である、請求の範囲第１又は２項に記載の液体医薬製剤。
- インターフェロン−ベータが、0.6〜１MIU／mlの量で存在する請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の液体医薬製剤。
- 緩衝液がアセタート緩衝液である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の液体医薬製剤。
- 緩衝液が0.01Ｍの濃度を有する、請求の範囲第４項記載の液体医薬製剤。
- ヒトアルブミンをさらに含んでなる、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の液体医薬製剤。
- pH3.5の0.01Ｍアセタート緩衝液中に１MIU／mlのインターフェロン−ベータ、54.6mg／mlのマンニトール、0.5mg／mlのアルブミンを含んでなる、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の液体医薬製剤。
- 賦形剤の溶液を用いてインターフェロン−ベータを希釈することを含んでなる、請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の液体医薬製剤の製造方法。
- 請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の液体医薬製剤を含んでなり無菌条件下で密閉されそして使用前の貯蔵に対し適切な容器。
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