JP3691556B2 - ゲノムdnaを定量する方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、
1)反復ゲノム配列に相補的なプライマーを用いることによる核酸増幅法により試料中に含まれるDNAを増幅し、そして
2)得られた増幅されたDNAを検出する、
工程を含んでなる、試料中のゲノムDNAを定量する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
医学の分野において、バイオテクノロジーにより得られたタンパク質を用いることは、その製品の品質管理に関し製薬産業に新しい問題を提出する。細胞培養に由来する不純物を測定するための新しい検出法が確立されねばならない。かくして例えば世界健康機関(World Health Organization)は、組み換え製品中におけるヘテロガスな混入DNAの量は投与される用量(dose)当り100pg以下であることを要求し、他方米国食品薬品局(U.S.Food and Drug Administration)の要求によれば、個々の用量当り僅か10pgのみのDNAが受容される。
【0003】
今日まで、組換え製品中の混入DNAの測定は膜にハイブリダイズさせることにより主に行われている。Por[Clin.Chem.35巻(1989)、1859ページ]は、放射性ラベルのゲノムプローブを用いると5pgという少量のDNAが検出できることを示す。しかしながら14の研究室が参加した研究室間試験は、ハイブリダイジングによるDNA測定は、一研究室内でも、いくつかの研究室を比較した場合も、満足すべき再現性のある結果を生じないことを示した[RobertsonおよびHeath、Biologicals、20巻(1992)、73ページ]。
【0004】
Gillilandは競合的PCRに基づく定量的なPCR法を記載する[PNAS、87巻(1990)、2725ページ]。DNA量を測定するために、彼は試料と同時に増幅する内部標準の希釈シリーズを使用する。そのPCRは飽和まで行う。これはエチジウムブロマイド染色によるPCR生成物の検出を可能にする。その後PCR生成物をゲル上で分離し、試料のコピー数を標準希釈シリーズのコピー数と比較し、試料の濃度を計算する。標準および試料濃度が反応容器中で約1:1の比で増幅されているならこの濃度評価は正確であろう。標準希釈物を多く用いるほどDNA量の測定はより正確であることをこのことは暗示する。
【0005】
RNAを定量する方法もWang等により提案されている[PNAS、86巻(1989)、9719ページ]。このPCRは指数期に中止する。様々な標準濃度を増幅することにより、著者は検量線を提供する(外部標準化)。指数的な反応期においては、PCR生成物の数は存在するRNA分子の数に比例して増加するので、この検量線は直線であり、増幅された試料濃度を最終的に読むことができる。この方法の欠点は、PCR生成物の最終濃度が比較的低く、感度の高い検出法を検出のために用いなければならないということである。Wang等は放射性ラベルのヌクレオチドを用いる。
【0006】
Porcher等[Biotechnique、13巻(1992)、106ページ]は、蛍光ラベルのプライマーを用い、PCR生成物を自動レーザー蛍光DNAシークエンサーにより定量することによって少量のPCR生成物の検出を改良することに成功した。
【0007】
これ等すべての方法は、ある遺伝子、ウイルスのDNA部分またはmRNA等の少量のホモロガスな配列の測定を可能にする。しかしながら混入したヘテロジニアスなゲノムDNAを測定する正確な方法を見出すことは可能でなかった。
【0008】
国際公開94/12669号において、混入するDNAの検出のためのPCR法が提案され、該方法ではゲノムの反復配列を増幅させる。この方法では0.1pg〜0.01pgのDNA量が検出可能であると言われる。しかしながら染色体DNAの適当な定量はこの方法では可能でない。増幅反応前の標準の添加も、試料中に最初に含まれる全染色体DNAを増幅したDNAから再計算できる方法も開示されていない。反復配列は試料を汚染する器官のゲノム中に少くとも1%の濃度で存在しなければならないと述べられているだけである。しかし実施例に記載されたハムスター細胞(CHO)の混入DNAの測定において、CHOゲノム中にいかに多くの反復配列が含まれるか述べられていない。また同文献中にこれに関するデータを見出すのは不可能であった。しかしながら原理的にこれらのデータなしには試料中の混入DNA含量を正確に再計算するのは不可能である。何故ならそのような再計算のためにはとにかく増幅されたDNA片および全染色体DNAの間の定量的関係が必要であるからである。
【0009】
国際公開94/12669号によればPCR生成物の検出は、DNA中に析出する染料ヘキスト32258を用いて行われることも述べておく。この染料はPCR後に反応生成物に加える。この分析が内部標準の使用を除外するという事実にもかかわらず、このキャクタリゼーションはその低感度のためDNAの正確な定量には適しない。しかしこれは国際公開94/12669号の目的ではなかった。DNA検出のこの方法は、染色体DNAが調べるべき試料中の含まれているか否かという疑問へのイエス/ノーの答を提供することを意図しただけであった。
【0010】
しかしPCRによる正確なDNA濃度測定には内部標準を添加する必要がある。何故ならPCRの効率は反応容器ごとにしばしば異ることが示されているからである。この効率の差異は105までの結果の差異をもたらす。国際公開94/12669号の方法では、この誤差の原因は完全に無視されており、したがって国際公開94/12669号の方法の再現性は疑わしい。
【0011】
本発明は、試料中に存在する染色体DNAの全量に関して非常に正確な定量的な情報を与えることのできる染色体DNAの定量方法を提供することをその目的として有する。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明による、そして最初に定義されるタイプの方法は、
1)従来公知の方法における増幅の前に、一定量の公知の核酸を内部標準として試料に加え(その標準核酸は少くとも1つの検出可能な特徴において定量すべきゲノムDNAと異る);そして
2)増幅されたゲノムDNAの量と増幅された標準核酸の量を測定し、得られた標準核酸の量から出発して試料中に始めに存在するゲノムDNAの量を測定する;
ことに特徴がある。
【0013】
この方法によって、染色体DNAのある部分的な量(現在の場合にはある反復配列)の定量により試料中に存在する染色体DNAの含量を測定することが始めて可能となった。
原理的には核酸増幅はMullis等および他の人々によって開発され技術(米国特許第4,683,195号および同4,683,202号)、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)、リガーゼーCR(LCR)の逆転写酵素−PCR(RT−PCR)をベースにした方法を意味する。
標準核酸は、増幅すべきゲノムDNAと少くとも1つの検出可能な特徴において異らなければならないが、それは同じプライマーの助けにより増幅させることができるべきである。増幅すべきゲノムDNAの大きさと異なる大きさを有し、増幅すべきゲノムDNAのそれと異なる制限切断部位を有する標準核酸が便利であることがわかった。好ましくは標準核酸はDNAである。何故なら標準核酸と試料中に含まれる定量すべき染色体DNAの間の類似性ができるだけ大きくなければならないからである。これはGC含量、制限部位、配列にもあてはまる。好ましい標準は増幅すべき染色体DNAと、1〜20%の長さだけ異る。標準核酸の正確な配列は勿論知られているべきである。
【0014】
増幅工程に用いるプライマーは、増幅された核酸の検出限界を増大させる基、例えば蛍光性若しくは放射性の基、またはアフィン(affine)タンパク質およびその後の検出反応により検出できる化学基(例えばビオチン−アビジン、ジゴキシゲニンラベリング等)を好ましくは含む。蛍光性の基を有するプライマーが特に好ましい。
【0015】
DNA分析のための好ましい反復ゲノム配列はAlu配列またはAlu−イクイバレント配列であり、プライマーはAlu−イクイバレント(equivalent)共通配列、特に哺乳動物、特に齧歯類および霊長類のAlu−イクイバレント共通配列の部分に好ましくは結合する。
【0016】
増幅後のDNA量の測定(DNA量は例えば或るDNA分子の質量の形で(mg、μg、ng、pg、…)またはコピー数として与えられる)は様々な方法で行い得るが、大ていの場合増幅した標準核酸を定量すべき増幅されたゲノムDNAと分離し、その分離したDNA量を別に測定する工程が提供されねばならない。好ましくはこの分離工程はゲル電気泳動またクロマトグラフ法による。
【0017】
自動的に行われ、分離および定量工程を一緒にした検出方法が特に適していることがわかった。かくして本発明による方法の好ましい態様は、増幅した核酸量の測定を、核酸検出製造、好ましくは蛍光感受性核酸検出装置を用いることにより行う。そのような核酸検出装置の例はレーザー誘起蛍光測定装置[例えばApplied Biosystemsのジーン・スキャナー(Gene Scanner)(登録商標)373A]またはHPLC装置を有する自動DNAシークエンサーである。これらの装置を用いれば長さで1塩基対しか異ならないDNA分子を互いに分離することが可能である。
【0018】
ジーン・スキャナーの特別の利点は、一つの単一レーン中で異る蛍光染料間を区別することが可能なことである。これは一つのゲル上で多数の試料を同時に処理することを可能にする。何故ならゲル上で利用できるすべてのレーンが試料用に使用し得るからである。さらに一つの単独レーンで、異る蛍光染料でラベルした多数のPCR生成物を分析し(マルチプレックス−PCR)、それによって或る試料中の様々な起源のゲノムDNAを検出することが可能である。例えば1試料中の2つの異る核酸を同時に検出する場合、経費はほとんど半分に節減できる。ルーチン操作で本発明の方法を用いる場合、これは特に有利である。これと対照的に、Porcher等によりPCR生成物の分析に用いられた自動レーザー蛍光DNAシークエンサーはレーン当りただ1つの蛍光染料(従ってただ1つのDNA)を分析できるだけである。
【0019】
本発明による方法の好ましい態様では増幅工程は指数期ですでに中止する。
それによって増幅された標準のコピー数の比は反復配列のコピー数に比例する。さらに、単一の標準の共増幅によって反復配列のコピー数を測定できる。これに関して本発明による方法はGilliland等のしばしば用いられた方法に比べはるかに優れている。何故なら試料当りただ1つの標準を実験する必要があるだけであるのに対し、Gillilandによる方法は、異った試料における異った希釈においてより多くの標準を用いるほど、より正確であるからである。
【0020】
本発明の方法によれば、好ましくは混入しているゲノムDNAを測定する。この測定は、ワクチンにおいて、または細胞培養に由来する組換え製品の品質管理において、混入したDNAを測定する場合特に重要である。
試料中に含まれた定量すべきゲノムDNAの量は、増幅された標準核酸の量から、検量線により好ましくは決定する。
【0021】
これまで、前もって測定した少量(反復配列のコピー数)からより多い全体の量(ゲノムDNA)へいかに結論を引き出すかに関する文献はなかった。ゲノム中の反復配列の部分は1〜10%範囲にあることが知られているだけである。これまで増幅された反復配列とゲノムDNAの全量との間の直線的関係は開示されていない。
【0022】
好ましくはこの関係づけは次の方法において見出すことができる検量線によって行うことができる:
様々な既知の濃度のある種のゲノムDNAを、内部標準を用いることにより競合的核酸増幅法で本発明の本法を用いて増幅させる。その方法を指数期で中止し、増幅された核酸量を測定する。
【0023】
増幅された内部標準により生じたピーク面積(=コピー数)は、用いたゲノムDNAの増幅された反復配列のピーク面積(=コピー数)に比例する。検量線を得るために、それから計算された反復配列のコピー数を、最初に用いたゲノムDNA量に対してプロットする。これに関して低DNA濃度で(0〜60pg/ml)この検量線は直線であることが驚くべきことに見出された。この直線から係数を計算し、未知のDNA量を測定するのに最終的に用いる。
【0024】
本発明の方法によれば、かくしてゲノムDNA量は以下の式によりpg/mlで計算される。
【数1】
m(試料) = A(試料)/A(標準) × N(標準) × F1 × D × 1/F2
【0025】
[式中、A(試料)は試料の増幅された染色体DNAのピーク面積であり、
A(標準)は増幅された内部標準のピーク面積であり、
N(標準)は内部標準の用いたコピーであり、
F1は標準の体積と抽出した体積との比であり、
Dは希釈係数であり(試料が抽出の前に希釈されているなら)、そして
F2は反復配列のいかに多くの検出可能なコピーが1pgのゲノムDNA当り含まれるかを示す換算係数である]
この検量線は用いたゲノムDNA、用いたプライマーおよび特に選択した増幅条件に特有である。
【0026】
染色体DNAの定量における更なる指標は感度と再現性である。本発明の方法を用いると、1pg〜100pgの範囲のDNA量を非常に正確に再現性よく測定できる。この方法の感度限界はいかなる方法によっても到達されていない。
【0027】
本発明による方法はバイオテクノロジーにより製造されたタンパク質のチェックおよび品質管理に特に適しており、これ等のタンパク質の製造方法についての制限はない。例えば、組換えタンパク質、トランスジェニックタンパク質またはハイブリドーマ技術により得られたタンパク質を、本発明の方法により、それらの染色体DNA含量につき分析できる。多数の分析はハイブリドーマ細胞系で得られたモノクローナル抗体を、由来の種の混入DNAにつき簡単で有効な方法で分析することを可能にする。
【0028】
特にワクチンまたは組換えタンパク質の場合には品質管理がバックグラウンドの問題に直面している。霊長類細胞培養物中の混入染色体DNAを測定する場合、生成物の製造または処理中の取扱いによって起る不純物も、用いるプライマーが霊長類のすべてのAlu配列に特異的であるなら、本発明の方法によりカバーできる。しかし組換えタンパク質の生産が、例えばCHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓細胞)またはCEC(ニワトリ胚細胞)などの非霊長類の細胞培養中で行われるなら、本発明の方法の場合の検出限界ははるかに小さい。何故なら試料の取扱いにより起る不純物の問題は排除されるからである。本発明の定量法はCHO−、Vero−(モンキー細胞系)、BHK−、SK−Hepl−(ヒト肝臓細胞系)、ハイブリドーマ細胞またはCEC細胞について特に好ましく用いられる。何故ならこれらの細胞培養は、ワクチン、組換えタンパク質またはモノクローナル抗体の製造に最も一般的に用いられているからである。
【0029】
本発明の方法の再現性は少くとも95%に達する。これを得るために、標準および試料の増幅反応の効率が等しいよう注意すべきである。増幅反応の効率は、それが指数期に中止されるなら第1に重要である。
【0030】
従って本発明の他の態様は、生物学的製品、特にバイオテクノロジーによって製造された製品のチェックおよび品質管理のために本発明の方法を用いることに関する。何故ならこれ等の場合DNAで汚染される危険が特に大きいからである。本発明の方法は、HIV表面抗原、gp160、組換え血液因子、血漿タンパク質およびワクチン[例えばヘルペス、インフルエンザ、およびダニ媒介脳炎(TBE)ウイルスに対するワクチン]のチェックおよび品質管理に用いられる。
本発明の方法の高感度および特に低い検出限界のため、混入している核酸の非常に低い含量または核酸が含まれないことによって定義される新しい品質基準が生物学的製品につき測定できる。
【0031】
更なる態様によれば、本発明は、用量(dose)当り本発明の方法を用いて測定して10または100pgの許容限界以下に少くともある染色体DNAの含量を有し、従って実質的に外来遺伝子を含まない、生物学的な、特にバイオテクノロジー製品に関する。
特に好ましいのはgp160等のウイルスタンパク質、組換え血液因子、血漿タンパク質、および特にヘルペス、インフルエンザ、肝炎またはTBEウイルスに対するワクチンである。
【0032】
PCRの効率は、例えばプライマーの標準および試料核酸への結合によって影響される。この理由で好ましくは同じプライマーを標準および試料について用いる。これ等のプライマーは標準および増幅すべきゲノムDNAのプライマー結合部位にできる限り100%相同性であるべきである。合成標準の場合これは問題でないが、増幅すべきゲノム配列の場合には問題である。反復配列は必ずしも100%相同的ではなく、しばしば異る配列を有する。プライマーを選択する場合、最も完全に保存されたヌクレオチド配列を用いるよう注意しなければならない。プライマーがゲノムの反復配列に相同性が小さいほどプライマーの結合は弱くなり、PCRの効率も小さくなる。本発明の方法においては、ジーンデータライブラリーの反復配列内部の保存されたDNA部分の配列(alignment)により選択する。
【0033】
それ故更なる態様によれば本発明は本方法に用いるプライマーに関する。すなわち
【0034】
【化1】
Alu A2/2:GCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGT bp 149−176
(配列番号1)
Alu B: GAGACAGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGG bp 294−267
(配列番号2)
[Batzer等による番号づけ(Nucl.acid Res.18巻(1990)6793頁)]
CR1: ATGAGGCACTGGAACAGGTTGCCC bp 260−283
(配列番号3)
CR1A CAGGGCCACATCCAGCCTGG bp 345−326
(配列番号4)
[Stumph等による番号づけ(PNAS、81巻(1984)、6667〜6671ページ)]
【0035】
本発明は標準製造用のプラスミドにも関する。すなわち
pAlu−wt(公知のpCRIIプラスミドおよび多数のクローニングサイト中の挿入物よりなり、該挿入物はBatzer等からのAlu繰返し特異配列の塩基対(bp)148〜294を含む。)、
pAlu20(pAlu−wtから誘導され、Batzer等からのAlu繰返し特異配列のbp178における20bpを削除する。)、
pCR1−wt(公知のpCRIIプラスミド(インビトローゲンの)およびpCRIIプラスミドのEcoRI部位における挿入物よりなり、該挿入物はStumph等(1984)からのCR1配列のbp260〜345を含む。)、
pCR1+11(プラスミドpCR1−wtより誘導され、bp300部位に11ヌクレオチドを挿入する。)、
pCR1−8(プラスミドpCR1−wtより、302位置(Stumph等による)において8個のヌクレオチドを削除することにより誘導する。)。
【0036】
増幅反応の効率は、増幅すべきDNA分子の種類にもよる。本発明の方法の場合、増幅の前にリニアー化(linearised)の形の内部標準を加えるのが有利であることがわかった。それによって反応効率の更なる相異が補償され、増幅すべき異なった形のDNAに戻る。
【0037】
本発明の他の態様によれば、本発明は試料中のゲノム核酸を定量するためのキットにも関し、該キットは
1)定量すべき核酸と少なくとも一つの検出可能な特徴において異なる、内部標準としての少なくとも一つの公知の核酸、
2)標準の核酸および定量すべき核酸に結合する蛍光ラベルしたプライマー、
3)既知量のゲノム核酸を含むポジティブ対照、
4)核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
5)マニュアル
を含んでなる。
【0038】
本発明によるキットの好ましい態様は以下のようなものである:
1.1)内部標準としてのプラスミドpAlu20、
2)蛍光ラベルしたプライマーAlu A2/2およびAlu B、
3)既知量のVero細胞DNAを含むポジティブ対照、
4)ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
5)マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノム霊長類(primate)DNA定量用キット。
2.1)内部標準としてのプラスミドpCR1+15およびpCR1−8、
2)蛍光ラベルしたプライマーCR1およびCR1A、
3)既知量のトリ(avian)DNAを含むポジティブ対照、
4)ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
5)マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノムトリDNAの定量用キット。
【0039】
本発明を実施例および図面によってより詳細に説明するがそれに限定されるものではない。特に、本発明の方法が様々な試料中の染色体DNAのルーチンな、早い、しかし正確で再現性のある定量に特に適していることを図面は示す。
【0040】
【実施例】
1.一般式な作業指示
1.1 方法の原理
様々な起源の核酸を、蛍光性の基を有するプライマーを用いることによりPCRにより増幅させる(Saiki等、Science、239巻(1985)、487〜491ページ)。得られた増幅されたPCR生成物の分析および定量を、レーザー誘起蛍光測定手段を有する自動DNAシークエンサー(Applied Biosystemsの373Aジーン−スキャナー)の助けにより行った。この装置は、変性条件下においてポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動により蛍光ラベルのPCR生成物を大きさにより分離し、その量を定量的に測定することができる。試料中のある配列のコピー数を、染色体DNAおよび内部標準のPCR生成物について得られた強度を基準にして測定する。DNAの標準の質量当りの増幅された反復染色体配列の数の間の与えられた比を用いることにより(「検量線の提供」項参照)、試料中に存在する全染色体DNAへの直接的結論を引き出すことが可能である。
【0041】
1.2 核酸の抽出
試料500μlに5μlの1Mトリス/HCl(pH8.0)および10μlのプロテナーゼK(Boehringer Manheim、20mg/ml)、および20μlの20%SDS溶液を加える。一定量の標準核酸および1μgのヘリング(herring)***DNAを加え、その試料を56℃で1時間インキュベートする。その試料をフェノールおよびクロロホルムで首尾よく抽出し、10μlのグリコゲン(Boehringer Manheim、20mg/ml)を加える。その後DNAをエタノールで沈澱させ、遠心分離し、ペレットを洗滌し、最終的に水に再溶解する。
【0042】
1.3 PCR
公知の方法におけるPCRセットアップは、抽出された核酸のアリコート、PCR緩衝液(Boehringer Manheim)、MgCl2、dNTP、プライマー、Taq−DNAポリメラーゼ(Boehringer Manheim、5.0U/μl)および水を含む。PCRは緩衝液および酵素の製造者の指示に従い、および一般的な作業指示に従い[Mullis等、Methods in Enzymology、155巻(1987)、335ページ]PCR装置(Perkin−ElmerのGeneAmp System 9600)で行う。
【0043】
1.4 生成物の分析
PCR生成物を測定および定量するために、PCR溶液から0.5〜1.0μlを取り出し、Applied Biosystemsの373A装置および特別なジーンスキャンソフトウェアで製造者の指示に従い分析する。
【0044】
2.1 実施例1: ゲノムモンキーDNAの定量
この定量において、いわゆる「Alu 繰返し」配列中の高度に保存された領域に結合し、146bp断片を増幅するプライマーを用いる[Jelinek等、Ann.Rev.Biochem.51巻(1982)、813〜844ページ]。すなわち、
【0045】
【化2】
Alu A2/2: GCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGT bp 149-176
(配列番号1)
Alu B: GAGACAGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGG bp 294-267
(配列番号2)
(番号付けはBatzer等による)。
【0046】
プライマーはホスホアミダイト化学を用いてDNAシンセサイザー(AppliedBiosystems 394 DNA Sinthesizer)で調製した。
標準プラスミドpAlu20はプラスミドpAlu−wtから誘導され、pAlu−wtは公知のpCRIIプラスミド(インビトロゲンの)およびpCRIIプラスミドの多数のクローニング部位における挿入物からなり、該挿入物はBatzer等からのAlu繰返し特異配列のbp148〜294を含む。
pAlu20においてはbp178〜197を削除した。そのプラスミドを精製し(QUIAGEN法)、濃度を260nmにおける分光学的測定により測定した。それをEcoRIで解裂させ、10mMトリス/HCl(pH8)/0.1mM EDTA緩衝液中に希釈した[Sambrook等、Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Lab Press、Cold Spring Harbor(1989)]。
標準および野性型DNAのPCR生成物の長さは126および146bpである。
【0047】
2.1 モンキーDNAを用いる検量線の提供
ゲノムモンキーDNAの1pg当りのAluコピー数を測定するため、3つの検量用実験を行った(ブランク、2pg、5pg、10pg、20pg、40pg、60pg、100pg DNA/ml)。得られたすべてのデータ(濃度段階当り6つのPCR)を表1に要約し、回帰(リグレッション)直線を図1に説明する。
【0048】
【表1】
【0049】
DNA: pg/mlで表したDNA
CF: 見出されたコピー
RG: リグレッション(regression)
MV: 平均値
SD: 標準偏差
VC: 変動係数
【0050】
データの計算は次の関係により行った。
面積(試料):面積(pAlu−20)=x
X−(面積(ブランク)):(面積(pAlu−20))=y(補正した面積比)
y×100000=500μlの試料中のコピー数=z(500μlを抽出し、標準プラスミドの100000コピーを加えた)
z×2=ml当りのコピー数
リグレッションの直線(y=4533.9+8720.1x)を計算した後、ゲノムモンキーDNApg当りの9200コピーの平均値を得た。
【0051】
2.2 染色体のモンキーDNA(ベロ(vero)細胞)の定量
Barrett等[AIDS Research and Human Retroviruses、5巻(1989)、159〜171頁]により製造したワクチンバッチの前段階物を、DNA抽出、およびプライマーAlu A2/2およびAlu B、並びに同じプライマーによって認識されるが異なった大きさのPCR生成物を生じる内部標準(pAlu20)の助けによる定量的PCRにより分析した。分析の結果を表2および図2〜図10に説明する。
【0052】
表2に測定した試料の種類、程度および測定値を掲げる。1欄は標準プラスミドpAlu20のコピー数を示す; 2欄は試料の希釈段階を示し、1は希釈しない試料である; 3欄は試料の抽出した体積を示す、4および5欄は試料のタイプを示す(gp160製品のバッチ数;緩衝液および標準の希釈); 6欄は試料1ml当りのVeroの全DNAのpgで表した測定値を示す; 7欄はこれらの測定の平均値を示す; 8欄は試料を分析したレーンの数を示す(図2〜10も参照); 9および10欄は測定した標準ピークの面積および測定すべき染色体DNAのピークの面積を示す。第1線は対照線である。
【0053】
【表2】
【0054】
図2〜10はPCR生成物の定量的測定のグラフ的な評価を説明する。PCR生成物(および副生物)の蛍光シグナルの強度を様々なレーンで説明する。その生成物はその定義された大きさで同定される(bpで)。標準pAlu20(S)は126bpに表れ、野性型のピーク(P)は146bpに表れる。ピーク面積およびDNA量の計算を表2に示す。
【0055】
3.1.染色体チキンDNAの定量
プライマーとPCRの条件を最高に活用するという考えは、1mlの試料あたり1pg〜100pgの濃度範囲のチキンのDNAにおける正確なそして特異的な測定である。pg領域での測定の望ましい特異性と感度を得るために反復DNAファミリーの配列をPCRの標的配列として選んだ。これらのDNAファミリーは種に非常に特異的であるばかりでなく、ゲノム中の非常に多数のコピーがあり、したがって少量の特異的DNAの測定のための基準に合致する。アベス(aves)(鳥)のファミリーにおけるCR1反復DNAファミリーが記載され、ゲノムあたり7000〜20000コピー存在すると言われる(Stumpf等、Nucleic Acids Res.、9巻(1981)、5383〜5397ページ)。このファミリーの様々なメンバー間で比較すると、部位261〜391に高度に保存された領域があることを示す(Stumpf等による番号づけによる)。チキンのDNAを測定するためのプライマーのペアは、その反復配列のアライメント(alignment)により選択され、それはこの保存された配列の内部で特異的に結合し、84bpの長さを有するDNAフラグメントを増幅する。すなわち、
【0056】
【化3】
CR1: ATGAGGCACTGGAACAGGTTGCCC bp 260-283 配列番号3
CR1A CAGGGCCACATCCAGCCTGG bp 345-326 配列番号4
[Stumpf等(1984)による番号づけ]
【0057】
プライマーはホスホアミダイト化学を用いることによりDNAシンセサイザー(Applied Biosystems 394 DNA Synthesizer)で調製した。
【0058】
標準プラスミドpCR1+11およびpCR1−9は、pブル−スクリプト(pBluescript)ベクターのNcoIおよびSacI部位間に、260〜345位置(Stumph等による)からのCR1に由来する配列を含む合成ヌクレオチドを挿入することにより得た。pCR1+11の場合、CR1配列は11ヌクレオチドの挿入を含み、標準プラスミドpCR1−8については302位置(Stumph等による)における8ヌクレオチドの削除を含む。それ故これら標準プラスミドから誘導されたPCR生成物は長さが95bpまたは76bpである。そのプラスミドを精製し(QUIAGEN法)、濃度を260nmにおける分光学的測定により測定する。それをEcoRIで解裂させ、10mM TRIS/HCl(pH8)/0.1mM EDTA緩衝液に希釈した[Sambrook等、Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Lab Press、Cold Spring Harbor(1989)]。
【0059】
検量用の直線を2.1と同様提供した。実験において200、40、20、10、4および2pgのゲノムDNAをチキンの細胞(CEF−細胞)から抽出し、蛍光ラベルプライマーCR1およびCR1Aを用いるPCRに付した。特異性の対照として100pgのマウスおよびヒトの染色体DNAもPCRに付した。10μlの水がネガティブ対照として役立った。
【0060】
分析の結果を表3および図11〜14に説明する。
表3は測定した試料の種類、程度、および測定値を示す。1欄には測定の数(図11〜14中の1レイン数に対応する)を示す。2欄はCEF細胞のゲノムDNAの用いた量を示す;3欄は測定したピークの面積を示す。
【0061】
【表3】
【0062】
図11〜14にはPCR生成物測定の図的な評価を示す。PCR生成物(および副生物)の蛍光シグナルの強度を様々なレーンで示す。生成物はそれらの定義された大きさ(bpで)により同定できる。野性型のピークが86bpで生じ、ピーク面積は表3に示す。
チキンのDNAを用いたすべてのレーンにおいて、定義された(defined)ピークが86bpに生じる。これとは対照的に、大量のヒトまたはマウスを用いたとしても有意な量の86bp特異的な生成物は検出されなかった。これらの結果をベースにして、染色体のチキンDNAの検出限界は本発明の方法においては2pg/ml未満であると決定できる。
【0063】
3.2.チキンDNAの定量
チキンDNA25、10、5、2.5および1pg/mlの希釈物および水を抽出し、PCRに付した。表4は、加えた標準プラスミドpCR1+11およびプラスミドpCR1−8の数(1および2欄)、希釈(3欄)、体積(4欄)、試料の記述(5欄)、コメント(6欄)、−標準(7欄)または+標準(8欄)を用いて計算した試料中のCR1配列の数、チキンDNAのpgで表した平均値(9欄)、試料を分析したレーン(10欄)、−標準のピーク面積(11欄)、野生型のピーク面積(12欄)、+標準のピーク面積(13欄)を示す。PCR生成物の測定の図的な評価を図15に示す。PCR生成物はその大きさにより同定できる。野生型のピークは04bpに、マイナス標準ピークは76bpに、プラス標準ピークは95bpに生じる。蛍光シグナルのピーク面積を表4に示す。
【0064】
【表4】
【0065】
【配列表】
配列番号: 1
配列の長さ: 28
配列の型: 核酸
鎖の数: 1本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
GCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGT 28
【0066】
配列番号: 2
配列の長さ: 28
配列の型: 核酸
鎖の数: 1本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
GAGACAGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGG 28
【0067】
配列番号: 3
配列の長さ: 24
配列の型: 核酸
鎖の数: 1本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
ATGAGGCACTGGAACAGGTTGCCC 24
【0068】
配列番号: 4
配列の長さ: 20
配列の型: 核酸
鎖の数: 1本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
CAGGGCCACATCCAGCCTGG 20
【図面の簡単な説明】
【図1】 染色体のモンキーのDNAについての検量用直線を示す。pg/mlで表したゲノムDNA量をmlあたりの見出されたコピー数に対してプロットした。
【図2】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図3】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図4】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図5】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図6】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図7】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図8】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図9】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図10】 染色体のモンキーDNAの定量の結果を示す。
【図11】 染色体のチキンDNAの定量の結果を示す。
【図12】 染色体のチキンDNAの定量の結果を示す。
【図13】 染色体のチキンDNAの定量の結果を示す。
【図14】 染色体のチキンDNAの定量の結果を示す。
【図15】 染色体のチキンDNAの定量の結果を示す。
【図16】 染色体のチキンDNAの定量の結果を示す。
Claims (30)
- 以下の工程:
1)反復ゲノム配列に相補的なプライマーを用いることによる核酸増幅法により試料中に含まれるDNAを増幅し、そして
2)得られた増幅されたDNAを検出する、
を含んでなる試料中のゲノムDNAを定量する方法であって、
1)従来公知の方法における増幅の前に、一定量の少くとも1つの公知の核酸を内部標準として試料に加え(その標準核酸は少くとも1つの検出可能な特徴において定量すべきゲノムDNAと異る);そして
2)増幅されたゲノムDNAの量と増幅された標準核酸の量を測定し、得られた標準核酸の量から出発してサンプル中に始めに存在するゲノムDNAの量を測定する;
ことを特徴とする定量方法。 - 増幅において蛍光性若しくは放射性基、またはアフィンタンパク質およびその後の検出反応で検出可能な化学基を有するプライマーを用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 検出可能な化学基が蛍光性基であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- Alu配列をコードする増幅プライマーを用いることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 増幅工程を指数期において中止することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 増幅された核酸の量の測定を、核酸検出装置を用いて行うことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 核酸検出装置が蛍光感受性核酸検出装置であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 混入しているゲノムDNAを測定することを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 増幅された標準核酸の量から試料中の定量すべきゲノムDNA量を検量用直線により測定することを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- Aluイクイバレント共通配列の部分に相補的な増幅プライマーを用いることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- Aluイクイバレント共通配列が齧歯類または霊長類のAluイクイバレント共通配列であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- CHO、Vero、BHK、SK−Hepl、ハイブリドーマまたはCEC細胞のゲノムDNAを定量することを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 生物学的製品の品質をチェックし、品質管理する方法であって、該方法は請求項1〜12のいずれかに記載の方法を含んでなる方法。
- 生物学的製品がバイオテクノロジーにより製造された製品である請求項13に記載の方法。
- 生物学的製品が、ウイルスタンパク質、gp160、組換え血液因子、血漿タンパク質、ワクチンまたはモノクローナル抗体である請求項13または14に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれかに記載の方法により測定して、用量当り10pgまたは100pgの限界以下の染色体DNAの含量を含み、実質的に外来遺伝子を含まない生物学的製品。
- 生物学的製品がバイオテクノロジーによって製造される請求項16に記載の製品。
- ウイルスタンパク質、gp160、組換え血液因子、血漿タンパク質、ワクチン、およびモノクローナル抗体から選択されることを特徴とする請求項16または17に記載の生物学的製品。
- ワクチンが、ヘルペス、インフルエンザまたはTBEウイルスに対するものである請求項18に記載の生物学的製品。
- 配列番号1に記載の配列を有するプライマー。
- 配列番号2に記載の配列を有するプライマー。
- 配列番号3に記載の配列を有するプライマー。
- 配列番号4に記載の配列を有するプライマー。
- 標準プラスミドpAlu−wt。
- 標準プラスミドpAlu−20。
- 標準プラスミドpCR1−wt。
- 標準プラスミドpCR1+11。
- 1)定量すべき核酸と少なくとも一つの検出可能な特徴において異なる、内部標準としての少なくとも一つの公知の核酸、
2)標準の核酸および定量すべき核酸に結合する蛍光ラベルしたプライマー、
3)既知量のゲノム核酸を含むポジティブ対照、
4)核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
5)マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノム核酸定量用キット。 - 1)内部標準としてのプラスミドpAlu20、
2)蛍光ラベルしたプライマーAlu A2/2およびAlu B、
3)既知量のVero細胞DNAを含むポジティブ対照、
4)ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
5)マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノム霊長類DNA定量用キット。 - 1)内部標準としてのプラスミドpCR1+11およびpCR1−8、
2)蛍光ラベルしたプライマーCR1およびCR1A、
3)既知量のトリDNAを含むポジティブ対照、
4)ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
5)マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノムトリDNAの定量用キット。
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