KR100312800B1 - 핵산의정량방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 최소량의 핵산 증폭 반응으로 실시될 수 있는 개선된 핵산 정량 방법에 관한 것이다. 샘플중의 피분석물인 핵산을 정량하기 위한 본 발명에 따른 방법은 피분석물인 핵산과 구별될 수 있고 이 핵산과 동시 증폭될 수 있는 여러 핵산 작제물들의 상이한 각각의 양을 샘플에 첨가하는 단계; 상기 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물과 반응할 수 있는 증폭 시약을 사용하여 상기 샘플을 핵산 증폭 절차로 처리하는 단계; 피분석물인 핵산과 각각의 핵산 작제물로부터 유래된 증폭물의 상대적인 양을 측정하는 단계; 상기 상대적인 양들로부터 피분석물인 핵산의 양을 계산하는 단계로 구성된다. 각각의 핵산 작제물은 상이하며; 핵산 작제물들은 서로 구별될 수 있고 피분석물인 핵산과도 구별될 수 있다. 핵산 작제물은 동일한 증폭 시약으로 반응 할 수 있다는 점에서 각각의 핵산 작제물, 및 피분석물인 핵산과 유사하다.

Description

핵산의 정량 방법{IMPROVED METHOD FOR THE QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACID}

본 발명은 핵산의 개선된 정량 방법에 관한 것이다. 핵산 정량은 진단 분야뿐만 아니라 다양한 연구 분야에서 매우 중요할 수 있다. 핵산 정량은 유전자 조절을 이해하는데 중요한 도구이며, 또한 치료 효과를 모니터하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 인체 혈액이나 기타 체액과 같은 샘플내에 존재하는 특정한 핵산 서열의 양은, 예컨대 특정 비루스로 감염된 사람의 질병상태 및 특정 의약으로의 치료 효율과 관련하여 귀중한 정보를 제공할 수도 있다.

다양한 핵산의 정량적인 증폭 방법으로는 여러가지 방법이 개시된 바 있다. WO 91/02817호에는 증폭 기법으로서 폴리머라제 사슬반응(PCR)을 사용하여 핵산을 정량하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 샘플에 표준 핵산 분절을 첨가하는 단계를 포함하며, 이 분절은 샘플내에 존재하는 미지의 양의 표적 핵산을 증폭시키는데 사용된 것과 동일한 프라이머와 반응할 수 있는 것이다. 증폭시킨 다음 2개의 PCR 생성물의 각각의 양을 측정하고, 표준 곡선에 대하여 외삽시키므로써 원샘플내의 표적 분절의 양을 정량한다. 표준 곡선은 증폭전에 존재하는 다양하나 공지된 양의 핵산에 대하여 폴리머라제 사슬 반응시에 생성되는 표준 분절의 양을 플롯팅하므로서 작도한다.

피분석물인 핵산을 함유하는 샘플에 이 피분석물인 핵산과 동시 증폭될 수 있는 다른 서열을 첨가하는 방법도 또한 베커와 할브록[Becker and Hahlbrock, Nucleic Acids Research, Vol. 17, Number 22. (1989)]에 의해 기술된 바 있다. 베커와 할브록에 의해 기술된 상기 방법은 단지 하나의 뉴클레오티드가 피분석물인 핵산과 다른 (점 돌연변이) 핵산 서열을 함유하는 여러 공지된 양의 내부 표준 물질을 미지량의 피분석물인 핵산을 함유하는 기지의 용량의 샘플 분획에 첨가하고 피분석물인 핵산과 함께 PCR로 동시 증폭시키므로써 핵산을 정량하는 방법이다. 따라서, 총 RNA의 동일한 분획들은 감소되는 기지량의 내부 표준 RNA에 의해 "스파이크(spike)"된다.

내부 표준 서열내에 하나의 염기 변화를 도입시키므로써 특정 제한 부위가 만들어지고 이 변이 서열을 적절한 제한 효소로 절단한 다음 증폭된 핵산을 함유하는 샘플을 전기영동 겔에 적용한다. 변이 서열(그 일부) 및 피분석물인 핵산을 나타내는 겔내의 밴드들을 비교하므로써 핵산을 정량한다. 이 방법의 단점중의 하나는 제한 효소에 의한 내부 표준 물질의 불완전한 분해가 핵산의 존재량을 측정하는데 있어서 부정확한 결과를 산출할 수 있다는 것이다.

베커와 할브록은 정량 방법중에 마커로서 내부 표준물질을 사용하며, 여기에서 피분석물과 마커는 비 경쟁적으로 증폭한다.

표적 핵산에 상응하는 핵산 서열의 기지수의 분자를 미지량의 표적 핵산 서열을 함유하는 샘플에 첨가하는 단계를 사용하여 핵산을 정량하는 방법은 또한 EP 525882호하에 공개된 동시 계류중인 본 출원인의 유럽 특허 출원에 기술된 바 있다. EP 525882호에 기술된 바와 같은 방법은 확실하게 규명된 기지량의 변이 서열을 첨가한 미지 농도의 야생형 표적 핵산을 함유하는 샘플로부터 핵산을 증폭시키는 원리에 기초를 둔 것이다. 증폭은 변이 서열뿐만 아니라 표적 서열에도 하이브리드할 수 있는 1군의 프라이머군에 의해 실시한다. EP 525882호에 기술된 경쟁적 증폭 방법은 고정양의 샘플과 일련의 희석된 변이 서열을 사용하여 또는 그 반대량을 사용하여 실시할 수 있다.

상기 기술된 방법은 증폭 혼합물에 확실하게 규명된 표준 서열을 첨가하는 단계를 포함한다. 전술한 방법을 가지고 정확하고 신뢰성 있는 측정을 수득할 수 있도록 하기 위해 많은 증폭 반응들은 다음과 같이 수행되어야만 한다. 샘플은 기지량의 여러 분획들로 분할되어야 하며, 그 각각에 여러가지 기지량의 표준 핵산이 첨가되어야 한다. 또는 WO 91/02817호에 기술된 바와 같은 방법을 가지고 일련의 희석물로부터 표준 곡선을 작도해야 하는데, 이것은 다소 번거롭고, 또한 표적 핵산에 대한 실제 증폭과 표준 곡선에 대한 증폭이 별도로 수행되므로 핵산 존재량의 추정이 부정확할 수 있다.

정확하고 신뢰성 있는 방식으로 핵산양을 측정하기 위해서는 다량의 증폭 반응이 수행되어야 하기 때문에, 전술한 방법은 매우 힘이 들고, 시간 소모적인 방법이다. 따라서, 힘이 덜들고 시간소모가 적은 핵산 정량 방법이 필요하였다. 본 발명은 이런 방법을 제공한다.

본 발명은 피분석물인 핵산과 구별될 수 있고 그 핵산과 동시 증폭될 수 있는 여러 핵산 작제물들의 여러가지 각각의 양을 샘플에 첨가하는 단계;

상기 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물과 반응할 수 있는 증폭 시약을 사용하여 상기 샘플을 핵산 증폭 절차로 처리하는 단계;

피분석물인 핵산과 각각의 핵산 작제물로부터 유래되는 증폭물의 상대적인 양을 측정하는 단계 ;

상기 상대적인 양으로부터 피분석물인 핵산의 양을 계산하는 단계로 구성되는 샘플중의 피분석물인 핵산의 정량방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서는 여러 핵산 작제물이 샘플에 첨가된다.

각 핵산 작제물은 상이한 것으로, 핵산 작제물은 서로 구별될 수 있으며 피분석물인 핵산과도 구별될 수 있지만, 이 핵산 작제물은 동일한 증폭 시약을 사용하여 반응할 수 있다는 점에서, 서로 그리고 피분석물인 핵산과 유사한 것이다. 증폭시약이란, 다른 것중에서도 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물에 하이브리드할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머를 의미한다. 기타 다른 증폭시약은 당해 기술분야에 공지된 다른 증폭 기법에서 사용되는 필수 효소인 핵산 폴리머라제처럼 증폭 절차에 사용되는 통상의 시약이다. 본 발명에 따른 방법은 임의의 종류의 증폭절차, 예컨데 USP 4,683,195호 및 4,683,202호에 기술된 바와 같은 소위 폴리머라제 사슬반응(PCR)과 함께 사용될 수 있다. 핵산 증폭의 또다른 방법은 유럽 특허 출원 EP 0,329,822호에 기술된 바와 같은 "핵산 서열을 기초로 한 증폭반응(NASBA)"이다.

본 발명에 따른 방법에 사용된 핵산 작제물은 동일한 증폭 시약에 의해 반응할 수 있다는 점에서 피분석물인 핵산과 유사한 핵산 서열이다. 따라서 각 핵산 작제물은 적어도 사용된 핵산 증폭 프라이머가 어닐링할 수 있는 서열을 포함해야 하는데, 이 서열은 또한 피분석물인 핵산내에도 존재하는 것이다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 핵산 작제물은 서로 그리고 피분석물인 핵산과 구별될 수 있다. 이것은 사용된 다른 핵산 작제물이나 피분석물인 핵산내에도 존재하지 않는 구별 가능한 비반복 서열을 각 작제물이 포함하도록 핵산 작제물을 작제하므로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 핵산 작제물은 구별가능한 비반복 서열이 예컨대 약 20개의 뉴클레오티드를 함유하며, 이에 따라 작제물과 피분석물인 핵산의 길이 및 뉴클레오티드 성분이 동일하게 유지되는 무작위 서열을 사용하는 것이 좋다. 이 검출 방법에 있어서, 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산과 핵산 작제물을 증폭시킨 다음, 여러 핵산 작제물들은 상이한 검출 프로브를 사용하므로써 별도로 측정할 수 있는데, 이 때 각각의 프로브들은 핵산 작제물중에 존재하는 단지 하나의 비반복 서열을 인식할 수 있다. 물론 핵산 작제물이 고유성을 갖도록 작제할 수 있는 다른 방법들도 있다. 그러나, 증폭을 방해하는 핵산 작제물의 변이는 일어나지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 있어 핵산 작제물은 피분석물인 핵산과 동일한 효율을 가지고 증폭될 수 있는 것이 좋은데, 그렇지 않다면 증폭후 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산과 작제물인 핵산의 양을 기초로 하여 정확히 계산하기가 어렵다.

핵산 작제물은 당해 기술 분야에 공지된 여러 방법들로 제조할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 핵산 작제물은 예컨대, 다양한 재조합 DNA 전략에 의해 제조할 수 있다. 예를들면, 피분석물의 서열을 함유하는 플라스미드를 제한 효소로 분해한 후, 원 서열은 제거하고, 핵산 합성기 상에서 제조되거나 다른 플라스미드로부터서브클로닝될 수 있는 신규 서열을 삽입시키므로써 피분석물 서열내에 신규 서열을 도입시킬 수 있다. 완전한 핵산 작제물도 또한 핵산 합성기를 사용하여 제조할 수 있다.

핵산 작제물은 미지량의 피분석물인 핵산을 함유하는 샘플을 증폭절차로 처리하기 전에 상기 샘플에 첨가되어야만 한다. 기지량의 여러 핵산 작제물이 첨가되는 샘플은 물론 이후에 샘플내에 존재하는 핵산의 농도를 계산할 수 있도록 소정의 용량이어야만 한다. 샘플은 핵산양이 측정되어야만 하는 재료로부터 취해진 기지의 용량 또는 양의 재료를 함유해야만 한다. 특정 시험액내에 존재하는 핵산의 농도가 측정되어야만 할때, 샘플은 연구중인 기지량의 시험 재료로부터 분리되는 모든 핵산을 함유해야만 한다.

핵산 작제물은 연구중인 시험액(예컨대, 인체 혈청)을 핵산 분리 절차로 처리하기 전이나 처리한 후에 첨가할 수 있다. 핵산의 분리 방법은 개시된 바 있고, 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 방법으로 처리될 샘플을 제조하는데 사용될 수 있는 핵산 분리 절차는 예컨대, 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다. 핵산 함유 샘플을 처리하기 위한 또다른 방법은 문헌[Boom et al., J. Clin. Microbiol. 28:495-503, 1990]에 기술되어 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 시험액의 일정량으로부터 핵산을 분리하기 전에 핵산 작제물을 첨가한다. 이 방법에서 분리 절차 동안 임의적으로 일어날 수 있는 핵산의 손실은 샘플내 존재하는 피분석물인 핵산과 작제물인 핵산의 최종 양으로부터 알 수 있을 것이다. 얻어지는 결과로부터 연구중인 본래의 시험액중에 존재하는 피분석물인 핵산의 양을 직접 계산할 수 있다.

핵산 분리 절차로 시험액을 처리하기 전에 기지량의 시험액에 핵산 작제물을 첨가할 때, 핵산 분리 절차가 수행된 후에 분리 대조용 핵산 작제물을 샘플에 첨가할 수 있다. IC(분리 대조용) 서열을 첨가하므로써 핵산 분리 절차의 효율을 측정하는 것이 가능하다. 따라서, 각 샘플에 대한 초기 값은 분리 효율에 따라 조정될 수 있다. 분리 대조용 작제물은, 예컨대 이 작제물이 비반복 서열을 함유하기 때문에 피분석물 및 다른 핵산 작제물과 상이한 서열일 수 있으나, 바람직하게는 동일한 효율로 증폭되는 것이 좋다. IC는 또다른 "핵산 작제물"로서 간주될 수 있는데, 그 차이는, IC 분자는 핵산 분리 절차가 수행된 후 첨가되는 반면, 본 발명의 바람직한 구체예에서의 핵산 작제물은 시험액을 핵산 분리 절차로 처리하기 전에 첨가된다는 것이다. 이와 같이 각 핵산 작제물의 정확한 양의 분자가 첨가된 후 시험액을 핵산 분리 절차로 처리하고, 핵산 분리 절차가 수행된 후 정확한 양의 IC 분자가 첨가되므로 분리 절차의 효율을 계산할 수 있다. 예컨대, 특정한 핵산 작제물 100 분자가 첨가되고 동일한 양의 IC 분자가 첨가되었을때, 100% 분리 효율이면 핵산 작제물과 IC에 대해 동일한 시그널(증폭 후)이 얻어질 것이다. 얻어진 IC 시그널이 핵산 작제물에 대해 얻어진 시그널의 2배라면 핵산 분리 절차의 효율은 단지 50%인 것이다 (본래 존재하는 핵산 분자의 절반이 분리 절차 중에 손실되었음을 의미함) 이에 따라서, 최초 값을 조정하면 허위 음성 시험 결과가 산출될 위험성을 줄일 수 있다.

1종 이상의 핵산 작제물은 각각 여러 가지 기지량으로 첨가한다. 바람직하게는 핵산 작제물은 일정 계수(예, 계수 10) 만큼 서로 상이한 일정 범위의 양으로 첨가하는 것이 좋다. 예컨대, 3가지 핵산 작제물 QA, QB 및 QC가 사용되는 경우 QA는 10²분자, QB는 10³분자, QC는 10⁴분자를 샘플에 첨가할 수 있다.

샘플은 또한 하나 이상의 반응 일정량으로 분할될 수 있는데, 그 각각은 기지의 용량으로, 그 각각에 핵산 작제물이 여러 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 바람직하게는 각각의 반응 용량에 동일한 핵산 작제물을 첨가하는 것이 좋다. 예컨대, 2가지 반응 용량이 사용되는 경우 "저농도 범위" 반응과 "고농도 범위" 반응을 실시할 수 있다. 예컨대, 핵산 작제물의 범위들이 중복될 때, 저농도 범위 반응 용량에는 QA, QB 및 QC를 전술한 바와 같은 양으로 첨가할 수 있는 반면, 고농도 범위 반응 용량에는 QA, QB 및 QC를 각각 10⁴, 10⁵및 10⁶분자 첨가한다. 핵산 작제물의 양의 범위는 중복될 수 있으나, 또한 저농도 범위와 고농도 범위의 핵산 작제물의 양 사이에 갭이 생길 수도 있다. 반응 용량을 1가지 이상 사용한다는 것은 증폭 반응이 1회 이상 실시되어야 함을 의미하지만, 최소의 반응 용량으로 매우 넓은 범위의 피분석물의 농도가 정량될 수 있기 때문에 핵산 정량에 있어서 종래방법에 비해 작업 및 시간을 상당히 절감시키는 잇점이 있다.

중복되지 않는 핵산 작제물의 양의 범위를 사용하는 경우의 잇점은 사용되는 작제물의 수가 감소되지만 여전히 넓은 범위의 농도가 정량될수 있다는 점이다. 피분석물이 핵산 작제물 양의 범위 사이의 갭에 속하는 양으로 존재하는 경우, 샘플이나 반응 일정량중에 존재하는 핵산 작제물로부터 유래하는 시그널 범위와 직접적인 비교는 할 수 없지만, 피분석물인 핵산의 시그널이 저농도 범위의 시그널보다는 강하고 고농도 범위의 시그널보다는 약할 것이므로, 이로부터 피분석물인 핵산의 양을 측정할 수 있으며, 이 데이타를 사용하여 그 농도도 계산할 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 사용하여 여러 범위의 핵산 작제물을 하나 이상의 반응 용량에 첨가하는 경우에는, 피분석물인 핵산의 농도가 결정되어야만 하는 샘플을 여러 용량으로 분할하고 이 용량들에 핵산 작제물을 첨가한 다음 각 용량을 핵산 분리 절차로 처리한다. 각 용량이 각각의 분리 절차로 처리되어야 할지라도, 정확하게 동일한 처리를 받고 동일한 변화로 처리되는 핵산 작제물의 첨가에 의해 성능의 변차가 보정되므로, 분리동안 피분석물인 핵산의 임의의 손실에 대해 어떤 보정도 필요치 않다. 물론, 총 용량을 핵산 분리 절차로 처리하고 이를 여러 용량으로 분할할 수 있으며, 그후 일정 범위의 작제물들이 첨가될 것이다.

증폭 반응을 수행할 때 발생할 수 있는 문제점은 샘플이 예컨대 동일 실험실에서 이전에 시험하던 다른 샘플로부터 유래하는 핵산 분자로 오염될 수 있다는 것이다. 이것은 허위 양성시험 결과를 초래할 수 있으며, 또는 정량 측정의 경우에는 샘플내에 존재하는 핵산 분자수의 계산에도 허위 결과를 초래할 수 있다.

본 발명의 따른 방법으로 시험된 샘플이 10 내지 100 분자의 범위로 오염된 경우에는, 내부 교정선을 변화시키지 않으나, 오염이 주로 피분석물 분자로 구성되고 시험되는 샘플내의 피분석물인 핵산의 양이 100 분자 이하라면 피분석물인 핵산 분자의 계산 양에만 영향을 미칠 것이다. 약 100 내지 1000분자로의 오염은 내부교정선에 약간 영향을 미칠 것이며, 샘플내에 존재하는 피분석물인 분자의 양이 1000분자 이하라면 샘플내에 존재하는 피분석물 핵산 분자의 양의 계산을 방해할 것이다. 1000분자 이상으로의 오염은 교정선 및 계산값을 변화시킬 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예를 사용하면 이전에 시험된 샘플이나 다른 샘플에서 유래하는 핵산 분자로의 샘플의 오염을 검측할 수 있다.

본 발명에 따른 방법이 하나 이상의 샘플을 시험하는데 사용될때 동일한 핵산 작제물이 모든 샘플중에서 사용되고 각각의 특정 핵산 작제물의 양이 다양하다면 오염을 검측할 수 있다. 예컨대, 3가지 핵산 작제물이 사용되는 경우 (Qa, Qb 및 Qc), 샘플 "A"에 이 작제물을 다음과 같은 양으로 첨가할 수 있다: Qa_고, Qb_중및 Qc_저, 샘플 "B"에도 동일 작제물을 Qa_저, Qb_고, Qc_중의 양으로 첨가할 수 있는 반면, 샘플 "C"에는 Qa_중, Qb_저, Qc_고등의 양으로 첨가된다. 물론 핵산 작제물의 동일 조성물은 또한 또다른 조성물을 사용하고자 전환시키기 전에 하나 이상의 샘플에 예컨대, 일련의 10개의 샘플에 사용될 수 있다.

3가지 작제물이 사용되는 경우, 동일 조성의 핵산 작제물을 반복적으로 사용해야만 하기 전에 6개 이하의 변형물로 제조할 수 있다. 4가지 작제물이 사용되는 경우에는 24개 이하의 변형물이 제조될 수 있다, 여러 샘플중에서 여러 조성의 핵산 작제물을 사용하면 다른 조성물이 검출 가능하게 사용된 샘플로부터 유래하는 핵산 물질로 오염될 수 있다. 오염은 연구중인 샘플의 내부 교정선을 변화시킬 것인데, 즉 교정선의 기울기가 변화하고, 상관 계수도 정상 데이타에 비해 낮아져 오염으로서 구별될 수 있을 것이다.

각 샘플에 있어서 작제물중의 하나가 0의 양으로 사용된다면(그리고 0의 양으로 사용되는 작제물이 샘플마다 변화함), 오염 분자가 극소량으로 검출될 수 있다. 0의 양으로 첨가되는 특정 작제물이 검출가능한 양으로 존재한다면, 이 특정 샘플은 다른 조성이 선택되었던 샘플 유래의 물질로 오염되었음을 명백히 알 수 있다.

증폭 후 핵산 작제물 및 피분석물인 핵산의 검출은 여러 방식으로 수행될 수 있다. 측정가능한 시그널이 이 시그널이 나타내는 증폭된 핵산(작제물 또는 피분석물)의 양에 따라 상이하게 발생되기만 한다면, 당업계에 공지된 많은 검출 절차가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법과 함께 사용될 수 있는 검출 방법으로는 예컨대 금이나 염료솔과 같은 고형 표지 인자를 사용하는 검출 방법 및 응집에 근거를 둔 검출 방법 뿐만 아니라 효소적 및 발광성(형광성, 전기화학적 발광성, 포스포레슨트) 현상에 근거한 방법을 포함한다.

샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산의 농도는 검출 절차동안 발생되는 시그널에 의해 나타나는 피분석물인 핵산과 핵산 작제물의 상대적인 양으로부터 계산될 수 있다.

예컨대, 작제물(Q) 및 피분석물(A) 서열을 나타내는 시그널 사이의 비(ratio)의 로그값인 log(Q/A)는 샘플에 첨가되는 작제물의 양의 로그값인 log(Q-주입량)의 직선 함수이다. log(Q/A)가 Q(주입량)의 함수로서 플롯팅되는 경우 직선 그래프가 수득되어야 하며, 여기에서 피분석물인 핵산의 양은 X 축과 직선으로 교차하는 점으로부터 쉽게 얻을 수 있다(단, 피분석물인 핵산의 양은 첨가되는 핵산 작제물의 양의 범위 근처에 있어야 한다).

본 발명의 또다른 구체예로서, 일정량의 시험액을 기지의 계수로 희석하는 것을 포함하여, 시험액의 패널에서 피분석물인 핵산을 정량하는 방법을 포함한다. 샘플은 특정 범위내에 속할 것으로 예상되는 피분석물인 핵산의 양을 함유하는 상기 희석된 시험액으로부터 취해질 수 있다. 시험액들의 패널 각각에 존재하는 피분석물인 핵산의 양이 결정되어야만 할 때, 전체 패널이 상기 범위에 속할 것으로 예상되는 농도로 예비 희석될 수 있다. 예비 희석은 샘플의 대부분이 상기 범위내의 농도이고, 나머지 샘플이 모두 상기 범위 이하의 농도이거나 또는 모두 상기 범위 이상의 농도가 되도록 실시해야 한다. 희석 단계 후 전체 패널은 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 방법으로 처리하고, 이때 샘플에 첨가되는 핵산 작제물의 양은 상기 범위내에 속해야 한다.

상기 범위 이하(또는 이상)인 패널로부터 취해진 나머지 시험액은 다른 조정된 희석물이나 희석되지 않은 샘플과 함께 다시 시험될 수 있다, 이 방법의 잇점은 전술된 고농도 범위/저농도 범위 분리시 필요한 것보다 더 적게 증폭 반응이 필요하다는 것이다.

본 발명에 따른 샘플중에 존재하는 피분석물인 핵산을 정량하는 방법의 또다른 구체예는, 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산의 예상양과 동일범위내에 있을 것으로 추정되는 핵산 작제물의 일정량을 샘플에 첨가하는 단계, 그 다음 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물과 모두 반응할 수 있는 증폭 시약을 사용하여 핵산 증폭절차로 상기 샘플을 처리하는 단계, 피분석물인 핵산과 핵산 작제물로부터 유래되는 증폭물의 상대적인 양을 검출하는 단계, 및 이 상대적인 양으로부터 상기 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산의 양을 산정하는 단계를 포함한다. 이와 같이 산정한 후 동일 시험액에서 취한 제2의 샘플을 전술한 본 발명에 따른 방법으로 처리할 수 있는 데, 이때 첨가되는 핵산 작제물의 양은 제1 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산의 산정된 양과 동일 범위로 사용한다.

이러한 절차의 잇점은 사용된 작제물의 양의 범위를 줄일 수 있고, 따라서 방법의 정확도를 증가시킬 수 있으며, 추가로 실시되어야만 하는 증폭 반응의 양도저하시킬 것이다.

도면의 설명

제1A도는 실시예 1에 기재한 바와 같은 실험 1에 사용된 핵산 작제물 및 샘플(피분석물) 핵산의 주입량 및 증폭량을 도시한 것이다.

제1B도는 실시예 1에 기재한 실험 1에서 사용된 바와 같은 주입 작제물 복사수의 양에 대해 로그 눈금상에 플롯팅된 작제물 시그널 및 샘플 시그널의 비를 도시한 것이다. 피분석물인 핵산의 양은 그래프중의 수직선에 대해 x 축상에 나타내었다.

제2A도는 실시예 1에 기재한 바와 같은 실험 2에 있어서의 핵산 작제물과 샘플(피분석물) 핵산의 주입량 및 증폭량을 도시한 것이다.

제2B도는 실시예 1에 기재한 실험 2에서 사용된 바와 같은 주입 작제물 복사수의 양에 대해 로그 눈금으로 플롯팅된 작제물 시그널 및 샘플 시그널의 비를 도시한 것이다. 피분석물인 핵산의 양은 그래프중의 수직선에 대해 x 축상에 나타내었다.

제3A도는 실시예 1에 기재한 바와 같은 실험 3에 있어서의 핵산 작제물과 샘플(피분석물) 핵산의 주입량 및 증폭량을 도시한 것이다.

제3B도는 실시예 1에 기재한 실험 3에서 사용된 바와 같은 주입 작제물 복사수의 양에 대해 로그 눈금으로 플롯팅된 작제물 시그널 및 샘플 시그널의 비를 도시한 것이다. 피분석물인 핵산의 양은 그래프중의 수직선에 대해 x 축상에 나타내었다.

제4A도는 실시예 1에 기재한 바와 같은 실험 4에 있어서의 핵산 작제물과 샘플(피분석물) 핵산의 주입량 및 증폭량을 도시한 것이다.

제4B도는 실시예 1에 기재한 실험 4에서 사용된 바와 같은 주입 작제물 복사수의 양에 대해 로그 눈금으로 플롯팅된 작제물 시그널 및 샘플 시그널의 비를 도시한 것이다. 피분석물인 핵산의 양은 그래프중의 수직선에 대해 x 축상에 나타내었다.

제5A도는 실시예 1에 기재한 바와 같은 실험 5에 있어서의 핵산 작제물과 샘플(피분석물) 핵산의 주입량 및 증폭량을 도시한 것이다.

제5B도는 실시예 1에 기재된 실험 5에서 사용된 바와 같은 주입 작제물 복사수의 양에 대해 로그 눈금상에 플롯팅된 작제물 시그널 및 샘플 시그널의 비를 도시한 것이다. 피분석물인 핵산의 양은 그래프중의 수직선에 대해 x 축상에 나타내었다.

제6도는 단일 시험관 Q-NASBA의 동적 범위를 도시한 것이다. 정량 주입물로서 10^1.44, 10^2.83, 10^4.23및 10^4.83의 시험관에서 생성된 WT-RNA 분자를 사용하였다. 모든 WT-RNA 양의 정량은 8 내지 10회 수행하였다. Q_A, Q_B및 Q_CRNA는 각각 10⁴, 10³및 10²RNA 분자양으로 사용되었다.

제7도는 용균 완충액으로 핵산을 분리하기 전에 내부 표준 RNA 인 Q_A, Q_B및 Q_C를 첨가한 단일 시험관 Q-NASBA의 개략적인 순서도를 도시한 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다:

실시예 1

다음 실시예는 본 발명의 방법에 따라 실시된 정량 분석 및 연속적인 검출 분석의 이론적인 예이다. 이 실험으로부터 본 발명에 따른 분석이 수행되는 방법과, 뿐만 아니라 생성될 수 있는 결과도 보여줄 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로 수행될 수 있는 5가지 실험을 하기 요약한다, 이 실험은 주입되는 피분석물인 핵산 분자의 양과 증폭전에 첨가되는 핵산 작제물의 양의 범위를 달리한 것이다.

피분석물 주입량 및 작제물 주입량은 하기 표(표 1)에 나타낸 바와 같다.

이 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 처음 3가지 이론 실험에는 3가지 작제물을 첨가하고(각각 QA, QB, QC), 2가지 증폭 반응을 "저농도 범위"의 작제물양과 "고농도 범위"의 작제물양으로 실시하였다. 이 실험에서 저능도 범위 및 고농도 범위는 중복된다. 상기 두 범위중의 중복점은 증폭을 비교하는데 사용될 수 있다(증폭이 동일한 방식으로 수행된다면, 두 범위내의 작제물의 중복양에 대해 발생된 시그널은 동일해야만 한다). 실험 4와 5에서도 또한 2가지 농도 범위의 작제물 양을 사용하였지만, 저농도 범위와 고농도 범위는 중복시키지 않았다. 결과적으로 증폭반응마다 사용되는 작제물의 양은 감소될 수 있지만 동일한 총범위의 양이 여전히 정량될 것이다.

Q-RNA(작제물) 및 야생형 RNA의 증폭 속도는 그 RNA 들이 20개의 무작위 뉴클레오티드의 서열만이 상이한 동일 크기이고, 증폭에 동일한 프라이머와 효소가 사용되므로 동일하다. 따라서, 각 작제물 RNA 양 및 야생형 RNA 양의 초기 비는 증폭동안 변화하지 않을 것이다. 증폭 다음의 검출 절차에 있어서 각 증폭물의 혼합물은 야생형, QA, QB 또는 QC RNA 증폭물을 검출하기 위해 4가지 분석물로 분할한다(실험 4 및 5의 증폭물의 혼합물은 단지 3가지 분석물로 분할한다).

작제물 시그널과 야생형 시그널의 로그비가 작제물 RNA의 주입량의 로그값에 대하여 도시된다면, 직선이 예상된다. 이 직선으로부터 야생형 RNA의 양이 계산될 수 있다. 전술한 실험으로 얻어지는 결과는 제1도 내지 제5도에 도시한다. 각 그림의 제1 그래프 (a)는 증폭전과 증폭후의 여러 작제물들의 양을 제시하면서, 또한 피분석물인 핵산의 양을 나타낸다.

각 그림의 제2 그래프인 (b)는 추정되는 작제물 시그널과 피분석물 시그널(샘플 시그널)의 로그비가 작제물의 주입량의 로그값의 함수로서 표현되는 그래프를 나타낸다. 이 그래프로부터 피분석물인 핵산 분자의 주입량이 유도될 수 있는데, 즉 로그비가 1을 나타내는 수직축상의 점에 속하는 주입 값의 로그값(수평축상에 도시됨)으로부터 산출된다.

실시예 2

3가지 핵산 작제물 QA, QB, 및 QC를 각각 200, 2000, 및 20000 복사수 포함하는 작제물 HIV-1 gag1 RNA 전사물의 정량된 양의 혼합물을 제조한다. 5가지 다른 야생형 HIV-1 gag1 전사물의 정량된 양, 즉, 각각 200000, 20000, 2000, 200, 20 복사수 및 대조군을 Q 작제물 RNA의 혼합물과 혼합한다. wt-RNA의 각 양마다 1개의 샘플을 가지고 6가지 증폭 반응을 표준 프로토콜(T. Kievits et al.)에 따라 수행하였다.

각 증폭물로부터 5 ㎕를 TBE 완충액(90mM 트리스-붕산염, 1mM EDTA, pH8.4) 100 ㎕로 희석하였다. 각 희석액으로부터 5 ㎕를, 모든 증폭물을 포착하기 위한 비오틴-올리고 3pmol, 여러 트리(2,2'-비피리딘) 루테늄 II 킬레이트 표지된 올리고뉴클레오티드 3pmol(각각은 야생형 RNA 증폭물이나 작제된(QA, QB 또는 QC) 증폭물중의 하나에 나타나는 특정 서열을 포함함) 및 스트렙트아비딘 코팅된 자기 다이날 비드 M280 20을 6.67 x SSC 완충액(0.75M NaCl, 0.075M 구연산나트륨 pH7 내지 8)중에 용해한 혼합물 15 ㎕를 함유하는 시험관에 첨가하였다.

WT, QA, QB 또는 QC를 검출하기 위한 4가지 하이브리드화 분석을 하나의 증폭물에 대해 수행하였다. 혼합물을 41℃에서 30분동안 하이브리드화하고 10분마다 혼합하였다. IGEN의 ORIGEN 1.5 검출 시스템을 사용하여 전기 화학 발광성 ECL 검출을 위한 분석 완충액 300 ㎕를 첨가하고 혼합하였다. ORIGEN 1.5 검출 시스템에서의 실제 검출은 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다.

실시예 3

이 실시예는 3가지 Q-RNA 내부 표준 물질이 10⁴, 10³, 10²분자 양으로 WT-RNA 샘플에 스파이크된 Q-NASBA 분석에 관한 것이다. 3가지 내부 표준 RNA 분자는 각각의 내부 표준 물질에 특이적인 20개의 뉴클레오티드 무작위 서열(Van Gemen et al. J. Virol. Methods. 43, 177-188, 1993)에 대해 특이적인 ECL 표지된 프로브를 사용하므로써 구별하였다. NASBA 증폭된 내부 표준 물질과 WT-RNA의 비는 ECL 검출 기구를 사용하여 측정하였다.

ECL은 전극의 표면상에서 빛을 발하는 화학 발광성 표지인자에 기초를 둔 것이다(Blackburn et al., Clin. Chem. 37, 1534-1539, 1991). 시그널의 검출은 특이적으로 개발된 검출 기구를 사용하여 5등급 이상의 동력학적 범위로 정량될 수 있다. ECL 기법은 하이브리드화 분석에서 ECL 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하기 위해 적용된 바 있다(Kenten, J. H, et al. Clin. Chem. 38, 873-879, 1992). WT, Q_A, Q_B및 Q_CECL 프로브의 비활성은 알려져 있으므로, WT, Q_A, Q_B및 Q_CNASBA 증폭된 RNA의 비가 각 프로브의 시그널비로부터 측정될 수 있다.

WT 주입 RNA의 초기량은 ECL 비드를 기초로 한 분석법에서 Q_A, Q_B및 Q_C시그널에 대한 WT 시그널의 비로부터 판독하였다.

Q 작제물이 제조되고 분석이 실시된 방법은 본 실시예의 "재료 및 방법" 부분에 기재하였다.

시험관내에서 생성된 여러 양의 WT-RNA를 정량하기 위해 ECL 검출과 함께 단일 시험관 Q-NASBA 프로토콜을 사용하였다. 주입물로서 각각 10^1.44, 10^2.83, 10^4.23및 10^4.83초기 WT-RNA 분자를 사용하여 3가지 상이한 분석을 수행하였다. ECL 비드를 기초로 한 분석법을 사용하는 Q-NASBA는 단일 NASBA 증폭시에 10⁴Q_ARNA 분자, 10³Q_BRNA 분자 및 10²Q_CRNA 분자와 함께 WT-RNA를 혼합하여 정량화한 각 WT-RNA 양에 대해 8 내지 10회 수행하였다. 수행된 정량 결과(평균값 ±SD)는 주입물로서 초기 WT-RNA 분자를 10^1.44, 10^2.83, 10^4.23및 10^4.83사용했을때, 각각 10^1.54±6.23, 10^2.68±0.21,10^4.16±0.20, 10^4.81±0.23이었다. 수행된 분석 결과를 제6도에 도시한다. 이 그림으로부터 알수 있는 바와 같이 WT-RNA 양은 하나의 시험관에서의 정량 프로토콜에 사용된 가장 낮은 Q-RNA 양의 1/10로 신뢰성 있게 정량되었다.

재료 및 방법

플라스미드 및 RNA 합성

유전자 기법 및 재조합 DNA 기법은 표준 절차를 따랐다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Lab., 1989, Ed. 2판). 22개의 무작위 뉴클레오티드 서열(pos. 1429-1451 HIV-I pv22 서열 : Muesing, M,A. et al., Nature 313, 450-458, 1985)을 지닌 플라스미드 pGEM3RAN (Van Gemen et al., 1993)을 사용하여 정량적인 NASBA 증폭과 관련이 없는 HIV-1 클로닝된 서열의 일부 (pos 1691 내지 2105 HIV-1pv22)와 다중 클로닝 부위내의 AccI 부위를 결실시켰다. 이 플라스미드내의 무작위 서열을 5'ATG.CAA.GGT.CGC.ATA.TCA.GTA.A3' 또는 5'ATA.AGC.ACG.TGA.CTG.AGT.ATG.A3'로 대체시켜 각각 pGEM3Q_Bδ gag 3 및 pGEMQ_Cδ gag 3을 작제하였다. 플라스미드 pGEM3RAN을 pGEM3Q_A로 재명명하였다. 시험관내에서 SP6 RNA 폴리머라제를 사용하여 pGEM 3p24(WT-RNA), pGEM3Q_A(Q_A-RNA), pGEM3Q_Bδ gag 3(Q_B-RNA) 및 pGEM3Q_Cδ gag 3(Q_C-RNA)으로부터 RNA를 작제하였다(Sambrook, 1989). pGEM3p24 및 pGEM3Q_A의 클로닝된 삽입물을 벡터 pGEM4내로 재클로닝하여 pGEM4p24 및 pGEM4Q_A를 만들었다. 이 플라스미드를 사용하여 시험관내에서 RNA를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 제조하였다(Sambrook, 1989). 시험관내 RNA의 길이는 플라스미드 pGEM3p24 (WT-RNA) 및 pGEM3Q_A(Q_ARNA)의 경우에는 1514개 뉴클레오티드이고 플라스미드 pGEM3Q_Bδgag3(Q_B-RNA) 및 pGEMQ_Cδ gag 3(Q_C-RNA) 경우에는 1090개 뉴클레오티드이다. 이 RNA를 DNase로 처리하여 플라스미드 DNA를 제거하고 음이온 교환 컬럼 (Qiagen) 상에서 정제하였다. 시험관내 RNA를 분광 분석법으로 정량하고 목적하는 농도로 물로 희석하였다. 모든 RNA 용액을 -20℃에서 보관하였다.

핵산 분리

핵산은 붐 등(Boom, R., et al., J. Clin. Microbiol. 28, 495-503, 1990: Van Gemen et al. 1993)의 방법에 따라 혈장으로부터 분리하였다. 100 ㎕ 혈장의 핵산을 최종적으로 100 ㎕ 물에 재현탁시킨 뒤, -70℃에서 보관하였다.

NASBA

모든 효소는 파마시아로부터 구입했고, 단 AMV-역 전사효소는 세이카가쿠에서 구입하였다. BSA는 뵈링거 맨하임에서 구입하였다. NASBA 반응 혼합물 [25 ㎕ 반응 혼합물중의 최종 농도: 40mM Tris, pH8.5, 12mM MgCl₂, 42mM KCl, 15% v/v DMSO, 1mM 각 dNTP, 2mM 각 NTP, 0.2프라이머 1 : 5'AAT.TCT.AAT.ACG.ACT. CAC.TAT.AGG.GTG.CTA.TGT.CAC.TTC.CCC.TTG.GTT.CTC.TCA, 0.2프라이머 2: 5'AGT.GGG.GGG.ACA.TCA.AGC.AGC.CAT.GCA.AA, 0.2 내지 2 ㎕ 야생형 RNA 및 2 ㎕ 시험관내 Q-RNA(Kievits, T. et al. J. Virol. Methods. 35, 273-286, 1991; Van Gemen et al. 1993)] 23 ㎕를 65℃에서 5분동안 항온 처리하여 RNA의 2차 구조의 안정성을 제거하고 이어서 41℃로 냉각시켜 프라이머를 어닐링시켰다. 여기에 효소 혼합물(0.1/㎕ BSA, 0.1 유니트RNase H. 40 유니트 T7 RNA 폴리머라제 및 8 유니트의 AMV-역전사효소) 2 ㎕를 첨가하여 증폭을 개시하였다. 반응액을 41℃에서 90분동안 항온처리하였다. 정량 반응마다 2개의 음성 대조군을 첨가하였다.

효소적 비드를 기초로 한 검출 반응

전술한 정량 프로토콜(Van Gemen et al. 1993)에서 NASBA 증폭된 WT 및 Q_ARNA의 비를 검출하고 측정하기 위해 비드를 기초로 한 효소적 분석법을 개발하였다. 스트렙트아비딘으로 코팅된 2.8폴리스티렌 상자성 비드(Dynal Inc, Great Neck, N.Y., USA) 100 ㎕를 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% BSA로 2회 세척하고, 1 x PBS, 0.1% BSA에 재현탁하였다. 세정된 비드를 HIV-1 특이적인 비오틴화된 포착프로브(5'TGT,TAA,AAG,AGA.CCA.TCA.ATG.AGG.A) 300 pmol과 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 이어서 200 ㎕ 5 x SSPE, 0.1% SDS로 1회 세척하고 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% BSA로 1회 세척하였다. 비드를 100 ㎕의 1 x PBS, 0.1% BSA 내에 재현탁시켰다. 5 ㎕ 비드, 5 ㎕ NASBA 반응 혼합물 및 50 ㎕ 하이브리드화 완충액(5 x SSPE, 0.1% SDS. 0.1% 차단 시약, 10 ㎍/ml 연어 정자 DNA)을 45℃에서 30분동안 항온배양하였다. 이 비드를 100 ㎕의 2 x SSC, 0.1% BSA로 2회 세척한 다음, 5 x 10^-7 mol의 WT또는 Q 검출 올리고뉴클레오티드 프로브와 항온처리하고, 이중 10%를 50 ㎕ 하이브리드화 완충액중에서 45℃에서 30분동안 HRP 표지시켰다.

비드-포착 올리고뉴클레오티드-NASBA 증폭된 WT RNA 또는 QA RNA 검출 프로브 복합체를 100 ㎕ 2 x SSC, 0.1% BSA로 1회, 100 ㎕ TBST로 1회, 및 100 ㎕ TBS로 2 회 세척하였다. 이어서, 이 비드에 100 ㎕ 발색 기질(TMB/과산화물 용액)을 첨가하고 실온에서 3분 동안 항온 처리하였다. 발색 반응은 250mM 옥살산염을 50 ㎕ 첨가하므로써 정지시켰다. 150 ㎕ 발색 반응물의 흡광도를 미량 평판 판독기(Micro SLT 510, Organon Teknika, Boxtel, The Netherlands)로 450nM에서 판독하였다. 흡광도 값을 기본 시그널(즉, 음성 대조군)에 대해 보정하고, 시그널을 각각 증폭된 WT RNA 또는 QA RNA에 의해 나타나는 시그널의 %로서 계산하였다.

ECL 비드를 기초로 한 검출 반응

물로 20배 희석한 NASBA 증폭된 RNA(WT, Q_A, Q_B및 Q_C) 5 ㎕를 HIV-1 특이적인 비오틴화된 포착 프로브(효소적 비드를 기초로 한 검출 반응 참조) 20 ㎕(3.3pmol), WT, Q_A, Q_B또는 Q_CNASBA 증폭된 RNA에 특이적인 ECL(트리스[2,2- 비피리딘]루테늄[II]복합체) 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브3.3pmol 및 5 x SSC 중의 스트렙트아비딘 코팅된 자기 비드 20(2 ㎕)과 30분동안 41℃에서 항온처리하였다. 항온처리 동안 시험관을 10분마다 볼텍싱으로 혼합하였다. 이어서, TPA 용액(100mM 트리프로필아민, pH=7.5) 300 ㎕를 첨가하고 하이브리드화 혼합물을 Origen 1.5 ECL 검출 기구 (Organon Teknika, Boxtel, The Netherlands)에 배치하였다.

실시예 4

핵산 분리 효율은 WT-RNA 정량의 결과에 영향을 미칠 수 있다. 분리동안 핵산 손실의 영향을 피하기 위해, Q_A, Q_B및 Q_CRNA를 핵산 분리 1단계 전이나 1단계중에 첨가할 수 있다(제7도). 이 원리는 시험관내에서 생성된 WT-RNA 및 시험관내에서 배양된 비루스 원료 용액으로부터 분리된 HIV-1을 10⁴분자 사용하여 시험하였다. 시험관내에서 생성된 WT-RNA 및 HIV-1 비루스 원료 RNA를 핵산 분리 제1 단계동안(즉, 용균 완충액중에서) Q_A, Q_B, 및 Q_CRNA를 첨가 및 무첨가하에 재분리하였다.

사용된 방법은 실시예 3의 "재료 및 방법" 부분에서 설명한 바와 같다.

최초로 분리된 WT-RNA 및 HIV-1 비루스 원료 RNA를 증폭동안 Q_A, Q_B및 Q_C를 첨가하여 정량했을때(즉, 대조군 정량), 그 결과는 시험관내에서 생성된 WT-RNA 및HIV-1 비루스 원료 RNA에 대해 각각 3.3 x 10⁴및 2.1 x 10⁴이었다. 재분리 절차전에 Q_A, Q_B및 Q_CRNA를 첨가한 경우 재분리된 RNA를 정량한 결과 시험관내 생성된 WT-RNA 및 HIV-1 비루스 원료 RNA에 대해 각각 2.5 x 10⁴및 1.5 x 10⁴을 나타냈다. 그러나, 재분리 절차후 Q^A, Q^B및 Q^CRNA를 첨가한 경우 재분리된 RNA를 정량했을때, 그 결과는 시험관내 생성된 WT-RNA 및 HIV-1 비루스 원료 RNA 각각에 대해 4.7 x 10³및 2.0 x 10³이었다. 이것은 RNA 재분리 효율이 약 10% 임을 나타낸다. 그러나, 재분리전 Q_A, Q_B및 Q_C의 첨가는 분리된 핵산의 절대양과는 무관하게 WT : Q_A: Q_B: Q_CRNA의 일정비로 인해 대조군 정량과 동일한 RNA 정량을 산출하였다.

표 2에 그 결과를 나타냈다.

a. Q_A, Q_B및 Q_C는 10², 10³및 10⁴RNA 분자로 각각 첨가되었다.

b. 핵산 재분리가 관련되지 않은 대조군 정량.

실시예 5

본 발명에 따른 방법을 단지 하나의 Q-RNA가 사용된 전술한 Q-NASBA 프로토콜(Van Gemen et al. 1993 ; Jurriaans et al., 제출됨, 1993)과 비교하였고, 5 log의 동적 범위를 얻고자 하는 경우, 임상(야생형) 샘플당 6가지 이상의 증폭 반응물, 즉 내부 표준물질이 첨가되지 않은 하나의 양성 WT 대조군과 증가량(10²내지10⁶)의 내부 표준 RNA 분자를 보유한 5가지 반응물이 필요로 된다.

증폭 반응의 수는 여러가지 구별가능한 내부 표준물질이 하나의 증폭 반응시에 스파이크되는 본 발명에 기재된 방법을 사용할 때 감소될 수 있다.

이와 반대로, 단지 하나의 Q-RNA(Q_A)가 효소 표지된 프로브와 함께 사용되는 경우에 초기 WT-RNA 농도는 여러 증폭 반응에 여러 농도의 Q-RNA를 사용하여 Q-시그널에 대한 WT-시그널의 비로부터 추론되어야만 한다.

상기 2가지 방법은 HIV-1 감염된 개체의 혈장 샘플과 모델 시스템을 사용하여 비교하였다.

Q_A, Q_B및 Q_CRNA를 사용하는 단일 시험관 Q-NASBA를 3명의 무증후성 HIV-1 감염된 개체의 0.1 ml 혈장 샘플을 분석하므로써, 정량분석당 6가지 증폭 반응을 사용하는 전술한 Q-NASBA 프로토콜(Van Gemen et al., 1993)과 비교하였다. 동일한 실험으로 핵산 분리전과 핵산 분리후에 Q_A, Q_B및 Q_C를 첨가한 경우 간의 차이를 재연구하였다(표 3). WT-RNA가 단일 시험관 Q-NASBA 프로토콜에 의해 정량되는 경우에 있어서, WT-RNA양은 단일 시험관 정량 프로토콜에서 사용된 Q-RNA 최저량의 1/10의 양까지 신뢰성있게 정량될 수 있다.

Q_A, Q_B및 Q_C(각각 610⁵, 610⁴및 610³)는 0.1 ml 혈장에 첨가(용균 완충액에 첨가되는 경우)되어야 하기 때문에 신뢰성있는 보다 낮은 정량 범위는0.1 ml 혈장당 610²RNA 복사수이다. 분리된 핵산에 대한 Q_A, Q_B및 Q_C(각각 10⁴, 10³및 10²)의 첨가는 1 ㎕ 혈장 등가물의 핵산이 증폭에 사용되는 경우 0.1 ml 혈장당 10³RNA 복사수의 신뢰성 있는 보다 낮은 정량 범위를 제공된다. 상기 두 경우 모두 WT-RNA 양을 단일 시험관 정량 프로토콜 사용된 Q-RNA 최저량의 1/10까지 신뢰성있게 정량할 수 있다. 최저 내부 표준 Q-RNA 양을 10²으로 하여 정량 분석당 6가지 증폭 반응을 사용한 프로토콜은 1 ㎕ 혈장 등가물의 핵산이 증폭에 사용되는 경우 0.1 ml 혈장당 10⁴RNA 복사수의 신뢰성있는 보다 낮은 정량범위를 제공한다. 이 결과는 상기 특정 실험에서 핵산 분리 효율이 100%(환자1) 내지 50%(환자2) 사이에서 다양한 것으로 나타났다. 환자 3은 항상 신뢰성있는 정량범위 이하이었지만, 이 범위가 핵산 분리전에 용균 완충액에 Q_A, Q_B및 Q_C를 첨가한 단일 시험관 Q-NASBA 분석에 있어서 가장 정확한(즉, 최저 범위) 것이었다(표3).

실시예 6

마지막으로 본 발명자들은 시험관내에서 배양된 HIV-1 비루스 모액을 사용하여 핵산을 분리하기전에 용균 완충액에 Q_A, Q_B및 Q_C를 첨가하는 단일 시험관 Q-NASBA의 재현성을 시험했고, 상기 비루스 입자의 양은 전자현미경으로 정량하였다(Layne, S.P. et al., Virology. 189. 695-714, 1992). 1 ml당 2.910¹⁰비루스 입자를 함유하는 HIV-1 비루스 모액을 물로 10,000배 희석하고 희석된 비루스 원료 용액 100 ㎕에 Q_A, Q_B및 Q_C(각각 610⁵, 610⁴및 610³)를 첨가한결과 1 ml당 4.35×10¹⁰RNA 분자의 측정값이 얻어졌다. 그 결과를 표 4에 나타냈다. RNA정량의 평균값 ±SD는 10^10.64±0.05였고, 이것은 시험관내에서 배양된 비루스 모액을 정량했을때 단일 시험관 Q-NASBA의 정확도가 0.1 log 이내 임을 나타낸다. (다음 절차는 실시예 3의 재료 및 방법 부분에서 설명한 바와 같다).

표 4로부터 알수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 방법을 사용하면 시험관내에서 배양된 비루스 모액중의 HIV-1 RNA를 정량할때 0.1 log이내의 분석의 정확도를 얻을 수 있다. 이 결과로부터 0.4 log 이상의 HIV-1 RNA 양의 차이를 신뢰성있게 측정할 수 있다.

Q_A, Q_B및 Q_C(각각 610⁵, 610⁴및 610³)를 물중의 10,000 희석율의 비루스 모액 100 ㎕에 첨가하였다.

a. 2회 증폭

b. 3회 증폭

모든 정량의 평균값 ±SD는 1 ml당 10^10.64±0.05(4.35×10¹⁰) RNA 분자이다.

Claims (17)

1. 피분석물인 핵산과 구별되지만 그 핵산과 동시 증폭될 수 있는 여러 핵산 작제물들의 여러 가지 양을 각각 샘플에 첨가하는 단계;

   상기 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물과 모두 반응할 수 있는 증폭 시약을 사용하여 상기 샘플을 핵산 증폭 절차로 처리하는 단계;

   피분석물인 핵산과 각각의 핵산 작제물로부터 유래되는 증폭물의 상대적인 양을 측정하는 단계;

   상기 상대적인 양으로부터 피분석물인 핵산의 양을 계산하는 단계를 포함하는 샘플중의 피분석물인 핵산의 정량 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 핵산 작제물이 각각의 핵산 작제물중에 존재하는 구별가능한 비반복 서열을 제외하고는 피분석물인 핵산과 동일한 서열을 가지고 있음을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서,

   상기 구별가능한 비반복 서열이 약 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 무작위서열인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   핵산 작제물이 일정 계수씩 서로 달라지는 일정 범위의 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   핵산 작제물이 10의 계수씩 서로 다른 일정 범위의 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서,

   상기 샘플이 공지된 양의 시험액을 핵산 분리 절차로 처리하므로써 제조되는데, 이 때 상기 시험액을 상기 핵산 분리 절차로 처리하기 전에 핵산 작제물을 상기 시험액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서,

   상기 시험액을 핵산 분리 절차로 처리한 후 상기 샘플에 기지량의 분리 대조용 서열을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   상기 샘플을 하나 이상의 반응 용량으로 분할하고, 그 각각에 핵산 작제물을 여러 범위의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서,

   각각의 반응 용량에 동일한 핵산 작제물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제8항에 있어서,

    상기 범위의 양들이 중복되지 않음을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항의 방법으로 각 샘플을 처리하는데 있어 모든 샘플에 동일한 핵산 작제물을 사용하고, 이 특정 핵산 작제물의 양을 각각 다양하게 사용하는 것이 특징인, 1종 이상의 샘플중에 존재하는 피분석물인 핵산의 정량 방법.
12. 제11항에 있어서,

    각 샘플중에 첨가되는 핵산 작제물 중의 하나가 0의 양으로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
13. 일정량의 시험액을 기지의 계수만큼 희석하고, 특정 범위내에 있을 것으로 추정되는 피분석물인 핵산의 양을 함유하는 상기 희석된 시험액으로부터 샘플을 취하는 단계,

    상기 샘플을 제1항의 방법으로 처리하는 단계를 포함하며, 이때 샘플에 첨가되는 핵산 작제물의 양이 상기 범위내에 포함되는 것인, 시험액 패널에 존재하는 피분석물인 핵산의 정량 방법.
14. 제13항에 있어서,

    상기 범위의 양보다 적은 양의 피분석물인 핵산을 함유하는 샘플을 판별하는 단계,

    판별된 샘플에서 취한 시험액을 제13항의 방법으로 처리하는 단계를 더 포함하며, 이 경우에는 상기 시험액의 양을 보다 낮은 계수 만큼 희석하는 것이 특징인 방법.
15. 제13항에 있어서,

    상기 범위의 양보다 많은 양의 피분석물인 핵산을 함유하는 샘플을 판별하는 단계,

    판별된 샘플에서 취한 시험액을 제13항의 방법으로 처리하는 단계를 더 포함하며, 이 경우에는 상기 시험액의 양을 보다 높은 계수 만큼 희석하는 것이 특징인 방법.
16. 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산의 예측되는 양과 동일범위내에 있을 것으로 추정되는 핵산 작제물의 일정량을 상기 샘플에 첨가하는 단계,

    상기 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물과 모두 반응할 수 있는 증폭 시약을사용하여 상기 샘플을 핵산 증폭 절차로 처리하는 단계,

    상기 피분석물인 핵산과 상기 핵산 작제물로부터 유래되는 증폭물의 상대적인 양을 측정하는 단계,

    상기 샘플내에 존재하는 피분석물인 핵산의 양을 상기 상대적인 양으로부터 산정하는 단계,

    상기 동일한 시험액 유래의 제2 샘플을 제1항의 방법으로 처리하는 단계를 포함하며, 이 때 첨가되는 핵산 작제물의 양이 제1 샘플중에 존재하는 피분석물인 핵산의 산정된 양과 동일한 범위내에 속하는 양인 것이 특징인, 샘플중의 피분석물 핵산의 정량 방법.
17. 여러 핵산 작제물, 이 핵산 작제물 및 피분석물인 핵산과 반응할 수 있는 증폭 시약, 증폭된 피분석물 핵산에 대한 검출 프로브 및 증폭된 여러 핵산 작제물에 대해 각각 특이적인 여러 검출 프로브를 포함하는, 제1항의 방법에 따라 샘플중의 핵산을 정량하기 위한 시험 킷트.