CN111334565A - 一种荧光定量pcr检测t淋巴细胞中car基因拷贝数的方法 - Google Patents

一种荧光定量pcr检测t淋巴细胞中car基因拷贝数的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，该荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法具体步骤如下：S1：标准品的准备，使用含CAR基因的质粒作为标准品，梯度稀释为10倍梯度稀释；S2：提取待测样品的DNA；S3：使用引物对和探针，对标准品系列和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应；S4：将待测样本的CAR基因的Ct值带入S3中的标准曲线的计算公式，通过内参基因作为参照，标准化校正基因的含量。本发明的引物对、探针或方法的特异性好，灵敏性高，反应体系可重复性好，稳定性好，能够用于制备的CAR‑T中CAR拷贝数的定量检测或者CAR‑T治疗患者外周血细胞中CAR拷贝数的定量检测。

Description

一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法
技术领域
本发明涉及CAR基因拷贝数检测技术领域，具体为一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)(June CH,Blazar BR,RileyJL.Engineering lymphocyte subsets:tools,trials and tribulations.NatRevImmunol.2009；9:704-16)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragmentvariable，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒***转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达，在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时，CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此，准确检测CAR基因的拷贝数是CAR-T药物质量控制的关键步骤和诊断的重要环节。传统外源基因拷贝数的检测方法是Southern blot，但耗时、费力、并需要大量基因组DNA。实时荧光定量PCR技术是近年来迅速发展的DNA/RNA定量技术，省却了Southernblot方法的繁琐的步骤，可以简单快速准确地检测基因组的拷贝数。
TaqMan定量PCR方法是在原有一对引物的基础之上，需要重新合成一条与正反向引物之间的靶序列相结合的特异性探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭基团则在3'末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭；PCR扩增时，Taq酶的5'一3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，该荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法具体步骤如下：
S1：标准品的准备，使用含CAR基因的质粒作为标准品，梯度稀释为10倍梯度稀释，计算质粒的拷贝数，提取未感染(UNT)的T淋巴细胞DNA作为背景DNA模板进行梯度稀释，制成标准品系列，制作标准曲线；
S2：提取待测样品的DNA；
S3：使用引物对和探针，对标准品系列和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应，PCR的扩增反应的条件为：95℃、10min；95℃、15s，60℃1min，共40个循环；根据每个标准品产生的RSV基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线，获得标准曲线的计算公式；
S4：将待测样本的CAR基因的Ct值带入S3中的标准曲线的计算公式，通过内参基因作为参照，标准化校正基因的含量，避免因上样量和上样过程中存在的实验误差带来的结果不准确，获得待测样品的CAR基因绝对拷贝数。
优选的，所述S3中进行PCR反应的采用的是试剂盒，且试剂盒包含：引物对1和引物对2，以及探针A和探针B；所述试剂盒还包含PCR反应所需的试剂，具体为Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。
优选的，引物1和探针A为选取含CAR基因的载体上RSV promoter特异序列设计得到，引物对2和探针B为选取PTBP2基因作为内参基因设计得到。
优选的，所述探针A和探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述荧光报告基团选自FAM、VIC；所述荧光淬灭基团选自TAMRA。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的引物对、探针或方法对CAR基因的检测具有通用性，引物设计在RSV promoter区，适合于任何含有RSV promoter病毒载体的CAR基因的拷贝数鉴定，对CAR结构没有任何限制。本发明的引物对、探针或方法的特异性好，灵敏性高，反应体系可重复性好，稳定性好，能够用于制备的CAR-T中CAR拷贝数的定量检测或者CAR-T治疗患者外周血细胞中CAR拷贝数的定量检测。本发明的引物对、探针或方法对CAR最低的有效检测浓度为0.328个拷贝/细胞。
附图说明
图1为未感染(UNT)的T淋巴细胞DNA制成标准品曲线图；
图2为RSV基因的Ct值与对应的拷贝数对数值标准曲线图；
图3为CAR基因的病毒载体质粒图谱；
图4为荧光定量PCR扩增反应的循环次数曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种试剂盒，且试剂盒包含：引物对1和引物对2，以及探针A和探针B；所述试剂盒还包含PCR反应所需的试剂，具体为Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。引物1和探针A为选取含CAR基因的载体上RSV promoter特异序列设计得到，引物对2和探针B为选取PTBP2基因作为内参基因设计得到。所述探针A和探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述荧光报告基团选自FAM、VIC；所述荧光淬灭基团选自TAMRA。引物及序列信息如下：
Figure BDA0002432943700000041
实施例2
一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，该荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法具体步骤如下：
S1：标准品的准备，使用含CAR基因的质粒作为标准品，梯度稀释为10倍梯度稀释，计算质粒的拷贝数，提取未感染(UNT)的T淋巴细胞DNA作为背景DNA模板进行梯度稀释，制成标准品系列，制作标准曲线；
S2：提取待测样品的DNA；
S3：使用引物对和探针，对标准品系列和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应，PCR的扩增反应的条件为：95℃、10min；95℃、15s，60℃1min，共40个循环；根据每个标准品产生的RSV基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线，获得标准曲线的计算公式；
S4：将待测样本的CAR基因的Ct值带入S3中的标准曲线的计算公式，通过内参基因作为参照，标准化校正基因的含量，避免因上样量和上样过程中存在的实验误差带来的结果不准确，获得待测样品的CAR基因绝对拷贝数。
本发明的引物对、探针或方法对CAR基因的检测具有通用性，引物设计在RSVpromoter区，适合于任何含有RSV promoter病毒载体的CAR基因的拷贝数鉴定，对CAR结构没有任何限制。本发明的引物对、探针或方法的特异性好，灵敏性高，反应体系可重复性好，稳定性好，能够用于制备的CAR-T中CAR拷贝数的定量检测或者CAR-T治疗患者外周血细胞中CAR拷贝数的定量检测。本发明的引物对、探针或方法对CAR最低的有效检测浓度为0.328个拷贝/细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，其特征在于：该荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法具体步骤如下：
S1：标准品的准备，使用含CAR基因的质粒作为标准品，梯度稀释为10倍梯度稀释，计算质粒的拷贝数，提取未感染(UNT)的T淋巴细胞DNA作为背景DNA模板进行梯度稀释，制成标准品系列，制作标准曲线；
S2：提取待测样品的DNA；
S3：使用引物对和探针，对标准品系列和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应，PCR的扩增反应的条件为：95℃、10min；95℃、15s，60℃1min，共40个循环；根据每个标准品产生的RSV基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线，获得标准曲线的计算公式；
S4：将待测样本的CAR基因的Ct值带入S3中的标准曲线的计算公式，通过内参基因作为参照，标准化校正基因的含量，避免因上样量和上样过程中存在的实验误差带来的结果不准确，获得待测样品的CAR基因绝对拷贝数。
2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，其特征在于：所述S3中进行PCR反应的采用的是试剂盒，且试剂盒包含：引物对1和引物对2，以及探针A和探针B；所述试剂盒还包含PCR反应所需的试剂，具体为Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。
3.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，其特征在于：引物1和探针A为选取含CAR基因的载体上RSV promoter特异序列设计得到，引物对2和探针B为选取PTBP2基因作为内参基因设计得到。
4.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测T淋巴细胞中CAR基因拷贝数的方法，其特征在于：所述探针A和探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述荧光报告基团选自FAM、VIC；所述荧光淬灭基团选自TAMRA。
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