JP3672258B2 - 大麦焼酎蒸留残液を培地に使用したナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法 - Google Patents
大麦焼酎蒸留残液を培地に使用したナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養するナイシンを含有する発酵生産物の製造方法であって、前記培地として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法に関する。本発明のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法は、前記培養を回分培養方式及び／又は連続培養方式で行う態様を包含する。また、本発明のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法は、前記大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の一部を、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)で置き換える態様を包含する。本発明により得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として使用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般にナイシンと呼称されて知られているものは、34のアミノ酸から成るポリペプチドであり、アミノ酸配列の27位がヒスチジンであるものをナイシンAと言い、アミノ酸配列の27位がアスパラギンであるものをナイシンZと言う。こうしたナイシンは、Lactococcus lactis subsp. Lactisによって生産されるバクテリオシンの一種であり、Streptococcus、Bacillus、Clostridium、Staphylococcusなどのグラム陽性菌に対して抗菌作用を示し、現在約50カ国で、特定の食品に限って、保存剤としての使用が認められている。そうした食品の主なものとしては、チーズ、缶詰、牛乳、クリーム、マヨネーズなどを挙げることができる。
【０００３】
ナイシンの製造については、以下に述べるような方法が提案されている。即ち、特開平4-75596号公報［以下、「文献１」と言う］には、乳酸菌を用いるナイシンの発酵生産において、ナイシン生産菌が生産するナイシン以外の代謝産物によりこの生産菌の増殖速度が低下するか或いは増殖が停止する前に、菌体を含む培養液を膜を用いて連続的に濾過し、菌体を含む液と、菌体を含まずナイシンを含む液とに分離し、前記菌体を含む液は培養槽内に返送し、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液の量と同体積の新鮮な液体培地を前記培養槽内のナイシン生産菌培養液に、希釈率0.1〜10hr-1で供給しつつ濾過培養を続け、前記菌体を含まずナイシンを含む液、前記培養槽内の培養液、或いは該培養液に含まれる菌体そのものからナイシンを分離することを特徴とするナイシンの製造方法が記載されている。より詳細には、文献1には、培地としてMRS培地を使用し、ナイシン生産能を有する乳酸菌菌株としてストレプトコッカス・ラクチスIFO12007を使用し、上記濾過培養法を用いて発酵に付すことが記載されており、当該発酵により得られる培養液のナイシン濃度は1.72×105U/Lである旨記載されている。
【０００４】
特開平4-126093号公報［以下、「文献2」と言う］には、ナイシン生産能を有するストレプトコッカス・ラクチスSBT1212株を培養に付してナイシンを生産するにあたり、培養液中にセリンまたはフェニルアラニンを0.1〜10mg/ml添加して培養を行い、ナイシンの生産を増強することを特徴とするナイシンの生産方法が記載されている。また、文献2には、セリンを添加した全乳からなる培地を使用し、当該生産方法により得られる発酵生産物のナイシン生産量は1000(I.U./ml)である旨記載されている。
特開平6-9690号公報［以下、「文献3」と言う］には、Lactococcus lactis亜種lactisNRRL-B-18809を、1%酵母抽出物を添加したMRS培地、或いは0.5%酵母抽出物を添加した7%乳清からなる培地を用いて培養するバクテリオシン（ナイシン）の生産方法が記載されており、また当該生産方法において得られる発酵生産物のナイシン力価は1600AU/mlである旨記載されている。
【０００５】
しかしながら、文献1乃至3に記載のナイシン製造方法によって達成される発酵生産物中のナイシン濃度は上述した通りいずれも極めて低いことから、これらのナイシン製造方法はナイシンを工業的に多量生産するには適さないものである。因みに、現在のところこれらのナイシン製造方法は工業的に実施されていない。
【０００６】
ところで、焼酎蒸留残液を乳酸菌の培養用培地として使用することが提案されている。即ち、特開2000-236891号公報［以下、「文献4」と言う。］には、米焼酎蒸留粕を固液分離することにより固体分から得られる培地に乳酸菌を添加して発酵に付すことを特徴とする乳酸の製造方法が記載されている。特開2000-245491号公報［以下、「文献5」と言う］には、蒸気滅菌をしない開放系で、芋焼酎蒸留粕を固液分離した固体分から得られる培地にL乳酸を生産する乳酸菌を添加して発酵に付すことを特徴とする高純度L乳酸の製造方法が記載されている。
特開2000-342247号公報［以下、「文献6」と言う］には、大麦を原料とする焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分を有効成分として含有した微生物用培地が、酵母、乳酸菌、及びビフィズス菌の培養用培地として優れ、前記微生物用培地を酵母、乳酸菌、及びビフィズス菌の培養に使用した場合、培養菌体の量が著しく増加する旨記載されている。
【０００７】
また、特開2002-369672号公報［以下、文献7と言う。］には、ナイシン等のバクテリオシンを含有する乳酸発酵液による食品の殺菌方法が記載されている。そして、食品に対して、該乳酸発酵液とカルシウムイオンを加えることにより、該乳酸発酵液の有する抗菌作用を長く維持できることが記載されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平4-75596号公報
【特許文献２】
特開平4-126093号公報
【特許文献３】
特開平6-9690号公報
【特許文献４】
特開2000-236891号公報
【特許文献５】
特開2000-245491号公報
【特許文献６】
特開2000-342247号公報
【特許文献７】
特開2002-369672号公報
【０００９】
しかしながら、文献4及び文献5において培地原料として使用する米焼酎蒸留残液の固体分及び芋焼酎蒸留残液の固体分は、本発明において培地原料として使用する、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分及び米を原料とする焼酎製造において副生する米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分とは客観的に区別される明らかに別異なるものである。その上、文献4及び文献5に記載の発明は、米焼酎蒸留残液または芋焼酎蒸留残液から得られる固体分からなる培地を使用して乳酸菌を培養することによって乳酸を生産することを目的とするものであり、ナイシンを含有し、優れた呈味性を有する乳酸菌発酵液の製造方法については示唆すらも全くない。
【００１０】
文献6は、前記微生物用培地がLactobacillus属の乳酸菌、即ちLactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、及びLactobacillus fermentum等の菌体の増殖に有効である旨記載しているが、ナイシン生産能を有するLactococcus lactis subsp. Lactisに属する乳酸菌の菌体増殖効果については全く記載していない。また文献6には、前記微生物用培地がLactobacillus属の乳酸菌、即ちLactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、及びLactobacillus fermentum等の菌体増殖に有効である旨記載されていることから、該微生物用培地を用いて上述したナイシン生産能を有するLactococcus lactis subsp. Lactisに属する乳酸菌を培養した場合、同様の菌体増殖効果が奏されることを推測することは容易であるかもしれない。しかしながら、前記ナイシン生産能を有する乳酸菌を培養することによって培養液中に生産されるナイシンの量は、培養液中の菌体量の増加のみによって必然的に高まるものでは到底ない。この点は、上述の菌体増殖効果を有する該微生物用培地を使用する場合であっても同様である。因みに、本発明者らは、該文献6に記載の前記微生物用培地を使用して、ナイシン生産能を有するLactococcus lactis subsp. Lactisに属する幾つかの乳酸菌のそれぞれの菌株を培養条件を変えて培養し、得られた発酵生産物中の菌体量及びナイシン濃度を調べたが、いずれの場合にあっても、前記菌体量と前記ナイシン濃度との間には何ら普遍的な相関関係は認められなかった。
【００１１】
文献7には、ナイシン等のバクテリオシンを含有する乳酸発酵液による食品の殺菌方法について記載されている。また、前記乳酸発酵液を得るに際して、培地に使用する窒素源として焼酎粕が使用できる旨記載されている。しかしながら、文献7には、前記焼酎粕を窒素源として使用した場合にナイシンの生産性が顕著に高まり、更に得られる乳酸発酵液が優れた呈味性を有することについては全く記載されていない。
【００１２】
以上述べたことからしても明らかなように、上述した文献を精査してみても、大麦焼酎蒸留残液または米焼酎蒸留残液を固液分離して得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養した場合、ナイシン生産が顕著に増大すること、そして得られる発酵生産物がナイシンを著量含有し且つ優れた呈味性を有することは、到底予測できないことである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたように、従来のナイシン製造技術においては、上述した各種の培地が使用されているが、それら従来の培地のいずれを使用しても、得られる発酵生産物中のナイシン濃度は極めて低い。こうしたことから、工業的にナイシンを多量生産するためには発酵生産物中に生産されるナイシンの量を更に高める手段の早期提供が強く求められている。
これとは別に、上述したように、文献7には、焼酎粕を窒素源とする培地を使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養して得られるナイシンを含有する乳酸発酵液は抗菌作用を有し、この乳酸発酵液を食品に添加することによる食品の殺菌方法が記載されている。しかしながら、このような従来の培地を使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養して得られるナイシンを含有する乳酸発酵液は、上述したようにナイシン濃度が低く、しかもその呈味性は満足のゆくものでは到底ない。このような乳酸発酵液を食品に添加して使用する場合には、該乳酸発酵液は、ナイシンを著量含有し且つ優れた呈味性を有するものであることが切望される。
【００１４】
本発明は、上述した従来技術における問題点に鑑みて、更なる研究の結果、完成に至ったものである。本発明の目的は、従来のナイシンの製造技術における上記問題点を解決し、ナイシンの多量生産を可能にするナイシンの工業的製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ナイシンを著量含有し、且つ優れた呈味性を有し、食品への使用が極めて好適な発酵生産物の効率的製造を可能にする方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、焼酎蒸留残液をより有効に利用して従来のナイシンの製造技術における上述した問題を解決する、即ち、前記焼酎蒸留残液を培地に使用してナイシン生産の増大を可能にする方法を開発すべく実験を介して鋭意検討を行った。
その結果、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法を採用した場合、ナイシンの生産量が著しく増大し、ナイシンを著量含有する発酵生産物が得られることが判明した。そして該発酵生産物を官能検査に付したところ、従来培地を使用することにより得た発酵生産物に比べて、優れた呈味性を有し、食品としての使用に極めて適するものであることが判った。本発明は、以上の発見に基づいて完成に至ったものである。
【００１６】
本発明は、従来のナイシンの製造技術においては、培地として使用されることの全くなかった大麦焼酎蒸留残液を培地と使用することによりナイシンの著量生産を可能にするものである。即ち、本発明は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供するものである。本発明の製造方法における前記培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行ってもよい。本発明により得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として好適に使用できるものである。
【００１７】
本発明者らは、文献6に記載の微生物用培地を使用してLactobacillus属の乳酸菌を培養した場合、得られる培養菌体の量が著しく増加することに鑑み、文献6には、前記微生物用培地を使用してナイシン生成能を有するLactococcus lactis subsp. Lactis属の乳酸菌を培養することについては触れるところは全くないが、このナイシン生成能を有する乳酸菌を前記微生物用培地を使用して培養した場合、培養菌体量の増大の程度はともかく、もしかするとナイシンの顕著な生産がもたらされるのではと想像して、本発明者らは実験を介して鋭意検討を行った。即ち、本発明者らは、文献6に記載の、大麦を原料とする焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液（以下、これを“大麦焼酎蒸留残液”と略称する）を固液分離して液体分を得、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分、及び前記液体分を、それぞれBrix濃度8.0に調整後、それぞれに同量のグルコースを添加し、次いでLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌をそれぞれ接種して別々に回分培養に付した。対照には、前記と同量のグルコースを添加したMRS培地を使用し、他は全て上述したのと同様の方法により回分培養に付した。
【００１８】
それぞれの回分培養において得られた発酵生産物について乳酸菌菌体量及びナイシン濃度を測定した。その結果、文献6に記載の前記液体分からなる培地を使用した場合及び前記非吸着性画分からなる培地を使用した場合、これら二つの場合で得られた発酵生産物中の乳酸菌菌体量及びナイシン濃度は実質的に同じであることが判明した。更に該乳酸菌菌体量及び該ナイシン濃度は、対照のMRS培地を使用した場合と比較しても有意差は認められず、実質的に同等であることが判明した。即ち、文献6に記載の微生物用培地を単に使用するだけでは、前記対照のMRS培地を顕著に上回るナイシン生産性を達成できないことが明らかになった。
【００１９】
そこで、本発明者らは大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分からなる培地を使用してナイシンの生産に係る検討を実験を介して行った。即ち、前記液体分からなる培地を使用してナイシンを生産するに当たり、該液体分のBrix濃度がナイシンの生産に痛切に影響するのではないかと推測して、ナイシン生産に適した該液体分のBrix濃度を決定することを目的として実験を介して検討を行った。即ち、前記液体分のBrix濃度を0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、及び15.0に調整し、それぞれに同量のグルコースを添加して、下記のナイシン生成能を有する乳酸菌のナイシン生産に係る至適pH値に調整した液体培地を得、それぞれの液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して別々に回分培養に付した。対照には、上記と同量のグルコースを添加して上記と同じpH値に調整したMRS培地を使用し、それ以外は全て上述と同様の方法により回分培養に付した。その結果、前記液体分のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整して得た液体培地を使用した場合、前記対照のMRS培地を使用した場合と比較して、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が高まる傾向が認められた。
【００２０】
そこで、上記液体分からなる培地を使用してナイシン生産を目的とした培養に付すに当たり、ナイシンの多量生産に至適なpH条件を決定することを目的として実験を介して検討を行った。即ち、Brix濃度4.0に調整した上記液体分に所定量のグルコースを添加してpH値を3.0乃至8.0に調整した複数の液体培地を得た。得られたpH値の異なる各々の液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌をそれぞれ接種し、調整したpH値を保持しながら別々に回分培養に付した。対照には、上記と同量のグルコースを添加してpH6.8に調整したMRS培地を使用し、それ以外は全て上述と同様の方法により回分培養に付した。その結果、前記液体培地のpH値を4.0乃至7.0の範囲に保持して培養を行った場合、前記対照のMRS培地（pH6.8に保持）を使用して培養を行った場合と比較して、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が顕著に高まることが判明した。
【００２１】
以上のことから、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整し、これに糖を添加してpH値を4.0乃至7.0の範囲に保持してLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して回分培養に付すことにより、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が、従来のMRS培地を使用して培養を行った場合と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。
【００２２】
上記【００１９】及び【００２０】に述べた実験を、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（A)の場合と同様にして、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（B)について行ったところ、上述した大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（A)の場合と同様の結果が得られた。即ち、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（B)のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整し、これに糖を添加してpH値を4.0乃至7.0の範囲に保持してLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して回分培養に付すことにより、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が、従来のMRS培地を使用して培養を行った場合と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。
【００２３】
次に、上記液体分からなる培地を使用して、連続培養法によるナイシン生産について実験を介して検討を行った。即ち、前記液体分のBrix濃度を4.0に調整し、これにグルコースを3重量%添加してpH値を5.5に調整することにより液体培地を得、該液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種し、ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用し、pHコントローラーによりpH値を5.5に保持し、更に文献1に記載の濾過培養法、即ち、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液量と同体積の新鮮な前記液体培地をジャーファーメンターに供給する連続培養を行った。対照としては、前記濾過培養において新鮮な前記液体培地を使用する代わりに、グルコース3重量%を添加したMRS培地を使用した以外は、全て同様の方法により連続培養を行った。その結果、濾過培養においてジャーファーメンターに供給する新鮮培地に前記液体培地を使用することにより、該新鮮培地に前記MRS培地を使用した場合よりも、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が顕著に高まることが判明した。
【００２４】
更に文献1の表1には、新鮮培地として使用するMRS培地のグルコース含量が高いほど、培養液中のナイシン濃度が高まる旨記載されているが、同文献1の第4図及び第5図から明らかなように、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度は、供給するMRS培地のグルコース濃度に関わらずいずれの場合においても実質的に限りなく0g/Lに近い値を示している。そこで、本発明者らは、連続培養時における培養液中のグルコース濃度がナイシン生産性に影響を及ぼすのではないかと推察し実験を介して検討を行った。
【００２５】
即ち、上記液体分のBrix濃度を4.0に調整し、これにグルコースを3重量%添加してpH値を5.5に調整することにより液体培地を得、該液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種し、ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用し、pHコントローラーによりpH値を5.5に保持し、更に文献1記載の濾過培養法、即ち、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液量と同体積の新鮮な前記液体培地をジャーファーメンターに供給する連続培養を行った。その際、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーを用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養に移行後、前記液体培地をジャーファーメンターに供給して培養液のグルコース濃度を0.01、0.1、1.0、5.0、及び10.0g/Lに保持して、それぞれ別々に連続培養を行った。その結果、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を0.1、1.0、5.0、及び10.0g/Lに維持した場合には、培養液中のグルコース濃度を0.01g/Lに維持した場合に比べて、培養液中のナイシン濃度が飛躍的に高まることが明らかになった。このことから、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を0.1g/L以上に維持することにより、極めて高濃度のナイシンを含有する培養液を連続的に生産することが可能となることが判明した。
【００２６】
そこで、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、従来のMRS培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２７】
また、上記米焼酎蒸留残液の液体分（B）を使用して【００２５】に述べた手法で実験を行ったところ、上記大麦焼酎蒸留残液の液体分を使用した場合と同様に、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を0.1g/L以上に維持することにより、極めて高濃度のナイシンを含有する培養液を連続的に生産することが可能となることが判明した。そこで、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（B）からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、従来のMRS培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２８】
また、前記培地として、前記大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の一部を米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)で置き換えたものからなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。その結果、該発酵生産物のナイシン濃度は、従来のMRS培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２９】
この他に、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着画分とし、前記液体分(A)を前記非吸着画分を含有するものにした液体分(A')と、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着画分とし、前記液体分(B)を前記非吸着画分を含有するものにした液体分(B')を用意し、前記液体分(A')を使用しBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したもの、及び前記液体分(A')及び前記液体分(B')を使用しBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを夫々培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、いずれの発酵生産物のナイシン濃度も従来のMRS培地を使用することにより得られる発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００３０】
【実施態様例】
以下、本発明の好ましい実施態様例について述べるが、本発明は、これらの実施態様例によって何ら制限されるものではない。本発明は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより液体分(A)を得る工程（イ）、前記液体分(A)を水で希釈してそのBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整する工程（ロ）、前記工程（ロ）で得られるものに糖を添加して培地を得る工程（ハ）、及び前記培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う工程（ニ）を有することを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供する。工程（イ）においては、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の一部を、米を原料とする焼酎の製造において副生する米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)で置き換えてもよい。また、前記液体分(A)及び／又は前記液体分(B)の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着分離処理に付して得られる非吸着画分にしてもよい。工程(ニ)における培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことができる。
【００３１】
本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液は、大麦又は精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹、及び蒸麦中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、酵母によるアルコール発酵に付して熟成もろみを得、該熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、大麦焼酎の蒸留残液を意味する。また、米焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として大麦を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液に包含される。
前記大麦焼酎蒸留残液を得るに際して、大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（Aspergillus kawachii）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspergillus awamori）及び清酒製造等で使用する黄麹菌(Aspergillus oryzae）などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００３２】
本発明において使用する米焼酎蒸留残液は、米を原料として米麹及び蒸米を製造し、得られた米麹、及び蒸米中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、更に酵母によるアルコール発酵に付して熟成もろみを得、該熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、米焼酎の蒸留残液を意味する。また、大麦焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として米を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において使用する米焼酎蒸留残液に包含される。
前記米焼酎蒸留残液を得るに際して、米焼酎の製造に用いる米麹は、通常の米焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に米焼酎製造で使用する白麹菌（Aspergillus kawachii）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspergillus awamori）及び清酒製造等で使用する黄麹菌(Aspergillus oryzae）などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また米焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００３３】
工程（イ）において、大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る理由は、該大麦焼酎蒸留残液から原料大麦及び大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣を除去して液体分のみを使用することにある。前記固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いた固液分離処理を行い、前記液体分を得る。
【００３４】
工程（イ）において、米焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る理由は、該米焼酎蒸留残液から原料米及び米麹由来の水不溶性の発酵残渣を除去して液体分のみを使用することにある。前記固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いた固液分離処理を行い、前記液体分を得る。
【００３５】
前記液体分(A)及び／又は前記液体分(B)を合成吸着剤を用いる吸着分離処理に付すことにより非吸着画分にするのは、該液体分に含まれる雑味を呈する成分を除去することを目的として行うものである。前記合成吸着剤の好適な具体例としては、オルガノ（株）製のアンバーライトXAD-4、アンバーライトXAD-16、アンバーライトXAD-1180及びアンバーライトXAD-2000、三菱化学（株）製のセパビーズSP850及びダイヤイオンHP20等の芳香族系（又はスチレン系とも言う）合成吸着剤、オルガノ（株）製のアンバーライトXAD-7、及び三菱化学（株）製のダイヤイオンHP2MG等のメタクリル系（又はアクリル系とも言う）合成吸着剤を挙げることができる。これらの他、場合によっては三菱化学（株）製のセパピーズSP207等の芳香族系修飾型合成吸着剤を用いることができる。このようにして得られる前記非吸着画分は、前記液体分の少なくとも一部に代えて使用することができる。
【００３６】
工程（ロ）において、工程（イ）から供給される前記液体分(A)〔前記液体分(A)の非吸着画分を包含する〕及び前記液体分(B)〔前記液体分(B)の前記非吸着画分を包含する〕の夫々のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整するのは、ナイシン生産能を有する乳酸菌のナイシン生産性に適した培地成分濃度に調整することを目的として行うものであり、これによりナイシンの生産性を高めることができる。前記Brix濃度は、2.0乃至4.0の範囲に調整するのがより好ましい。即ちこの場合、ナイシン生産性の顕著な向上を図ることができる。
【００３７】
工程（ハ）において添加する前記糖の好ましい具体例としては、グルコース、キシロース、スクロース、フラクトース、マルトース、リボース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、セロビオース、サッカロース、及びトレハロースを挙げることができる。前記液体培地の糖濃度は、使用する糖の種類により異なるが、一般的には、5乃至70g/Lの範囲である。これらの糖の中、グルコースが特に好ましく、その場合のグルコース濃度は、5乃至70g/Lの範囲に設定するのが好ましい。
【００３８】
工程（ニ）で使用する前記ナイシン生産能を有する乳酸菌は、ナイシン生産能を有する菌株であればいかなるものでも良く、特にLactococcus lactis subsp. Lactisに属する乳酸菌が好ましい。具体的には、生産するナイシンがナイシンAである場合の菌株として、Lactococcus lactis NCDO497、Lactococcus lactis NIZO R5、Lactococcus lactis ATCC 7962及びLactococcus lactis ATCC11454を好ましいものとして挙げることができる。また、生産するナイシンがナイシンZである場合の菌株として、Lactococcus lactis NIZO 22186、Lactococcus lactis NRRL-B-18583、Lactococcus lactis NCFB2118、Lactococcus lactis NCFB2054、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactis NIZO 221186、Lactococcus lactis IO-1(JCM7638)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM11181)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 7B(JCM11182)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 8B(JCM11183)、及びLactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 9B(JCM11184)、を好ましいものとして挙げることができる。
【００３９】
工程（ニ）における培養を、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つ培養液のpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う工程は、回分培養方式或いは連続培養方式で行うことができる。この他、流加培養方式を採用することができる。前記培養液のpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御するに際しては、上述したように、培養槽にpH測定用複合ガラス電極を装着し、pHメーターで測定し、実側pH値が設定pH値よりも低くなった時に、pHコントローラー等を用いて水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を培養槽に供給することにより、設定pH値に保持することができ、好ましくはpH値5.0乃至6.5の範囲に調整する。尚、前記所定のpH値の変動範囲は0.1以下にすることが好ましい。工程（ニ）において、前記培養液の糖濃度（グルコース濃度）を少なくとも0.1g/L以上に制御するに際しては、前記培養を連続培養方式または流加培養方式で行う場合には、グルコースアナライザー等を使用して制御することができる。当該工程においてはグルコースの他に酵母エキスやポリペプトンからなる窒素源を含有する基質溶液又は上記液体製培地からなる基質溶液を培養槽に供給することにより行うことができ、これにより培養工程にある液体培地のグルコース濃度を所望の値に保持することができる。当該グルコース濃度は少なくとも0.1g/L以上とするが、好ましくは1.0g/L以上に保持することによりナイシン生産能を有する乳酸菌の活性及び比ナイシン生産速度を高い値に維持することができる。前記培養を行う際の培養温度は、使用する乳酸菌の生育に最適な温度に設定すればよく、一般的には20乃至40℃の範囲、好ましくは25乃至37℃の範囲とする。攪拌速度は10乃至1000rpm、好ましくは50乃至300rpmが好適である。
【００４０】
工程（ニ）における培養を連続培養方式で行う場合には、上述の培養条件に従って培養を開始し、菌体濃度が上昇して、対数増殖期の後期に到達した段階で連続培養に移行する。該連続培養法においては、培養槽にpH測定用複合ガラス電極を装着し、pHメーターで測定し、実側pH値が設定pH値よりも低くなった時に水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を培養槽に供給することにより、該設定pH値に保持することができる。この際、培養槽に供給された前記液体培地又はアルカリ溶液と同量の除菌液を限外濾過膜或いは精密濾過膜等を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持することができる。また、前記pH制御とは別に、培養槽にプロセスオンライン濁度計プローブを装着し、その出力をDDCコントローラーに入力し、培養槽に供給した滅菌水又は液体培地と同量の培養液（菌体を含む）を培養槽から抜き出すことにより、培養槽の濁度制御を行い、培養液中の菌体濃度及び培養液液量を一定に保持することができる。該菌体濃度は4.0乃至18.0g/Lの範囲、好ましくは8.0乃至15.0g/Lの範囲に設定する。培地の希釈率は培養液の菌体濃度及びナイシン生産速度等により任意の値に設定することができ、一般的には0.1乃至2.0hr-1の範囲とするが、好ましくは0.2乃至1.2hr-1の範囲とする。
【００４１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４２】
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（70%精白）を用いた。
〔大麦麹の製造〕
大麦を40%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、大麦トンあたり1kgの種麹（白麹菌）を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間保持することにより、大麦麹を製造した。
〔蒸麦の製造〕
大麦を40%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷することにより、蒸麦を製造した。
〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕
1次仕込みでは前述の方法で製造した大麦麹（大麦として3トン）に、水3.6キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg（湿重量）を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵（1段目の発酵）に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4キロリットル、前述の方法で製造した蒸麦（大麦として7トン）を加えて11日間の発酵（2段目の発酵）に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎10キロリットルと大麦焼酎蒸留残液15キロリットルを得た。得られた大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
【００４３】
以下の実施例に供する目的で米焼酎の製造を行った。原料としては、精米（70%精白）を用いた。
〔米麹の製造〕
米麹の製造は米を35%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、米kg当り1g量の白麹菌を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間で行った。
〔蒸米の製造〕
蒸米は米を35%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷することにより、蒸米を製造した。
〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕
1次仕込みでは前述の方法で製造した米麹（米として3トン）に、水3.6キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg（湿重量）を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵（1段目の発酵）に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4キロリットル、前述の方法で製造した蒸米（米として7トン）を加えて15日間の発酵（2段目の発酵）に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、米焼酎10キロリットルと米焼酎蒸留残液15キロリットルを得た。得られた米焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
【００４４】
【実施例１】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1.で得た乳酸菌培養用培地500mlと上記2.で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００４５】
【比較例１】
1．MRS培地の調製
MRS培地（ペプトン1重量%、肉エキス1重量%、酵母エキス0.5重量%、K2HPO40.2重量%、クエン酸二アンモニウム0.2重量%、グルコース3.6重量%、Tween80 0.1重量%、酢酸ナトリウム0.5重量%、MGSO4・7H2O 0.058重量%、MnSO4・4H2O 0.028重量%）を、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1.で調製したMRS培地500mlと上記2.で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００４６】
【実施例２】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００４７】
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。4．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに上記1で得た乳酸菌培養用培地1800mlと上記3で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後8時間目に培養液のグルコース濃度が4g/Lに達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記2で得たグルコース濃度調整用基質溶液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液の量と前記グルコース濃度調整用基質溶液の量の総和量と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００４８】
【比較例２】
1．MRS培地の調製
MRS培地（ペプトン1重量%、肉エキス1重量%、酵母エキス0.5重量%、K2HPO40.2重量%、クエン酸二アンモニウム0.2重量%、グルコース3.6重量%、Tween80 0.1重量%、酢酸ナトリウム0.5重量%、MGSO4・7H2O 0.058重量%、MnSO4・4H2O 0.028重量%）を、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用MRS培地を得た。
2．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに上記1.で得た乳酸菌培養用培地1800mlと上記3で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後12時間目に培養液のグルコース濃度が0.1g/L未満に達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を0.1g/L未満に保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、基質溶液（グルコース1重量%、酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%、NaCl0.5重量%）を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を0.1g/L未満に保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液及び前記基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００４９】
【実施例３】
実施例２で使用したLactococcus lactis IO-1に代えて、Lactococcus lactis NIZO 22186、Lactococcus lactis NRRL-B-18583、Lactococcus lactis NCFB2118、Lactococcus lactis NCFB2054、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactis NIZO 221186、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM11181)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 7B(JCM11182)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 8B(JCM11183)、及びLactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 9B(JCM11184)、を使用した以外は、全て実施例2と同様にして連続培養を行った。
【００５０】
【比較例３】
比較例2で使用したLactococcus lactis IO-1に代えて、Lactococcus lactis NIZO 22186、Lactococcus lactis NRRL-B-18583、Lactococcus lactis NCFB2118、Lactococcus lactis NCFB2054、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactis NIZO 221186、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM11181)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 7B(JCM11182)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 8B(JCM11183)、及びLactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 9B(JCM11184)、を使用した以外は、全て比較例2と同様にして連続培養を行った。
【００５１】
【実施例４】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約3倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該充填カラムから溶出してきた当該合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈そのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、次いで水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整した後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た乳酸菌培養用培地500mlと上記2で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００５２】
【実施例５】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約3倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該カラムから溶出してきた前記合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約3倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該カラムから溶出してきた前記合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
【００５３】
4．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに上記1.で得た乳酸菌培養用培地1800mlと上記3で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後8時間目に培養液のグルコース濃度が4g/Lに達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記2で得たグルコース濃度調整用基質溶液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００５４】
【実施例６】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
4．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た乳酸菌培養用培地250ml、上記2で得た乳酸菌培養用培地250ml、及び上記3で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００５５】
【実施例７】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
3．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
米焼酎製造の蒸留工程で得られた前記米焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して米焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をBrix4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
4．米焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００５６】
5．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
6．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに、上記1で得た乳酸菌培養用培地900ml、上記3で得た乳酸菌培養用培地900ml、及び上記5で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後8時間目に培養液のグルコース濃度が4g/Lに達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記2で得たグルコース濃度調整用基質溶液と前記4で得たグルコース濃度調整用基質溶液を1:1の割合で混合することにより得た混合液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００５７】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得た発酵生産物のそれぞれを以下の試験例１に供し、該発酵生産物のナイシン濃度を測定した。
【００５８】
【試験例１】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得たそれぞれの発酵生産物を9000rpm、30minの条件で遠心分離に付すことにより該発酵生産物の上清1を得、それぞれの発酵生産物の上清1に濃塩酸を加えてpH3.0に調整後、4℃で一晩放置し、再度9000rpm、30minの条件で遠心分離に付すことによりそれぞれの発酵生産物の上清2を得、得られたそれぞれの発酵生産物の上清2を試料として以下の方法に従って、培養液のナイシン濃度を測定した。即ち、指標菌としてMicrococcus luteus(IFO N0.3333)を用い、ナイシン(ICN製)を3000IU/mlとなるように0.01N HClに溶解したものをナイシンA標準液として用いた。前記指標菌をLB液体培地10mlに一白金耳接種し、培養温度30℃、攪拌速度100rpm、培養時間18時間の条件で振とう培養を行い培養液を得、該培養液100μlを適温まで冷ましたソフトアガー2.0mlに懸濁して懸濁液を得、該懸濁液をLB寒天培地上に重層して1時間放置後、0.01N HClで適当な濃度に希釈した前記発酵生産物上清2を該LB寒天培地上に10μlづつスポットし、30℃で24時間培養後、スポット箇所周辺の増殖阻害を起こした生育阻止円の有無を確認し、該生育阻止円が現れる時の試料の最大希釈率Dを求め、ナイシン抗菌活性(AU/ml)=1/D×試料添加量(ml)の関係式からナイシン抗菌活性値を算出した。
【００５９】
【評価１】
実施例1及び比較例1において培養開始後24時間目に得たそれぞれの発酵生産物のナイシン抗菌活性値を表1に示す。表1に示す結果から以下のことが判明した。即ち、培養開始後24時間目のナイシン抗菌活性値は、比較例1で得た発酵生産物は1200IU/mlと低い値であったのに対して、実施例1で得た発酵生産物は4500IU/mlと極めて高い値を示した。即ち、大麦焼酎蒸留残液から得た前記乳酸菌培養用培地を使用する本発明のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、MRS培地を使用する従来のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値の約3.8倍に達することが判明した。
実施例2及び比較例2の連続培養におけるナイシン抗菌活性値を表2に示す。表2に示す結果から以下のことが判明した。即ち、ナイシン抗菌活性値は、比較例2においては、回分培養から連続培養に移行した培養開始後12時間目において最大値を示した後は漸減し、培養開始後42時間目には1000IU/mlとなったのに対して、実施例2においては、回分培養から連続培養に移行した培養開始後12時間目において極大値を示した後、24時間目までは減少したが、24時間目以降は再び上昇し、培養開始後42時間目には6300IU/mlに達した。即ち、大麦焼酎蒸留残液から得た前記乳酸菌培養用培地を使用し、且つ連続培養時の培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養を行う本発明のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、MRS培地を使用し、且つ連続培養時の培養液のグルコース濃度を0.1g/L未満に保持して培養を行う従来公知のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値の6.3倍に達することが判明した。
実施例3及び比較例3の結果からは以下のことが判明した。即ち、実施例3においてナイシン生産能を有する各種乳酸菌菌株を連続培養に付すことにより得られるそれぞれの発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、いずれの菌株を使用した場合であっても、比較例3に示す従来公知のナイシンの製造方法を採用した場合よりも顕著に高い値を示した。
【００６０】
実施例4及び実施例5の結果からは以下のことが判明した。即ち、本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の代わりに、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる前記文献6に記載の非吸着性画分からなる溶液を使用した場合、実施例4及び実施例5において得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、実施例1及び実施例2のそれぞれにおいて得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値と同等であることが判った。
【００６１】
実施例6及び実施例7の結果からは以下のことが判明した。即ち、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の混合物を培地に使用した場合の実施例6及び実施例7において得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、実施例1及び実施例2のそれぞれにおいて得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値と同等であることが判った。
【００６２】
【試験例２】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得た発酵生産物のそれぞれを呈味性について官能試験に供した。即ち、実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得た発酵生産物のそれぞれを10名のパネラーによる官能試験に付し、該発酵生産物の呈味性を評価した。
【００６３】
【評価２】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得たそれぞれの発酵生産物の官能試験結果を表3に示す。表3に示す結果から以下のことが判明した。即ち、比較例1及び比較例2で得たそれぞれの発酵生産物は極めて単調な香味と好ましくない雑味を有することから官能評価の値が極めて低かったのに対して、実施例1、実施例2、及び実施例4乃至実施例7で得た発酵生産物は、いずれも、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味を呈することから官能評価の値が顕著に高く、調味料あるいは食品素材として好適であることが判明した。そして上記パネラーのコメントから、実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7で得た発酵生産物の中で、実施例4及び実施例5で得た発酵生産物は、いずれも特に際立ったまろやかな香味を呈するという特徴を有し、実施例6及び実施例7で得た発酵生産物は、いずれも、実施例1及び実施例2で得た発酵生産物よりも更に味わいのある豊かな旨味を呈するという特徴を有していることが明らかになった。
【００６４】
以上の結果から、本発明によれば、従来公知のナイシンの製造方法と比較してナイシン生産性を飛躍的に高めることが可能であることが理解される。また、本発明よって得られる発酵生産物は、ナイシンを著量含有し、優れた抗菌活性に加えて、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味を呈することから、食品として極めて好適に使用できる。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明のナイシンを含有する発酵生産物の製造方法は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（A）からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行うことを特徴とし、ナイシンを著量含有する発酵生産物の効率的製造を可能にする。そして、得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として好適に使用することができる。
【発明が属する技術分野】
本発明は、焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養するナイシンを含有する発酵生産物の製造方法であって、前記培地として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法に関する。本発明のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法は、前記培養を回分培養方式及び／又は連続培養方式で行う態様を包含する。また、本発明のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法は、前記大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の一部を、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)で置き換える態様を包含する。本発明により得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として使用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般にナイシンと呼称されて知られているものは、34のアミノ酸から成るポリペプチドであり、アミノ酸配列の27位がヒスチジンであるものをナイシンAと言い、アミノ酸配列の27位がアスパラギンであるものをナイシンZと言う。こうしたナイシンは、Lactococcus lactis subsp. Lactisによって生産されるバクテリオシンの一種であり、Streptococcus、Bacillus、Clostridium、Staphylococcusなどのグラム陽性菌に対して抗菌作用を示し、現在約50カ国で、特定の食品に限って、保存剤としての使用が認められている。そうした食品の主なものとしては、チーズ、缶詰、牛乳、クリーム、マヨネーズなどを挙げることができる。
【０００３】
ナイシンの製造については、以下に述べるような方法が提案されている。即ち、特開平4-75596号公報［以下、「文献１」と言う］には、乳酸菌を用いるナイシンの発酵生産において、ナイシン生産菌が生産するナイシン以外の代謝産物によりこの生産菌の増殖速度が低下するか或いは増殖が停止する前に、菌体を含む培養液を膜を用いて連続的に濾過し、菌体を含む液と、菌体を含まずナイシンを含む液とに分離し、前記菌体を含む液は培養槽内に返送し、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液の量と同体積の新鮮な液体培地を前記培養槽内のナイシン生産菌培養液に、希釈率0.1〜10hr-1で供給しつつ濾過培養を続け、前記菌体を含まずナイシンを含む液、前記培養槽内の培養液、或いは該培養液に含まれる菌体そのものからナイシンを分離することを特徴とするナイシンの製造方法が記載されている。より詳細には、文献1には、培地としてMRS培地を使用し、ナイシン生産能を有する乳酸菌菌株としてストレプトコッカス・ラクチスIFO12007を使用し、上記濾過培養法を用いて発酵に付すことが記載されており、当該発酵により得られる培養液のナイシン濃度は1.72×105U/Lである旨記載されている。
【０００４】
特開平4-126093号公報［以下、「文献2」と言う］には、ナイシン生産能を有するストレプトコッカス・ラクチスSBT1212株を培養に付してナイシンを生産するにあたり、培養液中にセリンまたはフェニルアラニンを0.1〜10mg/ml添加して培養を行い、ナイシンの生産を増強することを特徴とするナイシンの生産方法が記載されている。また、文献2には、セリンを添加した全乳からなる培地を使用し、当該生産方法により得られる発酵生産物のナイシン生産量は1000(I.U./ml)である旨記載されている。
特開平6-9690号公報［以下、「文献3」と言う］には、Lactococcus lactis亜種lactisNRRL-B-18809を、1%酵母抽出物を添加したMRS培地、或いは0.5%酵母抽出物を添加した7%乳清からなる培地を用いて培養するバクテリオシン（ナイシン）の生産方法が記載されており、また当該生産方法において得られる発酵生産物のナイシン力価は1600AU/mlである旨記載されている。
【０００５】
しかしながら、文献1乃至3に記載のナイシン製造方法によって達成される発酵生産物中のナイシン濃度は上述した通りいずれも極めて低いことから、これらのナイシン製造方法はナイシンを工業的に多量生産するには適さないものである。因みに、現在のところこれらのナイシン製造方法は工業的に実施されていない。
【０００６】
ところで、焼酎蒸留残液を乳酸菌の培養用培地として使用することが提案されている。即ち、特開2000-236891号公報［以下、「文献4」と言う。］には、米焼酎蒸留粕を固液分離することにより固体分から得られる培地に乳酸菌を添加して発酵に付すことを特徴とする乳酸の製造方法が記載されている。特開2000-245491号公報［以下、「文献5」と言う］には、蒸気滅菌をしない開放系で、芋焼酎蒸留粕を固液分離した固体分から得られる培地にL乳酸を生産する乳酸菌を添加して発酵に付すことを特徴とする高純度L乳酸の製造方法が記載されている。
特開2000-342247号公報［以下、「文献6」と言う］には、大麦を原料とする焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分を有効成分として含有した微生物用培地が、酵母、乳酸菌、及びビフィズス菌の培養用培地として優れ、前記微生物用培地を酵母、乳酸菌、及びビフィズス菌の培養に使用した場合、培養菌体の量が著しく増加する旨記載されている。
【０００７】
また、特開2002-369672号公報［以下、文献7と言う。］には、ナイシン等のバクテリオシンを含有する乳酸発酵液による食品の殺菌方法が記載されている。そして、食品に対して、該乳酸発酵液とカルシウムイオンを加えることにより、該乳酸発酵液の有する抗菌作用を長く維持できることが記載されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平4-75596号公報
【特許文献２】
特開平4-126093号公報
【特許文献３】
特開平6-9690号公報
【特許文献４】
特開2000-236891号公報
【特許文献５】
特開2000-245491号公報
【特許文献６】
特開2000-342247号公報
【特許文献７】
特開2002-369672号公報
【０００９】
しかしながら、文献4及び文献5において培地原料として使用する米焼酎蒸留残液の固体分及び芋焼酎蒸留残液の固体分は、本発明において培地原料として使用する、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分及び米を原料とする焼酎製造において副生する米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分とは客観的に区別される明らかに別異なるものである。その上、文献4及び文献5に記載の発明は、米焼酎蒸留残液または芋焼酎蒸留残液から得られる固体分からなる培地を使用して乳酸菌を培養することによって乳酸を生産することを目的とするものであり、ナイシンを含有し、優れた呈味性を有する乳酸菌発酵液の製造方法については示唆すらも全くない。
【００１０】
文献6は、前記微生物用培地がLactobacillus属の乳酸菌、即ちLactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、及びLactobacillus fermentum等の菌体の増殖に有効である旨記載しているが、ナイシン生産能を有するLactococcus lactis subsp. Lactisに属する乳酸菌の菌体増殖効果については全く記載していない。また文献6には、前記微生物用培地がLactobacillus属の乳酸菌、即ちLactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、及びLactobacillus fermentum等の菌体増殖に有効である旨記載されていることから、該微生物用培地を用いて上述したナイシン生産能を有するLactococcus lactis subsp. Lactisに属する乳酸菌を培養した場合、同様の菌体増殖効果が奏されることを推測することは容易であるかもしれない。しかしながら、前記ナイシン生産能を有する乳酸菌を培養することによって培養液中に生産されるナイシンの量は、培養液中の菌体量の増加のみによって必然的に高まるものでは到底ない。この点は、上述の菌体増殖効果を有する該微生物用培地を使用する場合であっても同様である。因みに、本発明者らは、該文献6に記載の前記微生物用培地を使用して、ナイシン生産能を有するLactococcus lactis subsp. Lactisに属する幾つかの乳酸菌のそれぞれの菌株を培養条件を変えて培養し、得られた発酵生産物中の菌体量及びナイシン濃度を調べたが、いずれの場合にあっても、前記菌体量と前記ナイシン濃度との間には何ら普遍的な相関関係は認められなかった。
【００１１】
文献7には、ナイシン等のバクテリオシンを含有する乳酸発酵液による食品の殺菌方法について記載されている。また、前記乳酸発酵液を得るに際して、培地に使用する窒素源として焼酎粕が使用できる旨記載されている。しかしながら、文献7には、前記焼酎粕を窒素源として使用した場合にナイシンの生産性が顕著に高まり、更に得られる乳酸発酵液が優れた呈味性を有することについては全く記載されていない。
【００１２】
以上述べたことからしても明らかなように、上述した文献を精査してみても、大麦焼酎蒸留残液または米焼酎蒸留残液を固液分離して得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養した場合、ナイシン生産が顕著に増大すること、そして得られる発酵生産物がナイシンを著量含有し且つ優れた呈味性を有することは、到底予測できないことである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたように、従来のナイシン製造技術においては、上述した各種の培地が使用されているが、それら従来の培地のいずれを使用しても、得られる発酵生産物中のナイシン濃度は極めて低い。こうしたことから、工業的にナイシンを多量生産するためには発酵生産物中に生産されるナイシンの量を更に高める手段の早期提供が強く求められている。
これとは別に、上述したように、文献7には、焼酎粕を窒素源とする培地を使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養して得られるナイシンを含有する乳酸発酵液は抗菌作用を有し、この乳酸発酵液を食品に添加することによる食品の殺菌方法が記載されている。しかしながら、このような従来の培地を使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養して得られるナイシンを含有する乳酸発酵液は、上述したようにナイシン濃度が低く、しかもその呈味性は満足のゆくものでは到底ない。このような乳酸発酵液を食品に添加して使用する場合には、該乳酸発酵液は、ナイシンを著量含有し且つ優れた呈味性を有するものであることが切望される。
【００１４】
本発明は、上述した従来技術における問題点に鑑みて、更なる研究の結果、完成に至ったものである。本発明の目的は、従来のナイシンの製造技術における上記問題点を解決し、ナイシンの多量生産を可能にするナイシンの工業的製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ナイシンを著量含有し、且つ優れた呈味性を有し、食品への使用が極めて好適な発酵生産物の効率的製造を可能にする方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、焼酎蒸留残液をより有効に利用して従来のナイシンの製造技術における上述した問題を解決する、即ち、前記焼酎蒸留残液を培地に使用してナイシン生産の増大を可能にする方法を開発すべく実験を介して鋭意検討を行った。
その結果、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法を採用した場合、ナイシンの生産量が著しく増大し、ナイシンを著量含有する発酵生産物が得られることが判明した。そして該発酵生産物を官能検査に付したところ、従来培地を使用することにより得た発酵生産物に比べて、優れた呈味性を有し、食品としての使用に極めて適するものであることが判った。本発明は、以上の発見に基づいて完成に至ったものである。
【００１６】
本発明は、従来のナイシンの製造技術においては、培地として使用されることの全くなかった大麦焼酎蒸留残液を培地と使用することによりナイシンの著量生産を可能にするものである。即ち、本発明は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供するものである。本発明の製造方法における前記培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行ってもよい。本発明により得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として好適に使用できるものである。
【００１７】
本発明者らは、文献6に記載の微生物用培地を使用してLactobacillus属の乳酸菌を培養した場合、得られる培養菌体の量が著しく増加することに鑑み、文献6には、前記微生物用培地を使用してナイシン生成能を有するLactococcus lactis subsp. Lactis属の乳酸菌を培養することについては触れるところは全くないが、このナイシン生成能を有する乳酸菌を前記微生物用培地を使用して培養した場合、培養菌体量の増大の程度はともかく、もしかするとナイシンの顕著な生産がもたらされるのではと想像して、本発明者らは実験を介して鋭意検討を行った。即ち、本発明者らは、文献6に記載の、大麦を原料とする焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液（以下、これを“大麦焼酎蒸留残液”と略称する）を固液分離して液体分を得、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分、及び前記液体分を、それぞれBrix濃度8.0に調整後、それぞれに同量のグルコースを添加し、次いでLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌をそれぞれ接種して別々に回分培養に付した。対照には、前記と同量のグルコースを添加したMRS培地を使用し、他は全て上述したのと同様の方法により回分培養に付した。
【００１８】
それぞれの回分培養において得られた発酵生産物について乳酸菌菌体量及びナイシン濃度を測定した。その結果、文献6に記載の前記液体分からなる培地を使用した場合及び前記非吸着性画分からなる培地を使用した場合、これら二つの場合で得られた発酵生産物中の乳酸菌菌体量及びナイシン濃度は実質的に同じであることが判明した。更に該乳酸菌菌体量及び該ナイシン濃度は、対照のMRS培地を使用した場合と比較しても有意差は認められず、実質的に同等であることが判明した。即ち、文献6に記載の微生物用培地を単に使用するだけでは、前記対照のMRS培地を顕著に上回るナイシン生産性を達成できないことが明らかになった。
【００１９】
そこで、本発明者らは大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分からなる培地を使用してナイシンの生産に係る検討を実験を介して行った。即ち、前記液体分からなる培地を使用してナイシンを生産するに当たり、該液体分のBrix濃度がナイシンの生産に痛切に影響するのではないかと推測して、ナイシン生産に適した該液体分のBrix濃度を決定することを目的として実験を介して検討を行った。即ち、前記液体分のBrix濃度を0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、及び15.0に調整し、それぞれに同量のグルコースを添加して、下記のナイシン生成能を有する乳酸菌のナイシン生産に係る至適pH値に調整した液体培地を得、それぞれの液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して別々に回分培養に付した。対照には、上記と同量のグルコースを添加して上記と同じpH値に調整したMRS培地を使用し、それ以外は全て上述と同様の方法により回分培養に付した。その結果、前記液体分のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整して得た液体培地を使用した場合、前記対照のMRS培地を使用した場合と比較して、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が高まる傾向が認められた。
【００２０】
そこで、上記液体分からなる培地を使用してナイシン生産を目的とした培養に付すに当たり、ナイシンの多量生産に至適なpH条件を決定することを目的として実験を介して検討を行った。即ち、Brix濃度4.0に調整した上記液体分に所定量のグルコースを添加してpH値を3.0乃至8.0に調整した複数の液体培地を得た。得られたpH値の異なる各々の液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌をそれぞれ接種し、調整したpH値を保持しながら別々に回分培養に付した。対照には、上記と同量のグルコースを添加してpH6.8に調整したMRS培地を使用し、それ以外は全て上述と同様の方法により回分培養に付した。その結果、前記液体培地のpH値を4.0乃至7.0の範囲に保持して培養を行った場合、前記対照のMRS培地（pH6.8に保持）を使用して培養を行った場合と比較して、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が顕著に高まることが判明した。
【００２１】
以上のことから、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整し、これに糖を添加してpH値を4.0乃至7.0の範囲に保持してLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して回分培養に付すことにより、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が、従来のMRS培地を使用して培養を行った場合と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。
【００２２】
上記【００１９】及び【００２０】に述べた実験を、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（A)の場合と同様にして、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（B)について行ったところ、上述した大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（A)の場合と同様の結果が得られた。即ち、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（B)のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整し、これに糖を添加してpH値を4.0乃至7.0の範囲に保持してLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して回分培養に付すことにより、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が、従来のMRS培地を使用して培養を行った場合と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。
【００２３】
次に、上記液体分からなる培地を使用して、連続培養法によるナイシン生産について実験を介して検討を行った。即ち、前記液体分のBrix濃度を4.0に調整し、これにグルコースを3重量%添加してpH値を5.5に調整することにより液体培地を得、該液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種し、ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用し、pHコントローラーによりpH値を5.5に保持し、更に文献1に記載の濾過培養法、即ち、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液量と同体積の新鮮な前記液体培地をジャーファーメンターに供給する連続培養を行った。対照としては、前記濾過培養において新鮮な前記液体培地を使用する代わりに、グルコース3重量%を添加したMRS培地を使用した以外は、全て同様の方法により連続培養を行った。その結果、濾過培養においてジャーファーメンターに供給する新鮮培地に前記液体培地を使用することにより、該新鮮培地に前記MRS培地を使用した場合よりも、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が顕著に高まることが判明した。
【００２４】
更に文献1の表1には、新鮮培地として使用するMRS培地のグルコース含量が高いほど、培養液中のナイシン濃度が高まる旨記載されているが、同文献1の第4図及び第5図から明らかなように、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度は、供給するMRS培地のグルコース濃度に関わらずいずれの場合においても実質的に限りなく0g/Lに近い値を示している。そこで、本発明者らは、連続培養時における培養液中のグルコース濃度がナイシン生産性に影響を及ぼすのではないかと推察し実験を介して検討を行った。
【００２５】
即ち、上記液体分のBrix濃度を4.0に調整し、これにグルコースを3重量%添加してpH値を5.5に調整することにより液体培地を得、該液体培地にLactococcus lactis subsp. Lactisに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種し、ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用し、pHコントローラーによりpH値を5.5に保持し、更に文献1記載の濾過培養法、即ち、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液量と同体積の新鮮な前記液体培地をジャーファーメンターに供給する連続培養を行った。その際、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーを用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養に移行後、前記液体培地をジャーファーメンターに供給して培養液のグルコース濃度を0.01、0.1、1.0、5.0、及び10.0g/Lに保持して、それぞれ別々に連続培養を行った。その結果、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を0.1、1.0、5.0、及び10.0g/Lに維持した場合には、培養液中のグルコース濃度を0.01g/Lに維持した場合に比べて、培養液中のナイシン濃度が飛躍的に高まることが明らかになった。このことから、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を0.1g/L以上に維持することにより、極めて高濃度のナイシンを含有する培養液を連続的に生産することが可能となることが判明した。
【００２６】
そこで、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、従来のMRS培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２７】
また、上記米焼酎蒸留残液の液体分（B）を使用して【００２５】に述べた手法で実験を行ったところ、上記大麦焼酎蒸留残液の液体分を使用した場合と同様に、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を0.1g/L以上に維持することにより、極めて高濃度のナイシンを含有する培養液を連続的に生産することが可能となることが判明した。そこで、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（B）からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、従来のMRS培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２８】
また、前記培地として、前記大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の一部を米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)で置き換えたものからなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。その結果、該発酵生産物のナイシン濃度は、従来のMRS培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２９】
この他に、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着画分とし、前記液体分(A)を前記非吸着画分を含有するものにした液体分(A')と、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着画分とし、前記液体分(B)を前記非吸着画分を含有するものにした液体分(B')を用意し、前記液体分(A')を使用しBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したもの、及び前記液体分(A')及び前記液体分(B')を使用しBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを夫々培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、いずれの発酵生産物のナイシン濃度も従来のMRS培地を使用することにより得られる発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を10名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００３０】
【実施態様例】
以下、本発明の好ましい実施態様例について述べるが、本発明は、これらの実施態様例によって何ら制限されるものではない。本発明は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより液体分(A)を得る工程（イ）、前記液体分(A)を水で希釈してそのBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整する工程（ロ）、前記工程（ロ）で得られるものに糖を添加して培地を得る工程（ハ）、及び前記培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う工程（ニ）を有することを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供する。工程（イ）においては、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(A)の一部を、米を原料とする焼酎の製造において副生する米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分(B)で置き換えてもよい。また、前記液体分(A)及び／又は前記液体分(B)の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着分離処理に付して得られる非吸着画分にしてもよい。工程(ニ)における培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことができる。
【００３１】
本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液は、大麦又は精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹、及び蒸麦中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、酵母によるアルコール発酵に付して熟成もろみを得、該熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、大麦焼酎の蒸留残液を意味する。また、米焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として大麦を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液に包含される。
前記大麦焼酎蒸留残液を得るに際して、大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（Aspergillus kawachii）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspergillus awamori）及び清酒製造等で使用する黄麹菌(Aspergillus oryzae）などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００３２】
本発明において使用する米焼酎蒸留残液は、米を原料として米麹及び蒸米を製造し、得られた米麹、及び蒸米中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、更に酵母によるアルコール発酵に付して熟成もろみを得、該熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、米焼酎の蒸留残液を意味する。また、大麦焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として米を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において使用する米焼酎蒸留残液に包含される。
前記米焼酎蒸留残液を得るに際して、米焼酎の製造に用いる米麹は、通常の米焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に米焼酎製造で使用する白麹菌（Aspergillus kawachii）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspergillus awamori）及び清酒製造等で使用する黄麹菌(Aspergillus oryzae）などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また米焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００３３】
工程（イ）において、大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る理由は、該大麦焼酎蒸留残液から原料大麦及び大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣を除去して液体分のみを使用することにある。前記固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いた固液分離処理を行い、前記液体分を得る。
【００３４】
工程（イ）において、米焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る理由は、該米焼酎蒸留残液から原料米及び米麹由来の水不溶性の発酵残渣を除去して液体分のみを使用することにある。前記固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いた固液分離処理を行い、前記液体分を得る。
【００３５】
前記液体分(A)及び／又は前記液体分(B)を合成吸着剤を用いる吸着分離処理に付すことにより非吸着画分にするのは、該液体分に含まれる雑味を呈する成分を除去することを目的として行うものである。前記合成吸着剤の好適な具体例としては、オルガノ（株）製のアンバーライトXAD-4、アンバーライトXAD-16、アンバーライトXAD-1180及びアンバーライトXAD-2000、三菱化学（株）製のセパビーズSP850及びダイヤイオンHP20等の芳香族系（又はスチレン系とも言う）合成吸着剤、オルガノ（株）製のアンバーライトXAD-7、及び三菱化学（株）製のダイヤイオンHP2MG等のメタクリル系（又はアクリル系とも言う）合成吸着剤を挙げることができる。これらの他、場合によっては三菱化学（株）製のセパピーズSP207等の芳香族系修飾型合成吸着剤を用いることができる。このようにして得られる前記非吸着画分は、前記液体分の少なくとも一部に代えて使用することができる。
【００３６】
工程（ロ）において、工程（イ）から供給される前記液体分(A)〔前記液体分(A)の非吸着画分を包含する〕及び前記液体分(B)〔前記液体分(B)の前記非吸着画分を包含する〕の夫々のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整するのは、ナイシン生産能を有する乳酸菌のナイシン生産性に適した培地成分濃度に調整することを目的として行うものであり、これによりナイシンの生産性を高めることができる。前記Brix濃度は、2.0乃至4.0の範囲に調整するのがより好ましい。即ちこの場合、ナイシン生産性の顕著な向上を図ることができる。
【００３７】
工程（ハ）において添加する前記糖の好ましい具体例としては、グルコース、キシロース、スクロース、フラクトース、マルトース、リボース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、セロビオース、サッカロース、及びトレハロースを挙げることができる。前記液体培地の糖濃度は、使用する糖の種類により異なるが、一般的には、5乃至70g/Lの範囲である。これらの糖の中、グルコースが特に好ましく、その場合のグルコース濃度は、5乃至70g/Lの範囲に設定するのが好ましい。
【００３８】
工程（ニ）で使用する前記ナイシン生産能を有する乳酸菌は、ナイシン生産能を有する菌株であればいかなるものでも良く、特にLactococcus lactis subsp. Lactisに属する乳酸菌が好ましい。具体的には、生産するナイシンがナイシンAである場合の菌株として、Lactococcus lactis NCDO497、Lactococcus lactis NIZO R5、Lactococcus lactis ATCC 7962及びLactococcus lactis ATCC11454を好ましいものとして挙げることができる。また、生産するナイシンがナイシンZである場合の菌株として、Lactococcus lactis NIZO 22186、Lactococcus lactis NRRL-B-18583、Lactococcus lactis NCFB2118、Lactococcus lactis NCFB2054、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactis NIZO 221186、Lactococcus lactis IO-1(JCM7638)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM11181)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 7B(JCM11182)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 8B(JCM11183)、及びLactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 9B(JCM11184)、を好ましいものとして挙げることができる。
【００３９】
工程（ニ）における培養を、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つ培養液のpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行う工程は、回分培養方式或いは連続培養方式で行うことができる。この他、流加培養方式を採用することができる。前記培養液のpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御するに際しては、上述したように、培養槽にpH測定用複合ガラス電極を装着し、pHメーターで測定し、実側pH値が設定pH値よりも低くなった時に、pHコントローラー等を用いて水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を培養槽に供給することにより、設定pH値に保持することができ、好ましくはpH値5.0乃至6.5の範囲に調整する。尚、前記所定のpH値の変動範囲は0.1以下にすることが好ましい。工程（ニ）において、前記培養液の糖濃度（グルコース濃度）を少なくとも0.1g/L以上に制御するに際しては、前記培養を連続培養方式または流加培養方式で行う場合には、グルコースアナライザー等を使用して制御することができる。当該工程においてはグルコースの他に酵母エキスやポリペプトンからなる窒素源を含有する基質溶液又は上記液体製培地からなる基質溶液を培養槽に供給することにより行うことができ、これにより培養工程にある液体培地のグルコース濃度を所望の値に保持することができる。当該グルコース濃度は少なくとも0.1g/L以上とするが、好ましくは1.0g/L以上に保持することによりナイシン生産能を有する乳酸菌の活性及び比ナイシン生産速度を高い値に維持することができる。前記培養を行う際の培養温度は、使用する乳酸菌の生育に最適な温度に設定すればよく、一般的には20乃至40℃の範囲、好ましくは25乃至37℃の範囲とする。攪拌速度は10乃至1000rpm、好ましくは50乃至300rpmが好適である。
【００４０】
工程（ニ）における培養を連続培養方式で行う場合には、上述の培養条件に従って培養を開始し、菌体濃度が上昇して、対数増殖期の後期に到達した段階で連続培養に移行する。該連続培養法においては、培養槽にpH測定用複合ガラス電極を装着し、pHメーターで測定し、実側pH値が設定pH値よりも低くなった時に水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を培養槽に供給することにより、該設定pH値に保持することができる。この際、培養槽に供給された前記液体培地又はアルカリ溶液と同量の除菌液を限外濾過膜或いは精密濾過膜等を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持することができる。また、前記pH制御とは別に、培養槽にプロセスオンライン濁度計プローブを装着し、その出力をDDCコントローラーに入力し、培養槽に供給した滅菌水又は液体培地と同量の培養液（菌体を含む）を培養槽から抜き出すことにより、培養槽の濁度制御を行い、培養液中の菌体濃度及び培養液液量を一定に保持することができる。該菌体濃度は4.0乃至18.0g/Lの範囲、好ましくは8.0乃至15.0g/Lの範囲に設定する。培地の希釈率は培養液の菌体濃度及びナイシン生産速度等により任意の値に設定することができ、一般的には0.1乃至2.0hr-1の範囲とするが、好ましくは0.2乃至1.2hr-1の範囲とする。
【００４１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４２】
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（70%精白）を用いた。
〔大麦麹の製造〕
大麦を40%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、大麦トンあたり1kgの種麹（白麹菌）を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間保持することにより、大麦麹を製造した。
〔蒸麦の製造〕
大麦を40%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷することにより、蒸麦を製造した。
〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕
1次仕込みでは前述の方法で製造した大麦麹（大麦として3トン）に、水3.6キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg（湿重量）を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵（1段目の発酵）に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4キロリットル、前述の方法で製造した蒸麦（大麦として7トン）を加えて11日間の発酵（2段目の発酵）に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎10キロリットルと大麦焼酎蒸留残液15キロリットルを得た。得られた大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
【００４３】
以下の実施例に供する目的で米焼酎の製造を行った。原料としては、精米（70%精白）を用いた。
〔米麹の製造〕
米麹の製造は米を35%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、米kg当り1g量の白麹菌を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間で行った。
〔蒸米の製造〕
蒸米は米を35%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷することにより、蒸米を製造した。
〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕
1次仕込みでは前述の方法で製造した米麹（米として3トン）に、水3.6キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg（湿重量）を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵（1段目の発酵）に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4キロリットル、前述の方法で製造した蒸米（米として7トン）を加えて15日間の発酵（2段目の発酵）に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、米焼酎10キロリットルと米焼酎蒸留残液15キロリットルを得た。得られた米焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
【００４４】
【実施例１】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1.で得た乳酸菌培養用培地500mlと上記2.で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００４５】
【比較例１】
1．MRS培地の調製
MRS培地（ペプトン1重量%、肉エキス1重量%、酵母エキス0.5重量%、K2HPO40.2重量%、クエン酸二アンモニウム0.2重量%、グルコース3.6重量%、Tween80 0.1重量%、酢酸ナトリウム0.5重量%、MGSO4・7H2O 0.058重量%、MnSO4・4H2O 0.028重量%）を、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1.で調製したMRS培地500mlと上記2.で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００４６】
【実施例２】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００４７】
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。4．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに上記1で得た乳酸菌培養用培地1800mlと上記3で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後8時間目に培養液のグルコース濃度が4g/Lに達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記2で得たグルコース濃度調整用基質溶液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液の量と前記グルコース濃度調整用基質溶液の量の総和量と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００４８】
【比較例２】
1．MRS培地の調製
MRS培地（ペプトン1重量%、肉エキス1重量%、酵母エキス0.5重量%、K2HPO40.2重量%、クエン酸二アンモニウム0.2重量%、グルコース3.6重量%、Tween80 0.1重量%、酢酸ナトリウム0.5重量%、MGSO4・7H2O 0.058重量%、MnSO4・4H2O 0.028重量%）を、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用MRS培地を得た。
2．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに上記1.で得た乳酸菌培養用培地1800mlと上記3で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後12時間目に培養液のグルコース濃度が0.1g/L未満に達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を0.1g/L未満に保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、基質溶液（グルコース1重量%、酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%、NaCl0.5重量%）を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を0.1g/L未満に保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液及び前記基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００４９】
【実施例３】
実施例２で使用したLactococcus lactis IO-1に代えて、Lactococcus lactis NIZO 22186、Lactococcus lactis NRRL-B-18583、Lactococcus lactis NCFB2118、Lactococcus lactis NCFB2054、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactis NIZO 221186、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM11181)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 7B(JCM11182)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 8B(JCM11183)、及びLactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 9B(JCM11184)、を使用した以外は、全て実施例2と同様にして連続培養を行った。
【００５０】
【比較例３】
比較例2で使用したLactococcus lactis IO-1に代えて、Lactococcus lactis NIZO 22186、Lactococcus lactis NRRL-B-18583、Lactococcus lactis NCFB2118、Lactococcus lactis NCFB2054、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactis NIZO 221186、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM11181)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 7B(JCM11182)、Lactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 8B(JCM11183)、及びLactococcus lactis subsp. Lactis A. Ishizaki Yasaka 9B(JCM11184)、を使用した以外は、全て比較例2と同様にして連続培養を行った。
【００５１】
【実施例４】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約3倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該充填カラムから溶出してきた当該合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈そのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、次いで水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整した後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
3．乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た乳酸菌培養用培地500mlと上記2で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００５２】
【実施例５】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約3倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該カラムから溶出してきた前記合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約3倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該カラムから溶出してきた前記合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
【００５３】
4．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに上記1.で得た乳酸菌培養用培地1800mlと上記3で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後8時間目に培養液のグルコース濃度が4g/Lに達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記2で得たグルコース濃度調整用基質溶液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００５４】
【実施例６】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
3．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
4．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た乳酸菌培養用培地250ml、上記2で得た乳酸菌培養用培地250ml、及び上記3で得た乳酸菌前培養液25mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、培養時間24時間、pH5.5の条件で回分培養を行った。
【００５５】
【実施例７】
1．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
2．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
3．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
米焼酎製造の蒸留工程で得られた前記米焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して米焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をBrix4に調整し、グルコースを3.6重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
4．米焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのBrix濃度を4に調整し、グルコースを1.0重量%添加し、水酸化ナトリウムを用いてpH5.5に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００５６】
5．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Lactococcus lactis IO-1の保存株50μlを10mlのTGC 培地に接種し、37℃で18時間静置培養することにより培養液を得、該培養液10mlをCMG培地100mlに接種し、37℃で3時間、100rpmで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
6．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、3L容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記3L容ジャーファーメンターに、上記1で得た乳酸菌培養用培地900ml、上記3で得た乳酸菌培養用培地900ml、及び上記5で得た乳酸菌前培養液90mlを導入し、攪拌速度250rpm、培養温度30℃、pH5.5の条件で回分培養に付し、培養開始後8時間目に培養液のグルコース濃度が4g/Lに達した時点で、pH制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養開始後42時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記pH制御は、pHセンサーを使用して、5N水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してpH5.5に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーBF-410（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記2で得たグルコース濃度調整用基質溶液と前記4で得たグルコース濃度調整用基質溶液を1:1の割合で混合することにより得た混合液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持することにより行った。また、前記pH制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記5N水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス0.5重量%、ポリペプトン0.5重量%）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００５７】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得た発酵生産物のそれぞれを以下の試験例１に供し、該発酵生産物のナイシン濃度を測定した。
【００５８】
【試験例１】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得たそれぞれの発酵生産物を9000rpm、30minの条件で遠心分離に付すことにより該発酵生産物の上清1を得、それぞれの発酵生産物の上清1に濃塩酸を加えてpH3.0に調整後、4℃で一晩放置し、再度9000rpm、30minの条件で遠心分離に付すことによりそれぞれの発酵生産物の上清2を得、得られたそれぞれの発酵生産物の上清2を試料として以下の方法に従って、培養液のナイシン濃度を測定した。即ち、指標菌としてMicrococcus luteus(IFO N0.3333)を用い、ナイシン(ICN製)を3000IU/mlとなるように0.01N HClに溶解したものをナイシンA標準液として用いた。前記指標菌をLB液体培地10mlに一白金耳接種し、培養温度30℃、攪拌速度100rpm、培養時間18時間の条件で振とう培養を行い培養液を得、該培養液100μlを適温まで冷ましたソフトアガー2.0mlに懸濁して懸濁液を得、該懸濁液をLB寒天培地上に重層して1時間放置後、0.01N HClで適当な濃度に希釈した前記発酵生産物上清2を該LB寒天培地上に10μlづつスポットし、30℃で24時間培養後、スポット箇所周辺の増殖阻害を起こした生育阻止円の有無を確認し、該生育阻止円が現れる時の試料の最大希釈率Dを求め、ナイシン抗菌活性(AU/ml)=1/D×試料添加量(ml)の関係式からナイシン抗菌活性値を算出した。
【００５９】
【評価１】
実施例1及び比較例1において培養開始後24時間目に得たそれぞれの発酵生産物のナイシン抗菌活性値を表1に示す。表1に示す結果から以下のことが判明した。即ち、培養開始後24時間目のナイシン抗菌活性値は、比較例1で得た発酵生産物は1200IU/mlと低い値であったのに対して、実施例1で得た発酵生産物は4500IU/mlと極めて高い値を示した。即ち、大麦焼酎蒸留残液から得た前記乳酸菌培養用培地を使用する本発明のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、MRS培地を使用する従来のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値の約3.8倍に達することが判明した。
実施例2及び比較例2の連続培養におけるナイシン抗菌活性値を表2に示す。表2に示す結果から以下のことが判明した。即ち、ナイシン抗菌活性値は、比較例2においては、回分培養から連続培養に移行した培養開始後12時間目において最大値を示した後は漸減し、培養開始後42時間目には1000IU/mlとなったのに対して、実施例2においては、回分培養から連続培養に移行した培養開始後12時間目において極大値を示した後、24時間目までは減少したが、24時間目以降は再び上昇し、培養開始後42時間目には6300IU/mlに達した。即ち、大麦焼酎蒸留残液から得た前記乳酸菌培養用培地を使用し、且つ連続培養時の培養液のグルコース濃度を4g/Lに保持して培養を行う本発明のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、MRS培地を使用し、且つ連続培養時の培養液のグルコース濃度を0.1g/L未満に保持して培養を行う従来公知のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値の6.3倍に達することが判明した。
実施例3及び比較例3の結果からは以下のことが判明した。即ち、実施例3においてナイシン生産能を有する各種乳酸菌菌株を連続培養に付すことにより得られるそれぞれの発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、いずれの菌株を使用した場合であっても、比較例3に示す従来公知のナイシンの製造方法を採用した場合よりも顕著に高い値を示した。
【００６０】
実施例4及び実施例5の結果からは以下のことが判明した。即ち、本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の代わりに、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる前記文献6に記載の非吸着性画分からなる溶液を使用した場合、実施例4及び実施例5において得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、実施例1及び実施例2のそれぞれにおいて得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値と同等であることが判った。
【００６１】
実施例6及び実施例7の結果からは以下のことが判明した。即ち、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の混合物を培地に使用した場合の実施例6及び実施例7において得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、実施例1及び実施例2のそれぞれにおいて得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値と同等であることが判った。
【００６２】
【試験例２】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得た発酵生産物のそれぞれを呈味性について官能試験に供した。即ち、実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得た発酵生産物のそれぞれを10名のパネラーによる官能試験に付し、該発酵生産物の呈味性を評価した。
【００６３】
【評価２】
実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7、比較例1及び比較例2で得たそれぞれの発酵生産物の官能試験結果を表3に示す。表3に示す結果から以下のことが判明した。即ち、比較例1及び比較例2で得たそれぞれの発酵生産物は極めて単調な香味と好ましくない雑味を有することから官能評価の値が極めて低かったのに対して、実施例1、実施例2、及び実施例4乃至実施例7で得た発酵生産物は、いずれも、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味を呈することから官能評価の値が顕著に高く、調味料あるいは食品素材として好適であることが判明した。そして上記パネラーのコメントから、実施例1、実施例2、実施例4乃至実施例7で得た発酵生産物の中で、実施例4及び実施例5で得た発酵生産物は、いずれも特に際立ったまろやかな香味を呈するという特徴を有し、実施例6及び実施例7で得た発酵生産物は、いずれも、実施例1及び実施例2で得た発酵生産物よりも更に味わいのある豊かな旨味を呈するという特徴を有していることが明らかになった。
【００６４】
以上の結果から、本発明によれば、従来公知のナイシンの製造方法と比較してナイシン生産性を飛躍的に高めることが可能であることが理解される。また、本発明よって得られる発酵生産物は、ナイシンを著量含有し、優れた抗菌活性に加えて、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味を呈することから、食品として極めて好適に使用できる。
【００６５】
【表１】
【表２】
【表３】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明のナイシンを含有する発酵生産物の製造方法は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（A）からなり、Brix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に制御し且つそのpH値を4.0乃至7.0の範囲に制御しながら行うことを特徴とし、ナイシンを著量含有する発酵生産物の効率的製造を可能にする。そして、得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として好適に使用することができる。
Claims (6)
- 微生物を培養してナイシン含有発酵生産物を製造する方法であって、微生物としてナイシン生産能を有する乳酸菌を用いること、該乳酸菌を培養する培地として大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分そのものを使用すること、該液体分そのものの使用に際し、該液体分のBrix濃度を0.5乃至6.0の範囲に調整しそれに糖を添加することを特徴とするナイシン含有発酵生産物の製造方法。
- 前記微生物の培養が、前記糖を添加した培地に前記乳酸菌を加え、培養液の糖濃度を少なくとも0.1g/L以上に、かつ、そのpH 値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行われることを特徴とする請求項１のナイシン含有発酵生産物の製造方法。
- 前記液体分のBrix濃度の調整は、液体分を水で希釈することにより行う請求項１または２のナイシン含有発酵生産物の製造方法。
- 前記液体分そのものの使用に際し、液体分の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して非吸着画分としてから、Brix濃度の調整を行う請求項１、２または３のナイシン含有発酵生産物の製造方法。
- 前記合成吸着剤は、芳香族系、芳香族系修飾型、及びメタクリル系の合成吸着剤よりなる群より選ばれるものである請求項４のナイシン含有発酵生産物の製造方法。
- 前記培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことを特徴とする請求項１または２のナイシン含有発酵生産物の製造方法。
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