JP3657515B2 - ウイルスエンベロープ蛋白中のエピトープおよびこれらのエピトープに対して指向された特異的抗体：宿主組織中のｈｃｖウイルス抗原の検出のための使用 - Google Patents
ウイルスエンベロープ蛋白中のエピトープおよびこれらのエピトープに対して指向された特異的抗体：宿主組織中のｈｃｖウイルス抗原の検出のための使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＣＶのＥ１およびＥ２蛋白の特異的エピトープに対して指向された抗体を用いて宿主組織中のウイルス抗原を検出することができるという知見に基づく。
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は先進国および発展途上国の両方における大きな健康上の問題である。世界の人口の約１ないし５％が当該ウイルスにかかっていると見積もられる。ＨＣＶ感染は輸血に関連した肝炎の最も重要な原因と思われ、しばしば、慢性の肝臓障害に進行する。そのうえ、ＨＣＶが肝細胞癌腫の誘導に関与している証拠がある。したがって、信頼できる診断方法および有効な治療薬に対する要求が大きい。また、ＨＣＶに汚染された血液製品に関する高感度かつ特異的なスクリーニング方法ならびにＨＣＶの培養方法も必要である。
【０００３】
ＨＣＶは、少なくとも３つの構造蛋白および６つの非構造蛋白をコードする約９４００個の塩基からなるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。配列相同性に基づいて、構造蛋白は機能的に１つの単一コア蛋白および２つのエンベロープ蛋白Ｅ１およびＥ２に帰属されている。Ｅ１蛋白は１９２個のアミノ酸からなり、ＨＣＶ遺伝子型に応じて５ないし６個のＮ−糖鎖付加部位を含む。Ｅ２蛋白はＨＣＶ遺伝子型に応じて９ないし１１個のＮ−糖鎖付加部位を含む３６３ないし３７０個のアミノ酸からなる（調査するにはMajor and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997参照）。Ｅ１蛋白は種々の可変ドメインを含むが、Ｅ２蛋白は２個の超可変ドメインを含み、その主要ドメインは蛋白のＮ末端に存在している（Maertens and Stuyver, 1997）。エンベロープ蛋白は、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞において組換え法により生産されている。高等真核細胞の発現系、特に哺乳動物細胞培養の使用は優れた品質のエンベロープ蛋白を生じ、すなわち、それらの蛋白はは、Maertensらに付与されたＰＣＴ／ＥＰ９５／０３０３１に記載されたように元の試料中の抗体により効果的に認識されるものである。
【０００４】
現在、細胞または組織中のＨＣＶの検出は、主としてウイルスＲＮＡが示されることによっている。しかしながら、細胞または組織におけるＲＮＡの検出は、ＲＮＡ抽出後に逆転写またはネステッドＰＣＲを用いるかあるいはin situ ＲＴ−ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションを用いる煩わしい方法である。また、これらの手法は擬陽性を生じやすいので、ウイルスＲＮＡの検出はもっぱら血清試料について行われている。血清および組織試料中のウイルス蛋白抗原の信頼できる検出方法は依然として存在しない。
【０００５】
ＨＣＶの複製部位はまだ十分に解明されていない。当該ウイルスは肝細胞中で複製するということが一般的に受け入れられているが、リンパ組織のごとき他の組織中での複製についてはまだかなり議論の余地がある。それゆえ、細胞中のウイルス蛋白またはウイルス自体を検出するための信頼できる方法により、この問題が解決されるかもしれない。
【０００６】
細胞中のウイルス蛋白の検出は、ウイルス蛋白に特異的に結合し、天然のＨＣＶ蛋白抗原（すなわち、ＨＣＶ感染後に宿主により発現される抗原）を特異的に認識しうる抗体が無かったことにより妨げられていた。結果として、現在に至るまで、宿主細胞中のウイルスＨＣＶ蛋白の存在を示すことに関連した研究はごくわずかしかなかった（調査するにはGuido and Thung, 1996参照）。そのうえ、宿主由来の抗体はこれらの研究の多くに使用されていた。しかしながら、宿主由来の抗体を含む調合物は容易に再生産できず、これらの調合物は自己免疫抗体ならびに他の既知もしくは未知抗原に対する抗体により汚染される可能性がある。対照的に、組み換え抗体で免疫した動物において産生された抗体は所望の特異性を有することが知られている。再生産可能な品質を得るためにはモノクローナル抗体も同様に好ましい。さらに、良好な品質の抗原を得るためには、ＨＣＶのエンベロープ蛋白は哺乳動物発現系により産生される必要がある。現在、この発現条件は理解できない問題を含んでいる。それゆえ、患者の組織標本中のＨＣＶエンベロープ抗原を検出するのに使用できたモノクローナル抗体はごくわずかしか記載されていない。これらの抗体はＥ１のＮ末端領域、すなわちアミノ酸（ａａ）１９２−２２６（Hiramatsu et al., 1992; Kaito et al., 1994）、あるいはＥ２のＣ末端ドメイン、すなわちａａ ４５１−７１５（Sansonno et al., 1997a, 1997b）に指向されていた。しかしながら、これらの刊行物ならびにGuidoおよびThung (1996)によるレビューおよびLiang (1996)によるレビューから、血清および組織試料中の天然ＨＣＶ蛋白抗原の効果的かつ常套的な検出を可能にする十分に特徴づけられた抗体に対する必要性がやはりあるということが明らかである。この必要性は、Driesおよび共同研究者(1999)による研究によって、最近確認された。Driesのグループは、肝臓生検試料においてＨＣＶ ＲＮＡを検出することができたので、ＨＣＶ抗体陽性で血清ＲＮＡ陰性である個体の６１％がＨＣＶのキャリヤであることを証明したが、抗体のパネルを用いる免疫組織化学によればこれらの症例の３分の１が検出可能であるに過ぎなかった。よって、肝臓生検におけるＨＣＶ抗原の常套的な検出はやはり感度不足である。また、血清または血漿のごとき体液中のウイルス抗原の検出は同じ問題により妨げられている。現在に至るまで、これらの体液中のコア抗原の検出を可能にする手法はわずかに１つだけ記載されているに過ぎない。しかしながら、その方法では、コア蛋白を検出するためには試料中に存在するコア蛋白を水酸化ナトリウムを用いて完全に変性させることを必要とする（Kashiwakuma et al., 1996）。
【０００７】
それゆえ、まとめると、抗体にアクセス可能で、組織または体液試料中の抗体の検出を可能にする新たな特異的ＨＣＶエピトープの同定が緊急に必要である。ＨＣＶエンベロープ蛋白は、かかるエピトープを見出すための候補標的と推定される。なぜなら、これらの蛋白はすべての生物学的試料：体液、ウイルス膜上、ならびに感染初期段階（すなわち、ウイルス侵入段階）から完全な複製サイクルに至るまでの細胞に存在するはずだからである。しかしながら、これらのエンベロープ蛋白は非常に変化しやすいので、異なる遺伝子型のＨＣＶに対して高い交差反応性を有する抗体が必要である。よって、かかるエピトープの同定およびＨＣＶの配列変種に対して高い交差反応性を有する抗体の検索について検討すべきである。
【０００８】
本願は、ＨＣＶのエンベロープ蛋白中の特定のエピトープに対して指向される特異的モノクローナル抗体に関し、該抗体は患者の組織標本中のＨＣＶ抗原を検出しうるものである。全部で２つのかかるエピトープ、および対応抗体が見出された。それらのうち１つはエンベロープ蛋白Ｅ１のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）中にあり、もう１つはＥ２のＮ末端超可変領域（ＨＶＲ）（ａａ３８４−４５０）中にある。後者の領域、より詳細には領域３９５−４１５は超可変領域であると考えられているが、驚くべきことに我々は、Ｅ２のＨＶＲの種々の既知配列と反応する抗体を特徴づけた。
【０００９】
発明の目的
ＨＣＶに関する信頼できる診断方法、信頼できるワクチンおよび有効な治療薬を緊急に開発する必要があることは、文献から明らかである。また、ＨＣＶが混入した血液製品の高感度かつ選択的なスクリーニング法ならびにＨＣＶを培養するための改良された方法が必要である。動物またはインビトロ法において、あるいはその天然宿主においてウイルスを検出できる新たな抗体は、有効な診断ツールおよび治療薬の設計を促進する可能性がある。この点において、本発明は、種々の組織または細胞におけるＨＣＶ抗原の検出に使用できる、Ｅ１またはＥ２−ＨＶＲに対して指向されたモノクローナル抗体に関する驚くべき知見に基づく。これらの組織は肝臓のみならず、血液試料由来の細胞も包含する。それゆえ、本発明は、Ｅ１蛋白の主要部分（Ｃ末端）、およびＥ２蛋白のＮ末端領域をカバーするＨＣＶエンベロープ蛋白領域ａａ２２７−４５０に特異的に結合する抗体の提供および使用を目的とする。これらの抗体は天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出を可能にし、天然ＨＣＶ蛋白抗原検出キットの製造に使用できる。完全なＥ１蛋白がａａ１９２−３８３に対応し、完全なＥ２蛋白がａａ３８４−７４７に対応することが明らかとなっている（Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997参照）。
【００１０】
より詳細には、本発明は、以下のエピトープ：
ＨＣＶ Ｅ１蛋白のａａ３０７−３２６（配列番号：３０）
ＨＣＶ Ｅ２蛋白のａａ３９５−４１５（配列番号：３１）
の少なくとも１つに特異的に結合する、上で定義した抗体の提供および使用を目的とする。
【００１１】
そのうえ、本発明は、モノクローナル抗体である上で定義した抗体の提供および使用を目的とする。この点において、本発明は、受託番号９８０３１２１５または９８０３１２１４としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の提供および使用を目的とする。
【００１２】
本発明は、上で定義した抗体の機能的に等価な変種またはフラグメント、ならびにそれらの変異体、あるいは配列番号：３０および３１との同様の反応性を示す分子（ファージまたは他のライブラリーから得られるような）の提供および使用を目的とする。
さらに、本発明は、ＨＣＶ蛋白抗原の検出を可能にし、天然ＨＣＶ蛋白抗原検出キットの製造に使用できる、ＨＣＶ Ｅ１蛋白（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２ Ｎ末端超可変領域（ａａ３８４−４５０）に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の提供および使用を目的とする。より詳細には、本発明は、受託番号９８０３１２１５または９８０３１２１４を有するＥＣＡＣＣ寄託物に対応するハイブリドーマ細胞系の提供および使用を目的とする。
【００１３】
さらにそのうえ、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法を提供し、該方法は、
ＨＣＶ蛋白抗原を含む可能性のある試験試料を、上で定義した抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントと接触させて抗体−抗原複合体を形成させ、次いで、
該抗原−抗体複合体を適当なマーカーを用いて調べる
ことを含む。
【００１４】
より詳細には、本発明は、上で定義した方法であって、該試験試料が末梢血液細胞のごときヒト細胞、または肝臓組織のごときヒト組織を含むものである方法を提供することを目的とする。
【００１５】
最後に、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原を検出するためのアッセイキットの提供を目的とし、該キットは
上で定義した抗体、または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメント、および
試験試料中のＨＣＶ蛋白抗原と該抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントとの間に形成される複合体を調べることのできる適当なマーカー
を含む。
本発明のすべての目的は、後で示す具体例に合致したものと考えられる。
【００１６】
表の簡単な説明
表１は、本願のすべてのペプチドの配列を示す。
表２は、Ｅ２中の超可変ドメインの種々の配列に対するＩＧＨ ２２２の交差反応性を示す。すべてのペプチドをビオチン化し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに結合し、ＩＧＨ ２２２と反応させた。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書記載の本発明は、すでに公表された研究および係属中の特許出願に源を発するものである。例えば、かかる研究は科学文献、特許または係属中の特許出願からなる。すでに引用され、あるいは以下に引用されるこれらの刊行物および出願のすべてを、参照により本明細書に一体化させる。
【００１８】
ウイルス蛋白に特異的に結合し、天然ＨＣＶ蛋白抗原（すなわち、ＨＣＶ感染後に宿主により発現される蛋白抗原）を認識できる抗体の欠如によりウイルス蛋白の検出が妨げられてきたことは明らかである。本発明は、ＨＣＶエンベロープ蛋白上の２つの新たなエピトープを見出したことに基づくものであり、これらのエピトープに対して指向された抗体を用いることにより、それらは宿主由来の生物学的試料中の天然ＨＣＶ蛋白抗原を常套的に検出することを可能にするものである。よって、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白検出キットの製造のためのＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）に特異的に結合する抗体の使用に関する。用語「ＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）に特異的に結合する抗体」は、Ｃ型肝炎ウイルス粒子または該ウイルス粒子由来の分子に、より詳細にはＥ１蛋白のＣ末端領域およびＥ２蛋白のＮ末端領域に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体をいう。ＨＣＶウイルスの「エンベロープ領域」、および「ＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）」は当業者によく知られた領域である（Wengler, 1991; Major and Feistone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997）。
【００１９】
用語「結合」は、本発明抗体が物理的にＨＣＶ蛋白に連結されることを示す。詳細には、抗体がＨＣＶエンベロープ蛋白に特異的に結合することを示し、ＨＣＶの他の成分または他の蛋白との交差反応が実質的にないことを意味する。結合、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ型のアッセイまたは競合アッセイのごとき当該分野で知られた方法またはアッセイキットにより、ＨＣＶ蛋白への抗体の結合を示すことができる（例えば、Current protocols in immunology参照）。抗体に結合するＨＣＶエンベロープ蛋白の領域は連続した配列から構成されている必要はないことが明らかなはずである。
【００２０】
本明細書の用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。該用語は抗体の種または起源を限定するのもではなく、作成方法により限定されるものでもない。さらに、用語「抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト化抗体および米国特許第４９４６７７８号に記載されたような１本鎖抗体ならびに元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持しているＦab、Ｆ’ (ab)2、Ｆvおよび他のフラグメントのごとき抗体フラグメントをいう。Lorreらの欧州特許出願第９７８７００９２．０に記載されたような、元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持している２価抗体、３価抗体、４価抗体も用語「抗体」に含まれる。本発明の抗体は天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法において使用できることが明らかなはずである。
【００２１】
用語「試験試料」は、血清、血漿、唾液、粘膜、脊髄液または生検のごとき宿主から得られた試料をいう。この点において、用語「試験試料」および「生物学的試料」を混用する。用語「生検」は、特に、細胞含有試料、とりわけヒト細胞含有試料をいう。そのうえ、後者の用語は末梢血細胞のごとき液体組織由来の試料、あるいは肝臓組織のごとき固体組織由来の試料もいう。生検に基づいて抗原検出を行う場合、用語「in situ検出」を使用する。
【００２２】
用語「天然ＨＣＶ蛋白抗原検出キット」は、当業者に知られたいずれかの方法によりＨＣＶ蛋白抗原の検出、好ましくはＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）のそれらの天然または元の位置での検出、好ましくは試験試料中に存在する抗原の検出を行うためのキットをいう。他の場合において、この用語は、本発明の抗体の結合によりＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）のそれらの天然宿主または組織における存在を可視化することをいう。検出キットは以下の成分を含む：
（ｉ）適当な場合には、試験試料の単離手段
（ｉｉ）可能ならば、細胞を透過性にする溶液
（ｉｉｉ）本明細書記載の抗体、あるいはその機能的に等価な変種またはフラグメント
（ｉｖ）可能ならば、二次抗体および三次抗体、
（ｖ）可能ならば、インキュベーションおよび／または洗浄バッファー、
（ｖｉ）可能ならば、染色溶液。
好ましくは、ＨＣＶエンベロープ蛋白のin situでの検出に該キットを使用する。
【００２３】
天然宿主細胞または組織は、いずれの宿主細胞またはいずれの宿主種由来の組織であってもよい。特に、天然宿主細胞は末梢血細胞をいい、天然組織は肝臓組織をいう（本明細書の実施例の部分参照）。天然宿主は、とりわけ、ヒトをいうが、非ヒト霊長類または他の哺乳動物をいうこともある。
より詳細には、本発明は、下記エピトープ：ＨＣＶ Ｅ１蛋白のａａ３０７−３２６およびＨＣＶ Ｅ２蛋白のａａ３９５−４１５の少なくとも１種に特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体は、the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, U.K. (Tel: +44 1980 612512; fax: +44 1980 611315)に１９９８年３月１３日に寄託され、以下の受託番号：９８０３１２１５［（エピトープａａ３９５−４１５（配列番号：３１）に結合するｍＡｂ ＩＧＨ ２２２を分泌するハイブリドーマ１７Ｈ１０Ｆ４Ｄ１０に関して）］ならびに９８０３１２１４［（エピトープａａ３０７−３２６（配列番号：３０）に結合するｍＡｂ ＩＧＨ ２０７を分泌するハイブリドーマ１４Ｈ１１Ｂ２に関して）］を付与されたハイブリドーマにより分泌される。この点において、該エピトープの部分に結合する抗体も本発明の一部であることが明らかなはずである。例えば、それゆえ、下記エピトープ：
aa307-311, aa308-312, aa309-313, aa310-314, aa311-315, aa312-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa307-312, aa308-313, aa309-314, aa310-315, aa311-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa 307-313, aa308-314, aa309-315, aa310-316, aa311-317, aa312-318, aa313-319, aa314-320, aa315-321, aa316-322, aa317-323, aa318-324, aa319-325, aa320-326, aa307-314, aa308-315, aa309-316, aa310-317, aa311-318, aa312-319, aa313-320, aa314-321, aa315-322, aa316-323, aa317-324, aa318-325, aa319-326, aa307-315, aa308-316, aa309-317, aa310-318, aa311-319, aa312-320, aa313-321, aa314-322, aa315-323, aa316-324, aa317-325, aa318-326, aa307-316, aa308-317, aa309-318, aa310-319, aa311-320, aa312-321, aa313-322, aa314-323, aa315-324, aa316-325, aa317-326, aa307-317, aa308-318, aa309-319, aa310-320, aa311-321, aa312-322, aa313-323, aa314-324, aa315-325, aa316-326, aa307-318, aa308-319, aa309-320, aa310-321, aa311-322, aa312-323, aa313-324, aa314-325, aa315-326, aa307-319, aa308-320, aa309-321, aa310-322, aa311-323, aa312-324, aa313-325, aa314-326, aa307-320, aa308-321, aa309-322, aa310-323, aa311-324, aa312-325, aa313-326, aa307-321, aa308-322, aa309-323, aa310-324, aa311-325, aa312-326, aa307-322, aa308-323, aa309-324, aa310-325, aa311-326, aa307-323, aa308-324, aa309-325, aa310-326, aa307-324, aa308-325, aa309-326, aa307-325, aa308-326, ならびに,
aa395-399, aa396-400, aa397-401, aa398-402, aa399-403, aa400-404, aa401-405, aa402-406, aa403-407, aa404-408, aa405-409, aa406-410, aa407-411, aa408-412, aa409-413, aa410-414, aa411-415, aa395-400, aa396-401, aa397-402, aa398-403, aa399-404, aa400-405, aa401-406, aa402-407, aa403-408, aa404-409, aa405-410, aa406-411, aa407-412, aa408-413, aa409-414, aa410-415, aa395-401, aa396-402, aa397-403, aa398-404, aa399-405, aa400-406, aa401-407, aa402-408, aa403-409, aa404-410, aa405-411, aa406-412, aa407-413, aa408-414, aa409-415, aa395-402, aa396-403, aa397-404, aa398-405, aa399-406, aa400-407, aa401-408, aa402-409, aa403-410, aa404-411, aa405-412, aa406-413, aa407-414, aa408-415, aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404-412, aa405-413, aa406-414, aa407-415,aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404-412, aa405-413, aa406-414, aa407-415, aa395-404, aa396-405, aa397-406, aa398-407, aa399-408, aa400-409, aa401-410, aa402-411, aa403-412, aa404-413, aa405-414, aa406-415, aa395-405, aa396-406, aa397-407, aa398-408, aa399-409, aa400-410, aa401-411, aa402-412, aa403-413, aa404-414, aa405-415, aa395-406, aa396-407, aa397-408, aa398-409, aa399-410, aa400-411, aa401-412, aa402-413, aa403-414, aa404-415, aa395-407, aa396-408, aa397-409, aa398-410, aa399-411, aa400-412, aa401-413, aa402-414, aa403-415, aa395-408, aa396-409, aa397-410, aa398-411, aa399-412, aa400-413, aa401-414, aa402-415, aa395-409, aa396-410, aa397-411, aa398-412, aa399-413, aa400-414, aa401-415, aa395-410, aa396-411, aa397-412, aa398-413, aa399-414, aa400-415, aa395-411, aa396-412, aa397-413, aa398-414, aa399-415, aa395-412, aa396-413, aa397-414, aa398-415, aa395-413, aa396-414, aa397-415, aa395-414 および 396-415
に結合する抗体も包含される。
【００２４】
また本発明は、上記抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントにも関する。用語「機能的に等価な変種もしくはフラグメント」は、元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持している、該抗体の当該分野で知られた変種もしくはフラグメントをいう。
【００２５】
より詳細には、この用語は、上記のごとく定義されたヒト化抗体および１本鎖抗体ならびにＦab、Ｆ’ (ab)2、Ｆv等のごとき抗体フラグメントをいう。上記のような２価抗体、３価抗体および４価抗体ならびにそれらの変異形態あるいはLadner, 1995; Maclennman, 1995およびCannon et al., 1996により記載されたファージまたは他のライブラリーから得られるような配列番号：３０および３１に対して類似の機能的結合反応性を示す分子をいう。実際、これらの著者らにより記載されたペプチドは天然のＨＣＶ蛋白抗原の検出を可能にするものであり、本発明の一部である。
【００２６】
また本発明は、上で定義した抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。この点において、本質的にはKohler and Milstein (1975)に準じたｍＡｂを得るためのハイブリドーマ法が当業者によく知られていることは明らかなはずである。ｍＡｂが特異的に結合するエピトープのマッピングを、DeplaらのＰＣＴ／ＥＰ９７／０７２６８に記載された方法のごとき当該分野で知られた方法により行うことができる。
【００２７】
また本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法にも関し、該方法は、
ＨＣＶ蛋白抗原を含む可能性のある試験試料を、上で定義した抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントと接触させて抗体−抗原複合体を形成させ、次いで、
該抗原−抗体複合体を適当なマーカーを用いて調べる
ことを含む。
好ましくは、該方法を、in situでのＨＣＶエンベロープ蛋白の検出に使用する。
【００２８】
用語「該抗体−抗原複合体を適当なマーカーを用いて調べる」は、上記抗原−抗体複合体を検出または可視化する、蛍光フローサイトメトリー、結合、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ型アッセイまたは競合アッセイのごとき当該分野で知られた方法をいう（実施例の部分、Hertogs et al., 1993、およびMehta et alのWO93/04084参照）。同様に、用語「適当なマーカー」は、Mehta et alのWO93/04084およびColigan et al., 1992に記載のマーカーのごとき当該分野で知られたマーカーであって、上記抗原−抗体複合体を可視化させるものをいう。
【００２９】
この点において、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原を検出するためのアッセイキットにも関し、該キットは、上で定義した抗体、または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメント、および試験試料中のＨＣＶ蛋白と該抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントとの間に形成された複合体を調べることを可能にする適当なマーカーを含む。
【００３０】
特に有利な具体例を示す下記実施例を参照することにより本発明を説明する。しかしながら、これらの具体例は単なる説明であって、本発明を限定するものと解してはならない。
【００３１】
実施例
実施例１：Ｅ１およびＥ２に対するモノクローナル抗体の取得
MaertensらのＰＣＴ／ＥＰ９５／０３０３１に記載されたように、組み換えワクシニアウイルスにより発現されたＥ１の末端切断バージョン（ａａ１９２−３２６）およびＥ２の末端切断バージョン（ａａ３８４−６７３）でマウスを免疫した。免疫後、マウスの脾臓細胞をミエローマ細胞系と融合させた。Ｅ１またはＥ２に対して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマをＥＬＩＳＡにより選択した。
【００３２】
実施例２：モノクローナル抗体の選択
Ｅ１またはＥ２に対して指向された広範なモノクローナル抗体（全部で２５種、そのうち１４種について詳細を調べた；これら１４種はInnogenetics NV, Gent, Belgiumから得た）を、ＨＣＶ患者の肝臓生検および対照（下記参照）において天然ＨＣＶ抗原の染色に関して評価した。凍結切片またはホルムアルデヒド固定生検のいずれかに対して染色を行った（プロトコールに関しては、図面のリジェンド参照）。３つのモノクローナル抗体のみが明確かつ特異的な染色を示した。他のすべてのモノクローナル抗体は染色を示さないかまたは弱い染色を示し、あるいは非特異的染色を示した。２種の異なる抗原染色パターンが明確に観察された。Ｅ２に指向されたモノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２は肝細胞を明確に染色したが（図１）、Ｅ１に指向されたＩＧＨ ２０７およびＩＧＨ ２１０は肝臓中に浸潤したリンパ球を染色した（図２ａおよび２ｂ）。ＩＧＨ ２０７は肝細胞も染色したが、ＩＧＨ ２２２よりも程度が弱かった（図１と２ａとを比較）。この染色パターンは、５人の異なる患者の一連の生検により確認された。
【００３３】
実施例３：末梢血細胞中のウイルスエンベロープ抗原の検出を可能にするモノクローナル抗体の同定
肝臓中のリンパ球浸潤物をＨＣＶエンベロープ抗原に関して染色できたという知見を得たので、末梢血単核細胞についても調べることにした。細胞内染色を可能にするために、末梢血細胞をサポニンで透過性にし、その後、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１または２０７（Ｅ１に指向され、それぞれ、肝臓生検に対して弱い陽性および強い陽性を示す）と反応させた。最後に、二次ＦＩＴＣ−標識抗体を用いる蛍光セルソーターで反応性をチェックした。肝臓中のリンパ球浸潤物をすでに染色しているＩＧＨ ２０７は高い特異性を示した。このモノクローナル抗体を用いると、バックグラウンド染色はほとんど検出されず、５人のうち４人の患者が明確に陽性染色となった（図３）。やはりＥ１に指向された第２のモノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１（配列番号：２９に結合する；ＥＣＡＣＣ受託番号：９８０３１２１６）は高いバックグラウンドを生じたが、図４に示す棒グラフからわかるように５人の患者のうち５人において細胞内Ｅ１が検出され、対照試料と比較して蛍光強度の強い細胞の明確な下位集団が示された。
【００３４】
実施例４：Ｅ１またはＥ２に対する反応性モノクローナル抗体のマッピング
抗体を生じさせたＥ１およびＥ２蛋白をスキャンするペプチドを用いて、全部で１４種のモノクローナル抗体をそれぞれのエピトープにマッピングした。これらのペプチドはビオチン化され、ストレプトアビジン結合マイクロタイタープレートに結合させ、次いで、モノクローナル抗体と反応させた。陽性対照として、組み換えエンベロープ蛋白をチェックした。
各モノクローナル抗体について、２つの重複ペプチドにより画定される特異的エピトープ領域に対する反応性を決定した（配列の詳細については表Ｉ参照）。
ＩＧＨ ２０１に対するエピトープを、領域２１２−２２６（配列番号：２９）と決定することができ、ＩＧＨ ２１０に対しては３０７−３２６（配列番号：３０）と、ＩＧＨ ２２２に対しては３９５−４１５（配列番号：３１）と決定できる。ＩＧＨ ２０１のアミノ酸領域はむしろＨＣＶのＥ１蛋白の可変領域であり、ＨＣＶのin situ検出に関連してすでに報告されている（Hiramatsu et al., 1992、Kaito et al., 1994）。しかしながら、我々の研究によれば、この抗体での肝臓生検染色が陰性であり、末梢血リンパ球に対する染色がかなりのバックグラウンドを示したので、このエピトープに指向された抗体はＨＣＶのin situ検出にはむしろ不適であることが明らかである。対照的に、ＩＧＨ ２０７およびＩＧＨ ２１０はＥ１の完全に保存された領域（Maertens and Stuyver, 1997）を認識する。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２は、Ｅ２のＮ末端超可変ドメインの部分であるＥ２の一領域を認識し、ＨＣＶのin situ検出に非常に適していることがわかった。
【００３５】
実施例５：可変のエピトープに対する交差反応性の決定
Ｅ２の種々のＮ末端超可変エピトープの配列に由来するさらなるシリーズのペプチドを用いて、ＩＧＨ ２２２をさらに特徴づけた。表２はこれらの実験をまとめたものである。この表から、このモノクローナル抗体は数種の配列と反応するが、他のいくつかのものとは反応しないと結論できる。ＩＧＨ ２２２により認識されない他の配列に対してより良い反応性を持った、このエピトープに対するさらなる抗体を当業者が得るには、このエピトープで十分であることがわかる。かかる配列は、例えば、＃４９０、９４０、８８４、４８４および４９４のペプチドであるが、ａａ３９５−４１５間の領域にある他の配列に対してはＩＧＨ ２２２が反応しない可能性があることがわかる。
【００３６】
これらの実施例から、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１、２０７、２１０および２２２により認識されるエピトープは結合抗体が容易に近接可能であり、肝臓生検および末梢血細胞における抗原の検出を可能にするということが明らかである。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１、２０７、２１０および２２２の特性はむしろユニークなものである。なぜなら、同じエピトープに指向された他のモノクローナル抗体は高いバックグラウンドを生じ、特異的染色をしなかったからである。例えば、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０７、２０９および２１０はすべて同じエピトープを認識するが、ＩＧＨ ２０９はすべての細胞タイプにおいてＥ１抗原を染色できず、一方、ＩＧＨ ２１０はリンパ球のみを染色し、ＩＧＨ ２０７はリンパ球および肝細胞の両方を染色する。本発明を用いると、天然のＨＣＶ蛋白抗原の検出に使用できる広範な抗体を当業者が製造することが可能になるはずである（性質としてはポリクローナルまたはモノクローナルいずれかものを種々の種において）。
【００３７】
一定のエピトープに対する一連の抗体を製造することの必要性は、抗体の挙動が、認識されるエピトープのみならずエピトープに対する親和性、溶解度、イソタイプ、および抗体が生成される種のごとき二次的な特性によっても決定されるという事実を反映する。それぞれの適用例に関し、異なる二次的特性を有する抗体が必要であるかもしれない。よって、かかる広範な抗体の製造により、ＩＧＨ２０１、２０７、２１０および２２２のように類似の特性を有する抗体のいくつかを同定でき、すなわち、宿主の生物学的試料中におけるＨＣＶエンベロープ蛋白の存在が明らかになるであろう。実際、これらのエピトープが、宿主中で発現されたようなＨＣＶエンベロープ蛋白に明らかに近接可能であるという知識は、本明細書に示したようなin situのみならず溶液中（例えば、血漿または血清中）でこれらの抗原を検出するアッセイを開発するのに必要な情報を提供する。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１、２０７、２１０または２２２、あるいは同じエピトープに対して生成したが可溶性抗原の検出に最適な特徴を有する他の抗体を、可能ならば他の抗体と組み合わせて用いて、かかるアッセイを開発することもできる。
【００３８】
文献一覧
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【００３９】
【表１】
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＨＣＶ患者の肝臓生検において、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２により明らかとなったＥ２抗原の染色を示す。新鮮凍結材料の４μｍ厚クリオスタット切片について、３工程の間接的イムノ−ペルオキシダーゼ法を用いる免疫組織化学的方法を行った（液体窒素で冷却したイソペンタン中で肝臓生検を即時凍結し、使用するまで−７０℃保存した）。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２（精製ＩｇＧ1：１０ｎｇ／μｌ）とともに切片を４℃で一晩インキュベーションした。二次抗体および三次抗体はそれぞれ、ペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗マウスおよびペルオキシダーゼ抱合ブタ抗ウサギＩｇＧからなっていた（いずれもDakopatts, Copenhagen, Denmarkから得た；使用希釈率はそれぞれ１／５０および１／１００）。各インキュベーションを室温で３０分行い、次いで、リン酸緩塩衝化セイライン，ｐＨ７．２セイライン，ｐＨ７．２を３回交換することにより洗浄した。０．０５％ ３−アミノ−９−エチル−カルバゾールおよび０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含有する１００ｍＭ酢酸塩バッファー（ｐＨ５．２）中で１５分インキュベーションすることにより反応生成物を発色させ、免疫反応部位を明赤色に染色した。ヘモトキシリンで切片を対比染色した。対照（示さず）は、一次抗体と類似のイソタイプの無関係なモノクローナル抗体、あるいは発色物質のみからなっていた。これらの対照は一貫して陰性であった。写真は２５倍に拡大したものを示す。最も濃い染色は肝細胞のみの中にＨＣＶ抗原が存在することを示す（矢印参照）。
【図２Ａ】 図２Ａは、ＨＣＶ患者の肝臓生検において、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０７により明らかとなったＥ１抗原の染色を示す。行った手順は、モノクローナル抗体濃度が３０ｎｇ／μｌであったことを除いて、図１で説明したのと同じである。写真は１０倍に拡大したものを示し、リンパ球浸潤物中の細胞の染色が優勢である。最も濃い染色は、肝細胞および浸潤リンパ球中のＨＣＶ抗原の存在を明らかにする（矢印参照）。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ＨＣＶ患者の肝臓生検において、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２１０により明らかとなったＥ１抗原の染色を示す。肝臓生検をホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋した。熱（マイクロウェーブ法）およびプロテアーゼ消化により切片を前処理した。抗体濃度は６ｎｇ／μｌであった。写真は、肝細胞の中の明確に染色された単離単核細胞を示し（矢印）、肝細胞はこのモノクローナル抗体では染色されない。
【図３】 図３は、末梢血単核細胞中の細胞内Ｅ１抗原の、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０７により明らかにされた染色を示す。末梢白血球（０．５ｘ１０6個）を２００μｌのＰＢＳ−０．１％サポニンに懸濁し、２μｇのＩＧＨ ２０７を添加し、４℃で２５分間反応させた。３ｍｌのＰＢＳ−０．１％サポニンで細胞を３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ−０．２％ ＮａＮ3で３回洗浄した。最後に、細胞を２５０μｌのＰＢＳ−０．２％ ＮａＮ3に再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。単核細胞フラクション（右欄）に対してゲイティング（gating）した後、蛍光をプロットした（左欄）。試料１〜５はＨＣＶ慢性キャリヤ由来であり、試料６は健康血液キャリヤ由来である。左欄は単核細胞フラクションに対するゲイティングの例（試料２および６）を示し、右欄はこれらの単核細胞において見出された蛍光を示す。対照試料はこのモノクローナル抗体では全く染色されないが、患者４（弱いシグナルが得られた）を除くすべてのＨＣＶ患者において著しい陽性シグナルが存在する。
【図４】 図４は、末梢血単核細胞中の細胞内Ｅ１抗原の、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１により明らかとなった染色を示す。当該方法は図３について説明したのと同様であった。試料７〜１１はＨＣＶ慢性キャリヤ由来であり、試料１２は健康血液キャリヤ由来である。左欄は単核細胞フラクションに対するゲイティングの例（試料７および１２）を示し、右欄はこれらの単核細胞において見出された蛍光を示す。対照試料は濃いバックグラウンド染色を示すが、元の試料における反応は、検出できる２つの集団に基づいて容易に区別することができる。該２つの集団とは、対照と同様に染色される集団ならびに対照には見られない強い染色を示す第２の集団である。
発明の分野
本発明は、ＨＣＶのＥ１およびＥ２蛋白の特異的エピトープに対して指向された抗体を用いて宿主組織中のウイルス抗原を検出することができるという知見に基づく。
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は先進国および発展途上国の両方における大きな健康上の問題である。世界の人口の約１ないし５％が当該ウイルスにかかっていると見積もられる。ＨＣＶ感染は輸血に関連した肝炎の最も重要な原因と思われ、しばしば、慢性の肝臓障害に進行する。そのうえ、ＨＣＶが肝細胞癌腫の誘導に関与している証拠がある。したがって、信頼できる診断方法および有効な治療薬に対する要求が大きい。また、ＨＣＶに汚染された血液製品に関する高感度かつ特異的なスクリーニング方法ならびにＨＣＶの培養方法も必要である。
【０００３】
ＨＣＶは、少なくとも３つの構造蛋白および６つの非構造蛋白をコードする約９４００個の塩基からなるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。配列相同性に基づいて、構造蛋白は機能的に１つの単一コア蛋白および２つのエンベロープ蛋白Ｅ１およびＥ２に帰属されている。Ｅ１蛋白は１９２個のアミノ酸からなり、ＨＣＶ遺伝子型に応じて５ないし６個のＮ−糖鎖付加部位を含む。Ｅ２蛋白はＨＣＶ遺伝子型に応じて９ないし１１個のＮ−糖鎖付加部位を含む３６３ないし３７０個のアミノ酸からなる（調査するにはMajor and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997参照）。Ｅ１蛋白は種々の可変ドメインを含むが、Ｅ２蛋白は２個の超可変ドメインを含み、その主要ドメインは蛋白のＮ末端に存在している（Maertens and Stuyver, 1997）。エンベロープ蛋白は、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞において組換え法により生産されている。高等真核細胞の発現系、特に哺乳動物細胞培養の使用は優れた品質のエンベロープ蛋白を生じ、すなわち、それらの蛋白はは、Maertensらに付与されたＰＣＴ／ＥＰ９５／０３０３１に記載されたように元の試料中の抗体により効果的に認識されるものである。
【０００４】
現在、細胞または組織中のＨＣＶの検出は、主としてウイルスＲＮＡが示されることによっている。しかしながら、細胞または組織におけるＲＮＡの検出は、ＲＮＡ抽出後に逆転写またはネステッドＰＣＲを用いるかあるいはin situ ＲＴ−ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションを用いる煩わしい方法である。また、これらの手法は擬陽性を生じやすいので、ウイルスＲＮＡの検出はもっぱら血清試料について行われている。血清および組織試料中のウイルス蛋白抗原の信頼できる検出方法は依然として存在しない。
【０００５】
ＨＣＶの複製部位はまだ十分に解明されていない。当該ウイルスは肝細胞中で複製するということが一般的に受け入れられているが、リンパ組織のごとき他の組織中での複製についてはまだかなり議論の余地がある。それゆえ、細胞中のウイルス蛋白またはウイルス自体を検出するための信頼できる方法により、この問題が解決されるかもしれない。
【０００６】
細胞中のウイルス蛋白の検出は、ウイルス蛋白に特異的に結合し、天然のＨＣＶ蛋白抗原（すなわち、ＨＣＶ感染後に宿主により発現される抗原）を特異的に認識しうる抗体が無かったことにより妨げられていた。結果として、現在に至るまで、宿主細胞中のウイルスＨＣＶ蛋白の存在を示すことに関連した研究はごくわずかしかなかった（調査するにはGuido and Thung, 1996参照）。そのうえ、宿主由来の抗体はこれらの研究の多くに使用されていた。しかしながら、宿主由来の抗体を含む調合物は容易に再生産できず、これらの調合物は自己免疫抗体ならびに他の既知もしくは未知抗原に対する抗体により汚染される可能性がある。対照的に、組み換え抗体で免疫した動物において産生された抗体は所望の特異性を有することが知られている。再生産可能な品質を得るためにはモノクローナル抗体も同様に好ましい。さらに、良好な品質の抗原を得るためには、ＨＣＶのエンベロープ蛋白は哺乳動物発現系により産生される必要がある。現在、この発現条件は理解できない問題を含んでいる。それゆえ、患者の組織標本中のＨＣＶエンベロープ抗原を検出するのに使用できたモノクローナル抗体はごくわずかしか記載されていない。これらの抗体はＥ１のＮ末端領域、すなわちアミノ酸（ａａ）１９２−２２６（Hiramatsu et al., 1992; Kaito et al., 1994）、あるいはＥ２のＣ末端ドメイン、すなわちａａ ４５１−７１５（Sansonno et al., 1997a, 1997b）に指向されていた。しかしながら、これらの刊行物ならびにGuidoおよびThung (1996)によるレビューおよびLiang (1996)によるレビューから、血清および組織試料中の天然ＨＣＶ蛋白抗原の効果的かつ常套的な検出を可能にする十分に特徴づけられた抗体に対する必要性がやはりあるということが明らかである。この必要性は、Driesおよび共同研究者(1999)による研究によって、最近確認された。Driesのグループは、肝臓生検試料においてＨＣＶ ＲＮＡを検出することができたので、ＨＣＶ抗体陽性で血清ＲＮＡ陰性である個体の６１％がＨＣＶのキャリヤであることを証明したが、抗体のパネルを用いる免疫組織化学によればこれらの症例の３分の１が検出可能であるに過ぎなかった。よって、肝臓生検におけるＨＣＶ抗原の常套的な検出はやはり感度不足である。また、血清または血漿のごとき体液中のウイルス抗原の検出は同じ問題により妨げられている。現在に至るまで、これらの体液中のコア抗原の検出を可能にする手法はわずかに１つだけ記載されているに過ぎない。しかしながら、その方法では、コア蛋白を検出するためには試料中に存在するコア蛋白を水酸化ナトリウムを用いて完全に変性させることを必要とする（Kashiwakuma et al., 1996）。
【０００７】
それゆえ、まとめると、抗体にアクセス可能で、組織または体液試料中の抗体の検出を可能にする新たな特異的ＨＣＶエピトープの同定が緊急に必要である。ＨＣＶエンベロープ蛋白は、かかるエピトープを見出すための候補標的と推定される。なぜなら、これらの蛋白はすべての生物学的試料：体液、ウイルス膜上、ならびに感染初期段階（すなわち、ウイルス侵入段階）から完全な複製サイクルに至るまでの細胞に存在するはずだからである。しかしながら、これらのエンベロープ蛋白は非常に変化しやすいので、異なる遺伝子型のＨＣＶに対して高い交差反応性を有する抗体が必要である。よって、かかるエピトープの同定およびＨＣＶの配列変種に対して高い交差反応性を有する抗体の検索について検討すべきである。
【０００８】
本願は、ＨＣＶのエンベロープ蛋白中の特定のエピトープに対して指向される特異的モノクローナル抗体に関し、該抗体は患者の組織標本中のＨＣＶ抗原を検出しうるものである。全部で２つのかかるエピトープ、および対応抗体が見出された。それらのうち１つはエンベロープ蛋白Ｅ１のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）中にあり、もう１つはＥ２のＮ末端超可変領域（ＨＶＲ）（ａａ３８４−４５０）中にある。後者の領域、より詳細には領域３９５−４１５は超可変領域であると考えられているが、驚くべきことに我々は、Ｅ２のＨＶＲの種々の既知配列と反応する抗体を特徴づけた。
【０００９】
発明の目的
ＨＣＶに関する信頼できる診断方法、信頼できるワクチンおよび有効な治療薬を緊急に開発する必要があることは、文献から明らかである。また、ＨＣＶが混入した血液製品の高感度かつ選択的なスクリーニング法ならびにＨＣＶを培養するための改良された方法が必要である。動物またはインビトロ法において、あるいはその天然宿主においてウイルスを検出できる新たな抗体は、有効な診断ツールおよび治療薬の設計を促進する可能性がある。この点において、本発明は、種々の組織または細胞におけるＨＣＶ抗原の検出に使用できる、Ｅ１またはＥ２−ＨＶＲに対して指向されたモノクローナル抗体に関する驚くべき知見に基づく。これらの組織は肝臓のみならず、血液試料由来の細胞も包含する。それゆえ、本発明は、Ｅ１蛋白の主要部分（Ｃ末端）、およびＥ２蛋白のＮ末端領域をカバーするＨＣＶエンベロープ蛋白領域ａａ２２７−４５０に特異的に結合する抗体の提供および使用を目的とする。これらの抗体は天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出を可能にし、天然ＨＣＶ蛋白抗原検出キットの製造に使用できる。完全なＥ１蛋白がａａ１９２−３８３に対応し、完全なＥ２蛋白がａａ３８４−７４７に対応することが明らかとなっている（Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997参照）。
【００１０】
より詳細には、本発明は、以下のエピトープ：
ＨＣＶ Ｅ１蛋白のａａ３０７−３２６（配列番号：３０）
ＨＣＶ Ｅ２蛋白のａａ３９５−４１５（配列番号：３１）
の少なくとも１つに特異的に結合する、上で定義した抗体の提供および使用を目的とする。
【００１１】
そのうえ、本発明は、モノクローナル抗体である上で定義した抗体の提供および使用を目的とする。この点において、本発明は、受託番号９８０３１２１５または９８０３１２１４としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の提供および使用を目的とする。
【００１２】
本発明は、上で定義した抗体の機能的に等価な変種またはフラグメント、ならびにそれらの変異体、あるいは配列番号：３０および３１との同様の反応性を示す分子（ファージまたは他のライブラリーから得られるような）の提供および使用を目的とする。
さらに、本発明は、ＨＣＶ蛋白抗原の検出を可能にし、天然ＨＣＶ蛋白抗原検出キットの製造に使用できる、ＨＣＶ Ｅ１蛋白（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２ Ｎ末端超可変領域（ａａ３８４−４５０）に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の提供および使用を目的とする。より詳細には、本発明は、受託番号９８０３１２１５または９８０３１２１４を有するＥＣＡＣＣ寄託物に対応するハイブリドーマ細胞系の提供および使用を目的とする。
【００１３】
さらにそのうえ、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法を提供し、該方法は、
ＨＣＶ蛋白抗原を含む可能性のある試験試料を、上で定義した抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントと接触させて抗体−抗原複合体を形成させ、次いで、
該抗原−抗体複合体を適当なマーカーを用いて調べる
ことを含む。
【００１４】
より詳細には、本発明は、上で定義した方法であって、該試験試料が末梢血液細胞のごときヒト細胞、または肝臓組織のごときヒト組織を含むものである方法を提供することを目的とする。
【００１５】
最後に、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原を検出するためのアッセイキットの提供を目的とし、該キットは
上で定義した抗体、または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメント、および
試験試料中のＨＣＶ蛋白抗原と該抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントとの間に形成される複合体を調べることのできる適当なマーカー
を含む。
本発明のすべての目的は、後で示す具体例に合致したものと考えられる。
【００１６】
表の簡単な説明
表１は、本願のすべてのペプチドの配列を示す。
表２は、Ｅ２中の超可変ドメインの種々の配列に対するＩＧＨ ２２２の交差反応性を示す。すべてのペプチドをビオチン化し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに結合し、ＩＧＨ ２２２と反応させた。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書記載の本発明は、すでに公表された研究および係属中の特許出願に源を発するものである。例えば、かかる研究は科学文献、特許または係属中の特許出願からなる。すでに引用され、あるいは以下に引用されるこれらの刊行物および出願のすべてを、参照により本明細書に一体化させる。
【００１８】
ウイルス蛋白に特異的に結合し、天然ＨＣＶ蛋白抗原（すなわち、ＨＣＶ感染後に宿主により発現される蛋白抗原）を認識できる抗体の欠如によりウイルス蛋白の検出が妨げられてきたことは明らかである。本発明は、ＨＣＶエンベロープ蛋白上の２つの新たなエピトープを見出したことに基づくものであり、これらのエピトープに対して指向された抗体を用いることにより、それらは宿主由来の生物学的試料中の天然ＨＣＶ蛋白抗原を常套的に検出することを可能にするものである。よって、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白検出キットの製造のためのＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）に特異的に結合する抗体の使用に関する。用語「ＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）に特異的に結合する抗体」は、Ｃ型肝炎ウイルス粒子または該ウイルス粒子由来の分子に、より詳細にはＥ１蛋白のＣ末端領域およびＥ２蛋白のＮ末端領域に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体をいう。ＨＣＶウイルスの「エンベロープ領域」、および「ＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）」は当業者によく知られた領域である（Wengler, 1991; Major and Feistone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997）。
【００１９】
用語「結合」は、本発明抗体が物理的にＨＣＶ蛋白に連結されることを示す。詳細には、抗体がＨＣＶエンベロープ蛋白に特異的に結合することを示し、ＨＣＶの他の成分または他の蛋白との交差反応が実質的にないことを意味する。結合、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ型のアッセイまたは競合アッセイのごとき当該分野で知られた方法またはアッセイキットにより、ＨＣＶ蛋白への抗体の結合を示すことができる（例えば、Current protocols in immunology参照）。抗体に結合するＨＣＶエンベロープ蛋白の領域は連続した配列から構成されている必要はないことが明らかなはずである。
【００２０】
本明細書の用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。該用語は抗体の種または起源を限定するのもではなく、作成方法により限定されるものでもない。さらに、用語「抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト化抗体および米国特許第４９４６７７８号に記載されたような１本鎖抗体ならびに元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持しているＦab、Ｆ’ (ab)2、Ｆvおよび他のフラグメントのごとき抗体フラグメントをいう。Lorreらの欧州特許出願第９７８７００９２．０に記載されたような、元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持している２価抗体、３価抗体、４価抗体も用語「抗体」に含まれる。本発明の抗体は天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法において使用できることが明らかなはずである。
【００２１】
用語「試験試料」は、血清、血漿、唾液、粘膜、脊髄液または生検のごとき宿主から得られた試料をいう。この点において、用語「試験試料」および「生物学的試料」を混用する。用語「生検」は、特に、細胞含有試料、とりわけヒト細胞含有試料をいう。そのうえ、後者の用語は末梢血細胞のごとき液体組織由来の試料、あるいは肝臓組織のごとき固体組織由来の試料もいう。生検に基づいて抗原検出を行う場合、用語「in situ検出」を使用する。
【００２２】
用語「天然ＨＣＶ蛋白抗原検出キット」は、当業者に知られたいずれかの方法によりＨＣＶ蛋白抗原の検出、好ましくはＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）のそれらの天然または元の位置での検出、好ましくは試験試料中に存在する抗原の検出を行うためのキットをいう。他の場合において、この用語は、本発明の抗体の結合によりＨＣＶ Ｅ１蛋白のＣ末端領域（ａａ２２７−３８３）またはＨＣＶ Ｅ２蛋白のＮ末端領域（ａａ３８４−４５０）のそれらの天然宿主または組織における存在を可視化することをいう。検出キットは以下の成分を含む：
（ｉ）適当な場合には、試験試料の単離手段
（ｉｉ）可能ならば、細胞を透過性にする溶液
（ｉｉｉ）本明細書記載の抗体、あるいはその機能的に等価な変種またはフラグメント
（ｉｖ）可能ならば、二次抗体および三次抗体、
（ｖ）可能ならば、インキュベーションおよび／または洗浄バッファー、
（ｖｉ）可能ならば、染色溶液。
好ましくは、ＨＣＶエンベロープ蛋白のin situでの検出に該キットを使用する。
【００２３】
天然宿主細胞または組織は、いずれの宿主細胞またはいずれの宿主種由来の組織であってもよい。特に、天然宿主細胞は末梢血細胞をいい、天然組織は肝臓組織をいう（本明細書の実施例の部分参照）。天然宿主は、とりわけ、ヒトをいうが、非ヒト霊長類または他の哺乳動物をいうこともある。
より詳細には、本発明は、下記エピトープ：ＨＣＶ Ｅ１蛋白のａａ３０７−３２６およびＨＣＶ Ｅ２蛋白のａａ３９５−４１５の少なくとも１種に特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体は、the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, U.K. (Tel: +44 1980 612512; fax: +44 1980 611315)に１９９８年３月１３日に寄託され、以下の受託番号：９８０３１２１５［（エピトープａａ３９５−４１５（配列番号：３１）に結合するｍＡｂ ＩＧＨ ２２２を分泌するハイブリドーマ１７Ｈ１０Ｆ４Ｄ１０に関して）］ならびに９８０３１２１４［（エピトープａａ３０７−３２６（配列番号：３０）に結合するｍＡｂ ＩＧＨ ２０７を分泌するハイブリドーマ１４Ｈ１１Ｂ２に関して）］を付与されたハイブリドーマにより分泌される。この点において、該エピトープの部分に結合する抗体も本発明の一部であることが明らかなはずである。例えば、それゆえ、下記エピトープ：
aa307-311, aa308-312, aa309-313, aa310-314, aa311-315, aa312-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa307-312, aa308-313, aa309-314, aa310-315, aa311-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa 307-313, aa308-314, aa309-315, aa310-316, aa311-317, aa312-318, aa313-319, aa314-320, aa315-321, aa316-322, aa317-323, aa318-324, aa319-325, aa320-326, aa307-314, aa308-315, aa309-316, aa310-317, aa311-318, aa312-319, aa313-320, aa314-321, aa315-322, aa316-323, aa317-324, aa318-325, aa319-326, aa307-315, aa308-316, aa309-317, aa310-318, aa311-319, aa312-320, aa313-321, aa314-322, aa315-323, aa316-324, aa317-325, aa318-326, aa307-316, aa308-317, aa309-318, aa310-319, aa311-320, aa312-321, aa313-322, aa314-323, aa315-324, aa316-325, aa317-326, aa307-317, aa308-318, aa309-319, aa310-320, aa311-321, aa312-322, aa313-323, aa314-324, aa315-325, aa316-326, aa307-318, aa308-319, aa309-320, aa310-321, aa311-322, aa312-323, aa313-324, aa314-325, aa315-326, aa307-319, aa308-320, aa309-321, aa310-322, aa311-323, aa312-324, aa313-325, aa314-326, aa307-320, aa308-321, aa309-322, aa310-323, aa311-324, aa312-325, aa313-326, aa307-321, aa308-322, aa309-323, aa310-324, aa311-325, aa312-326, aa307-322, aa308-323, aa309-324, aa310-325, aa311-326, aa307-323, aa308-324, aa309-325, aa310-326, aa307-324, aa308-325, aa309-326, aa307-325, aa308-326, ならびに,
aa395-399, aa396-400, aa397-401, aa398-402, aa399-403, aa400-404, aa401-405, aa402-406, aa403-407, aa404-408, aa405-409, aa406-410, aa407-411, aa408-412, aa409-413, aa410-414, aa411-415, aa395-400, aa396-401, aa397-402, aa398-403, aa399-404, aa400-405, aa401-406, aa402-407, aa403-408, aa404-409, aa405-410, aa406-411, aa407-412, aa408-413, aa409-414, aa410-415, aa395-401, aa396-402, aa397-403, aa398-404, aa399-405, aa400-406, aa401-407, aa402-408, aa403-409, aa404-410, aa405-411, aa406-412, aa407-413, aa408-414, aa409-415, aa395-402, aa396-403, aa397-404, aa398-405, aa399-406, aa400-407, aa401-408, aa402-409, aa403-410, aa404-411, aa405-412, aa406-413, aa407-414, aa408-415, aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404-412, aa405-413, aa406-414, aa407-415,aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404-412, aa405-413, aa406-414, aa407-415, aa395-404, aa396-405, aa397-406, aa398-407, aa399-408, aa400-409, aa401-410, aa402-411, aa403-412, aa404-413, aa405-414, aa406-415, aa395-405, aa396-406, aa397-407, aa398-408, aa399-409, aa400-410, aa401-411, aa402-412, aa403-413, aa404-414, aa405-415, aa395-406, aa396-407, aa397-408, aa398-409, aa399-410, aa400-411, aa401-412, aa402-413, aa403-414, aa404-415, aa395-407, aa396-408, aa397-409, aa398-410, aa399-411, aa400-412, aa401-413, aa402-414, aa403-415, aa395-408, aa396-409, aa397-410, aa398-411, aa399-412, aa400-413, aa401-414, aa402-415, aa395-409, aa396-410, aa397-411, aa398-412, aa399-413, aa400-414, aa401-415, aa395-410, aa396-411, aa397-412, aa398-413, aa399-414, aa400-415, aa395-411, aa396-412, aa397-413, aa398-414, aa399-415, aa395-412, aa396-413, aa397-414, aa398-415, aa395-413, aa396-414, aa397-415, aa395-414 および 396-415
に結合する抗体も包含される。
【００２４】
また本発明は、上記抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントにも関する。用語「機能的に等価な変種もしくはフラグメント」は、元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持している、該抗体の当該分野で知られた変種もしくはフラグメントをいう。
【００２５】
より詳細には、この用語は、上記のごとく定義されたヒト化抗体および１本鎖抗体ならびにＦab、Ｆ’ (ab)2、Ｆv等のごとき抗体フラグメントをいう。上記のような２価抗体、３価抗体および４価抗体ならびにそれらの変異形態あるいはLadner, 1995; Maclennman, 1995およびCannon et al., 1996により記載されたファージまたは他のライブラリーから得られるような配列番号：３０および３１に対して類似の機能的結合反応性を示す分子をいう。実際、これらの著者らにより記載されたペプチドは天然のＨＣＶ蛋白抗原の検出を可能にするものであり、本発明の一部である。
【００２６】
また本発明は、上で定義した抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。この点において、本質的にはKohler and Milstein (1975)に準じたｍＡｂを得るためのハイブリドーマ法が当業者によく知られていることは明らかなはずである。ｍＡｂが特異的に結合するエピトープのマッピングを、DeplaらのＰＣＴ／ＥＰ９７／０７２６８に記載された方法のごとき当該分野で知られた方法により行うことができる。
【００２７】
また本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法にも関し、該方法は、
ＨＣＶ蛋白抗原を含む可能性のある試験試料を、上で定義した抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントと接触させて抗体−抗原複合体を形成させ、次いで、
該抗原−抗体複合体を適当なマーカーを用いて調べる
ことを含む。
好ましくは、該方法を、in situでのＨＣＶエンベロープ蛋白の検出に使用する。
【００２８】
用語「該抗体−抗原複合体を適当なマーカーを用いて調べる」は、上記抗原−抗体複合体を検出または可視化する、蛍光フローサイトメトリー、結合、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ型アッセイまたは競合アッセイのごとき当該分野で知られた方法をいう（実施例の部分、Hertogs et al., 1993、およびMehta et alのWO93/04084参照）。同様に、用語「適当なマーカー」は、Mehta et alのWO93/04084およびColigan et al., 1992に記載のマーカーのごとき当該分野で知られたマーカーであって、上記抗原−抗体複合体を可視化させるものをいう。
【００２９】
この点において、本発明は、天然ＨＣＶ蛋白抗原を検出するためのアッセイキットにも関し、該キットは、上で定義した抗体、または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメント、および試験試料中のＨＣＶ蛋白と該抗体または該抗体の機能的に等価な変種もしくはフラグメントとの間に形成された複合体を調べることを可能にする適当なマーカーを含む。
【００３０】
特に有利な具体例を示す下記実施例を参照することにより本発明を説明する。しかしながら、これらの具体例は単なる説明であって、本発明を限定するものと解してはならない。
【００３１】
実施例
実施例１：Ｅ１およびＥ２に対するモノクローナル抗体の取得
MaertensらのＰＣＴ／ＥＰ９５／０３０３１に記載されたように、組み換えワクシニアウイルスにより発現されたＥ１の末端切断バージョン（ａａ１９２−３２６）およびＥ２の末端切断バージョン（ａａ３８４−６７３）でマウスを免疫した。免疫後、マウスの脾臓細胞をミエローマ細胞系と融合させた。Ｅ１またはＥ２に対して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマをＥＬＩＳＡにより選択した。
【００３２】
実施例２：モノクローナル抗体の選択
Ｅ１またはＥ２に対して指向された広範なモノクローナル抗体（全部で２５種、そのうち１４種について詳細を調べた；これら１４種はInnogenetics NV, Gent, Belgiumから得た）を、ＨＣＶ患者の肝臓生検および対照（下記参照）において天然ＨＣＶ抗原の染色に関して評価した。凍結切片またはホルムアルデヒド固定生検のいずれかに対して染色を行った（プロトコールに関しては、図面のリジェンド参照）。３つのモノクローナル抗体のみが明確かつ特異的な染色を示した。他のすべてのモノクローナル抗体は染色を示さないかまたは弱い染色を示し、あるいは非特異的染色を示した。２種の異なる抗原染色パターンが明確に観察された。Ｅ２に指向されたモノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２は肝細胞を明確に染色したが（図１）、Ｅ１に指向されたＩＧＨ ２０７およびＩＧＨ ２１０は肝臓中に浸潤したリンパ球を染色した（図２ａおよび２ｂ）。ＩＧＨ ２０７は肝細胞も染色したが、ＩＧＨ ２２２よりも程度が弱かった（図１と２ａとを比較）。この染色パターンは、５人の異なる患者の一連の生検により確認された。
実施例３：末梢血細胞中のウイルスエンベロープ抗原の検出を可能にするモノクローナル抗体の同定
肝臓中のリンパ球浸潤物をＨＣＶエンベロープ抗原に関して染色できたという知見を得たので、末梢血単核細胞についても調べることにした。細胞内染色を可能にするために、末梢血細胞をサポニンで透過性にし、その後、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１または２０７（Ｅ１に指向され、それぞれ、肝臓生検に対して弱い陽性および強い陽性を示す）と反応させた。最後に、二次ＦＩＴＣ−標識抗体を用いる蛍光セルソーターで反応性をチェックした。肝臓中のリンパ球浸潤物をすでに染色しているＩＧＨ ２０７は高い特異性を示した。このモノクローナル抗体を用いると、バックグラウンド染色はほとんど検出されず、５人のうち４人の患者が明確に陽性染色となった（図３）。やはりＥ１に指向された第２のモノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１（配列番号：２９に結合する；ＥＣＡＣＣ受託番号：９８０３１２１６）は高いバックグラウンドを生じたが、図４に示す棒グラフからわかるように５人の患者のうち５人において細胞内Ｅ１が検出され、対照試料と比較して蛍光強度の強い細胞の明確な下位集団が示された。
【００３４】
実施例４：Ｅ１またはＥ２に対する反応性モノクローナル抗体のマッピング
抗体を生じさせたＥ１およびＥ２蛋白をスキャンするペプチドを用いて、全部で１４種のモノクローナル抗体をそれぞれのエピトープにマッピングした。これらのペプチドはビオチン化され、ストレプトアビジン結合マイクロタイタープレートに結合させ、次いで、モノクローナル抗体と反応させた。陽性対照として、組み換えエンベロープ蛋白をチェックした。
各モノクローナル抗体について、２つの重複ペプチドにより画定される特異的エピトープ領域に対する反応性を決定した（配列の詳細については表Ｉ参照）。
【００３５】
実施例５：可変のエピトープに対する交差反応性の決定
Ｅ２の種々のＮ末端超可変エピトープの配列に由来するさらなるシリーズのペプチドを用いて、ＩＧＨ ２２２をさらに特徴づけた。表２はこれらの実験をまとめたものである。この表から、このモノクローナル抗体は数種の配列と反応するが、他のいくつかのものとは反応しないと結論できる。ＩＧＨ ２２２により認識されない他の配列に対してより良い反応性を持った、このエピトープに対するさらなる抗体を当業者が得るには、このエピトープで十分であることがわかる。かかる配列は、例えば、＃４９０、９４０、８８４、４８４および４９４のペプチドであるが、ａａ３９５−４１５間の領域にある他の配列に対してはＩＧＨ ２２２が反応しない可能性があることがわかる。
【００３６】
これらの実施例から、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１、２０７、２１０および２２２により認識されるエピトープは結合抗体が容易に近接可能であり、肝臓生検および末梢血細胞における抗原の検出を可能にするということが明らかである。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１、２０７、２１０および２２２の特性はむしろユニークなものである。なぜなら、同じエピトープに指向された他のモノクローナル抗体は高いバックグラウンドを生じ、特異的染色をしなかったからである。例えば、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０７、２０９および２１０はすべて同じエピトープを認識するが、ＩＧＨ ２０９はすべての細胞タイプにおいてＥ１抗原を染色できず、一方、ＩＧＨ ２１０はリンパ球のみを染色し、ＩＧＨ ２０７はリンパ球および肝細胞の両方を染色する。本発明を用いると、天然のＨＣＶ蛋白抗原の検出に使用できる広範な抗体を当業者が製造することが可能になるはずである（性質としてはポリクローナルまたはモノクローナルいずれかものを種々の種において）。
【００３７】
一定のエピトープに対する一連の抗体を製造することの必要性は、抗体の挙動が、認識されるエピトープのみならずエピトープに対する親和性、溶解度、イソタイプ、および抗体が生成される種のごとき二次的な特性によっても決定されるという事実を反映する。それぞれの適用例に関し、異なる二次的特性を有する抗体が必要であるかもしれない。よって、かかる広範な抗体の製造により、ＩＧＨ２０１、２０７、２１０および２２２のように類似の特性を有する抗体のいくつかを同定でき、すなわち、宿主の生物学的試料中におけるＨＣＶエンベロープ蛋白の存在が明らかになるであろう。実際、これらのエピトープが、宿主中で発現されたようなＨＣＶエンベロープ蛋白に明らかに近接可能であるという知識は、本明細書に示したようなin situのみならず溶液中（例えば、血漿または血清中）でこれらの抗原を検出するアッセイを開発するのに必要な情報を提供する。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１、２０７、２１０または２２２、あるいは同じエピトープに対して生成したが可溶性抗原の検出に最適な特徴を有する他の抗体を、可能ならば他の抗体と組み合わせて用いて、かかるアッセイを開発することもできる。
【００３８】
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【００３９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＨＣＶ患者の肝臓生検において、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２により明らかとなったＥ２抗原の染色を示す。新鮮凍結材料の４μｍ厚クリオスタット切片について、３工程の間接的イムノ−ペルオキシダーゼ法を用いる免疫組織化学的方法を行った（液体窒素で冷却したイソペンタン中で肝臓生検を即時凍結し、使用するまで−７０℃保存した）。モノクローナル抗体ＩＧＨ ２２２（精製ＩｇＧ1：１０ｎｇ／μｌ）とともに切片を４℃で一晩インキュベーションした。二次抗体および三次抗体はそれぞれ、ペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗マウスおよびペルオキシダーゼ抱合ブタ抗ウサギＩｇＧからなっていた（いずれもDakopatts, Copenhagen, Denmarkから得た；使用希釈率はそれぞれ１／５０および１／１００）。各インキュベーションを室温で３０分行い、次いで、リン酸緩塩衝化セイライン，ｐＨ７．２セイライン，ｐＨ７．２を３回交換することにより洗浄した。０．０５％ ３−アミノ−９−エチル−カルバゾールおよび０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含有する１００ｍＭ酢酸塩バッファー（ｐＨ５．２）中で１５分インキュベーションすることにより反応生成物を発色させ、免疫反応部位を明赤色に染色した。ヘモトキシリンで切片を対比染色した。対照（示さず）は、一次抗体と類似のイソタイプの無関係なモノクローナル抗体、あるいは発色物質のみからなっていた。これらの対照は一貫して陰性であった。写真は２５倍に拡大したものを示す。最も濃い染色は肝細胞のみの中にＨＣＶ抗原が存在することを示す（矢印参照）。
【図２Ａ】 図２Ａは、ＨＣＶ患者の肝臓生検において、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０７により明らかとなったＥ１抗原の染色を示す。行った手順は、モノクローナル抗体濃度が３０ｎｇ／μｌであったことを除いて、図１で説明したのと同じである。写真は１０倍に拡大したものを示し、リンパ球浸潤物中の細胞の染色が優勢である。最も濃い染色は、肝細胞および浸潤リンパ球中のＨＣＶ抗原の存在を明らかにする（矢印参照）。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ＨＣＶ患者の肝臓生検において、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２１０により明らかとなったＥ１抗原の染色を示す。肝臓生検をホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋した。熱（マイクロウェーブ法）およびプロテアーゼ消化により切片を前処理した。抗体濃度は６ｎｇ／μｌであった。写真は、肝細胞の中の明確に染色された単離単核細胞を示し（矢印）、肝細胞はこのモノクローナル抗体では染色されない。
【図３】 図３は、末梢血単核細胞中の細胞内Ｅ１抗原の、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０７により明らかにされた染色を示す。末梢白血球（０．５ｘ１０6個）を２００μｌのＰＢＳ−０．１％サポニンに懸濁し、２μｇのＩＧＨ ２０７を添加し、４℃で２５分間反応させた。３ｍｌのＰＢＳ−０．１％サポニンで細胞を３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ−０．２％ ＮａＮ3で３回洗浄した。最後に、細胞を２５０μｌのＰＢＳ−０．２％ ＮａＮ3に再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。単核細胞フラクション（右欄）に対してゲイティング（gating）した後、蛍光をプロットした（左欄）。試料１〜５はＨＣＶ慢性キャリヤ由来であり、試料６は健康血液キャリヤ由来である。左欄は単核細胞フラクションに対するゲイティングの例（試料２および６）を示し、右欄はこれらの単核細胞において見出された蛍光を示す。対照試料はこのモノクローナル抗体では全く染色されないが、患者４（弱いシグナルが得られた）を除くすべてのＨＣＶ患者において著しい陽性シグナルが存在する。
【図４】 図４は、末梢血単核細胞中の細胞内Ｅ１抗原の、モノクローナル抗体ＩＧＨ ２０１により明らかとなった染色を示す。当該方法は図３について説明したのと同様であった。試料７〜１１はＨＣＶ慢性キャリヤ由来であり、試料１２は健康血液キャリヤ由来である。左欄は単核細胞フラクションに対するゲイティングの例（試料７および１２）を示し、右欄はこれらの単核細胞において見出された蛍光を示す。対照試料は濃いバックグラウンド染色を示すが、元の試料における反応は、検出できる２つの集団に基づいて容易に区別することができる。該２つの集団とは、対照と同様に染色される集団ならびに対照には見られない強い染色を示す第２の集団である。
Claims (10)
- 天然ＨＣＶ蛋白抗原を検出するためのキットを製造するための、ＥＣＡＣＣ受託番号９８０３１２１４を有するハイブリドーマ細胞系により、またはＥＣＡＣＣ受託番号９８０３１２１５を有するハイブリドーマ細胞系により分泌される抗体、あるいは該抗体のいずれかの機能的に等価なフラグメントの使用。
- ＥＣＡＣＣ受託番号９８０３１２１４または９８０３１２１５を有するハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体。
- 請求項２記載の抗体の機能的に等価なフラグメント。
- ＥＣＡＣＣ受託番号９８０３１２１４または９８０３１２１５を有するハイブリドーマ細胞系。
- ＨＣＶ蛋白抗原を含む可能性のある試験試料を請求項２または３のいずれかに記載の抗体と接触させて抗体−抗原複合体を形成させ、ついで、
適当なマーカーを用いて該抗原−抗体複合体を検出する
ことを特徴とする、天然ＨＣＶ蛋白抗原の検出方法。 - 該試験試料がヒト細胞または組織を含むものである請求項５記載の方法。
- 該ヒト細胞が末梢血細胞である請求項６記載の方法。
- 該ヒト組織が肝臓組織である請求項６記載の方法。
- 請求項２または３のいずれかに記載の抗体を含む、試験試料中の天然ＨＣＶ蛋白抗原を検出するためのアッセイキット。
- 試験試料中のＨＣＶ蛋白と該抗体との間に形成された複合体の検出を可能にする適当なマーカーをさらに含む請求項９記載のキット。
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