JP3612538B2 - 共焦点顕微鏡装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点顕微鏡装置において光軸方向の走査を制御する技術に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来の共焦点顕微鏡装置としては、たとえば、図5aに模式的に構成を示すニポウ板型の共焦点顕微鏡装置が知られている。
図示するように、この共焦点顕微鏡装置は、レーザ光を試料20上に集光させるためのマイクロレンズアレイ101及びピンホールアレイ102(ニポウ板)及び対物レンズ103と、対物レンズ103を光軸方向(図中Z方向)に移動するためのアクチュエータ104と、集光レンズ105を備えたカメラ106と、対物レンズ103とピンホールアレイ102を通過した試料からの反射光の進路をカメラ106方向に変化させるビームスプリッタ107とを有している。
【0003】
そして、このような構成において、対物レンズ103のZ方向の位置によってレーザ光の集光点のZ座標が制御され、マイクロレンズアレイ101とピンホールアレイ102を回転させることによりレーザ光の集光点のXY座標が制御される。すなわち、対物レンズ103のZ方向位置と、マイクロレンズアレイ101とピンホールアレイ102の回転角によって、カメラ106に撮影される試料20中の走査点を3次元的に制御できるようになっている。
【0004】
さて、このような共焦点顕微鏡装置における、従来の走査の技術としては、図5bに示すように、カメラ106の垂直同期信号に同期してマイクロレンズアレイ101とピンホールアレイ102を回転させながら、トリガ信号入力直後に発生したカメラの垂直同期信号に同期して、対物レンズ103をZ座標増加方向に複数フレーム期間より長い期間一様に移動する動作を開始する技術が知られている(たとえば特開2002−72102号公報)。
【0005】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【0006】
【特許文献1】
特開2002−72102号公報
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来の技術では、対物レンズ103の移動を開始するタイミングを垂直同期信号に同期させているが、移動開始後の移動は垂直同期信号とは非同期に行っている。このため、カメラ106で撮影する各映像フレームに対して、走査点のZ方向位置を精度良く制御することが比較的困難である。より具体的には、Z方向位置の移動を行いながら繰り返し撮影する場合において、Z方向位置のずれが累積的に大きくなり、また、そのようなずれを確認、修正等、することができない。
【0008】
さて、前記従来の技術は、常時Z座標を変化させながらXY方向の走査を行い各走査点を撮影していくものである。そして、このように常時Z座標を変化させながら撮影する手法によれば、全てのXY座標についても走査されないZ座標点の発生を抑止することができ、Z方向に微少な構造であっても撮影映像中に少なくとも、その部分が現れる確率を高めることができる。
【0009】
しかしながら、この従来の技術では、カメラ106において撮影が行われない垂直同期信号期間等の同期信号期間も対物レンズ103の座標は一様に変化する。そして、同期信号期間に対物レンズ103の移動した範囲に対応する試料20中のZ座標範囲は全く撮影されないことになるため、この従来の技術によれば、Z方向に微少な構造が欠落してしまう確率を充分に抑制することができない。
【0010】
一方で、共焦点顕微鏡装置を適用する用途によっては、Z座標を固定して試料のXY平面を撮影した映像フレームを、異なるZ座標のそれぞれについて生成したい場合がある。たとえば、このようにして生成された映像フレームの集合は、そのままXYZ座標系を持つボクセルとなるため、試料20の3次元解析などの処理に好適である。
【0011】
しかしながら、前記従来の技術によれば、カメラ106における映像撮影期間中も常時Z座標を変化させるために、Z座標を固定して試料のXY平面を撮影した映像フレームを生成することができない。
そこで、本発明は、共焦点顕微鏡装置において、より試料の光軸方向走査の位置制御の精度を向上することを課題とする。また、併せて本発明は、共焦点顕微鏡装置において、微少な構造を撮影映像中に捉えることのできる確率を高めることを課題とする。また、さらに本発明は、共焦点顕微鏡装置において、光軸方向座標を固定して試料の光軸と垂直な平面を撮影した映像フレームを、異なる光軸方向座標のそれぞれについて生成することを課題とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】
前記課題達成のために、本発明は、光ビームの焦点位置を試料に対して光軸と垂直な方向に走査する共焦点スキャナと、前記光ビームの焦点位置を試料に対して光軸方向に走査する移動機構と、試料の前記光ビームによる像を撮像するカメラと、前記カメラの垂直同期信号に同期して、垂直同期信号毎に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させる移動制御部とを備えた共焦点顕微鏡装置を提供する。
【0013】
このような共焦点顕微鏡装置によれば、個々の垂直同期信号に同期して光ビームの焦点位置の移動を行うようので、光軸方向に関して、各映像フレーム毎に走査点を必ず一定の座標範囲内に収めることができる。したがって、焦点位置の光軸方向位置のずれが累積することはなく、試料の光軸方向走査を、より精度よく制御することができるようになる。
【0014】
また、本発明は、このような共焦点顕微鏡装置において、前記移動制御部によって、少なくとも前記カメラの垂直同期信号期間中は、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を一定に保たせ、前記カメラの垂直同期信号期間を少なくとも除く期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させるようにしたものである。
【0015】
このように、撮像が行われない垂直同期信号期間中には走査点の光軸方向への移動を行わないようにすることにより、撮影対象から欠落してしまう光軸方向の座標範囲の発生を小さく抑えることができる。したがって、微少な構造を撮影映像中に捉えることにできる確率を向上することができる。
また、本発明は、このような共焦点顕微鏡装置において、前記移動制御部によって、少なくとも前記カメラの画素撮像期間中は、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を一定に保たせ、前記カメラの画素撮像期間を少なくとも除く期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【0016】
このように画素撮像期間中を少なくとも除く期間にのみ走査点の光軸方向の移動を行うことにより、光軸方向座標を固定して試料の光軸と垂直な平面を撮影した映像フレームを、異なる光軸方向座標のそれぞれについて生成することができるようになる。
【0017】
なお、この場合には、前記移動制御部において、前記カメラの垂直同期信号期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させるようにしても良い。
また、以上の共焦点顕微鏡装置には、前記カメラの撮像と並行して、前記カメラによって撮像された像より前記試料の3次元表現による像を再構成して表示すると共に、前記カメラによって新たに撮像された像によって前記3次元表現による像を更新する表示手段を備えることが好ましい。このようにすることにより、試料の3次元表現による像を、所謂リアルタイムに観察することができるようになる。
【0018】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。
図1に本実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の構成を示す。
図示するように、共焦点顕微鏡装置は、本体部1、試料20を載置するステージ2、レーザ光源3、共焦点スキャナユニット4、通信規格としてIEEE 1394を採用した66フレーム/秒倍速カメラ等の高速なカメラ5、カメラ5にイメージ増強や高速シャッタ機能などを付加するイメージインテンシファイヤ6、対物レンズ7、対物レンズ7を光軸方向に移動するアクチュエータ8、Z軸走査制御装置9、ビデオキャプチャインタフェースを備えたコンピュータ等である画像処理装置10、表示装置11とを有している。そして、共焦点スキャナユニット4には、前述したマイクロレンズアレイや、ピンホールアレイや、ビームスプリッタや、マイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する回転制御部が収容されている。
【0019】
また、本共焦点顕微鏡装置は、照明光源12を備えており、この照明光源12と、本体部1に収容された光学系とより光学顕微鏡装置としても機能するようになっている。
以下、本共焦点顕微鏡装置における、走査制御について説明する。
図2に、本共焦点顕微鏡装置の走査シーケンスを示す。
本走査シーケンスは、図aに示すZ軸走査制御装置9が出力するTRIGER信号によって開始される。カメラ5は、TRIGER信号を外部トリガ信号として入力し、図bに示すようにTRIGER信号に垂直同期信号を同期させ、撮影を開始する。
【0020】
また、カメラ5の垂直同期信号V SYNCは、共焦点スキャナユニット4とZ軸走査制御装置9に出力される。そして、共焦点スキャナユニット4の回転制御部は、入力する垂直同期信号V SYNCに同期して、各映像フレームの撮像期間毎に1回XY全域の走査を行うようにマイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する。ここで、撮像期間とは、1映像フレーム期間のうちの、垂直同期信号期間を少なくとも除く期間を指す。なお、撮像期間には水平同期信号期間や、水平同期信号期間や垂直同期信号期間の前後にある画素を撮像しない期間を含めないようにしてもよい。
【0021】
一方、Z軸走査制御装置9は、図cに示すように、入力する垂直同期信号V SYNCに同期して、各映像フレームの撮像期間中に所定周期のパルスを所定数アクチュエータに、移動制御信号CNTとして出力するステージを実行する。また、入力する垂直同期信号V SYNCをカウントし、所定カウントに達したならば、パルス出力を停止し、図dに示すようにリセット信号RSTをアクチュエータ8に出力するステージを実行する。そして、次の垂直同期信号V SYNCが入力したならば、以上と同様に、所定数の映像フレーム期間、各映像フレームの撮像期間中に所定数の所定周期のパルスを移動制御信号CNTとしてアクチュエータ8に出力するステージと、1映像フレーム期間パルス出力を停止すると共に、リセット信号RSTをアクチュエータ8に出力するステージとよりなるシーケンスを繰り返す。
【0022】
一方、アクチュエータ8は、Z軸走査制御装置9から入力する移動制御信号CNTのパルスを積分し、図e、fに示すように、垂直同期信号V SYNCの期間は一定値を保ち、映像フレームの撮像期間は一様に増加する駆動信号を生成し、この駆動信号によって対物レンズ7をZ方向に移動する。なお、ここでは、対物レンズ7の移動量は、駆動信号の大きさに比例するものとしている。もし、対物レンズ7の移動量が、駆動信号の大きさにリニアに比例しない場合は、対物レンズ7が、垂直同期信号V SYNCの期間は移動せず、映像フレームの撮像期間は一様に移動するような波形を持つ駆動信号を生成するようにする。なお、対物レンズ7を移動する機構としては、ピエゾ素子を用いた機構などを用いることができる。
【0023】
そして、アクチュエータ8は、Z軸走査制御装置9からリセット信号RSTが入力したならば、駆動信号を初期値に戻す。
以上の動作によって、試料20中の走査点と各映像フレームとの関係は、図gに示すようになる。すなわち、各映像フレーム期間(図ではT1〜T8)のそれぞれにおいて、各映像フレーム期間毎に異なるZ座標範囲内の映像が撮影される。ここで、本実施形態では、以上のように映像フレームの撮像期間にのみ対物レンズ7をZ方向に移動する。したがって、いずれのXY座標についても全く撮影されないZ座標範囲の発生は少ない。
【0024】
さて、図1に戻り、画像処理装置10は、カメラ5から出力される各映像フレームVIDEOを取り込み記憶すると共に、合成して表示装置11に表示する処理を繰り返す。ここで、画像処理装置10には、Z軸走査制御装置9からTRIGER信号のタイミングなどを表すタイミング信号が供給されており、画像処理装置10はこのタイミング信号に従って、各映像フレームとその映像フレームに撮像された試料20の走査面のZ方向の順番との対応を認識し、認識した順番に従って各映像フレームを合成又は配置して試料20の3次元画像(ボクセル)を再構成し、3次元画像を適当なレンダリングアルゴリズム(たとえば、ボリュームレンダリング等)によって仮想的な2次元スクリーンに投影した3次元表現による画像を表示装置11に表示する処理を繰り返す。すなわち、画像処理装置10は、試料20の3次元表現による画像のリアルタイム表示を行う。
【0025】
以下、Z軸走査制御装置9の一構成例について説明する。
図3に、Z軸走査制御装置9の構成例を示す。
以下、図2に示した走査シーケンスにおいて、Z軸走査制御装置9が、所定数Nの映像フレーム期間、各映像フレームの撮像期間中に所定数Mの所定周期Tのパルスを移動制御信号CNTとしてアクチュエータ8に出力するステージと、1映像フレーム期間パルス出力を停止すると共に、リセット信号RSTをアクチュエータ8に出力するステージとよりなるシーケンスを繰り返すものとして説明する。
【0026】
さて、図3中において、シーケンス制御部91は、画像処理装置10からの要求やユーザ操作等に応じて、前述したTRIGER信号を生成する。
第1カウンタ92は、TRIGER信号でリセットされ、垂直同期信号V SYNCを0からカウントする。第1デコーダ93は、第1カウンタ92のカウント値をデコードし、カウント値が所定値Nとなるとリセットイネーブル信号をリセット出力回路94とマスク回路95に出力し、カウンタリセット信号を第1カウンタ92に出力する。リセット出力回路94は、リセットイネーブル信号が入力すると、所定パルス長のリセット信号RSTを生成し、アクチュエータ8に出力する。また、第1カウンタ92は、カウンタリセット信号が入力されると、次の垂直同期信号V SYNCの入力に同期して0にリセットされる。
【0027】
第2カウンタ96は、発振器97の出力する所定周期Tのクロック信号を0からカウントする。第2デコーダ98は、カウント値をデコードし、カウント値がMとなるとパルスマスク信号をマスク回路95に出力すると共に、停止信号を第2カウンタ96に出力する。マスク回路95は、第1デコーダ93からリセットイネーブル信号が出力されておらず、かつ、第2デコーダ98からパルスマスク信号が出力されていない期間のみ、発振器97の出力する所定周期Tのクロック信号を移動制御信号CNTのパルスとしてアクチュエータ8に出力する。ここで第2カウンタ96は、停止信号が入力されると垂直同期信号V SYNCが入力されるまでカウント動作を停止し、垂直同期信号V SYNCが入力されるとカウント値を0にリセットしてカウント動作を開始する。
なお、以上のZ軸走査制御装置9の構成は一例に過ぎず、Z軸走査制御装置9の構成としては他の構成を採用することもできる。たとえば、PLLを用いて垂直同期信号に同期した撮像期間の1/M周期のパルス信号を生成し、このパルスを撮像期間のみ移動制御信号CNTとして出力するような構成をとることもできる。また、Z軸走査制御装置9をCPU回路として構成し、以上のZ軸走査制御装置9の動作を、ソフトウエア的に実施するようにしてもよい。
【0028】
さて、次に、アクチュエータ8における駆動信号の生成は、前述したようにZ軸走査制御装置9から入力する移動制御信号CNTのパルスを積分することによって行う。この積分は、周知のアナログ積分回路によって行うようにしてもよいが、たとえば、図に示すような移動制御信号CNTのパルスをカウントするカウンタ81と、カウンタ81のカウンタ値をD/A変換するD/Aコンバータ82と、D/Aコンバータ82の出力を増幅するドライバ回路83などによっても構成することができる。なお、カウンタ81は、Z軸走査制御装置9から入力するリセット信号RSTでリセットされる。
【0029】
以上、本発明の実施形態について説明した。
さて、以上の実施形態における共焦点顕微鏡装置においては、さらに、次のような走査シーケンスを実行するようにしてもよい。
図示するように、この走査シーケンスも、図aに示すZ軸走査制御装置9が出力するTRIGER信号によって開始される。カメラ5は、TRIGER信号を外部トリガ信号として入力し、図bに示すようにTRIGER信号に垂直同期信号を同期させ、撮影を開始する。
【0030】
カメラ5の垂直同期信号V SYNCは、共焦点スキャナユニット4とZ軸走査制御装置9に出力される。そして、共焦点スキャナユニット4の回転制御部は、入力する垂直同期信号V SYNCに同期して、各映像フレームの撮像期間毎に1回XY全域の走査を行うようにマイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する。
【0031】
一方、Z軸走査制御装置9は、図cに示すように、入力する垂直同期信号V SYNCに同期して、垂直同期信号期間中にパルスを移動制御信号CNTとしてアクチュエータ8に出力するステージを実行する。また、入力する垂直同期信号をカウントし、所定カウントに達したならば、移動制御信号CNTのパルス出力を停止し、図dに示すようにリセット信号RSTをアクチュエータ8に出力するステージを実行する。そして、次の垂直同期信号V SYNCが入力したならば、以上と同様に、所定数の映像フレーム期間、垂直同期信号期間にパルスを移動制御信号CNTとしてアクチュエータ8に出力するステージと、1映像フレーム期間移動制御信号CNTのパルス出力を停止すると共に、リセット信号RSTをアクチュエータ8に出力するステージとよりなるシーケンスを繰り返す。
【0032】
アクチュエータ8は、Z軸走査制御装置9から入力する移動制御信号CNTのパルスを積分し、図e、fに示すように、垂直同期信号期間に増加し、映像フレームの撮像期間は一定を保つ駆動信号を生成し、この駆動信号によって対物レンズ7をZ方向に移動する。なお、ここでは、対物レンズ7の移動量は、駆動信号の大きさに比例するものとしている。
【0033】
そして、アクチュエータ8は、Z軸走査制御装置9からリセット信号RSTが入力したならば、駆動信号を初期値に戻す。
以上の動作によって、試料20中の走査点と各映像フレームとの関係は、図gに示すようになる。すなわち、各映像フレーム期間(図ではT1〜T8)のそれぞれにおいて、各映像フレーム期間毎に映像フレーム毎に離間した特定のZ座標を持つXY平面の映像が撮影される。
以上のような走査シーケンスによれば、映像フレームの素直期間にのみ対物レンズ7をZ方向に移動する。したがって、Z座標を固定して試料20のXY平面を撮影した映像フレームを、異なるZ座標のそれぞれについて生成することができる。
【0034】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、共焦点顕微鏡装置において、より試料の光軸方向走査の位置制御の精度を向上することができる。また、共焦点顕微鏡装置において、微少な構造を撮影映像中に捉えることのできる確率を高めることができる。また、共焦点顕微鏡装置において、光軸方向座標を固定して試料の光軸と垂直な平面を撮影した映像フレームを、異なる光軸方向座標のそれぞれについて生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。
【図2】本発明の実施形態に係る走査シーケンスを示す図である。
【図3】本発明の実施形態に係るZ軸走査制御装置とアクチュエータの構成例を示すブロック図である。
【図4】本発明の実施形態に係る他の走査シーケンスを示す図である。
【図5】従来の共焦点顕微鏡装置の構成と走査シーケンスを示す図である。
【符号の説明】
1:本体部、2:ステージ、3:レーザ光源、4:共焦点スキャナユニット、5:カメラ、6:イメージインテンシファイヤ、7:対物レンズ、8:アクチュエータ、9:Z軸走査制御装置、10:画像処理装置、11:表示装置、12:照明光源、20:試料、81:カウンタ、82:D/Aコンバータ、83:ドライバ回路、91:シーケンス制御部、92:第1カウンタ、93:第1デコーダ、94:リセット出力回路、95:マスク回路、96:第2カウンタ、97:発振器、98:第2デコーダ。
Claims (2)
- 光ビームの焦点位置を試料に対して光軸と垂直な方向に走査する共焦点スキャナと、
前記光ビームの焦点位置を試料に対して光軸方向に走査する移動機構と、
試料の前記光ビームによる像を撮像するカメラと、
前記カメラの垂直同期信号に同期して、垂直同期信号周期毎に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させる移動制御部とを備え、
前記移動制御部は、前記カメラの前記光ビームによる像の撮像期間中にのみ、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に移動させ、前記カメラの前記光ビームによる像の撮像期間を除く期間には前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に移動させないことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。 - 請求項1記載の共焦点顕微鏡装置であって、
前記カメラの撮像と並行して、前記カメラによって撮像された像より前記試料の3次元表現による像を再構成して表示すると共に、前記カメラによって新たに撮像された像によって前記3次元表現による像を更新する表示手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
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