JP3582234B2 - ＩｇＡ腎症特異的フィブロネクチン断片、その検出方法およびキット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片に関し、さらにそのフィブロネクチン断片の、結合アッセイ法を用いた検出方法および検出用キットに関する。さらにＩｇＡ腎症の診断方法および診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩｇＡ腎症とは慢性糸球体腎炎のうち、糸球体メサンギウム領域、ときに糸球体毛細血管壁にかけてのＩｇＡを主体とする沈着物を認めるものをいう。またＩｇＡ腎症はメサンギウム増殖性糸球体腎炎のひとつであり、メサンギウムの病変が主体となる。初期ないし軽症ではメサンギウム細胞および基質の軽度の増殖が見られる。病状が進行してくるとこれらの変化が増強し、それと同時に分節状の小半月体形成、係蹄癒着が生じ、メサンギウム基質の増加が進み、硬化性変化が増強される。この糸球体病変の程度に応じて、尿細管萎縮、間質の細胞浸潤と繊維化、細動脈の硬化が進む。
【０００３】
ＩｇＡ腎症は慢性糸球体腎炎のうち最大頻度を占めており、長期的には末期腎不全へ至る症例が少なくないことから、早期に的確な診断と予後判定を行い、個々の症例に適した治療を実施することが望まれるが、症状は大部分が無症候であるため、早期に的確な判断を行うことが困難である。
【０００４】
従来、ＩｇＡ腎症の診断方法は光顕的、免疫蛍光抗体法または電顕的検索といった腎生検による糸球体の観察が唯一の方法であった。しかも、この腎生検でＩｇＡ腎症が検出できるのは病状がかなり進行してからである。
近年報告された方法にセデルホルムらの“ＩｇＡ腎臓病の診断のための方法およびキット”（特表平２−５０３７１４）がある。セデルホルムらは、ＩｇＡ腎症において血清ＩｇＡが特異的にコラーゲンと親和性を持ち、その結合にフィブロネクチンが介していること、ＩｇＡ腎症患者らにＩｇＡ−フィブロネクチン複合体が存在することを見いだし、診断方法およびキットを提供したが、検出率および、測定値の再現性に問題が残るものであり、依然としてＩｇＡ腎症を早期に的確に診断しうる診断方法が望まれていた。
【０００５】
フィブロネクチンは線維芽細胞や内皮細胞の表面、生体の基底膜面、血液中等に存在する粘着性の糖タンパク質で、サブユニットαおよびβが２個のジスルフィド結合を介して結合している分子量約４０万の高分子物質である。コラーゲン、ヘパリン、フィブリンに親和性を示し、細胞間の接着、損傷組織の修復、更に免疫応答の環境作りに関与する性質を有する等、数多くの生物学的機能を有している。また近年フィブロネクチン自体の研究が急速に進み、種々のプロテアーゼによるフィブロネクチン断片化の解析が行われている。フィブロネクチンは断片化されることによりマトリックス形成に関わる多くの生物活性を示すことが知られているが、フィブロネクチンの断片化が生体内でどの様な機能に対応しているのかは殆ど明確にされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
的確な予後判定および個々の症例に適した治療を実施するために、ＩｇＡ腎症を早期に、的確に診断できることが望まれるが、本発明の目的はＩｇＡ腎症の患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片の提供、およびそれを検出する方法ならびに検出用キット、さらにはＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片を検出することによるＩｇＡ腎症の診断方法およびＩｇＡ腎症の診断用キットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的達成のため、本発明者らが鋭意研究を行なった結果、ＩｇＡ腎症の患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片を見い出し、本発明を完成するに至った。以下に本発明について詳細に説明する。
本発明は下記の通りである。
（１） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片。
（２） ＩｇＡ腎症患者に優位に観察される上記（１）記載のフィブロネクチン断片。
（３） 分子量が２５ＫＤａ〜４０ＫＤａである上記（１）記載のフィブロネクチン断片。
（４） フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内の部分に存在する上記（１）記載のフィブロネクチン断片。
（５） フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質および、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いる結合アッセイ法により試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
（６） 次の工程からなる上記（５）記載の検出方法。
ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチンを該物質に結合させ、試料中のフィブロネクチンを除去した後、
ｂ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチン断片を該物質に結合させ、
ｃ）そして、こうして生じたフィブロネクチン断片とＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質との複合体を検出することにより試料中のフィブロネクチン断片の存在を測定する。
（７） ａ）試料をヘパリンアフィニティ処理により前処理し、
ｂ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いてウエスタンブロットを行なうことにより、
試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
（８） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いる、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
（９） 次の工程よりなる上記（８）記載の検出方法。
ａ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチン断片を該物質に結合させ、
ｂ）そして、こうして生じた、フィブロネクチン断片とＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質との複合体を検出することにより試料中のフィブロネクチン断片の存在を測定する。
（１０） ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質を含む第１成分、および
ｂ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む第２成分、
から構成されるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の検出用キット。
（１１） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第３成分を含む上記（１０）記載のフィブロネクチン断片の検出用キット。
（１２） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む成分からなる検出用キット。
（１３） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第２の成分を含む上記（１２）記載の検出用キット。（１４） フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質と、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いた結合アッセイ法により、被検者から採取した体液試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出することを特徴とするＩｇＡ腎症の診断方法。
（１５） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いた結合アッセイ法により被検者から採取した体液試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出することを特徴とするＩｇＡ腎症の診断方法。
（１６） ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質を含む第１成分、および
ｂ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む第２成分、
から構成されるＩｇＡ腎症診断用キット。
（１７） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第３成分を含む上記（１６）記載のＩｇＡ腎症診断用キット。
（１８） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む成分から構成されるＩｇＡ腎症診断用キット。
（１９） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第２の成分を含む上記（１８）記載のＩｇＡ腎症診断用キット。
【０００８】
本発明者らは、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を得ることに成功し、当該断片がＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるという新知見を得た。さらにこのフィブロネクチン断片がＩｇＡと結合し、メサンギウムにおけるＩｇＡの沈着を来しＩｇＡ腎症が発症することが予想される。
【０００９】
本発明の断片はＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するものであり、さらに次の特徴を有する。
ａ）ＩｇＡ腎症患者に優位に観察される。
ｂ）分子量が２５ＫＤａ〜４０ＫＤａである。
ｃ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内の部分に存在する。
【００１０】
本発明のフィブロネクチン断片はＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合する断片であるが、ＦＮＨ３−８抗体はフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降に位置するカルボキシル末端側ヘパリン結合ドメインの部分を、ＦＮ１−１抗体はフィブロネクチンのカルボキシル末端のジスルフィド結合の部分を、ＦＮ８−１２抗体はフィブロネクチンのカルボキシル末端側から４０ＫＤａ以内に位置するフィブリン結合ドメインを、それぞれ特異的に認識することが知られている。これらの抗体は、例えば、フィブロネクチンをサーモリシンによって限定分解した時に得られる、各部分を含む断片を抗原としてマウスに免疫し、常法に従ってモノクローナル抗体を作成することにより得られる。これらの抗体はそれぞれ宝酒造株式会社より入手できる。
【００１１】
本発明のフィブロネクチン断片は、例えば次の様にして得ることができる。即ち、原料を適当な精製手段に付すことによって調製することができる。かかる精製手段としては、例えば、分別沈澱、限外濾過、結晶化等の操作や、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法が例示される。さらに、これらの方法を組み合わせることにより、より純粋に得ることができる。より具体的には、例えば次の方法によって調製することができる。 ＦＮＨ３−８抗体を吸着体として用いたカラムにヘパリン処理した血清を流し、非吸着物質をＦＮ１−１抗体またはＦＮ８−１２抗体を吸着体としたカラムにかけて、このカラムに吸着した物質を溶出することにより得られる。ヘパリン処理には、例えばヘパリンカラムに吸着させる方法が挙げられる。
微量のフィブロネクチン断片を得るためには、例えば原料をヘパリンアフィニティ処理した後、変性処理等の操作を行ない、常法通りＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、分離することによって行なわれる。当該分離方法には例えば、得られたポリアクリルアミドゲルを細切し、物理的な破砕により抽出する方法、電気的手段により抽出する方法が挙げられる。抽出に用いられる緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス塩緩衝液等が用いられる。これらの緩衝液には界面活性剤を含んだものも使用できる。
原料としては当該フィブロネクチン断片を含む溶液、例えばＩｇＡ腎症患者の血液、血清、血漿又は唾液等が使用できる。
変性処理には２−メルカプトエタノールやＤＴＴ等の還元剤による処理が挙げられる。
【００１２】
本発明におけるフィブロネクチン断片を検出する方法は、前記のようにして行なわれる。
また、当該フィブロネクチン断片の検出方法に用いる物質を前記のようにキットとしておくことで試料中のフィブロネクチン断片を簡便に測定することができる。
【００１３】
本発明の検出方法における試料としては、フィブロネクチン断片の存在の可能性のあるものであれば特に制限はなく、例えばヒトの血液、血清、血漿、唾液等が使用される。
【００１４】
本発明の検出方法および検出用キットで用いられるフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質としては、例えばＦＮＨ３−８抗体が挙げられる。ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質としては、例えばＦＮ１−１抗体、ＦＮ８−１２抗体等が挙げられる。
これらの抗体は完全な形の抗体のままで用い得ることは勿論のこと、その本質的結合能が維持される抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２等として用いることもできる。さらに、適宜抗体希釈用の緩衝液に希釈されていてもよい。
【００１５】
本発明においてＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を単独で用いる場合、例えば、当該フィブロネクチン断片に対する特異抗体の使用が好適である。
【００１６】
また、本発明のフィブロネクチン断片の検出方法および検出用キットにおいて用いられる第１の結合物質であるフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質およびＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質は不溶性担体に結合しておくことが好ましい。用いられる不溶性担体としては例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属およびこれらの組み合わせ等を例示することができる。また不溶性担体の形状としては、例えばトレー状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状で本発明を実施することができる。多数の試料を同時に測定できる点では、９６穴マイクロタイタープレート等が好ましい。不溶性担体への結合は公知の方法が使用できる。
キット化する場合、不溶性担体に結合させた状態で構成されることにより簡便に測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の第２の結合物質であるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を、直接酵素や放射性同位元素或いはＦＩＴＣ等の蛍光物質で標識してもよい。或いはかかる第２の結合物質と、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片との複合体を検出するために第２の結合物質とは異なる認識部位を持つＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を標識したものを第３の結合物質として用いてもよい。
【００１８】
標識にはビオチン等のマーカー化合物、酵素、蛍光色素、放射性同位元素等が用いられる。
【００１９】
酵素を用いる方法では、酵素としては、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）等があり、それぞれの酵素に対応する比色基質、或いは蛍光基質を加え、比色計または蛍光光度計を用いて生成物を定量する。上記酵素の代表的な基質としては、β−Ｇａｌの基質としては、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（比色基質）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（蛍光基質）等、ＨＲＰの基質としては、ｏ−フェニレンジアミン（比色基質）等、ＡＰの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸（比色基質）等を挙げることができる。
放射性同位元素を用いる方法では、１２５Ｉで標識しγ−カウンター等を用いて放射活性を測定する方法が挙げられる。
また、ビオチンで標識した場合、更にアビジン或いはストレプトアビジンを酵素等で標識したものと結合させて検出することも可能である。
また、蛍光物質を用いる方法では、蛍光物質として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等を例示することができる。
【００２０】
本発明のフィブロネクチン断片はウエスタンブロットによっても検出できる。例えば前記のヘパリンアフィニティ処理により前処理した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、タンパク質を膜に転写し、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いて常法に従いウエスタンブロットを行なう。ここで用いる膜はニトロセルロース紙、ナイロン膜、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜等が一般的である。転写後、膜をブロッキング緩衝液で処理し非特異的な結合を防止する。ブロッキング緩衝液としては、ＢＳＡ、スキムミルク等が含まれたものが使用できる。
該フィブロネクチン断片と前記物質の複合体の検出系には、前記の系が使用できる。当該フィブロネクチン断片の分子量はウエスタンブロットの結果、分子量２５ＫＤａ〜４０ＫＤａであることが確認される。
ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体、およびＦＮ８−１２抗体との結合性およびその分子量から当該フィブロネクチン断片はフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内に存在することが示される。
【００２１】
キット化する場合これらの検出系に用いる試薬、洗浄液、ブロッキング用の緩衝液および希釈用の緩衝液等を付属品とすることが好適である。
【００２２】
ＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を前記の様に検出することにより、ＩｇＡ腎症を早期に診断することが可能となる。さらに該検出用キットはＩｇＡ腎症診断用キットとしても使用できる。
【００２３】
【実施例】
以下に本発明の実施例をもって説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１ （ウエスタンブロットにより検出されるフィブロネクチン断片）
１）血清のカラム処理
原発性ＩｇＡ腎症の患者の血清、対照として健康な血液供与者の血清を使用した。血清を０．４５μｍのフィルターに通し、あらかじめ０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡化しておいたヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ ヘパリン、ファルマシア社製）に添加する。非吸着物質を除去した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）にてカラム吸着物質を溶出する。
２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による血清中タンパク質の分離ヘパリンカラムで処理した原発性ＩｇＡ腎症の患者の血清および健康な血液供与者の血清を試料とした。各試料に２−メルカプトエタノールを０．２（Ｖ／Ｖ）％になるように添加し５分間煮沸することにより試料を還元した。各試料について７．５％ゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。
３）免疫ブロットによるフィブロネクチンおよびフィブロネクチン断片の検出タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、０．２Ａ、３０分間かけて電気泳動的にニトロセルロース膜（バイオ・ラッド社製）に転写した。２％スキムミルクを含むブロッキング緩衝液を用いて２５℃で１時間インキュベートすることにより非特異的な結合を防止した。続いてマウス抗ヒトフィブロネクチン抗体であるＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体、ＦＮ８−１２抗体（全て宝酒造社製）を１次抗体として用い、各々２５℃で１時間インキュベートし反応させた。さらに２次抗体としてアルカリホスファターゼで標識された抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を用い、２５℃で１時間インキュベートし反応させた。反応後、発色基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を用い酵素反応を行い、発色させ、試料中のフィブロネクチンおよびフィブロネクチン断片を検出した。
ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体を各々１次抗体として用いた場合のウエスタンブロット像を図１に示す。
分子量２５ＫＤａ〜４０ＫＤａの位置にＩｇＡ腎症の患者の血清に優位に、ＦＮＨ３−８抗体で認識されず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体で認識されるフィブロネクチン断片が存在している。
さらに、ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体、およびＦＮ８−１２抗体との結合性およびその分子量から当該フィブロネクチン断片はフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内に存在することが示される。
【００２４】
実施例２ （ＥＬＩＳＡ法によるフィブロネクチン断片の検出）
０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中で、ＦＮ１−１抗体（宝酒造社製）をポリスチレン製の９６穴のマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に非変性条件下で一夜被覆した。これに続いて非特異的な結合を防止するために０．２％の血清アルブミンを含む同じ緩衝液で２５℃で１時間インキュベートし、ＦＮ１−１抗体固定化マイクロタイタープレートを作成した。同様にして別のポリスチレン製の９６穴のマイクロタイタープレートにＦＮＨ３−８抗体を固定化したものを作成した。
検体には原発性ＩｇＡ腎症の患者の血清（Ｎ＝４０）、対照として健康な血液供与者の血清（Ｎ＝３２）を使用した。
各血清をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２５倍に希釈し、ＦＮＨ３−８抗体が被覆されたマイクロタイタープレート中で２５℃、１時間反応させた。反応後の液をＦＮ１−１抗体が被覆されたマイクロタイタープレート中に移し２５℃で１時間反応させた。次に、あらかじめビオチンを結合させたＦＮ８−１２抗体を反応液の入っているマイクロタイタープレート中に添加し、２５℃、１時間反応させることでビオチン標識されたＦＮ８−１２抗体はマイクロタイタープレート上でＦＮ１−１抗体に結合したフィブロネクチン断片に結合する。アルカリホスファターゼで標識されたストレプトアビジン（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．製）を添加し２５℃で１時間反応させた。発色基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用い、反応後０分の吸光度および６０分間、２５℃で反応した後の吸光度を各々測定し、その差を測定することによりフィブロネクチン断片を検出、およびその量を測定した。
吸光度測定はマイクロプレートリーダ ＭＴＰ−１２０（コロナ電気社製）を用いて４０５ｎｍで測定した。
抗体の被覆工程より以降の各工程の間、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いてマイクロタイタープレートを洗浄した。
各工程を模式的に示した図を図２に示す。
各検体について２試料ずつ測定し、その平均値を計算し、試料中に含まれるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の量に対する分布図を図３に示した。
ＩｇＡ腎症の患者の血清に優位にフィブロネクチン断片が検出された。
【００２５】
実施例３ （ＩｇＡ腎症特異的なフィブロネクチン断片を検出することによるＩｇＡ腎症診断用キット）
ＩｇＡ腎症診断用キットには下記の成分が含まれる。
１）抗体固定化９６穴マイクロタイタープレート ２種類
ａ）ＦＮＨ３−８抗体（宝酒造社製）が固定化された９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）
ｂ）ＦＮ１−１抗体（宝酒造社製）が固定化された９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）
両プレートともすでに２％スキムミルクを含有するブロッキング緩衝液で処理されている。
２）アルカリホスファターゼ標識抗体
ＦＮ８−１２抗体（宝酒造社製）をアルカリホスファターゼで標識したもの。
３）発色試薬
アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を含む。
４）反応停止液
水酸化ナトリウムを含む。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片は、ＩｇＡ腎症の発症機構の探索用として、また、当該断片にてその抗体を容易に調製することができ、当該抗体を使用することによって、より簡便なＩｇＡ腎症の診断が可能となる。さらに、本発明のフィブロネクチン断片の検出方法、検出用キット、さらに本発明のフィブロネクチン断片を検出することにより可能であるＩｇＡ腎症の診断方法、診断用キットを用いることによりＩｇＡ腎症の早期での的確な診断が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩｇＡ腎症の患者の血清および対照としての健康な血液供与者の血清の、ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体を各々１次抗体として用いた場合の電気泳動写真像（ウエスタンブロット像）である。図中の矢印はＩｇＡ腎症の患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片の位置を示している。
【図２】ＥＬＩＳＡ法によるフィブロネクチン断片の検出の方法を模式的に示した模式図である。
【図３】ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の量に対する、ＩｇＡ腎症の患者および対照としての健康な血液供与者の分布図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片に関し、さらにそのフィブロネクチン断片の、結合アッセイ法を用いた検出方法および検出用キットに関する。さらにＩｇＡ腎症の診断方法および診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩｇＡ腎症とは慢性糸球体腎炎のうち、糸球体メサンギウム領域、ときに糸球体毛細血管壁にかけてのＩｇＡを主体とする沈着物を認めるものをいう。またＩｇＡ腎症はメサンギウム増殖性糸球体腎炎のひとつであり、メサンギウムの病変が主体となる。初期ないし軽症ではメサンギウム細胞および基質の軽度の増殖が見られる。病状が進行してくるとこれらの変化が増強し、それと同時に分節状の小半月体形成、係蹄癒着が生じ、メサンギウム基質の増加が進み、硬化性変化が増強される。この糸球体病変の程度に応じて、尿細管萎縮、間質の細胞浸潤と繊維化、細動脈の硬化が進む。
【０００３】
ＩｇＡ腎症は慢性糸球体腎炎のうち最大頻度を占めており、長期的には末期腎不全へ至る症例が少なくないことから、早期に的確な診断と予後判定を行い、個々の症例に適した治療を実施することが望まれるが、症状は大部分が無症候であるため、早期に的確な判断を行うことが困難である。
【０００４】
従来、ＩｇＡ腎症の診断方法は光顕的、免疫蛍光抗体法または電顕的検索といった腎生検による糸球体の観察が唯一の方法であった。しかも、この腎生検でＩｇＡ腎症が検出できるのは病状がかなり進行してからである。
近年報告された方法にセデルホルムらの“ＩｇＡ腎臓病の診断のための方法およびキット”（特表平２−５０３７１４）がある。セデルホルムらは、ＩｇＡ腎症において血清ＩｇＡが特異的にコラーゲンと親和性を持ち、その結合にフィブロネクチンが介していること、ＩｇＡ腎症患者らにＩｇＡ−フィブロネクチン複合体が存在することを見いだし、診断方法およびキットを提供したが、検出率および、測定値の再現性に問題が残るものであり、依然としてＩｇＡ腎症を早期に的確に診断しうる診断方法が望まれていた。
【０００５】
フィブロネクチンは線維芽細胞や内皮細胞の表面、生体の基底膜面、血液中等に存在する粘着性の糖タンパク質で、サブユニットαおよびβが２個のジスルフィド結合を介して結合している分子量約４０万の高分子物質である。コラーゲン、ヘパリン、フィブリンに親和性を示し、細胞間の接着、損傷組織の修復、更に免疫応答の環境作りに関与する性質を有する等、数多くの生物学的機能を有している。また近年フィブロネクチン自体の研究が急速に進み、種々のプロテアーゼによるフィブロネクチン断片化の解析が行われている。フィブロネクチンは断片化されることによりマトリックス形成に関わる多くの生物活性を示すことが知られているが、フィブロネクチンの断片化が生体内でどの様な機能に対応しているのかは殆ど明確にされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
的確な予後判定および個々の症例に適した治療を実施するために、ＩｇＡ腎症を早期に、的確に診断できることが望まれるが、本発明の目的はＩｇＡ腎症の患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片の提供、およびそれを検出する方法ならびに検出用キット、さらにはＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片を検出することによるＩｇＡ腎症の診断方法およびＩｇＡ腎症の診断用キットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的達成のため、本発明者らが鋭意研究を行なった結果、ＩｇＡ腎症の患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片を見い出し、本発明を完成するに至った。以下に本発明について詳細に説明する。
本発明は下記の通りである。
（１） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片。
（２） ＩｇＡ腎症患者に優位に観察される上記（１）記載のフィブロネクチン断片。
（３） 分子量が２５ＫＤａ〜４０ＫＤａである上記（１）記載のフィブロネクチン断片。
（４） フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内の部分に存在する上記（１）記載のフィブロネクチン断片。
（５） フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質および、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いる結合アッセイ法により試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
（６） 次の工程からなる上記（５）記載の検出方法。
ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチンを該物質に結合させ、試料中のフィブロネクチンを除去した後、
ｂ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチン断片を該物質に結合させ、
ｃ）そして、こうして生じたフィブロネクチン断片とＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質との複合体を検出することにより試料中のフィブロネクチン断片の存在を測定する。
（７） ａ）試料をヘパリンアフィニティ処理により前処理し、
ｂ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いてウエスタンブロットを行なうことにより、
試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
（８） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いる、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
（９） 次の工程よりなる上記（８）記載の検出方法。
ａ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチン断片を該物質に結合させ、
ｂ）そして、こうして生じた、フィブロネクチン断片とＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質との複合体を検出することにより試料中のフィブロネクチン断片の存在を測定する。
（１０） ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質を含む第１成分、および
ｂ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む第２成分、
から構成されるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の検出用キット。
（１１） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第３成分を含む上記（１０）記載のフィブロネクチン断片の検出用キット。
（１２） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む成分からなる検出用キット。
（１３） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第２の成分を含む上記（１２）記載の検出用キット。（１４） フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質と、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いた結合アッセイ法により、被検者から採取した体液試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出することを特徴とするＩｇＡ腎症の診断方法。
（１５） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いた結合アッセイ法により被検者から採取した体液試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出することを特徴とするＩｇＡ腎症の診断方法。
（１６） ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質を含む第１成分、および
ｂ）ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む第２成分、
から構成されるＩｇＡ腎症診断用キット。
（１７） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第３成分を含む上記（１６）記載のＩｇＡ腎症診断用キット。
（１８） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を含む成分から構成されるＩｇＡ腎症診断用キット。
（１９） ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする第２の成分を含む上記（１８）記載のＩｇＡ腎症診断用キット。
【０００８】
本発明者らは、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を得ることに成功し、当該断片がＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるという新知見を得た。さらにこのフィブロネクチン断片がＩｇＡと結合し、メサンギウムにおけるＩｇＡの沈着を来しＩｇＡ腎症が発症することが予想される。
【０００９】
本発明の断片はＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するものであり、さらに次の特徴を有する。
ａ）ＩｇＡ腎症患者に優位に観察される。
ｂ）分子量が２５ＫＤａ〜４０ＫＤａである。
ｃ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内の部分に存在する。
【００１０】
本発明のフィブロネクチン断片はＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合する断片であるが、ＦＮＨ３−８抗体はフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降に位置するカルボキシル末端側ヘパリン結合ドメインの部分を、ＦＮ１−１抗体はフィブロネクチンのカルボキシル末端のジスルフィド結合の部分を、ＦＮ８−１２抗体はフィブロネクチンのカルボキシル末端側から４０ＫＤａ以内に位置するフィブリン結合ドメインを、それぞれ特異的に認識することが知られている。これらの抗体は、例えば、フィブロネクチンをサーモリシンによって限定分解した時に得られる、各部分を含む断片を抗原としてマウスに免疫し、常法に従ってモノクローナル抗体を作成することにより得られる。これらの抗体はそれぞれ宝酒造株式会社より入手できる。
【００１１】
本発明のフィブロネクチン断片は、例えば次の様にして得ることができる。即ち、原料を適当な精製手段に付すことによって調製することができる。かかる精製手段としては、例えば、分別沈澱、限外濾過、結晶化等の操作や、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法が例示される。さらに、これらの方法を組み合わせることにより、より純粋に得ることができる。より具体的には、例えば次の方法によって調製することができる。 ＦＮＨ３−８抗体を吸着体として用いたカラムにヘパリン処理した血清を流し、非吸着物質をＦＮ１−１抗体またはＦＮ８−１２抗体を吸着体としたカラムにかけて、このカラムに吸着した物質を溶出することにより得られる。ヘパリン処理には、例えばヘパリンカラムに吸着させる方法が挙げられる。
微量のフィブロネクチン断片を得るためには、例えば原料をヘパリンアフィニティ処理した後、変性処理等の操作を行ない、常法通りＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、分離することによって行なわれる。当該分離方法には例えば、得られたポリアクリルアミドゲルを細切し、物理的な破砕により抽出する方法、電気的手段により抽出する方法が挙げられる。抽出に用いられる緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス塩緩衝液等が用いられる。これらの緩衝液には界面活性剤を含んだものも使用できる。
原料としては当該フィブロネクチン断片を含む溶液、例えばＩｇＡ腎症患者の血液、血清、血漿又は唾液等が使用できる。
変性処理には２−メルカプトエタノールやＤＴＴ等の還元剤による処理が挙げられる。
【００１２】
本発明におけるフィブロネクチン断片を検出する方法は、前記のようにして行なわれる。
また、当該フィブロネクチン断片の検出方法に用いる物質を前記のようにキットとしておくことで試料中のフィブロネクチン断片を簡便に測定することができる。
【００１３】
本発明の検出方法における試料としては、フィブロネクチン断片の存在の可能性のあるものであれば特に制限はなく、例えばヒトの血液、血清、血漿、唾液等が使用される。
【００１４】
本発明の検出方法および検出用キットで用いられるフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質としては、例えばＦＮＨ３−８抗体が挙げられる。ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質としては、例えばＦＮ１−１抗体、ＦＮ８−１２抗体等が挙げられる。
これらの抗体は完全な形の抗体のままで用い得ることは勿論のこと、その本質的結合能が維持される抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２等として用いることもできる。さらに、適宜抗体希釈用の緩衝液に希釈されていてもよい。
【００１５】
本発明においてＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を単独で用いる場合、例えば、当該フィブロネクチン断片に対する特異抗体の使用が好適である。
【００１６】
また、本発明のフィブロネクチン断片の検出方法および検出用キットにおいて用いられる第１の結合物質であるフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降の部分を認識する物質およびＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質は不溶性担体に結合しておくことが好ましい。用いられる不溶性担体としては例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属およびこれらの組み合わせ等を例示することができる。また不溶性担体の形状としては、例えばトレー状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状で本発明を実施することができる。多数の試料を同時に測定できる点では、９６穴マイクロタイタープレート等が好ましい。不溶性担体への結合は公知の方法が使用できる。
キット化する場合、不溶性担体に結合させた状態で構成されることにより簡便に測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の第２の結合物質であるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を、直接酵素や放射性同位元素或いはＦＩＴＣ等の蛍光物質で標識してもよい。或いはかかる第２の結合物質と、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片との複合体を検出するために第２の結合物質とは異なる認識部位を持つＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を標識したものを第３の結合物質として用いてもよい。
【００１８】
標識にはビオチン等のマーカー化合物、酵素、蛍光色素、放射性同位元素等が用いられる。
【００１９】
酵素を用いる方法では、酵素としては、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）等があり、それぞれの酵素に対応する比色基質、或いは蛍光基質を加え、比色計または蛍光光度計を用いて生成物を定量する。上記酵素の代表的な基質としては、β−Ｇａｌの基質としては、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（比色基質）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（蛍光基質）等、ＨＲＰの基質としては、ｏ−フェニレンジアミン（比色基質）等、ＡＰの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸（比色基質）等を挙げることができる。
放射性同位元素を用いる方法では、１２５Ｉで標識しγ−カウンター等を用いて放射活性を測定する方法が挙げられる。
また、ビオチンで標識した場合、更にアビジン或いはストレプトアビジンを酵素等で標識したものと結合させて検出することも可能である。
また、蛍光物質を用いる方法では、蛍光物質として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等を例示することができる。
【００２０】
本発明のフィブロネクチン断片はウエスタンブロットによっても検出できる。例えば前記のヘパリンアフィニティ処理により前処理した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、タンパク質を膜に転写し、ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を認識する物質を用いて常法に従いウエスタンブロットを行なう。ここで用いる膜はニトロセルロース紙、ナイロン膜、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜等が一般的である。転写後、膜をブロッキング緩衝液で処理し非特異的な結合を防止する。ブロッキング緩衝液としては、ＢＳＡ、スキムミルク等が含まれたものが使用できる。
該フィブロネクチン断片と前記物質の複合体の検出系には、前記の系が使用できる。当該フィブロネクチン断片の分子量はウエスタンブロットの結果、分子量２５ＫＤａ〜４０ＫＤａであることが確認される。
ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体、およびＦＮ８−１２抗体との結合性およびその分子量から当該フィブロネクチン断片はフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内に存在することが示される。
【００２１】
キット化する場合これらの検出系に用いる試薬、洗浄液、ブロッキング用の緩衝液および希釈用の緩衝液等を付属品とすることが好適である。
【００２２】
ＩｇＡ腎症患者に優位に観察されるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を前記の様に検出することにより、ＩｇＡ腎症を早期に診断することが可能となる。さらに該検出用キットはＩｇＡ腎症診断用キットとしても使用できる。
【００２３】
【実施例】
以下に本発明の実施例をもって説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１ （ウエスタンブロットにより検出されるフィブロネクチン断片）
１）血清のカラム処理
原発性ＩｇＡ腎症の患者の血清、対照として健康な血液供与者の血清を使用した。血清を０．４５μｍのフィルターに通し、あらかじめ０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡化しておいたヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ ヘパリン、ファルマシア社製）に添加する。非吸着物質を除去した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）にてカラム吸着物質を溶出する。
２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による血清中タンパク質の分離ヘパリンカラムで処理した原発性ＩｇＡ腎症の患者の血清および健康な血液供与者の血清を試料とした。各試料に２−メルカプトエタノールを０．２（Ｖ／Ｖ）％になるように添加し５分間煮沸することにより試料を還元した。各試料について７．５％ゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。
３）免疫ブロットによるフィブロネクチンおよびフィブロネクチン断片の検出タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、０．２Ａ、３０分間かけて電気泳動的にニトロセルロース膜（バイオ・ラッド社製）に転写した。２％スキムミルクを含むブロッキング緩衝液を用いて２５℃で１時間インキュベートすることにより非特異的な結合を防止した。続いてマウス抗ヒトフィブロネクチン抗体であるＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体、ＦＮ８−１２抗体（全て宝酒造社製）を１次抗体として用い、各々２５℃で１時間インキュベートし反応させた。さらに２次抗体としてアルカリホスファターゼで標識された抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を用い、２５℃で１時間インキュベートし反応させた。反応後、発色基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を用い酵素反応を行い、発色させ、試料中のフィブロネクチンおよびフィブロネクチン断片を検出した。
ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体を各々１次抗体として用いた場合のウエスタンブロット像を図１に示す。
分子量２５ＫＤａ〜４０ＫＤａの位置にＩｇＡ腎症の患者の血清に優位に、ＦＮＨ３−８抗体で認識されず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体で認識されるフィブロネクチン断片が存在している。
さらに、ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体、およびＦＮ８−１２抗体との結合性およびその分子量から当該フィブロネクチン断片はフィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以内に存在することが示される。
【００２４】
実施例２ （ＥＬＩＳＡ法によるフィブロネクチン断片の検出）
０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中で、ＦＮ１−１抗体（宝酒造社製）をポリスチレン製の９６穴のマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に非変性条件下で一夜被覆した。これに続いて非特異的な結合を防止するために０．２％の血清アルブミンを含む同じ緩衝液で２５℃で１時間インキュベートし、ＦＮ１−１抗体固定化マイクロタイタープレートを作成した。同様にして別のポリスチレン製の９６穴のマイクロタイタープレートにＦＮＨ３−８抗体を固定化したものを作成した。
検体には原発性ＩｇＡ腎症の患者の血清（Ｎ＝４０）、対照として健康な血液供与者の血清（Ｎ＝３２）を使用した。
各血清をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２５倍に希釈し、ＦＮＨ３−８抗体が被覆されたマイクロタイタープレート中で２５℃、１時間反応させた。反応後の液をＦＮ１−１抗体が被覆されたマイクロタイタープレート中に移し２５℃で１時間反応させた。次に、あらかじめビオチンを結合させたＦＮ８−１２抗体を反応液の入っているマイクロタイタープレート中に添加し、２５℃、１時間反応させることでビオチン標識されたＦＮ８−１２抗体はマイクロタイタープレート上でＦＮ１−１抗体に結合したフィブロネクチン断片に結合する。アルカリホスファターゼで標識されたストレプトアビジン（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．製）を添加し２５℃で１時間反応させた。発色基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用い、反応後０分の吸光度および６０分間、２５℃で反応した後の吸光度を各々測定し、その差を測定することによりフィブロネクチン断片を検出、およびその量を測定した。
吸光度測定はマイクロプレートリーダ ＭＴＰ−１２０（コロナ電気社製）を用いて４０５ｎｍで測定した。
抗体の被覆工程より以降の各工程の間、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いてマイクロタイタープレートを洗浄した。
各工程を模式的に示した図を図２に示す。
各検体について２試料ずつ測定し、その平均値を計算し、試料中に含まれるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の量に対する分布図を図３に示した。
ＩｇＡ腎症の患者の血清に優位にフィブロネクチン断片が検出された。
【００２５】
実施例３ （ＩｇＡ腎症特異的なフィブロネクチン断片を検出することによるＩｇＡ腎症診断用キット）
ＩｇＡ腎症診断用キットには下記の成分が含まれる。
１）抗体固定化９６穴マイクロタイタープレート ２種類
ａ）ＦＮＨ３−８抗体（宝酒造社製）が固定化された９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）
ｂ）ＦＮ１−１抗体（宝酒造社製）が固定化された９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）
両プレートともすでに２％スキムミルクを含有するブロッキング緩衝液で処理されている。
２）アルカリホスファターゼ標識抗体
ＦＮ８−１２抗体（宝酒造社製）をアルカリホスファターゼで標識したもの。
３）発色試薬
アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を含む。
４）反応停止液
水酸化ナトリウムを含む。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片は、ＩｇＡ腎症の発症機構の探索用として、また、当該断片にてその抗体を容易に調製することができ、当該抗体を使用することによって、より簡便なＩｇＡ腎症の診断が可能となる。さらに、本発明のフィブロネクチン断片の検出方法、検出用キット、さらに本発明のフィブロネクチン断片を検出することにより可能であるＩｇＡ腎症の診断方法、診断用キットを用いることによりＩｇＡ腎症の早期での的確な診断が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩｇＡ腎症の患者の血清および対照としての健康な血液供与者の血清の、ＦＮＨ３−８抗体、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体を各々１次抗体として用いた場合の電気泳動写真像（ウエスタンブロット像）である。図中の矢印はＩｇＡ腎症の患者に優位に観察されるフィブロネクチン断片の位置を示している。
【図２】ＥＬＩＳＡ法によるフィブロネクチン断片の検出の方法を模式的に示した模式図である。
【図３】ＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の量に対する、ＩｇＡ腎症の患者および対照としての健康な血液供与者の分布図である。
Claims (5)
- フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降に位置するカルボキシル末端側ヘパリン結合ドメインの部分を認識するＦＮＨ３−８抗体、フィブロネクチンのカルボキシル末端のジスルフィド結合の部分を認識するＦＮ１−１抗体およびフィブロネクチンのカルボキシル末端側から４０ＫＤａ以内に位置するフィブリン結合ドメインを認識するＦＮ８−１２抗体を用いる結合アッセイ法により試料中のＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。
- 次の工程からなる請求項１記載の検出方法。
ａ）ＦＮＨ３−８抗体を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチンを該抗体に結合させ、試料中のフィブロネクチンを除去した後、
ｂ）ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体を試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチン断片を該ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体に結合させ、
ｃ）そして、こうして生じた、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体との複合体を検出することにより試料中のフィブロネクチン断片の存在を測定する。 - ａ）試料をヘパリンアフィニティ処理により前処理し、
ｂ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、フィブロネクチンのカルボキシル末端のジスルフィド結合の部分を認識するＦＮ１−１抗体およびフィブロネクチンのカルボキシル末端側から４０ＫＤａ以内に位置するフィブリン結合ドメインを認識するＦＮ８−１２抗体を用いてウエスタンブロットを行なうことにより、
試料中の、フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降に位置するカルボキシル末端側ヘパリン結合ドメインの部分を認識するＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片を検出する方法。 - ａ）フィブロネクチンのカルボキシル末端から４０ＫＤａ以降に位置するカルボキシル末端側ヘパリン結合ドメインの部分を認識するＦＮＨ３−８抗体を含む第１成分、および
ｂ）フィブロネクチンのカルボキシル末端のジスルフィド結合の部分を認識するＦＮ１−１抗体またはフィブロネクチンのカルボキシル末端側から４０ＫＤａ以内に位置するフィブリン結合ドメインを認識するＦＮ８−１２抗体を含む第２成分、
から構成されるＦＮＨ３−８抗体と結合せず、ＦＮ１−１抗体およびＦＮ８−１２抗体と結合するフィブロネクチン断片の検出用キット。 - ＦＮ１−１抗体またはＦＮ８−１２抗体に結合したフィブロネクチン断片の測定を可能にする上記抗体のうち残る一方の抗体である第３成分を含む請求項４記載のフィブロネクチン断片の検出用キット。
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