CN108026522B - 特异性纯化的抗普莱晒谱星抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗普莱晒谱星多克隆抗体,其与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合。由此提供与S68抗体相比抗体批次间的测定值的偏差小且适于测定普莱晒谱星的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种对测定检测体中的普莱晒谱星(presepsin)有用的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
背景技术
众所周知,CD14分子是一种表达于单核细胞的膜表面的糖蛋白,并具有作为LPS(脂多糖)的受体的功能。CD14分子具有两种存在形式:表达于细胞表面上的膜结合型CD14(mCD14)和可溶型CD14(sCD14)。作为sCD14,已知分子量约55kDa和约49kDa的sCD14(以下,称为“高分子量可溶型CD14”或“高分子量sCD14”),已报告了sCD14在败血症(SEPSIS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、***性红斑狼疮(SLE)等许多疾病的患者血液中显示出高的值。因此,认为这些高分子量sCD14不是疾病特异性标记(非专利文献1~2)。
另一方面,报告了存在sCD14-ST(可溶性CD14抗原亚型,也称作普莱晒谱星),其作为一种新的sCD14分子,在败血症患者的血液中的浓度特征性地上升的。
所谓sCD14-ST(普莱晒谱星),其特征在于,在sCD14中,在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)中,其迁移至分子量为13±2kDa的位置,并且,保持CD14的N端部。对sCD14-ST而言,与高分子量sCD14相比,其具有C端侧显著缺失的氨基酸序列,而与高分子量sCD14不同的是,其不具有LPS结合能。另外,普莱晒谱星显示出与高分子量sCD14不同的免疫原性,因而能够使用抗体来对两者进行区分。在败血症患者中,普莱晒谱星在血液中的浓度特异性地升高(专利文献1)。另外,报告了:相比于显示出难以与败血症进行判别的全身性炎症反应(SIRS)的患者,普莱晒谱星在败血症患者血液中也显示出更高的值,认为普莱晒谱星是败血症的特异性诊断标记(非专利文献3)。
已公开了可特异性识别普莱晒谱星的来自兔的多克隆抗体(S68抗体)以及来自大鼠的单克隆抗体(F1146-17-2)(专利文献1、2)。
目前,在普莱晒谱星的测定中,使用来自兔的多克隆抗体作为针对普莱晒谱星的特异性抗体的测定***已投入实际应用中,测定试剂盒已在欧洲和日本的市场上销售(PATHFASTTM普莱晒谱星,三菱化学美迪恩斯株式会社)。
对于来自兔的多克隆抗体而言,与来自小鼠等啮齿类的抗体相比,抗原识别能力有多种,且具有强抗原亲和性,另一方面,由于兔的个体差异较大,因此,难以稳定地制备,其抗体产品的批次差大。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2005/108429;
专利文献2:国际公报WO2004/044005。
非专利文献
非专利文献1:Hayashi等,Infection and Immunity,67:417-420,1999年;
非专利文献2:Lawn等,Clinical&Experimental Immunology,120:483-487,2000年;
非专利文献3:Yaegashi等,Journal of Infection and Chemotherapy,11:234-238,2005年。
发明内容
发明所要解决的问题
以往,使用来自兔的抗普莱晒谱星多克隆抗体(S68抗体)测定普莱晒谱星。但是,明确了用S68抗体构建ELISA来测定检测体时,在抗体批次间测定值的偏差较大。
本发明的课题在于,提供与S68抗体相比在抗体批次间测定值的偏差少且适于测定普莱晒谱星的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
另外,本发明的另一课题在于,提供与普莱晒谱星特异性结合且难以与人血液中存在的高分子量sCD14发生交叉反应的高特异性抗体。
另外,本发明的又一课题在于,提供与S68抗体相比与普莱晒谱星的反应性高的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
本发明的目的在于,提供能够解决上述课题中的至少一个的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
解决问题的技术手段
以往的来自兔的抗普莱晒谱星多克隆抗体(S68抗体)通过固定化有S68肽的亲和柱对多克隆抗体进行纯化来制备,所述多克隆抗体是使用S68肽(序列号2)对兔进行免疫而得到的。本发明人发现,通过固定化有P03肽(序列号1)的亲和柱来代替固定化有S68肽的柱对多克隆抗体进行纯化,从而能得到与普莱晒谱星的反应性高的抗普莱晒谱星多克隆抗体。此处,P03肽的序列包括S68肽的一部分。
本发明人通过肽竞争抑制反应试验确认了使用P03肽进行纯化而得到的多克隆抗体的特异性。而且发现,与S68抗体相比,与P03肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(以下,也称作“P03特异多克隆抗体”)在抗体批次间的测定值的偏差小,与人血液中存在的高分子量可溶型CD14(以下,也称作“血液中高分子量sCD14”)难以发生交叉反应,具有适于测定普莱晒谱星的性能,从而完成了本发明。
即,对抗体批次间的测定值的偏差而言,使用三个批次的P03特异多克隆抗体和三个批次的S68抗体测定多个检测体(已知普莱晒谱星的浓度)的普莱晒谱星浓度,对得到的测定值和已知浓度进行相关分析,在实施例中对回归直线的斜率的变动系数(CV)进行评价。在实施例中确认了P03特异多克隆抗体的分析***的CV(10.6%)是比S68抗体(20%)低的值,在使用P03特异多克隆抗体的分析***中,在抗体批次间测定值的偏差小。
另外,对于其与血液中高分子量sCD14的交叉反应而言,在实施例中确认了在使用P03特异多克隆抗体的ELISA分析***中,对血液中高分子量sCD14的交差反应为检测灵敏度以下。
通常,多克隆抗体在制备工序中的特异性纯化使用给药抗原(在本发明中,为S68肽)来进行,除了给药抗原以外,通常没有更适于特异性纯化的肽。本次,令人惊讶的是,通过使用P03肽进行特异性纯化,能得到比S68抗体更适于测定普莱晒谱星的抗体,所述P03肽的序列中包括S68肽的一部分。
即,本发明如下所述。
[1]一种抗普莱晒谱星多克隆抗体,其与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合。
[2]一种抗普莱晒谱星多克隆抗体,相比于S68抗体中的与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体的含有率,抗普莱晒谱星多克隆抗体中的与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体的含有率更高。
[2-1]一种抗普莱晒谱星多克隆抗体,在抗普莱晒谱星多克隆抗体中,与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体的含有率为40%以上。
[3]如上述[1]至[2-1]中任一项所述的抗体,在使由序列号1的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的30%以上受到竞争抑制,
在使由序列号9的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
[3-1]如[1]至[3]中任一项所述的抗体,进一步地满足选自以下的(A)~(C)中的至少一个。
(A)在使由序列号6的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
(B)在使由序列号7的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
(C)在使由序列号8的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
[4]如上述[1]至[3-1]中任一项所述的抗体,使用抗体的ELISA分析***与使用S68抗体的ELISA分析***相比,与人血液中存在的高分子量可溶型CD14的交叉反应的发生率低。
[5]如上述[1]至[4]中任一项所述的抗体,通过使用抗体的ELISA分析***,对含有普莱晒谱星的检测体(已知普莱晒谱星浓度)的普莱晒谱星浓度进行测定,对测定值与已知浓度进行相关分析,在此情况下,回归直线的斜率的变动系数(CV)为15%以下。
[6]如上述[1]至[5]中任一项所述的抗体,抗体以小于10-7的亲和性(KD)与普莱晒谱星结合。
[7]如上述[1]至[6]中任一项所述的抗体,对多克隆抗体进行纯化而得到所述抗体,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽。
[8]如上述[1]至[6]中任一项所述的抗体,通过对多克隆抗体实施提高与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗体的比例的处理而得到,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽。
[9]一种抗普莱晒谱星多克隆抗体,其使用固定化有由序列号1的氨基酸序列构成的肽的柱纯化多克隆抗体而得到,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽。
[10]如上述[9]所述的抗体,进一步地实施除去与由序列号8的氨基酸序列构成的肽结合的抗体的处理。
[11]如上述[9]所述的抗体,进一步地实施减弱与由序列号8的氨基酸序列构成的肽结合的抗体的结合活性的处理。
[11-1]如上述[9]至[11]中任一项所述的抗体,在使由序列号1的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的30%以上受到竞争抑制,
在使由序列号9的氨基酸序列构成的肽进行竞争反应以使抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
[11-2]如上述[9]至[11-1]中任一项所述的抗体,使用所述抗体的ELISA分析***与使用S68抗体的ELISA分析***相比,与人血液中存在的高分子量可溶型CD14的交叉反应的发生率低。
[11-3]如上述[9]至[11-2]中任一项所述的抗体,通过使用抗体的ELISA分析***,测定含有普莱晒谱星的检测体(已知普莱晒谱星浓度)的普莱晒谱星浓度,对测定值与已知浓度进行相关分析,在此情况下,回归直线的斜率的变动系数(CV)为15%以下。
[11-4]如上述[9]至[11-3]中任一项所述的抗体,抗体以小于10-7的亲和性(KD)与普莱晒谱星结合。
[12]一种抗普莱晒谱星多克隆抗体的制造方法,至少包括:得到多克隆抗体的工序,该工序中,从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到多克隆抗体,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽;以及,纯化工序,该工序中,使用固定化有由序列号1的氨基酸序列构成的肽的柱对得到的抗体进行纯化。
[13]如上述[12]所述的制造方法,还包括除去工序,该工序中,将与由序列号8的氨基酸序列构成的肽结合的抗体除去。
[14]一种普莱晒谱星的测定方法,至少包括使上述[1]至[11-4]中任一项所述的抗体与含有普莱晒谱星的检测体进行接触的工序。
[15]一种普莱晒谱星测定用试剂盒,至少包含上述[1]至[11-4]中任一项所述的抗体。
[16]一种用于检测败血症的试剂盒、或者用于对败血症的检测或诊断进行辅助的试剂盒,至少包含上述[1]至[11-4]中任一项所述的抗体。
发明效果
根据本发明,提供与普莱晒谱星的反应性优异且适于对检测体中的普莱晒谱星进行测定的抗普莱晒谱星多克隆抗体,由此能够提高普莱晒谱星测定的质量和精度。
根据本发明的优选方式的抗体,由于用抗体测定普莱晒谱星时,抗体在批次间的测定值的偏差小且适于测定普莱晒谱星,因此能够稳定地提供品质均一且实用性优异的抗体。
通常,使用抗体对检测体进行测定(特别是诊断药)时,重要的是,即使抗体的批次不同,如实施例5所示那样的回归直线的斜率也总是落在一定范围内,对于本发明的优选方式的抗体而言,回归直线的斜率的CV值为10%左右,即使抗体的批次不同,回归直线的斜率也容易落在标准内。
根据本发明的进一步优选的方式的抗体,其在夹心ELISA***中与普莱晒谱星特异性结合,与S68抗体相比,与人血液中存在的高分子量sCD14难以产生交叉反应,因此能够进行高特异性的测定。
附图说明
图1是表示实施例5中得到的P03特异多克隆抗体(P03-A)的回归直线的图。
图2是表示实施例5中得到的P03特异多克隆抗体(P03-B)的回归直线的图。
图3是表示实施例5中得到的P03特异多克隆抗体(P03-C)的回归直线的图。
具体实施方式
下面,详细地说明本发明。下述实施方式是用于说明本发明的示例,并非旨在将本发明仅限定于所述实施方式。在不脱离主旨的范围内,本发明能够以各种形式实施。
1.本发明的抗体
本发明提供以下的抗普莱晒谱星多克隆抗体(称作“本发明的抗体”)。
(1)与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(P03特异多克隆抗体)、或者
(2)抗普莱晒谱星多克隆抗体中与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(P03特异多克隆抗体)的含有率比S68抗体中与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(P03特异多克隆抗体)的含有率更高的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
“普莱晒谱星”也称作sCD14-ST(可溶性CD14抗原亚型)。如上所述,作为CD14,除了膜结合型CD14(mCD14)以外,还有可溶型CD14(sCD14),在血液中存在分子量不同的多个可溶型CD14。普莱晒谱星是CD14的可溶型片段,且具有下述1)~3)的性质。
1)在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中,分子量为13±2kDa;
2)N末端序列具有序列号3的氨基酸序列(人全长可溶型CD14的氨基酸序列)的第1位~第11位的氨基酸序列;以及,
3)与以由序列号2的16个氨基酸残基(相当于序列号3的氨基酸序列的第53位至第68位的氨基酸序列)构成的肽(S68肽)为抗原而制备的抗体特异性结合。
在本发明中,除非另有说明,普莱晒谱星指人普莱晒谱星。普莱晒谱星例如为普莱晒谱星标准品(WO2005/108429的实施例16中记载的rsCD14-ST)。或者,也可以使用具有作为普莱晒谱星的结合活性且对普莱晒谱星的一部分进行了改变的物质。
“抗普莱晒谱星多克隆抗体”是指对普莱晒谱星进行免疫学识别、和/或与普莱晒谱星显示出通常的抗原抗体反应的多克隆抗体。能够通过凝集法、夹心法、直接固相法、竞争法等确认显示出抗原抗体反应。在用亲和性表示抗体识别的对象与该抗体的结合的情况下,通常,平衡解离常数(KD)小于10-7M。
“由序列号1的氨基酸序列构成的肽”是P03肽。“P03肽”是由相当于人全长可溶型CD14(序列号3)的第52位~第61位的氨基酸序列构成的肽。
“与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合”是指抗体与普莱晒谱星的氨基酸序列中的序列号1(P03肽)的氨基酸序列特异性结合而与其他肽不结合。也可以说,抗体特异性识别在P03肽的氨基酸序列中存在的表位,而不识别其他肽。更具体地说,例如,也可以通过下述来表示:按照本说明书的实施例3的记载进行肽竞争抑制反应试验(优选利用吸光度)时,添加P03肽则使本发明的抗体与普莱晒谱星的结合的30%以上受到竞争抑制,而添加其他肽则使小于30%受到竞争抑制。
“其他肽”例如是由序列号6的氨基酸序列构成的肽(P01肽)、由序列号7的氨基酸序列构成的肽(P02肽)、由序列号8的氨基酸序列构成的肽(P04肽)、由序列号9的氨基酸序列构成的肽(P05肽)、由序列号10的氨基酸序列构成的肽(P06肽)、由序列号11的氨基酸序列构成的肽(P07肽)以及由序列号12的氨基酸序列构成的肽(P08肽)。“与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合”包括与固定化于柱上的P03肽特异性结合的情况。“固定化于柱上的P03肽”能够包括在N末端或C末端结合半胱氨酸并通过该半胱氨酸与柱结合的P03肽。
此处,序列号6的氨基酸序列(P01肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第46位~第55位的氨基酸序列。序列号7的氨基酸序列(P02肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第49位~第58位的氨基酸序列。序列号8的氨基酸序列(P04肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第55位~第64位的氨基酸序列。序列号9的氨基酸序列(P05肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第58位~第67位的氨基酸序列。序列号10的氨基酸序列(P06肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第61位~第70位的氨基酸序列。序列号11的氨基酸序列(P07肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第64位~第73位的氨基酸序列。序列号12的氨基酸序列(P08肽)相当于序列号3的氨基酸序列的第67位~第76位的氨基酸序列。
“抗普莱晒谱星多克隆抗体中与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体的含有率比S68抗体中与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体的含有率高”是指,抗普莱晒谱星多克隆抗体所含的P03特异多克隆抗体的比例比S68抗体所含的P03特异多克隆抗体的比例高。对于这种抗体而言,由于具有优选性能的P03特异多克隆抗体的含有率比S68抗体高,因此,与S68抗体相比,其发挥优异的性能。
这种抗体例如能够通过对多克隆抗体实施提高与由序列号1的氨基酸序列构成的肽(P03肽)特异性结合的抗体的比例的处理而得到,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽。详细内容将在后面叙述。
“S68抗体”是用固定化有S68肽的柱对多克隆抗体进行纯化而得到的抗S68肽多克隆抗体,所述多克隆抗体从使用S68肽作为免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到。“S68肽”是由序列号2的氨基酸序列(序列号3的氨基酸序列的第53位至第68位的氨基酸序列)构成的肽。具体的S68抗体的制备方法如WO2004/044005的实施例1以及后述的实施例1所述。
对抗普莱晒谱星多克隆抗体以及S68抗体中的P03特异多克隆的含有率的计算没有特别的限定,例如,按照实施例1和实施例6的记载,对抗普莱晒谱星多克隆抗体或S68抗体(A)进行纯化,取得P03特异多克隆抗体(B),对(A)和(B)的蛋白量进行测定,从而能够求出(B)与(A)的比率。蛋白量的测定能够使用例如实施例1-3中记载的方法等。
对于抗普莱晒谱星多克隆抗体和S68抗体中的P03特异多克隆抗体的含有率的比较而言,优选地,如上所述分别计算多个批次的抗普莱晒谱星多克隆抗体和S68抗体的含有率,优选将含有率的平均值进行比较。对多个批次没有特别的限定,优选为三个批次以上。
本发明的优选方式之一为抗普莱晒谱星多克隆抗体中与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(P03特异多克隆抗体)的含有率高的抗普莱晒谱星多克隆抗体。
“抗普莱晒谱星多克隆抗体中的P03特异多克隆抗体的含有率高”是指抗普莱晒谱星多克隆抗体所含的P03特异多克隆抗体的比例优选为40%以上,更优选为50%以上,进一步优选为60%以上,特别优选为70%以上。多克隆抗体中的P03特异多克隆抗体的含有率的计算能够如上所述地实施。
在本方式中,抗普莱晒谱星多克隆抗体中能够包含的抗体除了P03特异多克隆抗体以外,还有(1)识别P03肽且识别其他肽的抗普莱晒谱星多克隆抗体、(2)不识别P03肽而识别其他肽的抗普莱晒谱星多克隆抗体。“其他肽”为例如P01肽、P02肽、P04肽、P05肽、P06肽、P07肽以及P08肽。
这种抗体例如能够通过对多克隆抗体实施提高与由序列号1的氨基酸序列构成的肽(P03肽)特异性结合的抗体的比例的处理而得到,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽。详细内容将在后面叙述。
在本发明中,除非另有说明,“抗体”一词是指“抗体或其抗原结合性片段”。“抗原结合性片段”是指在抗体的部分片段中,具有与原抗体实质相同的抗原结合性的片段。对于抗原结合性片段而言,例如,可举出Fab、Fab′、F(ab′)2等。
本发明的抗体来自非人哺乳动物。作为本发明的抗体所来源的非人哺乳动物,例如,可举出兔、山羊、马、羊、猪、大鼠、小鼠等。在制备抗体的容易性方面,优选兔、山羊等,更优选兔。
对于本发明的抗体而言,与普莱晒谱星的反应性优异,适于测定检测体中的普莱晒谱星。本发明的抗体与普莱晒谱星的反应性的评价也可以使用本发明的抗体构建夹心ELISA***来进行。该夹心ELISA***更优选为使用(a)本发明的抗体以及(b)F1106-13-3抗体或F1031-8-3抗体(WO2004/044005的实施例3中记载)的夹心ELISA。更具体地说,按照实施例2的记载,也可以将本发明的抗体固定于固相来与普莱晒谱星进行反应,通过吸光度来评价本发明的抗体与普莱晒谱星的反应性。如实施例2所示,求出将抗体与普莱晒谱星0pg/mL进行反应时的吸光度设为1时、抗体与普莱晒谱星500pg/mL进行反应时的吸光度的比(S/N比),能够使用抗体的S/N比来评价其与普莱晒谱星的反应性。本发明的抗体的S/N比优选为36以上,更优选为40以上,进一步优选为45以上。另外,与S68抗体相比,本发明的抗体的S/N比高,优选为1.2倍以上,更优选为2倍以上,进一步优选为2~3倍。
本发明的抗体与普莱晒谱星特异性结合,优选具有比S68抗体对普莱晒谱星的亲和性优异的亲和性。本发明的抗体对普莱晒谱星的亲和性(平衡解离常数,KD值)优选小于10-7M,更优选小于10-8M。本发明的抗体对普莱晒谱星的平衡解离常数例如为10-7M~10-13M的范围。亲和性(平衡解离常数,KD值)例如能够使用BIACORE(GE医疗集团)进行测定。
优选地,本发明的抗体的特征在于,
在使P03肽进行竞争反应(优选利用吸光度)以使该抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的30%以上受到竞争抑制,
在使P05肽进行竞争反应(优选利用吸光度)以使该抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
该反应体系优选为夹心ELISA。更优选为使用(a)本发明的抗体以及(b)F1106-13-3抗体或F1031-8-3抗体(WO2004/044005的实施例3中记载)的夹心ELISA。更具体地说,竞争抑制反应能够通过实施例3中记载的方法来评价。
本发明的抗体更优选的是,由P01肽、P06肽、P07肽以及P08肽产生的竞争抑制小于30%。本发明的抗体进一步优选的是,由选自P02肽和P04肽中的至少一个肽产生的竞争抑制小于30%。本发明的抗体最优选的是,由P02肽和P04肽产生的竞争抑制小于30%。
对本发明的抗体而言,优选的是,与普莱晒谱星特异性结合,但与作为人血液中存在的主要的可溶型CD14的、约55kDa以及约49kDa的可溶型CD14(以下,也称作“血液中高分子量sCD14”)的交叉反应的发生率低。普莱晒谱星的分子量与高分子量sCD14不同,且氨基酸序列比高分子量sCD14更短。因此,认为血液中的普莱晒谱星的结构与高分子量sCD14不同,与抗体的反应性不同,因此,认为本发明的抗体与普莱晒谱星结合得更强。
交叉反应性的评价也可以使用本发明的抗体构建夹心ELISA***来进行。该夹心ELISA***更优选为使用(a)本发明的抗体以及(b)F1106-13-3抗体或F1031-8-3抗体(WO2004/044005的实施例3中记载)的夹心ELISA。更具体地说,交叉反应性的评价能够通过实施例4中记载的方法进行。按照实施例4,将本发明的抗体固定于固相,并与血清中的高分子量sCD14反应,通过吸光度能够对本发明的抗体的交差反应性进行评价。
高分子量sCD14可以使用由序列号3的氨基酸序列构成的人全长可溶型CD14,或者,例如也可以通过对正常人体液进行3C10抗体亲和柱吸附来制备(参照WO2005/108429实施例23)。含有血液中高分子量sCD14的检测体例如能够使用正常人血清和分离CD14的人血清(使血液中高分子量sCD14减少而得的血清)进行制备。对于分离CD14的人血清而言,例如能够按照实施例4的记载,通过将正常人血清应用于固定化有抗CD14抗体的亲和柱而得到。
交叉反应性例如能够通过下述式计算。
交叉反应性(%)=(将使用抗体测定的含有血液中高分子量sCD14的检测体的吸光度绘制在普莱晒谱星标准曲线上而求出的浓度÷用于测定的高分子量sCD14浓度)×100
通过上述式求出的本发明的抗体与高分子量sCD14的交叉反应性优选为检测灵敏度以下。
优选地,对于使用本发明的抗体的ELISA分析***而言,与使用S68抗体的ELISA分析***相比,其与血液中高分子量sCD14的交叉反应的发生率低(交叉反应性的值(%)小)。将交叉反应的发生率进行比较时,优选将抗体的多个批次(例如,三个批次以上)的交叉反应性的平均值进行比较。
本发明的抗体优选具有以下特征:用于测定人血清中的普莱晒谱星浓度时,与S68抗体相比,抗体的批次间的测定值的偏差小,而且抗体的批次间的均匀性高。用于评价批次间的测定值的偏差的人血清中的普莱晒谱星浓度的测定也可以使用本发明的抗体构建夹心ELISA***来进行。该夹心ELISA***更优选为使用(a)本发明的抗体以及(b)F1106-13-3抗体或F1031-8-3抗体(WO2004/044005的实施例3中记载)的夹心ELISA。
更具体地说,批次间的测定值的偏差能够通过实施例5中记载的方法进行评价。能够按照实施例5的记载,将本发明的抗体(例如,使用三个批次)固定于固相,对多个检测体(已知普莱晒谱星的浓度)中的普莱晒谱星浓度进行测定,使用得到的测定值和已知浓度实施相关分析,求出回归直线,从而求出该回归直线的斜率的变动系数(CV)。也可以使用该求出的斜率的CV来评价抗体的批次间的测定值的偏差。本发明的优选方式的抗体的斜率的CV优选为15%以下,更优选为13%以下,特别优选为11%以下。在另一优选方式中,本发明的抗体的斜率的CV比S68抗体小,其差优选为3%以上,更优选为5%以上,进一步优选为8%以上。优选的是,使用普莱晒谱星测定试剂盒(例如PATHFASTTM普莱晒谱星,三菱化学美迪恩斯(三菱化学メディエンス)株式会社等),测定作为基准的已知普莱晒谱星浓度的检测体的普莱晒谱星浓度,所述试剂盒使用了S68抗体。
对于本发明的抗体而言,构建测定体系来测定多个检测体中(已知普莱晒谱星的浓度)的普莱晒谱星时,优选测定值与已知浓度的相关性良好的抗体。相关性良好是指,优选相关系数为0.9以上,更优选为0.95以上。
在本发明的一些方式中,本发明的抗体是纯化的抗体。
本发明的抗体例如通过对多克隆抗体进行纯化而得到,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽(例如S68肽)。
或者,本发明的抗体例如通过对多克隆抗体实施提高与由序列号1的氨基酸序列构成的肽(P03肽)特异性结合的抗体的比例的处理而得到,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的兔中得到,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽(例如S68肽)。
具体而言,本发明的抗体的制造方法如后面所述。
2.本发明的抗体的制造方法
本发明提供抗普莱晒谱星多克隆抗体的制造方法,包括:得到多克隆抗体的工序,该工序中,从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到多克隆抗体,所述免疫原为包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽;以及,纯化工序,该工序中,使用固定化有由序列号1的氨基酸序列构成的肽(P03肽)的柱对得到的抗体进行纯化。
在本发明的抗体的制造中,作为免疫原使用的肽是包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基且包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽。“连续9个以上的氨基酸残基”优选为连续10个以上的氨基酸残基,更优选为连续12个以上的氨基酸残基,特别优选为连续16个氨基酸残基。进一步地,只要作为抗原的肽包含序列号2的氨基酸残基的连续9个以上的氨基酸,对其他氨基酸序列就没有限定,优选肽的全部氨基酸序列为来自序列号2的氨基酸序列的肽。为了通过SH基结合后述的载体,也可以在肽的N末端或C末端(优选为N末端)***半胱氨酸。作为免疫原的肽,特别优选为由序列号2的氨基酸序列中的连续16个氨基酸残基(即,全部氨基酸残基)构成的肽(S68肽),但也可以在N末端或C末端(优选为N末端)***半胱氨酸。
对于作为免疫原的肽的制备方法而言,可举例使用通常使用的肽合成仪(肽合成仪433A型,珀金埃尔默日本公司(パーキン-エルマージャパン))等的方法、基因重组法(东京大学医科学研究所制癌研究部编,新细胞工学实验方案,秀润社(Shujunsha Co.,Ltd.))等。
例如,包括序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基的肽能够使用433A型肽合成仪通过Fmoc法合成,用三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)进行脱保护并从树脂切断后,使用C18HPLC柱(卡赛帕克(Capcell-pak),日本资生堂公司)进行纯化,从而能够制备目标肽。
在抗原为蛋白质的情况下,能够直接作为免疫原,但是,当为8~30个氨基酸残基以下的肽时,由于分子量小,因此有时不具有通常的免疫原性。在该情况下,使其与载体结合、或者使用多抗原肽(Multiple Antigen Peptide,MAP)法制备MAP肽,使其具备有免疫原性的分子量而成为免疫原即可。
对于与上述肽结合的载体而言,可举出载体蛋白、聚合物。对于载体蛋白而言,可以使用牛血清白蛋白、钉形贝血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、甲状腺球蛋白或卵清蛋白等异源蛋白。这些载体蛋白可以利用肽或载体蛋白的氨基酸所含的侧链的官能团、或者导入马来酰亚胺基、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)基或醛基,从而与上述肽结合。在该情况下,也可以使能够利用官能团的氨基酸(例如半胱氨酸)与肽结合。对于聚合物而言,可举出甘露聚糖或壳聚糖等糖类、聚乙烯吡咯烷酮(PVA)。这些聚合物也可以通过吸附或如上所述的化学键与上述肽结合。
在本发明的一些方式中,免疫原是通过在N末端***的半胱氨酸与KLH结合的S68肽(S68肽-KLH)。
使用如上制备的免疫原,使用公知技术(例如,参照免疫实验操作法(日本免疫学会编;日本免疫学会发行))能够制备针对免疫原的多克隆抗体。
使用如上所述制备的免疫原对非人哺乳动物进行免疫。例如,能够将免疫原20~1000μg与弗氏不完全佐剂、RIBI佐剂、ALUM等佐剂混合,对非人哺乳动物进行免疫。作为非人哺乳动物,可举出兔、山羊、马、羊、猪、大鼠、小鼠等,优选兔、山羊等,更优选兔。作为免疫方法,能够使用肌肉内给药、皮内给药、皮下给药、腹腔内给药、***给药等方法。在初次给药后,以1~4周的间隔同样地给药与弗氏不完全佐剂、RIBI佐剂、ALUM等佐剂混合而成的免疫原、或者直接静脉内给药免疫原,由此进行加强免疫。
针对免疫原的多克隆抗体能够从通过上述方法进行了免疫的非人哺乳动物的血液、腹水等中采取,优选从血液中采取。对于血液而言,从经免疫的非人哺乳动物中通过常规采血方法从例如颈动脉、耳静脉、心脏、足静脉等采取血液。通过离心等能够从采取的血液中分离出抗血清。在制备多克隆抗体时,优选使用从经免疫的非人哺乳动物中的已确认了抗体效价的个体中得到的抗血清。抗血清中的抗体效价的测定能够如下进行:例如,使标记P03肽与抗血清反应后,对与P03肽结合的标记的活性进行测定;或者,使固定化于板上的P03肽与抗血清反应后,用标记二次抗体检测与P03肽结合的抗体的量。对于抗血清,然后通过添加硫酸铵、硫酸钠等的盐析法使γ球蛋白组分沉淀,在适当的缓冲液中透析后,使用能够对蛋白质A、蛋白质G等γ球蛋白进行特异性纯化的亲和介质,能够制备针对免疫原的多克隆抗体(例如,IgG组分的纯化多克隆抗体)。
在如上述地制备的多克隆抗体中,除了P03特异多克隆抗体以外,还能够包含除P03特异多克隆抗体以外的抗普莱晒谱星多克隆抗体。因此,本发明对如上述地制备的多克隆抗体实施提高与P03肽特异性结合的抗体的比例的处理。作为这种处理,例如,可举出纯化。
为了从得到的多克隆抗体纯化与P03肽结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(称作“P03纯化多克隆抗体”),使用亲和介质进行纯化。更具体地说,这种亲和介质使用固定化有P03肽的柱。对于P03肽而言,为了通过SH基与柱结合,也可以在N末端或C末端结合半胱氨酸。将在N末端结合了半胱氨酸的P03肽的氨基酸序列以及在C末端结合了半胱氨酸的P03肽的氨基酸序列分别示于序列号4和序列号5。优选地,作为固定化有P03肽的柱使用结合了以下两者的肽:在N末端结合了半胱氨酸的P03肽、以及在C末端结合了半胱氨酸的P03肽。P03纯化多克隆抗体能够通过使用这种柱对上述得到的纯化IgG组分进行纯化来制备。
P03纯化多克隆抗体是使用如上述的P03肽进行纯化而得到的与P03肽结合的抗体,P03纯化多克隆抗体中的P03特异多克隆抗体的含有率比S68抗体中的P03特异多克隆抗体的含有率高。因此,与S68抗体相比,P03纯化多克隆抗体能够发挥来自P03特异多克隆抗体的优异的性能。
根据需要,也可以按照实施例3的记载对得到的抗体实施肽竞争抑制反应试验,并对抗体特异性进行确认,根据其结果,也可以对抗体施加以下的处理。
例如,在制备的P03纯化多克隆抗体中,除了P03特异多克隆抗体以外,有时还包括与从P02肽及P04肽中选出的至少一个肽例如P02肽或P04肽结合的多克隆抗体。
在本发明的一些方式中,还可以对得到的P03纯化多克隆抗体实施除去与P04肽结合的抗体的处理,优选实施除去与P02肽和P04肽结合的抗体的处理。作为除去与这些肽结合的抗体的处理,例如,可举出使用亲和介质的纯化。更具体地说,例如,当抗体包括也与P04肽结合的抗体时,亲和介质使用固定化有P04肽的柱。对于P04肽而言,为了通过SH基与柱结合,也可以在N末端或C末端结合半胱氨酸。优选地,作为结合了P04肽的柱使用结合了以下两者的柱:在N末端结合了半胱氨酸的P04肽、以及在C末端结合了半胱氨酸的P04肽。通过使用这种柱进行纯化,能够从P03纯化多克隆抗体中除去与P04肽结合的抗体。当抗体包括也与P02肽结合的抗体时,按照上述内容,能够使用固定化有P02肽的柱进行纯化。由此,能由P03纯化多克隆抗体制备与P03肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体(称作“P03特异多克隆抗体”)。
在本发明的另一些方式中,还可以对得到的P03纯化多克隆抗体实施减弱也与P04肽结合的抗体的结合活性的处理,优选实施减弱也与P02肽结合的抗体以及也与P04肽结合的抗体的结合活性的处理。例如,作为减弱与P04肽结合的抗体的结合活性的处理,可举出在P03纯化多克隆抗体中添加P04肽,产生抗原抗体反应从而阻断与P04肽结合的抗体的结合活性的处理。减弱与P02肽结合的抗体的结合活性的处理也能够按照上述进行。由此,也能够减弱P03纯化多克隆抗体中也与P04肽结合的抗体的结合活性,能够优选减弱也与P02肽结合的抗体以及也与P04肽结合的抗体的结合活性。
抗原结合性片段能够通过公知的方法由上述制造的多克隆抗体制备。
在抗原结合性片段中,Fab是由H链的N末端侧约一半与整个L链通过二硫键结合的具有抗原结合活性的抗体片段,例如,能够用蛋白质分解酶木瓜蛋白酶将多克隆抗体IgG处理成片段并根据需要通过公知的方法进行纯化来制备。
F(ab′)2是通过铰链区的二硫键将Fab′结合而成,能够用蛋白质分解酶胃蛋白酶将多克隆抗体IgG处理成片段并根据需要通过公知的方法进行纯化来制备。
Fab′是将F(ab′)2的铰链区的二硫键切断而得到的具有抗原结合活性的抗体片段,例如,能够用还原剂二硫苏糖醇对F(ab′)2进行处理从而切断铰链区的二硫键并根据需要通过公知的方法进行纯化来制备。
3.普莱晒谱星的测定方法
本发明提供使用本发明的抗体对普莱晒谱星进行免疫学测定的方法,该方法(称作“本发明的测定方法”)包括使本发明的抗体与含有普莱晒谱星的检测体进行接触的工序。在本发明中,“测定”一词能够与“检测”、“定量”、“分析”等用语相互变换地使用,意指包括定量的和定性的确定。普莱晒谱星的测定优选在体外进行。
普莱晒谱星作为用于检测败血症的标记物而众所周知,因此,该方法还能够称为用于检测败血症的方法,所述方法包括使本发明的抗体与含有普莱晒谱星的检测体进行接触的工序。
即,还能称为检测败血症的方法、或者称为用于对败血症的检测或诊断进行辅助的方法,所述方法包括1)使用本发明的抗体来测定受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度的工序;以及2)判定1)中得到的普莱晒谱星浓度是否高于临界值的工序。此时的临界值为314~600pg/mL,优选为400~580pg/mL,更优选为450~550pg/mL,进一步优选为500pg/mL。
在本发明中,可以将“疾病的检测”更替为“疾病检测的辅助”或“疾病诊断的辅助”使用。
另外,对抗体而言,例如,能够用于从以下选出的至少一种疾病的检测或评价中:败血症与全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的判别、败血症的严重化的风险评价、败血症的预后预测(死亡率预测)、败血症的严重度的评价、术后传染病的检测、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)的检测、感染性DIC的检测、心脏疾病的检测、伴随细菌感染的呼吸道传染病的检测、炎症性肠疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)的检测、粒细胞减少性发热(febrile neutropenia,FN)的检测、噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome,HPS)的检测以及吞噬细胞的功能评价。
术后传染病是在手术后发病的传染病的总称,是指由手术以及其所需的辅助疗法导致的全部传染病。另外,术后传染病包括基于外科手术部位感染预防指南(Guidelinefor prevention of surgical site infection,1999,CDC)而诊断为术后传染病的全部疾病。
作为心脏疾病,例如,可举出急性冠状动脉综合症(ACS)、急性心衰、急性失代偿性心衰(ADHF)、慢性心衰、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性脑卒中、出血性脑卒中以及短暂性脑缺血发作。
作为伴随细菌感染的呼吸道传染病,可举出下呼吸道传染病或肺炎。下呼吸道传染病包括急性下呼吸道传染病和慢性下呼吸道传染病。急性下呼吸道传染病包括急性气管炎、急性支气管炎以及急性细支气管炎,大多是因对上呼吸道的病毒感染波及到下呼吸道而发病,但有一部分是由细菌引起的二次感染的继发。发现细菌二次感染的征兆时,适合抗生素给药。慢性下呼吸道传染病是指,在因支气管扩张症、慢性阻塞性肺病等而具有器质性障碍的下呼吸道中细菌的持续感染成立的病态,存在持续感染和急性恶化。使下呼吸道发生器质性障碍的疾病包括支气管扩张症、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、弥漫性泛细支气管炎、陈旧性肺结核、尘肺、非结核分枝杆菌病(nontuberculous mycobacterialinfection)、变应性支气管肺曲霉菌病、肺纤维症、慢性支气管哮喘等。持续感染、急性恶化均适合抗生素给药。肺炎包括社区获得性肺炎以及院内感染性肺炎。优选为社区获得性肺炎。
作为吞噬细胞的功能评价,可举出(a)中性粒细胞、颗粒细胞和/或白血球的吞噬能力的测定;(b)通过测定中性粒细胞、颗粒细胞和/或白血球的吞噬能力进行的免疫功能的评价;(c)自体细胞移植或他体细胞移植时的移植用细胞的品质评价;以及,(d)吞噬细胞的吞噬作用相关疾病的检测等。作为吞噬细胞的吞噬作用相关疾病,例如,可举出自身免疫疾病、类风湿性关节炎、乳腺炎、痛风、肾小球肾炎、溃疡性结肠炎、地中海热、中耳炎、鼻炎、肺炎、结核、膀胱炎、羊水传染病以及脓性***症。作为在对吞噬细胞的吞噬作用相关疾病进行检测时使用的检测体,能使用组织液、淋巴液、关节液、乳汁、脑脊髓液、脓、唾液、泪液、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、羊水、***等体液,还能使用对鼻腔、支气管、肺、皮肤、腹腔、各种脏器、关节、骨等进行洗涤后的洗涤液。
作为使用本发明的抗体对普莱晒谱星进行免疫学测定的方法,例如,可举出酶免疫分析(下面,也记作EIA或ELISA)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、荧光抗体法(FAT)、荧光酶免疫测定法(FEIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫层析法、凝集法、竞争法等,但是,并不限于这些方法。在本发明中,可以使用直接法或间接法。还可以使用使生物素-抗生物素蛋白(链霉)复合体形成以进行检测的增感方法。
EIA是使用酶标记抗体进行的免疫测定法之一,可举出直接法、间接法等。作为优选例,有夹心ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)。
所谓夹心ELISA是指下述方法:使用抗原识别部位不同的两种以上的抗体,预先将其中之一的抗体固定化于固相,并使用两种抗体来夹持想要检测的抗原,从而形成抗体-抗原-抗体复合体,由此来进行测定。
化学发光酶免疫测定法(CLEIA:Chemiluminescent Enzyme Immunoassay)是指如下方法:使检测体中的抗原与固定于磁性粒子、磁珠等的抗体进行反应后,使酶标记抗体进行反应,并在洗涤(B/F分离)后加入化学发光底物进行酶反应,然后测定发光强度。
例如,可以使检测体中的抗原与结合了生物素的抗体在液相中进行反应,并将抗体捕获于结合有链霉的磁性粒子,洗涤(B/F分离)后,使酶标记抗体进行反应,并进行与上述同样的处理。
在使用碱性磷酸酶(ALP)作为标记酶时,对于化学发光底物而言,优选使用CDP-StarTM、AMPPDTM、CSPDTM。当标记酶为HRP时,化学发光底物优选使用鲁米诺(luminol)。
对于检测灵敏度而言,通常按照化学发光>荧光>吸光(显色)的顺序依次递减,可根据所需的灵敏度来选择测定方法。
化学发光免疫测定法(CLIA:Chemiluminescent Immunoassay)是如下所述的方法:使固定于磁性粒子等的抗体与检测体中的抗原进行反应后,使由化学发光物质标记的抗体进行反应,在洗涤(B/F分离)后测定发光強度。标记物质可使用吖啶酯(acridinium)。
荧光酶免疫测定法(FEIA:Fluorescent Enzyme Immunoassay)是一种如下所述的方法:使已固定化的抗体与检测体中的抗原进行反应后,使酶标记抗体进行反应,在洗涤(B/F分离)后添加荧光底物以进行酶反应,然后测定荧光强度。在标记酶中可使用HRP、ALP等。对于荧光底物而言,当标记酶为HRP时,可优选使用AmplexTMRed等;当标记酶为ALP时,可优选使用4-MUP(4-甲基伞花基磷酸盐,4-Methylumbelliphenyl phosphate)、AttoPhosTM等。
电化学发光免疫测定法(ECLIA:Electro Chemiluminescence Immunoassay)是一种如下所述的方法:使固定于磁性粒子的抗体以及由电化学发光物质标记的抗体与检测体中的抗原进行反应后,进行洗涤(B/F分离),并测定由电能所导致的发光强度。在标记物质中可使用钌等。在标记物质中可使用Ru(bpy)3等,通过由电极带电引起的氧化以及由三丙胺(TPA)等引起的还原反应,反复进行激发发光。
放射免疫测定法((RIA:Radioimmunoassay)是一种使用基于放射性同位素的标记体的测定方法。例如,能够在使固定于磁珠等的抗体与检测体中的抗原进行反应后,使由放射性同位素(125I等)标记的抗体进行反应,在洗涤(B/F分离)后测定125I的放射线量。
免疫层析法是利用了毛细管现象的免疫测定法,所述毛细管现象是在溶解试剂的同时,被检测体沿试纸条移动的现象。检测体中的抗原、试纸条上的标记抗体及捕获抗体这三者形成免疫复合体,并确认标记物颜色的方法。对于抗体的标记而言,可使用金胶体、酶、荧光物质等。在使用酶标记抗体时,在试纸条上设置酶底物,使其进行显色。
渗滤法(flow through method)是检测体中的溶液与作为被检测物质的抗原一同在作为不溶性载体的膜上形成抗体-抗原-抗体复合体的方法。此时,未被固定于膜的物质通常垂直地从膜的表面穿透至背面而除去。
凝集法是使检测体中的抗原与试剂中的抗体进行反应,并观察凝集的方法。可举出不使用固相的方法、作为固相使用人工制备的粒子的粒子凝集法(particleagglutination:PA)、在PA中使用胶乳粒子的胶乳凝集法(latex agglutination:LA)等。
对于竞争法而言,例如,使抗体与固相结合,并使一定量的标记抗原与被检测试样同时进行反应,根据所结合的标记物的量能够测定试样中的抗原的量。
本发明的抗体可优选用于上述测定方法。
对于在普莱晒谱星测定中使用的检测体而言,没有特别地限定,但是,优选水性检测体,例如,可举出血液(全血、血浆、血清等)、尿、组织液、淋巴液、关节液、乳汁、脑脊髓液、脓、唾液、泪液、粘液、鼻水、痰、腹水、用水、***等体液,另外,还可举出对鼻腔、支气管、肺、皮肤、腹腔、各种脏器、关节、骨等进行洗涤后的洗涤液,或者,细胞培养上清液,或柱洗脱液等。这些试样可以保持原样地用于测定中,或者使用各种缓冲液等进行稀释或萃取后进行浓缩,再用于测定中。
另外,在使用全血检测体作为检测体的情况下,可以在采集全血检测体以后72小时、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、或者4小时内进行分析。另外,可以通过EDTA采血管或肝素采血管来采集全血检测体。优选地,可举出:通过EDTA采血管来采集全血检测体,并在6小时内进行分析,或者通过肝素采血管来采集全血检测体并在4小时内进行分析。
4.sCD14-ST测定用试剂盒
本发明提供以本发明的抗体为必须的构成要素的普莱晒谱星测定用试剂盒(称作“本发明的测定试剂盒”)。
本发明的测定试剂盒优选含有用于测定普莱晒谱星的辅助试剂。作为辅助试剂,例如,可举出一次抗体、二次抗体、标记抗体、标记酶、金胶体等标记物质;显色底物、荧光底物(AmplexTM Red、AttoPhosTM、4-MUP等)、化学发光底物(鲁米诺、CDP-StarTM、AMPPDTM、CSPDTM等)、生物素-链霉等特异性结合物质、不溶性载体、阻断剂、稀释液、洗涤液、标准物质等,但并不限于上述试剂。
本发明的测定试剂盒可结合普莱晒谱星测定法适当组合来使用。
一次抗体优选与普莱晒谱星结合的抗体,更优选对与本发明的抗体不同的表位进行识别的抗体。例如,可举出WO2004/044005的实施例3中记载的F1106-13-3抗体、F1031-8-3抗体等。
可以将本发明的抗体或一次抗体作为标记抗体。当本发明的抗体和一次抗体都未进行标记时,可以使用经标记的二次抗体。
作为不溶性载体,例如,可举出磁性粒子、珠、玻璃、纤维素、硝基纤维素、多孔性合成聚合物、玻璃纤维、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、塑料板、胶乳粒子、无纺布、滤纸等。
对于抗体的标记物而言,优选使用辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖酶等酶、金胶体等,但并不限于上述标记物。
例如,在使用HRP的情况下,作为显色底物,可举出3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)等。在使用ALP的情况下,作为显色底物,可举出对硝基苯磷酸酯(pNPP)等。在使用β-半乳糖酶时,作为显色底物,可举出邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside:ONPD)等。
例如,夹心ELISA法用测定试剂盒能够包含本发明的抗体及一次抗体(任意抗体都可进行酶标记)、显色底物、稀释液、标准物质等。当本发明的抗体及一次抗体未被标记时,可以包含经标记的二次抗体。
化学发光酶免疫法(CLEIA)用测定试剂盒能够包含例如固定于磁性粒子等的抗体、酶标记抗体、化学发光底物、稀释液、洗涤液等。
荧光酶免疫测定法(FEIA)的测定试剂盒能够包含例如固定于磁性粒子等的抗体、酶标记抗体、荧光底物、稀释液、洗涤液等。
电化学发光免疫测定法(ECLIA)的测定试剂盒能够包含例如生物素化抗体、Ru(bpy)3标记抗体、链霉亲和素包覆的磁性粒子、三丙胺等。
免疫层析法的测定试剂盒是将试样添加部、试剂部、检测部以及吸收部设置成使添加于试样添加部的液性检测体按上述顺序进行移动的试纸条。例如,能够使经标记的第二抗体浸渍于试剂部,并在检测部设置结合了第一抗体的不溶性载体。
对于试纸条而言,可举例使用多孔性载体等。对于多孔性载体,例如,可举出硝基纤维素、纤维素、纤维素衍生物、尼龙、尼龙纤维、玻璃纤维、多孔性合成聚合物等。对于吸收部而言,可举出水吸收性材料的海绵等可吸收聚合物、纤维素滤纸、滤纸等。
对于败血症患者而言,由于报告了普莱晒谱星的血液中浓度特征性上升,因此,本发明的普莱晒谱星测定用试剂盒可以是败血症检测用试剂盒、或者是用于对败血症的检测或诊断进行辅助的试剂盒。
另外,本发明的测定试剂盒能够用作败血症的诊断药或者败血症诊断的辅助药。对于普莱晒谱星测定用试剂盒而言,在以这种检测败血症等为目的时,当使用本发明的抗体测定的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度比临界值更高时,能够判定受试者可能患有败血症,并能够对检测或诊断进行辅助。此时,临界值为314~600pg/mL,优选为400~580pg/mL,更优选为450~550pg/mL,进一步优选为500pg/mL。
另外,例如,普莱晒谱星测定用试剂盒能够用于从以下选出的至少一种疾病的检测或评价中:败血症与全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory responsesyndrome,SIRS)的判别、败血症的严重化的风险评价、败血症的预后预测(死亡率预测)、败血症的严重度的评价、术后传染病的检测、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascular coagulation,DIC)的检测、感染性DIC的检测、心脏疾病的检测、伴随细菌感染的呼吸道传染病的检测、炎症性肠疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)的检测、粒细胞减少性发热(febrile neutropenia,FN)的检测、噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome,HPS)的检测以及吞噬细胞的功能评价。普莱晒谱星测定用试剂盒可以是用于上述至少一种疾病的检测或评价的试剂盒。
5.败血症患者的治疗方法
本发明提供一种败血症患者的治疗方法,其使用本发明的抗体对受试者进行败血症的治疗,所述受试者已实施了用于辅助检测败血症的方法。
用于辅助检测败血症的方法如上所述。对败血症的治疗没有特别的限定,可举出例如抗菌药、类固醇的给药、升压药、输液、氧给药、人工呼吸管理、持续血液透析滤过、血浆置换等。
6.受试药(或治疗药)的筛选方法
本发明提供一种受试药(或治疗药)的筛选方法,其包括使用本发明的抗体或本发明的测定试剂盒来确定已给药受试药(或治疗药)的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度的工序。对于受试药所要应对的疾病而言,只要是受试者检测体中的普莱晒谱星浓度上升的疾病,就没有特别的限定。优选地,将受试药给药前与给药后的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度进行比较,确定受试药给药后的普莱晒谱星浓度是否低于给药前。或者,可以确定受试药给药后的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度是否降低至正常人水平。
即,一种包括下述工序的受试药的筛选方法。
1)确定已给药受试药的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度的工序
7.抗普莱晒谱星多克隆抗体的筛选方法
本发明是抗体的筛选方法,用于得到对测定检测体中的普莱晒谱星有用的抗普莱晒谱星多克隆抗体,所述方法至少包括下述工序。
1)得到候选的抗普莱晒谱星多克隆抗体的工序;以及
2)使用该候选的抗体构建普莱晒谱星测定***,对以下抗体进行选择的工序,
在使由序列号1的氨基酸序列构成的肽(P03肽)进行竞争反应以使所述抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,所述抗体与普莱晒谱星的结合的30%以上受到竞争抑制,
在使由序列号9的氨基酸序列构成的肽(P05肽)进行竞争反应以使所述抗体与普莱晒谱星的结合受到抑制的反应体系中,所述抗体与普莱晒谱星的结合的小于30%受到竞争抑制。
所述竞争抑制反应试验能够按照实施例3的记载进行。
优选地,还可以追加对由P01肽、P02肽、P04肽、P06肽、P07肽和/或P08肽导致的竞争抑制小于30%的抗体进行选择的工序。这些肽能够适当选择。
需要说明的是,在本说明书中引用的全部文献、公开公报、专利公报以及其他专利文献均作为参照引入本说明书中。
通过以下的实施例更详细地描述本发明,应该理解本发明并不限定于这些实施例。
实施例
实施例1通过S68肽或P03肽而特异性地纯化的多克隆抗体的制备
对于以S68肽为免疫原对兔进行免疫而得到的兔抗S68肽多克隆抗体,使用分别固定化有P03肽(序列号1)或S68肽(序列号2)的亲和柱实施特异纯化。
1-1兔抗S68肽多克隆抗体的制备
按照WO2004/044005的实施例1中记载的方法,使用S68肽-KLH作为免疫原对兔进行免疫后,按照常规方法制备抗血清,通过硫酸铵盐析、蛋白质A纯化(Prosep-A、密里博公司(ミリポア))制备三个批次的纯化IgG组分(A、B、C)。
1-2P03肽固定化亲和柱以及S68肽固定化亲和柱的制备
按照手册将3.0mL的巯基蛋白琼脂糖偶联凝胶(SulfoLink Coupling Gel)(赛默科技(サーモサイエンス))填充在柱中,用柱体积的6倍量的50mM Tris、5mM EDTA(pH8.5)洗涤。在柱的底部盖上盖。然后,分别用50mM Tris、5mM EDTA(pH8.5)将在N末端结合了半胱氨酸的S68肽(2.5mg)、在N末端或C末端结合了半胱氨酸的P03肽(3.0mg,序列号4和5的等量混合物)溶解为1mg/mL。
在N末端结合了半胱氨酸的P03肽(序列号4:CKRVDADADPR)
在C末端结合了半胱氨酸的P03肽(序列号5:KRVDADADPRC)
将制成的肽溶液添加在各柱的凝胶中,在柱上进行密封。在室温条件下颠倒搅拌15分钟,接着在室温条件下静置30分钟。取下柱上下的盖,使反应液自然滴下进行回收。然后,用凝胶的3倍量的50mM Tris、5mM EDTA(pH8.5)洗涤凝胶后,用包含50mM半胱氨酸的溶液封闭未反应的活性基团。反应结束后,用凝胶的16倍量的1M NaCl和16倍量的磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)洗涤凝胶。对于凝胶而言,添加1M NaCl/PBS溶液,在冰箱中保存。
1-3特异纯化抗体的制备
在各柱中分别注入1-2中制备的S68肽固定化凝胶以及P03肽固定化凝胶1mL,用PBS洗涤,进行平衡。然后,将1-1中得到的三个批次的纯化IgG组分(各50mg)分别以0.5mL/min的流速应用于两种肽固定化亲和柱,用PBS洗涤未吸附组分。接着用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.5)溶出,回收峰组分。对得到的溶出组分进行中和、浓缩后,用PBS(pH7.4)进行透析。通过SDS-PAGE确认得到的各抗体的纯度后,在150kDa附近确认了单一谱带。另外,通过DC蛋白质分析(DC Protein Assay,美国伯乐公司(バイオラッド))对蛋白质浓度进行测定。在表1中示出了制成的各抗体的蛋白质浓度的结果。S68-A、S68-B以及S68-C表示通过S68肽固定化亲和柱进行特异纯化而得到的抗体,P03-A、P03-B以及P03-C表示通过P03肽固定化亲和柱进行纯化而得到的抗体。
表1
抗体 | 蛋白质浓度(mg/mL) |
S68-A | 0.47 |
S68-B | 0.28 |
S68-C | 0.44 |
P03-A | 0.24 |
P03-B | 0.23 |
P03-C | 0.11 |
实施例2与普莱晒谱星的反应性的评价
分别使用实施例1中制成的六种特异纯化抗体制备夹心ELISA,对普莱晒谱星标准品(WO2005/108429的实施例16中记载的rsCD14-ST)进行测定,评价各抗体的反应性。(下面,将通过P03肽固定化亲和柱进行特异纯化而得到的抗体称为“P03纯化多克隆抗体”,将通过S68肽固定化亲和柱进行特异纯化而得到的抗体称为“S68抗体”。)
2-1各抗体固相化板的制备
分别用PBS(pH7.4)将实施例1中制成的六种抗体稀释为5μg/mL,分别注入到免疫检测微孔板(MAXISORP;C8板;丹麦能肯公司(ヌンク))中。对板进行密封并在4℃条件下静置一夜。次日,用冷藏PBS(pH7.4)洗涤板5次后,添加封闭液200mL,制备将各抗体固相化而得的板。
2-2利用夹心ELISA进行的特异纯化抗体的反应性的比较
用检测体稀释液(包含0.1%BSA的D-PBS(pH7.4))将普莱晒谱星标准品稀释至500pg/mL。在2-1中制备的各板的每孔中添加50μL的检测体稀释液(相当于普莱晒谱星标准品0pg/mL)以及普莱晒谱星标准品500pg/mL,使用振荡器(TAITEC生物振荡器M-BR-022UP)在500rpm、25℃条件下反应1小时。反应结束后,使用洗板机(生物技术(biotech)MW-96AR·Nunc-ImmunoWash),用包含0.05%Tween20(吐温20)的生理盐水洗涤5次,在各孔中添加50μL的用标记抗体稀释液将过氧化物酶标记F1106-13-3抗体(WO2004/044005的实施例3中记载)稀释至0.125μg/mL而得到的溶液。在25℃、500rpm条件下反应2小时后,同样地洗涤5次,在各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB,BioFx),在室温条件下反应20分钟。在各孔中添加50μL的1M硫酸溶液,停止反应,接着通过微孔板分光光度计(CORONA ELECTRIC MTP-300)测定450nm/650nm的吸光度。将添加普莱晒谱星标准品0pg/mL或500pg/mL时的各抗体的吸光度示于表2。
其结果是,对于使用吸光度求出的S/N比(添加普莱晒谱星标准品500pg/mL时的吸光度/普莱晒谱星标准品0pg/mL的吸光度)而言,在P03纯化多克隆抗体的情况下为44至57,相对于此,在S68抗体的情况下为17至35。可知与S68抗体相比,P03纯化多克隆抗体的S/N比约高2~3倍。根据该结果可知,即使来自相同的多克隆抗体,与使用S68肽固定化柱进行纯化相比,使用P03肽固定化亲和柱进行纯化能够制备与普莱晒谱星的反应性更高的抗体。
表2
实施例3特异性的评价肽竞争抑制反应
为了对实施例1中制成的六种抗体的特异性进行评价,使用实施例2中制成的夹心ELISA并在各抗体与普莱晒谱星的反应中添加来自S68肽的部分肽(各10个氨基酸,参照表3),进行竞争抑制反应试验。
3-1肽的制备
将包含S68肽的N末端3个氨基酸的10个氨基酸作为P01肽,合成向C末侧依次移动3个氨基酸而成的8种肽(表3)。用PBS(pH7.4)将这些合成肽稀释至20mg/mL,作为抑制肽。
表3
肽 | 序列号3中的氨基酸的位置 | 氨基酸序列 | 序列号 |
S68 | 第53位~第68位 | <u>rvdadadprqyadtvk</u> | 2 |
P01 | 第46位~第55位 | nlepflk<u>rvd</u> | 6 |
P02 | 第49位~第58位 | pflk<u>rvdada</u> | 7 |
P03 | 第52位~第61位 | k<u>rvdadadpr</u> | 1 |
P04 | 第55位~第64位 | <u>dadadprqya</u> | 8 |
P05 | 第58位~第67位 | <u>adprqyadtv</u> | 9 |
P06 | 第61位~第70位 | <u>rqyadtvk</u>al | 10 |
P07 | 第64位~第73位 | <u>adtvk</u>alrvr | 11 |
P08 | 第67位~第76位 | <u>vk</u>alrvrrlt | 12 |
3-2特异性的评价
用PBS(pH7.4)稀释普莱晒谱星标准品,制备400pg/mL的标准品。另外,使用不含肽的PBS(pH7.4)作为对照。按照实施例2中记载的方法,在用各特异纯化抗体制备的板中添加3-1中制备的抑制肽25μL和普莱晒谱星标准品25μL,在25℃、500rpm条件下反应1小时。洗涤板后,添加标记抗体,同样地进行反应。根据得到的吸光度,判断了吸光度与对照相比降低了30%以上的肽具有结合活性。
其结果是,S68抗体包括与从P01至P05的肽反应的抗体,相对于此,对于P03纯化多克隆抗体而言,有2个批次的抗体与P03肽和P04肽反应,有1个批次的抗体与P02肽、P03肽和P04肽反应。将结果示于表4。
表4
残留反应率(%)
-:大于70%;+:70%以下
实施例4与血液中高分子量sCD14的交叉反应性的比较
使用夹心ELISA测定实施例1中得到的六种抗体与血液中高分子量sCD14的交叉反应性。根据实施例3的结果可知,在P03纯化多克隆抗体中包括与P03肽和P04肽均结合的抗体。因此,在使用P03纯化多克隆抗体的ELISA中,在血液中高分子量sCD14和普莱晒谱星标准品的稀释液中添加P04肽以使其最终浓度达到20μg/mL,阻断与P04肽结合的抗体的结合活性,从而对与P03肽特异性结合的抗体(P03特异多克隆抗体)实施评价。
4-1血液中高分子量sCD14的制备
血液中高分子量sCD14的制备如下实施。将正常人血清应用于固定化有抗CD14抗体(F1024-1-3:WO01/072993的实施例2中记载)的柱,吸附CD14,从而制备分离CD14的人血清。分离CD14的人血清以及正常人血清的血液中高分子量sCD14浓度使用CD14ELISA试剂盒(美国R&D公司,#DC140)测定。对于各血液中高分子量sCD14的浓度而言,正常人血清为1603ng/mL,分离CD14的人血清为21ng/mL,将这些混合从而制备高分子量sCD14稀释系列。
4-2交叉反应性的测定
制备血液中高分子量sCD14(21~1603ng/mL)的稀释系列,用稀释液稀释20倍,按照实施例2中记载的方法,通过使用各抗体的ELISA测定吸光度。另外,对普莱晒谱星标准品(0~500pg/mL)进行测定,使用得到的吸光度制成普莱晒谱星的标准曲线。通过使用抗体的ELISA,对含有血液中高分子量sCD14的检测体(1603ng/mL)的吸光度进行测定,将其绘制在普莱晒谱星标准曲线上,求出与该吸光度对应的浓度。通过将该得到的浓度除以用于测定的血液中高分子量sCD14浓度(由于稀释20倍来进行测定,使用80ng/mL),计算交叉反应性。
交叉反应性(%)=(将使用抗体测定的、含有血液中高分子量sCD14的检测体的吸光度绘制在普莱晒谱星标准曲线上而求出的浓度÷用于测定的血液中高分子量sCD14浓度)×100
将结果示于表5。
其结果是,在使用P03特异多克隆抗体的ELISA分析***中,与血液中高分子量sCD14的交叉反应为检测灵敏度以下,可知P03特异多克隆抗体极难发生与血液中高分子量sCD14的交叉反应。由此表明,与使用S68抗体的ELISA相比,使用P03特异多克隆抗体制备的ELISA能够更高精度地测定普莱晒谱星。
表5(ND:检测灵敏度以下)
实施例5浓度已知的败血症患者检测体的测定
使用通过实施例1中得到的六种抗体制备的ELISA,测定22例的浓度已知的败血症患者检测体,进行相关分析。浓度已知的检测体的普莱晒谱星的测定使用普莱晒谱星测定试剂盒进行,该试剂盒利用S68抗体。对于P03纯化多克隆抗体而言,按照实施例4,在普莱晒谱星标准品和患者检测体的稀释液中添加P04肽以使P04肽为最终浓度20μg/mL,阻断与P04肽结合的抗体,对P03特异多克隆抗体实施评价。
5-1使用夹心ELISA测定败血症患者检测体
使用实施例2中记载的夹心ELISA,对普莱晒谱星标准品(0~500pg/mL,8个点,n=2)和用检测体稀释液稀释至20倍的败血症患者检测体进行测定(n=2)。使用SoftMax Pro(美国分子仪器公司(モレキュラデバイス))软件根据普莱晒谱星标准品的吸光度制成标准曲线,计算各检测体的浓度。对变动系数(CV)为30%以上的测定值不进行解析。
5-2测定结果的相关分析
使用5-1中得到的测定值和已知浓度通过excel2007实施相关分析,求出回归直线。将关于P03特异多克隆抗体(3个批次)制作的回归直线示于图1~3。将回归分析的结果示于表6。
其结果是,对于3个批次的S68抗体而言,回归直线的斜率的变动系数(CV)为20%,相对于此,对于3个批次的P03特异多克隆抗体而言,变动系数为10.6%。表明通过使用P03特异多克隆抗体,能够稳定地制备抗体批次间的测定值的偏差小的普莱晒谱星测定试剂盒。
表6
实施例6P03特异多克隆抗体的制备
根据实施例3的结果,可知在通过P03肽固定化亲和柱制成的抗体中包括与P03肽和P04肽均结合的抗体。因此,通过从得到的抗体中除去与P04肽结合的抗体,制备与P03肽特异性结合的抗普莱晒谱星多克隆抗体。在除去与其他肽结合的抗体的情况下,以下的方法也能够应用。
6-1使用P04肽固定化亲和柱的方法
按照实施例1中记载的方法,使用P04肽制备P04肽固定化亲和柱。按照实施例1-3,使实施例1-1中得到的IgG组分通过P04肽固定化亲和柱。与P04肽结合的抗体通过P04肽固定化亲和柱而被除去。然后,按照实施例1中记载的方法,通过P03肽固定化亲和柱对得到的未吸附组分进行纯化,从而能得到P03特异多克隆抗体。
6-2添加P04肽的方法
在实施例1-1中得到的IgG组分中添加P04肽后,通过P03肽固定化亲和柱进行纯化。通过该处理能够除去与P04肽结合的抗体来进行纯化,能得到P03特异多克隆抗体。
序列表的自由文字
[序列号:1]是P03肽的氨基酸序列。
[序列号:2]是S68肽的氨基酸序列。
[序列号:3]是人全长可溶型CD14的氨基酸序列。
[序列号:4]是在N末端结合有半胱氨酸的P03肽的氨基酸序列。
[序列号:5]是在C末端结合有半胱氨酸的P03肽的氨基酸序列。
[序列号:6]是P01肽的氨基酸序列。
[序列号:7]是P02肽的氨基酸序列。
[序列号:8]是P04肽的氨基酸序列。
[序列号:9]是P05肽的氨基酸序列。
[序列号:10]是P06肽的氨基酸序列。
[序列号:11]是P07肽的氨基酸序列。
[序列号:12]是P08肽的氨基酸序列。
序列表
<110> 持田制药株式会社
<120> 特异性纯化的抗普莱晒谱星抗体
<130> G1414WO
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成的构造(Synthetic Construct)
<400> 1
Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成的构造(Synthetic Construct)
<400> 2
Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成的构造(Synthetic Construct)
<400> 3
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val
1 5 10 15
Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys
20 25 30
Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu
35 40 45
Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala
50 55 60
Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala Ala
65 70 75 80
Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala Tyr
85 90 95
Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly Thr
100 105 110
Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser Leu
115 120 125
Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala Glu
130 135 140
Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln
145 150 155 160
Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro Ala
165 170 175
Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg Gly
180 185 190
Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn Leu
195 200 205
Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ile Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala Ala
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His Asn
225 230 235 240
Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp Ser
245 250 255
Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln Val
260 265 270
Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys Asn
275 280 285
Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp Asn
290 295 300
Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro
305 310 315 320
His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser
325 330 335
Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala
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Arg Gly Phe Ala
355
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成的构造(Synthetic Construct)
<400> 4
Cys Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成的构造(Synthetic Construct)
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Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Cys
1 5 10
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<220>
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<400> 12
Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr
1 5 10
Claims (5)
1.一种抗普莱晒谱星多克隆抗体,其与由序列号1的氨基酸序列构成的肽特异性结合,所述抗体与血液中高分子量可溶型CD14的交叉反应为检测灵敏度以下。
2.如权利要求1所述的抗体,其中,使用固定化有由序列号1的氨基酸序列构成的肽的柱,对多克隆抗体进行纯化而得到所述抗体,所述多克隆抗体从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到,所述免疫原为由序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基组成的肽且该肽包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基,所述肽与载体结合或不与载体结合。
3.一种抗普莱晒谱星多克隆抗体的制造方法,其中,至少包括:
得到多克隆抗体的工序,该工序中,从用免疫原进行了免疫的非人哺乳动物中得到多克隆抗体,所述免疫原为由序列号2的氨基酸序列中的连续9个以上的氨基酸残基组成的肽且该肽包括序列号2的氨基酸序列的第1位~第9位的氨基酸残基,所述肽与载体结合或不与载体结合;以及
纯化工序,该工序中,使用固定化有由序列号1的氨基酸序列构成的肽的柱对得到的抗体进行纯化。
4.如权利要求3所述的制造方法,其中,还包括除去工序,该工序中,将与由序列号8的氨基酸序列构成的肽结合的抗体除去。
5.一种普莱晒谱星测定用试剂盒、一种用于检测败血症的试剂盒、或者一种用于对败血症的检测或诊断进行辅助的试剂盒,其中,所述试剂盒至少包含权利要求1或2所述的抗体。
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