JP3512524B2 - リムルステスト試薬およびリムルステスト反応性物質の測定法 - Google Patents
リムルステスト試薬およびリムルステスト反応性物質の測定法Info
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Description
下、Etということもある)、(1→3)−β−D−グ
ルカン(以下、β−グルカンということもある)などの
リムルステスト反応性物質を測定するに際して、リムル
ステスト試薬を溶液状態で長時間安定に保持することが
できるリムルステスト試薬、およびそれを用いてリムル
ステスト反応性物質を測定する測定方法に関する。
(以下単にライセートともいう)を使用して、Etを測
定する方法(この測定法は一般的に「リムルステスト」
と呼ばれ、この測定に関与するライセートの反応は「リ
ムルス反応」と呼ばれている)が従来から知られてお
り、検出感度が非常に高いため、医薬品、水などの汚染
試験、臨床検査など多方面に汎用されている。この方法
は、微量のEtによりライセートが凝固することに基づ
いているが、その後の生化学的解明により、該反応はい
くつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らか
にされている(J. Protein Chem., 5, 255-268(1986))
。
chypleus tridentatus)から得られるライセートによ
り、図1を用いて説明すると、ライセートにEtが加わ
ると、ライセート中に存在するC因子(Et感受性因
子、分子量123,000)が活性化され、生成した活
性型C因子がB因子(分子量64,000)の特定箇所
を限定水解して活性型B因子を生成し、活性型B因子は
プロクロッティングエンザイム(分子量54,000)
を活性化してクロッティングエンザイムに変換し、クロ
ッティングエンザイムはコアギュロゲン(凝固タンパ
ク、分子量19,723)のジスルフィド結合で架橋さ
れたループ内の特定箇所、すなわち…Arg18−Thr
19…の間および…Arg46−Gly47…の間を限定水解
してH−Thr 19…Arg46−OHで表されるペプチド
C(アミノ酸28残基)を遊離しつつ残余の部分がコア
ギュリンゲルに変換される、という一連の反応(カスケ
ード反応とも呼ばれる;以下Etによる活性化に起因す
るカスケード反応をC因子系反応という)である。
ルカンが加わっても反応することが知られている。すな
わち、図1におけるG因子(β−グルカン感受性因子)
が活性化され、生成する活性型G因子がプロクロッティ
ングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性化
し、コアギュリンゲルを生成するというカスケード反応
が起こる(以下β−グルカンによる活性化に起因するカ
スケード反応をG因子系反応という)。
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばt−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド(Bo
c−Leu−Gly−Arg−pNA)のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離させる。したがっ
て、生成した発色物質(パラニトロアニリン)の吸光度
を測定することによりEtまたはβ−グルカンの定量が
行われている。
−グルカンによるG因子の活性化に際しては、カルシウ
ムやマグネシウムのような2価金属イオンの適当量が必
須であることも知られている。これらの反応原理に基づ
いて調製され市販されているリムルステスト試薬は、通
常、ライセートと2価金属塩あるいはこれらにさらに合
成基質を添加して凍結乾燥したものである。測定に際し
ては、これら凍結乾燥物を水、検体溶液または緩衝液で
溶解して用いている。
は、その溶解時に最適な反応条件(pHおよび2価金属
イオン濃度等)状態となっているため、いったん溶解し
たリムルステスト試薬を保存すると、溶液状態ではきわ
めて安定性が悪い。つまり、リムルステスト試薬調製時
にごく微量混入したリムルステスト反応性物質のため
に、低温に保存しておいても時間の経過とともに前記の
各因子が活性化され、ブランク値が高まり、検体測定時
に一定の反応値が得られなくなる。
ライセートを安定化する方法については、特開平2−1
87663号公報に記載されている。これはライセート
または凝固酵素前駆体を含有するその抽出物の水性分散
液を、試料中の内毒素を分析する方法に使用する前に、
水溶液のpHを6.0以下の値または8.0以上の値に
維持する方法である。また該公報には、欧州特許第74
7161号明細書においては凍結乾燥前にライセートを
pH6.5〜7.5に緩衝し、米国特許第403802
9号明細書においては凍結乾燥前にライセートをpH
6.5〜6.8に緩衝すること、また米国特許第432
2217号明細書では、凍結乾燥前にライセートを活性
pH範囲に、好ましくは6.5〜7.5に緩衝すべきで
あること、またライセートをpH5.5〜8.5内に緩
衝し得るとも記述している旨の記載がある。また、欧州
特許出願第0224830号明細書には2タイプの固相
状態のデバイスが開示されており、第1の実施態様にお
いてはライセートを乾燥前にpH6.3〜7.5に緩衝
し、第2の実施態様においてはライセートをpH7.5
〜8.5に緩衝することが記述されている旨の記載があ
る。これらは全てpHを調整することによるライセート
の時期尚早な活性化を抑制する方法である。
は、「米国特許第4301245号明細書において、凍
結乾燥前に溶解物にヘパリンを加えて時期尚早のゲル化
を防止することにより溶解物の安定性を向上する。」と
記載されており、また「従来技術における全ての溶解物
安定化方法についての問題点は、保管寿命及び他の処理
操作に際しての安定性の向上が依然として満足の行くも
のではないことである」と記載されている。
な反応条件ではない溶液状態で保存すると、失活して逆
に反応性が低下する場合もあり、一定の反応値が得られ
なくなる。従来の安定化されたライセートは、溶液(溶
解物分散液)状態においては低温で保持する必要があっ
た。例えば特開平2−187663号公報に記載された
発明の方法により処理されたライセート(LAL)は、
「通常は約4℃といった低温で1就業日の終日、即ち7
時間維持され得る適当な安定性を有する」との記載があ
る。室温での安定性に関しては言及されていないが、低
温での安定性には及ばないと思われる。
のであり、従ってリムルステスト試薬は溶解後は直ちに
使用し、残りは捨てるのが一般的であった。そのため、
検体数が少ない場合は非常に高価な測定法となってしま
っていた。
抑制し、かつ失活を抑制した状態で長時間安定に保つこ
とができれば、従来であれば捨ててしまっていたリムル
ステスト試薬をも有効に活用することができるので、測
定のコストを下げることができる。また人工透析におけ
るEt値の経時変化のモニタリングのように、長時間に
わたって自動的にEt量を測定するためには、室温状態
において長時間ライセートが活性化せず、かつ失活もし
ないリムルステスト試薬が必要であり、この開発が望ま
れていた。
り、リムルステスト試薬を用いて検体中のリムルステス
ト反応性物質を測定するに際し、いったん溶解したリム
ルステスト試薬溶液の安定性を高め、室温で長時間経て
も一定の反応値が得られるようなリムルステスト試薬及
びそのリムルステスト試薬を使用するリムルステスト反
応性物質の測定方法を提供することを課題とする。
を解決するために、ライセート中の各凝固因子を活性化
させることもなく、かつ失活させることなく、特に溶液
状態かつ室温で長時間安定に保つことのできるリムルス
テスト試薬及びその試薬を用いるリムルステスト反応性
物質を測定する方法について鋭意検討した。その結果、
ライセートをキレート剤と共存させ、溶液状態の時特定
のpHを示すように調整されれば、リムルス試薬溶液を
活性化させることもなく、かつ失活させることもなく、
室温で長時間安定に保持できること、さらにそのリムル
ステスト試薬溶液に適当な2価金属塩を添加し、リムル
ス反応を惹起するpHに調整し、ペプチド合成基質等を
添加するのみで通常のリムルス反応を惹起させることが
でき、リムルステスト反応性物質を、リムルステスト試
薬溶解後長時間経ても正確に測定する方法を見出し、本
発明に到達した。
剤とからなる、溶液状態において室温で少なくとも8時
間安定であるカブトガニ・アメボサイト・ライセート組
成物からなることを特徴とするリムルステスト試薬、 カブトガニ・アメボサイト・ライセート組成物が溶
液状態においてpH5.0〜9.0となるように調整さ
れることを特徴とする前記記載のリムルステスト試
薬、 カブトガニ・アメボサイト・ライセート組成物が溶
液または凍結乾燥物であることを特徴とする前記また
はに記載のリムルステスト試薬、 2価金属塩、測定用pH調整剤およびペプチド合成
基質からなる群から選ばれた1種または2種以上と前記
〜のいずれか1項に記載のリムルステスト試薬から
なることを特徴とするリムルステスト試薬キット、 リムルステスト試薬を用いて検体中のリムルステス
ト反応性物質を測定するに際し、前記記載のリムルス
テスト試薬を用い、リムルス反応時の反応混液のpHが
リムルス反応を惹起する範囲のpHとなるように調整す
ることを特徴とするリムルステスト反応性物質の測定
法、 リムルス反応を惹起する範囲のpHが7.0〜8.
5である前記に記載のリムルステスト反応性物質の測
定法、 pHをリムルス反応を惹起する範囲のpHに調整す
る際または調整前、リムルス反応を惹起することができ
る2価金属イオン濃度になるように2価金属塩を添加す
る前記またはに記載のリムルステスト反応性物質の
測定法、および pHをリムルス反応を惹起する範囲のpHに調整す
る際、調整前または調整後、カブトガニ・アメボサイト
・ライセートに含まれるクロッティングエンザイムのア
ミダ−ゼ活性を測定するためのペプチド合成基質を添加
してリムルス反応を起こさせる前記〜のいずれか1
項に記載のリムルステスト試薬反応性物質の測定法であ
り、これにより上記課題を解決できる。
リムルステスト試薬は、基本的にはライセートとキレー
ト剤を含むカブトガニ・アメボサイト・ライセート組成
物(以下、単にライセート組成物ともいう)からなり、
このライセート組成物を溶液とした時にpHが5.0〜
9.0、好ましくはpH6.0〜8.5を示すものであ
れば、その保存形態は制限されず溶液でも固体でもかま
わない。固体の場合は凍結乾燥物が好ましい。また、リ
ムルステスト試薬が固体の場合、リムルステスト試薬を
溶液とする時に使用する溶媒は、測定対象物を含まない
水自体が最も好ましいが、上記pHに影響を与えない範
囲の緩衝液等でもよい。
に使用されるライセートとしては、上記条件を満足すれ
ば、特に制限はない。該ライセートとしては、リムルス
・ポリフェムス(Limulus polyphemus)、タキプレウ
ス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)、タ
キプレウス・ギガス(T. gigas)、カルシノスコルピウ
ス・ロツンディカウダ(Carcinoscorpius rotundicaud
a)等のカブトガニ血リンパ液から、通常の方法(例え
ば、J. Biochem., 80, 1011-1021(1976)参照)により調
製した血球抽出物またはその加工物を挙げることができ
る。
ライセート組成物は、種々の化学物質を包含し得る。具
体的には、ライセート組成物は、前記血球抽出物または
その加工物にC因子及びG因子の活性化に有効な2価金
属塩〔例えば、マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩(塩
化物など)、硫酸塩等〕、クロッティングエンザイムの
基質(例えば、前記のBoc−Leu−Gly−Arg
−pNAのようなペプチド合成基質)を必要に応じて添
加したものであってもよい。好ましくは、これら2価金
属塩やペプチド合成基質を添加せず、別途、使用時に使
えるようにキット化したものが挙げられる。また、リム
ルステスト反応性物質の測定に際し、リムルス反応を惹
起させるためのpHに調整するためのpH調整剤(本明
細書において、測定用pH調整剤という)は、例えば、
トリス−塩酸緩衝液、2−〔4−(2−ヒドロキシエチ
ル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPE
S)緩衝液などの緩衝剤等が挙げられ、本発明のキット
に添付される。
ロロホルム等の有機溶媒で抽出処理したり、界面活性剤
を添加してEtに対する感受性を向上させたものが挙げ
られる。また、ライセートには、通常、Et感受性因子
(C因子)およびβ−グルカン感受性因子(G因子)の
両方が含まれるが、上記加工物としては、デキストラン
硫酸、スルホプロピル基等を結合した担体または特異的
な吸着担体等を用いてライセートを処理し、上記C因子
またはG因子の何れか一方の因子を分画もしくは除去し
てEtまたはβ−グルカンの一方のみに特異的に反応す
るように加工されたものが挙げられる。
−β−D−グルコシド構造単位が特定個数結合したポリ
グルコシドを共存させることによって、G因子の活性化
を阻害し、Etにのみ反応するように加工したものも上
記加工物に包含される。尚、ライセートとしては、市販
のものも使用することができる。本発明のリムルステス
ト試薬を構成するライセート組成物に含まれるキレート
剤としては、金属イオンに配位して安定な錯化合物を形
成するものであればとくに制限はないが、EDTA(エ
チレンジアミン4酢酸)、GEDTA(ビス(2−アミ
ノエチル)エチレングリコ−ル4酢酸;グリコ−ルエ−
テルジアミノ4酢酸)、BAPTA(アミノフェニルエ
チレングリコ−ル4酢酸)、クエン酸塩、NTA(ニト
リロ三酢酸)、リン酸等が使用でき、EDTA、GED
TA、クエン酸塩が特に好ましい。また、クエン酸塩と
しては、クエン酸のアルカリ金属塩が特に好ましい。
ムルステスト反応性物質を測定するには、pH5.0〜
9.0、好ましくはpH6.0〜8.5に調整されたラ
イセート組成物を、リムルス反応時の反応混液のpHが
リムルス反応を惹起する範囲のpH、通常、7.0〜
8.5になるように測定用pH調整剤により調整する、
及びそのpH調整の際または調整前に、リムルス反応を
惹起することができる2価金属イオン濃度になるように
2価金属塩を添加する。
pH範囲に調整され、2価金属が共存すると検体に含ま
れるリムルステスト反応性物質によりリムルス反応が起
こる。このリムルス反応は、従来公知の手段により基質
の変化から測定される。なお、本発明においてリムルス
テスト反応性物質とは、リムルス反応を惹起する物質を
意味し、具体的にはEt、β−グルカン等が挙げられ
る。
ロッティングエンザイムの基質になるようなものであれ
ば、特に限定されない。すなわち、クロッティングエン
ザイムのアミダーゼ活性の測定には、基質として、例え
ば前記のp−ニトロアニリンのような発色性残基を有す
るペプチド合成基質(Boc−Leu−Gly−Arg
−pNA)もしくは発色性残基を有するこれと類似の配
列(例えば、Ac−Ile−Glu−Ala−Arg、
Boc−Val−Pro−Arg、Boc−Val−S
er−Gly−Arg等)のペプチド合成基質、または
これと同一もしくは類似の配列のペプチドであって、C
末端のアミノ酸のカルボキシル基に前記発色性残基の代
わりに公知の発蛍光性残基、発光性残基、アンモニアな
どがアミド結合により置換したペプチド合成基質を使用
することができる(特公昭59−19532、特公昭6
1−54400、特公昭63−26871)。クロッテ
ィングエンザイムがこれらの合成基質に作用して生成す
る反応生成物を測定することによって、アミダーゼ活性
の測定を行うことができる。具体的には、反応(カスケ
ード反応および必要に応じてその、他色素等への変換反
応)によって生成する色素、蛍光物質またはアンモニア
をそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発光測定装
置、アンモニア検出用電極(特開昭62−14886
0)等によって測定する方法を例示することができる。
アーゼ活性の測定には、ライセート中に含まれる(もし
くは別途添加した)コアギュロゲン(基質)にクロッテ
ィングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成す
る際のゲル形成反応を、例えば適当な機器(例えば、濁
度測定装置、粘度測定装置等)で測定するか、または肉
眼で判定する方法を採用することができる。
においては、上記リムルス反応を惹起する範囲のpHに
調整する際、調整前または調整後、カブトガニ・アメボ
サイト・ライセートに含まれるクロッティングエンザイ
ムのアミダ−ゼ活性を測定するための基質、好ましくは
ペプチド合成基質がライセート組成物溶液に添加される
ことが好ましい。尚、ライセート組成物が基質を既に含
む場合はその必要はない。
ス反応に必要な所要量が分取されるような機構を有し
て、その分取量と上記2価金属塩、測定用pH調整剤、
基質等とが混和されリムルステスト反応性物質との接触
によりリムルステスト試薬が活性化されるようにするこ
とが好ましい。この混和の態様は、目的に応じて種々選
定でき、2価金属塩および基質を混和して一緒に使用し
ても、あるいはそれらの少なくとも一方を測定用pH調
整剤と混和して一緒にして使用してもよい。測定用検体
とリムルステスト試薬との混合の時期は、特に制限はな
いがリムルステスト試薬を活性化させるときに添加され
ることが好ましい。
室温(20〜25℃)において少なくとも8時間、4℃
では16時間以上は安定であるから、各種検体に含まれ
るEt、β−グルカン等の濃度の経時変化を長時間にわ
たってモニタリングする上で非常に有用である。なお、
本発明においてリムルステスト試薬が「安定である」と
は、検体を添加しない時、ライセート中の前記各因子の
非特異的な活性化および失活が実質的にないことであ
る。具体的には「活性化」によってブランク値が異常に
高くなり、「失活」によって検体の反応値が異常に低く
なる。換言すれば、そのリムルステスト試薬を使用して
Et、β−グルカン等のリムルステスト反応性物質を測
定する際に、ブランク値が十分に低く、検体の反応値が
一定である場合、「安定である」といえる。
性〜アルカリ性のものならば特に限定はされないが、ト
リス−塩酸緩衝液やグッド緩衝液(例えば、HEPES
緩衝液等)等が好ましい。pHは7.0〜8.5が好ま
しい。本発明によりリムルステスト反応性物質が測定さ
れる検体としては、基本的には特に制限なく、リムルス
テスト反応性物質の定量の必要があるものあるいはその
存否を確認する必要があるものであればよい。例えば、
生体試料、医薬品、透析液、医療分野で使用する水等を
挙げることができる。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例1 T.tridentatus 血リンパ液1.0Lを4℃、1,500
rpm で10分間遠心し、その沈殿部分(アメボサイト)
約21g に0.02Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0)210mLを加え、ホモゲナイザー(ポリトロンR
PT10(商品名)、Kinematica社製造)にて均一に
破砕および抽出し、10,000×Gで30分間冷却遠
心し、上澄液(ライセート)190mLを得た。
M Bis−Tris緩衝液(pH6.5)0.01m
Lと0.021M EDTA−4Na 0.02mLを
加え、pH6.5の条件で室温(20℃)に8時間放置
した(2系列放置)。 B)別のライセート0.04mLに0.4M硫酸マグネ
シウム含有0.5Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)
0.04mLと4.0mM Boc−Leu−Gly−
Arg−pNA0.02mLを加え(通常の発色合成基
質法リムルステスト試薬溶液;比較例)、pH8.0の
条件で同様に放置した。
有2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.01mL
及び4.0mM Boc−Leu−Gly−Arg−p
NA0.02mLを加え(A−1)、もう一方には、
1.6M硫酸マグネシウム0.01mL、上記の発色合
成基質溶液0.02mLを加えた(A−2)後、A、B
に検体として、蒸留水(以下、DW、これをブランクと
して用いる)または大腸菌(Escherichia
coli)0111:B4株由来のEt(シグマ社販売
のWestphal type;50pg/mL)を
0.1mL加え、A−1 とBはpH8.0とし、A−2
はpH6.5のままとした。それらを37℃、30分間
加温して反応させ、生じたパラニトロアニリンを0.0
4%亜硝酸ナトリウム(0.48M塩酸溶液)、0.3
%スルファミン酸アンモニウム、0.07%N−1−ナ
フチルエチレンジアミン二塩酸塩を各々0.5mLずつ
順次加えてジアゾカップリングさせ、545nmで吸光
度を測定した。それらの結果とA、Bとも室温に放置せ
ず調製後直ちに測定した結果と合わせて表1に示した。
B、即ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件とな
っている通常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液
を室温に8時間放置すると活性化されてブランク値が非
常に高まり、Et検体溶液の反応値(Et検体の吸光度
とブランクの吸光度との差)が低下し、一定の測定値が
得られないため濃度未知のEtを正確に定量できない。
一方、本発明の実施例A−1では、ブランク値もほとん
ど上昇せず、Et検体の反応値も放置しないときの値と
ほぼ同一で、8時間後でも活性化も失活も起こらず一定
の測定値が得られることがわかる。
ず、放置pHの6.5のままで測定したA−2では、E
t検体反応値はブランク値より少し高い程度で、非常に
反応性が低く、正確な定量値が得られない。 実施例2 A)実施例1で調製したライセート0.04mLに0.
06M GEDTA0.01mLと0.3M 2−モル
ホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH6.
1)0.01mLを加え、pH6.1の条件で4℃に2
4時間放置した(2系列放置)。
0.04mLに0.4M塩化マグネシウム含有0.5M
HEPES緩衝液(pH7.6)0.04mLと4.
0mMBoc−Leu−Gly−Arg−pNA0.0
2mLを加え(通常の発色合成基質法リムルス試薬溶
液;比較例)、pH7.6の条件で同様に放置した。A
の一方には1.6M塩化マグネシウム0.01mL、2
M HEPES緩衝液(pH7.6)0.01mL及び
4.0mM Boc−Leu−Gly−Arg−pNA
0.02mLを加え(A−1)、もう一方には、1.6
M塩化マグネシウム0.01mL、DW0.01mLお
よび上記の発色合成基質溶液0.02mLを加えた(A
−2)後、A、Bに検体としてDW(ブランク)または
後述により調製したβ−グルカン(100pg/mL)
を0.1mL加え、A−1 とBは、pH7.6とし、A
−2はpH6.1のままとした。以下、それらを実施例
1と同様にして反応させた。A、Bとも4℃に放置せず
調製後直ちに測定した結果と合わせて表2に示した。
ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件となってい
る通常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液を4℃
に24時間放置すると活性化されてブランク値が非常に
高まり、β−グルカン検体溶液の反応値が低下し、一定
の測定値が得られない。一方、本発明の実施例A−1で
は、ブランク値もほとんど上昇せず、β−グルカン検体
の反応値も放置しないときの値とほぼ同一で、24時間
後でも活性化も失活も起こらず一定の測定値が得られる
ことがわかる。
では、β−グルカン検体反応値はブランク値よりやや高
い程度で、ほとんど反応しておらず、正確な定量値が得
られない。 (β−グルカンの調製法)PCT国際公開WO90/0
2951に記載の方法に準じ、カードラン(和光純薬工
業(株)販売)の1gを約100mLの5mM NaO
H水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
TM(大岳製作所、形式5202PZT、東京)により2
0KHZ、80Wで12分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を5M NaOH水溶液を用い、最終
0.3M水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー(GPCカラム:TSK gel G3000
PWXL2本、G2500PWXL 1本、移動相:0.3
M NaOH水溶液、流速0.5mL/min)により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量21
6,000画分を分画採取し、GPC分画精製標品(β
−グルカン標品)を得た。
ンも、上記と同様に調製されたものである。 実施例3 A)実施例1で調製したライセート0.08mLに0.
1M EDTA−4Na含有0.4M酢酸緩衝液(pH
5.0)0.01mLを加え、pH5.0の条件で4℃
に16時間放置した(2系列放置)。
0.08mLに0.4M硫酸マグネシウム含有1M ト
リス−塩酸緩衝液(pH7.4)0.02mLを加え
(通常のゲル化法リムルステスト試薬溶液;比較例)、
pH7.4の条件で同様に放置した。Aの一方には0.
8M硫酸マグネシウム含有2M トリス−塩酸緩衝液
(pH7.4)0.01mLを加え(A−1)、もう一
方には、0.8M硫酸マグネシウム0.01mLを加え
た(A−2)後、A、Bに検体としてDW(ブラン
ク)、Et(50pg/mL)またはβ−グルカン(4
00pg/mL)を0.1mL加え、A−1 とBはpH
7.4とし、A−2はpH5.0のままとした。比濁時
間分析装置「トキシノメ−タ−ET−201」(和光純
薬工業(株)販売)の専用アナリシスモジュ−ルにセッ
トし、37℃、90分加温して反応させ、ゲル化時間
(Tg)を測定した。A、Bとも4℃に放置せず調製後
直ちに測定した結果と合わせて表3に示した。
ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件となってい
る通常のゲル化法リムルステスト試薬溶液を4℃に16
時間放置すると活性化され、ブランク溶液が反応し、E
t検体溶液もβ−グルカン検体溶液もどちらも一定の測
定値が得られない。一方、本発明の実施例A−1では、
ブランク、Et、及びβ−グルカン値ともすべて放置し
ないときの値とほぼ同一で、16時間後でも活性化も失
活も起こらず一定の測定値が得られることがわかる。
では、Et検体もβ−グルカン検体もどちらもその反応
値はブランク値と同一でまったく反応していなかった。 実施例4 L.polyphemus血リンパ液1.0Lを4℃,1,500rpmで1
0分間遠心し、その沈殿部分(アメボサイト)約22g
に0.02Mクエン酸ナトリウム(pH8.2)210
mLを加え、ホモゲナイザ−にて均一に破砕および抽出
し、10,000×Gで30分間冷却遠心し、上澄液(キレー
ト剤含有ライセート)194mLを得た。
8.2)0.04mLにDW0.03mLを加え、pH
8.2の条件で4℃で20時間放置した(2系列放
置)。 B)別のキレート剤含有ライセート0.04mLに0.
1M硫酸マグネシウム含有0.5Mトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)0.04mLと4.0mM Boc−L
eu−Gly−Arg−pNA0.02mLを加え(通
常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液;比較
例)、pH8.0の条件で同様に放置した。
有2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.01mL
及び4.0mM Boc−Leu−Gly−Arg−p
NA0.02mLを加え(A−1)、もう一方には、D
W0.01mL、上記の発色合成基質溶液0.02mL
を加えた(A−2)後、A、Bに検体としてDW(ブラ
ンク)またはEtを0.1mL加え、A−1とBは2価
金属塩(硫酸マグネシウム)含有のpH8.0とし、A
−2は2価金属塩を含まないpH8.2のままとした。
以下、それらを実施例1と同様にして反応させた。A、
Bとも4℃に放置せず調製後直ちに測定した結果と合わ
せて表4に示した。
ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件となってい
る通常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液を4℃
で20時間放置すると活性化されてブランク値が非常に
高まり、Et検体溶液の反応値が低下し、一定の測定値
が得られない。一方、本発明の実施例A−1では、ブラ
ンク値はほとんど上昇せず、Et検体の反応値も放置し
ないときの値とほぼ同一で、20時間後でも活性化も失
活も起こらず一定の測定値が得られることがわかる。
2では、Et検体の反応値はブランク値よりもわずかに
高い程度で、ほとんど反応しておらず、正確な定量値が
得られない。
態で室温でも長時間安定であるため、リムルステスト反
応性物質を正確に経時的に測定することができ、例えば
医療分野で使用する医薬品の製造工程ならびに透析液中
のEtを経時的にモニタリングできるので有用である。
また、本発明のリムルステスト試薬は凍結乾燥物とした
場合も、長期間安定に保存し得、必要時に水で溶解する
だけで所定の安定な測定用リムルステスト試薬溶液を得
ることができる。
Claims (8)
- 【請求項1】カブトガニ・アメボサイト・ライセ−トと
キレート剤とからなる、溶液状態において室温で少なく
とも8時間安定であるカブトガニ・アメボサイト・ライ
セート組成物からなることを特徴とするリムルステスト
試薬。 - 【請求項2】カブトガニ・アメボサイト・ライセート組
成物が溶液状態においてpH5.0〜9.0となるよう
に調整されることを特徴とする請求項1記載のリムルス
テスト試薬。 - 【請求項3】カブトガニ・アメボサイト・ライセート組
成物が溶液または凍結乾燥物であることを特徴とする請
求項1または2に記載のリムルステスト試薬。 - 【請求項4】2価金属塩、測定用pH調整剤およびペプ
チド合成基質からなる群から選ばれた1種または2種以
上と請求項1〜3のいずれか1項に記載のリムルステス
ト試薬からなることを特徴とするリムルステスト試薬キ
ット。 - 【請求項5】リムルステスト試薬を用いて検体中のリム
ルステスト反応性物質を測定するに際し、請求項1記載
のリムルステスト試薬を用い、リムルス反応時の反応混
液のpHがリムルス反応を惹起する範囲のpHとなるよ
うに調整することを特徴とするリムルステスト反応性物
質の測定法。 - 【請求項6】リムルス反応を惹起する範囲のpHが7.
0〜8.5である請求項5に記載のリムルステスト反応
性物質の測定法。 - 【請求項7】pHをリムルス反応を惹起する範囲のpH
に調整する際または調整前、リムルス反応を惹起するこ
とができる2価金属イオン濃度になるように2価金属塩
を添加する請求項5または6に記載のリムルステスト反
応性物質の測定法。 - 【請求項8】pHをリムルス反応を惹起する範囲のpH
に調整する際、調整前または調整後、カブトガニ・アメ
ボサイト・ライセートに含まれるクロッティングエンザ
イムのアミダ−ゼ活性を測定するためのペプチド合成基
質を添加してリムルス反応を起こさせる請求項5〜7の
いずれか1項に記載のリムルステスト反応性物質の測定
法。
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---|---|---|---|
JP16307995A JP3512524B2 (ja) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | リムルステスト試薬およびリムルステスト反応性物質の測定法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08334514A JPH08334514A (ja) | 1996-12-17 |
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WO2006080448A1 (ja) * | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Seikagaku Corporation | リムルス測定用前処理剤 |
-
1995
- 1995-06-07 JP JP16307995A patent/JP3512524B2/ja not_active Expired - Fee Related
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