TW201520339A - 用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示用於測定去纖維蛋白多核苷酸之生物活性的方法，其包括以下步驟：a)使哺乳動物的優球蛋白及對血纖維蛋白溶酶具特異性的基質接觸去纖維蛋白多核苷酸，該基質藉由與該血纖維蛋白溶酶作用而提供一可測量的產物；以及b)測量於連續時間中所產生的產物之量，藉以測定該去纖維蛋白多核苷酸的生物活性。本發明亦揭示液體去纖維蛋白多核苷酸配方，其較佳為水溶液，具有定義的生物活性，且特別係具有去纖維蛋白多核苷酸之活性為25至35IU/mg者，較佳為27.5至32.5IU/mg，以及更佳為28至32IU/mg。

Description

用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法

本發明是關於一種用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之方法，以及更特別地是關於一種間接酵素方法，用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性。

去纖維蛋白多核苷酸(Merck Index,1996,no.2915)是天然起源的物質，其是從動物器官萃取而得，且其是由低分子量的聚去氧核糖核苷酸鈉鹽組成。去纖維蛋白多核苷酸已成為許多醫藥研究之標的，該研究已推測其可用於治療，作為抗凝血劑(美國專利第3,829,567號)。

此外，去纖維蛋白多核苷酸亦已被用於治療周邊動脈血管疾病、急性腎功能不全(美國專利第4,694,134號)或急性心肌缺血(美國專利第4,693,995號)。

目前，去纖維蛋白多核苷酸正用於進行靜脈阻塞疾病(VOD)的治療與預防之臨床試驗。

如同其他萃取而得的生物物質，去纖維蛋白 多核苷酸之組合物的變化性有限，這是典型天然生物聚合物之典型狀況。此狀況的經典例子是肝素，已知其變化性隨批次而有不同的鏈長、分子量、組合物、硫酚鹽化的程度等。結果為相同重量的去纖維蛋白多核苷酸可能實際上具有非均等的特定生物活性。

由於其固有的生物聚合物本質，萃取、分離與純化的製程無法確保產物之絕對的再現性。

然而，如果控制良好，可能降低此變化性。為達此目的，已有研究得到標準化的工業製程，其係用於分離自器官萃取之去纖維蛋白多核苷酸，例如美國專利第4,985,552號所描述者。

上述製程所得到的產物係藉由測定一些特定的物理化學參數而定性，例如，電泳移動率、消光係數、旋光力以及質量平均相對分子質量。然而，這些參數基本上取決於去纖維蛋白多核苷酸的結構，並且無法提供其生物活性的資訊。

目前如我們所知，已報導用於評估去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之方法僅有纖維蛋白平板測試法與優球蛋白水解時間凝血彈性圖式記錄(thromboelastographic recording)(Prino G.、Mantovani M.、Niada R.、Coccheri S.、Butti A.、Indagini preliminari sull'attività fibrinolitica、nell'animale e nell'uomo與di una nuova sostanza發表的diversi organi animali,Simposio Internazionale：La ricerca scientifica nell’industria farmaceutica，義大利，羅馬，1975年10 月2-4日-Il Farmaco,Ed.Prat.)(1969),24,552-561)，以及美國專利第7,338,777號揭露的以血纖維蛋白溶酶為基礎的方法，上述皆併入本案之先行技術。

然而，在上述方法中，優球蛋白水解時間凝血彈性圖式記錄(thromboelastographic recording)之特徵係相當大的實驗複雜性、不充分的再現性與精準性，以及，在一些特定例子中，凝血彈性圖式記錄的反應線性受限於非常嚴格的濃度範圍。

關於血纖維蛋白溶酶為基礎的方法，通常藉由體外測試中的各種標準而測定血纖維蛋白溶酶的酵素活性。最常使用的方法之一是由分光光度法或光譜螢光測定法測定色原性或螢光性化合物，其是藉由血纖維蛋白溶酶於合適的基質上作用而釋放(Haemostasis,(1978),7,138-145)。通常使用具有式A₁-A₂-A₃-X的胜肽基質，其中A₁與A₂是主要為非極性之胺基酸，A₃是離胺酸或精胺酸，以及X代表可測量的釋放化合物，例如對硝基苯胺(para-nitroaniline，pNa)或2-萘胺(2-naphthylamine，NA)(Haemostasis,(1978),7,146-149)。除了上述胜肽基質之外，已成功使用其他的、較簡單的化合物，例如p-硝基苄對甲苯磺醯-L-精胺酸(p-nitrobenzyl-p-toluenesulphonyl-L-arginine)(Haemosta sis,(1978),7,105-108)。

該化合物X釋放至培養基中的速率是與樣品中存在的血纖維蛋白溶酶活性(單位/毫克)成正比。美國專利第7,338,777號揭露的方法是基於上述血纖維蛋白 溶酶評估測試法，去纖維蛋白多核苷酸增加化合物X的釋放速率正比於其濃度。

然而，此方法是在TRIS緩衝液進行，不需要任何其他的血漿/血清活化物/抑制物。因此，該程序不會反應出生理條件或是在體內正確刺激去纖維蛋白多核苷酸的作用機制。

因此，至今未有有效地、精確地且可再現的方法被描述並且有效於測量去纖維蛋白多核苷酸的生物活性，而精確地反映出產物在複雜生物系統(體內)中之作用機制。。

我們已經建立簡單與可靠的方法用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性，使得萃取得到的樣品受到控制，且因而供予以去纖維蛋白多核苷酸為基礎的藥物製備被標準化。

本發明的方法可測定去纖維蛋白多核苷酸的特定生物活性，與參考標準比較，具有高度的精準性與正確性。

本發明是關於一種用於測定去纖維蛋白多核苷酸樣品的特定生物活性，該方法包含以下步驟：a)使優球蛋白及對血纖維蛋白溶酶具特異性的基質接觸去纖維蛋白多核苷酸，該基質藉由與該血纖維蛋白溶酶作用而提供一可測量的產物；以及b)測量在連續時間所形成之產物的量。

本發明是一種間接的體外方法，用於測定去 纖維蛋白多核苷酸的生物活性，其係以去纖維蛋白多核苷酸與優球蛋白之間的功能性作用為基礎。

優球蛋白是血清球蛋白的部分，其無法溶於蒸餾水中，但可溶於食鹽溶液中。

優球蛋白包含血纖維蛋白原、PAI-1、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)、血纖維蛋白溶酶原、以及少量的α 2-抗纖維蛋白溶酶(alpha 2-antiplasmin)以及因子VIII。

本案發明人意外發現去纖維蛋白多核苷酸催化血纖維蛋白溶酶原水解為血纖維蛋白溶酶。因此，當去纖維蛋白多核苷酸與優球蛋白及對血纖維蛋白溶酶具特異性的基質一起培養時，其中該基質例如Haemostasis,(1978),7,138-149揭露的式A₁-A₂-A₃-X之胜肽，其併入本案做為參考，該化合物X釋放至培養基的速率增加與去纖維蛋白多核苷酸的濃度成正比。

換言之，去纖維蛋白多核苷酸催化優球蛋白中所含之血纖維蛋白溶酶原水解為血纖維蛋白溶酶；血纖維蛋白溶酶與對血纖維蛋白溶酶具特異性的基質進行酵素反應，以提供可測量的產物，其中該基質較佳為色原性基質。

本發明之方法更包括步驟c)在去纖維蛋白多核苷酸之標準樣品與測試樣品二者的酵素反應過程中，測定該可測量的產物之釋放速率；d)數學上地及/或圖形上地表示該釋放速率與所對應的去纖維蛋白多核苷酸濃度之關聯，以得到該去纖維蛋白多核苷酸之測試樣品的 生物活性。

本發明中用於測定的去纖維蛋白多核苷酸之樣品，通常依照已知製程由器官萃取而成，該製程例如美國專利第4,985,552號，其於前已述，且亦併入本案之先行技術，。

根據本發明，選擇一批次正常工業製造的去纖維蛋白多核苷酸作為參考樣本(標準品)，並將其用於製備校正曲線。

一般而言，本發明的方法提供精準與正確的測量去纖維蛋白多核苷酸，即使有汙染物存在亦同，例如有RNA、肝素、降解的去纖維蛋白多核苷酸(已移除嘌呤與嘧啶的去纖維蛋白多核苷酸)或是乙醇，其重量濃度通常小於10%，不會損害系統。

除了可測定去纖維蛋白多核苷酸之外，本發明的方法亦可測定衍生自去纖維蛋白多核苷酸之其他生物相當之基質，例如去胺基的去纖維蛋白多核苷酸，或更簡單地，受到物理化學條件結合而變性/降解的去纖維蛋白多核苷酸。

本案方法的靈敏度足以偵測濃度(測定系統中的最終濃度)小於或等於2.5μg/ml的去纖維蛋白多核苷酸，並且通常表現良好的關聯性高達最大濃度值大於或等於1000μg/ml。

所使用的優球蛋白通常是任何的哺乳動物優球蛋白部分，例如牛、豬、兔或人類的優球蛋白，較佳係使用人類與牛的優球蛋白。

然而，雖然優球蛋白部分是選擇的酵素系統，但是使用其他相等酵素系統，例如稀釋的血漿與血清(以緩衝液稀釋高達1：10)、人工形成或是分離組合的血纖維蛋白溶酶原、tPA、uPA、PAI-1&2與α2-抗纖維蛋白溶酶以及化學與生物相關且具相似功能之類似的酵素系統，皆落入本發明的範圍內。

在本發明的方法中，血纖維蛋白溶酶的基質可被理解為任何對於血纖維蛋白溶酶有特異性的基質，在此方法條件下，其釋放出可偵測的水解產物X。

取決於可偵測的官能基X之本質，亦可採用熟知此技術領域之人士所周知的替代偵測系統。分光光度或螢光測定的偵測系統特別有利，特別是分光光度系統更為有利。

通常使用的基質是對於血纖維蛋白溶酶原-血纖維蛋白溶酶分析具有特異性的基質。較佳為使用式A₁-A₂-A₃-X之胜肽，其中A₁與A₂主要為非極性之胺基酸，A₃是離胺酸或精胺酸，以及X代表可測量的官能基。這些基質例如Val-Leu-Lys-pNa、Val-Phe-Lys-pNa或pyroGlu-Phe-Lys-pNa，其中分光光度計可偵測之官能基X係對硝基苯胺(pNA)。其他合適的基質，例如Val-Gly-Arg-2NA，包含2-萘胺，其可由螢光測定法偵測。特別較佳的基質是H-D-纈胺醯基-L-白胺醯基-L-離胺酸-對硝基苯胺(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)化合物。

用於測定優球蛋白部分的去纖維蛋白多核苷酸活性之特定基質通常係為商業上可取得者。

本發明的測定方法是將去纖維蛋白多核苷酸樣品置放於特定pH與莫耳濃度的優球蛋白溶液中。

特別地，得自哺乳動物血漿的優球蛋白部分，其係以食鹽緩衝液將該優球蛋白溶解並稀釋為產生血漿的原始體積而被重新調製(例如：得自10毫升血漿的優球蛋白部分，以食鹽緩衝溶液溶解並重新調製成10毫升，其pH在7與8之間)。

然而，色原性基質的使用濃度通常為0.3至4mM，較佳為2.5至3.5mM，以及更佳為3mM，而螢光性基質的使用濃度為0.05至0.15mM。

如同其他酵素方法，本發明的測定方法係對培養基的pH敏感。

事實上，它通常不能用於極端的pH值，因為該酵素系統會被去活化。

較佳是在進行測量期間的任何時間，培養基的pH值都不會發生變化，因此，以通常用於生物測試的緩衝系統重新調製優球蛋白部分。合適的緩衝系統，例如可為磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液或是三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽與氯化鈉(TRIS-NaCl)緩衝液。較佳是以TRIS-NaCl進行優球蛋白部分的重新調製。

在本發明的方法中，通常較佳是將培養基的pH維持在約7至8的範圍，更佳為約7.4至7.6。

此外，較佳為保持緩衝系統的濃度在10至200mM的範圍，更佳為約50mM。更具體而言，TRIS-NaCl的濃度應為50mM的TRIS與150mM的氯化 鈉。

在本發明用於測定去纖維蛋白多核苷酸生物活性的方法中，去纖維蛋白多核苷酸樣品溶液直接稀釋於優球蛋白部分，而後加入色原性或螢光性基質。特別地，為了能夠測量，較佳為先將去纖維蛋白多核苷酸稀釋/溶解於TRIS-NaCl緩衝液中，以得到樣品與標準品二者的母儲存液。藉由連續稀釋，從母儲存液稀釋該樣品與該標準品成為定義體積的優球蛋白部分，直到分析濃度範圍為約1至1000μg/mL的去纖維蛋白多核苷酸。

本發明之測定方法的一重要參數為溫度。關於建立參考曲線以及在測量階段，較佳是在整個測量過程中，以及對於所有欲測量之樣品維持相同溫度。為了達到此目的，較佳是使用溫控裝置，視需要可進行數組測量，適當改變樣品的位置，以確保系統具有最大的熱同質性。

一般而言，此測定方法使用的溫度範圍，例如25至40℃，較佳為35至39℃，更佳為37℃。

根據本發明，當已經加入所有的反應試劑時，藉由去纖維蛋白多核苷酸的作用，開始測量釋放在培養基中的化合物X之濃度，並且以預定的頻率，持續測量一段預定的時間，作為X化學本質與偵測系統的函數。

類似於其他生物測定方法，本發明的方法亦提供校正階段與測量階段，其較佳是在相同的微量盤上進行，以盡可能減少實驗變數的發生。

該校正階段包括在已知去纖維蛋白多核苷酸(標準品)的增加濃度，獲得與樣品相關的吸光值數據，那些數據的統計再處理以及校正曲線的推斷，其表示本發明之酵素反應速率之增加與存在優球蛋白部分中的去纖維蛋白多核苷酸的濃度之間的關聯性。在測量階段中，由於在校正階段得到該關聯性，可在相同條件下所測量之吸光值基礎上，決定去纖維蛋白多核苷酸樣品的未知生物活性。

詳言之，實驗程序通常提供用於製備數個樣品，在各種已知濃度的去纖維蛋白多核苷酸之標準品與未知者。根據預定的稀釋因子，連續稀釋母溶液，以製備該去纖維蛋白多核苷酸樣品

在本發明的方法中，較佳為製備至少5個濃度的標準品與5個濃度的待測樣品，對於標準品的每一個濃度以及同樣地對於測試樣品的每一個濃度，製備至少4重複，通常是對母溶液連續1：2稀釋。

去纖維蛋白多核苷酸之標準品與測試樣品濃度通常是0.1至1000μg/ml。

該測試樣品的濃度較佳是與標準品濃度的程度相同。

根據上述說明，每一個濃度的測量較佳是在一個微量盤上進行，其中每一個標準品與樣品的位置較佳是分別在對應濃度交替。根據此樣品配置，更進一步說明於實驗部分，對於每一濃度的去纖維蛋白多核苷酸標準品與測試樣品，每一次至少測量4個吸光值。

在預定的時間進行上述測量，亦即，首先在時間t₀，即已經加入所有的成分且在本發明的酵素反應開始之前，，而後在確切的間隔，進行一段足夠長的時間以獲取所需要的數據。

較佳地，持續進行吸光值測量至最多90分鐘，每1-10分鐘進行讀取。更有利的是每分鐘進行讀取。在一波長進行分光吸光值讀取，這取決於在酵素水解反應過程中所釋放之可偵測的官能基X之本質。在X為p-NA的例子中，測試405nm的吸光值。

該標準品與未知的去纖維蛋白多核苷酸樣品之吸光值讀數為原始數據，其通常是直接源自於提供讀取操作的相同裝置，其以此方式被製表以表示每一時間點與孔(well)的吸光值。

而後，使用例如Spread Sheet-Microsoft Excel®，處理該原始數據。此第一處理操作造成在每一時間點以及對於每組讀數之計算平均吸光值與相關標準偏差的計算，各組包括標準品與測試樣品去纖維蛋白多核苷酸二者的每一濃度至少4重複。

對於生物分析測定，進一步以商業上可獲取的軟體進行數據的統計處理，如Finney D J於Ch.Griffin,London and relevant Pharmacopoeias第二版中發表之生物分析中的統計方法(Statistical Method in Biological Assay)所述者。

更確切而言，根據本發明，可使用如European Pharmacopoeia General text 5.3中統計分析所定義的平 行線模式、斜率配給量模式與四參數邏輯模式，進行去纖維蛋白多核苷酸的生物分析測定。

如第1圖所示，藉由將時間放在橫座標以及吸光值放在縱座標，得到直線，其斜率「b」與酵素反應的速率成比例：藉由增加去纖維蛋白多核苷酸的濃度，水解的速率與「b」值會成比例地增加。最後，如上所述計算標準品去纖維蛋白多核苷酸與測試樣品去纖維蛋白多核苷酸的每組重複，得到斜率值與其相關的去纖維蛋白多核苷酸之濃度的關聯性。可使用橫座標之合適的數學轉型(亦即去纖維蛋白多核苷酸濃度的對數)以替代真實值。

圖形上，該關聯性造成該標準品為S形以及測試樣品為S形(第2圖)；S形的中央部分具有兩直線，其通常為平行，且其距離是該測試樣品與該標準品之間生物活性差的函數。此間隔係使用Finney D J於倫敦Griffin出版之生物分析中的統計方法第2版所述之平行線模式，以用於效力測定。

為了更特定的測定，使用四參數邏輯曲線模式，並且在此例子中，樣品與標準品的整個S形曲線係用於計算樣品的相對生物潛力。

在本發明的一較佳實施例中，標準溶液與待測的去纖維蛋白多核苷酸之樣品溶液被置入微量盤的各個孔中。優球蛋白在要使用時製備，且其係去纖維蛋白多核苷酸儲存溶液的稀釋媒介。最後，加入含有色原性基質的溶液。而後，將微量盤置於自動調溫讀取器，以 及在快速震動之後，在預定的間隔與預定的時間期間，進行系統之吸光值的讀取。而後，處理得到的原始數據，因而測定去纖維蛋白多核苷酸樣品的未知活性。

由以下範例可理解，根據本發明的方法可得到液體去纖維蛋白多核苷酸配方，較佳為水溶液，其具有定義的生物活性，以及特別係具有去纖維蛋白多核苷酸之活性為25至35IU/mg者，較佳為27.5至32.5IU/mg，以及更佳為28至32IU/mg。

液體去纖維蛋白多核苷酸配方較佳係以容器的形式銷售，較佳係為小玻璃瓶，包含200mg的去纖維蛋白多核苷酸於2.5ml的緩衝水溶液(較佳為pH6.5至8.5，更佳為7至8)，在使用之前稀釋；結果，當以本發明的方法評估生物活性時，每一個容器呈現去纖維蛋白多核苷酸活性為5000至7000IU，較佳為5500至6500IU，更佳為5600至6400IU。

本發明的上述與其他方面如以下實施例所述，然而以下實施例並不會限制本發明。

實施例

以下材料係用於本案之實施例中：

裝置

程式與軟體

o Microsoft Excel®(微軟公司，Redmond,Wash.,USA)

物質

○去纖維蛋白多核苷酸(Gentium)

○色原性基質S-2251(Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A.，義大利米蘭)

○三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(TRIS)-氯化鈉(TRIS-NaCl)，(Sigma-Aldrich，義大利米蘭)

○1N HCl(Carlo Erba reagenti，義大利米蘭)

○1N NaOH(Carlo Erba reagenti，義大利米蘭)

○牛血漿(Tebu Bio Italia,Magenta(MI)，義大利)

○冰醋酸(Carlo Erba reagenti，義大利米蘭)

溶液

○TRIS-NaCl(製備1L)：將6.06克的TRIS-HCl與2.2g的NaCl定量置入1L燒杯中，溶解於 500mL的純水中，並且以約40mL的1N HCl將pH調整至7.4。將溶液定量置入1L燒瓶中，並且以純水稀釋該溶液。將該溶液儲存於冰箱(2-8℃)。

○色原性基質S2251(CAS 63589-93-5)3mM(製備15.2mL)：以15.2mL純水溶解約25mg的色原性基質。將該溶液儲存在冰箱(2-8℃)。

○牛的優球蛋白(製備10mL)。在最小容量為300mL的容器中，加入240mL的冰純水，並且在攪拌下加入10mL牛血漿。以1%醋酸調整pH至5.3±0.1。在2-8℃靜置1至16小時。以虹吸管移除上清溶液，並且在4℃於2.800rpm離心5分鐘以收集沉澱物。機械式分散(例如：使用實驗用玻璃棒)懸浮該沉澱於5mL的冰純水，震盪約5分鐘，並且在4℃於2.800rpm離心5分鐘以收集沉澱。將該沉澱機械式分散於約10mL的TRIS-NaCl；為促使該沉澱分散，以合適的儀器(例如：實驗用玻璃棒)破壞沉澱粒子。將所得到的懸浮液儲存在2-8℃，在使用前之儲存不少於1小時且不超過6小時。

去纖維蛋白多核苷酸溶液之標準品與樣品

參考儲存溶液

將約100mg的去纖維蛋白多核苷酸參考標準品定量置入20mL的燒瓶。以約10mL的TRIS-NaCl溶解粉末，並以相同溶劑補足體積。將所得到的溶液以 TRIS-NaCl稀釋1：4，以得到約1.25mg/mL的去纖維蛋白多核苷酸RS溶液。

樣品儲存溶液

將約100mg的去纖維蛋白多核苷酸樣品定量置入20mL的燒瓶。以約10mL的TRIS-NaCl溶解粉末，並以相同溶劑補足體積。將所得到的溶液以TRIS-NaCl稀釋1：4，以得到約1.25mg/mL的去纖維蛋白多核苷酸樣品溶液。

參考品與樣品溶液之製備

a)125ug/mL的去纖維蛋白多核苷酸：用TRIS NaCl以1：10稀釋去纖維蛋白多核苷酸儲存溶液(參考品與樣品)(相當於盤孔中為50ug/mL)。定量置入500uL的製備溶液於微量離心管中，混合該溶液與500uL的優球蛋白。封閉該離心管，並且將其儲存於冰水中。

b)62.5ug/mL的去纖維蛋白多核苷酸：用TRIS NaCl以1：2稀釋溶液(a)(相當於盤孔中為25ug/mL)。定量置入500uL的製備溶液於微量離心管中，混合該溶液與500uL的優球蛋白。封閉該離心管，並且將其儲存於冰水中。

c)31.25ug/mL的去纖維蛋白多核苷酸：用TRIS NaCl以1：2稀釋溶液(b)(相當於盤孔中為12.5ug/mL)。定量置入500uL的製備溶液於微量離心管中，混合該溶液與500uL的優球蛋白。封閉該離心管，並且將其儲存於冰水中。

d)12.5ug/mL的去纖維蛋白多核苷酸：用 TRIS NaCl以1：2.5稀釋溶液(d)(相對於盤孔中為5ug/mL)。定量置入500uL的製備溶液於微量離心管中，混合該溶液與500uL的優球蛋白。封閉該離心管，並且將其儲存於冰水中。

空白溶液

混合1體積的優球蛋白與1體積的TRIS NaCl溶液(例如：500uL+500uL)。

盤儲存

根據所提出的儲存方案(請見以下表1)，在微量盤的每一孔中，加入200uL的標準品或樣品或空白溶液。可根據自動移液管的可用性與架構，而使用不同的儲存方案。然而，對於每個參考品與樣品溶液，必須使用不少於四個儲存以用於分析。

將盤放入微量盤讀取器之前，快速加入50uL的色原性基質於每一槽中。

S1,S2,S3,S4：參考溶液儲存1、儲存2、儲存3、儲存4

U1,U2,U2,U5：樣品溶液儲存1、儲存2、儲存3、儲存4

Ca,Cb,Cc等：去纖維蛋白多核苷酸參考品與樣品濃度a、b、c等

BLK：空白溶液

計算與結果

從動力圖可知，標準品製備的「吸光值與時間」(例如：S1_Ca、S1_Cb、S1_Cc)辨識合適的線性範圍(例如：30至35分鐘，請見第3圖)。

該線性動力範圍(405nm之吸光值對時間)的辨識

該標準品與樣品之每一製備在預定時間範圍內的分析反應(斜率)之計算如下。

其中：

Aa是在時間Ta的吸光值(自上述圖式的30分)

Ab是在時間Tb的吸光值(自上述圖式的35分)

將所得到的值列表於表2中。

將待測物質的反應及標準品的反應與濃度的對數作圖，並且使用Ph.Eur目前版本的第5.3.2章定義的平行線模式計算代測物質的活性。

應該使用不少於3個連序連續稀釋的參考品與樣品(例如去纖維蛋白多核苷酸濃度5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL或5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL或12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL

變異之分析

根據Ph.Eur.目前版本的5.3.2.3部分以及Finney DJ(1964年)生物分析中的統計方法第2版，進行變異之分析。

有效性之測試

1)線性回歸條件是重要的，亦即計算的機率小於0.05。如果未符合門檻，不可能計算95% C.I。

2)非平行的條件不是重要的，亦即計算的機率小於0.05。

3)非線性的條件不是重要的，亦即計算的機率小於0.05。

接受條件

4)估計效力不小於90%，且不大於所稱效力之111%。

5)估計效力的信心限制(P=0.95)不小於80%，且不大於所稱效力的125%。

計算

其中：

R：平行線模式分析所得的樣品結果

所稱效力：標準品的所稱效力(乾物質UI/mg)

標準品濃度：標準品的濃度(乾物質mg/mL)

樣品濃度：樣品的濃度(乾物質mg/mL)

用於去纖維蛋白多核苷酸配方的分析

以上揭示的分析已用於測定2.5ml中含有200mg的去纖維蛋白多核苷酸(每毫升有80毫克)且具有合格定量之表3所示組合物之液體配方的生物活性。

結果如表4所示。

第1圖，係藉由以去纖維蛋白多核苷酸(濃度 為0-50μg/ml，0-100分鐘)活化或非活化的哺乳動物的優球蛋白部分，說明pNA自基質S-2251的釋放動力學之曲線圖。

第2圖，係表示關於去纖維蛋白多核苷酸的標準品與測試樣品之上升的S形曲線圖。

第3圖，係顯示標準製備(例如：S1_Ca,S1_Cb,S1_Cc)的「吸光質與時間之對應圖」，其確認合適的線性範圍(例如：從30至35分鐘)。

Claims (20)

1. 一種用於測定去纖維蛋白多核苷酸之生物活性的方法，其包括以下步驟：a)使哺乳動物的優球蛋白及對血纖維蛋白溶酶具特異性的基質接觸去纖維蛋白多核苷酸，該基質藉由與該血纖維蛋白溶酶作用而提供一可測量的產物；以及b)測量在連續時間中所形成之產物的量，藉以測定該去纖維蛋白多核苷酸之生物活性。
2. 如請求項1之方法，其中該優球蛋白係哺乳動物的優球蛋白。
3. 如請求項1之方法，其中該優球蛋白係人類、兔子或牛的優球蛋白。
4. 如請求項1之方法，其中該與對血纖維蛋白溶酶具有特異性的基質作用之血纖維蛋白溶酶係由包含於優球蛋白中的血纖維蛋白溶酶原所釋放。
5. 如請求項1之方法，其中該對血纖維蛋白溶酶具有特異性之基質係色原性基質。
6. 如請求項1之方法，其中該對血纖維蛋白溶酶具有特異性之基質係為具有式A₁-A₂-A₃-X之化合物，其中A₁與A₂為非極性胺基酸，A₃係離胺酸或精胺酸，以及X係該可測量的產物。
7. 如請求項6之方法，其中該可測量的產物X係選自於對硝基苯胺與2-萘胺所組成的群組。
8. 如請求項4之方法，其中該對血纖維蛋白溶酶具有特 異性之基質係H-D-纈胺醯基-L-白胺醯基-L-離胺酸-對硝基苯胺。
9. 如請求項6之方法，其中係藉由分光光度法或光譜螢光測定法而測量該可測量的產物X。
10. 如請求項2之方法，其中該哺乳動物的優球蛋白係經重新調製而與原始血漿具有相同量，或係以合適的緩衝液稀釋達1：10，且色原性/螢光性基質之濃度為2.5至3.5mM，較佳為3mM。
11. 如請求項1之方法，其中該方法係在一反應媒介中進行，該反應媒介係水溶液，其被緩衝至pH 7至8，較佳為pH 7.4。
12. 如請求項1之方法，其中溫度維持在35至39℃，較佳為37℃。
13. 如請求項1之方法，其中該對血纖維蛋白溶酶具有特異性之基質的濃度為0.3至4mM，較佳為2.5至3.5mM，更佳為3mM。
14. 如請求項1之方法，其中該方法包括步驟：c)在標準樣品與測試樣品二者的酵素反應過程中，測定該可測量的產物之釋放速度；d)數學上地及/或圖形上地表示該釋放速度與所對應的去纖維蛋白多核苷酸濃度之關聯，以得到該去纖維蛋白多核苷酸之測試樣品的生物活性。
15. 一種液體去纖維蛋白多核苷酸配方，其具有之去纖維蛋白多核苷酸之生物活性為25至35IU/mg，較佳為27.5至32.5IU/mg，更佳為28至32IU/mg。
16. 如請求項15之液體去纖維蛋白多核苷酸配方，其係水溶液。
17. 如請求項16之液體去纖維蛋白多核苷酸配方，其較佳為被緩衝為pH 6.5至8.5，更佳為7至8。
18. 如請求項15至17之液體去纖維蛋白多核苷酸配方，其係用於VOD之治療與預防。
19. 一種容器，其包含液體去纖維蛋白多核苷酸配方且具有之生物活性為5000至7000IU，較佳為5500至6500IU，更佳為5600至6400IU。
20. 如請求項19之容器，其中該液體去纖維蛋白多核苷酸配方係水溶液。