JP3502855B2

JP3502855B2 - 自立性配列複製電気化学発光核酸測定法

Info

Publication number: JP3502855B2
Application number: JP2001171226A
Authority: JP
Inventors: ケンテン，ジョン; スミス，ロジャー
Original assignee: イゲン，インコーポレーテッド
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 2001-06-06
Publication date: 2004-03-02
Anticipated expiration: 2019-03-02
Also published as: JP2002034561A; ATE236269T1; CA2172248C; US6048687A; DE69432419D1; AU7840794A; AU700055B2; EP0722508A4; DE69432419T2; JPH09505464A; WO1995008644A1; CA2172248A1; EP0722508A1; EP0722508B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特異的核酸配列の
増幅、および電気化学発光標識結合種を使用するその配
列の迅速な検出と定量のための強化された方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】試料中に存在する特異的核酸配列の検出
と定量は、特異性の高い公知の診断方法である。この特
異性は、特異的配列の知識と特異的で相補的なプローブ
の作成に基づく。特異的核酸配列の検出と定量のための
方法は、下記の特許に例示されている：（１）米国特許第５，１３０，２３８号は、特異的核酸
配列を増幅するための改良方法に関する。この増幅方法
の改良点は、単独またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
と組合せたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の添加で
ある；（２）米国特許第４，６８３，１９５号は、核酸
又はその混合物に含まれる任意の標的核酸配列を増幅し
検出する方法に関する；（３）米国特許第４，６８３，
２０２号は、核酸又はその混合物に含まれる任意の目的
とする特異的核酸配列を増幅する方法に関する；（４）
米国特許第４，４８６，５３９号は、１工程サンドイッ
チハイブリダイゼーション試験により核酸を同定する方
法に関する；そして（５）ＷＯ９１／０２８１４は、特
異的核酸配列を増幅する方法に関する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】高度に特異的な核酸プ
ローブの使用は、ある場合には嚢胞性線維症のような遺
伝子欠損の解析の場合のように、そのタンパク質が存在
しない時に正確な結果を得ることのできる唯一の方法で
ある。これはまた、ＨＩＶ１またはヘルペスのように感
染によりタンパク質がほとんどまたは全く生成されない
潜伏性ウイルス感染の場合にも有用である。またこの核
酸プローブの非常に高い特異性により、交差反応のた
め、およびこれらの感染性物質のアイソタイプ間の交差
反応性の欠如のため、抗体で同定するのが困難な感染性
物質の診断にも有用である。さらに、ＤＮＡ配列の解析
により、特異的なプローブの迅速で有効な選択が可能に
なるが、これは抗体に基づく試薬では不可能である。既
存の核酸プローブ法の適用において最も困難でこれを制
約するものは、特異的配列の複雑さと検出のための方法
に時間がかかることである。核酸の増幅により、低レベ
ルの標的分子に関連した核酸プローブ法の制約は、上述
の米国特許第５，１３０，２３８号；第４，６８３，１
９５号；第４，６８３，２０２号において解決してい
る。ある場合には天然増幅の利用がこの問題を解決する
のに用いられた。これは、米国特許第４，８５１，３３
０号に開示されるように１００，０００コピー／細胞以
下のリボソームＲＮＡの使用により例示される。感染性
物質を培養する必要なく有効なものであるために、この
方法は多くのインキュベーションと洗浄を要する迅速化
学発光検出系を利用する。しかしこの方法も選択された
細胞性病原体にのみ限定され、ウイルスまたは遺伝子欠
損の場合には役に立たない。先行技術に開示された増幅
方法にもかかわらず、本発明は、試料の前処理（例え
ば、固相または膜への結合、試料の変性、油状物、タン
パク質の抽出によるかまたはゲル電気泳動による試料の
精製）を必要とせず、ハイブリダイズされ解析される増
幅混合物にプローブを直接添加することができる。プロ
ーブ配列が修飾されるか、または酵素や増幅混合物中の
条件により媒介される試料の分解を引き起こす可能性を
考えると、これは驚くべきことである。例えば、ＤＮＡ
とＲＮＡ間のハイブリッド（プローブハイブリダイゼー
ションの基礎）を分解するＲＮＡａｓｅＨの存在は、不
純な増幅混合物をプローブ結合させる過程で特異的ハイ
ブリッドを分解する。また、逆転写酵素の存在によりハ
イブリダイゼーション混合物中のプローブがプライマー
として使用され、特異的ハイブリダイゼーション複合体
形成反応からプローブが除去されてしまうであろう。こ
れらの問題の可能性に加えて、緩衝液は多くの化合物を
含有し、これらの化合物はハイブリダイゼーションの問
題を、また関与する特異的化学種（例えば、高レベルの
塩ＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ、ヌクレオチド、ジチオスレイト
ール、スペルミジン、ジメチルスルホキシド、グリセロ
ールおよびタンパク質）によるＥＣＬの生成の問題をも
引き起こすかもしれない。このリストには、他の核酸プ
ローブ法を妨害し、これらの方法を実施可能にするため
に除去する必要のある多くの物質が含まれる。すなわ
ち、驚くべきことに本発明ではこのような単純なプロト
コールによる核酸プローブ測定法を実施することができ
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、迅速で工程が
少なく従来の診断方法に比べて時間のかからない、増幅
により生成する特異的核酸配列の検出のための診断方法
に関する。この増幅は比較的一定の温度で起き、多くの
一本鎖ＲＮＡ種を生成する。この増幅に続いてプローブ
へのハイブリダイゼーションが、比較的一定の温度で行
われ、次に結合したかまたは複合体を形成した電気化学
発光種について解析される。このため、多数回のインキ
ュベーションと多数回の洗浄、これに続く核酸の検出の
ための多数回のインキュベーションを要する他の系とは
異なり、本診断方法は迅速であり、かつ感度が高い。本
発明の１つの面により、特異的核酸配列を増幅する方法
が使用され、次に２つのオリゴヌクレオチドプローブ
［１つは結合種を有する捕獲プローブ（すなわち、ビオ
チンまたは抗原）、他の１つは電気化学発光標識物を有
するプローブ］が添加される。本方法は一本鎖ＲＮＡ、
一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡの合成を含む。一本
鎖アンチセンスＲＮＡは第二のプライマーのための第一
鋳型である。一本鎖ＤＮＡは第一のプライマーのための
第二鋳型である。二本鎖ＤＮＡは、第一鋳型の多くのコ
ピーの合成のための第三鋳型である。第一のまたは第二
のプライマーの配列は、特異的核酸配列の配列に充分に
相補的であり、第一のまたは第二のプライマーの配列
は、特異的核酸配列の配列に充分相同的である。第二の
プライマーは第一ＲＮＡ鋳型の３’末端に結合し、第二
ＤＮＡ鋳型を生成させる。第一のプライマーの３’末端
は、第二ＤＮＡ鋳型の３’末端にハイブリダイズする。
第二鋳型は第一鋳型から除去され、相補的ＤＮＡ鎖を生
成させるのに使用される。生じた二本鎖ＤＮＡは第三鋳
型として作用して多くの第一鋳型を合成し、この第一鋳
型が順に上述のサイクルを繰り返す。この増幅方法は、
下記文献により詳述される：キービッツ（Ｋｉｅｖｉｔ
ｓ）ら、３５Ｊ．Ｖｉｒ．Ｍｅｔｈｏｄ．２７３−２
８６（１９９１）；ブルイステン（Ｂｒｕｉｓｔｅｎ）
ら、９ＡＩＤＳＲｅｓ．ａｎｄＨｕｍａｎＲｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ２５９−２６５（１９９３）；
ＥＰ０３２９８２２−Ａ２、ＷＯ９１／０２８１８、Ｗ
Ｏ９１／０２８１４（本質的に同様な方法がＷＯ８８／
１０３１５にも記載されている）。インキュベーション
の終了後、上述のように増幅からの試料をとり、相補的
プローブの混合物と、ハイブリダイゼーション緩衝液中
のプローブの１つと相補的な結合種中でコーティングさ
れたビーズを添加し、次にあらかじめ設定した温度でイ
ンキュベーションを行い、第一鋳型へのプローブのハイ
ブリダイゼーションと、結合相互作用（すなわち、抗体
−抗原またはビオチン−ストレプトアビジン）を介する
ビーズへの１つのプローブの結合を起こさせる。このイ
ンキュベーションの終了後、複合体が形成されるが、こ
の複合体は、２つの異なるプローブ（１つは電気化学発
光標識物を含有し、もう１つは結合種を含有する）にハ
イブリダイズする上記増幅反応から生成した第一のプロ
ーブよりなる。この複合体は、コーティングされたビー
ズとさらに複合体化して、プローブ結合種との相補的結
合対を形成する。生じた複合体は、増幅された第一鋳
型、電気化学発光標識物を有するプローブ、結合種を有
する捕獲プローブ、および結合種のコーティングを有す
るビーズを含み（図１参照）、これら全てが各成分の特
異的相互作用を介して複合体化している。ＮＡＳＢＡサ
イクル中に生成するＤＮＡ配列はハイブリダイゼーショ
ンと検出のための標的になることも理解されるであろ
う。

【０００５】特許請求される本発明の別の実施態様にお
いて、プローブとビーズ間の相互作用は、ビーズへの共
有結合の形成により、または結合種（この結合種が、共
有結合または非共有結合的にコーティングされている場
合に）相互作用を介して、またはビーズを非共有結合で
コーティング可能な分子種への共有結合を介して間接的
に、ハイブリダイゼーション工程の前に作ることができ
る。この間接共有結合コーティングの例は、タンパク質
のような担体に結合しているプローブの形をとり、次に
ビーズ表面に非共有結合的にコーティングすることがで
きる。別の実施態様において、増幅の試料は、ＥＣＬ種
で標識したプローブ、およびプローブと第一鋳型間に形
成されたハイブリッドに特異的な結合種でコーティング
されたビーズと混合される。例えば、ＤＮＡとＲＮＡの
このようなハイブリッドは、特異的抗体を用いて捕獲さ
れる。１つの例は抗ＤＮＡ：ＲＮＡ抗体の使用である
（マイルズ社（ＭｉｌｅｓＩｎｃ．）４，８３３，０
８４）。このような混合ハイブリッド分子を認識する他
の抗体（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡの、ホスホン酸、
ホスホロチオ酸、アルキルまたはアリールホスホン酸に
基づく核酸配列に対して作成した抗体）も有用であろう
（ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら、２４Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ４０４１−４０４６（１９８５）、グ
レン・リサーチ（ＧｌｅｎｎＲｅｓｅａｒｃｈ）（バ
ージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ））からも
入手可能）。これらの方法は、ハイブリダイゼーション
時の新規分子種の形成に基づき、この新規分子種は、抗
体に対するかつ抗体を作成するための結合種、またはこ
れらの分子種に対する他の結合種である。さらに別の実
施態様において、本測定法は出発物質中の核酸の量を定
量するのにも使用することができる。これは、試料への
反応中に増幅される特異的「スパイク」試料の添加によ
り達成される。スパイクシグナルと試料シグナルの測定
により比を計算することができ、元のスパイクレベルに
基づき試料レベルの測定が可能になる。存在する可能性
のある試料の量の範囲を越える量の範囲にわたる、標的
と試料間で１：１の比で読める検量線を作成することが
できる、多くのスパイクの使用により、これは最も正確
に測定される。これに基づく方法はよく理解されてい
る：バン・ゲメン（ＶａｎＧｅｍｅｎ）ら、４３
Ｊ．Ｖｉｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７７−１８７（１９
９３）；シーベルトとラリック（Ｓｉｅｂｅｒｔａｎ
ｄＬａｒｒｉｃｋ）、１４Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ２４４−２４９（１９９３）；ピアタク（Ｐｉａ
ｔａｋ）ら、１４Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７０
−８０（１９９３）。この定量方法は、ＥＣＬ標識物の
使用とＮＡＳＢＡ増幅を含む方法の使用により提供され
る、検出と定量のための迅速で正確な方法の使用により
改良される。

【０００６】本発明はさらに、以下の工程よりなる、特
定の核酸配列を検出する方法を提供する：（ａ）（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｉｉ）プロモーターのアンチセンス配列よりなる第二
のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉｉ）このプロ
モーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｉｖ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｖ）ＤＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｖｉ）一本鎖または二
本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌク
レアーゼ、よりなる試薬を含有する単一の反応媒体を提
供し、（ｂ）この反応媒体中に、（ｉ）第一のオリゴヌ
クレオチドプライマーがＲＮＡ第一鋳型にハイブリダイ
ズし、（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮ
Ａ第一鋳型を使用して、第一のオリゴヌクレオチドプラ
イマーの伸長によりＤＮＡ第二鋳型を合成し、これによ
ってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中間体を形成し、（ｉ
ｉｉ）リボヌクレアーゼが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッ
ド中間体よりなるＲＮＡを加水分解し、（ｉｖ）第二の
オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ第二鋳型にハイ
ブリダイズし、（ｖ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
が第二のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型として使
用して、ＤＮＡ第二鋳型の伸長によりプロモーターを合
成し；そして（ｖｉ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
がプロモーターを認識しＤＮＡ第二鋳型を転写し、これ
によってＲＮＡ第一鋳型のコピーを提供する、サイクル
が起こるような条件下で、特定の核酸配列または特定の
核酸配列に相補的な配列よりなるＲＮＡ第一鋳型よりな
るＲＮＡを提供し；そして次に（ｃ）特定の核酸配列の
目的の増幅を達成するのに充分な時間この条件を維持し
て次に、（ｉ）電気化学発光種で標識した、ＲＮＡ第一
鋳型に相補的な少なくとも１つのプローブ配列、（ｉ
ｉ）結合種で標識した、ＲＮＡ第一鋳型に相補的な少な
くとも１つの第二捕獲プローブ配列、（ｉｉｉ）第二プ
ローブ配列に相補的な結合種でコーティングされたビー
ズ、を添加し；そして次に（ｄ）ＲＮＡ第一鋳型へのプ
ローブのハイブリダイゼーションを可能にし、第二捕獲
プローブ上の結合種とビーズ上の相補的結合種とを結合
させてビーズ結合複合体の形成を可能にする温度と緩衝
液の条件を提供し；そして次に（ｅ）電気化学発光種を
使用してビーズ結合複合体を検出する。本発明はさら
に、以下の工程よりなる増幅産物を検出する方法を提供
する：（ａ）増幅産物を生成させる条件下で試料核酸を増幅
し、（ｂ）この増幅産物を、（ｉ）増幅核酸と二価の結合種との三分子複合体と相互
作用するＥＣＬ標識結合種；（ｉｉ）増幅核酸とＥＣＬ標識結合種との三分子複合体
と相互作用する二価の結合種、よりなる２つの結合種と
混合して結合複合体反応物を形成し；（ｃ）結合複合体反応物を、増幅産物、ＥＣＬ標識結合
種、および二価の結合種の三分子複合体の形成を可能に
する条件下でインキュベートし；（ｄ）二価の結合種の残りの結合部位を介して三分子複
合体を固相に捕獲し；そして（ｅ）固相に捕獲されたＥＣＬ標識物を定量する。

【０００７】定義本発明をさらに明確に理解するために、ある一定の用語
を下記のように定義する：“増幅産物”は、酵素反応を
用いてサンプル核酸配列を複数回複写することによって
形成された核酸配列を意味する。“アニーリング”は、
一本鎖核酸を含む溶液の温度が融解温度又は変性温度未
満に低下するときに、相補的一本鎖核酸の間で生ずるハ
イブリッド形成を意味する。“結合種”は他の分子種と
結合することが知られる任意の種を意味し、通常は１対
の種として定義されるが、高級複合体から、すなわち、
結合する３又は４個から形成されることができる：すな
わち、抗体：抗原又はオリゴヌクレオチド：抗体又はオ
リゴヌクレオチド：抗原又はＤＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮ
Ａ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ：Ｄ
ＮＡ又はビオチン−ＤＮＡ：ＤＮＡ−ＥＣＬ標識又はレ
セプター：リガンド又はＤＮＡ結合タンパク質（例え
ば、制限酵素、ｌａｃリプレッサー）。第１ヌクレオ
チド配列に対する“補体”は第１配列とのワトソン−ク
リック型ハイブリッド形成によって対となるような塩基
を含む第２配列であることが周知である。したがって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列５’ＡＴＧＣ３’に対
する補体は５’−ＧＣＡＴ３’であることが周知であ
る。二本鎖ＤＮＡに関して、二本鎖の各々は他方に対し
て相補的として又は相補的対として表される。補体及び
抗補体なる用語も用いることができる。ＲＮＡへの転写
がそれから進行する二本鎖ＤＮＡの鎖の同定に関して、
転写鎖は一般にプラスとして表示され、その補体はマイ
ナスとして表示される（“＋”又は“−”）、又は転写
鎖は一般にセンス鎖として表示され、その補体はアンチ
センスとして表示される。相補的な全ての塩基対を有す
る他方に対してそれぞれハイブリッド形成した２鎖は相
互に１００％相補的である。５％の非相補的塩基を有す
るそれぞれ他方にハイブリッド形成した２鎖は、９５％
の相補的である（又は、２鎖は９５％相補性を有す
る）。さらに、核酸配列が、三本鎖ハイブリッド内で特
定の形式で相互に相補的と考えられる３鎖の特定相互作
用に基づく三本鎖ヘリックス構造を形成しうることも理
解されるであろう。“検出”又は“定量”なる用語は
“測定”と呼ばれ、定量が基準組成物の用意と、較正と
を必要とすることは理解されるであろう。“電気化学的
発光（ＥＣＬ）種”は、電気化学的発光することが知ら
れる、任意の化合物を意味する。

【０００８】“電気化学的発光（ＥＣＬ）標識”は、電
気化学的に作用されたときに発光種になる標識である。
電気化学的発光方法は化学的発光方法の改良である。こ
れらの方法は問題の分析物の存在及び濃度を高感度でか
つ正確に測定する。このような方法では、発光を誘発す
るために、サンプルをボルタンメトリック作用電極に暴
露させる。標識によって生じた光が測定され、分析物の
存在又は濃度を表示する。このようなＥＣＬ方法はＢａ
ｒｄ等の“発光性金属キレート標識と検出方法”なる名
称のＰＣＴ出願Ｎｏ．ＵＳ８５／０２１５３と；Ｍａｓ
ｓｅｙ等の“電気化学的発光分析”なる名称のＰＣＴ出
願Ｎｏ．ＵＳ８７／００９８７と；“電気化学的発光成
分とそれらの利用方法”なる名称のＰＣＴ出願Ｎｏ．Ｕ
Ｓ８８／０３９４７、公報Ｎｏ．ＷＯ８９／０４３０２
と；Ｈａｌｌ等の“電気化学的発光測定を実施するため
の方法及び装置”なる名称の米国特許出願Ｎｏ．７４
４，８９０（１９９１年８月１４日出願）と；Ｚｏｓｋ
ｉとＷｏｏｄｗａｒｄの，“電気化学的発光現象の測定
の実施装置”なる名称のＰＣＴＮｏ．ＵＳ８９／０４８
５４（同時係属ＥＰＯ出願Ｎｏ．８９／９１２９１３．
４、公報Ｎｏ．０４４１８８０に対応）に開示される。
ＥＣＬタグ（tag）の例はタグＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ
ースクシンイミド）及びタグホスホラミジットである。
タグＮＨＳエステルは、ＮＨＳエステルと反応してアミ
ド結合を形成することができる遊離アミノ基を含む物質
を標識するために有用である（例えば、ＷＯ８６／０２
７３４を参照）。タグホスホラミジット（本明細書に援
用される、Ｇｕｄｉｂａｎｄｅ等の“ＤＮＡプローブ分
析のための改良された電気化学的発光標識”なる名称の
米国特許出願Ｎｏ．８０５，５３７ｆ）は、ホスホール
結合、特にホスホジエステル結合を形成する遊離アミノ
基、スルフヒドリル基又はヒドロキシル基を含む物質を
標識するために有用である。

【０００９】“ＥＣＬ分析緩衝液”は、ＥＣＬ分析器の
電極における電気化学的反応のために必要であるトリプ
ロピルアミンを含む、一般的な希釈剤である。“ＥＣＬ
希釈剤”は、貯蔵のために不安定なバイオ分子（biomol
ecule）を含む溶液の希釈に用いられる希釈剤試薬であ
る。“ＥＣＬ装置”は電気化学的発光に基づく分析を実
施するための任意の装置である。このようなＥＣＬ装置
はＢａｒｄ等の“発光性金属キレート標識と検出手段”
なる名称のＰＣＴ出願Ｎｏ．ＵＳ８５／０２１５３と；
Ｍａｓｓｅｙ等の“電気化学的発光分析”なる名称のＰ
ＣＴ出願Ｎｏ．ＵＳ８７／００９８７と；“電気化学的
発光成分とそれらの利用方法”なる名称のＰＣＴ出願Ｎ
ｏ．ＵＳ８８／０３９４７、公報Ｎｏ．ＷＯ８９／０４
３０２と；Ｈａｌｌ等の“電気化学的発光測定を実施す
るための方法及び装置”なる名称の米国特許出願Ｎｏ．
７４４，８９０と；Ｚｏｓｋｉ，Ｇ．とＳ．Ｗｏｏｄｗ
ａｒｄの，“電気化学的発光現象の測定の実施装置”な
る名称のＰＣＴＮｏ．ＵＳ８９／０４８５４（同時係属
ＥＰＯ出願Ｎｏ．８９／９１２９１３．４、公報Ｎｏ．
０４４１８８０に対応）に開示される。ポリヌクレオチ
ド配列間の“相同”は、各配列間の配列類似度を意味す
る。配列が同じである２鎖は１００％配列相同を有す
る。配列が５％異なる２鎖は９５％配列相同を有する。
２鎖ＡとＢの間の相同度が大きければ大きいほど、Ａ
と、Ｂの補体との間の相補度は大きくなる。“ハイブリ
ッド形成”は相補的一本鎖核酸からの二本鎖核酸の形成
を意味する。ハイブリッド形成は、充分に相補的な一本
鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの間で行われて、ＤＮＡ：Ｄ
ＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、又はＲＮＡ：ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ：ＲＮＡ：ＤＮＡ又はビオチン−ＤＮＡ：ＲＮＡ：Ｄ
ＮＡ−ＥＣＬ標識を形成する。これはまた、例えばホス
ホネート、ホスホロチオエート、アルキル又はアリール
ホスホネートに基づく核酸配列のような修飾天然化学を
用いて結合されるヌクレオチドの配列を含むこともでき
る（Ｍｕｒａｋａｍｉ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２４（１９８５）：４０４１〜４０４６，Ｇｌｅｎｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ヴァージニア州，スターリング）。
“標識”又は“標識した”なる用語は、核酸に適用する
場合に、問題の核酸がＥＣＬと発光、化学物質を同定す
る分析、放射能又は特異的結合性を含むことができる、
その性質によって検出可能である部分に結合することを
意味する。したがって、“標識”なる用語は、他に特に
指示しないかぎり、リガンド部分を含む。

【００１０】“核酸”なる用語が、本明細書に述べるよ
うな修飾塩基を含む又は含まない、ＤＮＡ又はＲＮＡ、
染色体又はそのフラグメントを含む、任意の長さのポリ
ヌクレオチドを意味することも、技術上周知である。
“ヌクレオチド”は、ホスフェートに加えた、糖（ＤＮ
Ａに対してはデオキシリボース、ＲＮＡに対してはリボ
ース）に加えて、下記塩基：アデニン、シトシン、グア
ニン、チミン又はウラシルの少なくとも１つを有するも
のである。ＤＮＡ重合反応のモノマーを用意するため
に、典型的に全体で４個のデオキシヌクレオチドトリホ
スフェートが必要である。本明細書で定義するヌクレオ
チドは、鋳型に対するポリメラーゼの作用を改良するた
めに用いられる、例えば５−メチル−ｄＣＴＰ及び７−
デアザ−ｄＧＴＰのような修飾塩基を含むこともでき
る。本明細書で用いるヌクレオチドなる用語は、ビオチ
ン及びジゴキシゲニンに結合した塩基（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ（インジアナ州，インジアナポリス）からのジゴ
キシゲニン−１１−ＵＴＰ）と、ビオチン−２１−ＵＴ
Ｐ及びアミノー７−ｄＵＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カル
フォルニア州，パロアルト）と、ＥＣＬ標識ヌクレオチ
ド（図６と７参照）をも含み、これらはプライマー又は
プライマー伸長生成物に増幅中に直接組み込まれて、増
幅配列に選択的に結合する。“オリゴヌクレオチド”は
少なくとも２個のヌクレオチドから形成される配列であ
る。“ポリヌクレオチド”は長いオリゴヌクレオチドで
あり、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであることができ
る。オリゴヌクレオチドなる用語は一般に、小さい核酸
鎖を表示するために当該技術分野で用いられ、“ポリヌ
クレオチド”なる用語は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
染色体又はそのフラグメントを含めて、大きい核酸鎖を
表示するために当該技術分野で用いられるが、本明細書
におけるいずれの用語の使用も、故意に表示しないかぎ
り、サイズの限定又は説明はない。

【００１１】“プライマー”は、問題の配列の一部に相
補的であるオリゴヌクレオチドの比較的短いセグメント
である（問題の配列とは、大きい核酸配列内のサブフラ
グメントでありうる）。プライマーは得られる伸長生成
物の５’末端を表す。鋳型鎖上の問題の配列に対してそ
の３’末端において相補的であるプライマーは、この
３’末端を鋳型へのハイブリッド形成時にポリメラーゼ
によって作用させることができる。３’末端に対する修
飾がオリゴヌクレオチドのプライマーとして機能する能
力に影響を与えることは周知である。１例はＤＮＡ配列
決定における、したがってＤＮＡポリメラーゼの作用を
妨害するジデオキシヌクレオチドの組み入れである。プ
ライマー長さが特定の用途に依存するが、２０〜３０塩
基対が通常の長さであることは周知である。また、周知
であるように、ハイブリッド形成の上首尾な実施のため
にプライマーが完全に相補的である必要はない。プライ
マーが不完全に相補的である場合には、プライマー配列
を組み入れた伸長生成物が得られ、後のサイクル中にプ
ライマー配列に対する相補性が鋳型配列中に組み入れら
れる。したがって、鋳型の補体の配列とは異なる配列を
有する、適当に選択されたプライマーを用いて、インビ
トロで突然変異を誘発させることができることが周知で
ある。プライマーは、上記で定義したような、任意の周
知の修飾又は標識塩基を含めて、技術上周知の任意の核
酸塩基を組み入れることができるので、プライマー伸長
生成物はこれらの特徴を組み入れて、プライマー伸長生
成物の分離及び検出を可能にすることができる。プライ
マーに有利に結合するタグ又はマーカーには、ＥＣＬ、
蛍光又は発光タグ、同位体（例えば、放射性同位体又は
磁気共鳴）標識、色素マーカー、酵素マーカー、抗体に
よって検出可能な抗原決定基、又は例えばストレプトア
ビジン被覆ビーズのような、他のインジケータ部分をプ
ライマー若しくはプライマーを組み込む核酸配列に特異
的に結合させることができる結合部分（例えば、ビオチ
ン）がある。標識した又はタグ付き増幅生成物が形成さ
れるときに、この増幅生成物をタグ又は標識の特徴性に
よって検出することができる。“プライマー伸長生成
物”なる用語は、プライマーの伸長中に得られる、鋳型
の補体と共に、プライマー配列を意味する。“プロー
ブ”は問題の標的核酸配列に相補的な配列を有し、プロ
ーブ−標的二本鎖（duplex）の検出を可能にする付加的
特徴を有する、一本鎖又は二本鎖核酸である。プローブ
及び／又は核酸が二本鎖であるならば、ハイブリッド形
成が起こりうる前に、二本鎖核酸が鎖分離を受けなけれ
ばならないことを、当業者は理解するであろう。三本鎖
形成を用いる場合には、二本鎖標的をハイブリッド形成
前に一本鎖にする必要がないことは考えられる。

【００１２】プローブは付着したタグ又はマーカーによ
って検出可能になる。プローブに結合するタグ又はマー
カーには、蛍光、ＥＣＬ又は発光タグ、同位体（例え
ば、放射性同位体又は磁気共鳴）標識、色素マーカー、
酵素マーカー、抗体によって検出可能な抗原決定基、又
は例えばストレプトアビジン被覆ビーズのような、他の
インジケータ部分をプライマー若しくはプライマーを組
み込む核酸配列に特異的に結合させることができる結合
部分（例えば、ビオチン）がある。標識した又はタグ付
きプローブ−標的二本鎖が形成されるときに、この二本
鎖（duplex）をタグ又は標識の特徴性によって検出する
ことができる。或いは、以下の実施例においてＥＣＬ分
析に関して述べるように、その結合部分を有するプロー
ブはハイブリッド形成及び二本鎖形成を介して標識標的
の捕獲を可能にし、標識又は他の技術上周知手段による
検出を可能にする。“サンプル”は核酸を含む混合物を
意味する。“配列”（例えば、配列、遺伝子配列、ポリ
ヌクレオチド配列、核酸配列）はポリヌクレオチド鎖
（例えば、５’及び３’方向から読み取る）中に存在す
る実際に数えられる塩基（例えば、リボース又はデオキ
シリボース）と、これらの塩基の相互に関する相対的な
位置とを意味する。“一本鎖プライマー（single prime
r）”は、問題の標的核酸配列と選択的にハイブリッド
形成するように設計された、一本鎖の非対合特異的又は
選択されたプライマーを意味する。“特異的（特定の）
核酸配列”は、プローブとして用いることができる又は
増幅することができる一本鎖又は二本鎖核酸を意味す
る。“特異的（特定の）又は選択された”核酸配列は、
他の差異（difference）配列から識別可能な（すなわ
ち、ハイブリッド形成分析によって）特定の配列を意味
する（例えば、特異的ヌクレオチド配列５’−ＡＴＧＣ
ＣＣ−３’は５’−ＡＡＧＣＣＣ−３’と同じ配列では
ない）。

【００１３】特異的又は選択されたプライマーは、プラ
イマーを鋳型配列の３’末端に相補的にする又はほぼ相
補的にすることによって所望の結果を得るために、特定
の鋳型配列とハイブリッド形成するように設計されたプ
ライマーである。特異的プライマーは、標的鋳型配列が
多くの他の核酸配列の混合物中に存在するとしても、選
択的に所望の結果を得ることができる。特異的又は選択
されたプライマーは、相補的（プライマーに対して）ア
ダプター末端配列が結合した任意にＤＮＡ配列に無差別
にアニールする“ユニバーサル（universal）プライマ
ー”とは区別される。ユニバーサルプライマーに関して
は、存在する全ての核酸配列へのアダプターのランダム
な結合を避けるために、問題の核酸を単離させるか、又
は問題の所望のＤＮＡ配列のみに連結操作を導くように
注意しなければならない。“鎖（strand）”は一本鎖核
酸配列である。したがって、二本鎖染色体、染色体フラ
グメント又は他の核酸配列は相補的な一本鎖に分離する
ことができる。“鎖分離”は二本鎖核酸の２本の相補的
な一本鎖ポリヌクレオチドへの転化を意味する。この分
離プロセスは酵素仲介分離（例えば、酵素ヘリカーゼに
よる）、物理−化学的分離（ｐＨ、イオン濃度等）、熱
変性としても知られる熱分離を含めた周知方法を用いる
ことができる。熱変性（“融解”とも呼ばれる）は、ポ
リヌクレオチドを保有する溶液の温度を上げることによ
る、二本鎖ポリヌクレオチド（完全に又は部分的に二本
鎖）を少なくとも２本の一本鎖ポリヌクレオチドに分離
することである。“充分に相補的”とは、２種の核酸が
特異的に相互作用することができ、ＤＮＡのプライマー
依存性及び鋳型指向性合成又は核酸配列へのプローブ結
合を可能にすることを意味する。“鋳型”は、それによ
って相補的コピーが合成される、核酸の任意の配列であ
る。これは一般にＤＮＡからのＤＮＡ複製、ＤＮＡから
のＲＮＡ転写又はＲＮＡからのＤＮＡ逆転写であること
ができる。ＤＮＡ鋳型はＤＮＡポリメラーゼ反応による
相補的プライマー伸長に関する配列情報を与える。ＲＮ
Ａ鋳型は逆転写酵素によって触媒されるアナロガス（an
alogous）反応による相補的ＤＮＡプライマーの伸長に
関する配列情報を与える。技術上周知であるように、鋳
型は一本鎖形又は二本鎖形のいずれでも存在しうる。鋳
型が二本鎖形で増幅プロセスに加わるならば、鋳型鎖は
それが第１熱変性サイクルによって変性するまで、その
相補的プライマーとハイブリッド形成しない。鋳型が既
に一本鎖形で増幅プロセスに加わるならば、プライマー
はその相補的鋳型と、第１熱変性工程の前に、ハイブリ
ッド形成する（熱サイクリングを用いる場合にはアニー
リングと表現される）。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、特定の核酸配列を増幅
する方法及びその迅速な検出並びに定量に関する。この
増幅は、ＤＮＡ及びＲＮＡについての交互合成を含む。
かかる方法では、一本鎖アンチセンス（−）ＲＮＡを一
本鎖ＤＮＡに変換し、引続いて二本鎖ＤＮＡに変換し、
オリジナルの一本鎖ＲＮＡの複数のコピーを合成するた
めの機能的な鋳型（テンプレート）となる。第一及び第
二のプライマーが増幅工程で用いられる。第一のプライ
マー又は第二のプライマーの配列は、特定の核酸の配列
中の一つの配列に対して十分に相補的であり、また第一
のプライマー又は第二のプライマーの配列は、特定の核
酸の配列中の一つの配列に対して十分に相同性である。
特定の核酸配列が二本鎖の場合には、プライマーは相補
的で且つ相同性である。増幅される特定の配列の検出
は、増幅生成物ＤＮＡあるいはＲＮＡとハイブリダイズ
するプローブ配列を使用することによって達成される。
これらのプローブ配列は、特定の核酸配列中の一つの配
列に対して一般的に十分に相補的であり、従って、その
結果、特定のハイブリッドが形成される。次いで、これ
らのハイブリッドは、ＥＣＬ検出装置を使用することに
よって検出され、この装置では電極表面において制御さ
れた方法でＥＣＬラベルが光を産生し、それによって検
出及び定量が可能となる（図１、２、３、４、５及び
６）。これらの増幅生成物のアッセイは、多くのフォー
マットを使用して可能となる。好ましい方法では、増幅
後に二つのプローブ分子が使用され、一つのプローブは
結合種（ビオチン、ジゴキシン、フルオレセインなど）
でラベル化され、他のプローブはＥＣＬラベル（Ｒｕキ
レート、Ｏｓキレート、Ｒｅ、Ｒｈなど）でラベル化さ
れる。これらのプローブは、オリジナルの一本鎖ＲＮＡ
又はＤＮＡの複数のＲＮＡコピーを産生する増幅反応後
のサンプルに添加される。これらのプローブは、オリジ
ナルの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡの複数のＲＮＡコピーに
対して相補的であり、又は十分に相補的である。プロー
ブと増幅された核酸の混合物は、オリジナルの一本鎖Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡの複数のＲＮＡコピー及び特定のプロ
ーブに対して選択された温度並びに緩衝液成分のコント
ロール下で、当業者に知られた方法を用いて、ハイブリ
ダイズする。これらのハイブリッドの形成により、両者
のプローブは同じハイブリッド複合体中において結合さ
れる。次いで、これらは、マグネチックビーズの添加に
より、インキュベーション系から捕獲される。マグネチ
ックビーズは、捕獲されるプローブ上の結合種に結合す
る結合種によって被覆されている（図１）。例えば、プ
ローブ上にビオチンが結合されている場合には、ストレ
プトアビジン又はアビジンがマグネチックビーズ上に被
覆され、プローブ上にジゴキシゲニンが結合されている
場合には、ジゴキシゲニンに対する抗体がビーズ上に被
覆される。次いで、ハイブリッド複合体とビーズの混合
物は、結合種間の結合相互作用を促進するような公知の
条件下でインキュベートされる。結合種同志の結合条件
は、当業者に周知であり、例えばビオチンとストレプト
アビジン、及び抗原と抗体の相互作用については周知で
ある。

【００１５】ハイブリッド複合体をマグネチックビーズ
上に捕獲後は、サンプルは、サンプルチューブに極めて
接近して用いられているマグネットによるビーズの捕獲
によって洗浄することができ、あるいはより理想的に
は、サンプルを直接ＥＣＬ装置に導入してサンプル化
し、そこでマグネチックビーズとその結合複合体が捕獲
され、次いで、表面に結合したＥＣＬ標識（ラベル）の
電気化学反応に付すこともできる。この電気化学反応か
ら産生される光は、測定されて、ビーズとの複合体を形
成したＥＣＬラベル量の決定に使用される。ある条件下
でビーズに結合したＥＣＬラベルの相対量を決定するこ
とによって、増幅されて産生されたオリジナルの一本鎖
ＲＮＡ又はＤＮＡの複数のＲＮＡコピーの量を決定する
ことができる。特定のＤＮＡ又はＲＮＡの増幅レベルに
関するこの情報によって、サンプルＤＮＡ又はＲＮＡに
ついて特定のＤＮＡ又はＲＮＡの存在を診断することに
より、サンプル中の遺伝子あるいは生物の存在を決定す
ることができる。上記した方法とは別の方法として、上
記したと同様にしてハイブリッド複合体を形成すること
ができ、但しプローブオリゴヌクレオチドに直接結合し
たＥＣＬラベルなしで該ハイブリッド複合体を形成でき
る結合種でラベル化した２つのオリゴヌクレオチドを使
用することができる。かかる別のフォーマットでは、ハ
イブリッド複合体のためにハイブリダイズする前か、あ
るいは結合ペアー複合体形成後のいずれかに、ＥＣＬラ
ベルをハイブリッド複合体に連結する。このようなシス
テムの例としては、ジゴキシン（結合種又は抗原）でラ
ベル化されたプローブと、ビオチン（結合種）でラベル
化されたプローブの使用が挙げられる。これら２つのプ
ローブは、増幅工程で産生されたオリジナルの一本鎖Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡの複数のＲＮＡコピーとのハイブリッド
複合体を公知の条件下で形成する。かかるハイブリッド
複合体を形成後、ＥＣＬラベル化抗ジゴキシン抗体（結
合種又は特定抗体に対して相補性）及びストレプトアビ
ジン（結合種に対して相補性）で被覆したマグネチック
ビーズを、結合相互作用を形成する公知の条件下で（ｐ
Ｈ４．９，１ｍＭ−２Ｍ塩、０−１０％洗浄剤）、添加
することにより、抗体への抗原の結合によりＥＣＬラベ
ルのハイブリッド複合体への結合が生じる。また、スト
レプトアビジンのビオチンへの結合相互作用により、複
合体はビーズの表面上に捕獲される。次いで、増幅工程
において産生されたオリジナルの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮ
Ａの複数のＲＮＡコピーにハイブリダイズしたプローブ
の得られる大きな複合体を、ＥＣＬアナライザーを使用
することによって分析する。あるいは、ＥＣＬ種でラベ
ル化された特定の複合体の形成は、増幅工程で産生され
たオリジナルの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡの複数のＲＮＡ
コピーにハイブリダイズさせた時に結合種を形成するＥ
ＣＬ種でラベル化されたプローブ配列の使用により達成
される。次いで、このハイブリッド複合体又は結合種
は、マグネチックビーズで被覆された相補性結合種を使
用することによって捕獲される。例えば、ＤＮＡ：ＲＮ
Ａハイブリッドに対する抗体である（図２）。

【００１６】あるいは、増幅は結合種を用いて行うこと
ができ、結合種は、増幅工程で産生された複数のＤＮＡ
及び／又はＲＮＡ分子に取り込まれる。かかる方法は、
当業者に周知である。かかる例としては、結合種を含む
ように修正されたプライマー（プライマー２、Ｕ．Ｓ．
ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，１３０，２３８）を使用する
ことが挙げられ、かかるプライマーは、ＲＮＡ種とプラ
イマー２に対するＲＴの作用により、ＤＮＡ＋鎖に取り
込まれる。ＤＮＡ＋生成物は、結合種分子に共有結合し
たＤＮＡ＋種である。次いで、このＤＮＡ結合種分子
は、ＥＣＬラベル化プローブにハイブリダイズされ、相
補性結合種を介してビーズ上に捕獲されてＥＣＬ分析に
付される（図４）。同様のフォーマットでは、ＤＮＡ結
合種分子はハイブリダイゼーションによりビーズ上に捕
獲され、次いで、ＥＣＬラベルでラベル化された相補性
結合種により、ＤＮＡ結合種に結合される。結合種の例
としては、ビオチンとその相補性結合種ストレプトアビ
ジンが挙げられる。ＲＮＡ−及びＤＮＡ＋（図１）は、
例えば、ビオチンとジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン−
１１−ＵＰＴ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ，インディアナポリス、インディアナ州）、ビオチン
−２１−ＵＴＰとアミノ−７−ｄＵＴＰ（クローンテッ
ク、パラアルト、カリフォルニア州）、ＥＣＬラベル化
ヌクレオチド（図７）などの結合種を増幅反応に導入す
るように修正された前記した如きヌクレオチドの取り込
みによって、結合種でラベル化できることが理解される
であろう。次いで、ＤＮＡ＋及び／又はＲＮＡ−結合種
分子は、上記したアッセイフォーマットに使用できる
（図３）。これらのアッセイに使用されるビーズは、典
型的には、ストレプトアビジンで被覆されたＤｙｎａｌ
Ｍ４５０、Ｍ２８０などであるが、常磁性で０．５μ
ｍから１０μｍの範囲のサイズであれば他のビーズも使
用することができる。捕獲されたオリゴヌクレオチド
は、結合種のための必要事項を省略できるこれらのビー
ズに結合することができる（図５）。一般的に本発明を
記載したが、以下の例を説明のために含める。しかし、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。

【００１７】

【実施例】例１：オリゴヌクレオチドの合成および標識オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルホスホラミダ
イト化学［Beaucage &Caruthers 22 Tetrahedron Lett.
1859-62(1982)］を用い、Applied Biosystems（San Jo
se, California）自動化オリゴヌクレオチドシンセサイ
ザーによって作製した。5'末端に対するオリゴヌクレオ
チドアミノ修飾は最終カップリング工程で起こった。ア
ミノ修飾剤はClontech（San Diego, California）から
供給された（米国特許第５，１４１，８１３号参照）。
得られた5'修飾オリゴヌクレオチドはすべてアミノ基に
６炭素スペーサーアームを含有し、（Ｃ6,ＮＨ2）で示
す。合成オリゴヌクレオチドは、すべて、BIOGEL^TMP6
（Bio-Rad Labs, Richmond,California）カラム上ゲル
ろ過によって精製して夾雑するアミノ基を除去した。ビ
オチンはＮＨＳ−ビオチン（Clontech San Diego, Cali
fornia）を用いてオリゴヌクレオチドの 5'-アミノ基を
介して導入した。ｔａｇ−ＮＨＳエステル標識（Ruトリ
スビピリジル複合体のＮＨＳエステル）は修飾されたオ
リゴヌクレオチドのアミノ基を介して以下のように導入
された。100 μl のＰＢＳ（ｐＨ 7.4）中オリゴヌクレ
オチド（0.1 μmole）を、ＤＭＳＯ中に溶解したｔａｇ
−ＮＨＳエステル標識 0.5μmoleと、一夜、室温暗所で
反応させた。オリゴヌクレオチドはエタノール沈殿によ
ってこれらの標識反応混合物から回収した。オリゴヌク
レオチドに対する修飾および標識は以下のように指示す
る。ビオチン：リンカー：「オリゴヌクレオチド」は
5'-アミノ基で修飾し、ついでビオチンＮＨＳ試薬と反
応させて 5'-ビオチン化オリゴヌクレオチドを生成させ
たオリゴヌクレオチドを示す。また、Ｒ：リンカー：
「オリゴヌクレオチド」は 5'-アミノ基で修飾し、つい
でルテニウムトリスビピリジンＮＨＳ試薬と反応させて
5'-ルテニウムキレートオリゴヌクレオチドを生成させ
たオリゴヌクレオチドを示す。また、「オリゴヌクレオ
チド」：リンカー：Ｒは 3'-アミノ基で修飾し、ついで
ルテニウムトリスビピリジンＮＨＳ試薬と反応させて
3'-ルテニウムキレートオリゴヌクレオチドを生成させ
たオリゴヌクレオチドを示す。

【００１８】Ｐｏｌ２アッセイのプローブは次の通りと
した。 OT1, TTAAATTTTCCCATTAGCCCTATTGAGACT HIV1 Genbank;
HIV BH102 #1900-1929 および OT2, AGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACT HIV1 Genbank;
HIV BH102 #1869-1898。これらには以下の修飾を行った。 5OT1, ビオチン：リンカー：TTAAATTTTCCCATTAGCCCTATT
GAGACT 35OT1, Ｒ：リンカー：TTAAATTTTCCCATTAGCCCTATTGAGA
CT：リンカー：Ｒ 5OT2, ビオチン：リンカー：AGAAATCTGTTGACTCAGATTGGT
TGCACT 35OT2, Ｒ：リンカー：AGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCA
CT：リンカー：Ｒ増幅は J.Vir.Methods 35 (1991): 273 の記載の通りと
した。Ｇａｇ３アッセイのプローブは次のようにした。ＨＩＶ１ｇａｇ遺伝子の分析用配列、 Genbank HIVBH102 #1139-1167 AKZO1 TA GAA GAA ATG ATG ACA GCA TGT CAG GGA（29塩
基） HIVBH102 #1208-1236 AKZO2 CA ATG AGC CAA GTA ACA AAT ACA GCT ACC（29塩
基）は以下のｇａｇ３アッセイのために AKZO1,ビオチン：リンカー：TA GAA GAA ATG ATG ACA G
CA TGT CAG GGA（29塩基）および AKZO2,Ｒ：リンカー：CA ATG AGC CAA GTA ACA AAT ACA
GCT ACC：リンカー：Ｒ（29塩基）として作製した。増
幅は Van Gemenら、43 J.Vir.Methods 177-187(1993)の
記載に従って実施した。定量的ｇａｇアッセイのための他のプローブは以下の通
りとした。プローブＡ：TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG AGG A （25
塩基）genbank ref.HIVBH102 #710-734 。プローブＢ：GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTG CAT G
（29塩基）genbank ref.HIVBH102 #742-769 。プローブＣ：GAC AGT GTA GAT AGA TGA CAG TCG （24塩
基）, Van Gemen ら、J.Vir.Methods (1993)に記載の定
量のための対照配列。これらのプローブＡ，ＢおよびＣの使用は次のように行
うことができる。Ａを捕獲、Ｂ，Ｃを検出に使用する
か、またはＢ，Ｃを捕獲、Ａを検出に使用する。必要な
プローブを発生させるためには、以下の配列にビオチン
（結合種）およびルテニウムトリビピリジン複合体（Ｅ
ＣＬ標識）の導入を行った。プローブＡは、 AKZO-A2,Ｒ：リンカー：TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG
AGG A ：リンカー：Ｒおよび AKZO-A1, ビオチン：リン
カー：TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG AGG とした。プローブＢは、 AKZO-B2,Ｒ：リンカー：GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA
GTG CAT G ：リンカー：Ｒおよび AKZO-B1, ビオチン：
リンカー：GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTGCAT G と
した。プローブＣは、 AKZO-C2,Ｒ：リンカー：GAC AGT GTA GAT AGA TGA CAG
TCG ：リンカー：Ｒおよび AKZO-C1, ビオチン：リンカ
ー：GAC AGT GTA GAT AGA TGA CAG TCG とした。この場合Ｒはオリゴヌクレオチド上のアミノ基に反応さ
せたルテニウムトリスビピリジンＮ−ヒドロキシスクシ
ンアミドエステルである。アミノ基は合成時に導入され
た。

【００１９】例２：ストレプトアビジン磁性ビーズの調
製 15mgのＢＳＡ（２〜３mlのＰＢＳ中）に、50 mg/mlのビ
オチン−ｘ−ＮＨＳ（Clontech San Diego, Californi
a）を含有する105 μｌのジメチルスルホキシドを加
え、ついで室温で30分間混合してインキュベートした。
30μｌの１Ｍグリシンを添加して反応を停止させ、室温
で10分間インキュベートした。反応混合物をゲルろ過ク
ロマトグラフィー（Bio-Gel P6, Bio-Rad Labs, Richmo
nd, California）によって精製した。このビオチン−Ｂ
ＳＡは0.2 μｍフィルターおよびシリンジを用いてろ過
した。10mlの0.2 Ｍ炭酸／重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
906 中５mgのビオチン−ＢＳＡを300mg の DYNABEADS^TM
（DYNAL No.14002）に加えた（DYNABEADS はDYNAL, Gre
at Neck, New York の商標である）。ビーズは（ｉ）
Dynal M-450 Dynabeads, 4.5μm 径の超常磁性粒子、30
mg/ml，Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck,
New York 11021 より入手；または（ｉｉ）Dynal M-28
0 Dynabeads, 2.8μm 径の超常磁性粒子、10 mg/ml，Dy
nal, 45 North Station Plaza, Great Neck, New York
11021より入手のいずれかからなり、炭酸塩／重炭酸塩
で洗浄した。この混合物をボルテックス攪拌し、一夜室
温で混合しながらインキュベートした。ビーズを磁性に
より分離し、ついで10 mlのＥＣＬ希釈液（Ｈ₂Ｏ中 37.
5 ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，109.2ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄３Ｈ₂Ｏ，
151.7 ｍＭＣａＣｌ，0.65ｍＭＮａＮ₃，0.43ｍＭ
ウシ血清アルブミン）および 100μl のｔＲＮＡ（10 m
g/ml）を添加した。この混合物を混合しながら室温で３
〜４時間インキュベートした。ビーズを10mlのＥＣＬ希
釈液で１回洗浄し、10mlのＥＣＬ希釈液および100 μl
のｔＲＮＡ（10 mg/ml）に再懸濁した。この混合物を混
合し、一夜２〜６℃でインキュベートしてビーズ上のタ
ンパク質を安定化させた。ビーズを磁性によって分離
し、次に15mgのストレプトアビジン（Scripps Laborato
ries, San Diego, California, カタログ番号 S1214）
を含有するリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）10 ml 中に懸
濁し、ついで１時間混合した。ビーズを10mlのＥＣＬ希
釈液により４回、各回５分間混合して洗浄した。最後
に、ビーズを29.7mlのＥＣＬ希釈液ならびに 300μl の
ｔＲＮＡ（10mg/ml）に、最終濃度が 10 mg/ml 粒子＋1
00 μg/ml ｔＲＮＡになるように再懸濁した。

【００２０】例３：Ｐｏｌ２アッセイプローブ溶液Ｉ：50回のアッセイ用に 50μl の 35OT1（ＥＣＬオリゴ，１μg/ml） 50μl の 5OT2 （ビオチン標識オリゴヌクレオチド，２
μg/ml）を配合した。増幅はプライマー OT188およびOT42を用
い、J.Vir.Methods 35(1991): 273 に記載の方法に従っ
て行った。サンプルは２つの方法のいずれかによって調
製した。Ａ）増幅からのサンプル４μl に、0.1 ％ＳＤＳ，20ｍ
ＭＥＤＴＡを含有するＡＫＺＯ緩衝液16μl を加え、
95℃に５分間加熱する。Ｂ）サンプル20μl に 1.25 ％ＳＤＳ，240 ｍＭＥＤ
ＴＡ 1.8μl を加え、95℃に５分間加熱する。アッセイチューブ中で以下を混合する。５μl のプロー
ブ溶液Ｉおよび５μlの上記サンプル。これらのサンプ
ルを50℃で30分間インキュベートしついで５μl のビー
ズ（20μg Dynal 450 ）を加えて60分間混合した。この
混合物に485μlのＥＣＬアッセイ緩衝液を加え、サンプ
ルをＥＣＬアナライザーでアッセイした。試験を行った
サンプルは、' ＮＴ' 鋳型を含まない対照、' Ａ' 10コ
ピーのＨＩＶ１および 'Ｂ' 10,000コピーのＨＩＶ１で
あった。これらは増幅反応液からの１μl アリコートで
あった。結果は以下の通りであった。

【００２１】

【表１】サンプルＥＣＬシグナルバックグランドシグナル 204 ＮＴ 1908 1884 1913 Ａ 1952 1862 1911 Ｂ 175679 179986 167539 これらの結果は、増幅およびＥＣＬによりＨＩＶ１配列
が迅速かつ高感度に検出できることを証明した。

【００２２】例４：ｇａｇ３およびＰｏｌ２アッセイ上述のアッセイ系を改良するために、本発明者らはさら
にプローブおよびビーズを用いて、従来ない範囲でのア
ッセイを提供した。増幅は例３と同様にして取り出し、
ｇａｇ遺伝子については 35 J.Vir.Methods 273(1991)
に記載のプライマー OT83 および OT82 を使用した。プローブ溶液Ｉ：50回のｐｏｌ２アッセイ用に 50μl の 35OT1（ＥＣＬオリゴ，20μg/ml） 50μl の 5OT2 （ビオチン標識オリゴヌクレオチド，20
μg/ml）を配合した。プローブ溶液２：50回のｇａｇ３アッセイ用に 50μl の AKZO2（ＥＣＬオリゴ，20μg/ml） 50μl の AKZO1（ビオチン標識オリゴヌクレオチド，20
μg/ml）を配合した。サンプルは２つの方法のいずれかによって
調製した。Ａ）増幅からのサンプル４μl に 0.1％ＳＤＳ，20ｍＭ
ＥＤＴＡを含有するＡＫＺＯ緩衝液16μl を加え、95
℃に５分間加熱する。Ｂ）サンプル20μl に 1.25 ％ＳＤＳ，240 ｍＭＥＤ
ＴＡ 1.8μl を加え、95℃に５分間加熱する。初期アッ
セイプロトコールではアッセイチューブ中で以下の順序
で混合する。５μl のプローブ５μl のサンプル。 50℃で30分間インキュベートし、ついで10μl （40μg
）のビーズを加えて60分間振盪した。これらのサンプ
ルを 485μl のＥＣＬアッセイ緩衝液で希釈して、ＥＣ
Ｌアナライザーでアッセイした。試験を行ったサンプル
は、'G11', 10¹¹コピーのＨＩＶ１; 'G10', 10¹⁰コピー
のＨＩＶ１; 'G9', 10⁹コピーのＨＩＶ１; 'G8', 10⁸コ
ピーのＨＩＶ１; およびハイブリダイゼーションバック
グランドのための 'ＢＢ' 緩衝液ブランクとした。これ
らは、この数のＲＮＡ分子を含む試験サンプルとしてこ
のアッセイにおいて生成させた純粋なＲＮＡのサンプル
であった。結果は以下の通りであった。

【００２３】

【表２】サンプルＥＣＬシグナルバックグランドシグナル 82 G11 249559 252442 G10 12783 16059 G9 1427 1429 G8 334 330 BB 250 250

【００２４】また、出発ＨＩＶ１配列の10,000コピーを
用い、増幅後のゲル電気泳動に基づいて１μl あたり５
×10¹⁰コピーと推定された増幅反応からのｐｏｌ２サン
プルをアッセイした。このサンプルでは、このサンプル
での新たなアッセイフォーマットの範囲を決定するため
に希釈した。サンプルは、'P10', 5×10¹⁰; 'P9', 5×1
0⁹;'P8', 5 ×10⁸; 'P7', 5×10⁷; 'P6', 5×10⁶,およ
び増幅サンプルを含まないアッセイにおける非特異的結
合の対照である 'ＢＢ' サンプルとした。結果は以下の
通りであった。

【表３】サンプルＥＣＬシグナルバックグランドシグナル 82 P10 58762 62039 P9 4696 4391 P8 677 665 P7 330 319 P6 254 263 BB 250 250 この実験は、この新規なアッセイフォーマットが少なく
とも 3.5 logサンプル濃度にわたって機能可能で、良好
な直線応答を与えることを証明した。

【００２５】例５：ｇａｇ３上述のアッセイ系を改良するために、本発明者らはさら
にプローブおよびビーズを用いて、従来ない範囲でのア
ッセイを提供した。プローブ溶液２：50回のｇａｇ３アッセイ用に 50μl の AKZO2（ＥＣＬオリゴ，20μg/ml） 50μl の AKZO1（ビオチン標識オリゴヌクレオチド，20
μg/ml）を配合した。サンプルは２つの方法のいずれかによって
調製した。Ａ）増幅からのサンプル４μl に 0.1％ＳＤＳ，20ｍＭ
ＥＤＴＡを含有するＡＫＺＯ緩衝液16μl を加え、95
℃に５分間加熱する。Ｂ）サンプル20μl に 1.25 ％ＳＤＳ，240 ｍＭＥＤ
ＴＡ 1.8μl を加え、95℃に５分間加熱する。初期アッセイプロトコール：アッセイチューブ中で以下
の順序に混合する。５μl のプローブ溶液２５μl のサンプル。 50℃で30分間インキュベートし、ついで10μl （40μg
）のビーズを加えて60分間振盪した。これらのサンプ
ルを 485μl のＥＣＬアッセイ緩衝液によって希釈し、
ＥＣＬアナライザーでアッセイを行った。試験を行った
サンプルはｇａｇ３'G6', 10⁶コピーのＨＩＶ１; 'G5',
10⁵コピーのＨＩＶ１; 'G4', 10⁴コピーのＨＩＶ１; '
G3', 10³コピーのＨＩＶ１; 'G2', 10²コピーのＨＩＶ
１; 'G1',10¹コピーのＨＩＶ１; および 'ＮＴ１', 'Ｎ
Ｔ２', 'ＮＴ３' のバックグランドのための鋳型を含ま
ない対照とした。これらのコピー数のサンプルは例４の
ようにして増幅し、増幅された配列の存在について１μ
l を分析した。また、増幅サンプルを含まないアッセイ
における非特異的結合の対照として 'ＢＢ' サンプルを
加えた。結果は以下の通りであった。

【００２６】

【表４】サンプルＥＣＬシグナル G6 55870 56541 G5 57798 58354 G4 66316 59120 G3 74763 71190 G2 75315 69284 G1 301 296 NT1 276 285 NT2 283 295 NT3 312 283 BB 272 289

【００２７】例６：患者の相関試験患者血液のサンプルを分画化し抽出して、増幅用のＲＮ
Ａを得た。例４と同様にした。これにより、全血
（Ｖ）、血小板（Ｔ）、マクロファージ（Ｍ）および血
漿（Ｐ）からのサンプルが得られた。これらのサンプル
を増幅し、これらのサンプルからの増幅のレベルおよび
性質を決定するための特異的プローブを用いてサザンブ
ロット分析に付した。この増幅分析からのサンプルをつ
いで、ＥＣＬ系による分析に付した。さらに、インビト
ロで発生させた標準サンプル、C2, 10²;C3, 10³; C4, 1
0⁴を陽性対照として用いた。プローブ溶液２：50回のｇａｇ３アッセイ用に 50μl の AKZO2（ＥＣＬオリゴ，20μg/ml） 50μl の AKZO1（ビオチン標識オリゴヌクレオチド，20
μg/ml）を配合した。１μl のサンプルを５μl に希釈して 0.1
％ＳＤＳ，20ｍＭＥＤＴＡとし、95℃に５分間加熱し
た。ついで５μl のプローブ溶液を加えた。50℃で30分
間インキュベートし、ついで10μl （40μg ）のビーズ
を加えて60分間振盪した。これらのサンプルを 485μl
のＥＣＬアッセイ緩衝液で希釈し、ＥＣＬアナライザー
でアッセイした。

【表５】ＥＣＬカウント患者番号ＴＭＰＶ 203 100124 316769 154032 581 204 499 227775 52619 310007 205 581 98188 501 75430 206 510 368765 101581 524 207 7990 251266 115186 81173 208 533 254802 81832 288289 C2 66644 C3 138150 C4 146093 C5 125322 NT2 207099 NT3 581 BB 605 605 さらに患者サンプルを分析した。

【００２８】

【表６】ＥＣＬカウント患者番号ＴＭＰＶ 209 648 777 813 670 210 672 261234 142876 162615 211 237886 242394 187486 228249 212 676 796 697 2802 213 699 8004 152223 143648 228 592 173790 609 539 C2 169992 C3 128430 C4 157989 C5 142345 NT 575 NT2 209712 すべてのデータが、夾雑による問題を示す鋳型なしの場
合の問題を含め、増幅サンプルで実施したノーザンブロ
ットハイブリダイゼーション試験と相関した。このアッ
セイにおいて、１μl サンプルよりも希釈後に高い結果
を与えたサンプル204Pにおいてフック効果の証拠が認め
られた。このサンプルは、本アッセイの直線応答の限界
である10¹²より高い値を有したものと考えられる。この
データは、ｇａｇ３アッセイおよびｐｏｌ２アッセイに
分けて血漿単離サンプルについてのアッセイで追跡し
た。また、サンプルを、指示したように全血（Ｖ）およ
びマクロファージ（Ｍ）から調製した。

【００２９】

【表７】ＧＡＧ３アッセイＥＬＣピークシグナルアッセイに用いたサンプル容量 nl サンプル 20 1,000 114 869 602 115 747 674 116 756 646 117 792 770 118 735 709 201V 878 9651 201 943 11149 202V 756 1592 202 722 671 203 21370 196556 204 11450 229730 205 686 686 206 11930 269703 207 13996 151126 208 13217 259667 209 663 585 210 663 608 211 30663 174421 212 684 690 213 21257 227918 228 703 568 NT 869 627 C2 3383 181566 C3 37989 103653 C4 31531 106488 37V 1156 20282 37M 1602 53922 41V 8716 262440 41M 3579 192855 42V 747 863 42M 739 806

【００３０】

【表８】ＰＯＬ２アッセイＥＬＣピークシグナルアッセイに用いたサンプル容量 nl サンプル 20 1,000 203 183 191 204 24301 ＞ 300000 205 236 234 206 217 278 207 190 558 208 16232 ＞ 300000 209 15150 ＞ 300000 210 204 516 211 3493 254728 212 192 335 213 358 7773 228 200 404 NT 221 398 C2 202 404 C3 11893 ＞ 300000 C4 17613 ＞ 300000 この患者データは、前のノーザンブロット分析と相関し
た［Van Gemen ら, 45J.Vir.Methods(1993)］。

【００３１】例７上記アッセイフォーマットに加えて、本発明者らはすべ
ての成分が添加されハイブリダイズされた一連のサンプ
ル、すなわちサンプルおよびビーズを前と同様に50℃で
インキュベートし、この混合物から５〜30分でサンプル
を採取した実験を行った。シグナルは５分の時点で最大
に達し、このアッセイ系のハイブリダイゼーション速度
および融通性が指示された。サンプルは10²および10³導
入鋳型分子からの２つの対照増幅サンプルの混合物で、
これらのサンプルは前の試験で陽性とされたものであっ
た。ＮＴは陰性であったサンプルである。

【表９】サンプル時間（分）ＥＣＬシグナル C2/C3混合物 5.40 39200 16.15 49025 29.25 42960 NT 7.40 863 22.15 1008 ＞30 853

【図面の簡単な説明】

【図１】核酸ハイブリッド形成プロセスの一般的な説明
である。

【図２】代替え核酸ハイブリッド形成プロセスの一般的
な説明である。

【図３】代替え核酸ハイブリッド形成プロセスの一般的
な説明である。

【図４】代替え核酸ハイブリッド形成プロセスの一般的
な説明である。

【図５】代替え核酸ハイブリッド形成プロセスの一般的
な説明である。

【図６】代替え核酸ハイブリッド形成プロセスの一般的
な説明である。

【図７】ＥＣＬ標識ヌクレオチドである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献国際公開93／10267（ＷＯ，Ａ１) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ. 35（1991），ｐ．273−286 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】特定の核酸配列の検出方法であって、以
下の工程からなる方法：（ａ）その特定の核酸配列を含んでいると考えられる
試料を得、（ｂ）試薬混合物に試料を添加して反応混合物を形成
し、この試薬混合物は以下のものを含み；（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉｉ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｖ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｖｉ）一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを加水
分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ
を加水分解するリボヌクレアーゼ、ここで第一又は第二のオリゴヌクレオチドプライマーは
プロモータ又はプロモータのアンチセンス配列を含み、
該プロモータは該ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによ
り認識され、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプライ
マーは任意に結合種又は電気化学発光（ＥＣＬ）種で標
識されるか、又は反応混合物が任意に結合種又はＥＣＬ
種で標識されたヌクレオチドを該結合種又は該ＥＣＬ種
で標識された増幅された標的分子を生成させるのに十分
な量で含むものであり、（ｃ）該特定の核酸配列を増幅して、増幅された核酸配
列を含む増幅された核酸配列混合物を形成するのに十分
な時間反応混合物をインキュベートし、（ｄ）該増幅された核酸配列混合物から試料を得、（ｅ）工程（ｄ）の増幅された核酸配列混合物からの該
試料に、該増幅された核酸配列に相補的な配列を有する
少なくとも一つの第一のプローブを添加し、この時結合種で標識されたプライマー又はヌクレオチド
は工程（ｂ）において存在し、第一のプローブはＥＣＬ
種で標識されているか、又はこの時ＥＣＬ種で標識され
たプライマー又はヌクレオチドは工程（ｂ）において存
在し、第一のプローブは結合種で標識された捕捉プロー
ブであるか、又はこの時工程（ｂ）のプライマー又はヌ
クレオチドはＥＣＬ種又は結合種で標識されてはおら
ず、第一のプローブはＥＣＬ種で標識されており、結合
種で標識された少なくとも一つの捕捉プローブが存在
し、該捕捉プローブは該増幅された核酸配列に相補的な
配列を有しており、そして捕捉プローブに対する結合パ
ートナーで被覆されたビーズを添加して、第二の混合物
を形成し、（ｆ）該第二の混合物を、該プローブと該増幅された
核酸配列との間でハイブリダイゼーションをさせるのに
十分な時間インキュベートして複合体を形成し、該ビー
ズ上での該複合体の捕捉を可能にし、そして（ｇ）該ＥＣＬ種を用いて該ビーズ結合複合体を検出
する。
【請求項２】ビオチニル化された又はＥＣＬ標識され
たヌクレオチドを、それぞれビオチニル化された又はＥ
ＣＬ標識された、増幅された標的分子を生成させるのに
十分な量で工程（ｂ）に添加する、請求の範囲１記載の
方法。
【請求項３】ビオチニル化された又はＥＣＬ標識され
たプライマーで、工程（ｂ）の第一のプライマー又は第
二のプライマーのいずれかを全体として又は部分的に置
き換え、ビオチニル化された又はＥＣＬ標識された、増
幅された標的分子を形成する、請求の範囲１記載の方
法。
【請求項４】前記ＥＣＬ種で標識された前記第一のプ
ローブと前記捕捉プローブが存在し、該捕捉プローブと
該第一のプローブが前記増幅された核酸配列の異なる領
域に結合する、請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】結合種がビオチンであり、結合パートナ
ーがビーズに共有結合されたストレプタビジンである、
請求の範囲１記載の方法。
【請求項６】結合種がビオチンであり、結合パートナ
ーがビーズ上に被覆されたストレプタビジンである、請
求の範囲１記載の方法。
【請求項７】前記ビーズがストレプタビジンビーズで
あり、捕捉プローブが、ストレプタビジン−ビオチン相
互作用を介して結合したプローブとビーズの複合体を形
成するように該ストレプタビジンビーズとプレインキュ
ベートされているビオチン標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブである、請求の範囲１記載の方法。
【請求項８】前記第二のオリゴヌクレオチドプライマ
ーがプロモータのアンチセンス配列を含み、前記インキ
ュベート条件が、（ｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドプライマー
を、特定の核酸配列又は該特定の核酸配列に相補的な配
列を含む第一の鋳型にハイブリダイズさせる条件、（ｉｉ）前記RNA依存性ＤＮＡポリメラーゼに、該第
一のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によりＤＮＡ
第二鋳型を合成し、それによりＲＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ッド中間体を形成するために、前記ＲＮＡ第一鋳型を利
用させる条件、（ｉｉｉ）前記リボヌクレアーゼに、該ＲＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッド中間体に含まれるＲＮＡを加水分解させる
条件、（ｉｖ）前記第二のオリゴヌクレオチドプライマー
を、該ＤＮＡ第二鋳型にハイブリダイズさせる条件、（ｖ）前記ＤNA依存性ＤＮＡポリメラーゼに、該Ｄ
ＮＡ第二鋳型の伸長により該プロモータを合成するため
の鋳型として該第二のオリゴヌクレオチドプライマーを
利用させる条件、及び（ｖｉ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに該プ
ロモータを認識させ、該ＤＮＡ第二鋳型を転写させる条
件である、請求の範囲１記載の方法。
【請求項９】前記第一のオリゴヌクレオチドプライマ
ーがプロモータを含み、前記インキュベート条件が、（ｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドプライマー
を、特定の核酸配列又は該特定の核酸配列に相補的な配
列を含む第一の鋳型にハイブリダイズさせる条件、（ｉｉ）前記RNA依存性ＤＮＡポリメラーゼに、該第
一のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によりＤＮＡ
第二鋳型を合成し、それによりＲＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ッド中間体を形成するために、前記ＲＮＡ第一鋳型を利
用させる条件、（ｉｉｉ）前記リボヌクレアーゼに、該ＲＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッド中間体に含まれるＲＮＡを加水分解させる
条件、（ｉｖ）前記第二のオリゴヌクレオチドプライマー
を、該ＤＮＡ第二鋳型にハイブリダイズさせる条件、（ｖ）前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、該
プロモータを含むＤＮＡ第一鋳型を合成するための鋳型
として該第二のオリゴヌクレオチドプライマーを利用さ
せる条件、及び（ｖｉ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに該プ
ロモータを認識させ、該ＤＮＡ第一鋳型を転写させる条
件である、請求の範囲１記載の方法。
【請求項１０】特定の核酸配列の検出方法であって、（ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二の
オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及び一本鎖又は二本鎖ＲＮ
Ａ又はＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼを
含む繰返しＤＮＡ／ＲＮＡ増幅反応混合物において該特
定の核酸配列を増幅し、それにより増幅された特定のＲ
ＮＡ配列を形成し、そして（ｂ）該増幅された特定のＲＮＡ配列を、ＥＣＬ種で
標識された第一の標識プローブ及び結合種で標識された
第二の捕捉プローブであって、各々該増幅された特定の
ＲＮＡ配列に相補的な配列を有する上記第一の標識プロ
ーブ及び第二の捕捉プローブを使用して検出することを
含む上記検出方法。