JP3494559B2 - フロー式粒子画像解析方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フロー式粒子画像解析
方法及びフロー式粒子画像解析装置に係り、流れている
液体中に懸濁した静止粒子、特に、血液または尿中の細
胞や粒子の画像を撮像し粒子解析する粒子画像解析に関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来の粒子画像解析においては、血液中
の細胞、尿中の細胞及び粒子を分類解析するには、スラ
イドガラス上に標本を作成し顕微鏡にて観察することで
行われてきた。尿の場合には、尿中の粒子濃度が薄いた
め、サンプルを予め遠心分離器で遠心濃縮してから観察
する。

【０００３】これらの観察、検査の作業を自動化する方
法又は装置としては、血液などのサンプル試料をスライ
ドガラス上に塗沫したあと顕微鏡にセットし、顕微鏡ス
テージを自動的に走査し、粒子の存在する位置で顕微鏡
ステージを止めて静止粒子画像を撮影し、画像処理技術
による特徴抽出およびパターン認識手法を用い、サンプ
ル試料中にある粒子の分類・解析等を行っている。

【０００４】しかし、上記手法では標本作成に時間がか
かること、さらに顕微鏡ステージを機械的に移動しなが
ら粒子を見つけ、粒子を適当な画像取り込み領域へ移動
させる作業が必要である。そのため、解析に時間を要し
たり、機械機構が複雑になるという欠点がある。

【０００５】上記のような塗沫標本を作成しない粒子画
像解析方法または粒子画像解析装置には、サンプル試料
を液体中に懸濁させた状態にてフローセル中に流し、光
学的に解析するフローサイトメータ法が知られている。

【０００６】このフローサイトメータによる方法は、サ
ンプル中の各粒子からの蛍光強度や散乱光強度を観測す
るもので、毎秒数千個の処理能力を備えている。

【０００７】しかし、粒子の形態学的特徴を反映する特
徴量を観測することはむずかしく、従来顕微鏡下で行わ
れていた形態学的特徴で粒子を分類することができな
い。

【０００８】連続的に流れているサンプル試料中の静止
粒子画像を撮像し、それぞれの静止粒子画像から粒子を
分類、解析する試みとしては、特表昭５７−５００９９
５号公報、特開昭６３−９４１５６号公報、特開平４−
７２５４４号公報等に記載された技術が知られている。

【０００９】特表昭５７−５００９９５号公報記載の技
術では、サンプル試料を特別な形状の流路に通して幅広
の撮像領域中に流し、フラッシュランプによる静止粒子
画像を撮影し、その画像を用い粒子解析する方法が示さ
れている。

【００１０】上記方法は、顕微鏡を用いてサンプル粒子
の拡大画像をＣＣＤカメラ上に投影するとき、パルス光
源であるフラッシュランプがＣＣＤカメラの動作に同期
して周期的に発光する。

【００１１】パルス光源の発光時間が短いので、粒子が
連続的に流れていても静止画像を得ることができ、しか
も、ＣＣＤカメラは、毎秒３０枚の静止画像を撮影する
ことができる。

【００１２】また、特開昭６３−９４１５６号公報に記
載の技術は、静止粒子画像撮像系とは別にサンプル流れ
中の粒子画像撮影領域より上流に粒子検出系を設けてい
る。つまり、予め、粒子検出系で粒子通過を知り、その
粒子が粒子画像撮像領域に達したときに適当なタイミン
グによりパルス光源であるフラッシュランプを点灯させ
る方法である。

【００１３】この方法においては、パルス光源の発光を
周期的に行わず、粒子の通過を検出してその時だけタイ
ミングを合わせて静止粒子画像を撮像することができる
ので、効率的に静止粒子画像が集められ、濃度の小さい
サンプル試料の場合でも粒子の存在しない無意味な画像
を撮像・処理することはない。

【００１４】さらに、特開平５−２９６９１５号公報で
は、特開昭６３−９４１５６と同じく、静止粒子画像系
とは別にサンプル流れ中の粒子を検出する手段を有し、
加えて検出された粒子画像において画像処理した粒子の
総数からサンプル粒子中の実際の粒子数、分類された種
類ごとの粒子数を求める手段を提供している。

【００１５】また、特開平７−８３８１７号公報では、
上記特開平５−２９６９１５号公報で問題になる、検出
粒子と検出された粒子画像の１対１の対応方法について
示されている。

【００１６】また、特開平８−３４７４８号公報では、
検出粒子と検出された粒子画像の１対１の対応を行うた
めの、粒子検出系の調整段階について述べられている。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】従来の粒子画像解析装
置においては、一般的に、連続的に流れているサンプル
粒子の静止画像を解析して、サンプル中の複数種類の粒
子数や分類を効率よく行うためには、上述した公知例で
行われているように、静止粒子画像撮像領域またはその
上流に通過粒子を検出する粒子検出系を配置することが
必要である。すなわち、サンプル粒子が通過したときだ
けパルス光源を点灯させサンプル粒子の静止画像を撮像
するように構成することが必要である。

【００１８】上述した、通過粒子を検出する粒子検出系
を配置する方法は、粒子濃度の小さい測定サンプルに対
し非常に効率よく処理できるため、測定サンプル量の増
大、解析時間の短縮、解析精度の向上を計ることができ
る。

【００１９】このようなフロー式粒子画像解析装置にお
いては、静止粒子画像撮像領域またはその上流に粒子が
通過したことを検出する粒子検出系と、粒子が通過した
ときだけパルス光源を点灯させ静止粒子画像を撮像する
画像撮像系とを有しているが、上記粒子検出系と上記画
像撮像系とは一般的にその測定原理が異なっている。

【００２０】上記粒子検出系としては、通常フローセル
中を流れている測定サンプルにレーザ光束を集光して照
射し、上記レーザ光束をよぎった粒子からの光散乱光を
検出する方法が用いられている。

【００２１】上記光信号は光検出器により電気信号に変
換される。光信号の大きさは、粒子の光学的な屈折率、
吸収、サイズ、粒子の内部状態、散乱光検出条件などに
より影響を受け、画像処理で用いられる粒子の形態情報
である粒子直径、周囲長、色彩情報、テクスチャ情報と
は必ずしも完全には一致しない。

【００２２】また、上記粒子検出系において、所定の粒
子検出レベル以上を粒子検出の条件とすると、実際の上
記画像撮像系による静止粒子画像には、サイズが小さく
光散乱による粒子検出レベルに達しない粒子が存在する
ことは、しばしば起こることである。

【００２３】その結果、粒子検出系で計数される粒子数
と画像処理された粒子数は、画像取り込みで避けられな
いデットタイムによる粒子数え落としを考慮しても一致
せず、粒子解析精度、再現性の低下を引き起す原因とな
る。

【００２４】これらの問題に正しく対応させる方法を提
供するのが特開平７−８３８１７号公報に記載された技
術である。この特開平７−８３８１７号公報に記載され
た方法は、１つの画像に撮像されている粒子と、粒子検
出系で検出された粒子とについて、１対１の対応関係を
取るものである。

【００２５】このために、粒子検出信号の中から、フラ
ッシュランプ光源が点灯した時点で画像に写っている粒
子のうち、検出粒子に相当する粒子を計数する手段と、
この計数値と画像中の粒子のうち検出粒子と対応させる
こと、および検出粒子と見なされない粒子と区別する手
段を提供する。

【００２６】上述した方法は、粒子検出系と画像撮像系
とをそれぞれ具備し、粒子検出系の原理と画像撮像系の
粒子画像識別の原理とが異なるフロー式粒子画像解析方
法およびフロー式粒子画像解析装置において、検出粒子
と静止粒子画像中の粒子とを対応させ、粒子検出系の検
出粒子以外の粒子が画像撮像系の静止粒子画像中に存在
しても、サンプル中の各種類の粒子個数、粒子存在比
率、粒子密度、濃度情報を正しく知ることができ、解析
精度の良好なフロー式粒子画像解析方法およびフロー式
粒子画像解析装置を提供するものである。

【００２７】しかしながら、上述した特開平７−８３８
１７号公報に記載された方法は、１つの静止画像ごとに
検出粒子との対応をとる方法であるため、作業は比較的
確実に行えるが、処理そのものが複雑になってしまい、
連続して流れてくる粒子の静止画像の処理に時間がかか
る。この静止画像を、高速で処理するためには複雑な回
路構成が必要となってしまう。

【００２８】この問題を軽減する方法としては、特開平
９−７２８４２号公報に示されているように、測定終了
後に一括して、検出粒子と粒子画像粒子の対応をとる方
法がある。

【００２９】つまり、特開平９−７２８４２号公報で
は、粒子検出系で検出された通過全粒子数を使って、予
想される粒子画像数を計算し、画像処理された粒子画像
を大きいサイズからさきに予想した粒子数分だけを、検
出粒子と対応すると見なすものである。

【００３０】この方法は、処理が簡単で時間的な制約が
少ない反面、測定終了まで粒子特徴パラメータを蓄積し
ていかなければならない。また、粒子画像を格納しなけ
ればならない測定対象では、画像メモリーは大きなもの
が必要になる。後者の場合には、この問題を解決するた
めに、１画像分の処理を行う段階で、画像中の粒子のう
ち予め設定した粒子サイズ以下は棄却してしまう処理を
行う。

【００３１】上述した特開平７−８３８１７号公報及び
特開平９−７２８４２号公報に示されている、２つの方
法は、不要粒子画像を捨てることが出来、さらに、画像
撮像系でのデットタイムに起因する粒子画像の数え落と
しが存在しても、正しい粒子の分類比率を求めることが
出来、結果として、正しい粒子密度が得られ、人による
顕微鏡検査と相関が良い分析データが得られる特徴があ
る。

【００３２】しかし、上述した粒子検出系で検出した粒
子と、撮像された粒子画像のうち粒子検出系で検出した
粒子との対応をとるためには、次の問題が存在する。す
なわち、これら２つの方法では、検出粒子と粒子画像と
対応させるための条件として、暗黙のうちに、サンプル
流れの幅が粒子画像撮像系の撮影領域に対して狭いこと
を仮定している。実際の流れの系では、常にこの仮定が
成立させられず、測定条件によって満足させることがで
きない場合が存在する。

【００３３】例えば、次のような事実が考えられる。フ
ローセル制作上での不具合、光学系の調整の問題、周囲
温度の変化によってサンプル流れの幅が大きく変化する
現象がある。また、測定モードが複数存在してサンプル
流れ条件を変えなければならないような場合では、サン
プル流れ形状が変化したり、流れ位置が移動する現象も
起こりうる。

【００３４】このような条件で粒子画像サンプルを処理
する場合には、測定粒子が、画像撮像領域の外側を通過
したり、粒子画像の一部分だけ撮像される現象が起る。
１個の完全な粒子画像が得られない場合には、通常画像
処理の段階で捨てられる。

【００３５】図６に具体的なサンプル流れと粒子画像撮
像視野が一致しない上述した問題が生じている場合の例
を示す。図６では２個の粒子が粒子検出系で検出された
が、視野の外側をながれている粒子は粒子画像が撮像さ
れなかった場合である。

【００３６】この場合、画像処理される粒子数が実際予
想される数より少なくなり、上述した検出系で検出した
粒子と粒子画像の１対１の対応が出来なくなる。結果と
して、粒子分析データの信頼性が低下する。

【００３７】すなわち、サンプル流れ幅が粒子画像撮像
系の視野と一致しない場合では、検出された粒子が、画
像視野の外側を流れる場合が生じ、検出粒子と粒子画像
の正しい対応関係を取ることができない問題が発生す
る。

【００３８】また、測定系に存在する誤差要因、例え
ば、配管系をサンプルが流れてくる段階で管壁の付着し
ている水溶液と置換して、サンプル粒子濃度が小さくな
るなどの系統的な誤差が生じる。

【００３９】本発明の目的は、サンプル流れの状態を定
量化し、装置を最良な状態に維持すると共に、測定デー
タを適切に補正し、データの信頼性を向上することが可
能なフロー式粒子画像解析方法及び装置を実現すること
である。

【００４０】 上記目的を達成するため、本発明は次の
用に構成される。（１）被測定粒子が懸濁された液体サ
ンプルをフローセル中に流し、粒子検出系により上記サ
ンプル中の粒子数を計数する粒子検出段階と、上記フロ
ーセル中の撮像領域を通過する粒子の静止画像を粒子撮
像系により撮像する撮像段階と、画像解析手段により上
記静止画像中の粒子の形態学的分類を行う解析段階とを
有するフロー式粒子画像解析方法において、所定の粒子
を含み粒子濃度の分かっている液体サンプルを用意し、
この粒子サンプルの測定時間中に通過した全粒子数を計
数し、通過した全粒子数から予想される画像処理粒子数
を計算し、予想される画像処理粒子数に対する実際に画
像処理した粒子画像数の割合に基づいて粒子画像有効係
数を求め、更に、上記全粒子数と、予め分かっている粒
子濃度から予想される粒子検出数の割合に基づいて粒子
濃度補正係数を求める段階と、サンプル測定段階におい
て測定時間中に通過した全粒子数を計数する段階と、通
過した全粒子数から予想される画像処理粒子数を計算す
る段階と、この予想される画像処理粒子数に先の粒子画
像有効係数と上記粒子濃度補正係数とを掛けて実効画像
粒子数を計算する段階と、サンプル粒子画像のうちサイ
ズの大きい方から上記実効画像粒子数だけを測定粒子画
像と定める段階とを備える。

【００４１】 （２）好ましくは、上記（１）におい
て、粒子画像有効係数を決める際、粒子の測定時間中に
通過した全粒子数を計数する段階にて、粒子検出条件を
通常の粒子検出条件とは別に、対象粒子以外の微小粒子
を検出しないように、粒子検出条件を切り替える。

【００４２】

【００４３】

【００４４】 （３）また、好ましくは、上記（１）に
おいて、あらかじめ測定した粒子画像有効係数の大小を
所定の値と比較する段階と、測定した粒子画像有効係数
が所定の値より大きければサンプル流が正常に流れてい
ると判断し、小さけれぱサンプル流れが正常でないと判
断する段階と、をさらに備える。

【００４５】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】 （４）被測定粒子が懸濁された液体サン
プルをフローセル中に流し、粒子検出系による上記サン
プル中の粒子数を計数する粒子検出手段と、上記フロー
セル中の撮像領域を通過する粒子の静止画像を粒子撮像
系により撮像する撮像手段と、画像解析手段により上記
静止画像中の粒子の形態学的分類を行う解析手段とを有
するフロー式粒子画像解析装置において、上記粒子検出
手段は、所定の粒子を含み粒子濃度の分かっている液体
サンプルを用意し、この粒子サンプルの測定時間中に通
過した全粒子数を計数し、通過した全粒子数から予想さ
れる画像処理粒子数を計算し、予想される画像処理粒子
数に対する実際に画像処理した粒子画像数の割合に基づ
いて求められた粒子画像有効係数と、更に、上記全粒子
数と、予め分かっている粒子濃度から予想される粒子検
出数の割合に基づいて求められた粒子濃度補正係数を記
憶する記憶手段と、サンプル測定段階において測定時間
中に通過した全粒子数を計数する手段と、通過した全粒
子数から予想される画像処理粒子数を計算する手段と、
この予想される画像処理粒子数に上記粒子画像有効係数
及び粒子濃度補正係数を掛けて実効画像粒子数を計算す
る手段と、サンプル粒子画像のうちサイズの大きい方か
ら上記実効画像粒子数だけを測定粒子画像と定める手段
と、を備える。

【００５６】

【００５７】

【００５８】 （５）好ましくは、上記（４）におい
て、複数の測定モードを有する場合に、各測定モードご
とに粒子画像有効係数を定める手段を、さらに備える。

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

【００７０】

【００７１】

【００７２】

【００７３】

【００７４】

【００７５】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】粒子検出系で検出した粒子と、撮像された
粒子画像のうち粒子検出系で検出した粒子との対応をと
るためには、次の問題が生じる。サンプル流れ幅が粒子
画像撮像系の視野と一致しない場合では、検出された粒
子が、画像視野の外側を流れる場合が生じ、検出粒子と
粒子画像の正しい対応関係を取ることができない。

【００８４】この影響を補正するために、粒子画像有効
係数Ｋｓを導入し粒子画像と粒子検出粒子の対応をとる
ため、正しい粒子数の測定、粒子濃度の算定ができる。

【００８５】さらに、粒子画像有効係数Ｋｓを、測定開
始前に標準粒子を使って測定することにより、粒子画像
解析装置のサンプル流れの状態をチェックすることがで
き、粒子画像の撮像位置の情報に基づいて、サンプル流
れの状態を把握することができる。

【００８６】また、同時に、測定系に存在する系統的誤
差要因や、配管系をサンプルが流れてくる段階で管壁の
付着している水溶液と置換して、サンプル粒子濃度が小
さくなるなどの系統的な誤差が生じる問題に対しても、
粒子濃度補正係数Ｋｕをあらかじめ標準粒子を使って調
べ、粒子画像測定データを補正する手段を使用すること
により、サンプル中の粒子濃度をより正確に測定を行う
ことができる。

【００８７】

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態の説明に先だ
って、本発明の基本原理について説明する。まず、フロ
ーセル中の粒子検出領域を通過した粒子を検出し、一定
時間後に、検出粒子が静止画像撮像領域の所定の位置に
到着したとき、フラッシュランプを点灯させ、粒子の静
止画像を撮影する。

【００８８】一般に、撮像された一枚の静止粒子画像中
には、粒子検出系で検出した粒子以外の小さな粒子も撮
像されていることが度々発生する。この現象は、粒子検
出信号レベルを高くすればするほど、この傾向は大きく
なる。このため、撮像した粒子画像のなかのどれとどれ
が検出対象粒子であるかを区別する方法が必要である。

【００８９】ここで、粒子検出系の検出原理として、粒
子検出信号の信号レベルを越えた粒子に対し、さらに、
信号のパルス幅が所定の値を越えたものを、粒子検出信
号と見なす。このパルス幅は、測定粒子が粒子検出系を
通過する時間に相当し、通過粒子のサイズに比例する。
そして、測定時間中に通過し検出した全粒子数を計数
し、全検出粒子数とする。

【００９０】粒子検出により、フラッシュランプ光源を
点灯させ、検出粒子の静止画像を撮影し、画像中にある
全粒子について画像処理をおこない、粒子分類に必要な
粒子特徴量を抽出し、粒子分類処理を行う。この特徴抽
出および粒子分類識別処理を測定時間に撮像した全画像
粒子に対し実行する。

【００９１】測定終了時に、上述した粒子検出系で測定
時間に通過した全検出粒子数より、測定時間にフラッシ
ュランプ点灯による粒子静止画像の内で予想される検出
画像粒子数を計算する。検出画像粒子数はサンプル中の
粒子濃度、測定時間、ＴＶカメラの画像撮像条件によっ
て計算する。この予想される検出画像粒子数計算式の形
は、測定条件で変わるが、粒子通過の発生事象が統計学
におけるポアソン過程をすることを仮定することで求め
る事が出来る。

【００９２】一般的には、次式（１）の形に表現され
る。 N = Nf・γ・{λ+exp(-λ(1-h))} −−−（１） 式（１）において、Ｎｆは測定時間にＴＶカメラが撮像
出来るフレーム画像の総数である。測定時間をＴｍ、１
フレーム時間をＴｆとすればＮｆ＝Ｔｍ／Ｔｆである。
また、γの項は、フレーム画像の総数Ｎｆのなかで、実
際のサンプル条件で粒子検出により撮像されるフレーム
数のＮｆに対する割合である。γの内容は測定条件で変
わる。Ｎｆ・γの値は、実際に粒子画像を撮像した予想
フレーム数に相当する。

【００９３】式（１）の｛λ+exp(-λ(1-h))｝は、画像
取り込み領域に存在する検出粒子を含む予想される平均
粒子数である。ここで、λは画像取り込み領域体積に相
当する体積Ｖｇに存在する平均粒子数、ｈは粒子検出に
よるフラッシュランプ点灯を画像取り込み領域のどこで
行うかにより決まる値で、０から１の間の値である。通
常は１に近い値の条件にする。Ｖｍは測定サンプル体積
である。

【００９４】また、λは次式（２）で表される。 λ = (Nm/Vm)・Vg −−−（２） 次に、具体的なγの式の形の例を以下に示す。

【００９５】フラッシュランプの点灯タイミングの制
約、すなわち、ＴＶカメラの奇数フィールドまたは偶数
フィールドでのみ点灯可能という制約がない一番効率よ
く粒子画像を撮像する場合を考える。フラッシュランプ
点灯後、２フィールドかけてＣＣＤ・ＴＶカメラに蓄積
された画像を画像メモリに読みだす場合には、γの式の
形は次式（３）で示される。 γ={2(1-exp(-Nm・Tf/(2・Tm)))}/{2-exp(-Nm・Tf/(2・Tm))} −−−（３） 上記（３）式で、Ｔｆは、ＴＶカメラ系の１フレーム時
間を表す。また、画像読みだし及び画像処理に３フィー
ルド必要な条件の場合にはデット・タイムが１フィール
ド増加するが、この場合のγの式の形は次式（４）で示
される。 γ={2(1-exp(-Nm・Tf/(2・Tm)))}/{3-2・exp(-Nm・Tf/(2・Tm))} −−−（４） いずれにしても、γの式の形は、粒子濃度、測定時間、
ＴＶカメラ撮像系の条件で変わる。この予想される検出
画像粒子数は、統計的なバラツキは避けられないが、比
較的正しい検出画像粒子数を得る。

【００９６】また、式（１）において、Ｎｆ・γの値
は、測定時間中にフラッシュランプ発光平均回数、すな
わち、粒子検出によって粒子撮像されたＴＶ画像の平均
フレーム数に相当する。よって、実際に画像処理した全
画像数、すなわち、粒子画像を撮像した全フレーム数Ｎ
ｆｓに置き換えたほうが、実際の装置においてはＮｆ・
γの値の計算をしなくてすみ、処理が簡単になる。式
（１）において、Ｎｆ・γをＮｆｓに置き換えるとＮは
次式（５）で示される。 N = Nfs・{λ+exp(-λ(1-h))} −−−（５） 上述したように、Ｎｆ・γの値は、実際に粒子画像を撮
像した予想フレーム数に相当する。

【００９７】なお、測定条件によっては、式（１）から
式（５）において、近似式を導きだし、計算処理を簡単
にすることも可能である。しかし、上述した計算式が成
立するための条件は、サンプル流れが粒子画像撮像視野
よりも狭い場合に成立するものである。

【００９８】サンプル流れが撮像視野と一致しない場合
には、粒子検出はされるけれども、撮像視野の外側を粒
子が流れる場合が生じ、これまで述べてきた検出粒子と
粒子画像の対応が取れなくなる場合がある。このため
に、この補正が必要になる。

【００９９】このような現象が生じるのは、サンプル流
れが撮像視野と一致しない場合の他に、サンプル流れの
位置がずれる場合、サンプル液およびシース液の温度上
昇による粘性の変化による流れの変化に起因する場合、
さらに、流量・流速などが異なる複数の測定条件を有す
る場合に発生する。また、流れの系の途中に気泡やゴミ
などが存在するとサンプル流れの位置や形状が変化す
る。

【０１００】この問題に対処するために、粒子画像有効
係数Ｋｓを導入し、上述した計算式の中の予想される粒
子画像数Ｎにこの係数をかけたものを実効画像粒子数と
定める。

【０１０１】粒子画像有効係数Ｋｓの算出は次のように
行う。サンプル測定の前に、あらかじめ粒子画像有効係
数を知る処理を行う。この処理を行うために、所定の粒
子を含む液体サンプルを用意し、この粒子サンプルの測
定時間中に通過した全粒子数を計数する段階と、通過し
た全粒子数から予想される画像処理粒子数を計算する段
階と、予想される画像処理粒子数に対する実際に画像処
理した粒子画像数の割合により粒子画像有効係数を求め
る段階とを実行する。

【０１０２】所定の粒子としては、サイズのそろった標
準粒子を懸濁した液体サンプルを使用するのが望まし
い。標準粒子として、ポリスチレン等を主成分としたラ
テックス標準粒子が好ましい。

【０１０３】粒子の測定時間中に通過した全粒子数を計
数する段階において、粒子検出条件を通常測定の場合の
粒子検出条件とは別に、対象粒子以外の微小粒子を検出
しないように、粒子検出条件を切り替えることが望まし
い。これにより、標準粒子だけが粒子検出される事にな
る。このために、標準粒子のサイズも大きめのものを使
うことが望ましい。

【０１０４】粒子検出系を通過した全粒子数と測定条件
から予想される画像処理粒子数を計算する方法は、上述
した計算方法と同一の計算方法を使用する。すなわち、
粒子検出系を通過した全粒子数と測定条件から予想され
る画像処理粒子数を計算する段階において、上記式
（１）及び式（３）を使用する。

【０１０５】撮像条件が異なる場合には、式（３）の代
わりに式（４）を使用する。また、画像フレーム数で代
用する場合には、式（１）の代わりに式（５）を使用す
ることができる。

【０１０６】粒子画像有効係数Ｋｓは、予想される画像
処理粒子数Ｎと、実際に画像処理された標準粒子画像数
Ｎｇとから次式（６）より求める。 Ks = Ng/N −−−（６） 複数の測定モードを有する測定系では、各測定モードご
とに粒子画像有効係数を定めることが必要である。

【０１０７】測定サンプル中の粒子濃度を決定するに
は、次のように行う。懸濁する液体サンプルをフローセ
ル中に流し、粒子検出系によるサンプル中の粒子数を計
数し、フローセル中の撮像領域を通過する粒子の静止画
像を粒子撮像系により撮像する。

【０１０８】そして、画像解析手段により画像中の粒子
の形態学的分類を行う解析処理を行い、測定時間中に通
過した全粒子数Ｎｍと、通過した全粒子数から予想され
る画像処理粒子数Ｎを計算し、この予想させる画像処理
粒子数Ｎに粒子画像有効係数Ｋｓを掛けて実効画像粒子
数を算出する。次に、サンプル粒子画像のうちサイズの
大きい方から上述した実効画像粒子数だけを測定粒子画
像と定める。

【０１０９】上述した処理を行って得られた測定粒子画
像だけに粒子分類の対象を限定し、この画像の中に、粒
子分類ｉの粒子がｎｉ個存在したとすると、測定サンプ
ル中に存在する粒子数Ｎｉは、次式（７）の形で表現さ
れる。 Ni = Nm・(ni/(N・Ks)) −−−（７） 粒子濃度の形で表現する場合には、粒子個数Ｎｉを測定
体積を使って単位体積当たりの個数で表現すればよい。

【０１１０】実際の粒子サンプルを測定する前に、あら
かじめ粒子画像有効係数Ｋｓを測定する段階は、粒子画
像測定系の状態を知るのに重要な段階である。すなわ
ち、サンプル流れが、撮像視野をどのように流れている
かを判断する材料になるからである。

【０１１１】具体的には、あらかじめ測定した粒子画像
有効係数Ｋｓを、所定の値と大小比較することで行え
る。所定の値より大きければサンプル流が正常に流れて
いること、小さければサンプル流れが正常でないと判断
する。Ｋｓが１に近い値ならば、サンプル流れは十分撮
像視野内を流れていることになる。

【０１１２】これに加えて、粒子画像撮像視野のどこの
位置で撮像したかの個々の粒子ごとに位置情報を表示す
る手段を設けると、サンプル流れの状態をより視覚的に
把握することができる。

【０１１３】サンプル流れの状態を表示するには、撮像
視野の撮像位置のヒストグラム情報、特にサンプル流れ
の幅方向または流れ方向の位置に対する粒子個数のヒス
トグラムで表現するのが適当である。

【０１１４】あらかじめ粒子画像有効係数Ｋｓを測定す
る段階で、標準粒子として粒子濃度の既知である液体サ
ンプルを使うことができれば、測定系に存在する誤差要
因に起因する補正を行うことが出来る。誤差要因として
は、測定系の個々の要素が持っている定量性誤差による
濃度の変化、測定系の系統誤差、サンプルが配管系など
を流れていく段階で管壁の溶液と置換して粒子濃度が小
さくなる現象を補正することが出来る。

【０１１５】実際に粒子検出された粒子数と、あらかじ
め分かっている粒子濃度から予想される粒子検出数の割
合を粒子濃度補正係数Ｋｕとして使用する。

【０１１６】粒子画像有効係数Ｋｓおよび粒子濃度補正
係数Ｋｕを使って、測定サンプルの粒子成分ｉの粒子数
Ｎｉは、先の式（７）の代わりに次式（８）を使って求
めることが出来る。 Ni = (Nm/Ku)・ni/(N・Ks) −−−（８） 測定サンプルの粒子濃度を測定するには、測定体積で割
って単位体積当たりの粒子数を求めればよい。複数の測
定モードを有する場合に、各測定モードにおいて、別々
に処理を実施することが必要である。

【０１１７】なお、粒子画像有効係数および粒子濃度補
正係数の粒子個数を算出する場合、複数の粒子が連接し
てあたかも１個の粒子と見なされる場合がある。この場
合には、粒子画像のパターン認識手法で連接粒子の存在
比率を決定し、これを基にして、上記補正を行なうこと
が必要である。連接した粒子の存在比率が小さな場合に
は、この影響は無視してもよい。

【０１１８】また、測定開始前に、定期的に、各測定モ
ードごとに、上述の２つの補正係数を求め、その値を基
に、サンプル中の粒子濃度を決定する段階を設けること
により、粒子画像処理結果の解析結果の信頼性を確保す
ることが出来る。

【０１１９】さらに、フロー系に存在する気泡やゴミに
よるサンプル流れの状態をこれらの補正係数から知るこ
とができ、測定系が正常動作をしているかどうかの判断
情報としても使うことが出来る。

【０１２０】次に、本発明の実施形態を、添付する図を
参照しながら説明する。図１は、本発明の一実施形態に
係るフロー式粒子画像解析方法に用いられるフロー式粒
子画像解析装置の略示構成図であり、図２は、図１の例
における粒子検出系処理部の構成を示すブロック図であ
る。

【０１２１】また、図３は、図１の粒子検出系動作を示
すタイムチャート図である。図４は、粒子検出および静
止粒子画像取り込みの概略説明図である。図５は、本発
明を実施する場合の処理の流れを示すフローチャートで
ある。

【０１２２】図１において、１００はフローセル、１０
１は画像撮像手段、１０２は粒子解析手段、１０３は粒
子検出手段である。また、１はフラッシュランプ、１ａ
はフラッシュランプ駆動回路、２はフィールドレンズ、
３は顕微鏡コンデンサレンズ、５は顕微鏡対物レンズ、
６は結像位置、７は投影レンズである。

【０１２３】また、８はＴＶカメラ、１１は視野絞り、
１２は開口絞り、１５は半導体レーザ、１６はコリメー
タレンズ、１７はシリンドリカルレンズ、１８及び１９
は反射鏡である。

【０１２４】また、２０はビームスプリッタ、２１は絞
り、２２は光検出回路、２３はフラッシュランプ点灯制
御回路、２４はＡＤ変換器、２５は画像メモリ、２６は
画像処理制御回路、２７は特徴抽出回路、２８は識別回
路、２９は中央制御部、４０は粒子検出処理部、５０は
表示部である。

【０１２５】図１において、本発明の一実施形態に係る
フロー式粒子画像解析方法に用いられるフロー式粒子画
像解析装置は、粒子を懸濁させたサンプル液が供給され
るフローセル１００と、フローセル１００中のサンプル
液を撮像する画像撮像手段１０１と、撮像された画像か
ら粒子を検出する粒子検出手段１０３と、検出された粒
子を分析する粒子解析手段１０２とを備えている。

【０１２６】フローセル１００には、サンプル液１１０
と共にシース液が供給され、サンプル液１１０がシース
液に包まれる流れが形成される。そして、サンプル液１
１０の流れは、画像撮像手段１０１（後述する）の顕微
鏡光軸９（後述する）に対して垂直方向に偏平な断面形
状を有する安定した定常流、いわゆるシースフローとな
り、フローセル１００の中心を紙面の上方から下方へ向
かって流下する。このサンプル液１１０の流速は、中央
制御部２９（後述する）により制御される。

【０１２７】画像撮像手段１０１は、顕微鏡としての機
能を有し、パルス光源であるフラッシュランプ１と、フ
ラッシュランプ１を発光させるフラッシュランプ駆動回
路１ａと、フラッシュランプ１からのパルス光束を平行
にするフィールドレンズ２と、フィールドレンズ２から
の平行なパルス光束１０をフローセル１００内のサンプ
ル液流れ１１０に集束させる顕微鏡コンデンサレンズ３
と、フローセル１００内のサンプル液流れ１１０に照射
されたパルス光束を集光し結像位置６に結像させる顕微
鏡対物レンズ５と、投影レンズ７を介して投影した結像
位置６の粒子像を、いわゆるインターレース方式により
取り込み電気信号である画像データ信号に変換するＴＶ
カメラ８と、パルス光束１０の幅を制限する視野絞り１
１および開口絞り１２とを具備している。上記ＴＶカメ
ラ８としては、残像の少ないＣＣＤカメラ等が一般に用
いられる。

【０１２８】また、粒子検出手段１０３は、検出光とし
てのレーザ光を発する検出光源である半導体レーザ１５
と、この半導体レーザ１５からのレーザ光を平行なレー
ザ光束１４にするコリメータレンズ１６と、このコリメ
ータレンズ１６からのレーザ光束１４の一方向のみを集
束させるシリンドリカルレンズ１７と、このシリンドリ
カルレンズ１７からのレーザ光束１４を反射させる反射
鏡１８と、顕微鏡コンデンサレンズ３とフローセル１０
０との間に位置し、上記反射鏡１８からのレーザ光束１
４をサンプル液流れ１１０上の画像取り込み領域の上流
側近傍に導く微小反射鏡１９とから構成されている。

【０１２９】さらに、粒子検出手段１０３は、粒子によ
る上記レーザ光束１４の散乱光を集光する顕微鏡対物レ
ンズ５（この顕微鏡対物レンズ５は、画像撮像手段１０
１の結像用の顕微鏡対物レンズ５と共用される）と、顕
微鏡対物レンズ５で集光された散乱光を反射させるビー
ムスプリッタ２０と、このビームスプリッタ２０からの
散乱光を絞り２１を介して受光し、その強度に基づく電
気信号を出力する光検出回路２２と、この光検出回路２
２からの電気信号に基づいて上記フラッシュランプ駆動
回路１ａを作動させるフラッシュランプ発光制御回路２
３とを具備している。

【０１３０】また、粒子解析手段１０２は、上記ＴＶカ
メラ８から転送された画像データ信号をデジタル信号に
変換するＡＤ変換器２４と、このＡＤ変換器２４からの
信号に基づくデータを所定のアドレスに記憶する画像メ
モリ２５と、この画像メモリ２５におけるデータの書き
込みおよび読み出しの制御を行う画像処理制御回路２６
と、画像メモリ２５からの信号に基づき画像処理を行い
粒子数や分類を行う特徴抽出回路２７と、識別回路２８
と、中央制御部２９と、サンプル液１１０中の粒子数を
決定し粒子検出系を制御し、かつ粒子画像の演算を行う
粒子検出処理部４０と、上記の画像処理の結果である粒
子数や分類を表示する表示部５０とからなっている。

【０１３１】上記中央制御部２９は、上記ＴＶカメラ８
の撮影条件やフローセル１００のサンプル液流れの条
件、画像処理制御回路２６の制御、識別回路２８からの
画像処理結果の記憶、粒子検出処理部４０とのデータの
授受、表示部５０への表示等を行うように構成されてい
る。

【０１３２】次に、図２を参照して、粒子検出処理部４
０の構成について説明する。図中、図１と同一符号は、
同等部分であるので、詳細な説明を省略する。図２にお
いて、４４は粒子検出回路、４１は粒子検出レベル設定
部、４２は粒子検出パルス幅設定部、４３は検出粒子カ
ウンタである。また、７０は画像処理粒子数計算部、７
１はフラッシュランプ点灯回数計算部、７２は画像処理
粒子数計数部、７３はフラッシュランプ点灯回数計数部
である。７５は粒子検出系調整部全体を制御する粒子検
出系制御・演算部である。

【０１３３】図２において、粒子検出処理部４０を構成
する粒子検出回路４４は、光検出回路２２からの所定の
信号レベル以上の粒子検出信号を検出する。粒子検出回
路４４の粒子検出レベルは粒子検出レベル設定部４１お
よび粒子検出パルス幅設定部４２で設定された検出条件
と比較され、この条件を満たすものを粒子検出信号とみ
なす。検出粒子カウンタ４３は、粒子検出回路４４で検
出したパルス数を数え上げる。測定終了時には粒子検出
カウンタ４３の計数値は、検出系を通過した全粒子数と
なる。

【０１３４】測定終了時の粒子検出カウンタ４３の粒子
計数値Ｎｍを使って、粒子画像数計算部７０にて、測定
時間中に画像処理されることが期待される画像処理粒子
数Ｎが計算される。また、粒子計数値Ｎｍを使って、フ
ラッシュランプ点灯数計算部７１にて、測定時間中にフ
ラッシュランプが点灯することが期待される点灯回数ｎ
ｆが計算される。

【０１３５】一方、実際に測定時間中に画像処理した粒
子画像数Ｎ’とフラッシュランプ点灯回数ｎｆ’とは、
それぞれ画像処理制御回路２６およびフラッシュランプ
点灯制御回路２３から、粒子画像計数部７２およびフラ
ッシュランプ点灯回数計数部７３にセットされる。粒子
検出系制御・演算部７５は、粒子検出系全体を制御し、
さらに、粒子数補正演算処理を実行する。

【０１３６】検出粒子カウンタ４３では、測定時間内に
粒子検出された全粒子数を計数しているから、この値を
基にして粒子画像数計算部７０において実際に測定時間
内に画像処理される予想粒子画像の総数を所定の数式を
使って計算する。計算式は、測定条件に左右される。計
算式の例が、上述した（１）式から（４）式に示されて
いる。フラッシュランプ点灯数計算部７１では測定時間
にＴＶカメラが撮像したフレーム総数の予想値も計算す
る機能を有する。計算式は、上記（６）式を使う。

【０１３７】上記構成のフロー式粒子画像解析方法とそ
れに用いられるフロー式粒子画像解析装置の動作を説明
する。まず、画像撮像手段１０１と、粒子検出手段１０
２との動作を説明する。半導体レーザ１５は、常時連続
的に発振しており、常に、サンプル１１０中の粒子が検
出領域を通過するのを観測している。

【０１３８】半導体レーザ１５からのレーザ光束１４
は、コリメータレンズ１６において平行なレーザ光束に
変換され、シリンドリカルレンズ１７において光束１４
の１方向のみ集束される。

【０１３９】そして、レーザ光束１４は、反射鏡１８お
よび微小反射鏡１９で反射され、フローセル１００内の
サンプル液流れ１１０上に照射される。この照射位置
は、シリンドリカルレンズ１７によってレーザ光束１４
が集束する粒子検出位置であり、サンプル液流れ１１０
上の画像取り込み領域の上流側近傍の位置である。

【０１４０】解析対象である粒子が上記レーザ光束１４
を横切ると、このレーザ光束１４は散乱される。レーザ
光束１４の散乱光は、ビームスプリッタ２０で反射さ
れ、光検出回路２２において受光される。そして、光検
出回路２２により、受光した光の強度に基づく電気信号
に変換される。

【０１４１】さらに、光検出回路２２の出力は、粒子検
出系処理部４０に送られ、信号のうち所定のレベル、所
定のパルス幅以上のものを、検出粒子とみなし、結果を
フラッシュランプ点灯制御回路２３に伝える。

【０１４２】つまり、光検出回路２２により、粒子検出
がなされると、画像処理対象粒子が通過したものとし、
検出したことを示す信号がフラッシュランプ発光制御回
路２３に伝送される。上記所定の遅延時間は、粒子検出
位置と画像取り込み領域との距離およびサンプル液１１
０の流速等により決定される。

【０１４３】フラッシュランプ点灯制御回路２３からフ
ラッシュ発光信号がフラッシュランプ駆動回路１ａに伝
送されると、フラッシュランプ駆動回路１ａはフラッシ
ュランプ１を発光させる。

【０１４４】フラッシュランプ１より発せられたパルス
光は、顕微鏡光軸９上を進み、フィールドレンズ２によ
り平行光となり、顕微鏡コンデンサレンズ３により集束
されてフローセル１００内のサンプル液流れ１１０上に
照射される。なお、視野絞り１１および開口絞り１２に
よりパルス光束１０の幅が制限される。

【０１４５】フローセル１００内のサンプル液流れ１１
０に照射されたパルス光束は、顕微鏡対物レンズ５で集
光され、結像位置６に像を結像する。この結像位置６の
像は、投影レンズ７によりＴＶカメラ８の撮像面上に投
影され、インターレース方式により画像データ信号に変
換される。このようにして、サンプル液１１０内の粒子
の静止粒子画像が撮像されたことになる。

【０１４６】上記ＴＶカメラ８における撮像条件は、中
央制御部２９に予め設定されており、この撮像条件によ
ってＴＶカメラ８の撮像動作が制御される。

【０１４７】次に、粒子解析手段１０２について説明す
る。上記ＴＶカメラ８により撮像され、インターレース
方式により変換される画像データ信号は、ＡＤ変換器２
４でデジタル信号に変換され、これに基づくデータが、
画像処理制御回路２６に制御され、画像メモリ２５の所
定のアドレスに記憶される。

【０１４８】画像メモリ２５に記憶されたデータは、画
像処理制御回路２６の制御により読み出され、特徴抽出
回路２７および識別回路２８に入力されて画像処理が行
われ、中央制御部２９にその結果が記憶される。中央制
御部２９に記憶される内容は、粒子分類に用いられた粒
子識別特徴パラメータと粒子分類結果データである。

【０１４９】粒子の分類識別処理は、通常行われている
パターン認識処理により自動的に行われる。この画像処
理結果と測定条件および画像処理された画像数情報が、
画像処理制御回路２６から粒子検出系処理部４０に送ら
れる。

【０１５０】ここで、図４を参照して、一画像粒子計数
における粒子検出位置と静止粒子画像取り込み位置の関
係について説明する。

【０１５１】図４に示すように、Ｔｇを、粒子が画像の
Ａ端からＢ端まで流れるに要する時間とし、Ｔｅを、粒
子が静止粒子画像取り込み視野のフラッシュランプ発光
位置ＰからＢ端まで流れるに要する時間とし、Ｔｏを、
粒子が画像のＡ端からフラッシュランプ発光位置Ｐまで
流れるに要する時間とすれば、Ｔｇ＝Ｔｅ＋Ｔｏとな
る。

【０１５２】測定サンプル中の粒子が粒子検出位置を通
過し、粒子検出信号が所定のレベル以上である粒子を検
出すれば、検出パルス信号を出力する。検出パルス信号
を出力した後、粒子が静止粒子画像取り込み領域の所定
の位置まで達するまでのディレイ時間Ｔｄが経過した後
に、フラッシュランプ１を発光させる。

【０１５３】フラッシュランプ１の発光条件は、次のと
おりである。一つ前の粒子検出による静止粒子画像取り
込みが終了し、すなわち、フラッシュランプ１発光後の
フラッシュランプ１発光の禁止状態にし、二つのフィル
ド読みだし信号により画像信号を一静止粒子画像転送さ
せた後に、再びフラッシュランプ１を発光可能状態にす
る。この状態にするのがランプ発光レディ信号であり、
フラッシュランプ制御回路２３でつくられる。

【０１５４】ランプ発光レディ信号の信号レベルが、
“ｏｎ”であれば、フラッシュランプ１は発光レデイ状
態、“ｏｆｆ”であれば発光禁止状態である。図３にお
いては、ｙ粒子が検出されたのち、Ｔｄ時間経過後、フ
ラッシュランプ１を発光させているが、ｙ粒子検出前に
通過した粒子が、流れの下流側に存在する可能性があ
る。

【０１５５】上述した流れの下流側に存在する可能性が
ある粒子としては、ｙ粒子通過以前の時間間隔Ｔｅの位
置に存在するもので、例えば、ｘ粒子が相当する。これ
は、Ｐ点からＢ端までサンプル粒子が流れていく時間Ｔ
ｅの間において、ランプ発光レディ信号が、まだ“ｏ
ｎ”状態になっていない場合があるためである。

【０１５６】これは、サンプル中の粒子濃度が濃い場合
に顕著に現われる。このような状態が発生する区間を図
３のランプ発光レディ信号の斜線区間で示した。

【０１５７】上記ランプ発光レディ信号が“ｏｎ”にな
ってからランプ発光までの時間がＴｅより大となると、
下流側の粒子、例えば、ｘ粒子が画像上から流れ去り、
この斜線の部分はなくなる。一画像粒子計数の時間間隔
は、粒子が静止粒子画像取り込み領域を通過する時間Ｔ
ｇの間である。

【０１５８】各信号のタイミングを図３を参照して説明
する。粒子検出信号には、粒子ｘ、ｙ、ｚの３個から検
出信号が発生するとする。タイミングよくフラッシュラ
ンプ１を発光させるには、粒子が検出後、時間Ｔｄ遅ら
せた粒子検出ディレイＴｄ信号を発信させればよい。

【０１５９】ここで、ランプ発光レディ信号が“ｏｎ”
または“ｏｆｆ”状態でランプ発光すべきかどうかが決
まる。図３において、一つ前のフレームで静止粒子画像
を取り込み中であったため、ランプ発光レディ信号が始
めから“ｏｎ”になっておらず、垂直同期信号によりラ
ンプ発光レディ信号が、レディ“ｏｎ”になった。

【０１６０】このため、粒子ｘではフラッシュランプは
発光せず、次のｙ粒子で発光され、ランプ発光レディ信
号は“ｏｆｆ”になる。

【０１６１】次に、図２を参照して粒子検出系処理部４
０の説明をする。まず、測定対象サンプルを測定する前
段階として、粒子画像有効係数および粒子濃度補正係数
を設定する段階を説明する。

【０１６２】この段階では、これら補正係数を決定する
ために、サイズの揃った標準粒子を懸濁したサンプル溶
液を使用する。粒子濃度は予め、別な手段で測定させて
おり既知であるとする。この標準粒子サンプルをフロー
式粒子画像解析装置にセットして測定を開始する。この
とき、粒子検出系の粒子検出条件は、通常の測定条件よ
りも厳しくし、上述の標準粒子だけが検出されるように
設定されていることが必要である。

【０１６３】粒子検出条件は、粒子検出レベル設定部４
１および粒子検出パルス幅設定部４２の設定値を変える
ことで行うことが出来る。測定時間内に通過した標準粒
子の全個数は粒子検出カウンタ４３にて計数される。フ
ラッシュランプの点灯回数はフラッシュランプ点灯回数
計数部７３にて計数される。また、粒子画像を処理した
結果、画像処理制御部２６をへて、このサンプルを粒子
画像処理した標準粒子の画像数は画像処理粒子数計数部
７２にセットされる。

【０１６４】これらの処理で得られた粒子検出した全粒
子数・粒子検出計数値を基にして、予想される粒子画像
処理数を計算する。計算式は上記式（１）〜式（４）を
使う。計算は画像処理粒子数計算部７０にて実行され
る。

【０１６５】画像処理粒子数計算部７０にて計算された
値は、サンプル流れと粒子画像撮像視野とが一致しない
ために、画像処理粒子計数部７２の計数結果値よりも一
般的に大きい。また、フラッシュランプ点灯回数計数部
７３の計数結果を使って予想される粒子画像処理数を計
算する場合には上記式（５）を使用する。

【０１６６】粒子画像有効計数Ｋｓは、予想される粒子
画像処理数に対する実際に処理された粒子画像数である
画像処理粒子数計数部７２の計数値の割合で、式（６）
により求められる。粒子画像有効計数Ｋｓは、サンプル
流れと粒子画像撮像視野とが一致していれば１に近づ
き、一致しない場合には１より小さな値を示す。

【０１６７】また、粒子濃度補正係数Ｋｕは、既知の粒
子濃度の標準粒子を前提にしているから、本来、粒子検
出系で計数されるべき粒子数は予想できるので、この予
想される粒子数に対する、実際に計数された粒子検出カ
ウンタ４３の計数値の割合で計算される。

【０１６８】実際の計算は、粒子検出系制御・演算部７
５にて行われる。粒子濃度補正係数Ｋｕは、測定系の構
成や系統誤差のための、粒子濃度補正を行なうもので、
この粒子濃度補正係数Ｋｕの値は１前後の値になる。

【０１６９】予め、粒子画像有効計数Ｋｓおよび粒子濃
度補正係数Ｋｕの値を定めておき、実際に測定された粒
子画像有効計数Ｋｓおよび粒子濃度補正係数Ｋｕの値
と、計算で得られた値とを比較する手段を設けて、比較
した結果から、粒子画像解析装置の装置状態を把握する
事が出来る。

【０１７０】さらに、粒子画像処理系で粒子を撮像した
粒子撮像位置が分かるようにしておけば、計算で得られ
た粒子画像有効計数Ｋｓおよび粒子濃度補正係数Ｋｕの
値と照合する事が出来る。

【０１７１】例えば、粒子画像の撮像位置を測定粒子全
体を画像として表示できる手段を使う事で、何が原因で
補正値が異常値を示すかの原因追求の参考になる。ま
た、撮像位置のヒストグラム情報で表示することが出来
る。この場合は、サンプル流れ方向またはサンプル流れ
の幅方向のヒストグラムで表示するのが良い。

【０１７２】フラッシュランプ点灯回数計数部７３の計
数値とフラッシュランプ点灯回数計算部７１の計算値と
の一致度から、フラッシュランプ点灯制御回路２３およ
びフラッシュランプ点灯動作の不具合をチェックするこ
とが出来る。このチェック処理は、粒子検出系制御・演
算部７５のなかで処理される。

【０１７３】次に、実際の粒子サンプルを測定する段階
について説明する。なお、測定の処理は、上述した補正
係数を求める場合と変わらない。測定サンプルを粒子画
像解析装置にセットして、測定を開始する。この場合、
粒子検出条件は、先の標準粒子のように標準粒子だけを
対象にしないから、粒子検出条件は、より小さな粒子成
分を処理できるように、粒子検出条件を緩くする事が必
要である。

【０１７４】１つの粒子サンプルを粒子検出しながら、
粒子画像処理により粒子画像のパターン認識・分類処理
を続け、測定終了段階で次の処理を実行する。測定時間
内に通過した粒子数は、粒子検出カウンタ４３に格納さ
れているから、この値をもとに画像処理粒子数計算部７
０にて予想される粒子画像処理数を計算する。画像処理
粒子数計算部７０による計算は、上記式（１）〜式
（５）により実行する。

【０１７５】次に、サンプル流れと粒子画像撮像視野と
が一致しないため、粒子画像数の補正を行なう。上記の
ように測定した粒子画像有効計数Ｋｓを予想される粒子
画像処理数に掛けて、実際の測定で画像処理した粒子数
を求める。この演算は、粒子検出系制御・演算部７５で
行われる。

【０１７６】次に、画像処理した粒子画像から、粒子検
出した粒子との対応を取る作業を実施する。具体的に
は、画像処理した粒子画像の個々の粒子の特徴パラメー
タのうち粒子サイズに相当するものに着目し、サイズの
大きい方から順に並べ替えを実施する。そして、上述の
ようにして求めた粒子画像有効計数Ｋｓとの積を計算し
て予想される粒子画像処理数分とし、この数だけを粒子
検出された粒子画像と定める。この作業により、粒子検
出系で検出した粒子に相当する粒子画像が選ばれた事に
なる。この対応関係は、中央制御部２９にて処理され
る。

【０１７７】パターン認識・分類処理された成分ｉのサ
ンプル中の個数Ｎｉは、粒子画像の個数ｎｉとして、上
記（７）より計算される。粒子濃度補正係数Ｋｕを考慮
する場合には、上記式（８）の演算を行なう。ここで、
Ｎｍは粒子検出系で計数された粒子個数で粒子検出カウ
ンタ４３の計数値である。

【０１７８】これまでの説明では、粒子画像数に着目し
て述べてきたが、フラッシュランプ１の点灯回数に着目
して、粒子検出系を調整することができる。フラッシュ
ランプ１の点灯回数から、予想される粒子画像数を上記
式（５）から計算し、さらに、画像処理有効係数Ｋｓを
掛けて、上述した操作を行なうものである。フラッシュ
ランプ点灯回数係数部７３の計数値を用いると、より簡
単に粒子画像数を計算できる。

【０１７９】なお、粒子画像有効係数および粒子濃度補
正係数の粒子個数を算出する場合、複数の粒子が連接し
てあたかも１個の粒子と見なされる場合がある。これ
は、粒子検出系および粒子画像処理の段階で生じる可能
性がある。粒子画像のパターン認識手法で連接粒子の存
在比率を決定し、これを基にして、上記補正を行なうこ
とが必要である。連接した粒子の存在比率が小さな場合
には、この影響は無視してもよい。

【０１８０】以上の粒子画像解析の処理の流れを図５に
示したフローチャートに従って説明する。 第１段階（Ｓ１）：サイズの揃った粒子濃度の分かって
いる補正用標準粒子を測定する。測定対象は、補正係数
としての粒子画像有効係数Ｋｓおよび粒子濃度補正係数
Ｋｕである。この時、粒子検出条件を、標準粒子だけが
検出されるように設定する。

【０１８１】第２段階（Ｓ２）：測定結果のうち、粒子
検出系で検出した全粒子数、この値から予想される粒子
画像数、画像処理系で実際に処理した標準粒子に関する
画像処理粒子数、さらに、粒子濃度から予想される粒子
検出系で検出される粒子数をもとにして、粒子画像有効
係数Ｋｓおよび粒子濃度補正係数Ｋｕを計算から求め
る。計算式は上記式（１）〜式（６）を使用する。

【０１８２】第３段階（Ｓ３）：粒子画像の撮像視野の
撮像位置を基にしたヒストグラムを作成する。

【０１８３】第４段階（Ｓ４）：粒子画像有効係数Ｋ
ｓ、粒子濃度補正係数Ｋｕおよびサンプル流れの状態を
表示・出力する。

【０１８４】第５段階（Ｓ５）：粒子画像有効係数Ｋｓ
および粒子濃度補正係数Ｋｕの値と、サンプル流れの状
態とをチェックして、サンプル流れが正常か否かの判定
を行なう。正常ならば、測定対象である粒子サンプルを
測定する第６段階（Ｓ６）に進む。サンプル流れに異常
があれば第１１段階（Ｓ１１）に進む。

【０１８５】第６段階（Ｓ６）：測定サンプルが存在す
るかどうかの判断をし、もし、測定サンプルが存在しな
ければ粒子画像解析操作を終了する。測定サンプルが存
在すれば、第７段階（Ｓ７）に進む。

【０１８６】第７段階（Ｓ７）：粒子検出条件を測定対
象粒子を検出する条件に設定して、実サンプルを測定
し、粒子画像解析を実行する。

【０１８７】第８段階（Ｓ８）：ここで、サンプル流れ
と粒子撮像視野との不一致に起因する粒子画像と検出粒
子との対応を行なう。つまり、粒子数補正演算を行う。
そのために、粒子画像有効係数Ｋｓを使う。画像処理し
た全粒子画像から、検出系で検出されたであろう粒子画
像を選別する。この作業により、検出粒子と粒子画像と
の対応が取れる事になる。

【０１８８】第９段階（Ｓ９）：粒子濃度補正係数Ｋｕ
を加えて、測定体積中にある粒子成分ｉの粒子数Ｎｉ、
さらに、粒子濃度を計算する。

【０１８９】第１０段階（Ｓ１０）：粒子分析結果を表
示・出力する。そして、第６段階に戻って、測定サンプ
ルが存在するかどうかの判断をし、もし、測定サンプル
が存在しなければ粒子画像解析操作を終了する。測定サ
ンプルが存在すれば、第７段階（Ｓ７）に進む。

【０１９０】第１１段階（Ｓ１１）：第５段階におい
て、サンプル流れに異常があると、判断した場合には、
この第１１段階において、サンプル流れの異常を表示・
出力して処理を中止する。

【０１９１】なお、サンプル測定モードに複数モードが
存在する場合には、各測定モード毎に調整を行なった
り、装置の動作チェックを各々の測定モードに対して実
行させる。当然、補正データとしての、粒子画像有効計
数Ｋｓおよび粒子濃度補正係数Ｋｕは各測定モードごと
に設定されている必要がある。サンプル流れの条件が違
うと、一般的に、粒子画像有効計数Ｋｓおよび粒子濃度
補正係数Ｋｕの値は変化するからである。

【０１９２】上述した、本発明の一実施形態に係るフロ
ー式粒子画像解析方法およびフロー式粒子画像解析装置
は、液体中に懸濁した生物サンプルや細胞、血液中の赤
血球や白血球などの血球成分、または尿中に存在する尿
沈渣成分の分類および分析に有効である。

【０１９３】特に、尿中の尿沈渣成分の粒子数の計数や
粒子の分類においては、サンプルごとに存在する粒子数
は数桁以上違う場合があるため、粒子検出手段による検
出した粒子に対し画像処理することは、サンプル液中の
粒子数情報を知る上で効果的である。

【０１９４】尿沈渣成分では粒子の種類と大きさが非常
にバラエティに富み、粒子検出系の検出粒子と静止粒子
画像中の粒子との対応を正確に取ることが出来ないが、
本発明の実施形態により、正確な粒子計数、粒子分類、
粒子濃度を解析することができる。

【０１９５】上述した例は、粒子検出系の粒子検出とし
て、半導体レーザからのレーザ光束を検出光として用
い、粒子で散乱されたレーザ光束を利用する場合の例で
あるが、これに限らず粒子からの蛍光や透過光を利用す
ることもできるし、一次元イメージセンサにより粒子を
検出する方法や、粒子通過による電気抵抗変化により粒
子を検出する方法を利用することもできる。

【０１９６】なお、これまでは画像取り込みにおいてＴ
Ｖカメラ撮像方式としてインターレース走査について説
明したが、ノンインターレース走査方式でも本発明を適
用することができ、上述した例と同様な効果を奏するこ
とができる。

【０１９７】

【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているため、次のような効果がある。サンプル流れの状
態を定量化し、装置を最良な状態に維持すると共に、測
定データを適切に補正し、データの信頼性を向上させる
ことが可能なフロー式粒子画像解析方法及び装置を実現
することができる。

【０１９８】つまり、粒子検出系で検出した粒子と、撮
像された粒子画像のうち粒子検出系で検出した粒子との
対応をとるために、サンプル流れ幅が粒子画像撮像系の
視野と一致しない場合に生じるが、この影響を補正する
ために、粒子画像有効係数Ｋｓを導入し粒子画像と粒子
検出粒子の対応をとるため、正しい粒子数の測定、粒子
濃度の算定ができる。

【０１９９】さらに、粒子画像有効係数Ｋｓを、測定開
始前に標準粒子を使って測定することにより、粒子画像
解析装置のサンプル流れの状態をチェックすることがで
き、粒子画像の撮像位置の情報に基づいて、サンプル流
れの状態を把握することができる。

【０２００】また、同時に、測定系に存在する定量性誤
差要因や、配管系をサンプルが流れてくる段階で管壁の
付着している水溶液と置換して、サンプル粒子濃度が小
さくなるなどの測定系の系統的な誤差が生じる問題に対
しても、粒子濃度補正係数Ｋｕをあらかじめ粒子濃度既
知の標準粒子を使って調べ、粒子画像測定データを補正
する手段を使用することにより、サンプル中の粒子濃度
をより正確に測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態に係るフロー式粒子画像解
析方法に用いられるフロー式粒子画像解析装置の概略構
成図である。

【図２】図１の例における粒子検出処理部の構成を示す
ブロック図である。

【図３】図１の例における一画像粒子計数の信号タイミ
ング関係を示す図である。

【図４】粒子検出および静止粒子画像取り込みの概略説
明図である。

【図５】本発明による粒子画像解析処理の流れを示すフ
ローチャートである。

【図６】粒子サンプル流れと粒子画像撮像視野との不一
致による撮像されない粒子の存在を示す概略図である。

【符号の説明】

１ フラッシュランプ １ａ フラッシュランプ駆動回路 ２ フィールドレンズ ３ 顕微鏡コンデンサレンズ ５ 顕微鏡対物レンズ ６ 結像位置 ７ 投影レンズ ８ ＴＶカメラ １１ 視野絞り １２ 開口絞り １５ 半導体レーザ １６ コリメータレンズ １７ シリンドリカルレンズ １８、１９ 反射鏡 ２０ ビームスプリッタ ２１ 絞り ２２ 光検出回路 ２３ フラッシュランプ点灯制御回路 ２４ ＡＤ変換器 ２５ 画像メモリ ２６ 画像処理制御回路 ２７ 特徴抽出回路 ２８ 識別回路 ２９ 中央制御部 ４０ 粒子検出系処理部 ４１ 粒子検出レベル設定部 ４２ 粒子検出パルス幅設定部 ４３ 粒子検出カウンタ ４４ 粒子検出回路 ７０ 画像処理粒子数計算部 ７１ フラッシュランプ点灯回数計算部 ７２ 画像処理粒子数計数部 ７３ フラッシュランプ点灯回数計数部 ７５ 粒子検出系制御・演算部 １００ フローセル １０１ 画像撮像手段 １０２ 粒子解析手段 １０３ 粒子検出手段 １１０ サンプル流れ Ｎｆ 測定時間にＴＶカメラが撮像出来るフレーム画像
の総数 Ｔｍ 測定時間 Ｔｆ １フレーム時間 γ Ｎｆのなかで実際のサンプル条件で粒子検出によ
り撮像されるフレーム数のＮｆに対する割合 Ｖｇ 画像取り込み領域体積に相当する体積 λ 画像取り込み領域体積に相当する体積Ｖｇに存在
する平均粒子数 ｈ 粒子検出によるフラッシュランプ点灯を画像取り
込み領域のどこで行うかにより決まる値で、０から１の
間の値 Ｖｍ 測定サンプル体積 Ｔｄ 粒子検出ディレイ時間 Ｔｅ 粒子画像がフラッシュランプ発光位置ＰからＢ端
まで流れるのに要する時間 Ｔｇ 粒子画像が画像のＡ端からＢ端まで流れるのに要
する時間 Ｔｏ 粒子画像が画像のＡ端からフラッシュランプ発光
位置Ｐまで流れるのに要する時間 Ｋｓ：粒子画像有効係数 Ｋｕ：粒子濃度補正係数

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 15/00 - 15/14

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】被測定粒子が懸濁された液体サンプルをフ
   ローセル中に流し、粒子検出系により上記サンプル中の
   粒子数を計数する粒子検出段階と、上記フローセル中の
   撮像領域を通過する粒子の静止画像を粒子撮像系により
   撮像する撮像段階と、画像解析手段により上記静止画像
   中の粒子の形態学的分類を行う解析段階とを有するフロ
   ー式粒子画像解析方法において、所定の粒子を含み粒子濃度の分かっている液体サンプル
   を用意し、この粒子サンプルの測定時間中に通過した全
   粒子数を計数し、通過した全粒子数から予想される画像
   処理粒子数を計算し、 予想される画像処理粒子数に対する実際に画像処理した
   粒子画像数の割合に基づいて粒子画像有効係数を求め、 更に、上記全粒子数と、予め分かっている粒子濃度から
   予想される粒子検出数の割合に基づいて粒子濃度補正係
   数を求める段階と、 サンプル測定段階において測定時間中に通過した全粒子
   数を計数する段階と、 通過した全粒子数から予想される画像処理粒子数を計算
   する段階と、 この予想される画像処理粒子数に先の粒子画像有効係数
   と上記粒子濃度補正係数とを掛けて実効画像粒子数を計
   算する段階と、 サンプル粒子画像のうちサイズの大きい方から上記実効
   画像粒子数だけを測定粒子画像と定める段階と、 を備えることを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
2. 【請求項２】請求項１記載のフロー式粒子画像解析方法
   において、粒子画像有効係数を決める際、粒子の測定時
   間中に通過した全粒子数を計数する段階にて、粒子検出
   条件を通常の粒子検出条件とは別に、対象粒子以外の微
   小粒子を検出しないように、粒子検出条件を切り替える
   ことを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
3. 【請求項３】請求項１記載のフロー式粒子画像解析方法
   において、あらかじめ測定した粒子画像有効係数の大小
   を所定の値と比較する段階と、測定した粒子画像有効係
   数が所定の値より大きければサンプル流が正常に流れて
   いると判断し、小さけれぱサンプル流れが正常でないと
   判断する段階と、をさらに備えることを特徴とするフロ
   ー式粒子画像解析方法。
4. 【請求項４】被測定粒子が懸濁された液体サンプルをフ
   ローセル中に流し、粒子検出系による上記サンプル中の
   粒子数を計数する粒子検出手段と、上記フローセル中の
   撮像領域を通過する粒子の静止画像を粒子撮像系により
   撮像する撮像手段と、画像解析手段により上記静止画像
   中の粒子の形態学的分類を行う解析手段とを有するフロ
   ー式粒子画像解析装置において、上記粒子検出手段は、所定の粒子を含み粒子濃度の分か
   っている液体サンプルを用意し、この粒子サンプルの測
   定時間中に通過した全粒子数を計数し、通過した全粒子
   数から予想される画像処理粒子数を計算し、 予想される画像処理粒子数に対する実際に画像処理した
   粒子画像数の割合に基づいて求められた粒子画像有効係
   数と、更に、上記全粒子数と、予め分かっている粒子濃
   度から予想される粒子検出数の割合に基づいて求められ
   た粒子濃度補正係数を記憶する記憶手段と、 サンプル測定段階において測定時間中に通過した全粒子
   数を計数する手段と、 通過した全粒子数から予想される画像処理粒子数を計算
   する手段と、 この予想される画像処理粒子数に上記粒子画像有効係数
   及び粒子濃度補正係数を掛けて実効画像粒子数を計算す
   る手段と、 サンプル粒子画像のうちサイズの大きい方から上記実効
   画像粒子数だけを測定粒子画像と定める手段と、 を備え
   ることを特徴とするフロー式粒子画像解析装置。
5. 【請求項５】請求項４記載のフロー式粒子画像解析装置
   において、複数の測定モードを有する場合に、各測定モ
   ードごとに粒子画像有効係数を定める手段を、さらに備
   えることを特徴とするフロー式粒子画像解析装置。