JP3493544B2 - Antibody assay device - Google Patents

Antibody assay device

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JP3493544B2
JP3493544B2 JP21884398A JP21884398A JP3493544B2 JP 3493544 B2 JP3493544 B2 JP 3493544B2 JP 21884398 A JP21884398 A JP 21884398A JP 21884398 A JP21884398 A JP 21884398A JP 3493544 B2 JP3493544 B2 JP 3493544B2
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温也 野田
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【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、体液中に存在する
抗体を検出乃至測定する装置、殊に、臨床検体としての
尿中に存在する、バクテリアやウイルス等の病原体に向
けられた抗体を精度よく、また簡便かつ特異的に検出乃
至測定する装置に関する。さらに本発明は、体液中、特
に尿中に存在する標的抗体を精度良く検出測定できる固
相アッセイ法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a device for detecting or measuring an antibody present in a body fluid, and more particularly to an antibody directed to a pathogen such as a bacterium or a virus present in urine as a clinical specimen with high accuracy. The present invention also relates to a device that performs good, simple, and specific detection or measurement. Furthermore, the present invention relates to a solid-phase assay method capable of accurately detecting and measuring a target antibody present in body fluid, particularly in urine.

【０００２】本発明によれば、特に被検試料が薄いなど
の原因によって生じる偽陰性を真性陰性と区別して検出
できるため、誤分析が少なく精度の高い抗体アッセイを
することができる。ゆえに、特に尿などの抗体の絶対量
が少ない検体を対象とするアッセイに有用である。According to the present invention, false negatives caused by factors such as thin test samples can be detected separately from true negatives, so that an accurate antibody assay with less false analysis can be performed. Therefore, it is particularly useful for an assay targeting a sample having a small absolute amount of antibody such as urine.

【０００３】[0003]

【従来の技術】体液中に存在する、バクテリアやウイル
ス等の病原体に向けられた特異抗体の検出・測定は、感
染の有無を間接的に診断するために有用であり、従来か
ら広く診断分野において、病原体またはその由来成分を
測定系の抗原（リガンド）として利用した免疫測定法及
び測定装置が用いられている。2. Description of the Related Art Detection and measurement of specific antibodies directed against pathogens such as bacteria and viruses present in body fluids are useful for indirectly diagnosing the presence or absence of infection, and have been widely used in the field of diagnostics. An immunoassay method and a measurement apparatus using a pathogen or a component derived from the pathogen as an antigen (ligand) of a measurement system are used.

【０００４】その一つとして、ストリップの形態の１片
の多孔質基材上で結合アッセイ（抗原抗体反応）を行う
ものを挙げることができる。この種のアッセイは、上記
多孔質基材の毛細管特性により、ストリップの一端に付
した液体が順次一定方向に毛細管移動するという性質を
利用したものである。つまり、分析対象物を含む被検試
料（液体）を、種々の反応成分が特定の位置に順次配置
されてなるストリップの一端に付すと、被検試料は該ス
トリップに沿って順次毛細管移動し、これにより所望の
位置で反応成分が接触して反応する。また分析対象物の
存在は、リガンドとリセプターの間の結合反応に含まれ
る検出可能な標識からのシグナルを検出することにより
確認、測定される。As one of them, there is one in which a binding assay (antigen-antibody reaction) is carried out on a piece of porous substrate in the form of a strip. This type of assay utilizes the property that the liquid applied to one end of the strip sequentially moves in a fixed direction due to the capillary characteristic of the porous substrate. That is, when a test sample (liquid) containing an analyte is attached to one end of a strip in which various reaction components are sequentially arranged at specific positions, the test sample sequentially moves along the strip by a capillary tube, As a result, the reaction components come into contact with each other and react at a desired position. The presence of the analyte is also confirmed and measured by detecting the signal from the detectable label contained in the binding reaction between the ligand and the receptor.

【０００５】これらの原理を用いるイムノアッセイは、
しばしばイムノキャピラリーアッセイ又はイムノクロマ
トグラフィーアッセイなどと呼ばれ、例えば国際公開第
８７／０２７７４号、ＥＰ０３０６７７２号等に開示さ
れている。またその改良法としては特開昭６４−６３８
６５号公報、特開平１−２９９４６４号公報及び特開平
６−１６７４９７号公報に記載された発明を挙げること
ができる。Immunoassays using these principles are
It is often referred to as an immunocapillary assay or an immunochromatographic assay, and is disclosed in, for example, WO 87/02774, EP0306772 and the like. Further, as an improved method thereof, Japanese Patent Laid-Open No. 64-638.
The inventions described in JP-A-65-65, JP-A-1-299464 and JP-A-6-167497 can be mentioned.

【０００６】かかる従来のアッセイ法は、測定機器等を
必要とせず、簡便で短時間で測定を終了できるという利
点はあるものの、感度や特異性の面からは未だ改良の余
地がある。また、１テストずつ独立した測定であるた
め、陰性或いは陽性コントロール検体を同時に測定する
ことができず、得られた測定値が適切な測定に基づく信
頼性あるものであるかどうかの判断ができないという問
題を有している。[0006] Although such a conventional assay method has an advantage that the measurement can be completed in a short time without requiring a measuring instrument or the like, there is still room for improvement in terms of sensitivity and specificity. In addition, since each test is an independent measurement, it is not possible to measure negative or positive control samples at the same time, and it is impossible to judge whether the obtained measurement values are reliable based on appropriate measurement. I have a problem.

【０００７】特に被検試料が尿等の血液以外の体液であ
る場合、その中に存在する抗体量は、血液中の抗体量の
通常１千分の１から１万分の１程度と非常に低濃度であ
る。加えて、水分を多量に摂取した被験者の尿サンプル
は極端に薄いといったように、サンプル間で抗体の量に
かなりのバラツキがある。In particular, when the test sample is a body fluid other than blood such as urine, the amount of antibody present therein is very low, usually about 1/1000 to 1 / 10,000 of the amount of antibody in blood. The concentration. In addition, there are considerable variations in the amount of antibody between samples, such as the extremely thin urine samples of subjects who ingest a large amount of water.

【０００８】この場合、上記の従来のアッセイ系では、
被検試料が薄すぎて抗体が検出できない場合も「陰性」
結果を示すため、結果が真なる「陰性」なのか、被検試
料が薄すぎて「陰性（偽陰性）」なのか、これら両者を
区別できないという問題を含んでいた。また、尿等のよ
うに抗体量の少ない被検試料を対象とする場合、高感度
に検出できる測定系が必要とされるが、その結果非特異
的反応が検出されやすく偽陽性を示しやすいという問題
もある。In this case, in the above conventional assay system,
"Negative" when the test sample is too thin to detect antibodies
In order to show the result, there was a problem in that it was not possible to distinguish between the true "negative" result and the test sample being too thin and "negative (false negative)". Further, when a test sample with a small amount of antibody such as urine is targeted, a measurement system capable of highly sensitive detection is required, but as a result, a non-specific reaction is likely to be detected and false positives are likely to occur. There are also problems.

【０００９】生体試料としての尿は、血液と比較して、
その調製が非侵襲的であり簡便かつ安全なことから、臨
床検査において殊に望ましい検体と考えられる。このた
め、尿を検体とする場合でも十分な精度を与える抗体ア
ッセイ系、つまり偽陰性や偽陽性検出が低減された、高
精度で且つ特異性の高いアッセイ系が必要とされる。Urine, which is a biological sample, is
Since its preparation is non-invasive, convenient and safe, it is considered to be a particularly desirable sample in clinical examination. Therefore, an antibody assay system that provides sufficient accuracy even when urine is used as a sample, that is, a highly accurate and highly specific assay system with reduced false negative and false positive detections is required.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる事情
に鑑みて開発された、上記イムノキャピラリーアッセイ
又はイムノクロマトグラフィーアッセイの改良法であ
り、被検試料中の分析対象である標的抗体の存在及び量
を、被検試料に基づく原因によって生じる「偽陰性」と
「真性陰性」とを区別して、精度よく検出測定できる分
析技術を提供することを目的とする。更に本発明は、イ
ムノキャピラリーアッセイ又はイムノクロマトグラフィ
ーアッセイにおいて、被検試料に由来する非特異反応を
抑制して偽陽性検出を低減させてなる分析技術を提供す
ることを目的とする（←追加しました。）。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention is an improved method of the above immunocapillary assay or immunochromatographic assay, which was developed in view of such circumstances, and shows the presence and presence of a target antibody to be analyzed in a test sample. It is an object of the present invention to provide an analytical technique capable of accurately detecting and measuring the amount by distinguishing between “false negative” and “true negative” caused by a cause based on a test sample. Further, the present invention aims to provide an analytical technique for suppressing false positive detection by suppressing a non-specific reaction derived from a test sample in an immunocapillary assay or an immunochromatographic assay (← added. .).

【００１１】しかして、本発明は、尿等の比較的抗体量
の少ない体液を被検試料とする場合にも十分な精度を与
える、優れた抗体測定技術（アッセイを行うのに有用な
装置、該装置を用いたアッセイ）を提供することを目的
とするものである。Therefore, the present invention provides an excellent antibody measuring technique (a device useful for performing an assay, which provides sufficient accuracy even when a body fluid having a relatively small amount of antibody such as urine is used as a test sample. It is intended to provide an assay using the device).

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記抗体
測定技術における問題点を解決して、特に尿を被検試料
とする尿中抗体の高精度測定装置を開発すべく、鋭意研
究を進めていたところ、ストリップの反応領域（判定領
域）に、分析対象である標的抗体を検出する部位（「テ
スト部位」）に加えて、被検試料中に含まれる任意の抗
体を検出測定する「コントロール部位」を設けることに
より、「真性陰性」を「偽陰性」と区別して正確に検出
測定できることを見出した。つまり、かかるアッセイ系
によれば、被検試料の濃度が薄いなどの理由で判定不能
な不適性な被検試料を使用した場合は、被検試料中の総
抗体量が少ないため、コントロール部位が陰性を示す
（判定不能の表示）。一方、被検試料が適性である場合
はコントロール部位は陽性を示し、この場合のテスト部
位での結果により、被検体中の測定対象物（標的抗体）
の有無、すなわち「陽性」であるか「真性陰性」である
かを判定することができる。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have earnestly studied to solve the problems in the above-mentioned antibody measuring technique, and particularly to develop a high-precision measuring device for urinary antibody using urine as a test sample. In the reaction area (judgment area) of the strip, in addition to the site for detecting the target antibody to be analyzed (“test site”), any antibody contained in the test sample is detected and measured. It was found that by providing a "control site", "true negative" can be distinguished from "false negative" and accurately detected and measured. That is, according to such an assay system, when an inadequate test sample that cannot be determined due to a low concentration of the test sample is used, the total amount of antibody in the test sample is small, so that the control site is Negative (indication not possible). On the other hand, when the test sample is appropriate, the control site shows a positive result, and the result of the test site in this case shows that the measurement target (target antibody) in the test sample
It is possible to determine whether or not there is, that is, "positive" or "true negative".

【００１３】なお、イムノキャピラリーアッセイ（イム
ノクロマトグラフィーアッセイ）の改良法を開示する特
開平１−２９９４６４号公報及び特開平６−１６７４９
７号公報には、本発明と同様に判定領域にテスト部位に
加えてコントロール部位を設けたアッセイ装置が記載さ
れているが、かかるコントロール部位は、ストリップの
上流域に配置した標識体が毛細管移動により移動してテ
スト部位を通ったか否かを確認判定するものであり、本
発明とは全く異なるものである。Incidentally, JP-A-1-299464 and JP-A-6-16749 which disclose an improved method of immunocapillary assay (immunochromatographic assay).
No. 7 discloses an assay device in which a control site is provided in addition to a test site in the determination region as in the present invention. However, in such a control site, a marker placed in the upstream region of the strip moves by capillary movement. This is to determine whether or not the object has moved and passed through the test site, which is completely different from the present invention.

【００１４】また、本発明者らは、尿などの試料濃度が
薄くしかも夾雑成分の多い検体を対象とする場合、測定
対象である抗体とそれに対するリガンドとの結合反応を
大腸菌由来成分の存在下で行うことにより、当該検体に
由来する非特異反応を抑制できることを見出した。さら
に、抗原抗体反応による尿中抗体の検出法において抗体
検出試薬としてＩｇＧのＦｃ領域に結合特異性を有する
試薬を用いることにより、検体に由来する非特異反応を
抑制し、偽陽性検出を低減できることを見出した。Further, when the present invention targets a sample such as urine, which has a low sample concentration and a large amount of contaminants, the binding reaction between the antibody to be measured and its ligand in the presence of a component derived from E. coli. It was found that the non-specific reaction derived from the sample can be suppressed by carrying out the method. Furthermore, by using a reagent having a binding specificity to the Fc region of IgG as an antibody detection reagent in the method for detecting urinary antibody by an antigen-antibody reaction, it is possible to suppress a non-specific reaction derived from a sample and reduce false positive detection. Found.

【００１５】本発明は、かかる知見に基づき完成された
ものであり；少なくとも (a)被検試料を接触させる第１
領域及び (b)被検試料中の抗体を反応させる第２領域
を、被検試料が毛細管現象により該第１領域から第２領
域に輸送されるように設けてなる固相支持体、並びに第
２領域での反応結果を検出するための標識手段を含有す
るアッセイ装置であって、上記(b)第２領域に、(i)アッ
セイ対象である標的抗体に対するリガンドを固定化した
テスト部位と (ii)被検試料中の任意抗体を捕捉するリ
ガンドを固定化したコントロール部位とを有することを
特徴とする抗体アッセイ装置である。The present invention has been completed based on these findings; at least (a) a first contacting test sample;
A region and (b) a second region for reacting an antibody in the test sample so that the test sample is transported from the first region to the second region by capillarity; An assay device comprising a labeling means for detecting a reaction result in two regions, wherein (b) the second region comprises (i) a test site in which a ligand for a target antibody to be assayed is immobilized. ii) An antibody assay device having a control site on which a ligand that captures an arbitrary antibody in a test sample is immobilized.

【００１６】とりわけ、本発明の抗体アッセイ装置の特
徴は、第２領域にテスト部位とは別個にコントロール部
位を設けたところにあり、該コントロール部位は、適性
な被検試料を適用し適切な装置で適切に測定された場合
は、被検試料中に標的抗体が存在すると否に拘わらず、
標識の存在下で陽性の結果を示す表示を形成し、一方不
適性な被検試料を適用した場合或いは不適切な装置でも
しくは不適切に測定された場合は、被検試料に標的抗体
が存在すると否に拘わらず、標識の存在下で陰性の結果
を示す表示を形成するように構成される。[0016] Particularly, the feature of the antibody assay device of the present invention resides in that a control site is provided in the second region separately from the test site, and the control site is an appropriate device to which an appropriate test sample is applied. If appropriately measured in, regardless of the presence of the target antibody in the test sample,
The presence of the target antibody is present in the test sample when it forms a display showing a positive result in the presence of the label, while applying an inadequate test sample or when using an improper instrument or improperly measured Then, whether or not, it is arranged to form a display showing a negative result in the presence of the label.

【００１７】すなわち、本発明装置の第２領域中のコン
トロール部位は、被検試料中に標的抗体が存在すると否
に拘わらず、テスト部位の結果（特に陰性の結果）が、
有効なアッセイ結果であるか否かを表示する部位に相当
する。しかして、かかる構成に基づいて、本発明の抗体
アッセイ装置によれば、偽陰性と真性陰性とを区別して
精度よく被検試料中の抗体を定性、定量することが可能
となる。That is, the control site in the second region of the device of the present invention has a test site result (particularly a negative result) regardless of the presence or absence of the target antibody in the test sample.
Corresponds to a site for displaying whether or not a valid assay result is displayed. Therefore, based on such a configuration, according to the antibody assay device of the present invention, it is possible to distinguish between false negatives and true negatives and to qualitatively and quantitatively determine the antibodies in the test sample with high accuracy.

【００１８】更に、本発明の抗体アッセイ装置の特徴
は、テスト部位における標記抗体の反応が大腸菌由来成
分の存在下で行われるように設計されている点、及び／
又は、当該テスト部位における反応を検出する抗体検出
試薬として標的抗体ＩｇＧのＦｃ領域に結合特異性を有
する試薬が所望により用いられるように設計されている
点である。かかる構成に基づいて、本発明の抗体アッセ
イ装置によれば、非特異的反応が抑制されて精度よく高
感度に被検試料中の抗体を定性、定量することが可能と
なる。Further, a feature of the antibody assay device of the present invention is that the reaction of the title antibody at the test site is designed to be carried out in the presence of an Escherichia coli-derived component, and / or
Alternatively, it is designed so that a reagent having a binding specificity to the Fc region of the target antibody IgG is optionally used as an antibody detection reagent for detecting the reaction at the test site. Based on such a configuration, according to the antibody assay device of the present invention, nonspecific reaction is suppressed, and it becomes possible to qualitatively and quantitatively measure the antibody in the test sample with high accuracy and high sensitivity.

【００１９】[0019]

【発明の実施の形態】本発明のアッセイ装置は、固相ア
ッセイを利用して、体液中の分析対象である標的抗体の
存在及び／又は量を精度よく検出測定するように改良さ
れたものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The assay device of the present invention is improved so as to accurately detect and measure the presence and / or amount of a target antibody to be analyzed in a body fluid by utilizing a solid phase assay. is there.

【００２０】本発明において「体液」とは、測定対象と
なる抗体の存在が認められる生体（ヒト、その他の動物
を含む）の体液であれば特に限定されることなく、一般
の臨床検査において検体とされる体液を広く意味するも
のであるが、具体的には尿、脊髄液、羊水、唾液、血
清，血漿を含む血液等の体液、好ましくは血液以外の体
液を例示することができる。特に、本発明は、従来から
抗体検出への利用が望まれていた尿検体における検出精
度の問題を解決するものであり、本発明の効果を鑑みれ
ば、体液として尿を特に好ましく例示することができ
る。In the present invention, the “body fluid” is not particularly limited as long as it is a body fluid of a living body (including humans and other animals) in which the presence of the antibody to be measured is recognized, and it is a sample in general clinical tests. The body fluids described above are broadly meant, and specific examples thereof include body fluids such as urine, spinal fluid, amniotic fluid, saliva, blood including blood serum and blood plasma, and preferably body fluids other than blood. In particular, the present invention is to solve the problem of detection accuracy in urine specimens that have been conventionally desired to be used for antibody detection, and in view of the effects of the present invention, urine can be particularly preferably exemplified as the body fluid. it can.

【００２１】また、体液中に存在する測定対象の「抗
体」は、その測定乃至検出が望まれる抗体であれば特に
限定はなく、例えば生体にとって異物である各種の病原
体に向けられた抗体であることができる。The “antibody” to be measured existing in the body fluid is not particularly limited as long as it is an antibody whose measurement or detection is desired, and for example, it is an antibody directed to various pathogens which are foreign to the living body. be able to.

【００２２】かかる病原体としては、特に限定はなく、
ヒト、その他の動物へ感染しその結果としての抗体産生
が認められる各種の病原体を挙げることができる。具体
的には、例えば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、Ａ
型，Ｂ型及びＣ型等の各種肝炎ウイルス、風疹ウイル
ス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメ
ガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状ヘル
ペスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス等の
ウイルス；ヘリコバクターピロリ菌（H. pylori：以
下、単にＨ．ピロリ菌ともいう）、クラミジア、結核
菌、スピロヘータ、淋菌、梅毒菌、マイコプラズマ等の
バクテリア；及びトキソプラズマ、赤痢アメーバー、ツ
ツガムシ等の原虫等を挙げることができる。好ましく
は、ＨＩＶ、各種肝炎ウイルス、風疹ウイルス、インフ
ルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス等
のウイルス；Ｈ．ピロリ菌等のバクテリアであり、特に
好ましくはＨ．ピロリ菌等のバクテリアである。The pathogen is not particularly limited,
Examples thereof include various pathogens which infect humans and other animals and are recognized to produce antibodies as a result. Specifically, for example, HIV (human immunodeficiency virus), A
Hepatobacter pylori virus (H. pylori virus, H. influenzae virus, influenza virus, influenza virus, measles virus, cytomegalovirus, herpes simplex virus, varicella-zoster virus, adenovirus, enterovirus, etc .; pylori: hereinafter also simply referred to as H. pylori bacterium), chlamydia, tubercle bacillus, spirochete, gonococcus, syphilis, mycoplasma, and other bacteria; Preferably, viruses such as HIV, various hepatitis viruses, rubella virus, influenza virus, measles virus, herpes virus; Bacteria such as H. pylori, particularly preferably H. pylori. Bacteria such as Helicobacter pylori.

【００２３】本発明によれば、まず、少なくとも第１領
域と第２領域を備える固相支持体が提供される。According to the present invention, first, a solid phase support comprising at least a first region and a second region is provided.

【００２４】第１領域は被検試料が付され被験試料と接
触する領域であり、第２領域は該被検試料中に含まれる
抗体（標的抗体を含み得る全抗体）がリガンド−リセプ
ター又は抗原−抗体の関係で反応・結合し、また更に標
識体の存在下でその反応結果が現れる領域（反応領域及
び判定領域）である。これらの領域は、固相支持体の第
１領域に付され、接触した被検試料が、該第１領域から
第２領域に毛細管現象によって輸送される態様で固相支
持体上に配置される。好ましくは、第１領域に接触した
被検試料の全部若しくは少なくとも一部が、固相支持体
の実質的に平面な層を通って第２領域に毛細管移動する
ように配置される。The first region is a region to which a test sample is attached and comes into contact with the test sample, and the second region is a ligand-receptor or an antigen in which the antibodies contained in the test sample (total antibodies that may include target antibodies) are present. -A region (reaction region and determination region) where the reaction result and the reaction result in the presence of the labeled substance in the presence of the labeled substance. These regions are provided on the first region of the solid-phase support, and the test sample in contact is arranged on the solid-state support in such a manner that the sample to be contacted is transported from the first region to the second region by capillary action. . Preferably, all or at least a portion of the test sample in contact with the first region is arranged to capillaryly move through the substantially planar layer of the solid support to the second region.

【００２５】尚、固相支持体は、第１領域から第２領域
を通って毛細管移動する被験試料（液体）を吸収する領
域として、第２領域に続いて第３領域を有していても良
い。The solid-phase support may have a third region following the second region as a region for absorbing a test sample (liquid) that moves capillaryly from the first region through the second region. good.

【００２６】固相支持体は、好ましくはストリップの形
状を有し、第１領域及び第２領域は、ストリップの同一
平面上に被験試料が毛細管作用により第１帯域（第１領
域）から第２帯域（第２領域）に移動し、必要であれば
更に第２帯域から続く第３帯域（第３領域）に流入する
様式で配列される。なお、このように固相支持体の好ま
しい形状は、ストリップ形状であるが、その形状及びそ
の形式が本発明の固相支持体の各種の機能を実施しうる
限り、他の形状のいずれをも採用することができる。The solid phase support preferably has the shape of a strip, and the first region and the second region are arranged on the same plane of the strip so that the test sample can be moved from the first zone (first zone) to the second zone by capillary action. It is arranged in such a manner that it moves to the zone (second area) and, if necessary, further flows into the third zone (third area) following the second zone. The preferred shape of the solid phase support is thus a strip shape, but any other shape may be used as long as the shape and the form thereof can perform various functions of the solid phase support of the present invention. Can be adopted.

【００２７】固相支持体は、被検試料（液体）を吸収す
ることができ、かつ試料により湿潤した際、少なくとも
該試料に含まれる抗体を毛細管作用によって固相支持体
の第１領域から第２領域に、必要であれば更に第２領域
から続く第３領域へ流動させることができるものであ
る。さらに固相支持体は、被検試料中に含まれる抗体
（標的抗体を含む）と反応してそれを捕捉するリガンド
を支持固定化できるものであることが好ましい。The solid phase support is capable of absorbing a test sample (liquid), and when wetted by the sample, at least the antibody contained in the sample is removed from the first region of the solid phase support by the capillary action. It can be made to flow into two regions, and if necessary, from the second region to the subsequent third region. Furthermore, it is preferable that the solid phase support can support and immobilize a ligand that reacts with and captures an antibody (including a target antibody) contained in a test sample.

【００２８】適切な固相支持体の例としては、ポリエチ
レン、グラスファイバー、セルロース、レーヨン、ナイ
ロン、架橋デキストラン、各種のクロマトグラフィー用
紙、ニトロセルロース、ろ紙などの多孔性基材が挙げら
れる。Examples of suitable solid supports include polyethylene, glass fiber, cellulose, rayon, nylon, crosslinked dextran, various chromatographic papers, nitrocellulose, porous substrates such as filter papers.

【００２９】固相支持体の第１領域、第２領域、第３領
域等の各領域は、上記に掲げる基材の中から選択される
同一又は異なる基材から構成することができ、各領域の
役割や機能に応じて、種々選択して採用される。Each region such as the first region, the second region and the third region of the solid phase support can be composed of the same or different base materials selected from the base materials listed above. Various types are selected and adopted according to the role and function of.

【００３０】固相支持体の第１領域は、その表面に適用
された被検試料を吸収し、該試料を第２領域に毛細管移
動させることができる多孔性基材からなることが好まし
い。第１領域に適した多孔性基材としては、特に制限は
されないが、通常ポリエチレン（例えばＰＯＲＥＸ：Po
rex Tchnoogies,Fairburn,Georgia 製）、グラスファイ
バー、レーヨン、ナイロン、及び紙を含むセルロース系
材料等が例示できる。好ましくは多孔性ポリエチレン、
ろ紙等のセルロース系材料である。The first region of the solid phase support is preferably made of a porous substrate capable of absorbing the test sample applied to its surface and moving the sample by capillary movement to the second region. The porous substrate suitable for the first region is not particularly limited, but is usually polyethylene (for example, POREX: Po).
rex Tchnoogies, Fairburn, Georgia), fiberglass, rayon, nylon, and cellulosic materials including paper and the like. Preferably porous polyethylene,
It is a cellulosic material such as filter paper.

【００３１】固相支持体の第２領域は、その毛細管作用
により第１領域から第２領域へ被験試料（液体）をはじ
きながら(wicking)、毛細管移動させることができ、ま
た被検試料中の抗体（標的抗体を含む）に対するリガン
ドを、試料の毛細管移動により脱離しないように支持で
きる多孔性基材であることが望ましい。このような多孔
性基材としては、ろ紙、クロマトグラフィー用紙、グラ
スファイバー、架橋結合されたデキストラン、ナイロン
及びニトロセルロースなどが挙げられるが、好ましく
は、リガンドを容易に固定することができる理由から、
ニトロセルロースである。The second region of the solid phase support is capable of wicking the test sample (liquid) from the first region to the second region by its capillary action, and it is possible to move the capillary by the capillary action. It is desirable to use a porous substrate that can support a ligand for an antibody (including a target antibody) so as not to be detached by capillary movement of a sample. Examples of such a porous substrate include filter paper, chromatography paper, glass fiber, cross-linked dextran, nylon and nitrocellulose, but preferably, because the ligand can be easily immobilized,
It is nitrocellulose.

【００３２】第２領域には、被験試料中の標的抗体を特
異的に認識してそれを捕捉するリガンドを結合固定化し
てなるテスト部位、及び被験試料中の任意抗体を認識し
てそれを捕捉するリガンドが結合固定化してなるコント
ロール部位が設けられる。コントロール部位は、テスト
部位と一定の間隔をおいて、好ましくは毛細管移動の下
流位置に配置され、両部位が同じ条件で被検試料の液体
先端により接触されることが望ましい。In the second region, a test site formed by binding and immobilizing a ligand that specifically recognizes and captures the target antibody in the test sample, and an arbitrary antibody in the test sample are recognized and captured. A control site is provided in which the ligand to be immobilized is bound and immobilized. The control site is arranged at a constant distance from the test site, preferably at a position downstream of capillary movement, and both sites are desirably contacted by the liquid tip of the test sample under the same conditions.

【００３３】テスト部位のリガンドとしては、分析対象
である標的抗体と特異的に結合するものであれば特に制
限されないが、好ましくは、分析対象である標的抗体に
特異的に認識され、特異的に結合（抗原抗体反応）する
抗原を挙げることができる。かかる抗原としては、既存
の血清抗体測定系において採用されている抗原を広く採
用することができる。これらは、前述するウイルスやバ
クテリア等の病原体そのものであってもよいが、少なく
とも当該病原体に固有の抗原決定基を有するものであれ
ばよい。例えば、病原体を加温処理や放射線照射等によ
り不活性化したもの、病原体を界面活性剤等で抽出処理
して得られる抗原、また、化学合成や遺伝子工学的手法
により人工的に調製した抗原等を例示することができ
る。The test site ligand is not particularly limited as long as it specifically binds to the target antibody to be analyzed, but is preferably specifically recognized by the target antibody to be analyzed and specifically The antigen which binds (antigen-antibody reaction) can be mentioned. As such an antigen, antigens used in existing serum antibody measurement systems can be widely adopted. These may be pathogens themselves such as the aforementioned viruses and bacteria, but may be those having at least an antigenic determinant specific to the pathogen. For example, a pathogen inactivated by heating or irradiation, an antigen obtained by extracting the pathogen with a surfactant, or an antigen artificially prepared by chemical synthesis or a genetic engineering method. Can be illustrated.

【００３４】コントロール部位のリガンドとしては、被
検試料中に含まれる任意の抗体と結合するものであれば
特に制限されないが、好ましくは、特に尿に含まれる任
意抗体を特異的に認識し、該抗体に結合する抗体（抗−
イムノグロブリン抗体）を挙げることができる。The ligand of the control site is not particularly limited as long as it binds to any antibody contained in the test sample, but preferably, it specifically recognizes any antibody contained in urine, Antibodies that bind to antibodies (anti-
(Immunoglobulin antibody).

【００３５】これらのリガンドは、液体試料の毛細管移
動によりテスト部位及びコントロール部位から脱離除去
されないように、それぞれテスト部位及びコントロール
部位に位置する多孔性基材に固定される。すなわち、各
リガンドは第２領域が分析対象物を含む試料により濡れ
たときに、拡散しないように上記多孔性基材の各部位に
結合し、そして該各部位に固定化された状態を保ち、固
相支持体の第３領域に輸送されることがないように支持
されることが望ましい。These ligands are immobilized on the porous substrates located at the test site and the control site, respectively, so as not to be detached and removed from the test site and the control site by the capillary movement of the liquid sample. That is, each ligand binds to each site of the porous substrate so as not to diffuse when the second region is wet by the sample containing the analyte, and remains immobilized at each site, It is desirable to support it so that it is not transported to the third region of the solid support.

【００３６】このようなリガンドの固定化は、当該技術
分野において公知の方法により、上記の各種多孔性基材
に物理的結合または化学的結合させることにより達成で
きる。The immobilization of such a ligand can be achieved by a physical or chemical bond to the above various porous substrates by a method known in the art.

【００３７】例えば、共有結合法としてジアゾ法、ペプ
チド法（酸アミド誘導体法、カルボキシルクロライド樹
脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体
法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体
法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用
する方法等）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合
法（例えば架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキ
サメチレンイソシアナート等を用いるもの）、Ｕｇｉ反
応による担体結合法等の化学的反応：或いはイオン結合
法：物理的吸着法等が例示できる。また第２領域に用い
られる多孔質基材がニトロセルロースの場合は、非共有
結合によって簡便に上記リガンドを結合することが可能
である。For example, as a covalent bond method, a diazo method, a peptide method (acid amide derivative method, carboxyl chloride resin method, carbodiimide resin method, maleic anhydride derivative method, isocyanate derivative method, cyanogen bromide activated polysaccharide method, cellulose) Carbonate derivative method, method using condensation reagent, etc., alkylation method, carrier binding method by cross-linking reagent (for example, glutaraldehyde, hexamethylene isocyanate, etc. are used as cross-linking reagent), carrier binding method by Ugi reaction, etc. Chemical reaction: or ionic bond method: physical adsorption method and the like. Further, when the porous substrate used in the second region is nitrocellulose, it is possible to easily bind the ligand by non-covalent bond.

【００３８】第２領域のテスト部位に用いられるリガン
ド（抗原）の量は、被検試料中に存在すると思われる標
的抗体が本質的にすべてテスト部位に結合するように過
剰量であることが好ましい。The amount of the ligand (antigen) used in the test site of the second region is preferably an excess amount so that essentially all the target antibody that is considered to be present in the test sample binds to the test site. .

【００３９】また、第２領域のコントロール部位に用い
られるリガンド（抗−イムノグロブリン抗体）の量は、
被検試料中の任意の抗体（標的抗体を含んでいても良
い）が本質的にすべてコントロール部位に結合するよう
に過剰量であることが好ましい。The amount of the ligand (anti-immunoglobulin antibody) used in the control site of the second region is
It is preferable that an excessive amount of any antibody (which may contain the target antibody) in the test sample is essentially all bound to the control site.

【００４０】なお、テスト部位における標的抗体とリガ
ンド（特に抗原）との結合反応は、大腸菌由来成分の存
在下で行なわれることが好ましい。かかる大腸菌由来成
分は被検試料の希釈溶液中に配合され被検試料とともに
第１領域に付されることによって反応系に供されてもよ
いし、また固相支持体のテスト部位又はその上流域（前
述の第１領域、後述するトレーサー領域等）に脱着可能
なように付着固定されていてもよい。大腸菌由来成分と
しては、後述するいずれものであってもよいが、、好ま
しくは大腸菌の可溶性抽出物、リポ多糖（ＬＰＳ）が例
示される。The binding reaction between the target antibody and the ligand (especially antigen) at the test site is preferably carried out in the presence of a component derived from Escherichia coli. The Escherichia coli-derived component may be supplied to the reaction system by being mixed in a dilute solution of the test sample and attached to the first region together with the test sample, or the test site of the solid phase support or its upstream region. It may be detachably attached and fixed to (the above-mentioned first region, the tracer region described later, etc.). The Escherichia coli-derived component may be any of those described below, but a soluble extract of Escherichia coli and lipopolysaccharide (LPS) are preferred.

【００４１】被検試料を第１領域に適用すると、試料は
第１領域から毛細管移動により第２領域に流入し、そこ
でまず第２領域内のテスト部位に試料中の標的抗体が結
合・固定化され、次いでその下流に位置するコントロー
ル部位に残りの任意抗体（テスト部位に結合しきれなか
った標的抗体を含む）が結合・固定化される。When the test sample is applied to the first region, the sample flows from the first region into the second region by capillary movement, whereupon the target antibody in the sample is bound and immobilized at the test site in the second region. Then, the remaining arbitrary antibody (including the target antibody that could not be completely bound to the test site) is bound and immobilized at the control site located downstream thereof.

【００４２】本発明で用いられる標識手段は、被検試料
中の標的抗体及び任意抗体がそれぞれ上記のテスト部位
及びコントロール部位に結合・固定化されたか否かを検
出する手段として用いられる。The labeling means used in the present invention is used as a means for detecting whether or not the target antibody and the arbitrary antibody in the test sample are bound and immobilized on the test site and control site, respectively.

【００４３】かかる標識手段としては、抗体に対するリ
ガンドと該リガンドに結合した検出可能な標識から構成
されるものを挙げることができる。Examples of such labeling means include those comprising a ligand for an antibody and a detectable label bound to the ligand.

【００４４】抗体に対するリガンドは、被検試料中に存
在する抗体を認識してかつそれに結合する分子であれば
特に制限されないが、本発明においては、測定対象であ
る標的抗体及び被検試料中に含まれる任意の抗体のいず
れにも結合するものであることが望ましく、かかるもの
としては前記したコントロール部位のリガンドと同一の
もの、特には該コントロール部位のリガンドとして採用
したと同一の結合性を有する抗イムノグロブリン抗体を
例示することができる。The ligand for the antibody is not particularly limited as long as it is a molecule that recognizes and binds to the antibody present in the test sample, but in the present invention, the ligand is the target antibody to be measured and the test sample. It is desirable that it binds to any of the antibodies contained therein, and it has the same binding properties as those of the above-mentioned control site ligand, particularly the same binding properties as those adopted as the control site ligand. An anti-immunoglobulin antibody can be illustrated.

【００４５】該抗イムノグロブリン抗体には、例えばヒ
トイムノグロブリン等の対象に応じたイムノグロブリン
を免疫源として免疫された任意の被免疫動物から得られ
る抗血清またはその精製物（ポリクローナル抗体）或い
はモノクローナル抗体が包含される。The anti-immunoglobulin antibody is, for example, antiserum obtained from any immunized animal immunized with an immunoglobulin suitable for the subject such as human immunoglobulin, or a purified product (polyclonal antibody) or monoclonal thereof. Antibodies are included.

【００４６】なお、コントロール部位のリガンドとして
の抗イムノグロブリン抗体は、所望により、例えば被検
試料に含まれる総抗体を補足しこれを検出するように全
てのクラスの抗体に向けられたものとすることができ、
或いは、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）等の任意の所望
クラスの抗体に向けられたものとすることもできる。好
ましくは、かかるリガンドは測定を所望する標的抗体の
クラスと同じクラスの抗体に向けられた抗イムノグロブ
リン抗体とすることができ、この場合にはコントロール
部位において標的抗体と同種抗体の検出が行われること
により、尿に限らず、血清等の各種の体液を被験試料に
用いる場合においても、そのアッセイが適切に実施され
たかを判断する上で最も適した指標を与える点で好まし
い。The anti-immunoglobulin antibody as a ligand for the control site is, if desired, directed to all classes of antibodies so as to supplement and detect the total antibody contained in the test sample, for example. It is possible,
Alternatively, it may be directed to any desired class of antibodies such as immunoglobulin G (IgG). Preferably, such a ligand can be an anti-immunoglobulin antibody directed against an antibody of the same class as the target antibody for which measurement is desired, in which case the target antibody and alloantibodies are detected at the control site. This is preferable not only in urine but also in the case of using various body fluids such as serum as a test sample because it gives the most suitable index for judging whether or not the assay was appropriately performed.

【００４７】また、測定対象抗体がＩｇＧである尿中抗
体の測定においては、上記標識手段としてのリガンド
は、より好ましくはＩｇＧのＦｃ領域に結合特異性を有
することで特徴づけられるリガンドあるのがよく、例え
ばＩｇＧの軽鎖或いはＦ(ａｂ)領域と反応性を示さない
Ｆｃ特異的抗ＩｇＧ抗体、又はＩｇＧのＦｃ領域に対し
て特異的に反応性を有するプロテインＡやプロテインＧ
等の採用を好ましく例示することができうｒ。これらの
抗イムノグロブリン抗体乃至リガンドは、常法に従って
調製することができ、また市販品としても入手すること
ができる。Further, in the measurement of urinary antibody in which the antibody to be measured is IgG, the ligand as the labeling means is more preferably a ligand characterized by having binding specificity to the Fc region of IgG. Often, for example, an Fc-specific anti-IgG antibody that is not reactive with the light chain or F (ab) region of IgG, or protein A or protein G that is specifically reactive with the Fc region of IgG
It is possible to exemplify the adoption of the above. These anti-immunoglobulin antibodies or ligands can be prepared according to a conventional method and can also be obtained as commercial products.

【００４８】検出可能な標識成分は、特異的結合アッセ
イ、特にイムノアッセイに使用される当該技術分野にお
いて公知のもの又は将来使用され得るあらゆる検出可能
な標識であれば特に制限はされない（「単クローン抗
体」岩崎辰夫 他著、講談社サイエンティフィク、198
4；「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治 他著、医学
書院、1982等）。The detectable label component is not particularly limited as long as it is known in the art used for specific binding assays, particularly immunoassays, or any detectable label that can be used in the future ("monoclonal antibody"). Tatsuo Iwasaki et al., Kodansha Scientific, 198
4; "Enzyme-linked immunosorbent assay", 2nd edition, Eiji Ishikawa et al., Medical School, 1982).

【００４９】好ましい標識としては、第２領域のテスト
部位やコントロール部位において好ましくは色の変化を
生じるものである。制限はされないが、より好ましくは
色の変化を何らかの計測器を必要とすることなく、可視
的に認識できるものである。例えば、各種の色原体、例
えば蛍光性物質、吸収性色素などが挙げられ、より好ま
しくは可視的に検出可能なマーカーを含む粒子状の標識
を挙げることができる。A preferred label is one that causes a color change at the test site or control site in the second region. Although not limited, it is more preferable that the color change can be visually recognized without requiring any measuring device. For example, various chromogens, for example, fluorescent substances, absorptive dyes and the like can be mentioned, and more preferably, a particulate label containing a visually detectable marker can be mentioned.

【００５０】適切な粒子状の標識には、ポリマー（例え
ば、ラテックス又はポリスチレン）、嚢（サック）、リ
ポソーム、金属ゲル（例えば、銀コロイド又は金コロイ
ド）またはポリスチレン染料の粒子が含まれる。好まし
くは銀コロイド又は金コロイド等の金属ゲルである。Suitable particulate labels include particles of polymers (eg latex or polystyrene), sacs, liposomes, metal gels (eg silver colloids or gold colloids) or polystyrene dyes. Preferred is a metal gel such as silver colloid or gold colloid.

【００５１】かかる標識は、常法に従い、リガンドに化
学的或いは物理的に結合させることによって標識化リガ
ンドとして調製され、これらはまた市販品としても入手
することができる。Such a label is prepared as a labeled ligand by chemically or physically binding to the ligand according to a conventional method, and these are also available as commercial products.

【００５２】本発明で用いられる標識手段は、固相支持
体の第２領域（テスト部位及びコントロール部位を含
む）に適用されて、該領域で生じた試料中の抗体との反
応結果を検出できるように標識するものであればよく、
かかる目的を満たす限りにおいてその存在態様は特に制
限されない。例えば、本発明アッセイ装置をフロースル
ー（flow through）タイプの装置とする場合には、当該
標識手段は固相支持体とは別個のものとして、本発明の
試薬キットに含ませることができる。The labeling means used in the present invention can be applied to the second region (including the test site and the control site) of the solid phase support to detect the reaction result with the antibody in the sample generated in the region. As long as it is labeled as
The existing mode is not particularly limited as long as the object is satisfied. For example, when the assay device of the present invention is a flow through type device, the labeling means can be included in the reagent kit of the present invention as a separate component from the solid phase support.

【００５３】好ましくは、標識手段は固相支持体に脱離
可能な態様で支持固定化されており、より好ましくは固
相支持体の第２領域より上流域に脱離可能な態様で支持
固定化されているのが望ましい。一層好ましい態様は、
固相支持体の第１領域と第２領域との間に位置する領域
（以下、トレーサー領域という）に支持されるものであ
る。かかる場合、第１領域に適用された被検試料は、毛
細管移動によりトレーサー領域にはじかれ（wicked)、
そこで標識化リガンドと接触して、標的抗体／標識化リ
ガンド−複合体及び任意抗体／標識化リガンド−複合体
をそれぞれ形成する。トレーサー領域を通過後、かかる
複合体を含む被検試料は更に毛細管移動により第２領域
に移動する。第２領域内のテスト部位に配置されたリガ
ンド（抗原）は、標的抗体に特異的であり、またコント
ロール部位に配置されたリガンド（抗イムノグロブリン
抗体）は、任意抗体に特異的である。このため、毛細管
移動してきた試料中の標的抗体／標識化リガンド−複合
体はまず該テスト部位に捕捉され、次いで試料中の残り
の任意抗体／標識化リガンド−複合体（標的抗体／標識
化リガンド−複合体を含む）がコントロール部位に捕捉
される。Preferably, the labeling means is supported and immobilized on the solid support in a detachable manner, and more preferably in a detachable manner on the upstream side of the second region of the solid support. It is desirable to be A more preferred embodiment is
It is supported by a region (hereinafter referred to as a tracer region) located between the first region and the second region of the solid phase support. In such a case, the test sample applied to the first region is wicked to the tracer region by capillary movement,
It then contacts the labeled ligand to form the target antibody / labeled ligand-complex and any antibody / labeled ligand-complex, respectively. After passing through the tracer region, the test sample containing the complex further moves to the second region by capillary movement. The ligand (antigen) located at the test site in the second region is specific to the target antibody, and the ligand located at the control site (anti-immunoglobulin antibody) is specific to any antibody. Therefore, the target antibody / labeled ligand-complex in the sample that has migrated by capillaries is first captured at the test site, and then any remaining antibody / labeled ligand-complex (target antibody / labeled ligand) in the sample is captured. -Comprising the complex) is captured at the control site.

【００５４】かかる固相支持体のトレーサー領域は、被
検試料を標的抗体及び任意抗体とともに第１領域から第
２領域へと毛細管移動により輸送でき、かつ上述する標
識化リガンドをかかる毛細管移動に伴って脱離可能なよ
うに支持固定できる基材からなるものであれば特に制限
されない。通常、多孔性基材からなり、例えばポリエチ
レン、グラスファイバー、レーヨン、ナイロン、又は紙
等を含むセルロース系材料等を例示することができる。
好ましくは、非特異的な吸着を呈しにくい材料であり、
例えば所望によりポリビニルアルコール（ＰＶＡ）で処
理されていてもよいグラスファイバー等を挙げることが
できる。The tracer region of such a solid support is capable of transporting the test sample together with the target antibody and the optional antibody from the first region to the second region by capillary migration, and the labeled ligand described above is accompanied by such capillary migration. There is no particular limitation as long as it is composed of a base material that can be supported and fixed so that it can be detached. Usually, it is made of a porous substrate, and examples thereof include cellulosic materials such as polyethylene, glass fiber, rayon, nylon, and paper.
Preferably, a material that is unlikely to exhibit non-specific adsorption,
For example, there may be mentioned glass fibers which may be treated with polyvinyl alcohol (PVA) if desired.

【００５５】本発明の好ましい態様には、固相支持体
に、上記のトレーサー領域と第２領域内のテスト部位と
が一定の間隔をおいて配置されてなるものが含まれる。
このように、トレーサー領域とテスト部位との間に一定
の領域が設けられることにより、トレーサー領域で標識
化リガンドと接触した被検試料は、第２領域のテスト部
位に到達するに先だって、かかる領域で抗体と標識化リ
ガンドとが混合され、抗体と標識化リガンドとの結合反
応が促進される。つまり、かかる領域は、試料中の標的
抗体及び任意抗体がそれぞれテスト部位及びコントロー
ル部位に接触する前に、該標的抗体及び任意抗体と標識
化リガンドとの結合のためのインキュベート領域（時
間、空間）を提供するものである。A preferred embodiment of the present invention includes a solid-phase support in which the tracer region and the test site in the second region are arranged at a constant interval.
Thus, by providing a certain region between the tracer region and the test site, the test sample that has come into contact with the labeled ligand in the tracer region can reach such a region before reaching the test site in the second region. The antibody and the labeled ligand are mixed with each other, and the binding reaction between the antibody and the labeled ligand is promoted. That is, such a region is an incubation region (time, space) for binding the target antibody and the arbitrary antibody in the sample to the labeled ligand before contacting the test site and the control site, respectively. Is provided.

【００５６】更に、本発明の固相支持体は、第２領域に
続いて第３領域を有していても良い。Further, the solid phase support of the present invention may have a third region following the second region.

【００５７】被検試料は第１領域、必要であればトレー
サー領域を通じて、第２領域に接触後、毛細管移動によ
って第２領域を通過して該第３領域へ移動し続ける。す
なわち、かかる第３領域は第２領域から流入する液体を
受ける領域として機能し、第２領域と毛細管移動により
液体伝達されている。The test sample contacts the second region through the first region, if necessary the tracer region, and then continues to move to the third region through the second region by capillary movement. That is, the third region functions as a region that receives the liquid that flows in from the second region, and the liquid is transmitted to the second region by capillary movement.

【００５８】第３領域は、通常少なくとも第２領域で結
合しなかった液体含有物質を受けるために機能するもの
であればよいが、更に、液体試料の毛細管流（すなわ
ち、液体の先端）が、固相支持体上の予め決定された完
了ゾーンに進んでアッセイの完了を知らせる部位を有す
ることもできる。The third region may be one that normally functions to receive the liquid-containing substance that has not been bound at least in the second region, and further, the capillary flow of the liquid sample (that is, the tip of the liquid) is It is also possible to have a site that goes to a predetermined completion zone on the solid support to signal the completion of the assay.

【００５９】かかる目的で、固相支持体には、第２領域
の下流域にエリスロシンＢ、サフラニンＯまたはフェノ
ールレッド等の水溶性染料を含む可視インディケーター
ゾーンを設けることもできる。この場合、被検試料の液
体先端が第２領域を横切り、そして第３領域に入る際に
上記インディケーターゾーンを通って流れ、そこに位置
する染料は被検試料（液体）の毛細管移動により下流域
に運ばれ、そこで被検試料が第１領域、トレーサー領域
及び第２領域（テスト部位、コントロール部位）を通過
して、アッセイが完了したことを検出確認することがで
きる。For this purpose, the solid support may be provided with a visible indicator zone containing a water-soluble dye such as erythrosin B, safranine O or phenol red in the downstream region of the second region. In this case, when the liquid tip of the sample to be tested crosses the second region, and when it enters the third region, it flows through the above-mentioned indicator zone, and the dye located there is moved downward by capillary movement of the sample to be tested (liquid). It is carried to the watershed where the test sample passes through the first region, the tracer region and the second region (test site, control site), and it can be detected and confirmed that the assay is completed.

【００６０】第３領域は、被検試料（液体）を吸水でき
る基材からなるものであれば特に制限されず、例えばポ
リエチレン、レーヨン、ナイロン、又は紙等を含むセル
ロース系材料等を例示することができる。好ましくは紙
等を含むセルロース系材料である。The third region is not particularly limited as long as it is made of a substrate capable of absorbing a test sample (liquid), and examples thereof include cellulosic materials including polyethylene, rayon, nylon, paper and the like. You can Cellulosic materials including paper and the like are preferable.

【００６１】以下、本発明を、抗体アッセイ装置及びそ
の部品の好ましい態様を添付する図面を参照しながら説
明する。ただし該図面で示す装置は本発明の一態様にす
ぎず、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。The present invention will now be described with reference to the accompanying drawings which show preferred embodiments of the antibody assay device and its components. However, the device shown in the drawings is only one embodiment of the present invention, and the present invention is not limited to these.

【００６２】図１は、本発明の装置に含まれるストリッ
プ形状の固相支持体（６０×５mm）の略図である。図１
中、記号１は被検試料が適用され該被検試料が接触する
第１領域（１６×５mm、厚さ０．９２mm）であり、記号
２は標識化リガンド（例えば、金コロイド標識化抗ヒト
ＩｇＧ抗体）が支持されているトレーサー領域（５×５
mm、厚さ０．７９mm）であり、記号３は被検試料中の抗
体と反応し、その結果を表示する第２領域（１８mm×５
mm、厚さ０．１mm）であり、記号４は第１領域から第２
領域を経て移動してきた被検試料を吸収する第３領域
（２２×５mm、厚さ１．４６mm）である。FIG. 1 is a schematic diagram of a strip-shaped solid phase support (60 × 5 mm) included in the device of the present invention. Figure 1
In the above, symbol 1 is a first region (16 × 5 mm, thickness 0.92 mm) to which the test sample is applied, and the test sample is in contact, and symbol 2 is a labeled ligand (eg, gold colloid labeled anti-human). Tracer region (5 x 5) supporting IgG antibody
mm, thickness 0.79 mm), and the symbol 3 reacts with the antibody in the test sample and displays the result of the second area (18 mm × 5)
mm, thickness 0.1 mm), and the symbol 4 is from the first region to the second region.
It is a third region (22 × 5 mm, thickness 1.46 mm) that absorbs the test sample that has moved through the region.

【００６３】第１領域の厚さは通常０．２〜２mm、好ま
しくは０．８〜１．２mmであり、トレーサー領域の厚さ
は通常０．２〜１．５mm、好ましくは０．５〜１mmであ
り、第２領域の厚さは通常０．０３〜０．２mm、好まし
くは０．０８〜０．１２mmであり、第３領域の厚さは通
常０．５〜３mm、好ましくは１〜２mmを挙げることがで
きるが、これらに何ら制限されることはない。The thickness of the first region is usually 0.2-2 mm, preferably 0.8-1.2 mm, and the thickness of the tracer region is usually 0.2-1.5 mm, preferably 0.5-. The thickness of the second region is usually 0.03 to 0.2 mm, preferably 0.08 to 0.12 mm, and the thickness of the third region is usually 0.5 to 3 mm, preferably 1 to 2 mm can be mentioned, but there is no limitation to these.

【００６４】第２領域（３）内には、標的抗体に特異的
に結合するリガンドが支持固定化されてなるテスト部位
（テストライン、約１×５mm）（記号５）と任意抗体に
結合するリガンド（抗ヒトイムノグロブリン抗体）が支
持固定化されてなるコントロール部位（コントロールラ
イン、約１×５mm）（記号６）とが配置される。テスト
部位（５）はトレーサー領域（２）から一定の間隔（約
６mm程度）を置いて、またコントロール部位（６）はテ
スト部位（５）から一定の間隔（約６mm程度）を置いて
配置される。テスト部位は、被検試料中の標的抗体と特
異的に反応し、標識の存在下でその標的抗体の存在の有
無を表示するように機能し、コントロール部位は使用し
た被検試料が適性であったか否かを標識の存在下で表示
するように機能する。In the second region (3), a test site (test line, about 1 × 5 mm) (symbol 5) in which a ligand that specifically binds to a target antibody is supported and immobilized and binds to an arbitrary antibody A control site (control line, about 1 × 5 mm) (symbol 6) on which a ligand (anti-human immunoglobulin antibody) is supported and immobilized is arranged. The test site (5) is placed at a fixed distance (about 6 mm) from the tracer region (2), and the control site (6) is placed at a fixed distance (about 6 mm) from the test site (5). It The test site reacts specifically with the target antibody in the test sample and functions to display the presence or absence of the target antibody in the presence of the label, and whether the test site used was appropriate for the control site It functions to display whether or not there is a sign.

【００６５】ストリップの固相支持体を構成する、第１
領域，トレーサー領域，第２領域及び第３領域の各部材
（基材）は、試料が移動するストリップの長手方向にそ
れぞれ接合されていればよく、その接合態様を問わない
が、好適には、第１領域の長手方向の先端域とトレーサ
ー領域の基端域、トレーサー領域の先端域と第２領域の
基端域、並びに第２領域の先端域と第３領域の基端域が
積層された状態で接合されていることが望ましい。より
好ましくは図１に示されるように、第１領域の長手方向
の先端域がトレーサー領域の基端域の上に積層され、ま
たトレーサー領域の長手方向の先端域が第２領域の基端
域の上に積層される態様であり、更に第３領域の基端域
が第２領域の先端域の上に積層されていてもよい。かか
る接合態様を有することによって、第１領域に付された
試料はストリップの長手方向にスムーズに移動すること
ができる。積層域の長手方向幅は特に制限されないが、
できるだけ小さい方が望ましく、好ましくは０．５〜２
ｍｍ、より好ましくは０．８〜１．２ｍｍ程度を例示す
ることができる。なお、積層部の各領域の上下位置はこ
れに限定されず、その逆であってもよい。The first, constituting the solid support of the strip,
Each member (base material) of the region, the tracer region, the second region, and the third region may be joined in the longitudinal direction of the strip on which the sample moves, and the joining mode is not limited, but preferably, The longitudinal region of the first region and the proximal region of the tracer region, the distal region of the tracer region and the proximal region of the second region, and the distal region of the second region and the proximal region of the third region are laminated. It is desirable that they are bonded together. More preferably, as shown in FIG. 1, the longitudinal distal region of the first region is laminated on the proximal region of the tracer region, and the longitudinal distal region of the tracer region is proximal region of the second region. And the base end region of the third region may be further stacked on the tip end region of the second region. By having such a joining mode, the sample attached to the first region can move smoothly in the longitudinal direction of the strip. The longitudinal width of the laminated area is not particularly limited,
It is desirable to be as small as possible, preferably 0.5 to 2
mm, and more preferably about 0.8 to 1.2 mm. The upper and lower positions of each region of the laminated portion are not limited to this, and may be reversed.

【００６６】次に図２に基づいて、本発明装置によるア
ッセイ原理を説明する。Next, the assay principle of the device of the present invention will be described with reference to FIG.

【００６７】アッセイにおいて、標的抗体を含む疑いの
ある被検試料は、まず固相支持体の第１領域（１）に適
用される。In the assay, the test sample suspected of containing the target antibody is first applied to the first region (1) of the solid support.

【００６８】なお、被検試料は、尿等の体液をそのまま
使用しても、また適当な希釈溶液で希釈して使用しても
よい。希釈溶液としては、特に制限されず、例えばｐＨ
５〜９程度、好ましくはｐＨ６．５〜８．５程度の範囲
で緩衝能のある緩衝剤（例えばクエン酸緩衝液、燐酸緩
衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等）、
界面活性剤などを含むことができる。As the test sample, body fluid such as urine may be used as it is, or may be diluted with an appropriate diluting solution before use. The diluted solution is not particularly limited, and for example, pH
A buffering agent having a buffering capacity in the range of about 5 to 9, preferably about pH 6.5 to 8.5 (eg, citrate buffer, phosphate buffer, Tris buffer, acetate buffer, borate buffer, etc.),
Surfactants and the like can be included.

【００６９】また、抗原抗体反応を大腸菌に由来する成
分の存在下で行うことにより、非特異的検出が抑制され
偽陽性検出が低減されることから、好ましくは、更に大
腸菌由来成分を含む希釈溶液を用いることが望ましい。
ここで大腸菌由来成分は、大腸菌（Escherichia coli）
に由来する成分であれば特に制限されず、例えば、その
蛋白質成分、糖質成分、脂質成分又はその混合成分であ
ることができる。好ましくは、大腸菌の可溶性抽出物、
またはリポ多糖（ＬＰＳ）を例示することができる。上
記大腸菌由来成分の調製方法は、特に制限されず各種の
方法によることができる。通常、任意の大腸菌を該大腸
菌の生育に適した培地を用いて生育増殖させ、得られた
菌体を集菌して、超音波破砕機等を利用した物理的手段
により或いは界面活性剤等を用いて破砕若しくは可溶化
することにより可溶性成分（可溶性抽出物）として調製
することができる。また、ＬＰＳは、有機溶媒（例え
ば、フェノール、クロロホルム及びエーテル等の単溶媒
又は２若しくは３種の混合溶媒使用）抽出により調製す
ることもでき、更に遺伝子工学的手法により人工的に調
製することもできる。また、これらは簡便には市販品を
使用することもできる。Further, by carrying out the antigen-antibody reaction in the presence of a component derived from Escherichia coli, non-specific detection is suppressed and false positive detection is reduced. Therefore, preferably, a diluted solution further containing a component derived from Escherichia coli. Is preferred.
Here, the component derived from Escherichia coli is Escherichia coli.
There is no particular limitation as long as it is a component derived from the above, and it may be, for example, a protein component, a sugar component, a lipid component or a mixed component thereof. Preferably, a soluble extract of E. coli,
Alternatively, lipopolysaccharide (LPS) can be exemplified. The method for preparing the Escherichia coli-derived component is not particularly limited and various methods can be used. Usually, any Escherichia coli is grown and proliferated using a medium suitable for the growth of the Escherichia coli, and the obtained bacterial cells are collected and then treated by physical means such as an ultrasonic crusher or with a surfactant or the like. It can be prepared as a soluble component (soluble extract) by crushing or solubilizing it. LPS can also be prepared by extraction with an organic solvent (for example, a single solvent such as phenol, chloroform and ether, or the use of a mixed solvent of 2 or 3 kinds), or can be artificially prepared by a genetic engineering method. it can. Moreover, these can also conveniently use a commercial item.

【００７０】希釈溶液中に配合する大腸菌由来成分の量
は、特に制限はされないが、反応系、すなわちテスト領
域におけるリガンド（抗原）１μｇあたり、０．１〜１
００μｇ程度、好ましくは０．５〜５０μｇ程度の割合
となるように調製されることが好ましい。The amount of the Escherichia coli-derived component mixed in the diluted solution is not particularly limited, but is 0.1 to 1 per 1 μg of the ligand (antigen) in the reaction system, that is, the test area.
It is preferable to prepare such that the ratio is about 00 μg, preferably about 0.5 to 50 μg.

【００７１】また被検試料に配合される大腸菌由来成分
の量として、通常５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは５〜５
０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０μｇ／ｍの範
囲を例示することができる。なお、５０μｇ／ｍｌ以上
配合することは特に制限しないが、それ以下の配合で本
発明の効果は達成される。The amount of Escherichia coli-derived component to be added to the test sample is usually 5 μg / ml or more, preferably 5 to 5
A range of 0 μg / ml, more preferably 10 to 30 μg / m can be exemplified. It should be noted that the compounding amount of 50 μg / ml or more is not particularly limited, but the effect of the present invention can be achieved with a compounding amount of less than that.

【００７２】被検試料を第１領域（１）に適用すること
によって第１領域は湿潤する。適用された被検試料は、
第１領域（１）を通って毛細管移動によりトレーサー領
域（２）に入り、ここでトレーサー領域内に脱離可能な
状態で支持されている標識化リガンド（金コロイド標識
化抗ヒトＩｇＧ抗体）と接触し反応する。The first area is wetted by applying the test sample to the first area (1). The test sample applied is
A labeled ligand (gold colloid-labeled anti-human IgG antibody) which is supported in the tracer region (2) by detachment in the tracer region by capillary movement through the first region (1); Contact and react.

【００７３】適性な被検試料を使用した場合において、
試料中に標的抗体が含まれている場合は、標的抗体と試
料に含まれる任意抗体はいずれも、トレーサー領域
（２）において上記標識化リガンドに結合して、それぞ
れ標的抗体／標識化リガンド−複合体及び任意抗体／標
識化リガンド−複合体を形成する。被検試料がトレーサ
ー領域（２）を通過後、形成された各複合体又は複合体
を形成していない標識化リガンドは被検試料と共にトレ
ーサー領域（２）から下流域に輸送される。好適な態様
において、未だ複合体を形成していない標識化リガンド
は、トレーサー領域（２）から第２領域（３）のテスト
部位（５）に接触するまでの間に、抗体を含む被検試料
と共に毛細管移動しながら、複合体形成に十分な時間
（空間）を与えられる。次いで第２領域のテスト部位
（５）に到達すると、まず該部位（５）において被験試
料に含まれる標的抗体／標識化リガンド−複合体が、該
部位に支持されてなるリガンドと結合し、固定化され
る。次いで、被検試料は更に毛細管移動により下流域に
移動して、コントロール部位（６）において任意抗体／
標識化リガンド−複合体が該部位のリガンド（抗イムノ
グロブリン抗体）と結合し、固定化される。次に、第２
領域のテスト部位（５）及びコントロール部位（６）に
固定化された複合体を、その標識化リガンドの標識成分
に基づいて検出することによってアッセイ結果を陽性と
して示すことができる。それに対して、被検試料として
標的抗体を含まない試料を用いた場合は、テスト部位
（５）に結合する標的抗体／標識化リガンド−複合体が
形成されないため、該テスト部位（５）で標識は検出さ
れない（陰性）。When an appropriate test sample is used,
When the sample contains the target antibody, both the target antibody and the arbitrary antibody contained in the sample bind to the labeled ligand in the tracer region (2) to form the target antibody / labeled ligand-complex, respectively. Form the body and any antibody / labeled ligand-complex. After the test sample passes through the tracer region (2), each complex formed or the labeled ligand that does not form the complex is transported from the tracer region (2) to the downstream region together with the test sample. In a preferred embodiment, the labeled ligand which has not yet formed a complex is a test sample containing an antibody during the period from contacting the test site (5) of the second region (3) with the tracer region (2). While moving together with the capillaries, sufficient time (space) for complex formation is given. Next, when the test site (5) in the second region is reached, first, the target antibody / labeled ligand-complex contained in the test sample at the site (5) binds to the ligand supported by the site and is immobilized. Be converted. Then, the test sample is further moved to the downstream region by capillary movement, and at the control site (6), an arbitrary antibody /
The labeled ligand-complex binds to the ligand at the site (anti-immunoglobulin antibody) and is immobilized. Then the second
The assay result can be shown as positive by detecting the complex immobilized at the test site (5) and the control site (6) of the region based on the labeling component of its labeled ligand. On the other hand, when a sample containing no target antibody is used as the test sample, the target antibody / labeled ligand-complex that binds to the test site (5) is not formed, and therefore the test site (5) is labeled with the test site (5). Is not detected (negative).

【００７４】ところでテスト部位（５）で表示される陰
性結果には、試料の濃度が薄い（すなわち、試料中の総
抗体量が少ない）ことに起因する陰性（偽陰性）結果と
試料中に標的抗体が存在しない陰性（真性陰性）結果の
両者が包含される。かかる陰性の別はテスト部位（５）
の結果だけでは判定することはできないが、偽陰性の場
合は、コントロール部位（６）に結合する任意抗体／標
識化リガンド−複合体自体が形成されないため、コント
ロール領域が陰性を示し、真性陰性の場合は、任意抗体
／標識化リガンド−複合体が形成されるため、コントロ
ール領域が陽性を示し、かかるコントロール部位（６）
の陰性及び陽性の相違によって、テスト部位（５）の陰
性結果が偽陰性であるのか真性陰性であるのかを区別す
ることができる。更に、失活した標識化リガンドが採用
された場合等、適切な装置で適切に測定が実施されなか
った場合には、同様にコントロール部位（６）が陰性を
示すことにより、これらの原因による偽陰性検出をも防
ぐことができる。By the way, the negative result displayed at the test site (5) includes a negative (false negative) result due to a low concentration of the sample (that is, a small total antibody amount in the sample) and a target in the sample. Both negative results for the absence of antibody (true negative) are included. Test site (5)
Although it is not possible to make a determination based on the result of 1. alone, in the case of a false negative, the control region shows a negative and a true negative because the arbitrary antibody / labeled ligand-complex which binds to the control site (6) is not formed. In this case, since the arbitrary antibody / labeled ligand-complex is formed, the control region is positive, and the control site (6)
The difference between the negative and the positive of the test site (5) makes it possible to distinguish whether the negative result of the test site (5) is a false negative or a true negative. Further, when the labeled ligand that has been inactivated is adopted, or when the measurement is not performed properly with an appropriate device, the control site (6) also shows a negative result, which causes false causes due to these causes. Negative detection can also be prevented.

【００７５】あらゆる未結合抗体、標識化リガンドなど
を含む液体試料は毛細管移動により更に第２領域（３）
から下流域に位置する第３領域（４）に移動し続ける。
所望により、インディケーターゾーンを設けることがで
き、この場合、液体の先端はインディケーターゾーンか
ら完了ゾーンへ染料を運び、該液体染料が第３領域を通
過してアッセイが終了したことを示す。The liquid sample containing any unbound antibody, labeled ligand, etc. was further transferred to the second region (3) by capillary migration.
To the third region (4) located in the downstream region.
If desired, an indicator zone can be provided where the liquid tip carries dye from the indicator zone to the completion zone, indicating that the liquid dye has passed through the third region and the assay is complete.

【００７６】前述する固相支持体は、使用しやすいよう
にアッセイ装置の形態でパッケージングされていること
が好ましい。The solid support described above is preferably packaged in the form of an assay device for ease of use.

【００７７】水平方向で使用される該アッセイ装置の例
を、図３に示す。第１領域（１）、トレーサー領域
（２）、第２領域（３）（テスト部位（５）とコントロ
ール部位（６）を含む）、第３領域（４）を含む固相支
持体（Ａ）は、適当な材料からなるハウジング内（Ｂ）
に置かれる。かかるハウジング材料としては、成形可能
なプラスチック、例えばポリスチレン等が好ましいが、
他の材料、例えばガラスや金属や紙などを使用すること
も可能である。上記ハウジングは、幾つかの開口部を有
する上部セクション（７）と下部セクション（８）とか
らなり、固相支持体はハウジングの下部セクション上に
配置され、その上から上部セクションにより覆われる。
ハウジングの上部セクションの開口部（９）及び（１
０）は、固相支持体の各領域の配置に沿って整列され、
それぞれ固相支持体の第１領域（１）及び第２領域
（３）に対応している。An example of the assay device used in the horizontal orientation is shown in FIG. Solid phase support (A) including a first region (1), a tracer region (2), a second region (3) (including a test site (5) and a control site (6)), and a third region (4) In the housing made of suitable material (B)
Placed in. As the housing material, a moldable plastic such as polystyrene is preferable,
Other materials such as glass, metal or paper can also be used. The housing consists of an upper section (7) with several openings and a lower section (8), the solid phase support being arranged on the lower section of the housing and covered from above by the upper section.
The openings (9) and (1 in the upper section of the housing
0) are aligned along the arrangement of each region of the solid support,
Each corresponds to the first region (1) and the second region (3) of the solid support.

【００７８】開口部（９）により支持体の第１領域
（１）に試料を適用することが可能となる（試料添加
窓）。開口部（９）は、該開口部の周辺に一段高い側面
を有していることが好ましく、かかる側面はウエルを形
成して液体試料が支持体の第１領域に滴下され浸透する
ことを促進する。なお、被検試料を固相支持体の第１領
域に接触させる方法は、特に制限されないが、装置の試
料添加窓（９）から固相支持体平面に対して垂直となる
ようにまっすぐ滴下することが好ましい。The opening (9) makes it possible to apply the sample to the first region (1) of the support (sample addition window). The opening (9) preferably has a raised side surface around the opening, and the side surface forms a well to promote the liquid sample to be dropped and permeated into the first region of the support. To do. The method of bringing the test sample into contact with the first region of the solid phase support is not particularly limited, but is dropped straight from the sample addition window (9) of the device so as to be perpendicular to the plane of the solid phase support. It is preferable.

【００７９】開口部（１０）は、固相支持体の第２領域
のテスト部位及びコントロール部位が目視できるように
配置され、これによりテスト部位への標識化リガンド／
標的抗体−複合体の結合の有無、及びコントロール部位
への標識化リガンド／任意抗体−複合体の結合の有無を
視覚によって検出可能となる（検出窓、判定窓）。な
お、開口部（１０）は、必ずしもテスト部位とコントロ
ール部位との双方を含むように開口している必要はな
く、固相支持体のテスト部位とコントロール部位とが別
個の開口部によって２つの検出窓を形成するものであっ
てもよい。The opening (10) is arranged so that the test site and the control site in the second region of the solid phase support can be visually observed, whereby the labeled ligand / the test site /
The presence or absence of binding of the target antibody-complex and the presence or absence of binding of the labeled ligand / arbitrary antibody-complex to the control site can be visually detected (detection window, determination window). The opening (10) does not necessarily have to be opened so as to include both the test site and the control site, and the test site and the control site of the solid-phase support may be separated by two separate openings. It may form a window.

【００８０】本発明のアッセイ装置によれば、通常４５
℃以下、好ましくは４〜４０℃、より好ましくは２５〜
４０℃程度の温度条件下で、被検試料適用後、数分〜３
０分、好ましくは５〜２０分放置することによって、被
検試料中の標的抗体の存在の有無及び／又はその量を精
度よくアッセイすることができる。According to the assay device of the present invention, usually 45
℃ or less, preferably 4 ~ 40 ℃, more preferably 25 ~
A few minutes to 3 after applying the test sample under a temperature condition of about 40 ° C.
By leaving it for 0 minutes, preferably 5 to 20 minutes, the presence or absence and / or the amount of the target antibody in the test sample can be assayed accurately.

【００８１】上記本発明の抗体アッセイ装置を用いて抗
体アッセイを行うにあたっては、かかる装置を含む試薬
キットを利用することが簡便である。When carrying out an antibody assay using the above-described antibody assay device of the present invention, it is convenient to use a reagent kit containing such a device.

【００８２】本発明は、前記する抗体アッセイを実施す
る為の試薬キットをも提供するものである。The present invention also provides a reagent kit for carrying out the above-mentioned antibody assay.

【００８３】該キットは、前記する抗体アッセイ装置を
必須成分として含有するものであるが、更に前述するよ
うな検体希釈液等の各種試薬、並びにスポイトや被検試
料を希釈するために使用されるアンプル（チューブ）等
の付属品を含んでいてもよい。The kit contains the above-mentioned antibody assay device as an essential component, and is further used for diluting various reagents such as the above-mentioned specimen diluting solution, a dropper and a test sample. Accessories such as ampoules (tubes) may be included.

【００８４】なお、本発明には下記の態様が含まれる； （１）少なくとも (a)被検試料を接触させる第１領域及
び (b)該被検試料中の抗体を反応させる第２領域を、被
検試料が毛細管現象により該第１領域から第２領域に輸
送されるように設けてなる固相支持体、並びに第２領域
での反応結果を検出するための標識手段を含有するアッ
セイ装置であって、上記(b)第２領域に、(i)アッセイ対
象である標的抗体を補足するリガンドを固定化したテス
ト部位と (ii)被検試料中の任意抗体を捕捉するリガン
ドを固定化したコントロール部位とを有することを特徴
とする抗体アッセイ装置： （２）テスト部位に固定化されたリガンドが、被検試料
中の標的抗体に対する抗原である（１）記載の抗体アッ
セイ装置： （３）コントロール部位に固定化されたリガンドが、被
検試料中の任意抗体を捕捉する抗ヒトイムノグロブリン
抗体である（１）又は（２）に記載の抗体アッセイ装
置： （４）標識手段として、標的抗体及び任意抗体のいずれ
にも結合する標識化されたリガンドを有する（１）乃至
（３）のいずれかに記載の抗体アッセイ装置： （５）標識手段が、標的抗体及び任意抗体のいずれにも
結合する標識化されたリガンドであって、該標識化リガ
ンドは固相支持体の第２領域より上流域に脱離可能に支
持されており、被検試料と接触すると該試料中の標的抗
体及び任意抗体と反応してそれぞれ標的抗体／標識化リ
ガンド−複合体及び任意抗体／標識化リガンド−複合体
を形成し、毛細管現象によって第２領域に輸送されてお
のおのテスト部位及びコントロール部位に結合するもの
である、（４）記載の抗体アッセイ装置。The present invention includes the following aspects: (1) at least (a) a first region for contacting a test sample and (b) a second region for reacting an antibody in the test sample. An assay device comprising a solid phase support provided so that a test sample is transported from the first region to the second region by capillarity, and a labeling means for detecting a reaction result in the second region In the above (b) second region, (i) a test site on which a ligand that complements the target antibody to be assayed is immobilized, and (ii) a ligand that captures an arbitrary antibody in the test sample are immobilized. (2) The antibody assay device according to (1), wherein the ligand immobilized at the test site is an antigen for the target antibody in the test sample: (3) ) Re-fixed on the control site Gand is an anti-human immunoglobulin antibody that captures an arbitrary antibody in a test sample (1) or the antibody assay device according to (2): (4) As a labeling means, both a target antibody and an arbitrary antibody The antibody assay device according to any one of (1) to (3), which has a labeled ligand to be bound: (5) The labeling means is a labeled ligand that binds to both the target antibody and any antibody. The labeled ligand is detachably supported upstream of the second region of the solid support, and when contacted with a test sample, the labeled ligand reacts with a target antibody and an arbitrary antibody in the sample to target them. Forming an antibody / labeled ligand-complex and an arbitrary antibody / labeled ligand-complex and binding to each test site and control site transported to the second region by capillarity, 4) antibody assay device according.

【００８５】（６）標識化リガンドが、固相支持体の第
１領域と第２領域との間に位置する領域（トレーサー領
域）に支持されてなる（５）記載の抗体アッセイ装置： （７）標的抗体及び任意抗体のいずれにも結合する標識
化リガンドが、標識化された抗ヒトイムノグロブリン抗
体である（４）乃至（６）のいずれかに記載の抗体アッ
セイ装置： （８）上記抗ヒトイムノグロブリン抗体が、イムノグロ
ブリンＧのＦｃ領域に結合特異性を有する抗ＩｇＧ抗体
である、（７）記載の抗体アッセイ装置： （９）固相支持体が、第１領域及び第２領域に続いて更
に吸収領域を有し、これにより第１領域から第２領域に
輸送された被検試料が毛細管現象によりさらに吸収領域
に輸送される（１）乃至（８）のいずれかに記載の抗体
アッセイ装置： （10）第２領域のテスト部位における標的抗体の結合反
応が大腸菌由来成分の存在下で行われる（１）乃至
（９）のいずれかに記載の抗体アッセイ装置。(6) The antibody assay device according to (5), wherein the labeled ligand is supported on a region (tracer region) located between the first region and the second region of the solid phase support: (7) The labeled ligand that binds to both the target antibody and any antibody is a labeled anti-human immunoglobulin antibody (4) to (6). The antibody assay device according to any one of (4) to (8) above. The antibody assay device according to (7), wherein the human immunoglobulin antibody is an anti-IgG antibody having binding specificity to the Fc region of immunoglobulin G: (9) The solid phase support is provided in the first region and the second region. Subsequently, the antibody according to any one of (1) to (8), which further has an absorption region, whereby the test sample transported from the first region to the second region is further transported to the absorption region by capillarity. Assay device: ( 10) The antibody assay device according to any one of (1) to (9), wherein the binding reaction of the target antibody at the test site in the second region is performed in the presence of a component derived from Escherichia coli.

【００８６】（11）被検試料が尿である（１）乃至（1
0）のいずれかに記載の抗体アッセイ装置： （12）（１）乃至（11）のいずれかの抗体アッセイ装置
を含む抗体アッセイ用キット： （13）被検試料を（１）乃至（９）のいずれかに記載の
抗体アッセイ装置の第１領域に接触させ、第２領域のコ
ントロール部位が発色している条件のもとで、第２領域
のテスト部位の発色の有無を検出することからなる、被
検試料中の標的抗体の固相アッセイ方法： （14）被験試料が尿である（13）記載の標的抗体の固相
アッセイ方法： （15）抗体アッセイ装置の第２領域のテスト部位におけ
る標的抗体の結合反応を大腸菌由来成分の存在下で行う
ことを特徴とする（13）又は（14）記載の標的抗体の固
相アッセイ方法。(11) The test sample is urine (1) to (1)
The antibody assay device according to any one of 0): (12) An antibody assay kit including the antibody assay device according to any one of (1) to (11): (13) A test sample (1) to (9) And detecting the presence / absence of color development at the test site of the second region under the condition that the control site of the second region is colored. Solid phase assay method of target antibody in test sample: (14) solid sample assay method of target antibody according to (13), wherein test sample is urine: (15) at test site in second region of antibody assay device The solid phase assay method for a target antibody according to (13) or (14), wherein the binding reaction of the target antibody is performed in the presence of a component derived from Escherichia coli.

【００８７】[0087]

【実施例】以下、本発明の内容を以下の実施例を用いて
具体的に説明する。以下の実施例は、本発明の抗体アッ
セイ装置の各部品及びそれを利用した装置の好ましい製
造及び使用方法、並びにそれを用いたアッセイ手順を記
載するものである。ただし、これらの実施例は本発明の
一態様にすぎず、本発明はこれらの実施例に何ら限定さ
れるものではない。EXAMPLES The contents of the present invention will be specifically described below with reference to the following examples. The following examples describe each component of the antibody assay device of the present invention, preferred methods of making and using the device utilizing the same, and assay procedures using the same. However, these examples are merely one aspect of the present invention, and the present invention is not limited to these examples.

【００８８】実施例１ （１）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原の調製 Ｈ．ピロリ菌（臨床分離株）をブルセラアガー培地（ベ
クトン社）で４８時間培養（10% CO2, 5% O2, 37℃）
し、冷ＰＢＳで集菌した。冷ＰＢＳで５回遠心洗浄後、
菌体濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように冷ＰＢＳを加
え、撹拌下、等量の冷０．２％トリトンＸ−１００のＰ
ＢＳ溶液を加えた。５分間撹拌後遠心して得た上清を
Ｈ．ピロリ抗原溶液とし、−８０℃で保存した。 Example 1 (1) H. Preparation of P. pylori antigen Helicobacter pylori (clinical isolate) is cultured in Brucella agar medium (Becton) for 48 hours (10% CO 2 , 5% O 2 , 37 ° C)
The cells were harvested with cold PBS. After centrifugal washing 5 times with cold PBS,
Cold PBS was added so that the cell concentration would be 100 mg / ml, and an equal volume of cold 0.2% Triton X-100 P was added under stirring.
BS solution was added. After stirring for 5 minutes and centrifuging, the supernatant obtained was washed with H. It was used as a H. pylori antigen solution and stored at -80 ° C.

【００８９】（２）標識抗ヒトＩｇＧ抗体含有乾燥グラ
スファイバーの調製 グラスファイバーシート（５.０mm×２６０mm、厚さ
０．８mm、Whatman社製）に直径４０nmの金コロイド標
識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体溶液を１ｍｌ加えて
一夜乾燥して調製した。これは、使用するまで乾燥剤と
ともに室温で保存した。(2) Preparation of Labeled Anti-Human IgG Antibody-Containing Dry Glass Fiber A glass fiber sheet (5.0 mm × 260 mm, thickness 0.8 mm, manufactured by Whatman) was coated with a colloidal gold anti-human IgG (Fc-specific) having a diameter of 40 nm. It was prepared by adding 1 ml of antibody solution and drying overnight. It was stored at room temperature with desiccant until used.

【００９０】（３）メンブレンの調製 上記（１）で調製したＨ．ピロリ抗原溶液（３ｍｇ／ｍ
ｌ）及び抗ヒトＩｇＧ抗体（０．３ｍｇ／ｍｌ）のそれ
ぞれを、ニトロセルロース膜（２６.５ｍｍ×２６０ｍ
ｍ、厚さ０．１ｍｍ；アドバンス・マイクロディバイス
社製）に、図４に示すように一定の間隔を置いて引いた
ライン状に噴霧（１.５μｌ／ｃｍ）し、３７℃で１２
０分間乾燥した。乾燥後、スキムミルクを含むボラック
ス（Borax）緩衝液（ｐＨ8.2）に３０分間浸漬して洗浄
した。３７℃で１時間乾燥し、乾燥剤とともに室温で保
存した。(3) Preparation of Membrane H. Helicobacter pylori antigen solution (3 mg / m
l) and anti-human IgG antibody (0.3 mg / ml) respectively, nitrocellulose membrane (26.5 mm x 260 m
m, thickness 0.1 mm; manufactured by Advance Micro Devices Co., Ltd.) and sprayed in a line shape (1.5 μl / cm) drawn at regular intervals as shown in FIG.
Dry for 0 minutes. After drying, it was washed by immersing it in a Borax buffer solution (pH 8.2) containing skim milk for 30 minutes. It was dried at 37 ° C. for 1 hour and stored at room temperature with a desiccant.

【００９１】（５）アセンブリー（固相支持体） 図３（Ａ)に示すように、上記メンブレン（３）、吸水
濾紙パッド（４）（２２×２６０ｍｍ、厚さ１．５ｍ
ｍ；Whatman社製）、上記標識抗体含有グラスファイバ
ー（２）及びサンプルパッド（１）（１５×２６０ｍ
ｍ、厚さ１．０ｍｍ；ろ紙、Whatman社製）を接着剤に
て貼り合わせ、５ｍｍ幅にてカットした。(5) Assembly (solid phase support) As shown in FIG. 3 (A), the membrane (3), the water absorbing filter paper pad (4) (22 × 260 mm, thickness 1.5 m).
m; manufactured by Whatman), the above-mentioned labeled antibody-containing glass fiber (2) and sample pad (1) (15 × 260 m)
m, thickness 1.0 mm; filter paper, manufactured by Whatman) was attached with an adhesive and cut into a width of 5 mm.

【００９２】これを図３（Ｂ）に示すような成形された
プラスチックハウジングの下部セクション（８）内にお
き、次いで、試料添加窓（９）及び検出窓（１０）が並
んだ２つの開口部を有するハウジングの上部セクション
（７）を支持体の上から被して下部セクション（８）と
一体化させた。This is placed in the lower section (8) of the molded plastic housing as shown in FIG. 3 (B), and then two openings are lined up with the sample addition window (9) and the detection window (10). The upper section (7) of the housing with the above was covered over the support and integrated with the lower section (8).

【００９３】実施例２ Ｈ．ピロ リ尿中抗体の測定 実施例１で調製した装置を用いて、Ｈ．ピロリ感染者
尿、同未感染者尿及び同感染者の極端に薄い尿の３種類
の尿検体におけるＨ．ピロリ抗体を測定した。 Example 2 H. Using an apparatus prepared in Measurement Example 1 pyrophosphoric Li urinary antibody, H. H. pylori in three types of urine specimens, urine of the infected person, uninfected person and extremely thin urine of the infected person. H. pylori antibody was measured.

【００９４】まず、検体希釈液（200mM Tris, 0.14M Na
Cl, 2% カゼイン, 0.5% BSA, 0.05%Tween 20, 0.1% NaN
3 (pH 7.3)、大腸菌ＬＰＳ（Gibco社製）５０μｇ／ｍ
ｌ）５００μｌに尿検体５００μｌを加えて混合し、該
混合液から６滴（約１５０μｌ）を実施例１記載の装置
の試料添加窓（９）に滴下して支持体に吸着させ、２０
分静置した。その結果、被検体として適性尿検体を使用
した場合は、検出窓（１０）のコントロール部位にピン
ク〜赤色の発色帯が出現し、一方被検体として極端に薄
い不適性尿検体を使用した場合は、検出窓（１０）のテ
スト部位及びコントロール部位はいずれも発色せず、判
定不能の結果を示した。適性尿検体を用いた場合、Ｈ．
ピロリ菌に感染していない場合は、検出窓（１０）のコ
ントロール部位のみにピンク〜赤色の発色帯が出現し、
Ｈ．ピロリ感染に関して陰性結果（真性陰性）を示し、
Ｈ．ピロリ菌に感染している場合は、検出窓（１０）の
テスト部位及びコントロール部位ともにピンク〜赤色の
発色帯が出現し、Ｈ．ピロリ感染に関して陽性結果を示
した。First, a sample diluent (200 mM Tris, 0.14M Na
Cl, 2% casein, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.1% NaN
3 (pH 7.3), E. coli LPS (manufactured by Gibco) 50 μg / m
l) 500 μl of a urine sample was added to 500 μl and mixed, and 6 drops (about 150 μl) of the mixed solution were dropped into the sample addition window (9) of the apparatus described in Example 1 to be adsorbed on the support, and 20
Let stand for a minute. As a result, when a suitable urine sample is used as the test subject, a pink to red coloring band appears at the control site of the detection window (10), while an extremely thin unsuitable urine sample is used as the test subject. The test site and the control site of the detection window (10) did not develop color, and the result was undecidable. When a suitable urine sample is used, H.
When not infected with H. pylori, a pink-red coloring band appears only in the control site of the detection window (10),
H. Negative result (true negative) for H. pylori infection,
H. When infected with H. pylori, a pink-red coloring band appears at both the test site and control site of the detection window (10), and H. A positive result was shown for H. pylori infection.

【００９５】実施例３ Ｈ．ピロ リ尿中抗体の測定 （１）実施例２の検体希釈液に配合した大腸菌ＬＰＳの
代わりに下記の方法で調製した大腸菌由来成分を使用す
る以外は、実施例２と同様にしてＨ．ピロリ尿中抗体の
測定を行った。その結果、実施例２と同様の結果が得ら
れた。ｍ （２）大腸菌由来成分の調製 大腸菌（pvc18/JM109株：宝酒造社製）をアンピシリン
含有液体ＬＢ培地（Luria-Bertani培地、日本製薬社）
で、３７℃、１８時間培養後、遠心により集菌しＰＢＳ
で２回洗浄した。菌体濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるよ
うに冷ＰＢＳを加え、超音波破砕機により破砕抽出した
（10秒×3回）。かくして得た遠心上清を大腸菌抽出蛋
白とした。 Example 3 H. Except using Escherichia coli-derived ingredient prepared by the following method instead of the pyro Li urine measuring antibodies (1) E. coli LPS formulated in sample dilution buffer of Example 2, in the same manner as in Example 2 H. The antibody in Helicobacter pylori was measured. As a result, the same result as in Example 2 was obtained. m (2) Preparation of components derived from Escherichia coli E. coli (pvc18 / JM109 strain: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) is a liquid LB medium containing ampicillin (Luria-Bertani medium, Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
After culturing at 37 ℃ for 18 hours, collect the cells by centrifugation and
It was washed twice with. Cold PBS was added so that the cell concentration was 100 mg / ml, and the cells were crushed and extracted by an ultrasonic crusher (10 seconds × 3 times). The centrifugal supernatant thus obtained was used as Escherichia coli extracted protein.

【００９６】実施例４ 現在ある診断法のうち最も正確なＨ．ピロリ感染診断法
であるとされる13Ｃ−ＵＢＴテスト[J.Gastroenterol.,
33:6-13(1998)]にて群分けしたＨ．ピロリ感染陽性者及
び同陰性者の各２１例（計４２例）の、全血液、血漿、
尿をそれぞれ被検試料として、被検試料中のＨ．ピロリ
抗体を上記実施例２に従って測定した。 Example 4 The most accurate H.264 method among existing diagnostic methods. 13 C-UBT test [J. Gastroenterol.,
33: 6-13 (1998)]. Total blood, plasma of 21 cases each of Helicobacter pylori positive and negative people (total 42 cases),
Urine was used as a test sample, and H. The H. pylori antibody was measured according to Example 2 above.

【００９７】尚、比較実験として、全血液、血漿を被検
試料とする市販のＨ．ピロリ抗体測定装置を使用して、
同一被験者の検体を対象として測定を行い、その結果か
ら本発明装置の効果を検討した。In addition, as a comparative experiment, a commercially available H. Using the H. pylori antibody measuring device,
The sample of the same subject was measured, and the effect of the device of the present invention was examined from the result.

【００９８】結果を図５に示す。The results are shown in FIG.

【００９９】なお、図中、比較装置Ａ〜Ｈは下記の測定
装置を示す。In the figure, comparative devices A to H are the following measuring devices.

【０１００】 Ａ：Helitest（Cortecs Diagnostics社製） Ｂ：H.pylori-Check-1（Bio-Medical Products社製） Ｃ：First Check H.pylori（Worldwide Medical Corp.
社製） Ｄ：Biocard Helicobacter pylori IgG（Anti Biotech
Oy.社製） Ｅ：Insta Test H.Pylori（Cortez Diagnostics Inc.社
製） Ｆ：One Step H.pylori Test（Teco Diagnostics社製） Ｇ：H.pylori SPOT（International Immuno-Diagnostic
s社製） Ｈ：Quick Stripe H.pylori（Diatech Diagnostics In
c.社製） また、図中「Specifity」は、13Ｃ−ＵＢＴテスト陰性
サンプルを各キットで測定した時に、陰性として検出で
きた割合（陰性率）を示し、「Sensitivity」は、13Ｃ
−ＵＢＴテスト陽性サンプルを各キットで測定した時
に、陽性として検出できた割合（陽性率）を示す。A: Helitest (manufactured by Cortecs Diagnostics) B: H.pylori-Check-1 (manufactured by Bio-Medical Products) C: First Check H.pylori (Worldwide Medical Corp.
Made by: D: Biocard Helicobacter pylori IgG (Anti Biotech
Oy.) E: Insta Test H. Pylori (Cortez Diagnostics Inc.) F: One Step H. pylori Test (Teco Diagnostics) G: H. pylori SPOT (International Immuno-Diagnostic)
s company) H: Quick Stripe H. pylori (Diatech Diagnostics In
In addition, "Specifity" in the figure represents the ratio (negative rate) that was detected as negative when 13 C-UBT test negative sample was measured by each kit, and "Sensitivity" is 13 C.
-The proportion (positive rate) that was detected as positive when the UBT test positive sample was measured by each kit is shown.

【０１０１】図５の結果から、本発明のアッセイ装置及
びアッセイ方法は、被検体として血液（全血液、血漿、
血清）を使用した場合はもちろん、尿を使用した場合で
も、高い検出特異性及び精度を有する優れたアッセイシ
ステムであることが分かる。From the results of FIG. 5, the assay device and assay method of the present invention show that blood (whole blood, plasma,
It can be seen that it is an excellent assay system having high detection specificity and accuracy when urine is used as well as when using serum).

【０１０２】また該結果より、本発明によれば、検体と
して安全かつ簡便な尿を採用しても高感度かつ高特異的
な抗体検出が可能であり、臨床検査分野において有用で
あることがいえる。From the above results, according to the present invention, it is possible to detect antibodies with high sensitivity and high specificity even if safe and simple urine is adopted as a sample, which is useful in the field of clinical examination. .

【０１０３】[0103]

【実験例】実験例１ 大腸菌由来成分の尿中抗体測定に
対する効果 （１）尿中抗体測定に対する大腸菌由来成分の効果を実
施例２の測定系を利用して評価した。具体的には、13Ｃ
−ＵＢＴテストにて群分けしたＨ．ピロリ感染陽性者及
び同陰性者の尿をそれぞれ被検試料として、検体希釈液
に大腸菌ＬＰＳを配合しない系（希釈液１）及び表１に
示す種々濃度の大腸菌ＬＰＳを配合した系で、尿中の
Ｈ．ピロリ抗体を測定した。テスト部位及びコントロー
ル部位のラインの発色は、デンシトメーター（ＡＴＴＯ
社製）によるライン強度で評価した。[Experimental example] Experimental example 1 For urinary antibody measurement of components derived from Escherichia coli
Effect on (1) The effect of Escherichia coli-derived components on the measurement of antibody in urine was evaluated using the measurement system of Example 2. Specifically, 13 C
H. grouped in UBT test. The urine of Helicobacter pylori-positive and the urine of Helicobacter pylori-infected were used as test samples, respectively, in a system in which Escherichia coli LPS was not mixed in the sample dilution solution (Dilution solution 1) and in which various concentrations of Escherichia coli LPS shown in Table 1 were mixed. H. H. pylori antibody was measured. The densitometer (ATTO
It was evaluated by the line strength according to the company.

【０１０４】結果を表１に示す。The results are shown in Table 1.

【０１０５】[0105]

【表１】 [Table 1]

【０１０６】被検試料に大腸菌ＬＰＳを１１．１μｇ／
ｍｌ以上配合することで、希釈液１で見られた非特異反
応が消失し、偽陽性検出（誤検出）を防止できることが
分かった。E. coli LPS 11.1 μg /
It was found that by adding more than ml, the non-specific reaction seen in the diluted solution 1 disappeared and false positive detection (false detection) could be prevented.

【０１０７】（２）次いで、被検試料（反応系）への大
腸菌ＬＰＳの配合が、ライン強度に影響を与えないこと
を確認するための実験を行った。具体的には、13Ｃ−Ｕ
ＢＴテスト陽性尿４検体、同陰性尿４検体（尚、陰性尿
としては予め（１）の試験により偽陽性反応を示さない
ものを用いた。）の計８検体について、大腸菌ＬＰＳを
配合しない系（希釈液２）と検体希釈液に大腸菌ＬＰＳ
を５０μｇ／ｍｌ含有する緩衝液を用いて、実施例２の
方法に準じて、尿中の抗体の反応性を検討した。結果を
表２に示す。(2) Next, an experiment was conducted to confirm that the combination of E. coli LPS in the test sample (reaction system) did not affect the line strength. Specifically, 13 C-U
System containing no E. coli LPS for a total of 8 samples of BT test positive urine and 4 samples of negative urine (note that negative urine did not show false positive reaction in the test of (1) previously) E. coli LPS in (dilution 2) and sample dilution
According to the method of Example 2, the reactivity of the antibody in urine was examined using a buffer solution containing 50 .mu.g / ml. The results are shown in Table 2.

【０１０８】[0108]

【表２】 [Table 2]

【０１０９】この結果から、反応系に配合されたＬＰＳ
はライン強度に影響を与えないことが確認された。From this result, LPS added to the reaction system
It was confirmed that does not affect the line strength.

【０１１０】実験例２ 公知測定法［CalypteTM HIV-1 Urine EIA：Arch. Patho
l. Lab. Med., 119, 139-141 (1995)； Clinical lnfec
tious Diseases, 19, 1100-1104 (1994)］による尿中Ｈ
ＩＶ抗体の測定において偽陽性の結果を与えた尿検体を
用いて、該測定系で非特異反応を与える成分を突きとめ
る検討を行った。 Experimental Example 2 Known measurement method [Calypte ™ HIV-1 Urine EIA: Arch. Patho
l. Lab. Med., 119, 139-141 (1995); Clinical lnfec
tious Diseases, 19, 1100-1104 (1994)]
Using a urine sample that gave a false positive result in the measurement of the IV antibody, a study was conducted to identify the component that gives a non-specific reaction in the measurement system.

【０１１１】（１）上記該当する尿検体を１Ｍリン酸緩
衝液（pH 7.7）にてｐＨ７．４に調整後、５．０、０．
８及び０．２μｍのカットフィルターで順次濾過し、そ
の２０ｍｌを限外濾過（10 kdカットのメンブラン）に
て２ｍｌにまで濃縮した。濃縮した尿検体をゲル濾過
（Sephacryl S-300, Pharmacia）に付し、得られた各分
画について、ＨＩＶ抗原への反応性を試験した。(1) The corresponding urine sample was adjusted to pH 7.4 with 1M phosphate buffer (pH 7.7), and then adjusted to 5.0, 0.
The mixture was filtered through 8 and 0.2 μm cut filters successively, and 20 ml thereof was concentrated by ultrafiltration (10 kd cut membrane) to 2 ml. The concentrated urine sample was subjected to gel filtration (Sephacryl S-300, Pharmacia), and each of the obtained fractions was tested for reactivity with HIV antigen.

【０１１２】尚、ＨＩＶ抗原への反応性は、各分画をＨ
ＩＶ抗原を固定化したＨＩＶ抗原固相化プレートと反応
させた後、結合成分（抗原抗体結合物）をＡＬＰ標識ヤ
ギ抗ヒト（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体（Jackson ImmunoRese
arch Labs.社製）にて検出することにより確認した。こ
の試験の結果、フラクション４６〜４８をピークとする
非特異反応成分の存在が確認された。The reactivity to HIV antigen was determined by comparing each fraction with H
After reacting with the HIV antigen-immobilized plate on which the IV antigen is immobilized, the binding component (antigen-antibody conjugate) is subjected to ALP-labeled goat anti-human (IgG + IgM) antibody (Jackson ImmunoRese
It was confirmed by detection with arch Labs.). As a result of this test, the presence of non-specific reaction components with peaks in fractions 46 to 48 was confirmed.

【０１１３】同様に、この抗原固相化プレートに結合し
た成分を、ＡＬＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）
抗体又はＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）
抗体（いずれもJackson ImmunoResearch Labs.社製）を
用いて、検出した。結果を図６に示す。Similarly, the components bound to the antigen-immobilized plate were treated with ALP-labeled goat anti-human IgG (Fc-specific).
Antibody or HRP labeled goat anti-human IgG (Fab specific)
Detection was performed using an antibody (both manufactured by Jackson ImmunoResearch Labs.). Results are shown in FIG.

【０１１４】図６において、縦軸は吸光度（O.D.）を、
横軸はゲル濾過の画分（フラクション番号）を示す。実
線は２８０ｎｍにおける蛋白質の吸光度を、黒丸線は上
記抗ヒト（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体による検出結果を、白
三角線は上記抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体による検
出結果を、黒三角線は上記抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異
的）抗体による検出結果をそれぞれ示す。In FIG. 6, the vertical axis represents the absorbance (OD),
The horizontal axis represents the fraction of gel filtration (fraction number). The solid line indicates the absorbance of the protein at 280 nm, the black circle line indicates the detection result by the above anti-human (IgG + IgM) antibody, the white triangle line indicates the detection result by the above anti-human IgG (Fc specific) antibody, and the black triangle line indicates the above anti-human. The detection results by IgG (Fab-specific) antibody are shown respectively.

【０１１５】図より、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗
体での検出においては、抗ヒト（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体
における場合と同様の反応様式（非特異反応成分との反
応性）を示し、一方、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体
を用いた場合には反応性を示さないことが明らかとなっ
た。このことより、非特異反応を与える成分は、抗ヒト
ＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体との反応性を保持したヒト
ＩｇＧの断片化物又は同変性物であると考えられた。From the figure, the detection with anti-human IgG (Fab-specific) antibody shows the same reaction mode (reactivity with non-specific reaction components) as that with anti-human (IgG + IgM) antibody, while It was revealed that no reactivity was exhibited when a human IgG (Fc-specific) antibody was used. From this, it was considered that the component that gives a non-specific reaction was a fragmented product or a modified product of human IgG that retained the reactivity with the anti-human IgG (Fab-specific) antibody.

【０１１６】（２）上記の各分画をヤギ抗ヒトＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch Labs.社製）
と反応させ、結合成分をＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ
（Ｆｃ特異的）抗体、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆ
ａｂ特異的）抗体又はＨＲＰ標識ラット抗ヒトＩｇＭ抗
体（いずれもJackson ImmunoResearch Labs.社製）と反
応させることにより、各グロブリン量を測定した。(2) Each of the above fractions was converted into goat anti-human IgG.
(H + L) antibody (manufactured by Jackson ImmunoResearch Labs.)
HRP-labeled goat anti-human IgG
(Fc-specific) antibody, HRP-labeled goat anti-human IgG (F
Ab specific) antibody or HRP-labeled rat anti-human IgM antibody (both manufactured by Jackson ImmunoResearch Labs.) was used to measure the amount of each globulin.

【０１１７】その結果、ＩｇＧ（Ｆｃ）濃度は、フラク
ション３８をピークとしてフラクション５０付近で検出
感度以下となったのに対し、ＩｇＧ（Ｆａｂ）濃度で
は、フラクション４６まではＩｇＧ（Ｆｃ）と同等の濃
度を示し、その以降は穏やかな減少傾向を示すに留まっ
た。特にフラクション４７以降はその差が顕著であっ
た。 このことは、フラクション４６までは、両者の測
定値は完全な形のＩｇＧに対する濃度を反映しているの
に対して、フラクション４７以降のＩｇＧ（Ｆａｂ）濃
度は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体との反応性を
保持したＩｇＧ断片化物若しくは同変性物の濃度を反映
しているものと考えられる。As a result, the IgG (Fc) concentration became less than the detection sensitivity in the vicinity of the fraction 50 with the peak of the fraction 38, whereas the IgG (Fab) concentration was the same as that of the IgG (Fc) up to the fraction 46. The concentration was shown, and thereafter, it showed only a gradual decrease. Especially, the difference was remarkable after the fraction 47. This means that up to fraction 46, both measured values reflect the concentration for IgG in the complete form, whereas the IgG (Fab) concentration after fraction 47 is anti-human IgG (Fab-specific). It is considered to reflect the concentration of the IgG fragment or the denatured product that retains the reactivity with the antibody.

【０１１８】なお、ＩｇＭは、測定を行ったいずれの分
画においても検出されなかった。IgM was not detected in any of the measured fractions.

【０１１９】（３）上記により、完全型ＩｇＧが豊富で
あると思われるフラクション３８及び非特異反応成分が
豊富であると思われるフラクション４７について、ＨＲ
Ｐ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体又はＨＲＰ
標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体を用いたウ
エスタンブロット分析を行った。(3) From the above, regarding the fraction 38 that seems to be rich in complete IgG and the fraction 47 that seems to be rich in non-specific reaction components, HR
P-labeled goat anti-human IgG (Fc specific) antibody or HRP
Western blot analysis using labeled goat anti-human IgG (Fab specific) antibody was performed.

【０１２０】その結果、フラクション３８においては、
両標識抗体による分析結果はともにヒトＩｇＧ（対照）
の場合と酷似の反応様式を示した。フラクション４７
は、ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体での分析では、ヒト
ＩｇＧのメインスポットと４３ＫＤにわずかに反応する
スポットが認められ、この４３ＫＤスポットはその分子
量より断片化された重鎖（Ｈ鎖）であると思われた。ま
た、フラクション４７のヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗
体での分析では、ヒトＩｇＧでは検出されないスポット
が２０及び４０ＫＤ付近に認められ、非特異反応を与え
る成分がこれらのスポットに該当すると考えられた。As a result, in the fraction 38,
The results of both labeled antibodies are human IgG (control)
The reaction pattern was very similar to that of. Fraction 47
In the analysis with human IgG (Fc-specific) antibody, a spot slightly reacting with the main spot of human IgG and 43KD was observed, and this 43KD spot is a heavy chain (H chain) fragmented from its molecular weight. I thought there was. In addition, in the analysis of human IgG (Fab-specific) antibody of fraction 47, spots which were not detected by human IgG were observed around 20 and 40 KD, and it was considered that components giving non-specific reaction correspond to these spots.

【０１２１】以上より、尿中ＨＩＶ抗体の測定時に非特
異的反応を与える成分は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異
的）抗体との反応性を保持したＩｇＧの断片化物若しく
は同変性物であると考えられ、また、その分子量から、
ＩｇＧ軽鎖（Ｌ鎖）及びその２量体などのＬ鎖に関与し
ている物質であると考えられた。From the above, it is considered that the component that gives a non-specific reaction during the measurement of HIV antibody in urine is a fragmented or modified product of IgG that retains the reactivity with anti-human IgG (Fab-specific) antibody. And, due to its molecular weight,
It was considered to be a substance involved in the L chain such as IgG light chain (L chain) and its dimer.

【０１２２】このことから、本発明の抗体アッセイ系
（アッセイ装置、アッセイ方法）において非特異反応を
与える成分との反応性を持たない、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ
特異的）抗体を抗体検出試薬（本発明における標識手
段、すなわち固相支持体のトレーサー領域に固定化させ
る標識化リガンド）として使用することにより、抗体検
出において非特異反応を防ぐことができ、しかして、偽
陽性検出が減少することにより特異性の高い高精度の抗
体検出が可能となることが明らかになった。From the above, anti-human IgG (Fc, which has no reactivity with a component that gives a non-specific reaction in the antibody assay system (assay device, assay method) of the present invention.
By using a (specific) antibody as an antibody detection reagent (a labeling means in the present invention, ie, a labeled ligand that is immobilized on the tracer region of the solid support), non-specific reactions can be prevented in antibody detection, but As a result, it became clear that highly accurate antibody detection with high specificity becomes possible by reducing false positive detection.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明のアッセイ装置に含まれるストリップ形
状の固相支持体の略図を示す図である。FIG. 1 is a schematic diagram of a strip-shaped solid phase support included in the assay device of the present invention.

【図２】本発明のアッセイ装置のよる被検試料中の標的
抗体の測定原理を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a principle of measuring a target antibody in a test sample by the assay device of the present invention.

【図３】本発明のアッセイ装置の一例を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an example of an assay device of the present invention.

【図４】第２領域におけるテスト部位及びコントロール
部位を示す図である（実施例１（３））。FIG. 4 is a diagram showing a test site and a control site in a second region (Example 1 (3)).

【図５】実施例４の結果を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing the results of Example 4.

【図６】尿中ＨＩＶ抗体の測定において偽陽性の結果を
与える尿検体のゲル濾過と各分画の抗体反応性を示す図
である。なお図中縦軸は、吸光度（O.D.）を、横軸はゲ
ル濾過の画分（フラクション番号）を示す。実線は２８
０ｎｍにおける蛋白質の吸光度を、黒丸線は上記抗ヒト
（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体による検出結果を、白三角線は
上記抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体による検出結果
を、黒三角線は上記抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体
による検出結果をそれぞれ示す。FIG. 6 is a diagram showing gel filtration of a urine specimen giving antibody false positive results in the measurement of HIV antibody in urine and antibody reactivity of each fraction. In the figure, the vertical axis represents the absorbance (OD) and the horizontal axis represents the gel filtration fraction (fraction number). The solid line is 28
The absorbance of the protein at 0 nm, the black circle line shows the detection result by the anti-human (IgG + IgM) antibody, the white triangle line shows the detection result by the anti-human IgG (Fc specific) antibody, and the black triangle line shows the anti-human IgG ( (Fab-specific) antibody detection results are shown.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１．第１領域 ２．トレーサー領域 ３．第２領域 ４．第３領域 ５．テスト部位 ６．コントロール部位 ７．ハウジングの上部セクション ８．ハウジングの下部セクション ９．試料添加窓 １０．検出窓 1. First area 2. Tracer area 3. Second area 4. Third area 5. Test site 6. Control site 7. Upper section of housing 8. Lower section of housing 9. Sample addition window 10. Detection window

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 町川 房市 徳島県板野郡藍住町住吉字乾19−18 (72)発明者 高橋 重雄 徳島県徳島市川内町平石寿野47−１− 502 (72)発明者 立川 哲也 徳島県板野郡北島町高房字東野神本13− ６ (56)参考文献 特表 平９−500962（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/531 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Fusa Machikawa 19-18 Sumiyoshi Inui, Aizumi-cho, Itano-gun, Tokushima Prefecture (72) Inventor Shigeo Takahashi 47-1-502 Hiraishi, Kawauchi-cho, Tokushima-shi, Tokushima Prefecture (72-72) ) Inventor Tetsuya Tachikawa 13-6, Higashi-no-Kamimoto, Takafusa, Kitajima-cho, Itano-gun, Tokushima Prefecture (56) References Table 9-950962 (JP, A) (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB) Name) G01N 33/543 G01N 33/531

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 少なくとも (a)被検試料を接触させる第
１領域及び (b)該被検試料中の抗体を反応させる第２領
域を、被検試料が毛細管現象により該第１領域から第２
領域に輸送されるように設けてなる固相支持体、並びに
第２領域での反応結果を検出するための標識手段を含有
するアッセイ装置であって、 1) 上記(b)第２領域に、(i)アッセイ対象である標的抗
体を補足するリガンドを固定化したテスト部位と (ii)
被検試料中の任意抗体を捕捉するリガンドを固定化した
コントロール部位とを有し、2) 上記テスト部位に固定化するリガンドが、病原体、
病原体を不活性化したもの、病原体を抽出処理して得ら
れる抗原、又は化学合成により調製した抗原であり、 3) 上記(b)第２領域の(i)テスト部位における標的抗体
の結合反応が大腸菌由来成分の存在下で行われる、 4) 被検試料が尿である、 ことを特徴とする抗体アッセイ装置。1. At least (a) a first region for contacting a test sample and (b) a second region for reacting an antibody in the test sample, wherein the test sample is moved from the first region by a capillary phenomenon. Two
An assay device comprising a solid phase support provided so as to be transported to a region and a labeling means for detecting a reaction result in the second region, wherein 1) the above (b) the second region, (i) a test site on which a ligand that complements the target antibody to be assayed is immobilized (ii)
And a control site on which a ligand that captures an arbitrary antibody in a test sample is immobilized, 2) the ligand immobilized on the test site is a pathogen,
Inactivated pathogen, obtained by extracting pathogen
3) or an antigen prepared by chemical synthesis, 3) the binding reaction of the target antibody at (i) the test site of the above-mentioned (b) second region is carried out in the presence of an Escherichia coli-derived component, 4) a test sample Is urine. 【請求項２】 更に下記構成を備えている、請求項１に
記載の抗体アッセイ装置： 5) 標識手段として、標的抗体及び任意抗体のいずれに
も結合し、イムノグロブリンＧのＦｃ領域に結合特異性
を有する標識化されたリガンドを有している。 2. The method according to claim 1, further comprising :
Described antibody assay device: 5) As a labeling means, any of a target antibody and an arbitrary antibody can be used.
Also binds to the Fc region of immunoglobulin G
Has a labeled ligand with. 【請求項３】 更に下記構成を備えている、請求項１又
は２に記載の抗体アッセイ装置： 6) 上記固相支持体は、幾つかの開口部を有する上部セ
クションと下部セクションとからなるハウジング内に置
かれており、 7) 該上部セクションの開口部の一つは、周辺に一段高
い側面を有する、上記 (a) 第１領域に対応している試料
添加窓である。 3. The method according to claim 1, further comprising the following configuration.
The antibody assay device according to 2 .: 6) The solid support is an upper cell having several openings.
Installed in the housing consisting of
And he, 7) one opening of the upper section, one step higher in the peripheral
A sample corresponding to the above-mentioned (a) first region having a side surface
Addition window.
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