JP5541748B2 - Immunochromatographic test device using avidin-biotin linked labeling reagent and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、イムノクロマトグラフ用試験具に関する。 The present invention relates to an immunochromatographic test device.
毛管現象を利用するクロマトグラフの手法と免疫学的手法とを組み合わせたイムノクロマトグラフ法は、簡便、且つ短時間で、試料中の被検物質を分析できる方法として、広く利用されている。 An immunochromatographic method combining a chromatographic method using a capillary phenomenon and an immunological method is widely used as a method capable of analyzing a test substance in a sample easily and in a short time.
図１に、従来の一般的なイムノクロマトグラフ用試験具を示す。展開方向の上流（同図において左側端部）から下流（同図において右側端部）に向かって、試料添加パッド８、展開パッド３、コンジュゲートパッド２、反応膜１、および吸収パッド４の順に、バックシート５上に配置されている。コンジュゲートパッドには、金コロイド粒子等の標識物質で標識された、被検物質と特異的に結合する第一親和性物質（標識試薬）が含浸されている。反応膜は、第一親和性物質とは異なる部位で被検物質と特異的に結合する第二親和性物質（捕捉試薬）が固定化されたテストライン６を有している。
FIG. 1 shows a conventional general immunochromatographic test device. The
つぎに、このイムノクロマトグラフ用試験具を用いた被検物質の分析について説明する。試験溶液を試料添加パッド８に供給すると、毛管現象により、展開パッド３を経由してコンジュゲートパッド２に移動する。すると、コンジュゲートパッドに含浸された標識試薬が、試験溶液中に溶出する。標識試薬を溶解した試験溶液は順次、毛管現象により反応膜１上のテストライン６へと展開する。ここで、試料中に被検物質が含まれていれば、展開中に形成された標識試薬と被検物質との複合体が、テストラインに固定化されている捕捉試薬に捕捉される。その結果、捕捉された標識物質により生じるシグナルの有無または程度を判定することにより、試料中の被検物質を分析することができる。
Next, analysis of a test substance using this immunochromatographic test device will be described. When the test solution is supplied to the
また多くの場合、テストラインより展開方向の下流側の反応膜上に、標識試薬に特異的に結合するが被検物質には結合しない物質（対照試薬）を固定化したコントロールライン７が設けられ、試験成立の可否を判定する指標として使用されている。コントロールラインでシグナルが検出された場合、測定に必要な量の試験溶液及び標識試薬がテストライン及びコントロールライン上を問題なく展開したことを意味するが、コントロールラインが検出されない場合には、測定に必要な量の試験溶液及び標識試薬が展開していない可能性があるため、その試験は不成立であるとみなされる。
In many cases, a
コントロールラインに固定化される対照試薬としては、標識試薬に対する抗体が一般的に用いられてきた。例えば、標識試薬として被検物質特異的な標識マウスモノクローナル抗体が使用される場合、対照試薬には抗マウス抗体が用いられる。 As a control reagent immobilized on the control line, an antibody against a labeling reagent has generally been used. For example, when a test substance-specific labeled mouse monoclonal antibody is used as the labeling reagent, an anti-mouse antibody is used as the control reagent.
ところが、血液等の生体試料を用いる試験では、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）等、種々の動物に対する異好性抗体を有する検体が存在するため、干渉除去抗体がしばしば使用される。干渉除去抗体は通常、被検物質特異的な標識抗体と同一種の非標識抗体が用いられ、標識抗体に比べて過剰に使用される。そのため、前記のような対照機構を有する試験具で干渉除去抗体を使用する場合、対照試薬に干渉除去抗体が捕捉されることにより、コントロールラインのシグナル強度は著しく減少するという問題があり、対照試薬の固定化量の増量や干渉除去抗体の使用量を控える等の対策が必要とされていた。 However, in tests using biological samples such as blood, interference-removing antibodies are often used because there are specimens having heterophilic antibodies against various animals such as human anti-mouse antibodies (HAMA). The interference-removing antibody is usually an unlabeled antibody of the same type as the labeled antibody specific for the test substance, and is used in excess compared to the labeled antibody. Therefore, when using the interference-removing antibody in the test device having the control mechanism as described above, there is a problem that the signal intensity of the control line is remarkably reduced by capturing the interference-removing antibody in the control reagent. Measures such as increasing the amount of immobilization and reducing the amount of interference-removing antibody used have been required.
一方、特許文献１、２では、干渉物質の影響を受けない、独立した対照用標識物質を用意するイムノクロマトグラフ用試験具が提供されている。例えば、特許文献１では、標識試薬として被検物質特異的な標識抗体と標識ビオチンを混合したものを用意し、対照試薬としてアビジンを固定化したイムノクロマトグラフ用試験具が記載されている。
また、これまでに、測定感度の上昇あるいは製造上の有利性を目的として、アビジン−ビオチン反応を利用して第一親和性物質と標識物質とを結合させるイムノクロマトグラフ用試験具が報告されている（特許文献３、４）。しかし、いずれもアビジン−ビオチンを測定過程で反応させており、特許文献４の実施例では、対照用標識試薬を別途用意したイムノクロマトグラフ用試験具が用いられている。また、特許文献３には、アビジン（又はビオチン）結合抗体とマーカー標識ビオチン（又はアビジン）とを予め反応させておき、これを測定対象物質と反応させると、測定感度が低下するため好ましくない旨の記載がある（段落００１１）。
On the other hand,
In addition, an immunochromatographic test device that binds a first affinity substance and a labeling substance using an avidin-biotin reaction has been reported so far for the purpose of increasing measurement sensitivity or manufacturing advantages. (
しかしながら、対照試薬の固定化量の増量は物理的に限界があり、コストアップにも繋がる。また、干渉除去抗体の使用量を抑えることにより、測定結果が異好性抗体の影響を受けることがある。一方、特許文献１、２の試験具では、対照試薬用として別途に標識試薬を用意しなければならず、試薬調製の煩雑化とコストアップが問題となる。また、被検物質との反応には関与しない対照用標識試薬が展開することにより、テストライン上で非特異反応が生じる場合がある。
そこで本発明は、検体中に含まれる内在性成分（異好性抗体など）または試験試薬の成分（干渉除去抗体など）に影響を受けることがなく、かつ、対照用標識試薬を別途用意する必要の無い、改良された対照機構を備えるイムノクロマトグラフ用試験具を提供することを課題としている。
However, an increase in the amount of control reagent immobilized is physically limited, leading to increased costs. In addition, by suppressing the amount of interference-removing antibody used, the measurement result may be affected by heterophilic antibodies. On the other hand, in the test devices of
Therefore, the present invention is not affected by endogenous components (such as heterophilic antibodies) or test reagent components (such as interference-removing antibodies) contained in the specimen, and it is necessary to prepare a control labeling reagent separately. It is an object of the present invention to provide an immunochromatographic test device having an improved control mechanism without any problem.
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、標識試薬として、被検物質に特異的な第一親和性物質と標識物質とをアビジン−ビオチン反応を利用して連結したものを用い、対照試薬として、ビオチンを含むもの（ビオチン又はビオチン化物）を用いることにより、上述の欠点を全て解消できることを見出した。
アビジン−ビオチン反応は、イムノクロマトグラフ法などの試験法に一般的に利用されているが、アビジン−ビオチン間の相互作用は迅速に形成され、一度形成されると、相互作用は極めて幅広い範囲のｐＨ、温度、有機溶媒およびその他の変性剤に影響されないことが知られているため、充分量の標識物質と第一親和性物質とを、アビジン−ビオチン反応を利用して連結させた標識試薬において、なおビオチン化物と結合可能なアビジンが残存しているとは考えられてこなかった。しかしながら本発明者らは、アビジン−ビオチン反応で連結した標識試薬において、意外にもビオチン化物と結合可能なアビジンが残存しており、対照試薬としてビオチン化物を用いることが可能であることに気がついた。さらに、アビジン−ビオチン反応で連結した標識試薬を用いることにより、良好なＳ／Ｎ比を呈するだけではなく、製造ロット毎の標識試薬性能を一定に保つという更なる利点を有するイムノクロマトグラフ用試験具を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies, the present inventors used a labeling reagent in which a first affinity substance specific for a test substance and a labeling substance were linked using an avidin-biotin reaction, and used as a control reagent. It has been found that all of the above-mentioned drawbacks can be eliminated by using a biotin-containing one (biotin or biotinylated product).
The avidin-biotin reaction is commonly used in test methods such as immunochromatography, but the avidin-biotin interaction is rapidly formed, and once formed, the interaction has a very broad pH range. In a labeling reagent in which a sufficient amount of a labeling substance and a first affinity substance are linked using an avidin-biotin reaction, it is known that the temperature, organic solvent and other denaturing agents are not affected. It has not been thought that avidin capable of binding to the biotinylated product remains. However, the present inventors have unexpectedly found that avidin capable of binding to a biotinylated substance remains in the labeling reagent linked by the avidin-biotin reaction, and it is possible to use the biotinylated substance as a control reagent. . Furthermore, by using a labeling reagent linked by an avidin-biotin reaction, not only a good S / N ratio is exhibited, but also an immunochromatographic test device which has the further advantage of keeping the labeling reagent performance constant for each production lot. Has been found to be able to be produced, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、
［１］被検物質と特異的に反応する捕捉試薬が固定化されているテストラインと、
標識試薬と特異的に結合する対照試薬が固定化されているコントロールラインと、
を備えるイムノクロマトグラフ用試験具であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、イムノクロマトグラフ用試験具、
［２］対照試薬がビオチン化タンパク質である、［１］のイムノクロマトグラフ用試験具、
［３］捕捉試薬が、第二親和性物質、又は、被検物質又はその類似体の競合物質である、［１］又は［２］のイムノクロマトグラフ用試験具、
［４］第一親和性物質及び／又は第二親和性物質が抗体である、［１］〜［３］のいずれかのイムノクロマトグラフ用試験具、
［５］干渉除去抗体を含む、［１］〜［４］のいずれかのイムノクロマトグラフ用試験具、
［６］被検物質と標識試薬とを接触させる工程、
被検物質と標識試薬との複合体を、被検物質に特異的に結合する捕捉試薬で捕捉する工程、
被検物質と未反応の標識試薬を、標識試薬に特異的に結合する対照試薬で捕捉する工程、
捕捉試薬および対照試薬で捕捉した標識試薬を検出する工程、
を含む被検物質の分析方法であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、被検物質の分析方法、
［７］被検物質を、被検物質と特異的に反応する捕捉試薬で捕捉する工程
被検物質と捕捉試薬との複合体に、標識試薬を接触させる工程
被検物質と未反応の標識試薬を、標識試薬に特異的に結合する対照試薬で捕捉する工程、
捕捉試薬および対照試薬で捕捉した標識試薬を検出する工程、
を含む被検物質の分析方法であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、被検物質の分析方法、
［８］被検物質と標識試薬とを接触させる工程、
被検物質と未反応の標識試薬を、被検物質又はその類似体の競合物質である捕捉試薬で捕捉する工程、
被検物質と未反応の標識試薬を、標識試薬に特異的に結合する対照試薬で捕捉する工程、
捕捉試薬および対照試薬で捕捉した標識試薬を検出する工程、
を含む被検物質の分析方法であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、被検物質の分析方法、
に関する。
That is, the present invention
[1] A test line on which a capture reagent that specifically reacts with a test substance is immobilized;
A control line on which a control reagent that specifically binds to the labeling reagent is immobilized;
An immunochromatographic test device comprising:
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
The test reagent for immunochromatography, wherein the control reagent contains biotin,
[2] The immunochromatographic test device according to [1], wherein the control reagent is a biotinylated protein,
[3] The immunochromatographic test device according to [1] or [2], wherein the capture reagent is a second affinity substance, or a competitive substance of a test substance or an analog thereof,
[4] The immunochromatographic test device according to any one of [1] to [3], wherein the first affinity substance and / or the second affinity substance is an antibody.
[5] The immunochromatographic test device according to any one of [1] to [4], comprising an interference-removing antibody;
[6] A step of bringing a test substance into contact with a labeling reagent,
Capturing a complex of a test substance and a labeling reagent with a capture reagent that specifically binds to the test substance;
Capturing a test substance and an unreacted labeling reagent with a control reagent that specifically binds to the labeling reagent;
Detecting a labeling reagent captured with a capture reagent and a control reagent;
A method for analyzing a test substance containing
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
The method for analyzing a test substance, wherein the control reagent contains biotin,
[7] Step of capturing the test substance with a capture reagent that specifically reacts with the test substance Step of contacting the label reagent with the complex of the test substance and the capture reagent The test substance and the unreacted labeling reagent Capturing with a control reagent that specifically binds to the labeling reagent,
Detecting a labeling reagent captured with a capture reagent and a control reagent;
A method for analyzing a test substance containing
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
The method for analyzing a test substance, wherein the control reagent contains biotin,
[8] A step of contacting a test substance with a labeling reagent,
Capturing the unreacted labeling reagent with the test substance with a capture reagent that is a competitive substance of the test substance or its analog,
Capturing a test substance and an unreacted labeling reagent with a control reagent that specifically binds to the labeling reagent;
Detecting a labeling reagent captured with a capture reagent and a control reagent;
A method for analyzing a test substance containing
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
The method for analyzing a test substance, wherein the control reagent contains biotin,
About.
本発明によれば、対照試薬が試験試薬の成分（干渉除去抗体等）の影響を受けないため、適切量の干渉除去抗体を使用することができるようになる。そのため、検体中に含まれる内在性成分（異好性抗体等）の影響も回避することが可能となる。これにより、テストライン及びコントロールラインにおける判定の確実性を高めることができる。また、対照用標識試薬を別途用意する必要が無いため、テストラインにおける対照用標識物質による非特異反応も生じることなく、簡便かつ低コストでイムノクロマトグラフ用試験具を製造することが可能となる。 According to the present invention, since the control reagent is not affected by the components of the test reagent (such as the interference removing antibody), an appropriate amount of the interference removing antibody can be used. For this reason, it is possible to avoid the influence of endogenous components (heterophilic antibodies and the like) contained in the specimen. Thereby, the certainty of the determination in a test line and a control line can be improved. In addition, since it is not necessary to prepare a control labeling reagent separately, a nonspecific reaction due to the control labeling substance in the test line does not occur, and an immunochromatographic test device can be manufactured easily and at low cost.
本発明は、検体中の被検物質を分析するイムノクロマトグラフ用試験具及びその利用である。なお、本明細書における「分析」には、被検物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、被検物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の試験具は、標識試薬と対象試薬の構成を除いて、従来公知のイムノクロマトグラフ用試験具と同様の構成からなることができ、以下の実施形態に限定されるものではない。
The present invention relates to an immunochromatographic test device for analyzing a test substance in a specimen and use thereof. In this specification, “analysis” includes both “measurement” for quantitatively or semi-quantitatively determining the amount of the test substance and “detection” for determining the presence or absence of the test substance. It is.
Hereinafter, although the form for implementing this invention is demonstrated, the test device of this invention can consist of the structure similar to a conventionally well-known immunochromatography test device except the structure of a labeling reagent and a target reagent. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
イムノクロマトグラフ用試験具を用いた分析としては、競合法と非競合法があり、さらに抗原検出系と抗体検出系があるが、当業者であれば被検物質に応じて適宜試験法を選択し、本発明を利用することができる。一例として後述する実施例に詳細に説明するが、非競合法の抗原検出系の場合は、捕捉試薬に被検物質特異的抗体（第二親和性物質）、対照試薬にビオチン化ＢＳＡ（ビオチン化物）を使用し、標識試薬として被検物質特異的抗体（第一親和性物質）と金コロイド（標識物質）とをストレプトアビジン−ビオチン反応で連結したものを使用することにより、一つの標識試薬でテストライン及びコントロールラインを判定することができる。
また、非競合法の抗体検出系の場合、例えば、被検物質がアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の場合は、捕捉試薬にアレルゲン（第二親和性物質）、対照試薬にビオチン化ＢＳＡ（ビオチン化物）を使用し、標識試薬としてヒトＩｇＥ抗体特異的抗体（第一親和性物質）と金コロイド（標識物質）とをストレプトアビジン−ビオチン反応で連結したものを使用することにより、一つの標識試薬でテストライン及びコントロールラインを判定することができる。
競合法の場合、例えば、被検物質がハプテンの場合は、捕捉試薬に競合用ハプテン、対照試薬にビオチン化ＢＳＡ（ビオチン化物）を使用し、標識試薬としてハプテン特異的抗体（第一親和性物質）と金コロイド（標識物質）とをストレプトアビジン−ビオチン反応で連結したものを使用することにより、一つの標識試薬でテストライン及びコントロールラインを判定することができる。
There are two types of analysis using immunochromatographic test tools: competitive methods and non-competitive methods, and antigen detection systems and antibody detection systems. Those skilled in the art will select the appropriate test method according to the test substance. The present invention can be used. An example will be described in detail in the examples described later. In the case of an antigen detection system of the non-competitive method, a test substance-specific antibody (second affinity substance) is used as a capture reagent, and biotinylated BSA (biotinylated product) is used as a control reagent. ), And a test substance-specific antibody (first affinity substance) and a colloidal gold (label substance) linked by a streptavidin-biotin reaction as a labeling reagent. Test lines and control lines can be determined.
In the case of a non-competitive antibody detection system, for example, when the test substance is an allergen-specific IgE antibody, allergen (second affinity substance) is used as a capture reagent, and biotinylated BSA (biotinylated product) is used as a control reagent. Use a test line with a single labeling reagent by using a human IgE antibody-specific antibody (first affinity substance) and colloidal gold (labeling substance) linked by a streptavidin-biotin reaction as the labeling reagent. And the control line can be determined.
In the case of the competition method, for example, when the test substance is a hapten, a competition hapten is used as a capture reagent, biotinylated BSA (biotinylated product) is used as a control reagent, and a hapten-specific antibody (first affinity substance) is used as a labeling reagent. ) And gold colloid (labeling substance) linked by streptavidin-biotin reaction, the test line and the control line can be determined with one labeling reagent.
本発明の試験具は、反応膜上に、被検物質と特異的に反応する捕捉試薬が固定化されているテストラインと、標識試薬と特異的に結合する第一親和性物質を含む対照試薬が固定化されているコントロールラインと、を少なくとも備え、被検物質を含むと推定される試験溶液が毛細管現象により、テストライン、コントロールラインの順序で通過するよう構成されている。テストラインは、必要に応じて２つ以上備えることも可能である。なお、テストラインおよびコントロールラインはライン状に制限されず、円形、多角形などの形状であってもよい。 The test device of the present invention comprises a test line on which a capture reagent that specifically reacts with a test substance is immobilized on a reaction membrane, and a control reagent that includes a first affinity substance that specifically binds to a labeling reagent. And a control line to which the test substance is immobilized, and the test solution presumed to contain the test substance passes through the test line and the control line in order of capillary action. Two or more test lines may be provided as necessary. Note that the test line and the control line are not limited to a line shape, and may be a circular shape, a polygonal shape, or the like.
本発明の試験具では、さらに反応膜の展開方向の上流側に試験溶液を導入する試料添加パッド、および、反応膜の下流側には上記試験溶液を吸い上げる吸収パッドを備えることが好ましい。被検物質と標識試薬との結合を試験具上で行う場合は、試料添加パッドと反応膜との間に、標識試薬を展開可能に保持したコンジュゲートパッドを備えることが好ましい。例えば、標識試薬が乾燥してコンジュゲートパッド上に保持されていることにより試験溶液が希釈されないので、高い濃度で被検物質と第一親和性物質や第二親和性物質を反応させて検出感度を上げることができる。また、必要に応じて、試料添加パッドとコンジュゲートパッドの間に展開パッドを備えてもよく、これらの部材が粘着性のバックシート上に配置されることが好ましい。 The test device of the present invention preferably further includes a sample addition pad for introducing the test solution upstream of the reaction membrane in the developing direction and an absorption pad for sucking up the test solution downstream of the reaction membrane. In the case where the test substance and the labeling reagent are bound on the test tool, it is preferable to provide a conjugate pad that holds the labeling reagent in a developable manner between the sample addition pad and the reaction membrane. For example, since the test reagent is not diluted because the labeling reagent is dried and held on the conjugate pad, the detection sensitivity is obtained by reacting the test substance with the first affinity substance or the second affinity substance at a high concentration. Can be raised. Further, if necessary, a development pad may be provided between the sample addition pad and the conjugate pad, and it is preferable that these members are disposed on an adhesive backsheet.
本発明の試験具に供される試験溶液には、被検物質を含む可能性のある検体又はその処理物（例えば、溶解物、希釈物など）だけでなく、前記検体又はその処理物に各種試薬類（例えば、標識試薬、干渉除去抗体など）を添加した混合物も含まれる。また、前記検体としては、被検物質を含む可能性のある限り特に限定されるものではなく、動物（特にヒト）から採取された血液、血清、血漿、尿、膿、涙液、汗、唾液、喀痰、鼻水などの体液、あるいは、糞便、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過物（スワブ）などの生体試料の他、菌やウイルス等の培養液、浮遊液、抽出物などを挙げることができる。 The test solution used in the test device of the present invention includes not only a sample that may contain a test substance or a processed product thereof (for example, a lysate, a diluted product, etc.), but also various types of samples or processed products thereof. A mixture to which reagents (for example, a labeling reagent, an interference removing antibody, etc.) are added is also included. The specimen is not particularly limited as long as it may contain a test substance. Blood, serum, plasma, urine, pus, tears, sweat, saliva collected from animals (particularly humans) In addition to bodily fluids such as sputum and runny nose, or biological samples such as feces, organs, tissues, mucous membranes and skin, and swabs that are thought to contain them, culture fluids such as bacteria and viruses, suspensions, An extract etc. can be mentioned.
本発明に用いる標識試薬は、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが、アビジン及びビオチンを介して連結されたものを含む。前記標識物質は、当業者であれば、公知の物質から適宜選択して使用することができるが、例えば、金、銀、白金、パラジウム等の金属コロイド、高分子ポリマー微粒子であるラテックス着色粒子等の天然又は合成の樹脂及びその誘導体、色素を含有したリポソームやマイクロカプセルなどを挙げることができる。取扱い易さや感度の点を考慮すると、中でも金コロイドが好ましい。金属コロイドの粒径は特に限定されないが、約１〜５００ｎｍが好ましく、特に強い色調が得られる５〜１００ｎｍがさらに好ましい。また、前記第一親和性物質としては、被検物質と特異的に結合し、アビジン又はビオチンと結合できる物質であれば特に制限されないが、抗体、抗原、アプタマーなどが挙げられる。当業者であれば、被検物質に応じて適宜決定することができる。なお、抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、酵素処理あるいは化学処理により、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’或いはＦａｂ断片として使用してもよい。 The labeling reagent used in the present invention includes one in which a first affinity substance that specifically binds to a test substance and a labeling substance are linked via avidin and biotin. Those skilled in the art can use the labeling substance by appropriately selecting from known substances, such as metal colloids such as gold, silver, platinum, and palladium, latex colored particles that are polymer polymer fine particles, and the like. And natural or synthetic resins and derivatives thereof, and liposomes and microcapsules containing dyes. In view of ease of handling and sensitivity, colloidal gold is particularly preferable. The particle size of the metal colloid is not particularly limited, but is preferably about 1 to 500 nm, and more preferably 5 to 100 nm, at which a particularly strong color tone can be obtained. The first affinity substance is not particularly limited as long as it is a substance that specifically binds to a test substance and can bind to avidin or biotin, and includes an antibody, an antigen, an aptamer, and the like. A person skilled in the art can determine appropriately according to the test substance. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and may be used as an F (ab ′) 2 , Fab ′ or Fab fragment by enzymatic treatment or chemical treatment.
本発明に用いる標識試薬は、アビジン（またはビオチン）固定化標識物質、及び、ビオチン（またはアビジン）結合第一親和性物質をそれぞれ調製した後、両者のアビジンとビオチンとを反応させることにより調製することができる。 The labeling reagent used in the present invention is prepared by preparing an avidin (or biotin) -immobilized labeling substance and a biotin (or avidin) -binding first affinity substance, and then reacting both avidin and biotin. be able to.
アビジンは、標識物質と第一親和性物質のどちらに結合させても構わないが、標識物質に結合させる場合には、アビジン固定化標識物質およびビオチン化第一親和性物質をそれぞれ調製した後、両者を連結することが好ましい。なお、本発明に用いるアビジンとしては、卵白アビジン、ストレプトアビジンの他、ニュートラアビジン等の類似体を挙げることができる。非特異的結合が少ないため、ストレプトアビジンが特に好ましい。ビオチンとの結合能力を持ったものであれば特に限定されず、アミノ酸の変異、付加、欠失等を適宜行うことができる。 Avidin may be bound to either the labeling substance or the first affinity substance, but when binding to the labeling substance, after preparing the avidin-immobilized labeling substance and the biotinylated first affinity substance, It is preferable to connect both. Examples of avidin used in the present invention include egg white avidin and streptavidin, and analogs such as neutravidin. Streptavidin is particularly preferred because of less non-specific binding. There is no particular limitation as long as it has the ability to bind to biotin, and amino acid mutations, additions, deletions and the like can be appropriately performed.
前記アビジン固定化標識物質は、物理的吸着法など、公知の方法により調製することができ、アビジンのビオチン結合能を失活させない方法であれば、何れの方法を利用してもよい。標識物質へのアビジン固定量により、テストライン及びコントロールラインの染色度合いはそれぞれ変動するため、使用する標識物質やアビジンの種類、または被検物質の感度や測定レンジに応じて、標識物質へのアビジン反応濃度は適宜設定することができる。 The avidin-immobilized labeling substance can be prepared by a known method such as physical adsorption, and any method may be used as long as it does not deactivate the biotin-binding ability of avidin. The degree of staining of the test line and control line varies depending on the amount of avidin fixed to the labeling substance, so depending on the type of labeling substance and avidin used, or the sensitivity and measurement range of the test substance, The reaction concentration can be set as appropriate.
前記ビオチン化第一親和性物質は、公知の方法により調製することができ、第一親和性物質の結合能を失活させない方法であれば、何れの方法を利用してもよい。タンパク質のＳＨ基、アミノ基、カルボキシル基、あるいは糖鎖にビオチンを結合できるものなど、多くのビオチン化試薬が市販されている。第一親和性物質として抗体を用いる場合、ビオチン化可能な抗体種は特に制限されず、全長としての（Ｗｈｏｌｅ）免疫グロブリン（Ｉｇ）、その酵素消化物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’或いはＦａｂ断片などを用いることができる。また、組み換え遺伝子操作により、ビオチンが導入されたタンパク質が抗体とキメラ化されて得られるキメラ抗体も、ビオチン化抗体として利用することが可能である。 The biotinylated first affinity substance can be prepared by a known method, and any method may be used as long as it does not deactivate the binding ability of the first affinity substance. Many biotinylation reagents such as those capable of binding biotin to the SH group, amino group, carboxyl group, or sugar chain of proteins are commercially available. When an antibody is used as the first affinity substance, the antibody species that can be biotinylated is not particularly limited, and (Whole) immunoglobulin (Ig) as a full length, F (ab ′) 2 , Fab ′ that is an enzyme digest thereof. Alternatively, Fab fragments and the like can be used. In addition, a chimeric antibody obtained by chimerizing a protein into which biotin is introduced by recombinant gene manipulation can be used as a biotinylated antibody.
本発明に用いる標識試薬では、標識物質と第一親和性物質とを直接結合させた標識試薬に比べて、製造ロット毎に生じる試薬性能のばらつきを一定に保ち、保存安定性を向上させることが可能となる。 In the labeling reagent used in the present invention, compared to a labeling reagent in which a labeling substance and a first affinity substance are directly bound, variation in reagent performance that occurs in each production lot can be kept constant, and storage stability can be improved. It becomes possible.
本発明において、テストラインに固定化される捕捉試薬は、被検物質と特異的に結合する第二親和性物質、あるいは被検物質（又はその類似体）の競合物質を含む。例えば、一般的な非競合法の場合は、被検物質と特異的に結合する第二親和性物質を含み、競合法の場合は、被検物質（又はその類似体）の競合物質を含む。競合法は、低分子化合物あるいはハプテンなど、単独では抗原性が低いものが分析できるので好ましい。 In the present invention, the capture reagent immobilized on the test line includes a second affinity substance that specifically binds to the test substance, or a competitive substance of the test substance (or an analog thereof). For example, a general non-competitive method includes a second affinity substance that specifically binds to a test substance, and a competitive method includes a test substance (or an analog thereof). The competitive method is preferable because a low molecular weight compound or a hapten alone can be analyzed with a low antigenicity.
前記第二親和性物質としては、被検物質と特異的に結合する限り特に限定されないが、抗体、抗原、アプタマー等が挙げられる。抗体は、酵素処理あるいは化学処理により、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’或いはＦａｂ断片として使用してもよい。第二親和性物質は、第一親和性物質と同じ部位に結合してもよいが、異なる部位で被検物質と特異的に結合することが好ましい。前記被検物質（又はその類似体）の競合物質は、第一親和性物質と特異的に結合する限り特に限定されないが、検体中の被検物質と同じ又は類似の構造を有するものが挙げられる。 The second affinity substance is not particularly limited as long as it specifically binds to the test substance, and examples thereof include antibodies, antigens, aptamers and the like. The antibody may be used as an F (ab ′) 2 , Fab ′ or Fab fragment by enzymatic treatment or chemical treatment. The second affinity substance may bind to the same site as the first affinity substance, but preferably binds specifically to the test substance at a different site. The competitive substance of the test substance (or an analog thereof) is not particularly limited as long as it specifically binds to the first affinity substance, and examples thereof include those having the same or similar structure as the test substance in the specimen. .
本発明に用いる対照試薬は、ビオチンを含むものである限り特に限定されない。反応膜に直接ビオチンを固定化させてもよいが、支持体物質にビオチンを結合させて用いることが望ましい。支持体物質としてはタンパク質が好ましく、該タンパク質としては、ビオチン化試薬が反応できるタンパク質である限り特に限定されない。使用可能な該タンパク質としては、測定中に他の物質との非特異的な反応が無いものが好ましく、血清アルブミンが挙げられ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が特に好ましく挙げられる。組み換え遺伝子操作により調製した、あるいは、天然に存在する、ビオチンが導入されたタンパク質の利用も可能である。前記ビオチン化試薬には、ビオチン化第一親和性物質の調製と同様のものが挙げられるが、対照試薬の調製に用いるビオチン化試薬では、ビオチンに導入されたスペーサー長が、ビオチン結合第一親和性物質で用いたビオチンに導入されたスペーサー長に比べて、同等あるいは長いものを使用することが好ましい。 The control reagent used in the present invention is not particularly limited as long as it contains biotin. Although biotin may be directly immobilized on the reaction membrane, it is desirable to use biotin bound to a support material. The support substance is preferably a protein, and the protein is not particularly limited as long as it is a protein that can react with a biotinylation reagent. The protein that can be used is preferably a protein that does not react with other substances during the measurement, and includes serum albumin, and bovine serum albumin (BSA) is particularly preferable. It is also possible to use biotin-introduced proteins prepared by recombinant gene manipulation or existing in nature. Examples of the biotinylation reagent include those similar to the preparation of a biotinylated first affinity substance. However, in the biotinylation reagent used for the preparation of the control reagent, the spacer length introduced into biotin has a biotin-binding first affinity. It is preferable to use the same or longer spacer length compared to the spacer length introduced into biotin used in the sex substance.
本発明の試験具は、被検物質特異的な第一親和性物質や第二親和性物質と反応することで誤判定の原因となりうる異好性抗体の影響を回避するため、干渉除去抗体を含む場合に特に有効である。前記干渉除去抗体としては、異好性抗体と反応可能な物質である限り特に限定されないが、第一親和性物質及び／又は第二親和性物質として用いる抗体と同一種の抗体であることが好ましい。例えば、第一親和性物質及び／又は第二親和性物質がマウスモノクローナル抗体である場合、干渉除去抗体にはマウス抗体が好ましく用いられる。また、干渉除去抗体は、被検物質が捕捉試薬及び／又は標識抗体と接触する前に含有されていることが好ましい。例えば、試験溶液（標識試薬、検体処理用試薬など）、あるいは部材（試料添加パッド、展開パッド、コンジュゲートパッドなど）のいずれか一つ以上に含まれていることが好ましい。当業者であれば、試験工程の違いに併せて、適宜、決定することができる。 The test device of the present invention uses an interference-removing antibody in order to avoid the influence of heterophilic antibodies that can cause misjudgment by reacting with a test substance-specific first affinity substance or second affinity substance. This is particularly effective when included. The interference-removing antibody is not particularly limited as long as it is a substance capable of reacting with a heterophilic antibody, but is preferably the same type of antibody as the first affinity substance and / or the second affinity substance. . For example, when the first affinity substance and / or the second affinity substance is a mouse monoclonal antibody, a mouse antibody is preferably used as the interference-removing antibody. The interference-removing antibody is preferably contained before the test substance comes into contact with the capture reagent and / or the labeled antibody. For example, it is preferably contained in any one or more of a test solution (labeling reagent, specimen processing reagent, etc.) or a member (sample addition pad, development pad, conjugate pad, etc.). A person skilled in the art can appropriately determine the difference in the test process.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
《実施例１：イムノクロマトグラフ用試験具の作製と評価》
（１）標識試薬の作製
（１−１）ストレプトアビジン固定化金コロイドの調製
５２０ｎｍの吸光度が１０となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．５で調製した１０ｍＬの金コロイド溶液（粒径４０ｎｍ、田中貴金属）に、ストレプトアビジン（和光純薬）を混合時終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬとなるように混合した。
混合液を１時間撹拌した後、ポリエチレングリコール（Ｍｗ．２００００、和光純薬社）溶液を終濃度０．５％となるように加え、さらに１時間撹拌した。続いてＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）溶液を終濃度１％となるよう加え、１時間撹拌しブロッキングを行った。この溶液を４℃、１００００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を取り除き、分散用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％ポリエチレングリコールを含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．５）を加えて再分散した。再び４℃、１００００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を取り除き、分散用緩衝液に再分散させ、ストレプトアビジン固定化金コロイド溶液を調製した。
<< Example 1: Preparation and evaluation of immunochromatographic test device >>
(1) Preparation of labeling reagent (1-1) Preparation of streptavidin-immobilized gold colloid 10 mL of gold colloid solution (particle size) prepared with 5 mmol / L phosphate buffer pH 7.5 so that the absorbance at 520 nm is 10. Streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was mixed with 40 nm, Tanaka Precious Metals) so that the final concentration at the time of mixing was 0.1 mg / mL.
After the mixture was stirred for 1 hour, a polyethylene glycol (Mw. 20000, Wako Pure Chemical Industries) solution was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was further stirred for 1 hour. Subsequently, BSA (SIGMA) solution was added to a final concentration of 1%, and the mixture was stirred for 1 hour for blocking. This solution was centrifuged at 10000 × g for 10 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant, and a dispersion buffer (5 mmol / L phosphate buffer pH 7.5 containing 1% BSA and 0.05% polyethylene glycol) was added. In addition, it was redispersed. Centrifugation was again performed at 4 ° C., 10,000 × g for 10 minutes, and the supernatant was removed and redispersed in a dispersion buffer to prepare a streptavidin-immobilized gold colloid solution.
（１−２）ビオチン化抗体（捕捉試薬）の調製
抗マイコプラズマ・ニューモニエ マウスモノクローナル抗体（ＭＣＭ１２）由来の２ｍｇ／ｍＬ Ｆ（ａｂ’）２を、ＳＨ基還元剤（ＴＣＥＰ：ＰＩＥＲＣＥ）を終濃度０．４ｍｍｏｌ／Ｌになる様に添加しＦａｂ’化した後、マレイミド化ビオチン試薬であるＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ（スペーサー長２９．１Å、ＰＩＥＲＣＥ）を終濃度０．４ｍｍｏｌ／Ｌになる様に添加し、結合させた。この反応物を分画分子量１万の限外ろ過膜を用いて、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．５にバッファー交換し、ビオチン化抗体を調製した。
(1-2) Preparation of Biotinylated Antibody (Capture Reagent)
（１−３）標識試薬の調製
（１−１）で得られたストレプトアビジン固定化金コロイド溶液（ＯＤ５２０ｎｍ＝９）１０ｍＬに、（１−２）で得られたビオチン化抗体を混合時終濃度が０．１４ｍｇ／ｍＬとなるように加え、２５℃、１時間撹拌した後、４℃、２０時間静置し、４℃、１００００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を取り除き、分散用緩衝液を加えて再分散した。再び４℃、１００００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を取り除き、分散用緩衝液に再分散させ、標識試薬とした。
(1-3) Preparation of Labeling Reagent The biotinylated antibody obtained in (1-2) was mixed with 10 mL of the streptavidin-immobilized gold colloid solution (OD 520 nm = 9) obtained in (1-1). Add to a concentration of 0.14 mg / mL, stir at 25 ° C. for 1 hour, leave at 4 ° C. for 20 hours, centrifuge at 4 ° C., 10,000 × g for 10 minutes to remove the supernatant and disperse The working buffer was added and redispersed. Centrifugation was again performed at 4 ° C., 10000 × g for 10 minutes, and the supernatant was removed and re-dispersed in a dispersion buffer to obtain a labeling reagent.
（２）対照試薬の作製
１２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）に、アミノ基に反応するビオチン化試薬ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−Ｂｉｏｔｉｎ（スペーサー長５６Å、ＰＩＥＲＣＥ）を終濃度３．２ｍｍｏｌ／Ｌになる様に添加し、結合させた後、分画分子量５万の限外ろ過膜を用いて、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．５にバッファー交換し、対照試薬とした。
(2) Preparation of Control Reagent A 12 mg / mL BSA (SIGMA) biotinylated reagent EZ-Link NHS-PEG12-Biotin (spacer length 56 mm, PIERCE) that reacts with amino groups is adjusted to a final concentration of 3.2 mmol / L. Then, the solution was exchanged with a 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 50,000, and used as a control reagent.
（３）イムノクロマトグラフ用試験具の作製
（３−１）コンジュゲートパッドの作製
（１）で調製した標識試薬を、分散用緩衝液でＯＤ５２０ｎｍ＝４．５となるように調製した。これを、５ｍｍ×６ｍｍのガラスファイバーパッド（ミリポア）に１０μＬ染み込ませ、一晩室温で乾燥させて、コンジュゲートパッドを作製した。
(3) Preparation of immunochromatographic test device (3-1) Preparation of conjugate pad The labeling reagent prepared in (1) was prepared with a dispersion buffer so that OD 520 nm = 4.5. This was impregnated with 10 μL of a 5 mm × 6 mm glass fiber pad (Millipore) and dried overnight at room temperature to prepare a conjugate pad.
（３−２）反応膜の作製
３０ｍｍ×６ｍｍのニトロセルロースメンブレン（ミリポア）に、テストラインとして２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗マイコプラズマ・ニューモニエ マウスモノクローナル抗体（ＭＣＭ１９）溶液、コントロールラインとして２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した（２）の対照試薬を、塗布機（ＢｉｏＤｏｔ）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布し、乾燥させて、反応膜を作製した。コントロールラインは、ニトロセルロースメンブレン下流端から９ｍｍの位置に、テストラインは、ニトロセルロースメンブレン下流端から１４ｍｍの位置に設けた。
(3-2) Preparation of reaction membrane An anti-Mycoplasma pneumoniae mouse monoclonal antibody (MCM19) solution prepared to be 2 mg / mL as a test line on a 30 mm × 6 mm nitrocellulose membrane (Millipore), 2 mg / ml as a control line The control reagent (2) prepared to be mL was applied in a line shape having a width of about 1 mm using a coating machine (BioDot) and dried to prepare a reaction film. The control line was provided at a position 9 mm from the downstream end of the nitrocellulose membrane, and the test line was provided at a position 14 mm from the downstream end of the nitrocellulose membrane.
（３−３）イムノクロマトグラフ用試験具の組み立て
６９ｍｍ×６ｍｍのバックシート（日栄化工）上に図１のように各部材を貼り付けた。まず、（３−２）で作製した反応膜を貼り付けた。さらに、（３−１）で作製したコンジュゲートパッド、１７ｍｍ×６ｍｍのガラスファイバーパッド（ミリポア）からなる展開パッド、１０ｍｍ×６ｍｍの試料添加パッド（日本ポール）、２６．７ｍｍ×６ｍｍの吸収パッド（日本ポール）を重ねて貼り付けて、イムノクロマトグラフ用試験具を作製した。
(3-3) Assembly of immunochromatographic test device Each member was affixed on a 69 mm x 6 mm backsheet (Nichiei Kako) as shown in FIG. First, the reaction film prepared in (3-2) was attached. Furthermore, the conjugate pad prepared in (3-1), a development pad composed of a 17 mm × 6 mm glass fiber pad (Millipore), a 10 mm × 6 mm sample addition pad (Nihon Pole), a 26.7 mm × 6 mm absorption pad ( NIPPON POLE) was stacked and pasted to prepare an immunochromatographic test device.
（４）イムノクロマトグラフ用試験具の評価
評価用検体として、マイコプラズマ・ニューモニエ菌液を用意した。培養したマイコプラズマ・ニューモニエを、抽出液に１０４〜１０７ＣＦＵ／ｍＬになるように浮遊させ、陽性検体とした。また、評価用陰性検体として、マイコプラズマ・ニューモニエ菌を含まないものを用意した。なお、抽出液の組成は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ ＢＳＡである。
(4) Mycoplasma pneumoniae solution was prepared as a sample for evaluation and evaluation of immunochromatographic test devices . The cultured Mycoplasma pneumoniae was suspended in the extract so as to be 10 4 to 10 7 CFU / mL, and used as a positive specimen. A negative sample for evaluation was prepared that does not contain Mycoplasma pneumoniae. The composition of the extract is 0.1 mmol / L phosphate buffer pH 7.5, 0.15 mmol / L NaCl, 1% Triton X-100, 1% BSA.
（３）で作製した各イムノクロマトグラフ用試験具に、各検体を１２０μＬ滴下し、１５分後のテストラインおよびコントロールラインの染色を判定した。結果を表１に示す。染色度は、染色の強さが弱いものから強いものまでを「＋」から「＋＋＋＋＋＋（６＋）」として、判定用色見本と比較することにより半定量的に評価した。「−」は陰性の反応を示す。
本発明の試験具によって、１０４〜１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度域に渡って、一つの標識試薬でテストライン及びコントロールラインを判定することが確認できた。通常、検出可能なレンジとして求められている１０４〜１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度範囲で使用できるので有用であることがわかった。
120 μL of each specimen was dropped on each immunochromatographic test device prepared in (3), and staining of the test line and the control line after 15 minutes was determined. The results are shown in Table 1. The degree of staining was evaluated semi-quantitatively by comparing “+” to “+++++ (6+)” from weak to strong staining with a color sample for determination. “-” Indicates a negative reaction.
With the test device of the present invention, it was confirmed that the test line and the control line were judged with one labeling reagent over a concentration range of 10 4 to 10 7 CFU / mL. It has been found useful because it can be used in a concentration range of 10 4 to 10 7 CFU / mL which is usually required as a detectable range.
《実施例２：干渉除去抗体を用いた場合の効果の確認》
サンプル処理パッド（日本ポール）に、０〜１０ｍｇ／ｍＬのノーマルマウス抗体（ＭａＫ３３ ＩｇＧ１：ロシュ）を染み込ませたのち乾燥させ、干渉除去抗体を含む試料添加パッドを作製した。評価用検体として、１０５ＣＦＵ／ｍＬのマイコプラズマ・ニューモニエ菌液を使用した。それ以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマトグラフ用試験具を作製し、判定時のテストライン及びコントロールラインの視認性について評価した。
<< Example 2: Confirmation of effect when using interference-removing antibody >>
A sample treatment pad (Nihon Pole) was dipped in 0-10 mg / mL normal mouse antibody (MaK33 IgG1: Roche) and then dried to prepare a sample addition pad containing an interference removing antibody. As an evaluation sample, 10 5 CFU / mL of Mycoplasma pneumoniae bacterial solution was used. Otherwise, an immunochromatographic test device was prepared in the same manner as in Example 1, and the visibility of the test line and the control line at the time of determination was evaluated.
その結果を表２に示す。染色度は、染色の強さが弱いものから強いものまでを「＋」から「＋＋＋＋＋＋（６＋）」として、判定用色見本と比較することにより半定量的に評価した。
干渉除去抗体と捕捉抗体及び標識抗体が同じサブクラスのマウス抗体であっても、コントロールラインの低下が認められなかった。本発明の試験具では、異好性抗体および干渉除去抗体の影響を回避可能であることが確認できた。
The results are shown in Table 2. The degree of staining was evaluated semi-quantitatively by comparing “+” to “+++++ (6+)” from weak to strong staining with a color sample for determination.
Even when the interference-removing antibody, the capture antibody and the labeled antibody were mouse antibodies of the same subclass, no decrease in the control line was observed. It was confirmed that the test device of the present invention can avoid the effects of heterophilic antibodies and interference-removing antibodies.
本発明の試験具によって、一つの標識試薬でテストライン及びコントロールラインを確実性高く判定できる。また、対照用標識試薬を別途用意する必要が無いため、テストラインにおける対照用標識物質による非特異反応も生じることなく、簡便かつ低コストでイムノクロマトグラフ用試験具を製造することが可能となり、産業上有用である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
With the test device of the present invention, the test line and the control line can be determined with high certainty with one labeling reagent. In addition, since it is not necessary to prepare a control labeling reagent separately, it is possible to manufacture an immunochromatographic test device easily and at low cost without causing non-specific reaction due to the control labeling substance in the test line. It is useful above.
As mentioned above, although this invention was demonstrated along the specific aspect, the deformation | transformation and improvement obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.
１・・・反応膜；２・・・コンジュゲートパッド；３・・・展開パッド；
４・・・吸収パッド；５・・・バックシート；６・・・テストライン；
７・・・コントロールライン；８・・・試料添加パッド。
1 ... Reaction membrane; 2 ... Conjugate pad; 3 ... Development pad;
4 ... Absorbing pad; 5 ... Back sheet; 6 ... Test line;
7 ... control line; 8 ... sample addition pad.
Claims (8)
標識試薬と特異的に結合する対照試薬が固定化されているコントロールラインと、
を備えるイムノクロマトグラフ用試験具であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、イムノクロマトグラフ用試験具。 A test line on which a capture reagent that specifically reacts with a test substance is immobilized;
A control line on which a control reagent that specifically binds to the labeling reagent is immobilized;
An immunochromatographic test device comprising:
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
An immunochromatographic test device, wherein the control reagent contains biotin.
被検物質と標識試薬との複合体を、被検物質に特異的に結合する捕捉試薬で捕捉する工程、
被検物質と未反応の標識試薬を、標識試薬に特異的に結合する対照試薬で捕捉する工程、
捕捉試薬および対照試薬で捕捉した標識試薬を検出する工程、
を含む被検物質の分析方法であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、被検物質の分析方法。 A step of bringing a test substance into contact with a labeling reagent,
Capturing a complex of a test substance and a labeling reagent with a capture reagent that specifically binds to the test substance;
Capturing a test substance and an unreacted labeling reagent with a control reagent that specifically binds to the labeling reagent;
Detecting a labeling reagent captured with a capture reagent and a control reagent;
A method for analyzing a test substance containing
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
A method for analyzing a test substance, wherein the control reagent contains biotin.
被検物質と捕捉試薬との複合体に、標識試薬を接触させる工程
被検物質と未反応の標識試薬を、標識試薬に特異的に結合する対照試薬で捕捉する工程、
捕捉試薬および対照試薬で捕捉した標識試薬を検出する工程、
を含む被検物質の分析方法であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、被検物質の分析方法。 A step of capturing a test substance with a capture reagent that reacts specifically with the test substance A step of contacting a labeling reagent with a complex of the test substance and the capture reagent Labeling the test substance and an unreacted labeling reagent Capturing with a control reagent that specifically binds to the reagent;
Detecting a labeling reagent captured with a capture reagent and a control reagent;
A method for analyzing a test substance containing
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
A method for analyzing a test substance, wherein the control reagent contains biotin.
被検物質と未反応の標識試薬を、被検物質又はその類似体の競合物質である捕捉試薬で捕捉する工程、
被検物質と未反応の標識試薬を、標識試薬に特異的に結合する対照試薬で捕捉する工程、
捕捉試薬および対照試薬で捕捉した標識試薬を検出する工程、
を含む被検物質の分析方法であって、
前記標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、
前記対照試薬がビオチンを含むものである、被検物質の分析方法。 A step of bringing a test substance into contact with a labeling reagent,
Capturing the unreacted labeling reagent with the test substance with a capture reagent that is a competitive substance of the test substance or its analog,
Capturing a test substance and an unreacted labeling reagent with a control reagent that specifically binds to the labeling reagent;
Detecting a labeling reagent captured with a capture reagent and a control reagent;
A method for analyzing a test substance containing
The labeling reagent is obtained by linking a first affinity substance and a labeling substance that specifically bind to a test substance via avidin and biotin,
A method for analyzing a test substance, wherein the control reagent contains biotin.
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