JP3482214B2 - ホトルハブダス由来殺虫性タンパク毒素 - Google Patents

ホトルハブダス由来殺虫性タンパク毒素

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、細菌から分離された毒素および殺虫剤とし
ての当該毒素の使用に関する。
発明の背景 自家所有者、ピクニックにでかける人々、庭師、農業
従事者、および作物への昆虫被害の結果によりその農作
物における投資がしばしば壊滅または減少させられるそ
の他の人々にとって、多くの昆虫は広く害虫と見做され
る。特に成育期間が短い地域では、栽培者にとって顕著
な昆虫被害は全ての利益の喪失と作物収量の劇的な減少
を意味する。特定の農産物の供給不足は、食品加工業
者、続いて食用植物およびこれらの植物に由来する製品
の最終消費者にとって常に高コストをもたらす。
作物および花卉への昆虫の被害の防止および厄介な害
虫の排除は、典型的には強力な有機害虫駆除剤および広
範な毒性を有する殺虫剤に依存する。これらの合成生成
物は環境に対して、さらにそのような薬剤に曝される者
に対してあまりに過酷であるということで公衆の攻撃を
受けることとなった。非農業的状況においても同様に、
自家所有者は、昆虫を自宅に寄せつけないことに、また
戸外での食事に昆虫を殺す必要がないことに満足を覚え
るであろう。
化学殺虫剤の広範囲な使用は、農業従事者、当該殺虫
剤を製造する企業、政府機関、関心公衆団体および一般
大衆に環境と健康上の懸念を惹起した。より侵襲性の少
ない害虫制御方法は、社会の環境に対する懸念と、昆虫
制御機構を解明する生物学的手段の進歩の両方によって
促進された。生物学的制御剤は化学殺虫剤に対して有望
な選択肢を提供する。
それぞれの進化発達段階で生物は、自分自身の存続と
生存を強化する多様な手段を獲得する。防御と攻撃の手
段として生物学的分子を使用することは動物界および植
物界を通して知られている。さらに、遺伝子工学の比較
的新しい手段によって生物学的殺虫剤の改変が可能にな
り、特定の問題に対して特定の解決が得られる。
そのような薬剤の１つ、Bacillus thuringiensis（B
t）は効果的な殺虫性薬剤であり、広く産業的に用いら
れている。実際、Bt細菌殺虫剤は限定された毒性を有す
るタンパク質であり、収穫した日に人間の食用作物とし
て用いることができる。目標とされていない生物に対し
ては、このBt毒素は消化可能な非毒性タンパク質であ
る。
また別の既に知られている生物学的昆虫制御剤の類
は、殺虫性細菌共生者の媒介動物として知られているあ
る種の線虫類である。殺虫性細菌を含む線虫は昆虫の幼
虫に侵入する。続いて細菌は幼虫を殺し線虫は幼虫の死
体の虫で増殖する。続いて線虫の子どもは体内から死体
を食べる。このようにして生産された細菌含有線虫の子
どもは続いて新たな別の幼虫に侵入することができる。
これまでにSteinernemaおよびHeterorhabditis属の殺
虫性線虫が昆虫制御剤として用いられた。明らかに、線
虫の各属は特定の細菌の宿主となる。Heterorhabditis
属の線虫では、共生細菌はPhotorhabdus luminescensで
ある。
これらの線虫は効果的な昆虫制御剤であるが、それは
現時点では高価でさらに製造し、維持し、昆虫制御のた
めに線虫を散布させることが困難である。
当技術分野では、ホトルハブダス ルミネセンス（Ph
otorhabdus luminescens）から殺虫性毒素を分離できる
ことが知られている。この毒素は、鱗翅目および鞘翅目
昆虫の幼虫に注入されたときにのみ活性を有する。この
ことが、線虫またはその共生細菌の殺虫性特性の効果的
な開発を不可能にしている。大切なことは、散布後もそ
の生物学的特性を保持する殺虫性毒素のより実際的で、
非労働集約型の薬剤送達方法であろう。経***性を有す
るPhotorhabdus属が産生する毒素を見つけることが強く
所望される。これらの毒素の分離と使用は有効であると
いう理由から所望される。出願人らが発見するまで、こ
れらの毒素は分離されたことがなく、また性状を調べら
れたこともなかった。
発明の要旨 天然の毒素は、Photorhabdus属の増殖細菌細胞が産生
し分泌するタンパク複合体で、特に興味のあるものはPh
otorhabdus luminescens種が産生するタンパク質であ
る。約1000kDaの分子量サイズをもつタンパク複合体
を、SDS−PAGEゲル分析で多数の成分タンパク質に分離
させることができる。この毒素はヘモリジン、リパー
ゼ、Ｃ型ホスホリパーゼまたはヌクレアーゼ活性を含ま
ない。この毒素は、多数の昆虫に曝露投与したとき顕著
な毒性を示す。
本発明は、投与が容易な殺虫性タンパク質とともに異
種系における毒素の発現を提供する。
本発明はまた、多くの昆虫目に対して機能する活性を
もちさらに効果的な殺虫性毒素の薬剤送達方法を提供す
る。
本発明の目的、利点および特徴は以下の明細書から明
らかになるであろう。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の毒素の配列遺伝子の一部として用い
たクローン化DNA分離物の対合を示す。
図２は、配列決定工程で用いた３つのプラスミドのマ
ップである。
図３は、幾つかの部分DNAフラグメント間の関係を示
すマップである。
図４は、TcbAiiおよびTcaBiiタンパク質のタンパク配
列間の相同性分析を示す。
図５は、Photorhabdus株の樹状図である。Photorhabd
us株の関係はrep−PCRで規定された。図５の上部の軸
は、rep−PCRの得点に基づく株間の％類似性を示す（す
なわち、0.0（類似性なし）から1.0（100％類似
性））。右軸の数字と文字は調べた種々の株を示す。す
なわち、14＝Ｗ−14、Hm＝Hm、H9＝H9、７＝WX−７、１
＝WX−１、２＝WX−２、88＝HP88、NC−１＝NC−１、４
＝WX−４、９＝WX−９、８＝WX−８、10＝WX−10、WIR
＝WIR、３＝WX−３、11＝WX−11、５＝WX−５、６＝WX
−６、12＝WX−12、x14＝WX−14、15＝WX−15、Hb＝H
b、B2＝B2、48から52＝ATCC43948からATCC43952。水平
線を分けている垂直の線は水平線ベースにある株または
株群の間の関係の度合い（例えば株Ｗ−14は株H9および
Hmと約60％類似である）を示している（これは上部の軸
と垂直線との外挿交点から読む）。
図６は、Ｗ−14株のゲノムマップである。
発明の詳細な説明 本発明は、昆虫に対して経口毒性を有するPhotorhabd
us属由来の極めて稀な殺虫性毒素類の発見を目的とす
る。Photorhabdusの固有の特性はその生物発光である。
Photorhabdusは種々の起源から分離することができる。
そのような起源の１つは線虫、より具体的にはHeterorh
abditis属の線虫である。また別の起源は人間の創傷か
ら得られる臨床サンプル由来である（Farmerら、J.Cli
n.Microbiol.27:1594−1600（1998）を例えば参照）。
これらの死物寄生株はアメリカ菌培養収集所（ロックビ
ル、メリーランド）に、ATCC＃43948、43949、43950、4
3952として寄託されており、この文献は参照により本明
細書に含まれる。他のものも殺虫性毒素を産生するPhot
orhabdus細菌を含む可能性があるだろう。環境中のその
ような起源は陸性または水性由来のいずれでも可能であ
ろう。
Photorhabdus属は、分類学的には腸内細菌科の菌と定
義されるが、この科に関しては非定型的なある種の特徴
を有する。例えば、この属の株は硝酸塩還元陰性、黄色
および赤色色素産生性、並びに生物発光性である。この
後者の特徴は腸内細菌科では知られてない。Photorhabd
usは最近になってXenorhabdusとは別の属として記載さ
れた（Boemareら。、Int.J.Syst.Bacteriol.43:249−25
5（1993））。この相違は、DNA−DNAハイブリダイゼー
ション実験、表現型の相違（例えばカタラーゼおよび生
物学的発光の有無（有（Photorhabdus）無（Xenorhabdu
s））、線虫宿主の種類（Xenorhabdus;（Steinernemati
dae）、Photorhabdus;（Heterorhabditidae））を基に
している。細胞脂肪酸の比較分析（Janseら、Lett.App
l.Microbiol.10:131−135（1990）;Suzukiら、J.Gen.Ap
pl.Microbiol.36:393−401（1990））は、Photorhabdus
のXenorhabdusからの分離を支持する。
本明細書で開示する株収集がPhotorhabdusを含むこと
を確認するために、Photorhabdusと特定し、さらに他の
腸内細菌科およびXenorhabdus種と区別するために認知
されている特徴に基づいてこれらの株の性状を調べた
（Farmer,Bergy's Manual of Systemic Bacteriology,1
巻、510−511;Akhurst ＆ Boemare,J.Gen.Microbiol.13
4:1835−1845（1988）;Boemareら、Int.J.Syst.Bacteri
ol.43:249−255（1993）、これらの文献は参照により本
明細書に含まれる）。調べた特徴は以下のとおりであっ
た：グラム染色陰性桿菌、微生物のサイズ、コロニー色
素沈着、封入体、カタラーゼの存在、硝酸塩還元能、生
物学的発光、色素取り込み、ゼラチン水解、選択培地の
で増殖、増殖温度、嫌気性条件下での生存および運動
性。脂肪酸分析は、本明細書の株は全て単一のPhotorha
bdus属に属することを確認するために用いた。
現在のところ、Photorhabdus属細菌は単一の限定され
た種、Photorhabdus luminescence（ATCC標準株＃2999
9、Poinarら、Nematologica 23:97−102（1977））を含
む。種々の関連株が文献に記載された（Akhurstら、J.G
en.Microbiol.134:1835−1845（1988）;Boemareら、In
t.J.Sys.Bacteriol.43:249−255（1993）;Putzら、App
l.Environ.Microbiol.56:181−186（1990））。本明細
書では多数の株の性状を調べた。そのような株は実施例
の表18に挙げた。現在のところPhotorhabdus属に規定さ
れるのはただ１つの種（luminescence）のみであるの
で、luminescence種の特徴は本明細書の株の特徴として
用いた。図５で分かるように、これらの株は極めて多様
である。luminescence種の特徴の幾つかを有し、しかも
現在のところPhotorhabdus luminescenceの特徴として
認識されていないいくつかの異なる特質を有する他のPh
otorhabdus種が将来出現することは予期せぬことではな
い。しかしながら、本発明の範囲は、それらの特徴およ
び性状にもかかわらず、昆虫制御剤としての機能的活性
を有するタンパク質を産生する一切のPhotorhabdus種ま
たは株を含む。
さらにまた、本明細書で具現するように、Photorhabd
us属の細菌は、本明細書で規定するように機能的な活性
を有するタンパク質を産生する。特に興味深いものは、
Photorhabdus luminescence種によって産生されるタン
パク質である。本明細書の発明はここに開示する株に全
く限定されるべきではない。これらの株は、Photorhabd
usの多様な分離株によって産生されるタンパク質は昆虫
をこれに曝したとき有毒であることを初めて例証する。
したがって、本発明に含まれるものは、本明細書で明ら
かにする特徴をもつ株およびその全ての変異株ととも
に、本明細書で開示する機能的活性を有するPhotorhabd
us属の一切の株または種である。
特定の意味を有し本明細書で用いられるいくつかの用
語があるが、それは以下のとおりである。
本明細書では“機能的な活性”とは、該タンパク毒素
が、経口的に活性であるか、または毒性効果を有してい
るか、または摂食を妨害させるか停止させて（昆虫の死
を引き起こすか否かにかかわらない）、昆虫制御剤とし
て機能することを意味する。昆虫が遺伝子導入植物の発
現、製剤化タンパク組成物、噴霧可能タンパク組成物、
毒餌マトリックスまたは他の薬剤送達系によってもたら
された有効量の毒素と接触するとき、典型的にはその結
果は昆虫の死であるか、または昆虫は毒素を昆虫に利用
させる元となる餌を食べることができない。
“Photorhabdus毒素”という用語を用いるとき、当該
用語はPhotorhabdus微生物株によって産生される、昆虫
に対して機能的な活性を有する一切のタンパク質を指す
が、この場合、Photorhabdus毒素は噴霧可能な組成物と
して製剤化されるか、遺伝子導入植物によって発現され
るか、毒餌マトリックスとして製剤化されるか、バキュ
ロウイルスを介して分布させられるか、または他の利用
可能な一切の宿主もしくは薬剤送達系を用いて分布させ
られる。
本明細書で考察されるタンパク毒素は典型的には“殺
虫剤”と呼ばれる。本明細書では“殺虫剤”とは、本明
細書でさらに定義するように、タンパク質が“機能的な
活性”を有し、昆虫制御剤として用いられることを意味
する。
“オリゴヌクレオチド”という用語は、RNAまたはDNA
のいずれかの短い鎖から成る巨大分子を意味する。その
ような鎖の長さは少なくとも１個のヌクレオチドである
が、典型的には約10から12ヌクレオチドの範囲である。
オリゴヌクレオチドの長さの決定は当技術分野で周知
で、本明細書で限定すべきものではない。したがって、
オリゴヌクレオチドは10未満でもよく、12より大きくて
もよい。
本明細書で用いられるように、“有毒”または“毒
性”という用語は、Photorhabdusによって産生される毒
素が、本明細書で定義するように“機能的な活性”を有
することを意味する。
本明細書で用いられるように、“遺伝物質”とは全て
の遺伝子、核酸、DNAおよびRNAを含むことを意味する。
表18で報告する選択株の醗酵ブロスを用いて、Photor
habdus属による殺虫性毒素産生の幅、これら毒素の殺虫
スペクトルを決定し、さらに毒素複合体の精製のための
出発材料が提供される。本明細書で性状を調べた株は昆
虫の多様な目に対して経口毒性を有することが示され
た。そのような昆虫目には、Coleoptera、Homoptera、L
epidoptera、Diptera、Acarina、HymenopteraおよびDic
tyopteraが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。
他の細菌毒素に関しては、この細菌の集団内の変異率
は、現存の配列と僅かに異なる多くの関連毒素を生じ
る。本明細書で興味のある毒素は、本明細書で開示する
ように暴露に際して多様な昆虫に毒性を有するタンパク
複合体を産生するものである。好ましくは、この毒素は
Coleoptera、Homoptera、Lepidoptera、Diptera、Acari
na、HymenopteraおよびDictyopteraに対して活性を有す
る。本発明は、本明細書の株およびその一切の誘導株に
よって産生されるタンパク毒素とともに、Photorhabdus
によって産生される全てのタンパク毒素と同種のタンパ
ク毒素を包含することを意図する。これらの同種タンパ
ク質は配列が異なるかもしれないが、本明細書で述べる
これらの毒素とは機能が異なることはない。同種毒素は
300kDaから2000kDaの間のタンパク複合体を含み、さら
に少なくとも２つのサブユニットを含むことが意図され
る。この場合、１つのサブユニットはペプチドで、他の
サブユニットと同じでも異なっていてもよい。種々のタ
ンパクサブユニットが同定され、本明細書の実施例で開
示される。典型的には、該タンパクサブユニットは約18
kDaから約230kDa、約160kDaから約230kDa、約100kDaか
ら160kDa、約80kDaから約100kDa、および約50kDaから約
80kDaである。
上記で考察したように、いくつかのPhotorhabdus株が
線虫から分離された。幾つかの線虫（線虫門の細長い筒
状の寄生虫）は、好ましい増殖環境として昆虫の幼虫を
利用する能力を進化させた。昆虫の幼虫は、成長する線
虫のために摂食源および増殖のための環境を提供する。
ある種の線虫による幼虫の侵入に続く劇的な作用の１つ
は幼虫の死である。幼虫の死は、ある種の線虫では殺虫
性毒素を産生する細菌の存在によって生じる。この毒素
は幼虫の増殖を拘束し、摂食能力を抑制する。
興味深いことには、昆虫寄生線虫は、当該線虫との共
生増殖のために固有の適応を示す特定の細菌種の宿主で
あるらしい。この研究を開始して暫くの間、細菌のXeno
rhabdusの呼称はXenorhabdusおよびPhotorhabdusに再分
類された。Photorhabdus属の細菌はHeterorhabditus線
虫の共生細菌であるという性状を有し、一方、Xenorhab
dus種はSteinernema種の共生細菌である。命名法に於け
るこの変化は本明細書にも反映されているが、命名法に
おけるこの変化は、本明細書に開示する本発明の範囲に
全く影響を与えない。
本明細書に開示するペプチドおよび遺伝子は、J.Bact
eriology誌の“著者への指示（Instructions to Author
s）”（ｉ−xiiページ、1996年、１月）（この文献は参
照により本明細書に含まれる）に最近発表されたガイド
ラインにしたがって名称を付与した。以下のペプチドお
よび遺伝子がPhotorhabdus株Ｗ−14から分離された。
上記に挙げた配列はゲノム領域でグループ分けされて
いる。tcbA遺伝子は、実施例で説明するように２つのタ
ンパクフラグメントTcbAおよびTcbAiiiとして大腸菌で
発現された。いくつかの配列をタンパク質分解によって
切り取って、遺伝子導入用市販品のためにより高い活性
をもつ毒素を得ることは有益であろう。
本明細書で開示する毒素は、当該毒素が機能的な活性
（これが昆虫制御戦略の開発の鍵であるが）を有すると
いう点において極めて特異的である。昆虫制御戦略の開
発では、生物の消化管を避けて当該生物に直接タンパク
質を注射してタンパク分解過程を遅らせまたは妨害する
ことが可能である。そのような場合には、該生物に投与
されるタンパク質は、変性、非特異的分解または高等生
物の免疫系による排除までその機能を保持するであろ
う。殺虫性毒素の昆虫への注射は実験室でのみ応用が可
能で、さらに容易に注射できる大型の昆虫について可能
である。本明細書で開示する殺虫性タンパク毒素は、経
口消化または毒素との接触後にその毒性活性を表すとい
う観察は、該タンパク毒素を昆虫の餌に取り込ませるこ
との可能性を専らあてにする昆虫制御計画の開発を可能
にする。そのような計画の結果は昆虫の毒餌であろう。
Photorhabdusの毒素は昆虫に精製形で投与してもよ
い。この毒素はまた約１から約100mg/リットルブロスの
量で薬剤分布させてもよい。これは、製剤の条件、接種
源の条件、毒素分離技術などにしたがって変動するであ
ろう。この毒素は異種原核細胞または真核細胞宿主で初
めに発現された滲出分泌物または細胞タンパク質として
投与してもよい。細菌は、典型的には当該タンパク質が
発現される宿主である。真核細胞宿主には植物、昆虫お
よび酵母が含まれるが、これらに限られるものではな
い。また別にはこの毒素は、細菌により、または野外で
遺伝子導入植物により、またはバキュロウイルスベクタ
ーにより昆虫で産生させてもよい。典型的にはこの毒素
は、昆虫の餌に１種または２種以上の毒素を混ぜること
によって昆虫に導入されるであろう。
摂食昆虫に対する完全致死率は有用であるが、有意義
な毒性を達成するためには要求されない。もし昆虫が毒
素を避けるかまたは摂食を中止するならば、たとえ毒素
の効果が致死量以下であったとしてもこの回避行動は幾
つかの応用例で有用であろう。例えば、昆虫耐性遺伝子
導入作物植物を所望する場合、昆虫が当該植物を接触す
るのをためらうことは該昆虫に対する致死的毒性と同様
に有用である。なぜならば、究極の目的は該植物の保護
であって当該昆虫を死滅させることではないからであ
る。
毒素を昆虫の餌に混ぜるために他の多くの方法があ
る。一例として、本明細書に開示したようにタンパク質
溶液を噴霧して当該毒素タンパク質を幼虫の摂食源に混
ぜることが可能である。また別には、精製タンパク質を
無害な細菌に遺伝子工学によって導入し、続いてこれを
培養して増殖させ、さらに摂食源に用いるかまたは該昆
虫を撲滅しようとする地域の土壌に定着させる。また、
該タンパク質を昆虫の摂食源に遺伝子工学的に直接導入
することもできる。例えば、多くの昆虫の幼虫の主要な
摂食源は植物成分である。
Photorhabdus毒素の殺虫特性をコードする遺伝成分
を、特定の害虫が摂食する植物のゲノムに組み込むこと
によって、該摂食用植物を食べた後で成虫または幼虫は
死滅するであろう。単子葉および双子葉に属する多くの
植物が形質転換された。遺伝子導入農作物は果物および
野菜とともに商業的に重要である。そのような作物には
トウモロコシ、コメ、ダイズ、カノラ（canola）、ヒマ
ワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、綿花、ピー
ナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれるが、これらに
限られるものではない。外来遺伝成分を植物細胞に導入
し、さらに該導入遺伝子を安定的に維持し発現させるた
めにはいくつかの技術がある。そのような技術には、微
粒子上に被覆された遺伝物質の直接細胞導入の促進が含
まれる（米国特許4945050号（Cornell）および同514113
1号（DowElanco））。植物はアグロバクテリウム関連技
術を用いて形質転換できる（米国特許5177010号（Unive
rsity of Tpledo）、同5104310号（Texas A＆Ｍ）、欧
州特許出願公開公報第0131624B1号、欧州特許出願公開
公報第120516号、同159418B1号および同176112号（Schi
lperoot）、米国特許5149645号、同5469976号、同54647
63号および同4940838号、並びに同4693976号（Schilper
oot）、欧州特許出願公開公報第116718号、290799号、3
20500号（全てMaxPlanck）、欧州特許出願公開公報第60
4662号および627752号（Jaapan Tobacco）、欧州特許出
願公開公報第0267159号および0292435号並びに米国特許
5231019号（全てCiba Geigy）、米国特許5463174号およ
び4762785号（ともにCaigene）、米国特許5004863号お
よび5159135号（ともにAgracetus）を参照のこと）。他
の形質転換技術にはウィスカー（Whiskers）の技術（米
国特許5302523号および5464765号（ともにZeneca）を参
照のこと）が含まれる。電気穿孔術（Electroporation
technology）もまた植物の形質転換に用いられた（WO87
/06614号（Boyce Thompson Institute）、同5472869号
および5384253号（ともにDekalb）、WO9209695号および
WO9321335号（ともにPGS）を参照のこと）。これらの形
質転換に関する特許および刊行物は参照により本明細書
に含まれる。植物を形質転換させる多くの技術だけでな
く、外来遺伝子と接触する組織の種類も同様に変化をも
たせることができる。そのような組織には胎児性組織、
カルス組織Ｉ型およびII型、ヒポコチル、メリステムな
どが含まれるが、これらに限定されるものではない。ほ
とんど全ての植物組織は、当技術分野の適切な技術を用
いて分化中に形質転換させることができる。
また別の変動因子は、選別マーカーの選択である。具
体的マーカーとして何を選択するかは当業者の自由裁量
であるが、以下の選別マーカーのいずれも使用すること
ができ、さらに、本明細書に挙げられていない選別マー
カーとして機能しえる他の何れの遺伝子も用いることが
できる。そのような選別マーカーには、トランスポゾン
Tn5（Aph II）のアミノグリコシドホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（これは、抗生物質（カナマイシン、ネオ
マイシンおよびG418）に対する耐性をコードする）とと
もに、グリホセート；ヒグロマイシン；メトトレキセー
ト；ホスフィノスリシン（ビアロホス）；イミダゾリノ
ン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン除草
剤（例えばクロロスルフロン）；ブロモキシニル、ダラ
ポンなどに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子
が含まれるが、これらに限定されるものではない。
選別マーカーの他に、レポーター遺伝子を用いること
が望ましい。いくつかの例では、選別マーカーを使用し
ないでレポーター遺伝子を用いることができる。レポー
ター遺伝子は、受容生物または組織には典型的には存在
しないかまたは発現されない遺伝子である。レポーター
遺伝子は典型的には、何らかの表現型の変化または酵素
特性を提供するタンパク質をコードする。そのような遺
伝子の例は文献に記載されている（K.Weisingら、Ann.R
ev.Genetics 22:421（1988）、この文献は参照により本
明細書に含まれる）。好ましいレポーター遺伝子はグル
クロニダーゼ（GUS）遺伝子である。
形質転換技術に関係なく、植物プロモーターをベクタ
ーに包含させることによって植物細胞でPhotorhabdus毒
素を発現できるように適応させた遺伝子伝達ベクターに
好ましくは当該遺伝子を取り込ませる。植物プロモータ
ーの他に、種々の起源のプロモーターが、外来遺伝子を
発現させるために植物細胞で有効に用いられる。例え
ば、細菌由来のプロモーター（例えばオクトピンシンセ
ターゼプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモータ
ー、マンノピンシンセターゼプロモーター）、ウイルス
由来プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイル
ス（35Sおよび19S））などを用いることができる。植物
プロモーターには、リブロース−1,6−ビスホスフェー
ト（RUBP）カルボキシラーゼ小サブユニット（ssu）、
ベーターコングリシニンプロモーター、ファセオリンプ
ロモーター、ADHプロモーター、熱ショックプロモータ
ーおよび組織特異的プロモーターが含まれるが、これら
に限られるものではない。プロモーターはまた、転写効
率を改良することができるある種のエンハンサー配列成
分を含むことができる。典型的なエンハンサーにはAdh
−イントロン１およびAdh−イントロン６が含まれる
が、これらに限定されない。構造性プロモーターも用い
ることができる。構造性プロモーターは、全ての細胞型
で常に連続的な遺伝子発現を誘導する（例えばアクチ
ン、ユビキチン、CaMV35S）。組織特異的プロモーター
も例えば葉または種子のような特定の細胞または組織型
での遺伝子発現をもたらし（例えばゼイン、オレオシ
ン、ナピン、ACP）、これらのプロモーターもまた使用
できる。プロモーターは、植物組織および器官で活性を
有するのと同様に植物の発育時の一定段階でもまた活性
を有する。そのようなプロモーターの例には花粉特異
的、胎児特異的、トウモロコシの穂の毛特異的、綿花繊
維特異的、根特異的、種子エンドスパーム（endosper
m）特異的プロモーターなどが含まれるが、これらに限
定されるものではない。
ある種の環境下では、誘導可能なプロモーターを用い
ることが望ましいであろう。誘導可能なプロモーター
は、特異的シグナル（例えば生理的シグナル（熱ショッ
ク遺伝子）、光（RUBPカルボキシラーゼ）、ホルモン
（Em）、代謝物およびストレス）に反応して遺伝子の発
現をもたらす。植物で機能する他の望ましい転写および
翻訳成分も用いることができる。植物特異的な多くの遺
伝子伝達ベクターが当技術分野で知られている。
さらに、植物で細菌遺伝子の高い発現を得るために
は、細菌遺伝子が植物の細胞質でより効果的に発現する
ようにそれらを再操作することが好ましいことが知られ
ている。トウモロコシは、形質転換の前に細菌遺伝子を
再操作して植物での毒素の発現レベルを高めることが好
ましい植物の１つである。再操作の理由の１つは、天然
の細菌遺伝子のＧ＋Ｃ含有量が極めて低い（Ａ＋Ｔ含有
量が高いという結果になる）ということである。この結
果は、Ａ＋Ｔが極めて豊富であることが知られている植
物遺伝子制御配列を模倣するまたは複製する配列の作製
であろう。植物内に導入される遺伝子のDNA内にＡ＋Ｔ
に富むいくつかの配列（例えば遺伝子プロモーターに通
常見出されるTATAボックス領域）が存在するということ
は、遺伝子の異常な転写をもたらす可能性がある。他
方、転写mRNAに存在する他の調節配列（例えばポリアデ
ニル化シグナル配列（AAUAAA）または前駆体mRNAのスプ
ライシングに必要な小型の核RNA）の存在は、RNAの不安
定性につながるかもしれない。したがって、再操作した
細菌遺伝子デザイン（より好ましくは植物最適化遺伝子
と称される）の目標の１つは、より高いＧ＋Ｃ含有量を
もつDNA配列、および好ましくは代謝酵素をコードする
植物遺伝子のそれに近いものを作製することである。植
物最適化遺伝子のデザインのまた別の目標は、Ｇ＋Ｃ含
有量が高いというだけでなく、その配列変化を修飾（変
更）することによって翻訳を妨げないDNA配列を作製す
ることである。
高Ｇ＋Ｃ含有量を有する植物の例はトウモロコシであ
る。下記の表は、Ｇ＋Ｃ含有量がトウモロコシでどのよ
うに高いかを示している。トウモロコシの場合のよう
に、他の植物のＧ＋Ｃ含有量もまた高いと考えられる。
表１のデータについては、遺伝子のコード領域はGenB
ank（レリース71）の登録から抽出し、塩基組成はマッ
クベクター（登録商標）プログラム（MacVectorTM,IBI,
New Haven,コネチカット）を用いて計算した。イントロ
ン配列は計算では無視した。Ｉ群およびII群の貯蔵タン
パク遺伝子配列はそれらの塩基組成における顕著な相違
で区別した。
遺伝暗号の余剰性（すなわちいくつかのアミノ酸は１
つ以上のコドンによって特定される）によって許容され
る柔軟性のゆえに、異なる生物または異なる種類のゲノ
ムの進化は余剰コドンの異なる用い方をもたらした。こ
の“コドンの偏り”はタンパクコード領域の平均塩基組
成に現れる。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含有量をもつ生
物は余剰コドンの第三位にＡまたはＴを有するコドンを
利用し、一方、高いＧ＋Ｃ含有量をもつものは第三位に
ＧまたはＣを有するコドンを利用する。遺伝子のmRNA内
に“マイナー”コドンが存在することによって、特に該
マイナーコドンに対応する稼働tRNAの相対的なゆとりが
低い場合は当該mRNAの絶対翻訳率が低下すると考えられ
る。これを拡大すれば、個々のマイナーコドンによる翻
訳率の低下は、多数のマイナーコドンについて少なくと
も累積的であるということである。したがって、マイナ
ーコドンの含有量が比較的高いmRNAはそれに対応して翻
訳率が低いであろう。この翻訳率は、該当コードタンパ
ク質の低レベルの合成によって体現される。
細菌遺伝子の再操作のために植物のコドンの偏りを決
定する。コドンの偏りは、植物がそのタンパク質をコー
ドするために用いる統計的コドン分布である。この偏り
を求めた後で対象遺伝子のコドンの％頻度を求める。植
物が好んで用いる主要コドンが、第二および第三の好ま
しいコドンとともに求められるべきであろう。対象タン
パク質のアミノ酸配列を逆に翻訳し、その結果、生じた
核酸配列が天然の細菌遺伝子と同じタンパク質をコード
するが、生じた核酸配列は所望の植物の第一の好ましい
コドンに対応するようにした。新規な配列は、変更によ
ってつくり出された制限酵素部位に関して分析される。
さらに第二または第三の好ましい選択コドンで当該コド
ンを置換することによって、この特定した部位を変更す
る。対象遺伝子の転写または翻訳に影響を与える配列内
のその他の部位は、エクソン：イントロン5'または3'結
合部、ポリＡ付加シグナル、またはRNAポリメラーゼ終
結シグナルである。さらにこの配列を分析し、TAまたは
GC対の頻度を減少させるために修飾する。これらの対の
他に、約４つ以上同じ残基を有するＧまたはＣ配列ブロ
ックも当該配列の転写に影響を与える。したがって、こ
れらのブロックもまた第一または第二の選択コドンなど
をその次に好ましい選択コドンで置換することによって
変更される。好ましくは、この植物最適化遺伝子は、約
63％の第一の選択コドンを、約22％から約37％の第二の
選択コドンを、さらに15％から０％の第三の選択コドン
を含み、ここで百分率の合計は100％である。最も好ま
しくは、植物最適化遺伝子は、約63％の第一の選択コド
ンを、少なくとも約22％の選択コドンを、約7.5％の第
三の選択コドンを、さらに約7.5％の第四の選択コドン
を含み、ここで百分率の合計は100％である。上記に述
べた方法は、当業者が、特定の植物にとって外来性であ
る遺伝子を修飾し、その結果該遺伝子を植物内で最適に
発現させることを可能にする。本方法は、現在審査中の
条件付き米国特許出願60/005405号（1995年10月13日出
願、この文献は参照により本明細書に含まれる）でさら
に詳述されている。
したがって、植物最適化遺伝子をデザインするため
に、形質転換される特定の植物についての遺伝子DNA配
列に関して編集したコドンの偏り表から確定した非余剰
性遺伝暗号を用いて、該毒素のアミノ酸配列をDNAに逆
翻訳する。得られたDNA配列（これはコドンの用い方に
おいては完全に均質である）をさらに修飾して、より高
いコドンの多様性を有するという他に、計画的な制限酵
素部位の配置、所望の塩基組成、および遺伝子の転写ま
たは生成mRNAの翻訳に干渉するおそれのある配列の除去
を図る。
細菌遺伝子がプラスミドで発現される場合には、該細
菌遺伝子はもっと容易に植物で発現されるであろうとい
う学説がある。したがって、遺伝子を植物発現に最適に
することなく細菌遺伝子を植物で発現させ、タンパク質
の高発現を得ることは可能かもしれない（例えば米国特
許4762785号、5451513号および5545817号を参照のこ
と、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。
商品として遺伝子導入植物を開発するための課題の１
つは耐性の管理である。これはBacillus thuringiensis
毒素に関して特にいえる。商業的にBacillus thuringie
nsisを開発している企業は多く、耐性Bt毒素に関しては
これまで懸念が多かった。昆虫の耐性に関する管理につ
いてのこれまでの戦略はPhotorhabdusによって産生され
る毒素を例えばBtのような草食性昆虫タンパク毒素（Ci
ba Geigy）または他の毒素と混ぜることであろう。噴霧
可能なようにこの組み合わせを製剤化するか、または分
子として組み合わせることができるであろう。植物は、
昆虫毒素を産生するPhotorhabdus遺伝子および他の昆虫
毒素遺伝子（例えばBt）で形質転換できるであろう。
欧州特許出願公開公報第0400246A1は、２種のBt（こ
の２種の遺伝子は何でもよい）による１つの植物の形質
転換を開示する。１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む遺伝
子導入植物を製造するまた別の方法は、各植物が１つの
昆虫耐性遺伝子を含む１種の植物を製造することであ
る。これらの植物を慣習的な交配技術を用いて戻し交配
し、２種以上の昆虫耐性遺伝子を含む植物を製造する。
植物最適化遺伝子を含む形質転換植物の製造に加え
て、細菌遺伝子の再操作にとって望ましいと思われる他
の薬剤送達系が存在する。同じように摂食源として昆虫
誘因性をもつ分子と毒素の殺虫活性とを融合させた、遺
伝学的に操作して容易に分離可能なタンパク毒素を作出
し、標準的で周知の技術を用いて細菌または真核細胞で
発現させることができる。研究室で精製した後、“はめ
込み式”毒餌を含むそのような毒素薬剤は標準的な昆虫
補足用ハウジングに梱包できる。
別の薬剤送達系はバキュロウイルスベクターに毒素の
遺伝物質を取り込ませることである。バキュロウイルス
は、特定の昆虫宿主（Photorhabdus毒素の好ましい標的
である昆虫を含む）に感染する。Photorhabdus毒素の発
現構築物を含む感染性バキュロウイルスを昆虫被害地域
に導入し、それによって感染昆虫を毒で汚染させる。
殺虫特性の伝達には、タンパク発現ベクターに組み込
まれたPhotorhabdus毒素のアミノ酸配列をコードする核
酸配列が必要である。当該ベクターはそれが生存する宿
主にとって適切なものでなければならない。殺虫特性を
有するタンパク質をコードする核酸配列を得る方法の１
つは、毒素のアミノ酸配列（その大部分は下記で詳述す
る）から推定される情報を用いて、Photorhabdusから該
毒素を産生する天然の遺伝物質を分離することである。
下記で説明するように、毒素活性をもたらすタンパク質
を精製する方法もまた開示する。
下記に述べるようにＮ−末端アミノ酸情報を用いて、
当該毒素の最初のアミノ酸をコードするDNA塩基の全て
（または部分）に対して相補的なオリゴヌクレオチドを
構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドを
放射能標識して、Photorhabdus株から分離した遺伝物質
から構築したゲノム遺伝子ライブラリーから当該遺伝物
質を分離するために分子プローブとして用いることがで
きる。この遺伝子ライブラリーは、プラスミド、コスミ
ド、ファージまたはファージミドベクターでクローニン
グできる。このライブラリーで大腸菌を形質転換し、毒
素に対して作製した抗体または昆虫毒素のための直接ア
ッセイを用いて、形質転換細胞による毒素産生について
スクリーニングすることができるであろう。
このアプローチはオリゴヌクレオチド一式の産生を必
要とする。なぜならば、縮退遺伝暗号のために、１つの
アミノ酸は数個の３ヌクレオチドの組み合わせによって
コードされえるからである。例えば、アミノ酸のアルギ
ニンは核酸トリプレット、CGA、CGC、CGG、CGT、AGAお
よびGGによってコードされえる。どのトリプレットが毒
素遺伝子のその位置で用いられるかを予想することはで
きないので、可能性のあるトリプレットの各々を用いて
オリゴヌクレオチドを調製する必要がある。経口毒素を
完成させるために必要なタンパクサブユニットの全てを
回収するためには、１つのタンパクサブユニットに対応
する１つ以上のDNA分子が、充分な数のオリゴヌクレオ
チドプローブを構築するために必要であろう。
精製タンパク質のアミノ酸配列から、毒素の生産に必
要な遺伝物質は容易に分離することができ、さらに分子
生物学の技術分野で習熟した者にとって周知のいくつか
の技術の何れかを用いて発現ベクターに全体または部分
をクローニングすることができる。典型的な発現ベクタ
ーはDNAプラスミドであるが、コスミド、ファージミド
およびファージを含む（ただしこれらに限定されない）
他の伝達手段もまた用いることができる。プラスミドの
複製のために必要なまたは望ましい特性（例えば複製起
点および抗生物質耐性または他の形態の選別マーカー
（例えばSteptomyces hygroscopicusまたはviridochrom
ogenesのbar遺伝子））に加えて、タンパク発現ベクタ
ーは通常発現カセットを必要とする。これは、対象の遺
伝子の転写および翻訳に必要なcis−作動性配列を含ん
でいる。原核細胞での発現に必要なcis−作動性配列
は、真核細胞および植物で必要とされるものとは異なっ
ている。
真核細胞発現カセットは、対象の遺伝子に対して上流
（5'）に転写プロモーター、転写終結領域（例えばポリ
Ａ付加部位）および対象の遺伝子の最初のコドンの上流
にリボソーム結合部位を必要とする。細菌細胞の場合に
ベクターに含むことができる有用な転写プロモーター
は、T7RNAポリメラーゼ結合プロモーターである。本明
細書で先に述べたように、プロモーターはmRNAの転写を
効果的に促進することが知られている。また対象の遺伝
子から上流に、該ベクターはシグナル配列をコードする
ヌクレオチド配列を含むことができるが、これは、宿主
細胞の特定の部分（例えば細胞表面）に共有結合によっ
て連結されたタンパク質を誘導することが分かってい
る。
昆虫ウイルスまたはバキュロウイルスは、ある種の昆
虫に感染または悪い影響を与えることが知られている。
昆虫に対するウイルスのこの影響は緩徐で、ウイルスは
昆虫の摂食を停止させない。したがって、ウイルスは害
虫制御剤として有用なようには見えない。Photorhabdus
毒素遺伝子をバキュロウイルスベクターに結合させるこ
とによって、ウイルスの致死性を高めながら当該毒素を
伝達する有効な方法が提供される。さらに、異なるバキ
ュロウイルスは異なる昆虫に対して特異性を有するの
で、特定の毒素を用いて特定の害虫を選択的に標的とす
ることが可能である。該毒素遺伝子に対して特に有用な
ベクターは核多角体病ウイルスである。このウイルスを
用いる伝達ベクターは既に記載され、外来遺伝子を昆虫
に伝達するために選択されるベクターとなっている。ウ
イルス−毒素遺伝子リコンビナントは、経口的に伝達可
能な形態として構築できる。通常、バキュロウイルスは
中腸の腸管粘液を介して昆虫に感染する。強力なウイル
スのコートタンパクプロモーターの後ろに挿入された毒
素遺伝子は発現されて迅速に感染昆虫を殺すであろう。
昆虫ウイルスもしくはバキュロウイルスまたは本発明
のタンパク毒素のための遺伝子導入植物による薬剤送達
系の他に、このタンパク質は、例えば米国特許4695455
号、4695462号、4861595号（ただしこれらに限定されな
い）（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）
のBacillus thuringiensis被包化技術を用いて被包化で
きる。本発明のタンパク毒素のまた別の薬剤送達系は毒
餌マトリックスへの該タンパク質の製剤化である。この
製剤は続いて地上または地下昆虫毒餌ステーションで用
いることができる。そのような技術の例にはPCT特許出
願WO93/23989号（この文献は参照により本明細書に含ま
れる）が含まれるが、ただしこれに限定されない。
上記で述べたように、当該タンパク質を本来の宿主で
はない宿主で発現させる場合は、該タンパク質をコード
する配列を変更することが必要となるかもしれない。な
ぜならば、他の宿主で好んで使用されるコドンはPhotor
habdusの場合と異なる可能性があるからである。そのよ
うな場合には、該コード配列に対して埋め合わせとなる
変更が行われないかぎり、新しい宿主での翻訳は極めて
効率が悪いであろう。さらに、新しい宿主のタンパク質
との抑制***差反応を避けるために、または新しい宿主
での該タンパク質の殺虫特性を高めるために、アミノ酸
配列に対する変更が望ましいであろう。遺伝子的に修飾
された毒素遺伝子は、例えば毒性強化もしくは低下、昆
虫の耐性発達の変化、安定性の変化または標的種特異性
の変化を示す毒素をコードするかもしれない。
該毒素をコードするPhotorhabdus遺伝子の他に、本発
明は、該毒素タンパク質と相同なアミノ酸バイオポリマ
ーをコードし、さらに経口消化の後で昆虫種においてPh
otorhabdusタンパク質の毒性効果を保持する関連核酸配
列を含むことを意図する。
例えば、本発明で用いられる毒素は、結果として死が
もたらされる前に先ず幼虫の摂食を抑制するように思え
る。Photorhabdus毒素の核酸配列またはその制御配列を
操作することによって、毒素遺伝子を植物に配置した遺
伝子工学技術者は、例えば摂食抑制活性を保ち、その一
方で幼虫に対する絶対的な毒性を取り除くために当該タ
ンパク質の能力またはその作用態様を調節することがで
きるであろう。この変化によって、全ての標的昆虫を根
絶させるという環境系に対する不必要で劇的な影響を与
えることなく、形質転換植物が収穫まで残存することが
可能となろう。該毒素をコードする遺伝子のそのような
変更の全て、または該遺伝子によってコードされるタン
パク質のそのような変更の全てが本発明の範囲内に包含
される。
包含される他の核酸の変更には、該毒素の有効性を改
善するために昆虫の幼虫の特定の部分に毒素を誘導する
ために照準用配列を付加することが含まれる。
ATCC55397、43948、43949、43950、43951、43952株は
アメリカ菌培養収集所（12301,Parklawn Drive,Rockvil
le,MD 20852 USA）に寄託された。Ｗ−14天然毒素（ATC
C55397）のアミノ酸および核酸配列データは下記に提示
する。毒素のゲノムDNAの細菌宿主からの分離は本明細
書で例証する。
標準的技術および分子生物的技術を用い、さらにそれ
らは本明細書で開示される。更なる情報は、分子クロー
ニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバ
ー研究所出版部（J.Sambrook,E.F.Fritsch ＆ T.Maniat
is（1989））で見出される（この文献は参照により本明
細書に含まれる）。
以下の略語は実施例を通して用いられる:Tris＝トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン;SDS＝ドデシル硫
酸ナトリウム;EDTA＝エチレンジアミンテトラ酢酸;IPTG
＝イソプロピルチオ−β−ガラクトシド;X−gal＝５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラク
トシド;CTAB＝臭化セチルトリメチルアンモニウム;kbp
＝キロ塩基対;dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Ｉ＝それぞれ
アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびイノシン
の2'−デオキシヌクレオシド5'−三燐酸塩;ATP＝アデノ
シン5'三燐酸塩。
実施例１ P.luminescens由来毒素の精製と精製毒素の経口的薬剤
送達後の毒性体現 本発明の殺虫性タンパク毒素は、P.luminescensW−14
株（ATCC Access ＃55397）から精製された。P.lumines
censのストック培養を1.5％寒天に２％プロテオースペ
プトン＃３（すなわちPP3、Difco Laboratories,デトロ
イト、ミシガン）を含むペトリ皿で25℃で保温し毎週継
代して維持した。細菌の一次形態コロニーを１リットル
フラスコ中の0.5％のポリオキシエチレンソルビタンモ
ノステアレート（トゥイーン60、Sigma Chemical Compa
ny,セントルイス、ミズーリ）補充200mlのPP3ブロスに
摂取した。回転シェーカーで30℃で72時間ブロス培養を
増殖させた。毒素タンパク質をトゥイーンの非存在下ま
たは存在下で増殖させた培養から回収することができ
る。しかしながらトゥイーンの非存在下では増殖細菌の
形態および該細菌によって産生されるタンパクプロフィ
ールは影響を受ける。トゥイーンの非存在下では、種々
のシフトが生じ、少なくとも特定された１つの毒素サブ
ユニットの分子量に関するかぎり約200kDaから約185kDa
へとシフトする。
この72時間培養を10000×ｇで30分遠心して細胞と残
屑を除去した。殺虫活性を含む上清分画を傾けて流し出
し、適切な容量の1.0MのK2HPO4を添加して50mMK2HPO4と
する。水酸化カリウムを添加してpHを8.6に調整した。
続いてこの上清分画を、50mMK2HPO4で平衡化したDEAE−
セファセル（Pharmacia LKB Biotechnology）と混合し
た。この毒性活性をDEAE樹脂に吸着させた。続いてこの
混合物を2.6×40cmカラムに注入し、50mMK2HPO4で室温
で流速30ml/時間で洗浄して、溶出液を安定した280nmUV
吸収基準ラインに到達させた。続いて溶出液が再び安定
した280nm基準ラインに達するまでカラムを150mMKClで
洗浄した。最後にカラムを300mMKClで洗浄し、分画を採
集した。
毒素を含む分画を集め、0.2ミクロン孔の膜フィルタ
ーを用いて濾過滅菌した。続いて毒素を濃縮し、さらに
分子量カットオフが100kDaの限外濾過膜（Centriprep 1
00,Amicon Division−W.R.Grace and Company）を用い
て４℃で100mMKPO4（pH6.9）に平衡化した。毒素濃縮物
の3mlを2.6×95cmのセファシルＳ−400HRゲル濾過カラ
ム（Pharmacia LKB Biotechnology）の上部に積載し
た。溶離液は100mMKPO4（pH6.9）で、これを17ml/時間
の流速で４℃で流した。溶出液を280nmでモニターし
た。
分画を集め毒素活性について調べた。クロマトグラフ
ィーの分画の毒性をManduca sextaの幼虫を用いて生物
学的アッセイで調べた。分画を直接昆虫の食餌（マイマ
イガ用コムギ麦芽餌、ICN Biochemicals Division−ICN
Biomedicals,Inc.）に適用するか、または第４もしく
は第５齢幼虫の第一前肢から５μｌのサンプルを30ゲー
ジ注射針を用いて血体腔注射によって投与した。処置群
の各幼虫の体重は24時間間隔で記録した。昆虫が摂食を
停止し、処置した昆虫餌を消費し数日以内に死んだ場
合、または分画を注射して24時間以内に死んだ場合に毒
性があったと推定した。
毒性分画を集め、Centriprep−100を用いて濃縮し、
続いて7.5mm×60cmのTSK−GELG−4000SWゲル透過カラム
を用い100mM燐酸カリウム（pH6.9）溶離液を0.4ml/分で
流しながらHPLCで分析した。この分析によって、毒素タ
ンパク質は約33.6分の保持時間でカラムから溶出する単
一のシャープなピークに含まれることが明らかにされ
た。この保持時間は概算分子量1000kDaに相当する。ピ
ーク分画を更なる精製のために集め、一方このタンパク
質を含まない分画は廃棄した。HPLCから溶出したピーク
は218および280nmでUV光を吸収したが405nmでは吸収し
なかった。405nmの吸収は、ゼノラブジン（xenorhabdi
n）抗生物質化合物の属性であることが示された。
集めたピーク分画の非変性アガロースゲル（Metaphor
Agarose,FMC BioProducts）での電気泳動によって、２
つのタンパク複合体が当該ピークに存在することが示さ
れた。このピーク材料（50mMトリス−HCl（pH7.0）で緩
衝）を、1.5％アガロースの積載用ゲル（100mMトリス−
HCl（pH7.0）で緩衝）および1.9％アガロースの解析用
ゲル（200mMトリス−ホウ酸塩（pH8.3）で緩衝）で標準
的緩衝液条件（陽極緩衝液1Mトリス−HCl（pH8.3）；陰
極緩衝液0.025Mトリス、0.192Mグリシン）下で分離し
た。フェノールレッドの追跡用色素がゲル端に達するま
で、ゲルに13mAの定常電流を15℃で流した。クマシーブ
リリアントブルー染色を用いて２本のタンパクバンドを
アガロースゲルで可視化させた。
より遅く移動するバンドを“タンパクバンド1"と呼
び、より速く移動するバンドを“タンパクバンド2"と呼
んだ。２本のタンパクバンドはほぼ等量で存在した。ク
マシー染色アガロースゲルは、ゲルの未染色部分から２
本のタンパクバンドを正確に切り出すためのガイドとし
て用いた。タンパクバンドを含む切り出した細片をふや
かし、少量の滅菌水を加えた。コントロールとして、タ
ンパク質を含まないゲルの一部分もまた切り出し、タン
パク質を含むゲルと同じ態様で処理した。100mMトリス
−ホウ酸塩（pH8.3）に100ボルト（定常電圧）で２時間
電気泳動してゲル片からタンパク質を回収した。また別
に、タンパク質は、等容量の50mMトリス−HCl（pH7.0）
をゲル片に加え、続いて30℃で16時間保温することによ
ってゲル片から受動的に溶出させた。これによってタン
パク質は緩衝液中に拡散させられ続いてこのタンパク質
を採集した。
HPLC精製毒素（33.6分ピーク）およびアガロースゲル
精製毒素を用いた昆虫毒素テストの結果は抽出物の毒性
を明示した。1.5μｇのHPLC精製タンパク質の注射は24
時間以内の死亡をもたらした。アガロースから受動的溶
出または電気泳動溶出で回収したタンパクバンド１およ
び２は両方とも注射では致死的であった。これらのサン
プルについての概算タンパク質濃度は50ng/幼虫未満で
あった。タンパクバンド１または２を注射された幼虫群
間での体重増加と死亡率の比較によって、タンパクバン
ド１は注射による送達ではより毒性が強いことが示され
た。
HPLC精製毒素を幼虫の餌に7.5μg/幼虫の濃度で適用
したとき、幼虫の体重増加の停止をもたらした（調べた
24匹の幼虫で）。幼虫は摂食を始めたが、毒素処理餌の
極めて少しの部分を消費した後、幼虫は毒素によって誘
発された病理兆候を示し始め、摂食を停止した。昆虫の
糞粒は変色し、大半の幼虫は下痢の症状を示した。７−
10日間にわたって餌にそれぞれ５μｇ毒素を適用したと
き有意の死亡率が得られた。
アガロース分離タンパクバンド１は、200ng/幼虫の投
与量で顕著に幼虫の体重増加を抑制した。同様な濃度の
タンパクバンド２を与えた幼虫では抑制されず、コント
ロールの幼虫と同じ率で体重は増加した。12匹の幼虫に
は溶出タンパク質を与え、45匹の幼虫にはタンパク質含
有アガロース片を与えた。これら２組のデータは、タン
パクバンド１はManduca sextaに対して経口的に毒性を
有することを示した。この実験では、タンパクバンド２
はManduca sextaには毒性をもたないようであった。
変性条件下でのSDS−PAGEによるタンパクバンド１お
よび２の更なる分析によって、各バンドはいくつかのよ
り小さなタンパクサブユニットを含むことが示された。
タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色で可視化
し、その後最大の感度を達成するために銀染色を施し
た。
２本のバンドのタンパクサブユニットは非常に類似し
ていた。タンパクバンド１は８個のタンパクサブユニッ
ト（25.1、56.2、60.8、65.6、166、171、184および208
kDa）を含む。タンパクバンド２は、25.1、60.8および6
5.6kDaタンパク質が存在しないという点を除いて同一の
プロフィールを有していた。56.2、60.8、65.6および18
4kDaタンパク質がタンパクバンド１の複合体中にほぼ等
しい濃度で存在し、当該複合体の全タンパク質含有量の
80％またはそれ以上を占めていた。
天然のHPLC精製毒素をさらに以下のように性状を調べ
た。毒素は易熱性で、60℃で15分加熱した後、M.sexta
の幼虫に注射または餌として与えたとき死亡させまたは
体重増加を抑制させるその能力を失った。リパーゼ、Ｃ
型ホスホリパーゼ、ヌクレアーゼ、または赤血球細胞溶
血活性を検出するためにアッセイをデザインし、精製毒
素を用いて実施した。これらの活性のいずれも存在しな
かった。抗生物質ゾーン抑制アッセイもまた実施した。
精製毒素はグラム陰性もしくは陽性細菌、酵母または糸
状菌の増殖を抑制することができなかった。このことは
この毒性はゼノラブジン抗生物質ではないことを示唆し
ている。
天然のHPLC精製毒素を、M.sexta以外の昆虫を殺す能
力について調べた。表２では、この実験でHPLC精製P.lu
minescens毒素によって殺される昆虫が列挙されてい
る。
実施例２ 殺虫剤の効用 Photorhabdus luminescensの効用及び毒性を、更に特
徴づけた。Photorhabdus luminescens（菌株Ｗ−14）培
養ブロスは、下記に従って調製した。生産培地は、ミリ
−Ｑ（登録商標）脱イオン水を溶媒とする、２％バクト
・プロテオース・ペプトン（登録商標）＃３（PP3、デ
ィフコラボラトリー社、デトロイト、ミシガン）であっ
た。播種培養フラスコは、デロング（Delong）首を備え
た500mlの３枚板（tribaffie）フラスコ中の培地175ml
からなり、カプット（Kaput）で覆い、温度121℃（250
゜F）で、20分間高圧滅菌した。生産フラスコは、デロ
ング首を備えた500mlの３枚仕切り板フラスコ中の2.8リ
ットル中50mlからなり、シンエツ（Shinetsu）シリコー
ンフォームクローシャーで覆った。これらは、温度121
℃（250゜F）で、45分間高圧滅菌した。播種培養は、振
幅5.08cm（２インチ）で旋回振盪しているインキュベー
ターにおいて、28℃、150rpmでインキュベートした。16
時間増殖した後、この播種培地の１％を、該生産フラス
コ中に入れ、収穫前に24時間増殖した。毒素の産生は、
対数増殖期に明らかであった。この微生物のブロスを、
１リットルの遠心管に移し、かつ細胞バイオマスをペレ
ットとした（４℃、2500rpmで、30分間［R.C.F.＝〜160
0］、HG−4LローターPC3、ソルバル（Sorval）遠心機、
ヂュポン社、ウィルミントン、デラウェア）。最初のブ
ロスを、４℃で、８〜16時間冷却し、少なくとも２時間
再度遠心分離し（前述の条件）、放置時に沈殿したムコ
多糖類と推定されるものを除去することによって、更に
ブロスを透明にした。（別の加工法は、両方の工程を組
合わせ、かつ前述と同じ条件で、16時間の透明化遠心分
離を使用した。）。その後、このブロスを、バイオアッ
セイ又はろ過の前に、４℃で貯蔵した。
このブロスから精製されたPhotorhabdus培養ブロス及
びタンパク質の毒素（複数）は、多くの昆虫に対して活
性（死亡及び／又は成長阻害、羽化の低下）を示した。
更に詳細に述べると、昆虫目のコレオプテラ（Coleopte
ra）の一員である、ハムシモドキ（幼虫及び成虫）、コ
ロラドジャガイモハムシ、及び芝の地虫（turf grubs）
に対する活性が認められた。コレオプテラ目の他の一員
は、コメツキムシ、花粉の甲虫（pollen beetle）、ト
ビハムシ、種子の甲虫（seed beetle）、及びゾウムシ
を含んだ。同様にホモプテラ（Homoptera）目の一員で
ある、アスターヨコバイに対する活性も認められた。ホ
モプテラ目の他の一員は、多くの宿主に特異的なアブラ
ムシ種に加え、プラントヨコバイ（planthopper）、ヨ
ーロッパナシキジラミ、リンゴサッカ（apple sucke
r）、カイガラムシ、コナジラミ及びアワフキを含ん
だ。前述のブロス及び精製された分画も、同じくシロイ
チモンジヨウトウガ、イラクサキンウワバ、黒色ネキリ
ムシ、タバコの芽食虫（budworm）、ヨーロッパアワノ
メイガ、オオタバコガ及びヒメハマキに対して活性を示
した。この目の他の典型的一員は、イガ、インディアン
ミールモス（Indian mealmoth）、ハマキムシ、アオム
シ、ワタキロバガ、ミノムシ、東部テンマクケムシ、芝
のガ（sod webworm）、及びシロナガヤであった。活性
は、ディプテラ（Diptera）目の一員であるミバエ及び
カの幼虫に対しても認められた。ディプテラ目の他の一
員は、エンドウのユスリカ、ニンジンのハエ、キャベツ
根のハエ、キスジノハムシ、タマネギのハエ、ガガン
ボ、イエバエ及び各種のカ種である。同じくフシアリ、
オデロウスイエアリ（oderous house ant）、及び小ク
ロアリ（little black ant）を含む目の一員である、オ
オアリ及びアルゼンチンアリ（Argentine ant）に対す
る活性も認めれらた。
前述のブロス／分画は、昆虫の個体数を減少するため
に有用であり、かつ昆虫の個体数を阻害する方法におい
て使用した。この方法は、前述の活性物を、昆虫を不活
性化するのに十分な量、昆虫の場所（locus）に塗布す
ることを含むことができる。結果を表３に示した。
ハムシモドキ幼虫に対する活性を、下記の方法で試験
した。Photorhabdusル培養ブロス（ろ過滅菌し、細胞を
含まない）又は精製したHPLC分画を、それぞれ、対照培
地又は10mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0に希釈
した後の30μｌアリコートを、人工飼料0.25mlの表面
（〜1.5cm2）に、直接塗布した。この飼料プレートを、
滅菌フローフード中で風乾し、かつこれらのウェルに
は、不稔卵からふ化した一匹の新生虫ディアブロティカ
・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（diabrotica und
ecimpun howardi）（南部ハムシモドキ、SCR）、人工飼
料で成長した第２齢のSCR、又はメトロミックス（登録
商標）中で生育したトウモロコシ苗木で飼育した第２齢
のディアブロティカ・ビルジフェラ・ビルジフェラ（Di
abrotica virgifera virugifera）（西部ハムシモド
キ、WCR）を群らがらせた。第２齢の幼虫は、飼料投与
前に秤量した。これらのプレートに封をし、湿らせた生
育用チャンバーに置き、適当な期間27℃に保った（SCR
新生虫及び成虫については４日間、WCR幼虫については
２〜５日間、第２齢のSCRについては７〜14日間）。死
亡率及び測定体重は、指示されたようにスコア化した。
一般に、全ての試験において、１処置について16匹の虫
を使用した。対照の死亡率は、下記のものである：新生
幼虫については＜５％、甲虫成虫については５％。
コロラドジャガイモハムシに対する活性を、下記の方
法で試験した。Photorhabdus培養ブロス又は対照培地
を、24ウェルの組織培養プレートのウェル中に保持され
た、標準人工飼料1.5mlの表面（〜2.0cm2）に塗布し
た。各ウェルに、50μｌの処置を行い、かつ風乾した。
次に、個々の第２齢のコロラドジャガイモハムシ（レプ
チノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decelimea
ta）、CPB）幼虫を、この飼料の上に置き、かつ４日後
の死亡率をスコア化した。全ての試験について、１処置
につき10匹の幼虫を用いた。対照の死亡率は33％であっ
た。
マメコガネの地虫（Japanese beetle grub）及び甲虫
に対する活性は、下記の方法で試験した。芝の地虫（ポ
ピィア・ジャポニカ（Popillia japonica）、第２〜３
齢）を、群生した芝から採取し、実験室内で、土壌／ピ
ート混合物で、追加食餌としてニンジンのスライスを与
え、養った。芝の甲虫は、局所的なフェロモンで捕獲し
（pheromone−trapped）、かつ実験室内では、プラステ
ィックの容器で、食餌としてカエデの葉を与えて養っ
た。未希釈のPhotorhabdus培養ブロス又は対照培地を、
ハムシモドキの人工飼料（30μl/1.54cm2、甲虫）又は
ニンジンのスライス（幼虫）に塗布した後、両ステージ
を飼料ウェル中に単独で配置し、死亡率及び摂食を観察
した。両方とも、摂食（及び糞***）量の明らかな減少
が認められた。
カの幼虫に対する活性は、下記の方法で試験した。こ
のアッセイは、96個のウェルの微量滴定プレートで行っ
た。各ウェルは、水溶液（Photorhabdus培養ブロス、対
照培地又は水）200μｌ、及び約20匹の、１日齢の幼虫
（アエデス・アエギプチ（Aedes aegypti））を含ん
だ。１処置につき６個のウェルを実施した。結果を、群
生の２時間後に調べ、かつ３日間の観察期間にわたり変
化しなかった。対照の死亡率は、調べなかった。
ミバエに対する活性を、下記の方法で調べた。購入し
たドロソフィア・メラノガステル（Drosophia meganoga
ster）培地を、乾燥培地50％、及び水、対照培地又はPh
otorhabdus培養ブロスのいずれかの液体50％を用いて調
製した。これは、１処置につき３個の飼育バイアルの各
々の中に、乾燥培地8.0mlを入れ、及び適当な液体8.0ml
を加えることによって達成した。その後、10日後期（la
te）齢のドロソフィア・メラノガステルのうじを、各バ
イアルに加えた。これらのバイアルは、室温で、天井に
蛍光灯のついた実験用ベンチの中に置いた。さなぎ又は
成虫の数を、暴露の3,7及び10日後に測定した。ミバエ
さなぎ用飼料へのPhotorhabdus培養ブロスの混合物で
は、10日目の羽化が、水又は対照培地（３％減少）と比
べ、わずか（17％）であるが有意の減少を示した。
アスターヨコバイに対する活性を、下記の方法で試験
した。アスターヨコバイ（マクロステレス・セベリニ
（Macrosteles severini））に関する摂取アッセイは、
外部と接触せずに、この活性物を摂取することができる
ようにデザインした。この活性物／“食品”溶液の容器
は、35×10mmのペトリ皿の底面の中央に２個の穴がある
ように製造した。5cm（２インチ）四方のパラフィルム
Ｍ（登録商標）を、この皿の表面を覆うように置き、か
つ“0"型リングでしっかり締めた。次に、28.3g（1o
z.）のプラスティックカップに、約７匹のヨコバイを群
がらせ、このカップの頂上に前述の容器を配置し、パラ
フィルムをはずした。その後試験溶液を、穴を通じてこ
の容器に入れた。未希釈のPhotorhabdus培養ブロスを使
用する試験においては、このブロス及び対照培地を、水
に対して透析し、対照の死亡率を低下した。死亡率は、
対照死亡率が26.5％であった２日目について報告した。
精製した分画（200mgタンパク質/ml）を使用する試験に
おいて、ショ糖の５％の最終濃度を、全ての処置におい
て用い、アスターヨコバイの生存率を高めた。このアッ
セイは、照射間隔が16/8である、28℃で、相対湿度が70
％のふ化器において行った。このアッセイは、72時間後
の死亡率について等級付けした。対照の死亡率は、5.5
％であった。
アルゼンチンアリに対する活性を、下記の方法で試験
した。100％Photorhabdus培養ブロス、対照培地又は水
の1.5mlアリコートを、2.0mlの透明なガラスバイアルに
ピペットで移した。これらのバイアルを、適当な処置で
湿らせた歯科用綿芯で栓をした。各バイアルを、８〜12
匹のアルゼンチンアリ（リネピセマ・フミレ（Lunepith
ema humile））の成虫を入れた、個別の60×16mmのペト
リ皿に置いた。１処置について３個を試験した。バイオ
アッセイプレートを、室温で、天井に蛍光灯がついた実
験用ベンチに置いた。死亡率は、暴露の５日後に読み取
った。対照の死亡率は、24％であった。
オオアリに対する活性は、下記の方法で試験した。黒
色オオアリの働きアリ（カンポノタス・ペンシルバニカ
ス（Camponotus pennsylvanicus））を、インディアナ
ポリス（IN）のダウエランコ（DowElanco）農場の木か
ら採取した。Photorhabdus培養ブロスによる試験は、下
記の方法で実施した。プラスティックのバイオアッセイ
容器（18.1cm×7.6cm（7 1/8"×3"））の各々に、15匹
の働きアリ、紙製隠れ家、及びプラスティックの一口用
グラスに入れたブロス又は対照10mlを置いた。一口用グ
ラスのふたに開けた穴を通して、綿芯を伝って、アリに
処置が届くようにした。全ての処置は、５％ショ糖を含
んだ。バイオアッセイは、暗所、室温で行い、かつ19日
目に等級付けした。対照の死亡率は、９％であった。ア
リの人工飼料に利用したアッセイ用に送達する精製した
分画は、前述の処置（精製した分画又は対照溶液）と、
プラスティック試験管の中で、処置0.2ml/飼料2.0gの割
合で混合した。精製された分画の最終的なタンパク質濃
度は、10μg/飼料ｇ未満であった。１処置につきアリ10
匹、水、隠れ家及び処理した飼料を、封をしたプラステ
ィック容器に入れ、かつ加湿したふ化器の中で、暗所、
27℃で養った。10日目に、死亡率をスコア化した。対照
の死亡率は調べなかった。
様々な鱗翅類の幼虫に対する活性を、下記の方法で試
験した。Photorhabdus培養ブロス又は精製した分画は、
標準の人工飼料0.25mlの表面（〜1.5cm2）に、それぞれ
対照培地又は10mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.0の
いずれかに希釈した後の30μｌアリコートで、直接塗布
した。これらの飼料プレートは、滅菌したフローフード
中で風乾し、かつこれらのウェルに、１匹の新生幼虫を
群がらせた。ヨーロッパアワノメイガ（オストリニア・
ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））及びオオタバコガ
（ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea））の卵は、
商業的供給源から入手し、かつ社内でふ化したが、シロ
イチモンジョウトウガ（スポドプテラ・エキシグア（Sp
odoptera exigua））、イラクサキンウワバ（トリコプ
ルシア・ニ（Trichoplusia ni））、タバコの芽食虫
（ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescen
s））、ヒメハマキ（ラスペイレシア・ポモネラ（Laspe
yresia pomonella））及び黒色ネキリムシ（アグロチス
・イプシロン（Agrotis ipsilo n））の幼虫は、社内で
調達した。幼虫を群がらせた後、飼料プレートに封を
し、加湿した生育用チャンバーの中に置き、暗所、27℃
で、適当な期間養った。死亡率及び体重測定は、Photor
habdus培養ブロスについては５〜７日目に、及び精製し
た分画については４〜７日目に、スコア化した。一般
に、全実験において、１処置につき昆虫16匹を使用し
た。対照培地に関する対照死亡率は、４〜12.5％の範囲
であり、かつPhotorhabdusバッファーに関しては10％未
満であった。
実施例３ 土壌への適用に関する殺虫剤の効用 Photorhabdus luminescens（菌株Ｗ−14）培養ブロス
を、土壌又は土壌混合物（メトロミックス（登録商
標））に直接適用した場合の、ハムシモドキに対する活
性を示した。メトロミックス（登録商標）中の新生SCR
及びWCRに対する活性を、下記の方法で試験した（表
４）。試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルター
ペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイテ
ィッドアグリシード銘柄のCL614）を用いて行った。根
が約３〜6cmに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、乾燥メ
トロミックス（登録商標）50gを入れた、591mlの透明な
プラスティックカップに、植えた。その後、20匹の新生
SCR又はWCRを、この苗木の根に直接置き、かつメトロミ
ックス（登録商標）で覆った。群生する間に、この苗木
に、希釈したブロス溶液全量50mlを散布（drench）し
た。散布した後、このカップに封をして、かつ明所、室
温で、７日間放置した。その後、この苗木を洗浄し、メ
トロミックス（登録商標）を完全に除去し、根を切断し
て、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存
率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷につい
て、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア
化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋のいずれかに等級
付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋
で表した。
土壌中の新生SCRに対する活性を、下記の方法で試験
した（表５）。この試験は、６日間、光をあてた、湿っ
たフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗
木（ユナイティッドアグリシード銘柄のCL614）を用い
て行った。根が約３〜6cmに伸びた後、１個の穀粒／苗
木を、レバノン（IN）の前年トウモロコシを栽培した畑
から採取した土壌150gを入れた、591mlの透明なプラス
ティックカップに、植えた。この土壌は、それまで殺虫
剤処理を行っていない。20匹の新生SCRを、この苗木の
根に直接置き、かつ土壌で覆った。群生後に、この苗木
に、希釈したブロス溶液全長50mlを散布した。散布した
後、封をしないカップを、相対湿度が高い（80％）チャ
ンバーで、25℃（78゜F）でインキュベートした。その
後、この苗木を洗浄し、土壌を完全に除去し、根を切断
して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残
存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷につい
て、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア
化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋に等級付けし、損
傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
Photorhabdus luminescens（菌株Ｗ−14）培養ブロス
の、メトロミックス（登録商標）中の第２齢の芝の地虫
に対する活性を、下記の方法で行った試験で観察した
（表６）。591mlの透明なプラスティックカップに、乾
燥メトロミックス（登録商標）約50gを入れた。その後
このメトロミックス（登録商標）を、50容量％希釈した
Photorhabdusブロス溶液全量50mlを散布した。粗ブロス
の希釈は、水で行い、50％ブロスは、粗ブロス25mlに、
水25mlを加えて、総量50mlとした。通常の培地濃度を50
％希釈したものである、プロテオースペプトン＃３（PP
3）の１重量／容量％溶液を、ブロス対照として使用し
た。散布した後、５匹の第２齢の芝地虫を、湿らせたメ
トロミックス（登録商標）の表面に置いた。元気な芝地
虫の幼虫は、メトロミックス（登録商標）の中に、即座
に穴を掘って潜り込んだ。１時間以内に穴を掘って潜ら
なかった幼虫は、除外し、新たな幼虫と交換した。この
カップに封をして、かつ暗所、28℃のふ化器に入れた。
７日後、メトロミックス（登録商標）から幼虫を取り出
し、死亡率をスコア化した。活性は、対照に対する死亡
率の割合で示した。
実施例４ 葉への適用に関する殺虫剤の効用 Photorhabdusブロスのヨーロッパアワノメイガに対す
る活性を、ブロスをトウモロコシの葉の表面に直接塗布
した場合について調べた（表７）。このアッセイにおい
て、Photorhabdusブロスを、培養培地で100倍希釈し、
かつ切り採ったトウモロコシの葉の表面に、葉表面の〜
6.0μl/cm2の割合で、手で塗布した。これらの葉を、風
乾し、等しい大きさの細片（約５×5cm（約２×２イン
チ））に切断した。これらの葉を丸め、ペーパークリッ
プで固定し、底面に２％寒天を0.63cm（0.25インチ）入
れた、28g（1oz）の一口用プラスチックグラスの中に置
き、湿らせた。その後、新生ヨーロッパアワノメイガ12
匹を、前述の丸めた葉の上に置き、カップに封をした。
５日間、暗所、27℃でインキュベートした後、これらの
試料を、摂食による損傷及び回収された幼虫について、
スコア化した。
新生タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス（Heli
othis virescens））に対する前述の培養ブロスの活性
を、葉の浸漬法を用いて明らかにした。新鮮な綿の葉
を、植物から切り採り、かつ葉のディスクを、18.5mmの
コルクの穴あけ器で切断した。このディスクを、対照培
地（PP3）、又は10kDaフィルターを備えたアミコン社
（ビバリー、MA）のプロフラックスM12接線方向のろ過
システムを用いて、約10倍に濃縮したPhotorhabdus lum
inescens（菌株Ｗ−14）培養ブロスに、個々に浸漬し
た。過剰な液体を取り除き、かつ真っ直ぐにしたペーパ
ークリップで、該ディスクの中心を貫通させた。その
後、ペーパークリップを、１％寒天を2.0ml含む28g（1o
z）の一口用プラスチックグラスの中に、打ち込んだ。
これは、葉が寒天の上方に吊り下げられた状態にした。
この葉ディスクを乾燥した後、１匹の新生タバコのハマ
キガの幼虫を、該ディスクの上に置き、カップに蓋をし
た。その後このカップを、ポリ袋内に入れ封をし、かつ
暗所、27℃のふ化器に、５日間放置した。この時点で、
残っている幼虫及び葉材料を秤量し、葉の損傷を測定し
た（表８）。
実施例５、パートＡ 毒素ペプチド成分の特徴 引き続き行われた分析において、実施例１で単離され
たバンドの毒素タンパク質のサブユニットを、30:0.8の
比（アクリルアミド:BIS−アクリルアミド）の７％SDS
ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分解した。このゲ
ルマトリックスは、比較的大きいタンパク質の分解をよ
り容易にする。実施例１において、バンド１及びバンド
２のサブユニットの分子量を推定するのに用いたゲルシ
ステムは、38:0.18の比（アクリルアミド:BIS−アクリ
ルアミド）の18％ゲルであり、これは、広範な領域で大
きさによる分離ができるが、高分子量成分については、
分解能が低い。
この分析においては、８個ではなく10個のタンパク質
バンドに分解された。表９は、10個の分解されたバンド
の計算上の分子量を示し、かつこれらの条件下で推定さ
れた分子量を、先の実施例の分子量と直接比較してい
る。追加のバンドが、本実施例で使用された異なる分離
条件下で検出されたことは、驚くべきことではない。前
述の分子量推定値及び新たな推定値の間の変動も、分解
条件の差異によってもたらされたと予想される。本実施
例の分析において、改善された分解能の結果、比較的大
きい分子量の推定値は、実施例１よりもより正確である
と考えられる。しかしながら、これらは、SDS−PAGE分
析を基に推定され、この方法は典型的には分析としては
正確ではなく、かつペプチドの推定値をもたらし、かつ
これは、翻訳後修飾又は翻訳時修飾のために、更に代わ
り得る。
アミノ酸配列は、10個の分解されたペプチド中の５個
のＮ−末端について決定した。表９は、これらのタンパ
ク質の分子量及び同定された配列を、相互に関連付けて
いる。配列番号２において、ある分析は、５位のプロリ
ン残基は、アスパラギン（asn）でありうることを示し
た。配列番号３において、ある分析は、13及び14位のア
ミノ酸残基は、いずれもアルギニン（arg）であること
を示した。配列番号４において、ある分析は、６位のア
ミノ酸残基は、アラニン（ala）又はセリン（ser）のい
ずれかであることを示した。配列番号５において、ある
分析は、３位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（as
p）であることを示した。
実施例５、パートＢ 毒素ペプチド成分の特徴 新たなＮ−末端配列である配列番号15、Ala Gln Asp
Gly Asn Gln Asp Thr Phe Phe Ser Gly Asn Thrは、前
記実施例５パートＡにおいて説明された天然のHPLCで精
製された毒素から単離されたペプチドを更にＮ−末端配
列決定することによって得られた。TcaAiiと称されるこ
のペプチドは、254位に始まり、かつ491位に至り、ここ
でTcaAiiペプチドは、配列番号４を開始する。遺伝子配
列を基にして推定されたこのペプチドの大きさは、25,2
40Daである。
実施例６ 毒素ペプチド成分の特徴 更に別の分析において、この毒素タンパク質複合体
は、Photorhabdus luminescensの増殖培地（ツイーンを
含まずに培養した後）から、10〜80％の硫酸アンモニウ
ムにより沈殿させ、その後のイオン交換クロマトグラフ
ィー工程（モノＱ）及び２種の分子サイジングクロマト
グラフィー工程により、再び単離した。これらの条件
は、実施例１で使用したものと類似していた。最初の分
子サイジング工程において、第二の生物学的活性のピー
クは、約100±10kDaに認められた。タンパク質測定を基
に、この分画は、約860±100kDa（天然）のより大き
い、又は第一の活性ピークよりも、20〜50倍活性が低か
った。この単離実験の間に、出発時の生物学的活性のか
なりの部分を保持した約325±50kDaのより小さい活性ピ
ークも、分解された。この325kDaのピークは、前述の86
0kDaのピークに、関連、もしくは由来したと考えられ
た。
この分析においては、56kDaタンパク質が分解され
た。このタンパク質のＮ−末端配列を、配列番号６に示
した。注目すべきは、このタンパク質が、配列番号５の
Ｎ−末端と、著しい同一性及び保存性を共有することで
あり、これは、これら２種が、ある遺伝子ファミリーの
別個の一員によってコードされ得ること、及び各遺伝子
によって産生されたタンパク質が、この殺虫性毒素複合
体において両方を操作することができるように十分類似
していることを示唆している。
二番目に顕著な185kDaタンパク質は、表９のタンパク
質３と同等の量、一貫して存在するので、これは同じタ
ンパク質又はタンパク質断片であろう。この185kDaタン
パク質のＮ−末端は、配列番号７に示した。
追加のＮ−末端アミノ酸配列のデータが、同じく単離
されたタンパク質から得られた。決定されたＮ−末端配
列はいずれも、表９で同定されたタンパク質とは一致し
なかった。他のタンパク質が、単離された調製物中に存
在した。このようなタンパク質の１種は、推定分子量が
108kDaであり、かつ配列番号８に示したＮ−末端配列を
有した。二番目のこのようなタンパク質は、推定分子量
が80kDaであり、かつ配列番号９に示したＮ−末端配列
を有した。
ほぼ325kDaに活性ピークを伴うこのタンパク質物質
を、大きさで分析すると、ほぼ51、31、28及び22kDaの
バンドが認められた。いずれも分子量を電気泳動の移動
度で決定したので、これらの分子量は、バッファーのイ
オン強度の差、電気泳動の電位差などに起因した誤差作
用を受けた。当業者は、明確な分子量値は、これらの標
準的方法を用いては決定することができないこと、及び
各々が変動をうけやすいことを、理解するであろう。こ
のような大きさのタンパク質は、より大きい最初の毒素
複合体において認められた、より大きいタンパク質種
（約200kDaの大きさ）の分解産物であると仮定された。
最後に、いくつかの調製物は、配列番号10に示された
Ｎ−末端配列を有するタンパク質を含んでいた。この配
列は、巨大なタンパク質複合体の構造形成機能が知られ
ている補助（accessory）タンパク質である、公知のシ
ャペロニンタンパク質との相同性が強かった。本出願人
は、このような構造形成機能が、配列番号10に同定され
たタンパク質に起因するとはみなさないが、これは、そ
の構造形成にシャペロンタンパク質が関連しているよう
な、説明された毒素タンパク質複合体の存在と矛盾しな
い。更に、このようなタンパク質は、毒性を有すること
が直接示唆されることはないが、このタンパク質にとっ
て、タンパク質毒素全体の構造的性質を決定することは
重要であり、その結果、経口的デリバリー後のin vivo
における、該複合体の毒性又は耐用度に貢献するであろ
う。
引き続きプロテイナーゼＫに対する該タンパク質毒素
複合体の安定性の分析を行った。該複合体を、プロテイ
ナーゼＫが10倍モル過剰量存在する条件で、24時間イン
キュベートした後、活性はほとんど失活した（経口投与
の死亡率は、約５％に低下した。）ことが結論づけられ
た。これらのデータは、前述の毒素がタンパク質性であ
ることを裏付けている。
この毒性は、更に透析膜によっても保持され、天然の
毒素複合体の大きさが大きいことが再度裏付けられた。
実施例７ Photorhabdus毒素の単離、特徴及び部分的アミノ酸配列
決定 単離及びＮ−末端アミノ酸配列決定：実施例５及び６に
平行して行われた１組の実験において、典型的には２〜
３リットルのPhotorhabdusブロスに、最終濃度が10又は
20％のいずれかになるように結晶硫酸アンモニウムをゆ
っくり添加し調節することによって、Photorhabdusタン
パク質の硫酸アンモニウム沈殿を行った。４℃で１時間
攪拌した後、この材料を12,000×ｇで、30分間遠心分離
した。上清を80％硫酸アンモニウムで調節し、４℃で１
時間攪拌し、かつ12,000×ｇで、60分間遠心分離した。
このペレットを、その容量の1/10量の10mM Na2PO4、pH
7.0中で再懸濁し、同じリン酸バッファーで、４℃で一
晩透析した。透析された材料を、12,000×ｇで、１時間
遠心分離し、イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
HR 16/50 Qセファロース（ファルマシア社）陰イオン
交換カラムを、10mM Na2PO4、pH7.0で平衡にした。遠心
分離し、透析した硫酸アンモニウムペレットを、このＱ
セファロースカラムに、1.5ml/分の速度で加え、かつ光
学濃度（O.D.280）が0.100未満に達するまで、平衡化バ
ッファーを、3.0ml/分で大量に流し洗浄した。次に、60
分間かけて、０から0.5MまでのNaCl勾配を3ml/分で、も
しくは60分間にわたり、0.1M、0.4M及び最後は1.0MのNa
Clを用いる一連の溶出工程のいずれかを、各々該カラム
に流した。分画を収集し、セントリプレップ（Centripr
ep）100を用いて濃縮した。あるいは、タンパク質を、
0.1M NaClで溶出せずに、単一の0.4M NaCl洗浄液で溶出
することができる。
濃縮したＱセファロースの2mlアリコート試料を、10m
M Na2PO4、pH7.0で平衡にしたHR 16/50スペロース12
（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、0.5ml/分で加
えた。このカラムを、同じバッファーで、240分間、0.5
ml/分で洗浄し、かつ２分間ずつ試料を収集した。間隙
容量の物質を収集し、かつセントリプレップ100を用い
て濃縮した。濃縮したスペロース12の試料の2mlのアリ
コートを、10mM Na2PO4、pH7.0で平衡にしたHR 16/50セ
ファロース4B−CL（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上
に、0.5ml/分で加えた。このカラムを、同じバッファー
で、0.5ml/分で、240分間洗浄し、２分間ずつ試料を収
集した。
溶出されたタンパク質のピークを、セファロースCL−
4B樹脂を使用したゲルろ過カラムに適用することによっ
て、２回目の分画を施し、〜30kDaから1000kDaの範囲の
タンパク質を分離した。この分画を、２種のピークにつ
いて分解し；小さいピークが間隙容量（＞1000kDa）
で、及び大きいピークが、見かけの分子量約860kDaで溶
出した。１週間以上、連続的に試料をゲルろ過に晒した
ところ、前述の大きいピークから生じるように見え、お
そらく限定的タンパク質分解によると思われる、第三の
ピーク（約325kDa）の段階的出現が認められた。これら
の３種のピークに関して行ったバイオッセイは、この間
隙ピークは活性を持たないが、860kDaの毒素複合体が高
い活性を有し、かつ325kDaのピークは、かなり可能性は
あるが、より活性が少ないことを示した。異なる発酵生
成物に由来するセファロースCL−4Bの毒素複合体のピー
クのSDS−PAGE分析は、“P"及び“S"と称される、２種
の異なるペプチドパターンを明らかにした。これら２種
のパターンは、分子量、及びそれらの分画中のペプチド
成分濃度の差が際立っていた。“S"パターンは、最も頻
繁に産生され、４個の高分子量ペプチド（＞150kDa）を
有する一方で、“P"パターンは、３個の高分子量ペプチ
ドを有した。これに加え、“S"ペプチド分画は、ヨーロ
ッパアワノメイガに対して、２〜３倍より強い活性が認
められた。この偏りは、接種の虫齢及び／又は年数を経
た培養（aged culture）の増殖因子を基にしたタンパク
質の因子に起因した、他発現の変動に関連するであろ
う。
“P"及び“S"ペプチドパターンと定義されたピーク毒
素複合体分画のミリグラム量に、分取的SDS−PAGEを施
し、かつトリス−グリシン（セプラバフ（登録商標））
で、PVDF膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバ
イオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写
し取った。ブロットは、アミノ酸分析及びＮ−末端アミ
ノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロ
ケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。“S"パタ
ーン中の３種のペプチドは、前述の例において同定され
た配列と比較して、独特のＮ−末端アミノ酸配列を有し
た。下記配列番号13で説明された201kDa（TcdAii）ペプ
チドは、配列番号１（TcbAii）と、33％のアミノ酸同一
性及び50％の類似性を共有した（表10、表10において縦
の線は、アミノ酸の同一性を示し、かつ点線はアミノ酸
の同類置換を意味した。）。配列番号14の197kDaの第二
のペプチド（TcdB）は、配列番２（TcaC）と、42％の同
一性及び58％の相同性を有した。更に、第三のペプチド
205kDaは、TcdAiiを意味した。これに加え、限定された
Ｎ−末端アミノ酸配列である配列番号16（TcbA）は、少
なくとも235kDaのペプチドであるが、これはクローン化
された配列番号11の遺伝子（tcbA）から推定された、配
列番号12のアミノ酸配列と、相同性が同じであり、配列
番号１（TcbAii）に相当する推定されたアミノ酸配列を
有した。これは、より大きい235＋kDaペプチドが、発酵
時に、タンパク質分解的に、201kDaペプチド（TcbAii）
（配列番号１）へと処理され、おそらく該分子の活性化
を生じることを示している。更に別の配列において、前
述の実施例５で報告された配列番号５（TcaBii）として
最初に報告された配列は、３位に、グリシン（Gly）で
はなくアスパラギン酸残基（Asp）を、並びに８及び９
位に、それぞれ、２個の追加のアミノ酸Gly及びAspを含
むことがわかった。更に別の２種の配列、配列番号２
（TcaC）及び配列番号３（TcaBi）においては、追加の
アミノ酸配列が得られた。Ｎ−末端分析に送られた“S"
調製物と同一である試料を用いて、デンシトメーターに
よる定量を行った。この分析は、201kDa及び197kDaペプ
チドが、それぞれ、“S"パターン中のクマーシーブリリ
アントブルーで染色されたタンパク質全体の7.0％及び
7.2％であり、かつ他の豊富なペプチドに匹敵する量で
存在することを示した。これらのペプチドが、他の細菌
性毒素、例えば様々なCry I Bt毒素などで認められた状
況に対し、タンパク質相同体、類似体を表すことが推測
された。これらのタンパク質は、そのＮ−末端アミノ酸
配列で、40〜90％相同性が変動し、これは毒性断片を包
含している。
内部アミノ酸配列決定：毒素ペプチド遺伝子のクローニ
ングを促進するために、選択されたペプチドの内部アミ
ノ酸配列を、下記の方法で得た。“P"又は“S"ペプチド
パターンであると決定されたピーク2A分画のミリグラム
量に、分取SDS−PAGEを施し、かつトリス−グリシン
（セプラバフ（登録商標））で、PVDF膜（プロブロット
（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜
４時間かけて、ブロットを写しとった。ブロットは、ア
ミノ酸分析及びＮ−末端アミノ酸配列決定のために、そ
れぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプ
ロケム社に送った。TcbAii（配列番号１を含む）、TcdA
ii及びTcaBi（配列番号３を含む）と称される３種のペ
プチドに、ハーバードマイクロケム社でトリプシン消化
を施し、その後HPCLクロマトグラフィーで、個々のペプ
チドを分離した。Ｎ−末端アミノ酸分析は、選択された
トリプシンペプチド断片について行った。ペプチドTcaB
i（205kDaペプチド）について配列決定された、２個の
内部ペプチドは、TcaBi−PT111（配列番号17）及びTcaB
i−PT79（配列番号18）と称される。ペプチドTcaBi（68
kDaペプチド）について配列決定された、２種の内部ペ
プチドは、TcaBi−PT158（配列番号19）及びTcaBi−PT1
08（配列番号20）と称される。ペプチドTcbAii（201kDa
ペプチド）について配列決定された、４種の内部ペプチ
ドは、TcbAii−PT103（配列番号21）、TcbAii−PT56
（配列番号22）、TcbAii−PT81（ａ）（配列番号23）、
及びTcbAii−PT81（ｂ）（配列番号24）と称される。
実施例８ Photorhabdus luminescensW−14ゲノムDNAのコスミドラ
イブラリーの作製、及び毒性タンパク質調製物を含むペ
プチドをコードしている遺伝子を単離するためのスクリ
ーニング 異種宿主における、Photorhabdusの昆虫毒性タンパク
質の生成、及び他の使用のための必須条件として、これ
らのペプチドをコードしている遺伝子を、単離し、かつ
特徴づけることが必要である。この目的は、平行して詳
細に調べられる。ひとつの方法では、後述するように、
その後発現ライブラリーからのクローンの単離に使用さ
れるような、精製された毒素に対して生じた、モノクロ
ーナル及びポリクローナル抗体の使用を基にしている。
別の方法は、本実施例において説明したように、PCR増
幅に使用するための縮重オリゴヌクレオチドを設計する
ための、Ｎ−末端及び内部のアミノ酸配列データの使用
を基にしている。いずれの方法も、各遺伝子の単離、及
びそれらのDNA塩基配列の決定を可能にするために、該
ペプチドをコードしている遺伝子を含むDNAクローンの
同定に使用することができる。
ゲノムDNAの単離:Photorhabdus luminescensの菌株Ｗ−
14（ATCC寄託番号55397）を、２％プロテオースペプト
ン＃３寒天（ディフコラボラトリー社、デトロイト、M
I）上で増殖し、かつ殺虫性毒素の受容能（competenc
e）を、前記実施例１の方法を用いて、通過後に反復さ
れたバイオアッセイにより維持した。振盪培養物50ml
を、２％プロテオースペプトン＃３培地を含む、175ml
の仕切り付きフラスコ中で作製し、28℃かつ150rpmで、
約24時間増殖した。この培養物15mlをペレット化し、か
つDNA単離のために解凍するまで、その培地中で、−20
℃で凍結した。この解凍した培養物を、遠心分離し（70
0×ｇ、30分間）、かつ浮遊しているオレンジ色のムコ
多糖物質を除去した。残りの細胞物質を、遠心分離し
（25,000×ｇ、15分間）、細菌細胞をペレット化し、か
つこの培地を取り除いた。
分子生物学における最近のプロトコール（Ausbelらの
編集、ジョン・ウィリー・ソン社（1994））の2.4.1節
に記載されたCTAB法を適用して、ゲノムDNAを単離した
（塩ショック（salt shock）を含み、及び全ての容量を
10倍に増量した点を変更した。）。ペレット化した細菌
細胞を、TFバッファー（10mMトリス−HCl、1mM EDTA、p
H8.0）中で再懸濁し、最終容量を10mlにし、その後5M N
aClを12ml添加し；この混合物を、15,000×ｇで、20分
間遠心分離した。得られたペレットを、TE 5.7ml中で再
懸濁し、かつこの懸濁液に、10％SDS 300ml及び20mg/ml
プロテイナーゼK 60ml（ギブコBRTプロダクツ社、グラ
ンド・アイランド、NY;滅菌蒸留水を溶媒とする）を添
加した。この混合物を、37℃で１時間インキュベート
し；その後、リゾチーム10mg（ウォーシングトン・バイ
オケミカル社、フリーホールド、NJ）を添加した。添加
の45分後に、5M NaCl 1ml及びCTAB/NaCl溶液800ml（10
重量／容量％CATB及び0.7M NaCl）を添加した。この調
製物を、65℃で10分間インキュベートし、次に緩やかに
攪拌し、更にインキュベートし、かつ約20分間攪拌し、
細胞物質が透明化するのを補助した。クロロホルム／イ
ソアミルアルコール溶液（24:1、容量／容量）を等量添
加し、緩徐に混合し、かつ遠心分離した。等量のPCI
（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、
50:49:1、容量／容量／容量、1Mトリス−HCl、pH8.0で
平衡にした；インターマウンティンサイエンティフィッ
ク社、カイスビル、UT）で２回抽出した後、このDNA
を、イソプロパノール0.6容量で沈殿した。このDNA沈殿
物を、ガラス棒でゆっくり取り出し、70％エタノールで
２回洗浄し、乾燥し、かつ2ml STE（10mMトリス−HCl、
pH8.0、10mM NaCl、1mM EDTA）に溶解した。この調製物
は、260nmで光学濃度を測定したところ（すなわちO
D260）、DNAを2.5mg/ml含有していた。
この単離されたゲノムDNAの分子の大きさの範囲は、
ライブラリーの作製に適すると評価した。CHEFゲル分析
を、パルスウェーブ760変換器を備えたバイラドCHEF−D
R II装置（バイオラドラボラトリー社、リッチモンド、
CA）上で、0.5×TBEバッファー（44.5mMトリス−HCl、p
H8.0、44.5mM H3BO3、1mM EDTA）を用い、1.5％アガロ
ース（シーケム（登録商標）LE、FMCバイオプロダクツ
社、ロックランド、ME）ゲル中で行った。この操作パラ
メーターは：初期Ａ時間、３秒；最終Ａ時間、12秒;200
ボルト；操作温度、４〜18℃；操作時間、16.5時間であ
った。臭化エチジウムで染色し、紫外線下でこのゲルを
検査し、このDNAの大きさが30〜250kbpの範囲であるこ
とが示された。
ライブラリーの作製：このPhotorhabdusゲノムDNA調製
物を、部分的Sau3A 1で消化した。この方法は、Ausbel
（前掲）の3.1.3節に基づいた。ほとんど最適の結果が
得られるまで、様々な条件下で、より小さい規模で反応
を実行することで適合させた。様々な条件で、規模拡大
したいくつかの大量反応を行い、結果を、CHEFゲル上で
分析し、かつ最良の大規模調製物のみについて、先に進
めた。最適な場合、PhotorhabdusゲノムDNA200μｌを、
Sau3A 1（ミューイングランド・バイオラボ社、“NE
B"、ビバリー、MA）1.5ユニットと共に、全量2mlの1X N
EB 4バッファー（該製造業者から10×で供給）中で、37
℃で、15分間、インキュベートした。この反応を、PCI
2mlを添加することによって停止し、かつ8000×ｇで10
分間、遠心分離した。上清に、5M NaClを200μｌと、氷
冷したエタノール6mlを添加した。この調製物を、−20
℃で30分間冷却し、その後12,000×ｇで15分間、遠心分
離した。上清を除去し、かつ沈殿を40℃の真空炉で乾燥
し、その後STE 400μｌに再懸濁した。分光光度学的ア
ッセイは、投入したDNAの約40％を回収したことを示し
た。消化されたDNAは、CPMBの5.3.2節（前掲）に従い、
ショ糖密度勾配上で大きさで分画した。10％から40％
（重量／容量）の直線状のショ糖密度勾配を、ウルトラ
−クリアー（登録商標）チューブ（ベックマンインスツ
ルメンツ社、パロアルト、CA）中で、勾配作製器を用い
て調製し、かつ該DNA試料を、最上部に乗せた。遠心分
離（26,000rpm、17時間、ベックマンSW41ローター、20
℃）後、分画（約750μｌ）を、この勾配の最上部から
採取し、かつCHEFゲル電気泳動（前述）で分析した。大
きさが20〜40kbpのSau3A 1断片を含有する分画を選択
し、かつAusbel（前掲）の5.3.3節の方法を変更して
（全ての溶液の量を、約6.3倍に増量）、DNAを沈殿し
た。一晩沈殿した後、DNAを、遠心分離（17,000×ｇ、1
5分間）により収集し、乾燥し、TEに再度溶解し、最終
容積80μｌとし、かつ3M酢酸ナトリウム８μｌ及びエタ
ノール220μｌを添加して、再沈殿した。前述の遠心分
離により収集されたペレットを、TE 12μｌ中で再懸濁
した。DNA濃度を、ホウファーTKO100蛍光光度計（ホウ
ファーサイエンティフィックインスツルメンツ社、サン
フランシスコ、CA）を用いて、ヘキスト33258染料（ポ
リサイエンス社、ワーリントン、PA）蛍光定量法で測定
した。大きさで分画されたDNAの約2.5μｌが、回収され
た。
コスミドpWE15 DNA（ストラータジーン社、ラホラ、C
A）30μｇを、制限酵素BamH 1（NEB）100ユニットで、
製造業者のバッファー（最終容量が200μｌ、37℃、１
時間）を溶媒として、完全に消化した。この反応物を、
PCI 100μｌで抽出し、かつDNAを、3M酢酸ナトリウム及
び−20℃の無水エタノール550μｌを添加することによ
って、水相から沈殿した。−70℃で20分間放置した後、
このDNAを、遠心分離（17,000×ｇ、15分間）により収
集し、真空で乾燥し、かつ10mMトリス−HCl、pH8.0、18
0μｌに溶解した。これに、10×CIPバッファー（100mM
トリス−HCl、pH8.3;10mM ZnCl2;10mM MgCl2）20μｌを
添加し、かつ1:4に希釈した仔ウシの腸のアルカリホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ
ポリス、IN）１μｌ（0.25ユニット）を添加した。37℃
で30分放置後、下記を添加し:0.5M EDTA pH8.0を２μl;
10％SDSを10μl;20mg/mlプロテイナーゼＫ（前述）を0.
5μｌであり、引き続き55℃で30分間インキュベートし
た。PCI 100μｌ及びフェノール（インターマウンティ
ンサイエンティフィック社、1Mトリス−HClで平衡化、p
H8.0）100μｌで連続抽出した後、脱リン酸化したDNA
を、7.5M酢酸アンモニウム72μｌ及び−20℃のエタノー
ル550μｌの添加により沈殿し、氷上で30分間インキュ
ベートし、前述のように遠心分離した。沈殿したDNA
を、−20℃の70％エタノール500μｌで１回洗浄し、真
空で乾燥し、かつTEバッファー20μｌに溶解した。
大きさで分画したSau3A 1断片の、BamH 1で消化しか
つリン酸化したpWE15ベクターへのライゲーションを、A
usbelの3.3節のプロトコールを変更（すなわち、製造業
者によって供給された、予備混合した10×ライゲーショ
ンバッファーを使用）して、T4リガーゼ（NEB）を用い
て達成した。ライゲーションは、総量20μｌについて、
15℃で一晩行い、引き続き−20℃で貯蔵した。
DNA約１μｇを含有する、コスミドDNAライゲーション
反応物４μｌを、市販のパッケージングエクストラクト
（ギガパック（登録商標）IIIゴールドパッケージング
エクストラクト、ストラータジーン社）を用いて、製造
業者の指示に従って、λバクテリオファージにパッケー
ジした。パッケージした調製物は、使用時まで４℃で貯
蔵した。下記のギガパック（登録商標）IIIゴールドプ
ロトコール（コスミドライブラリーのタイタリング（ti
tering））に従い、このパッケージしたコスミド調製物
を、エシェリキア・コリXL1ブルーMR細胞（ストラータ
ジーン社）への導入に使用した。XL1ブルーMR細胞を、
0.2重量／容量％マルトースと10mM MgSO4を含有する、L
B培地（g/L:バクト−トリプトンが10;バクト酵母抽出物
が5;バクト寒天が15;NaClが５（ディフコラボラトリー
社、デトロイト、M I））中で、37℃で増殖した。５時
間増殖した後、細胞を、700×ｇ（15分間）でペレット
化し、10mM MgSO4 6ml中に再懸濁した。培養物の濃度
を、10mM MgSO4で、OD600＝0.5に調節した。パッケージ
したコスミドライブラリーを、滅菌したSM培地（0.1M N
aCl、10mM MgSO4、50mMトリス−HCl、pH7.5、0.01重量
／容量％ゼラチン）で1:10又は1:20に希釈し、かつ希釈
した調製物25μｌを、希釈したXL1ブルーMR細胞25μｌ
と混合した。この混合物を、25℃で30分間インキュベー
トし（振盪せず）、その後LBブロス200μｌを添加し、
かつインキュベーションを、時々緩く攪拌しながら、約
１時間継続した。この培養物のアリコート（20〜40μ
ｌ）を、アンピシリンを100mg/l含む、LB寒天プレート
（すなわちLB−Amp100）上に播種し、37℃で一晩インキ
ュベートした。増幅せずにこのライブラリーを保存する
ために、単一のクローンを採取し、かつ滅菌した96ウェ
ルのマイクロウェルプレートの個々のウェルに接種し；
各ウェルには、テリフィックブロス（TB培地：バクトト
リプトンが12g/l、バクト酵母抽出物が24g/l、0.4容量
％グリセロール、17mM H2PO4、72mM K2HPO4）75μｌ
と、アンピシリン100mg/l（すなわちTB−Amp100）を入
れ、かつ一晩、37℃でインキュベートした（振盪せ
ず）。96ウェルプレートを、コピープレートに複写した
後、フィルター滅菌したTB:グリセロール（1:1、容量／
容量、アンピシリン100mg/lは有又は無）を75μl/ウェ
ルずつ、このプレートに添加し、これを手短に100rpm、
37℃で振盪し、その後パラフィルム（登録商標）（アメ
リカンナショナル社、グリニッジ、CT）で封をし、−70
℃のフリーザーに静置貯蔵した。コピープレートを、マ
スタープレートと同じように増殖処理した。全部で40個
のこのようなマスタープレート（及びそれらのコピー）
を、調製した。
放射標識したDNAプローブによるライブラリースクリー
ニング：放射性標識したプローブでプロービングするた
めのコロニーフィルターを調製するために、前述のライ
ブラリーの96ウェルプレート10個を、25℃で解凍した
（ベンチ表面は室温）。96の先が尖った部分を備えたレ
プリカプレーティング器具を用いて、TB−Amp100を75μ
l/ウェル含む、新たな96ウェルコピープレートに接種し
た。このコピープレートを、37℃で一晩増殖し（静
置）、その後100rpm、37℃で、約30分間振盪した。増殖
しなかったものを分離するために、全部で800のコロニ
ーを、このコピープレート上に出現させた。前記レプリ
カ器具を用いて、バイオアッセイプラスチックディッシ
ュ（Nunc、243×243×18mm;カーティンマティソンサイ
エンティフィック社、ウッドデールIL）中の、固形LB−
Amp100（100ml/ディッシュ）上に配置した、マグナNT
（MSI社、ウェストボロ、MA）ナイロン膜（0.45μｍ、2
20×250mm）の上に、この96ウェルアレーのデュプリケ
ートの痕跡（impression）を接種した。これらのコロニ
ーを、前述の膜の上で、37℃で、約３時間増殖した。
陽性対照コロニー（GZ4配列インサートを含む細菌ク
ローン、下記参照）を、クロラムフェニコール35mg/lを
補充したLB培地（すなわちLB−Cam35）について、セパ
レートのマグナNT膜（Nunc.、0.45μｍ、82mmの円形）
上で増殖し、かつこのライブラリーコロニー膜に沿って
処理した。膜上の細菌コロニーを溶菌し、かつゲニウス
（登録商標）システムユーザーガイド2.0版（ベーリン
ガーマンハイム、インディアナポリス、IN）のプロトコ
ールに従って、DNAを、変性かつ中和した。0.5N NaOHと
1.5M NaClに15分間浸漬したフィルターペーパー上に、
膜をコロニー側が上になるように置いて、変性し、かつ
1Mトリス−HCl、pH8.0、1.5M NaClに15分間浸漬したフ
ィルターペーパー上で中和した。ストラータジーン社の
UVストラタリンカーを自動架橋（auto crosslink）に設
定して用いて、UV架橋した後、この膜を、乾燥状態25℃
で、使用時まで保存した。膜を、単一の96ウェルプレー
トのデュプリケートの痕跡を含む細片に切り揃え、その
後CPMB（前掲）6.4.1節の方法で、広く洗浄した:3×SS
C、0.1重量／容量％SDS中で、25℃で３時間洗浄した
後、同じ溶液で、65℃で１時間洗浄し、次にハイブリダ
イゼーション工程（20×SSC＝3M NaCl、0.3Mクエン酸ナ
トリウム、pH7.0）のための調製物中の、２×SSCで洗い
流した。
tcaC遺伝子の特異的ゲノム断片の増幅：精製したTacCペ
プチド分画に関して決定されたＮ−末端アミノ酸配列
（ここでは配列番号２として示す）を基に、縮重オリゴ
ヌクレオチドのプール（プールS4Psh）を、アプライド
バイオシステムABI394DNA/RNAシンセサイザー（パーキ
ンエルマー社、フォスターシティー、CA）で、標準的β
シアノエチル化学により合成した。これらのヌクレオチ
ドを、８時間、55℃で脱保護し、水に溶解し、分光光度
計による測定で定量し、かつ使用するために希釈した。
このプールは、TacCペプチドのＮ−末端の決定されたア
ミノ酸配列と一致した。決定されたアミノ酸配列及び対
応する縮重したDNA配列を、下記に示し、ここでＡ、
Ｃ、Ｇ及びＴは、標準のDNA塩基であり、Ｉはイノシン
を表す： 縮重オリゴヌクレオチドの別のセットを、合成し（プ
ールP2.3.5R）、配列番号17の決定されたアミノ酸配列
に関するコード鎖の完全性を示した： これらのオリゴヌクレオチドは、Photorhabdus菌株−
14（前記参照）から調製されたゲノムDNA由来の特異的D
NA断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR
（登録商標）、ロッシュモレキュラーシステム社、ブラ
ンチュバーグ、NJ）のプライマーとして使用した。典型
的な反応物（50μｌ）は、各プライマープールP2Psh及
びP2.3.5Rを125pmol、ゲノム鋳型DNAを253ng、dATP、dC
TP、dGTP及びdTTPを各々10nmol 1×ゲネアンプ（登録商
標）PCRバッファー、並びにアムプリタック（登録商
標）DNAポリメラーゼを2.5ユニット（両方ともロシュモ
レキュラーシステム社から入手;10×ゲネアンプ（登録
商標）バッファーは、100mMトリス−HCl、pH8.3、500mM
KCl、0.01重量／容量％ゼラチン）を含有した。増幅
は、94℃（1.0分間）、55℃（2.0分間）、72℃（3.0分
間）、その後7.0分間72℃の伸長期間の35サイクルを用
い、パーキンエルマーセタスDNAサーマルサイクラー
（パーキンエルマー社、フォスターシティー、CA）中で
行った。増幅生成物は、TEAバッファー（40mMトリス−
酢酸、2mM EDTA、pH8.0）中で、２重量／容量％ヌシー
ヴ（登録商標）3:1アガロース（FMCバイオプロダクツ
社）を通す電気泳動で分析した。このゲルを臭化エチジ
ウム（0.5μg/ml）で染色し、紫外線下で検出すること
により、大きさが250bpと推定される特異的生成物が多
くの他の増幅生成物中に認められた。
およそ250bp生成物を含有しているゲルの部分を切
り、小さいプラグ（直径0.5mm）を取り出し、PCR増幅
（40サイクル）用の鋳型の供給に使用した。この反応物
（50μｌ）は、ゲノム鋳型DNAを除いて、前述と同じ内
容物を含有した。増幅後、この断片の末端を平滑にし、
かつ１ユニットのT4DNAポリメラーゼ（NEB）、1nmol AT
P、及び2.15ユニットのT4キナーゼ（ファルマシアバイ
オテク社、ピスケートウェイ、NJ）と共に、25℃で20分
間、インキュベートすることによって、リン酸化した。
DNA断片は、TEAを溶媒とする１重量／容量％GTG（登
録商標）アガロース（FMC）を通す電気泳動により、残
留するプライマーから分離した。見かけの大きさ250bp
の断片を有するゲル切片を切り取り、かつそのDNAを、
キアエックスキット（キアゲン社、チャストウォース、
CA）を用いて抽出した。
この抽出されたDNA断片を、制限酵素Sma 1で完全に消
化したプラスミドベクターpBC KS（＋）（ストラータジ
ーン社）にライゲートし、かつ前述のpWE15 DNAプロー
ブに関して説明したのと同様の方法で抽出した。典型的
なライゲーション反応物（16.3μｌ）は、１×ライゲー
ションバッファー（50mMトリス−HCl、pH7.4;10mM MgCl
2;10mMジチオスレイトール;1mMスペルミジン;1mM ATP;1
00mg/mlウシ血清アルブミン）を溶媒として、消化され
たpBC KS（＋）DNAを100ng、250bp DNA断片を70ng、1nm
ol［Co（NH3）６］Cl、及びT4 DNAリガーゼを3.9Weiss
ユニット（コラボラチブバイオメディカルプロダクト
社、ベッドフォード、MA）を含有した。14℃で一晩イン
キュベートした後、供給者の指示に従って、ライゲーシ
ョンした生成物を、凍結したコンピテントエシェリキア
・コリDH5α（ギブコBRL）に形質転換し、IPTS（119μg
/ml）及びＸ−ガル（50μg/ml）を含有する、LB−Cam35
プレート上に配置した。独立した白色コロニーを採取
し、かつプラスミドDNAを、変更されたアルカリ溶解/PE
G沈殿法（PRISM（登録商標）簡易反応ダイデオキシ（登
録商標）ターミネーターサイクル配列決定キットのプロ
トコール;ABI/パーキンエルマー社）により、調製し
た。このインサートDNAの両方の鎖のヌクレオチド配列
を、T7プライマー［pBC KC（＋）塩基601−623:TAAAACG
ACGGCCAGTGAGCGCG］及びLacZプライマー［pBC KS（＋）
塩基792−816:ATGACCATGATTACGCCAAGCGCGC］、及びPRIS
M（登録商標）配列決定キット（ABI/パーキンエルマー
社）のプロトコールを用いて決定された。組込まれてい
ない染色したターミネーターであるジデオキシリボヌク
レオチドは、セントリーセップ100カラム（プリンスト
ンセパレーション社、アデルフィア、NJ）を、製造業者
の指示に従って通すことによって、除去した。このDNA
配列は、ABIモデル373A DNAシークエンサー（ABI/パー
キネルマー社）を用いて、これらの試料を分析すること
によって得られた。２種の単離体GZ4及びHB14のDNA配列
は、図１に詳細に説明したものが認められた。
この配列は、下記の特徴を持つ:i）塩基１−20は、S4
Psh縮重オリゴヌクレオチドの64の可能性のある配列の
ひとつを表す、ii）アミノ酸１−３及び６−12の配列
は、TacCのＮ−末端について決定されたもの（配列番号
２）と正確に一致する、iii）コードされた４番目のア
ミノ酸は、セリン残基ではなく、システイン残基であ
り、この差異は、セリンコドンの縮重内でコードされて
いる（前記参照）、iv）コードされた５番目のアミノ酸
は、プロリンであり、配列番号２で示されたTcaC N−末
端配列に対応している、ｖ）塩基257−276は、縮重プー
ルにデザインされた192の可能性のある配列のひとつを
コードしている、vi）塩基268−270に導入されたTGA終
結コドンは、対応する位置で該オリゴヌクレオチドプー
ルに組込まれた縮重に対する相補性の結果であり、かつ
対応する遺伝子の短い読み枠を示すものではない。
TcaCペプチド遺伝子特異性プローブの標識 夫々100pモルのP2Pshプライマー及びP2.3.5Rプライマ
ー、鋳型としてのプラスミドGZ4またはHE14 10ng、夫々
20nモルのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、AmpliTAq DNA
ポリメラーゼ５単位、1X濃度のGeneAmp 緩衝液を上記
と同じ温度レジメのもとに使用して、上記276塩基に相
当するDNAフラグメントを100μｌの反応容積でPCR に
より増幅した（35サイクル）。増幅産物をQiaexキット
により１％GTG アガロースゲルから抽出し、フルオロ
メトリーにより定量した。
プラスミドHB14鋳型から抽出された増幅産物（約400n
g）を５つのアリコートに分け、製造業者の指示に従っ
てハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガ
ー・マンハイム）を使用して32P−dCTPで標識した。と
り込まれなかった放射性同位元素を供給業者の指示に従
ってNucTrap プローブ精製カラム（ストラタゲン）中
の通過により除去した。標識されたDNA産物の比活性を
シンチレーションカウントにより測定したところ、3.11
x 108dpm/μｇであった。この標識されたDNAを使用し
てゲノムライブラリーの800の員から調製された膜を探
査した。
TcaCペプチド遺伝子特異性プローブによるスクリーニン
グ 放射能標識されたHB14プローブを約10分間沸騰させ、
次いで“最小hyb"溶液に添加した［注：“最小hyb"方法
をCERESプロトコル；“制限酵素断片長多型研究マニュ
アルバージョン4.0",節４−40及び４−47;CERES/NPI,Sa
lt Lake City,UTから採用する。NPIは現存していない
が、その継承者がLinkage Geneticsとして運用してい
る］。“最小hyb"溶液は10％w/vのPEG（ポリエチレング
リコール、M.W.約8000）、７％w/vのSDS、0.6XのSSC、1
0mMのリン酸ナトリウム緩衝液（95g/lのNaH2PO4・1 H2O
及び84.5g/lのNa2HPO4・7 H2Oを含む1Mの原液から）、5
mMのEDTA、及び100mg/mlの変性サケ***DNAを含む。膜
を素早く乾燥ブロットし、次いで、プレハイブリダイゼ
ーションを用いないで、膜の５ストリップを、“最小hy
b"75ml及び2.6ng/mlの放射能標識されたHB14プローブを
含む二つのプラスチックボックスの夫々に入れた。これ
らを60℃で徐々に振とうしながら一夜インキュベートし
た。フィルターを夫々約10分間にわたって25℃で“最小
hyb洗浄液”（0.25XのSSC、0.2％のSDS）中で３回洗浄
し、続いて同溶液中で60℃で徐々に振とうしながら２回
の30分間の洗浄を行った。フィルターをライト−タイト
・オートラジオグラフィーカセット中でサランラップ
（ダウ・ブランド、Indianapolis,IN）で覆われた紙の
上に置き、４時間にわたって−70℃で２種のデュポン・
クロネックス・ライトニング・エンハンサー＋C1エンハ
ンサー（シグマ・ケミカル社,St.Lois,MO）を用いてＸ
−OmatX線フィルム（コダック,Rochester,NY）に露出し
た。現像（通常の写真操作）後に、有意なシグナルが更
に弱く、更に不規則なシグナルのハイバックグラウンド
の間で両方の反復試験で明らかであった。再度、フィル
ターを約４時間にわたって68℃で“最小hyb洗浄液”中
で洗浄し、次いで再度カセットに入れ、フィルムを−70
℃で一夜露出した。12の可能な陽性を二重の96ウェル・
コロニー陥凹の両方について強いシグナルにより同定し
た。シグナルは陰性の対照膜（pWE15を含むXL1ブルーMR
細胞のコロニー）では見られず、非常に強いシグナルが
実験サンプルで同時に処理された陽性の対照膜（PCR産
物のGZ4分離物を含むDH5α細胞）で見られた。
12の推定ハイブリダイゼーション−陽性コロニーを凍
結された96ウェルライブラリープレートから回収し、固
体LB−Amp100培地で37℃で一夜増殖させた。次いでそれ
らを固体LB−Amp100にパッチした（3/プレート、＋３種
の陰性対照:pWE15ベクターを含むXL1ブルーMR細胞）。
膜（マグナNTナイロン、0.45ミクロン）の二つの組をハ
イブリダイゼーションのために調製した。フィルターを
パッチプレートのコロニーの上に直接置き、次いでそれ
を付着バクテリア細胞とともに除去し、以下のようにし
て処理することにより第一組を調製した。第二組のフィ
ルターをLB−Amp100培地を含むプレートに入れ、次いで
細胞をパッチプレートからフィルターに移すことにより
接種した。37℃で一夜増殖後に、フィルターをプレート
から除去し、処理した。
フィルターのバクテリア細胞を溶解し、夫々のフィル
ターをプラスチックプレート中の0.5NのNaOHのプール
（1.0ml）に３分間にわたってコロニー面を上にして置
くことによりDNAを変性した。フィルターをペーパータ
オルで乾燥ブロットし、次いでそのプロセスを新しい0.
5NのNaOHで繰り返した。乾燥ブロッティング後に、フィ
ルターを夫々1Mのトリス−HCl、pH7.5の1.0mlのプール
に３分間入れることにより中和し、乾燥ブロットし、新
しい緩衝液で再度中和した。これに続いて0.5Mのトリス
−HCl、pH7.5＋1.5MのNaClのプールで２回の同様のソー
キング（夫々５分間）を行った。乾燥ブロッティング後
に、そのDNAをフィルター（上記のとおり）にUV架橋
し、フィルターを3X SSC約100ml＋0.1％（w/v）のSDS中
で洗浄した（25℃、100rpm）（４回、夫々の洗浄につい
て夫々新しい溶液で30分間）。次いでそれらを２時間に
わたって65℃、50rpmで最小容積のプレハイブリダイゼ
ーション溶液［6X SSC＋夫々１％w/vのフィコール400
（ファーマシア）、ポリビニルピロリドン（平均M.W.36
0,000;シグマ）及びウシ血清アルブミンフラクションV;
（シグマ）］に入れた。プレハイブリダイゼーション溶
液を除去し、ライブラリー膜の先のハイブリダイゼーシ
ョンから保存されており、95℃で５分間変性されたHB14
32P標識プローブで置換した。50rpmで振とうしながら
ハイブリダイゼーションを60℃で16時間行った。
標識プローブ溶液の除去後に、膜を25℃（50rpm、15
分間）で3X SSC（夫々約150mlの洗浄液）中で３回洗浄
した。次いでそれらを0.25X SSC＋0.2％のSDS（最小hyb
洗浄液）中で68℃で３時間洗浄し（50rpm）、1.5時間に
わたって25℃で上記のＸ線フィルムに露出した（無エン
ハンサースクリーン）。この露出はコスミド分離物22G1
2、25A10、26A5、及び26B10について非常に強いハイブ
リダイゼーションシグナルを明らかにし、またコスミド
分離物8B10では非常に弱いシグナルを明らかにした。シ
グナルは陰性対照（pWE15）コロニーでは見られず、非
常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽
性対照膜（PCR産物のGZ4分離物を含むDH5α細胞）で見
られた。
tcaB遺伝子の特定のゲノムフラグメントの増幅 精製されたTcaBiペプチドフラクションについて決定
されたＮ末端アミノ酸配列（本明細書配列番号３として
開示される）に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドのプ
ール（プールP8F）をペプチドTcaCについて記載された
ようにして合成した。決定されたアミノ酸配列及び相当
する縮重DNA配列を以下に示し、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは通
常のDNA塩基であり、Ｉはイノシンを表す。
縮重オリゴヌクレオチドの別の組を合成し（プールP
8.108.3R）、TcaBi−PT108内部ペプチドの決定されたア
ミノ酸配列（本明細書中配列番号20として開示される）
についてコードストランドの補体に相当した。
ホットスタート50チューブTM（モレキュラー・パイオ
−プロダクツ社,SanDiego,CA）を使用してこれらのオリ
ゴヌクレオチドをPCRのプライマーとして使用してフォ
トラブダス（Photorhabdus）株Ｗ−14（上記を参照のこ
と）から調製されたゲノムDNAから特定のDNAフラグメン
トを増幅した。典型的な反応液（50μｌ）は1XGeneAmp
PCR緩衝液中に夫々2nモルのdATP、dCTP、dGTP、及びd
TTPとともに夫々25pモルのプライマープールP8F及びP8.
108.3R（下層）、並びに1X GeneAmp PCR緩衝液中にゲ
ノム鋳型DNA230ng、夫々8nモルのdATP、dCTP、dGTP、及
びdTTP、及び2.5単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ（上
層）を含んでいた。増幅をTcaCペプチドについて記載さ
れたようにして35サイクルにより行った。増幅産物をTE
A緩衝液中で0.7％w/vのシーケム LEアガロース（FMC）
による電気泳動により分析した。推定サイズ1600bpの特
定産物を観察した。
４種のこのような反応液をプールし、増幅されたDNA
をTcaCペプチドについて記載されたようにしてQiaexキ
ットにより1.0％のシーケム LEゲルから抽出した。P8F
プライマープール及びP8.108.3Rプライマープールを使
用して、抽出されたDNAを配列決定（PRISMTM配列決定キ
ット）の鋳型として直接使用した。夫々の反応液は鋳型
DNA約100ng及び25pモルの一種のプライマープールを含
み、TcaCペプチドについて記載されたようにして通常の
プロトコルに従って処理した。P8Fプライマーの延長か
ら誘導された配列の分析は短いDNA配列（及びコードさ
れたアミノ酸配列）を明らかにした。
これは配列番号３（TcaBi）として開示されたＮ末端ペ
プチド配列の一部に相当する。
TcaBiペプチド遺伝子特異性プローブの標識 ゲル精製されたTcaBi DNAフラグメント約50ngを上記
のようにして32P−dCTPで標識し、とり込まれなかった
放射性同位元素をNICKカラム （ファーマシア）中の通
過により除去した。標識されたDNAの比活性を測定した
ところ、6 x 109dpm/μｇであった。この標識されたDNA
を使用してTcaC−ペプチド特異性プローブにハイブリッ
ドを形成したゲノムライブラリーの員から調製されたコ
ロニー膜を探査した。
TcaC−プローブライブラリースクリーン（上記を参照
のこと）で同定された12のコロニーを含む膜を毎回約30
分間で１リットルの0.1X SSC＋0.1％のSDS中で２回沸騰
することにより放射性TcaC−特異性標識からストリッピ
ングした。放射性標識の除去を６時間のフィルム露出で
チェックした。次いでストリッピングされた膜を先に調
製したTcaBiペプチド特異性プローブとともにインキュ
ベートした。標識DNAを10分間の沸騰により変性し、次
いで60℃で“最小hyb"溶液100ml中で１時間インキュベ
ートされたフィルターに添加した。この温度で一夜のハ
イブリダイゼーション後に、プローブ溶液を除去し、フ
ィルターを以下のようにして洗浄した（全て、0.3X SSC
＋0.1％のSDS中）。25℃で５分間にわたって１回、新し
い溶液中で60℃で１時間にわたって１回、そして新しい
溶液中で63℃で１時間にわたって１回。通常の操作によ
るＸ線フィルムへの1.5時間の露出後に、４つの強くハ
イブリッドを形成するコロニーを観察した。これらは、
TcaC−特異性プローブによれば、分離物22G12、25A10、
26A5、及び26B10であった。
同TcaBiプローブ溶液を等容積（約100ml）の“最小hy
b"溶液で希釈し、次いでゲノムライブラリーの800の員
を含む膜をスクリーニングするのに使用した。上記のよ
うなハイブリダイゼーション、洗浄、そしてＸ線フィル
ムへの露出後に、４種のコスミドクローン22G12、25A1
0、26A5、及び26B10のみがこのプローブに強くハイブリ
ッドを形成することがわかった。
TcaCペプチド及びTcaBiペプチドをコードする遺伝子を
含むサブクローンの単離、及びそのDNA塩基配列の決定 株XL1ブルーMR中の３種のハイブリダイゼーション陽
性コスミドを30℃でTB−Amp100中で一夜振とう（200rp
m）しながら増殖させた。細胞を遠心分離により回収し
た後、製造業者のプロトコルに従って市販のキット（BI
GprepTM、５プライム３プライム社,Boulder,CO）を使用
してコスミドDNAを調製した。一種のコスミド、26A5の
みをこの操作により成功裏に単離した。制限酵素EcoR 1
（NEB）で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、お
よそのサイズ14、10、８（ベクター）、５、3.3、2.9、
及び1.5kbpのフラグメントを検出した。３種の同株から
コスミドDNAを単離しようとする第二の試み（8mlの培
養;TB−Amp100、30℃）は沸騰ミニプレプ方法（EvansG.
及びG.Wahl.,1987,“Cosmid vectors for genomic walk
ing and rapid restri−ction mapping",Guide to Mole
cular Cloning Techniques.Meth.Enzymology,152巻,S.B
erger及びA.Kimmel編集,604−610頁）を利用した。一種
のコスミド、25A10のみをこの方法により成功裏に単離
した。制限酵素EcoR 1（NEB）で消化し、ゲル電気泳動
により分析した時、このコスミドはコスミド26A5で先に
見られたのと同じ断片化パターンを示した。
26A5コスミドDNA0.15μｇのサンプルを供給業者のプ
ロトコルによりE.coli DH5α細胞（ギブコBRL）50mlを
形質転換するのに使用した。その株の単一コロニー分離
物をTB−Amp100 4mlに接種し、37℃で８時間増殖させ
た。クロラムフェニコールを225μg/mlの最終濃度で添
加し、インキュベーションを更に24時間続け、次いで細
胞を遠心分離により回収し、−20℃で凍結した。26A5コ
スミドDNAの単離は全ての容積を50％増加し、夫々の工
程でボルテックスではなく攪拌または軽い混合を用いる
ことにより改良された通常のアルカリ溶解ミニプレプ
（Maniatisらの上記引用文献、382頁）によるものであ
った。DNAペレットを70％のエタノール中で洗浄した
後、それを25μg/mlのリボヌクレアーゼＡ（ベーリンガ
ー・マンハイム）を含むTEに溶解した。
GZ4誘導プローブ及びTcaBiプローブにハイブリッドを形
成するEcoR 1フラグメントの同定 コスミド25A10（XL1ブルーMR細胞から）約0.4μｇ及
びコスミド26A5（クロラムフェニコール増幅されたDH5
α細胞から）約0.5μｇを約15単位のEcoR 1（NEB）で85
分間にわたって夫々消化し、一夜凍結し、次いで65℃で
５分間加熱し、0.7％のアガロースゲル中で電気泳動に
かけた（シーケム LE、1X TEA、80ボルト、90分間）。
そのDNAを上記のようにして臭化エチジウムで染色し、
紫外線のもとに写真撮影した。コスミド25A10のEcoR 1
消化産物は完全消化であったが、コスミド26A5のサンプ
ルはこれらの条件下で部分消化されたにすぎなかった。
DNAフラグメントを含むアガロースゲルをデプリネーシ
ョン（depurination）、変性及び中和にかけ、続いて全
てAusubelら（CPMB、上記引用文献）の節2.9に記載され
たようにして高塩（20X SSC）プロトコルを使用してマ
グナNTナイロン膜にサザンブロッティングした。次いで
移入されたDNAを前記のようにしてナイロン膜にUV架橋
した。
プラスミド分離物GZ4のインサートに相当するTcaCペ
プチド特異性DNAフラグメントを上記のようにして100ml
の反応容積でPCRにより増幅した。３種のこのような反
応からの増幅産物をプールし、上記のようにしてQiaex
キットにより１％のGTG アガロースゲルから抽出し、
フルオロメトリーにより定量した。上記のようにしてハ
イ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・
マンハイム）を使用して、ゲル精製されたDNA（100ng）
を6.34 x 108dpm/μｇの比活性に32PーdCTPで標識し
た。
32P標識されたGZ4プローブを10分間沸騰し、次いで
“最小hyb"緩衝液に添加し（1ng/mlで）、消化されたコ
スミドDNAフラグメントを含むサザンブロット膜を添加
し、50rpmで穏やかに振とうしながら60℃で４時間イン
キュベートした。次いで膜を夫々約５分間で25℃で３回
洗浄し（最小hyb洗浄液）、続いて夫々30分間にわたっ
て60℃で２回洗浄した。ブロットを約30分間にわたって
−70℃でフィルム（エンハンサースクリーンを使用）に
露出した。GZ4プローブはこれらの２種のコスミド、26A
5及び25A10の両方の5.0kbp（見掛サイズ）EcoR 1フラグ
メントに強くハイブリッドを形成した。
膜を0.1X SSC＋0.1％のSDS中で約30分間沸騰すること
により放射能をストリッピングし、放射性標識の不在を
フィルムへの露出によりチェックした。次いでそれをコ
ロニー膜（上記）をスクリーニングするのに先に使用さ
れた“最小hyb"緩衝液中で60℃で3.5時間にわたって
（変性）TcaBiプローブとハイブリッドを形成し、前記
のようにして洗浄し、二つのエンハンサースクリーンを
使用して−70℃で40分間にわたってフィルムに露出し
た。両方のコスミドでは、TcaBiプローブが約5.0kbpのE
coR 1フラグメントと軽くハイブリッドを形成し、約2.9
kbpのフラグメントと強くハイブリッドを形成した。
前記のコスミド26A5 DNA（DH5α細胞から）のサンプ
ルをDNAの起源（これから関係するバンドをサブクロー
ン化する）として使用した。このDNA（2.5μｇ）を30μ
ｌの合計容積で1.5時間にわたって約３単位のEcoR I 1
（NEB）で消化して、ゲル電気泳動により確認して部分
消化産物を得た。pBC KS（＋）DNA（ストラタゲン）10
μｇを20μｌの合計容積で1.5時間にわたって20単位のE
coR I 1で消化して、電気泳動により確認して完全消化
をもたらした。両方のEcoR I 1切断DNA製剤を水で50μ
ｌに希釈し、夫々に等容積のPCIを添加し、その懸濁液
を穏やかに混合し、小型遠心分離機中で回転させ、水性
上澄みを回収した。DNAをエタノール150μｌにより沈殿
させ、その混合物を−20℃で一夜置いた。遠心分離及び
乾燥後に、EcoR1消化したpBC KS（＋）をTE100μｌに溶
解した。部分消化された26A5をTE20μｌに溶解した。DN
A回収をフルオロメトリーによりチェックした。
別々の反応において、EcoR 1消化したpBC KS（＋）DN
A約60ngを部分消化されたコスミド26A5 DNA約180ngまた
は270ngとつないだ。T4リガーゼ及びニュー・イングラ
ンド・バイオラブズからの緩衝液を使用して、結合を20
μｌの容積で15℃で５時間行った。無菌TEで100μｌに
希釈された結合混合物を供給業者の指示に従って凍結し
たコンピテントDH5α細胞（ギブコBRL）を形質転換する
のに使用した。種々の量（25〜200μｌ）の形質転換さ
れた細胞を、1mMのIPTG及び50mg/lのＸ−galを含む新た
に調製した固体LB−Cam35培地に塗布した。プレートを3
7℃で約20時間インキュベートし、次いで約３時間にわ
たって暗所で冷却して挿入選択のために着色を強化し。
白色のコロニーを同組成のパッチプレートに取り、37℃
で一夜インキュベートした。
選択されたパッチプレートの夫々の２種のコロニーリ
フトを以下のようにして調製した。白色のコロニーを新
しいプレートに取った後、円形のマグナNTナイロン膜を
パッチプレートに押しつけ、膜を持ち上げ、ライブラリ
ーコロニー膜について上記されたようにして変性、中和
及びUV架橋にかけた。過剰の細胞デブリをティッシュで
軽くふき取ることを含み、架橋されたコロニーリフトを
激しく洗浄した。“最小hyb"プロトコルに従って、一つ
の組を前記GZ4（TcaC）プローブ溶液とハイブリッドを
形成し、他の組を前記TcaBiプローブ溶液とハイブリッ
ドを形成し、続いてライブラリーコロニー膜について記
載されたようにして洗浄し、フィルムに露出した。GZ4
プローブのみ、GZ4プローブ及びTcaBiプローブの両方、
またはTcaBiプローブのみとハイブリダイゼーションシ
グナルを示すコロニーを更なる研究のために選択し、細
胞を前記のIPTG及びＸ−galを含むLB−Cam35培地に単一
コロニー単離のためにストリーキングした。16種の異な
る分離物からの約35の単一コロニーを液体LB−Cam35培
地に取り、37℃で一夜増殖させた。細胞を遠心分離によ
り回収し、プラスミドDNAをManiatisら（上記引用文
献、368頁）に従って通常のアルカリ溶解ミニプレプに
より単離した。DNAペレットをTE＋25μg/mlのリボヌク
レアーゼＡに溶解し、DNA濃度をフルオロメトリーによ
り測定した。EcoR 1消化パターンをゲル電気泳動により
分析した。下記の分離物を有益なものとして採取した。
分離物A17.2は再度つながれたpBC KS（＋）のみを含
み、（陰性）対照に使用した。分離物D38.3及びC44.1は
夫々pBC KS（＋）に挿入された2.9kbpのTcaBiとハイブ
リッドを形成するEcoR 1フラグメントのみを含む。pDAB
2000及びpDAB2001と称されるこれらのプラスミドが夫々
図２に示される。
分離物A35.3はpBC KS（＋）に挿入された約5kbpのGZ4
とハイブリッドを形成するEcoR 1フラグメントのみを含
む。このプラスミドをpDAB2002と称した（また、図２に
示される）。これらの分離物はDNA配列決定の鋳型を与
えた。
前記BIGprepTMキットを使用して、プラスミドpDAB200
0及びpDAB2001を調製した。培養物（30ml）をTB−Cam35
中で２のOD600まで一夜増殖し、次いでプラスミドを製
造業者の指示に従って単離した。DNAペレットを夫々100
μｌのTEに再度溶解し、サンプル保全性をEcoR 1消化及
びゲル電気泳動分析によりチェックした。
配列決定反応を二重反復試験で実験し、一つの反復試
験は鋳型としてpDAB2000 DNAを使用し、他の反復試験は
鋳型としてpDAB2001 DNAを使用した。GZ4/HB14 DNAの配
列決定について上記されたように、ジデオキシ色素ター
ミネーターサイクル配列決定方法を使用して、反応を行
った。初期配列決定実験はプライマーとして上記LacZプ
ライマー及びT7プライマー、＋TcaBi PCR増幅産物の決
定された配列をベースとするプライマー（TH1＝ATTGCAG
ACTGCCAATCGCTTCGG、TH12＝GAGAGTATCCAGACCGCGGATGATC
TG）を使用した。
夫々の配列決定アウトプットの整列及び編集後に、夫
々をパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステム
ズ部門SeqEd 675ソフトウェアにより解読されるような
クロマトグラフィーデータの積分に応じて250〜350塩基
にトランケートした。新規プライマーに適した配列を選
択することにより、その後の配列決定“工程”を行っ
た。二三の例外があるが、プライマー（上記のようにし
て合成した）は50％Ｇ＋Ｃ組成を有し、長さが24塩基で
あった。この方法による配列決定を約2.9kbpのEcoR 1フ
ラグメントの両方のストランドについて行った。
DNA配列決定の鋳型として更に利用するために、分離
物pDAB2002からのプラスミドDNAをBIGprepTMキットによ
り調製した。上記のようにして配列決定反応を行い、分
析した。初期に、T3プライマー（pBS SK（＋）塩基774
−796:CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG）及びT7プライマー（p
BS SK（＋）塩基621−643:GCGCGTAATACGACTCACTATAG）
を使用して隣接ベクター配列からインサートDNAまで読
み取る配列決定反応を開始した。プライマーの別の組
（GZ4F:GTATCGATTACAACGCTGTCACTTCCC;TH13:GGGAAGTGAC
AGCGTTGTAATCGATAC;TH14:ATGTTGGGTGCGTCGGCTAATGGACAT
AAC;及びLW−１−204:GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC）
をつくって内部配列から開始し、これらをサブクローン
化TcaC−ペプチドPCR産物の縮重オリゴヌクレオチド媒
介配列決定により前もって決定した。配列決定の初期ラ
ウンド中に生じたデータから、プライマーの新規な組を
設計し、約5kbpのフラグメントの完全長をウォーク（wa
lk）するのに使用した。合計55オリゴプライマーを使用
して、連続配列の合計4832bpの同定を可能にした。
pDAB2002のEcoR 1フラグメントインサートのDNA配列
をpDAB2000/pDAB2001分離物の決定された配列の一部と
組み合わせる場合、合計6005bpの連続配列を生じた（本
明細書中、配列番号25として開示される）。長い読み取
り枠を相当するアミノ酸に翻訳した場合、その配列はメ
チオニン残基（翻訳の開始）の直後に塩基19−75により
コードされたTcaBi N末端ペプチド（配列番号３として
開示される）を明らかに示す。上流に潜在的リボソーム
結合部位（塩基１−９）があり、下流に、TcaBi−PT158
内部ペプチド（本明細書中、配列番号19として開示され
る）が塩基166−228でコードされる。更に下流に、同読
み取り枠中に、塩基1738−1773で、TcaBi−PT108内部ペ
プチドをコードする配列（本明細書中、配列番号20とし
て開示される）が存在する。また、同読み取り枠中に、
塩基1897−1923で、TcaBiiN末端ペプチド（本明細書
中、配列番号５として開示される）がコードされ、読み
取り枠がヌクレオチド3586−3588にある翻訳終止コドン
まで中断されないで存続する。
TcaBi−PT108をコードする配列の末端とTcaBiiコード
領域の開始の間のイン−フレーム（in−frame）終止コ
ドンの欠如、及びTcaBiiコード領域の直ぐ上流の認識で
きるリボソーム結合部位の欠如は、ペプチドTcaBii及び
TcaBiが配列番号25中の塩基対16で開始する3567bpの単
一読み取り枠によりコードされ、おそらく後翻訳開裂に
より1189アミノ酸（131,586ダルトン；本明細書中、配
列番号26として開示される）の単一の一次遺伝子産物か
ら誘導されることを示す。TcaBiiN末端ペプチドに直ぐ
に先行するアミノ酸がペプチドTcaBiのＣ末端アミノ酸
に相当する場合、TcaBii（627アミノ酸）の予想質量はS
DS−PAGEにより観察されたサイズ（68kDa）より若干高
く、70,814ダルトンである（本明細書中、配列番号28と
して開示される）。このペプチドは1881塩基対の連続ス
トレッチ（本明細書中、配列番号27として開示される）
によりコードされるであろう。TcaBiの天然Ｃ末端はTca
Bi−PT108のＣ末端に若干近くあるものと考えられる。P
T108の分子量［3.438kDa;このペプチドのＮ末端アミノ
酸配列分析中に測定］は30アミノ酸のサイズを予測す
る。TcaBiコード領域のＣ末端［配列番号28の位置604に
あるGlu］を指示するのにこのペプチドのサイズを使用
して、TcaBiの誘導サイズは、更に実験上の観察と一致
して、604アミノ酸または68,463ダルトンであることが
測定される。
1686塩基対のTcaBiiペプチドコード領域（本明細書
中、配列番号29として開示される）の翻訳は60,789ダル
トンの予想質量を有する562アミノ酸（本明細書中、配
列番号30として開示される）のタンパク質を生じ、これ
は観察された61kDaと良く一致する。
潜在的リボソーム結合部位（塩基3633−3638）はtcaB
読み取り枠の終止コドンの48bp下流に見られる。塩基36
45−3677に、ペプチドTcaCのＮ末端をコードする配列
（配列番号２として開示される）が見られる。このＮ末
端ペプチドにより開始される読み取り枠は塩基6005まで
中断されないで存続する（2361塩基対、本明細書中、配
列番号31の最初の2361塩基対として開示される）。完全
TcaCペプチド（見掛けサイズ約165kDa;約1500アミノ
酸）をコードする遺伝子（tcaC）は約4500bpを含むであ
ろう。
また、コスミド26A5のクローン化EcoR 1フラグメント
を含む別の分離物、E20.6を前記GZ4プローブ及びTcaBi
プローブに対するその相同性により同定した。この株に
より宿されたプラスミド（pDAB2004、図２）のDNAのEco
R 1消化産物のアガロースゲル分析は推定サイズ2.9、
５、及び3.3kbpのインサートフラグメントを明らかにし
た。プラスミドpDAB2002の配列から指示されたプライマ
ーから開始されたDNA配列分析は、pDAB2004の3.3kbpのE
coR 1フラグメントがpDAB2002に代表された5kbpのEcoR
1フラグメントに隣接して存在することを明らかにし
た。pDAB2002中に発見された2361塩基対読み取り枠はpD
AB2004中の別の2094塩基［本明細書中、配列番号31の塩
基対2362〜4458として開示される）について中断されな
いで存続する。親コスミド26A5 DNAを鋳型として使用す
るDNA配列分析がその読み取り枠の連続性を確認した。
要するに、その読み取り枠（TcaC配列番号31）は4455塩
基対を含み、かつ1485アミノ酸［本明細書中、配列番号
32として開示される］のタンパク質（TcaC）をコードす
る。166,214ダルトンの計算分子サイズはTcaCペプチド
の推定サイズ（165kDa）と一致し、誘導アミノ酸配列は
TcaC N末端配列［配列番号２］について開示されたもの
と正確に適合する。
発見された配列中の縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ープールを設計するのに使用された配列番号17に相当す
るアミノ酸配列の欠如は、分離物GZ4及びHB14（これら
は初期ライブラリースクリーンにおいてプローブとして
使用された）中に見られるPCR産物の発生がその縮重プ
ール中のプライマーの一つによる逆ストランドプライミ
ングにより偶発的に生じたことを示す。更に、誘導タン
パク質配列は本明細書中配列番号18として開示された内
部フラグメントを含まない。これらの配列は、プラスミ
ドpDAB2004がTcaCペプチドの完全コード領域を含むこと
を明らかにする。
実施例９ TcbAiiペプチドをコードする遺伝子のフォトラブダス
ゲノムライブラリーのスクリーニング この実施例はTcbAiiペプチドをコードする遺伝子を含
むDNAクローンを同定するのに使用した方法、その遺伝
子の単離、及びその部分DNA塩基配列の決定を記載す
る。
プライマー及びPCR反応 昆虫活性製剤のTcbAiiポリペプチドは約206kDaであ
る。このペプチドのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号１
として開示される。このアミノ酸配列の一部をコードす
るために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーの４種の
プール（“フォワード（Forward）プライマー":TH−
４、TH−５、TH−６、及びTH−７）を実施例８に記載さ
れたようにして合成し、以下に示す。
加えて、内部ペプチド製剤（TcbAii−PT81）の一次配
列（“a"）及び二次配列（“b"）を決定し、夫々、本明
細書中、配列番号23及び配列番号24として開示する。以
下に示されるように、配列番号23のペプチドの一部をコ
ードする配列の逆補体をコードするために、縮重オリゴ
ヌクレオチドの４種のプール（“リバース（Re−vers
e）プライマー":TH−８、TH−９、TH−10及びTH−11）
を同様に設計し、合成した。
これらのプライマーの組をPCR反応に使用して、実施
例６で調製されたゲノム フォトラブダス・ルミネセン
スＷ−14 DNAからTcbAiiをコードする遺伝子フラグメン
トを増幅した。AmpliWaxTMゲム（gems）並びにその他の
パーキン・エルマー試薬及びプロトコルを使用して、全
てのPCR反応を“ホット・スタート”技術を用いて行っ
た。典型的には、MgCl2、dNTP、10X GeneAmp PCR緩衝
液II、及びプライマーの混合物（全容積11μｌ）を、単
一ワックスビードを含む管に添加した［10X GeneA−mp
PCR緩衝液IIは100mMのトリス−HCl、pH8.3、及び500m
MのKClを含む］。管を２分間にわたって80℃に加熱し、
冷却した。ワックスシールの上に、10X GeneA−mp PCR
緩衝液II、DNA鋳型、及びAmpliTAq＊ DNAポリメラーゼ
を含む溶液を添加した。ワックスシールの融解及び熱サ
イクルによる成分の混合後に、最終反応条件（50μｌの
容積）は、10mMのトリス−HCl、pH8.3、50mMのKCl、2.5
mMのMgCl2、夫々200μＭのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、1.
25mMの単一フォワードプライマープール、1.25μＭの単
一リバースプライマープール、1.25単位のAmpliTAq＊ D
NAポリメラーゼ、及び170ngの鋳型DNAであった。
反応液をサーモサイクラー（実施例８と同様）に入
れ、下記のプログラムで実験した。
縮重プライマープールを使用して、一連の増幅を三つ
の異なるアニーリング温度（55℃、60℃、65℃）で行っ
た。65℃におけるアニーリングによる反応はアガロース
電気泳動後に目視できる増幅産物を有していなかった。
60℃のアニーリングレジメを有し、プライマーTH−５＋
TH−10を含む反応は、2.9kbpに相当する移動度を有する
増幅産物を生じた。更に少ない量の2.9kbpの産物をプラ
イマーTH−７＋TH−10を用いるこれらの条件下で生じ
た。反応を55℃でアニールした場合、これらのプライマ
ー対は更に多くの2.9kbpの産物を生じ、またこの産物を
プライマー対TH−５＋TH−８及びTH−５＋TH−11により
生じた。付加的な非常に不鮮明な2.9kbpのバンドがプラ
イマー対TH−７＋TH−８、TH−９、TH−10、またはTH−
11からの増幅産物を含むレーン中で見られた。
クローニング及びDNA配列決定に充分なPCR増幅産物を
得るために、プライマーTH−５＋TH−10を使用して10の
別々のPCR反応を設定し、55℃のアニーリング温度で上
記条件を使用して行った。全ての反応液をプールし、2.
9kbpの産物を上記のようにしてアガロースゲルからQiae
x抽出により精製した。
TcbAii内部ペプチドについて決定された付加的な配列
が本明細書中配列番号21及び配列番号22として開示され
る。前記のように、これらのペプチドのアミノ酸配列の
一部をコードする配列の逆補体に相当する縮重オリゴヌ
クレオチド（リバースプライマーTH−17及びTH−18）を
つくった。
縮重オリゴヌクレオチドTH−18及びTH−17を、鋳型と
してのフォトラブダス・ルミネセンスＷ−14 DNA及び5'
−（フォワード）プライマーとしてのTH−４、TH−５、
TH−６、またはTH−７を用いる増幅実験に使用した。こ
れらの反応は夫々約4kbp及び4.5kbpの産物を増幅した。
これらのDNAをアガロースゲルからナイロン膜に移し、T
H−５＋TH−10プライマー対により増幅された2.9kbpの
産物から調製された32P−標識プローブ（上記のとお
り）とハイブリッドを形成した。4kbp及び4.5kbpの増幅
産物の両方が2.9kbpのプローブに強くハイブリッドを形
成した。これらの結果を使用して図３に示されたような
TcbAii内部ペプチド配列を規制する地図をつくった。プ
ライマー間のおよその距離を図３にヌクレオチド数で示
す。
2.9kbpのTcbAiiをコードするフラグメントのDNA配列 精製した2.9kbpのフラグメント（先に調製した）約20
0ngをエタノールで沈殿させ、水17mlに溶解した。25pモ
ルのTH−５プールをプライマーとして用いて、この半分
を配列決定鋳型として使用し、別の半分をTH−10プライ
ミングの鋳型として使用した。配列決定反応は実施例８
に示されたとおりであった。TH−10プライマープールを
使用して、信頼できる配列を生じなかった。しかしなが
ら、TH−５プライマープールとの反応は、以下に開示さ
れた配列を生じた。
この配列に基いて、配列決定プライマー（TH−21、5'
−CCGGGCGACGTTTATCTAGG−3'）を設計し、補体塩基120
−139を反転し、ゲル精製した2.9kbpのTcbAiiをコード
するPCRフラグメントの5'末端（即ち、TH−５末端）に
向かって重合を開始した。決定された配列を以下に示
し、TcbAii配列番号１の生化学的に決定されたＮ末端ペ
プチド配列と比較する。
TcbAii2.9kbp PCRフラグメント配列確認 ［下線を施したアミノ酸＝縮重オリゴヌクレオチドによ
りコードされる］ 生化学的に決定されたアミノ酸配列に対する誘導アミ
ノ酸配列の相同性から、2.9kbp PCRフラグメントがTcbA
コード領域に相当することが明らかである。次いでこの
2.9kbpフラグメントをハイブリダイゼーションプローブ
として使用してTcbAiiをコードする遺伝子を含むコスミ
ドについて実施例８で調製されたフォトラブダスＷ−14
ゲノムライブラリーをスクリーニングした。
Photorhabdusコスミドライブラリーのスクリーニング 実施例８に記載されたようなベーリンガー・マンハイ
ムのハイ・プライム標識キットを使用して、2.9kbpのゲ
ル精製したPCRフラグメントを32Pで標識した。コスミド
ライブラリーからの約800のコロニーのレムナント（rem
nant）を含むフィルターを前記（実施例８）のようにし
てスクリーニングし、陽性クローンを単離コロニーにつ
いてストリーキングし、再度スクリーニングした。３種
のクローン（8A11、25G8、及び26D1）は幾つかのスクリ
ーニング工程及び結合工程により陽性結果を生じた。Tc
bAii特異性プローブのハイブリダイゼーションが実施例
８で同定された４種のコスミド（これらはtcaB遺伝子及
びtcaC遺伝子を含む）のいずれでも観察されなかった。
コスミド8A11、25G8、及び26D1からのDNAを制限酵素Bgl
2、EcoR 1またはHind 3（単独または互いの組み合わ
せ）で消化し、フラグメントをアガロースゲルで分離
し、実施例８に記載されたようにしてナイロン膜に移し
た。膜を4.5kbpフラグメント（プライマーTH−５＋TH−
17によるPhotorhabdusゲノムDNAの増幅により生成し
た）から調製された32P標識プローブとハイブリッドを
形成した。コスミドDNA8A11及び26D1から生じたパター
ンは同膜について同様に切断されたゲノムDNAで生じた
パターンと同一であった。コスミド8A11及び26D1はゲノ
ムTcbAiiをコードする遺伝子座の正確な代表であること
が結論される。しかしながら、コスミド25G8はゲノムDN
Aよりわずかに大きい単一Bgl 2フラグメントを有する。
これはベクター内のインサートの位置決めに由来し得
る。
tcbAをコードする遺伝子のDNA配列 コスミド26D1の膜ハイブリダイゼーション分析は、4.
5kbpプローブが単一の大きいEcoR 1フラグメント（9kbp
より大きい）にハイブリッドを形成することを明らかに
した。このフラグメントをゲル精製し、実施例８に記載
されたようにしてpBC KS（＋）のEcoR 1部位につないで
プラスミドpBC/S1/R1を生成した。実施例８に記載され
た操作を使用して、このプラスミドのインサートDNAの
部分DNA配列を隣接ベクター配列からの“プライマーウ
ォーキング”により決定した。更に別の配列を先に決定
された配列から設計された新規なオリゴヌクレオチドか
らの延長により生じた。別法により同定されたtcbA遺伝
子について決定されたDNA配列（下記の実施例12に記載
されたように本明細書中配列番号11として開示される）
と比較した時に、完全相同性がヌクレオチド１−272、3
19−826、2578−3036、及び3068−3540（合計塩基＝171
2）について見られた。両方のアプローチがTcbAiiペプ
チドをコードするDNAフラグメントを同定するのに使用
し得ることが結論された。
tcbA遺伝子の誘導アミノ酸配列の分析 配列番号11として同定されたDNAフラグメントの配列
は、誘導アミノ酸配列が本明細書中配列番号12として開
示されるタンパク質をコードする。幾つかの特徴がTcbA
iiタンパク質をコードする配列としてのその遺伝子の同
定を証明する。TcbAiiN末端ペプチド（配列番号1:Phe I
le Gln Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn Arg Ala）は
アミノ酸88−100としてコードされる。TcbAii内部ペプ
チドTcbAii−PT81（ａ）（配列番号23）はアミノ酸1065
−1077としてコードされ、TcbAii−PT81（ｂ）（配列番
号24）はアミノ酸1571−1592としてコードされる。更
に、内部ペプチドTcbAii−PT 56（配列番号22）はアミ
ノ酸1474−1488としてコードされ、内部ペプチドTcbAii
−PT103（配列番号24）はアミノ酸1614−1639としてコ
ードされる。この遺伝子はPhotorhabdus・luminescens
株Ｗ−14の殺虫剤タンパク質製剤から単離されるような
TcbAiiペプチドをコードする真正クローンであることが
自明である。
ペプチドTcbAiiとして単離されたタンパク質は、更に
長いペプチドの開裂から誘導される。この証拠は、TcbA
iiN末端ペプチド配列番号１をコードするヌクレオチド
が更に長い読み取り枠の261塩基（配列番号11）（87N末
端近位アミノ酸をコードする）により先行されるという
事実により与えられる。この読み取り枠は大きいペプチ
ドTcbAのＮ末端配列に相当し、かつ本明細書中配列番号
16として開示されるアミノ酸配列Met Gln Asn Ser Leu
をコードするヌクレオチドで開始する。TcbAはTcbAiiの
前駆体タンパク質であると考えられる。
tcbA遺伝子、tcaB遺伝子及びtcaC遺伝子の関係 tcaB遺伝子及びtcaC遺伝子は密接に関連し、単一mRNA
として転写し得る（実施例８）。tcbA遺伝子は、tcaBク
ラスター及びtcaCクラスターを宿しているコスミドと明
らかに重ならないコスミドで産生される。何となれば、
夫々のゲノムライブラリースクリーンが異なるコスミド
を同定したからである。しかしながら、tcbA遺伝子との
tcaB遺伝子及びtcaC遺伝子によりコードされたアミノ酸
配列の比較は相同性の実質的な程度を明らかにする。ア
ミノ酸保存（マックベクターTM配列分析ソフトウェアの
タンパク質アラインメントモード、スコアリングマトリ
ックスpam250、ハッシュ値＝2;コダック・サイエンティ
フィック・イメージング・システムズ,R−ochester,N
Y）が図４に示される。図４中の夫々のパネルのスコア
ラインについて、上カラット（＾）は相同性または保存
アミノ酸変化を示し、また下カラット（ｖ）は非相同性
を示す。
この分析は、残基1739から1894までのTcbAペプチドの
アミノ酸配列がTcaBiペプチドのアミノ酸441−603（P8
の全627アミノ酸の162;配列番号28）に高度に相同であ
ることを示す。加えて、TcbAアミノ酸1932−2459の配列
はペプチドTcaBiiのアミノ酸12−531（全562アミノ酸の
520;配列番号30）に高度に相同である。TcbAペプチド
（配列番号12）が2505アミノ酸を含むことを考慮する
と、それのＣ近位末端にある合計684アミノ酸（27％）
はTcaBiペプチドまたはTcaBiiペプチドに相同であり、
その相同性が推定TcaBプレプロテイン（配列番号26）の
配置に共直線状に配置される。TcbA相同性中のサイザブ
ル（sizeable）ギャップはTcaBプレプロテインのTcaBi
部分とTcaBii部分の間の結合と一致する。明らかに、Tc
bA遺伝子産物及びTcaB遺伝子産物は進化的に関連し、そ
れらがPhotorhabdus中で或る種の共通の機能を共有する
ことが提案される。
実施例10 Photorhabdusブロース中の亜鉛−メタロプロテアーゼの
特性決定：プロテアーゼ抑制、分類、及び精製 プロテアーゼ抑制アッセイ及び分類アッセイ：基質と
して水に溶解したFITC−カゼイン（0.08％最終アッセイ
濃度）を使用して、プロテアーゼアッセイを行った。タ
ンパク質分解反応Photorhabdusブロース25μｌを含む適
当な緩衝液中で25℃で１時間行った（合計反応容積150
μｌ）。また、サンプルをジチオスレイトールの存在下
及び不在下で分析した。インキュベーション後、等容積
の12％のトリクロロ酢酸を添加して未消化のタンパク質
を沈殿させた。0.5時間の沈殿及びその後の遠心分離後
に、上澄み100μｌを96ウェル・ミクロタイタプレート
に入れ、その溶液のpHを等容積の4NのNaOHの添加により
調節した。次いで夫々485nm及び538nmの励起波長及び発
光波長でフルオロスキャンIIフルオロメトリー・プレー
トリーダーを使用してタンパク質分解を定量した。プロ
テアーゼ活性をpH5.0−10.0の範囲で0.5単位の増分で試
験した。下記の緩衝液を50mMの最終濃度で使用した：酢
酸ナトリウム（pH5.0−6.5）；トリス−HCl（pH7.0−8.
0）；及びビス−トリスプロパン（pH8.5−10.0）。観察
された一種以上のプロテアーゼのクラスを同定するため
に、粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビター（最
終濃度0.5μg/μｌ）で処理し、次いで上記基質を使用
してpH8.0でプロテアーゼ活性について試験した。使用
したプロテアーゼインヒビターはＥ−64（Ｌ−トランス
−エポキシサクシニルロイシルアミノ［４−，−グアニ
ジノ］−ブタン）、3,4−ジクロロイソクマリン、ロイ
ペプチン、ペプスタチン、アマスタチン、エチレンジア
ミンテトラ酢酸（EDTA）及び1,10フェナントロリンを含
んでいた。
pH範囲にわたって行われたプロテアーゼアッセイは、
実際に約8.0のpHで最大活性を示す一種以上のプロテア
ーゼが存在することを明らかにした（表16）。DTTの添
加はプロテアーゼ活性に影響しなかった。次いで粗ブロ
ースを種々のプロテアーゼインヒビターで処理した（表
17）。上記インヒビターによる粗ブロースの処理は1,10
フェナントロリンが50μｇの最終濃度で添加された時に
全プロテアーゼ活性の完全な抑制を生じることを明らか
にした。IC50は2mg/mlの粗ブロース溶液100μｌ中５μ
ｇであった。これらのデータは、Photorhabdusブロース
中に見られる最も多い一種以上のプロテアーゼが酵素の
亜鉛−メタロプロテアーゼクラスからのものであること
を示す。
Photorhabdus毒素について実施例５に記載されたよう
にして透析された10−80％の硫酸アンモニウムを50mMの
Na2PO4、pH7.0で平衡にされたＱセファロースカラスに
適用することにより、亜鉛−メタロプロテアーゼの単離
を行った。徹底的な洗浄後に、０〜0.5MのNaCl勾配を使
用して毒素タンパク質を溶離した。生物活性及びタンパ
ク質の大半を0.15〜0.45MのNaClで溶離した。しかしな
がら、タンパク質分解活性の大半が0.25−0.35MのNaCl
フラクション中に存在し、若干の活性が0.15−0.35MのN
aClフラクション中に存在することが観察された。0.25
−0.35MのNaClフラクションのSDS PAGE分析は約60kDaの
主要ペプチドバンドを示した。0.15−0.25MのNaClフラ
クションは同様の60kDaのバンドを含んでいたが、低い
相対タンパク質濃度であった。スペロース12HR 16/50カ
ラムを使用するこのフラクションのその後のゲル濾過は
SDS PAGE分析により主として（合計の染色タンパク質の
90％より大）58.5kDaバンドを含む57.5kDaで移動する主
要ピークを生じた。上記の種々のプロテアーゼインヒビ
ターを使用するこのフラクションの付加的な分析は、プ
ロテアーゼが亜鉛−メタロプロテアーゼであることを測
定した。醗酵１日目のPhotorhabdusブロース中に存在す
るプロテアーゼ活性の殆ど全てが約58kDaの亜鉛−メタ
ロプロテアーゼに相当した。
一種以上の亜鉛−メタロプロテアーゼの第二の単離に
おいて、３日間にわたって増殖されたＷ−14Photorhabd
usブロースを採取し、Schmidt,T.M.,Bleakley,B.及びNe
alson,K.M.1988に記載されたようにしてゼラチンと組み
合わされたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を使用してプロテアーゼ
活性を視覚化した。SDS運転ゲル（5.5 x 8cm）を、0.1
％のゼラチン最終濃度（バイオラドEIA銘柄試薬;Richmo
nd CA）を水に溶解後に混入した12.5％のポリアクリル
アミド（アクリルアミド／ビス−アクリルアミドの40％
原液；シグマ・ケミカル社,St.Louis,MO）でつくった。
SDS−スタッキングゲル（1.0 x 8cm）を0.1％のゼラチ
ンとまた組み合わされた５％のポリアクリルアミドでつ
くった。典型的には、試験すべきタンパク質2.5μｇを
ジチオスレイトール（DTT）を含まないSDS−PAGE装填緩
衝液0.03ml中で希釈し、ゲルに装填した。タンパク質を
SDS運転緩衝液（Laemmli,U.K.1970,Nature 227,680）中
で０℃で8mAで電気泳動にかけた。電気泳動が完結した
後、ゲルを２時間にわたって2.5％（v/v）のトリトンＸ
−100中で洗浄した。次いでゲルを１時間にわたって37
℃で0.1Mのグリシン（pH8.0）中でインキュベートし
た。インキュベーション後、ゲルを固定し、メタノール
−酢酸−水（30:10:60、vol./vol./vol.;シグマ・ケミ
カル社）中0.1％のアミドブラックで一夜にわたって染
色した。プロテアーゼ活性をタンパク質分解及びその後
のとり込まれたゼラチンの拡散のために暗色のアミドブ
ラック染色されたバックグラウンドに対する明るい領域
として視覚化した。58kDa、41kDa、及び38kDaのタンパ
ク質分解活性により生じた少なくとも三つの異なるバン
ドが観察された。
Ｗ−14の３日培養ブロース中の異なるプロテアーゼの
活性アッセイを、基質としての水に溶解されたFITC−カ
ゼイン（0.02％の最終アッセイ濃度）を使用して行っ
た。タンパク質分解実験を37℃で０〜0.5時間にわたっ
て0.1Mのトリス−HCl（pH8.0）中で0.15mlの全容積中の
異なるタンパク質フラクションで行った。反応を水に溶
解された12％のトリクロロ酢酸（TCA）の等容積の添加
により停止した。室温で0.25時間のインキュベーション
後に、サンプルを10,000 x gで0.25時間にわたって遠心
分離し、アリコート0.10mlを除去し、96ウェル・ミクロ
タイタプレートに入れた。次いでその溶液を等容積の2N
の水酸化ナトリウムの添加により中和し、続いて夫々48
5nm及び538nmの励起波長及び発光波長でフルオロスキャ
ンIIフルオロメトリープレートリーダーを使用して定量
した。FITC−カゼインを異なるプロテアーゼ濃度で37℃
で０〜10分間使用して、活性測定を行った。活性の単位
を1000の蛍光単位／分を生じるのに必要とされる酵素の
量と任意に定義し、また比活性をプロテアーゼ1mg当た
りの単位と定義した。
２種の亜鉛−メタロプロテアーゼインヒビター;1,10
フェナントロリン及びＮ−（ａ−ラムノピラノシルオキ
シヒドロキシホスフィニル）−Leu−Trp（ホスホルアミ
ドン）を使用して抑制研究を行い、夫々100％のエタノ
ール及び水に溶解したインヒビターの原液を使用した。
原液濃度は典型的には1,10フェナントロリン及びホスホ
ルアミドンの夫々について10mg/ml及び5mg/mlであり、
インヒビターの最終濃度は反応当たり0.5−1.0mg/mlで
あった。全ての亜鉛メタロプロテアーゼのインヒビター
である1,10フェナントロリンによる３日目のＷ−14粗ブ
ロースの処理は全てのプロテアーゼ活性の完全な排除を
もたらし、一方、サーモリシン様プロテアーゼ（Weave
r,L.H.,Kester,W.R.,及びMatthews,B.W.1977.J.Mol.Bio
l.114,119−132）のインヒビターであるホスホルアミド
ンによる処理はプロテアーゼ活性の約56％低下をもたら
した。残留タンパク質分解活性を追加のホスホルアミド
ンで更に低下することができなかった。
３日目のＷ−14Photorhabdusブロースのプロテアーゼ
を以下のようにして精製した。アミコンＭ−12濾過装置
に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッ
ジ型S1Y100を使用して、ブロース4.0リットルを濃縮し
た。アミコンＭ−12濾過装置に取り付けられたアミコン
らせん形限外濾過カートリッジ型S1Y100を使用して、サ
イズ100kDa未満の天然タンパク質を有するフロースルー
物質（3.8L）を0.375Lに濃縮した。レテンテート（rete
ntate）物質は10−100kDaのサイズの範囲のタンパク質
を含んでいた。この物質を、10mMのリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.0）中で平衡にされたパーセプチブ・バイオ
システム（Framington,MA）ポロス 50HQ強陰イオン交
換パッキングを詰め込まれたファーマシアHR16/10カラ
ムに装填した。タンパク質を5ml/分の流量でカラムに装
填し、続いてA280＝0.00まで未結合タンパク質を洗浄し
た。その後、40分で０−1.0MのNaClのNaCl勾配を使用し
て7.5ml/分の流量でタンパク質を溶離した。フラクショ
ンを上記のようにしてプロテアーゼ活性について分析
し、活性フラクションをプールした。タンパク質分解活
性フラクションを50％（v/v）の10mMのリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.0）で希釈し、10mMのリン酸ナトリウム
で平衡にされたファーマシアHR10/10モノＱカラムに装
填した。カラムをA280＝0.00まで緩衝液で洗浄した後、
１時間にわたって０−0.5MのNaClのNaCl勾配を使用して
2.0ml/分の流量でタンパク質を溶離した。フラクション
をプロテアーゼ活性について分析した。最大量のホスホ
ルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクショ
ンをプールした（ホスホルアミドン感受性活性は下記の
ように41/38kDaのプロテアーゼのためである）。これら
のフラクションは0.15−0.25MのNaClの範囲で溶離する
ことがわかった。また、優性のホスホルアミドン非感受
性プロテアーゼ活性を含むフラクション、58kDaのプロ
テアーゼをプールした。これらのフラクションは0.25−
0.35MのNaClの範囲で溶離することがわかった。次いで
ホスホルアミドン感受性プロテアーゼフラクションを、
ミリポア・ウルトラフリー −15遠心分離フィルター装
置バイオマックス−5K NMWL膜を使用して0.75mlの最終
容積に濃縮した。この物質を、10mMのリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.0）/0.1MのNaCl中で平衡にされたファーマ
シア・セファデックスＧ−50で詰め込まれたファーマシ
アHR10/30カラムに0.5ml/分の流量で適用した。次いで
最高のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有す
るフラクションをプールし、ミリポア・ウルトラフリー
−15遠心分離フィルター装置バイオマックス−50K NM
WL膜で遠心分離した。上記のタンパク質分解活性分析
は、この物質がホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活
性のみを有することを示した。ホスホルアミドン非感受
性プロテアーゼ、58kDaのタンパク質をプールし、続い
てミリポア・ウルトラフリー −15遠心分離フィルター
装置バイオマックス−50K NMWL膜中で濃縮し、ファーマ
シア・スーパーデックス−75カラムで更に分離した。プ
ロテアーゼを含むフラクションをプールした。
精製された58kDa及び41/38kDaの精製されたプロテア
ーゼの分析は、両方の型のプロテアーゼが1,10フェナン
トロリンで完全に抑制されるが、41/38kDaのプロテアー
ゼのみがホスホルアミドンで抑制されることを明らかに
した。粗ブロースの更なる分析は、１日目のＷ−14ブロ
ースのプロテアーゼ活性が41/38kDaのプロテアーゼのた
めに全プロテアーゼ活性の23％を有し、３日目のＷ−14
ブロースで44％に増大することを示した。
タンパク質純度を試験し、アミノ末端配列を得るため
の通常のSDS−PAGE分析を、インテグレーテッド・セパ
レーション・システムズ（Natick,MA）から購入した４
−20％の勾配ミリプラス・セプラゲルズを使用して行っ
た。アミノ末端配列決定すべきタンパク質を下記の精製
後にPVDF膜にブロットし（プロブロットTM膜；アプライ
ド・バイオシステムズ,Foster City,CA）、0.1％のアミ
ドブラックで視覚化し、切除し、配列決定のためにケン
ブリッジ・プロケム（Cambridge,MA）に送った。
３日経過したＷ−14ブロースからの58kDa（配列番号4
5）及び41/38kDa（配列番号44）のプロテアーゼの演繹
アミノ末端配列は夫々DV−GSEKANEKLK（配列番号45）及
びDSGDDDKVTNTDIHR（配列番号44）であった。
41/38kDaのプロテアーゼの配列決定は幾つかのアミノ
末端を明らかにし、夫々の末端がタンパク質分解により
除去される付加的なアミノ酸を有する。38kDa及び41kDa
のポリペプチドに関する一次配列、二次配列、三次配列
及び四次配列の試験は先に示された配列の演繹を可能に
し、これらの２種のプロテアーゼが相同であることを明
らかにした。
実施例11、パートＡ TcbAペプチドをコードする遺伝子に関する抗体の使用に
よるPhotorhabdusゲノムライブラリーのスクリーニング 上記配列決定と平行して、好適な探査及び配列決定を
TcbAiiペプチド（配列番号１）に基いて行った。上記実
施例１及び２に記載されたようにしてバクテリア培養ブ
ロースを調製し、その毒素を精製することにより、この
配列決定を行った。
ゲノムDNAをグレースの昆虫組織培地中で増殖したPho
torhabdus・luminescens株Ｗ−14から単離した。バクテ
リアを250mlの三角フラスコ中で28℃で250rpmで約24時
間にわたって培地5ml中で増殖した。培地100mlからのバ
クテリア細胞を5000 x gで10分間にわたってペレットに
した。上澄みを捨て、次いで細胞ペレットをゲノムDNA
単離に使用した。
Ausubel（上記文献）の節2.4.3に記載されたCTAB方法
の改良を使用して、ゲノムDNAを単離した。工程６中に
“バクテリアゲノムDNAの大規模CsCl prep"と題する節
に従った。この時点で、付加的なクロロホルム／イソア
ミルアルコール（24:1）抽出を行い、続いてフェノール
／クロロホルム／イソアミル（25:24:1）抽出工程及び
最後のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）抽
出を行った。DNAを0.6容積のイソプロパノールの添加に
より沈殿させた。沈殿したDNAをフッキングし、曲げた
ガラス棒の端部のわまりに巻付け、最終洗浄液としての
70％のエタノールに素早く浸漬し、TE緩衝液3mlに溶解
した。
280/260nmにおける光学密度により推定したDNA濃度は
約2mg/mlであった。
このゲノムDNAを使用して、ライブラリーを調製し
た。
ゲノムDNA約50μｇをSau3A1で部分消化した。次いでN
aCl密度勾配遠心分離を使用して部分消化されたDNAフラ
グメントをサイズ分別した。アガロースゲル電気泳動に
より測定して12kb以上の平均サイズを有するDNAフラグ
メントを含むフラクションをプラスミドBluScript（ス
トラタゲン,La Jolla,california）につなぎ、E.coli D
H5αまたはDHB10株に形質転換した。
別に、そのタンパク質の精製アリコートをタンパク質
に対するモノクローナル抗体の産生についてウィスコン
シン大学（Madison）にあるバイオテクノロジーハイブ
リドーマセンターに送った。送られた物質は65℃で変性
された天然バンド１及び２を含むHLPC精製フラクション
であり、その20μｇを４匹のマウスの夫々に注射した。
未免疫マウスからの脾臓細胞を安定なミエローマ細胞系
と融合した後、安定なモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ細胞系を回収した。モノクローナル抗体をハイブ
リドーマから回収した。
別に、天然アガロースゲル精製バンド１（実施例１を
参照のこと）を採取することによりポリクローナル抗体
を生じ、次いでそのタンパク質を使用してニュージーラ
ンド白ウサギを免疫した。バンドを天然アガロースゲル
から切除し、ゲル片を65℃に素早く加熱してアガロース
を融解し、アジュバントで直ちに乳化することによりタ
ンパク質を調製した。フロイント完全アジュバントを一
次免疫化に使用し、フロイント不完全を１ケ月間隔で３
回の追加の注射に使用した。夫々の注射について、タン
パク質50〜100マイクログラムを含む乳化バンド１約0.2
mlを多皮下注射によりウサギの背中に送出した。最初の
注射の10日後に血清を得、追加の採血を３週間にわたっ
て毎週行った。血清補体を56℃で15分間加熱することに
より不活化し、次いで−20℃で貯蔵した。
次いでモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を
使用して、エピトープにより検出し得る抗原の発現につ
いてゲノムライブラリーをスクリーニングした。陽性ク
ローンをニトロセルロースフィルターコロニーリフトで
検出した。陽性クローンのイムノブロット分析を試み
た。
イムノブロット及びサザン分析の両方により特定され
たクローンの分析はクローンの５種のクラスの暫定的な
分析をもたらした。
クローンの第一クラス中に、ここでTcbAiiと称される
ペプチドをコードする遺伝子があった。この遺伝子の完
全DNA配列（TcbA）を得た。それが配列番号11として示
される。その配列が配列番号１の内部配列をコードする
という確認は、配列番号11の読み取り枠により生じた演
繹アミノ酸配列からアミノ酸番号88にある配列番号１の
存在により実証される。これは配列番号12を参照するこ
とにより確認でき、これは配列番号11により生じた演繹
アミノ酸配列である。
毒素ペプチドの第二クラスはTcaBi、TcaBii及びTcaC
と上記されたセグメントを含む。ポリクローナル抗血清
によるライブラリーのスクリーニング後に、毒素遺伝子
のこの第二クラスを異なるサイズのタンパク質を産生す
る幾つかのクローンにより同定し、これらの全てがイム
ノブロットでポリクローナル抗体と交差反応し、またサ
ザンブロットでDNA相同性を共有することがわかった。
配列比較は、それらが上記TcaB及びTcaCと称される遺伝
子複合体に属することを明らかにした。
また、抗体毒素クローンの三つのその他のクラスをポ
リクローナルスクリーンで単離した。これらのクラスは
ポリクローナル抗体と交差反応するタンパク質を産生
し、またサザンブロッティングにより測定されるように
これらのウラスとDNA相同性を共有した。これらのクラ
スがクラスIII、クラスIV及びクラスＶと称された。ま
た、クラスＩ、II、III、及びIVと交差反応したモノク
ローナルを同定することが可能であった。これは、全て
が高いタンパク質相同性の領域を有することを示唆す
る。こうして、P.luminescens細胞外タンパク質遺伝子
は進化的に関連している遺伝子のファミリーに相当す
る。
この生物中に含まれる毒素ペプチドに進化的に関連す
る変化があり得るという概念を更に押し進めるために、
二つのアプローチを試みて関連タンパク質の存在につい
てP.luminescensのその他の株を試験した。これをゲノ
ムDNAのPCR増幅並びにポリクローナル抗体及び及びモノ
クローナル抗体を使用するイムノブロット分析の両方に
より行った。
結果は、関連タンパク質がP.luminescens株WX−２、W
X−３、WX−４、WX−５、WX−６、WX−７、WX−８、WX
−11、WX−12、WX−15及びＷ−14により産生されること
を示す。
実施例11、パートＢ クラスIII毒素クローン−tccの配列及び分析 更なるDNA配列決定を実施例11、パートＡに記載され
たクラスIII E.coliクローンから単離されたプラスミド
について行った。ヌクレオチド配列はこのゲノム遺伝子
座で三つの近くに結合された読み取り枠であることが示
された。この遺伝子座をtccと称し、三つの読み取り枠
をtccA配列番号56、tccB配列番号58及びtccC配列番号60
と称する（図6B）。
tccA読み取り枠からの演繹アミノ酸は、その遺伝子が
105,459Daのタンパク質をコードすることを示す。この
タンパク質をTccAと称した。このタンパク質の最初の12
アミノ酸は、毒素複合体の一部として先に同定された、
108kDaのタンパク質、配列番号７から得られたＮ末端配
列と適合する。
tccB読み取り枠からの演繹アミノ酸は、この遺伝子が
175,716Daのタンパク質をコードすることを示す。この
タンパク質をTccBと称した。このタンパク質の最初の11
アミノ酸は、185kDaの推定分子量を有するタンパク質、
配列番号８から得られたＮ末端配列と適合する。
tccCの演繹アミノ酸配列は、この読み取り枠が111,69
4DAのタンパク質をコードすることを示し、そのタンパ
ク質産物をTccCと称した。
実施例12 Photorhabdus株の特性決定 本明細書に記載されたコレクションがPhotorhabdus株
を含むことを証明するために、これらの株をPhotorhabd
usの特徴であり、かつそれをその他の腸内細菌科及びキ
セノラブダスspp.（Farmer,J.J.1984.Bergey's Manual
of Systemic Bacte−riology,1巻,510−511頁（Kreig
N.R.及びHolt,J.G.編集）.Williams＆Wilkins,Baltimor
e.;Akhurst及びBoemare,1988,Boemareら,1993）から区
別する認識された微生物学的形質に関して評価した。こ
れらの特徴的な形質は以下のとおりである。グラム染色
陰性ロッド、幅0.5−２μｍ及び長さ２−10μｍの生物
サイズ、赤色／黄色のコロニー着色、結晶性封入体の存
在、カタラーゼの存在、硝酸塩を還元できないこと、生
物発光の存在、成長培地から色素を吸収できること、プ
ロテアーゼ産生について陽性、37℃未満の成長温度範
囲、嫌気性条件下の生存及び積極的な運動（表18）。基
準のエシェリキア・コリ株、キセノラブダス株及びPhot
orhabdus株を比較のために全ての試験に入れた。総合の
結果は、全ての株が腸内細菌科及びPhotorhabdus属の一
部であることと合致する。
ルミノメーターを使用して夫々の株の生物発光を証明
し、発色の定量的かつ相対的測定を得た。相対的な発光
単位の測定について、夫々の株からのブロース（細胞及
び培地）を培養液中の接種後の三つの時間間隔（６、1
2、及び24時間）で測定し、バックグラウンド明度（未
接種の培地及び水）と比較した。種々のブロースからの
発光の測定の前に、シパー（sipper）セルを使用するギ
ルフォード・システムズ（Ob−erlin,OH）スペクトロメ
ーター中で吸光度（560nM）を測定することにより細胞
密度を確かめた。次いで明度を測定する前に適当な希釈
を行った（光学密度を1.0単位に基準化するため）。次
いで希釈したブロースのアリコートをキュベット（夫々
300μｌ）に入れ、バイオ−オービット1251ルミノメー
ター（Bio−Orbit Oy,Twiku,Finland）中で読み取っ
た。夫々のサンプルに関する組込み時間は45秒であっ
た。サンプルを連続的に混合（じゃま板付きキュベット
中で回転させた）し、その間に読み取って酵素利用能を
得た。陽性試験をバックグラウンドルミネセンスの５倍
以上（約５−10単位）であると決めた。加えて、コロニ
ー明度を写真フィルムオーバーレイで検出し、暗室中の
適合後に目視で検出した。夫々の株のグラム染色特性
を、グラム染色コントロールスライド（フィッシャー・
サイエンティフィック,Pitts−burgh,PA）と一緒に使用
した市販のグラム染色キット（BBL,Cockeysville,MD）
で確かめた。次いでザイス顕微鏡（Carl Zeiss,German
y）100Xオイル浸漬対物レンズ（10X接眼倍率及び2X本体
倍率）を使用して顕微鏡評価を行った。生物サイズ、細
胞の記載及び封入体（対数期増殖後の封入体）に関する
個々の株の顕微鏡試験を、オイル浸漬による湿潤取付け
スライド（10X接眼倍率、2X本体倍率及び40X対物倍率）
及びマイクロメーターを含む位相差顕微鏡（Akhurst,R.
J.及びBoemare,N.E.1990.Entomopathogenic Nematodes
in Biological Control（Gaugler,R.及びKaya,H.編
集）.75−90頁.CRC Press,Boca Raton,USA.;Baghdi−gu
ian S.,Boyer−GiglioM.H.,Thaler,J.O.,Bonnot G.,Boe
mare,N.1993.Biol.Cell 79,177−185）を使用して行っ
た。コロニー着色をラベル指示により調製されたバクト
栄養寒天（ジフコ・ラボラトリーズ,Detroit,MI）に接
種後に観察した。インキュベーションが28℃で起こり、
５−７日後に記載を生じた。酵素カタラーゼの存在につ
いて試験するために、試験生物のコロニーを栄養寒天プ
レートから小さいプラグで除去し、ガラス試験管の底部
に入れた。家庭用過酸化水素溶液1mlを管の側面を下に
穏やかに添加した。気泡（推定上、酸素）が直ちにまた
は５秒以内に現れた時に陽性反応を記録した。また、未
接種栄養寒天及び過酸化水素溶液の対照を試験した。硝
酸塩還元について試験するために、夫々の培養物をバク
トニトレートブロース［ジフコ・ラボラトリーズ,Detro
it,MI］10mlに接種した。28℃で24時間のインキュベー
ション後に、亜硝酸塩生成を２滴のスルファニル酸試薬
及び２滴のα−ナフチルアミン試薬の添加により試験し
た（ジフコ・マニアル、第10編、ジフコ・ラボラトリー
ズ,Detroit,MI,1984を参照のこと）。明瞭なピンク色ま
たは赤色の発生が硝酸塩からの亜硝酸塩の生成を示す。
成長培地から色素を吸収する夫々の株の能力を色素ニュ
ートラル・レッドを含むバクト・マッコンキィ寒天；色
素ブロモチモール・ブルーを含むバクト・タージトール
−７寒天及び色素エオシン−Ｙを含むバクトEMB寒天
（ジフコ・ラボラトリーズ,Detroit,MIからの寒天、全
てをラベル指示に従って調製した）で試験した。これら
の培地への接種後に、色素吸収を28℃で５日のインキュ
ベーション後に記録した。これらの後者の培地における
成長が腸内細菌科の員に特徴的である。夫々の株の運動
性を、ラベル指示に従って調製されたバクト運動性試験
培地（ジフコ・ラボラトリーズ,Detroit,MI）の溶液を
使用して試験した。バット−スタブ（butt−stab）接種
を夫々の株を用いて行い、運動性を接種物のラインから
広がる成長の拡散ゾーンにより巨視的に判断した。多く
の場合、運動性をまた湿潤取付けスライドのもとに培養
液から顕微鏡で観察した。夫々の株に関する生化学的栄
養評価を、BBLエンテロチューブII（ベントン、ディキ
ンソン、ドイツ）を使用して行った。インキュベーショ
ンを28℃で５日おこなった以外は製品指示に従った。結
果はPhotorhabdusに関する先の引用論文と一致した。プ
ロテアーゼの産生を、ラベル指示に従ってつくられたバ
クトゼラチン（ジフコ・ラボラトリーズ,Detroit,MI）
プレートを使用してゼラチンの加水分解を観察すること
により試験した。培養物を接種し、プレートを28℃で５
日間インキュベートした。異なる温度における成長を評
価するために、寒天プレート［脱イオン水中２％のバク
ト寒天（ジフコ、Detroit,MI）を含む２％のプロテオー
スペプトン＃３］を接種物の共通の源からストリーキン
グした。プレートをネスコ フィルムでシールし、３週
間までにわたって20℃、28℃及び37℃でインキュベート
した。37℃で成長を示さないプレートは28℃のインキュ
ベーターに１週間移した後に細胞生存度を示さなかっ
た。Photorhabdus株に関する酵素要求を下記の方法で試
験した。液体チオグリコレートブロース培地（ジフコ、
Detroit,MI）へのバット−スタブ接種を行った。管を室
温で１週間インキュベートし、次いで培養物を成長の型
及び程度について試験した。指示薬レサズリンは培地酸
化のレベルまたは好気生活ゾーンを示す（ジフコ・マニ
ュアル、第10編、ジフコ・ラボラトリーズ,Detroit,M
I）。試験したPhotorhabdus株について得られた成長ゾ
ーン結果は条件的嫌気性微生物の結果と一致した。
細胞脂肪酸分析は属レベル及び種レベルでバクテリア
特性決定について認められた手段であり（Tornabene,T.
G.1985.Lipid Analysis and the Relationship to Chem
otaxonomy in Methods in Microbiolgy,18巻,209−21
4.;Goodfellow,M.及びO'Donnell,A.G.1993.Roots of Ba
cterial Systematics in Handbook of New Bacterial S
ystematics（Goodfellow,M.及びO'Donnell,A.G.編集）
３−54頁London:Academic Press Ltd.）（これらの文献
が参考として本明細書に含まれる）、これらを使用して
本発明者らのコレクションが属レベルで関連することを
確かめた。培養物を、微生物ID（MIDI,Newark,DE,USA）
微生物同定系（MIS）を使用する脂肪酸メチルエステル
分析（FAME）のために外部の契約研究所に輸送した。MI
S系は25mm x 0.2mmの５％メチルフェニルシリコーン石
英シリカキャピラリーカラムを備えたヒューレット・パ
ッカードHP5890Aガスクロマトグラフからなる。水素を
キャリヤーガスとして使用し、炎イオン化検出器が自動
サンプラー、インテグレーター及びコンピューターと協
力して機能する。コンピューターはサンプル脂肪酸メチ
ルエステルを微生物脂肪酸ライブラリー及び既知脂肪酸
の較正混合物と比較する。契約研究所により選択された
ように、株を分析の前にトリプチカーゼ大豆寒天で28℃
で24時間増殖した。サンプルの抽出を通常のFAME方法に
従って契約研究所により行った。Photorhabdus以外のlu
minescensバクテリアグループについて株の直接の同定
がなかった。クラスター分析（これは分離物のグループ
の脂肪酸プロフィールを比較する）を行った時、株脂肪
酸プロフィールが属レベルで関連していた。
本発明者らのコレクション中のPhotorhabdus株の進化
上の多様性を、夫々の株からのゲノムDNAを使用してPCR
（ポリメラーゼ連鎖反応）媒介ゲノムフィンガープリン
ティングの分析により測定した。この技術は種々のバク
テリア種のゲノム中に存在する反復DNA配列のファミリ
ーに基いている（Versalovic,J.,Schneider,M.,DE Brui
jn,F.J.及びLupski,J.R.1994.Methods Mol.Cell.Biol.,
5,25−40に概説されている）。これらの三つ、反復遺伝
子外パリンドーム配列（REP）、腸内細菌の反復遺伝子
内コンセンサス（ERIC）及びBOX要素がバクテリアゲノ
ムの編成に重要な役割を果たすものと考えられる。ゲノ
ム編成は選択により成形されるものと考えられ、密接に
関連するバクテリア株のゲノム内のこれらの要素の差別
的な分散がこれらの株を区別するのに使用し得る（例え
ば、Louws,F.J.,Fulbright,D.W.,Stephens,C.T.及びDE
Bruijn,F.J.1994.Appl.Environ.Micro.60,2286−229
5.）。Rep−PCRはこれらの反復配列に相補性のオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用してそれらの間にある可変
サイズのDNAフラグメントを増幅する。得られた産物を
電気泳動により分離して夫々の株についてDNA“フィン
ガープリント”を確立する。
本発明者らの株からゲノムDNAを単離するために、細
胞ペレットをTE緩衝液（10mMのトリス−HCl、1mMのEDT
A、pH8.0）中で最終容積10mlに再度懸濁させ、次いで5M
のNaCl12mlを添加した。この混合物を15,000 x gで20分
間遠心分離した。得られるペレットをTE5.7ml中で再度
懸濁させ、10％のSDS300μｌ及び20mg/mlのプロテイナ
ーゼＫ（ギブコBRLプロダクツ,Grand Island,NY）60μ
ｌを添加した。この混合物を37℃で１時間インキュベー
トし、次いでリゾチーム約10mgを添加し、その混合物を
更に45分間インキュベートした。次いで5MのNaCl 1ml
及びCTAB/NaCl溶液（10％w/vのCTAB、0.7MのNaCl）800
μｌを添加し、その混合物を65℃で10分間にわたって穏
やかに攪拌してインキュベートし、次いで更に20分間に
わたってインキュベートし、攪拌して細胞物質の透明化
を助けた。等容積のクロロホルム／イソアミルアルコー
ル溶液（24:1、v/v）を添加し、穏やかに混合し、次い
で遠心分離した。次いで２回の抽出を等容積のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（50:49:1）
を用いて行った。ゲノムDNAを0.6容積のイソプロパノー
ルで沈殿させた。沈殿したDNAをガラス棒で除去し、70
％のエタノールで２回洗浄し、乾燥させ、STE（10mMの
トリス−HCl、pH8.0、10mMのNaCl、1mMのEDTA）2mlに溶
解した。次いでDNAを260nmにおける光学密度により定量
した。PhotorhabdusゲノムDNAのrep−PCR分析を行うた
めに、下記のプライマーを使用した。REP1R−I;5'−III
ICGICGICATCIGGC−3'及びREP2−I;5'−ICGICTTATCIGGCC
TAC−3'。下記の25μｌの反応液を使用してPCRを行っ
た。7.75μｌのH2O、2.5μｌの10X LA緩衝液（パンベラ
・コーポレーション,Madison,WI）、16μｌのdNTP混合
物（夫々2.5mM）、１μｌの夫々のプライマー（50pM/μ
ｌ）、１μｌのDMSO、1.5μｌのゲノムDNA（0.075−0.4
80μg/μｌの範囲の濃度）及び0.25μｌのタカラEX Taq
（パンベラ・コーポレーション,Madison,WI）。下記を
条件を使用してPCR増幅をパーキン・エルマーDNAサーマ
ル・サイクラー（Norwalk,CT）中で行った。95℃/7分、
次いで94℃/1分、44℃/1分、65℃/8分、続いて65℃で15
分の35サイクル。サイクル後に、反応液25μｌを6Xゲル
装填緩衝液（H2O中0.25％のブロモフェノールブルー、4
0％w/vの蔗糖）５μｌに添加した。次いで15x20cmの１
％アガロースゲルを、夫々の反応液８μｌを使用してTB
E緩衝液（0.09Mのトリス−ボレート、0.002MのEDTA）中
で実験した。ゲルを45vで約16時間実験した。次いでゲ
ルを20μg/mlの臭化エチジウム中で１時間にわたって染
色し、TBE緩衝液中で約３時間にわたって脱色した。次
いでゲルのポラロイド 写真をUV照射下で撮影した。
夫々の株に関する特定サイズのバンドの存在または不
在を写真からスコアに付け、数値分類学ソフトウェアプ
ログラム、NTSYS−pc（エクセター・ソフトウェア、Set
auket,NY）に類似性マトリックスとして入力した。同時
に評価したE.coli株HB101及びキサントモナス・オリザ
エpv.オリザエ（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）の対
照は公表された論文（Versalovic,J.,Koeuth.T.及びLup
ski,J.R.1991.Nucleic Acids Res.19,6823−6831;Vera
Cruz,C.M.,Halda−Alija,L.,Louws,F.,Skinner,D.Z.,Ge
orge,M.L.,Nelson,R.J.,DE Bruijn,F.J.,Rice,C.及びLe
ach,J.E.1995.Int.Rice Res.Notes,20,23−24;Vera Cru
z,C.M.,Ardales,E.Y.,Skinner,D.Z.,Talag,J.,Nelson,
R.J.,Louws,F.J.,Leung,H.,Mew,T.W.及びLeach,J.E.199
6.Phytopathology（夫々、印刷中）に一致するPCR“フ
ィンガープリント”を生じた。次いでPhotorhabdus株か
らのデータをNTSYS−ps内の一連のプログラム;SIMQUAL
（定性データに関する類似性）で分析して類似性係数
（ジャカード係数を使用する）及びSAHN（連続の凝集性
のヘアアーチカル（Heirarchical）かつ巣状（Neste
d））クラスタリング［UPGMA（算術平均による未計量の
ペア−グループ方法）方法を使用する］のマトリックス
（これは関連株をグルーピングし、フェノグラム（図
５）として表し得る）を生じた。COPH（コフェネチック
（cophenetic）値）プログラム及びMXCOMP（マトリック
ス比較）プログラムを使用してコフェネチック値マトリ
ックスを生じ、これとクラスタリングが基いている初期
のマトリックスの間の相関関係を比較した。得られる基
準化マンテル統計値（ｒ）を生じ、これはクラスター分
析の適合度の目安である（ｒ＝0.8−0.9は非常に良好な
適合を表す）。本発明者らの場合、ｒは0.919である。
それ故、本発明者らのコレクションはPhotorhabdus属の
代表的な容易に区別できる株の多様なグループを含む。
実施例13 種々のPhotorhabdus株により産生された一種以上の毒素
の殺虫剤実用性 種々のPhotorhabdus株の初期の“種子”培養物を、２
％のプロテオースペプトン＃３（PPS）（ジフコラボラ
トリーズ、Detroit,MI）液体培地175mlにカプット（Kap
ut）で覆われたデロング（Delong）口を有する三つのじ
ゃま板付きフラスコ500ml中で一次変異体サブクローン
を接種することにより生じた。夫々の種子培養の接種物
はオイル−オーバーレイ寒天スラント培養物またはプレ
ート培養物に由来した。接種後に、これらのフラスコを
ロータリー・シェーカーで16時間にわたって28℃で150r
pmでインキュベートした。次いでこれらの種子培養物を
夫々の株の所定の醗酵のための一様な接種源として使用
した。更に、後対数期の種子培養物を無菌鉱油でオーバ
ーレイし、将来の再懸濁のために無菌マグネチック攪拌
棒を加え、培養物を暗所で室温で貯蔵して、毒素応答状
態で接種物の長期保存を得た。生産ブロースを、新しい
２％のPP3培地に１％の活発に成長している種子培養物
（例えば、新しい培地175ml当たり1.75ml）を添加する
ことにより接種した。ブロースの生産は500mlの三つの
じゃま板付きフラスコ（上記を参照のこと）、またはシ
リコンフォームクロージャーで覆われた2800mlのじゃま
板付き凸形底部のフラスコ（体積500ml）中で起こっ
た。生産フラスコを上記条件下で24〜48時間インキュベ
ートした。インキュベーション後に、ブロースを無菌の
1Lのポリエチレンびんに分配し、10℃で１時間にたって
2600 x gで回転させ、細胞及びデブリペレットからデカ
ントした。次いで液体ブロースをワッマンGF/D（2.7μ
Ｍ保持）及びGF/B（1.0μＭ保持）ガラスフィルターに
より真空濾過してデブリを除去した。更なるブロース浄
化を、0.5μＭのオープン−チャンネルフィルターを使
用して接線方向の流れの微量濾過装置（ポール・フィル
トロン、Northborough,MA）で得た。必要な場合、付加
的な浄化を、ブロースを（４℃に）冷却し、数時間にわ
たって2600 x gで遠心分離することにより得ることがで
きた。これらの操作後に、0.2μＭのニトロセルロース
膜フィルターを使用してブロースをフィルター滅菌し
た。次いで無菌ブロースを生物学的アッセイ、生化学的
分析に直接使用し、または10,000MWカット−オフのM12
限外濾過装置（アミコン,Beverly MA）または10,000MW
細孔サイズを有する遠心分離濃縮機（ミリポア,Bedfor
d,MA及びポール・フィルトロン、Northborough,MA）を
使用して濃縮した。遠心分離濃縮機の場合、ブロースを
約２時間にわたって2000 x gで回転させた。10,000MWの
透過物を相当する保持物に添加して10,000MWより大きい
成分の所望の濃縮を得た。処理されたブロースサンプル
の熱不活化を、サンプルを10分間にわたって砂充填加熱
ブロック中で100℃で加熱することにより得た。
異なるPhotorhabdus株からの一種以上のブロース及び
一種以上の毒素複合体は昆虫の集団を減少するのに有益
であり、昆虫の遺伝子座に有効な昆虫不活化量の活性な
記載された物質を適用することを含む昆虫集団の抑制方
法に使用された。上記のようにして醗酵されたPhotorha
bdus株の選択されたグループのブロースから観察された
殺虫活性の幅の実証が表19に示される。付加的な殺虫活
性はブロースの増大された濃度により、または異なる醗
酵方法を使用することによりこれらの株で検出し得るこ
とが可能である。タンパク質と関連する活性と一致し
て、試験した全ての株の殺虫活性は熱不安定であった
（上記を参照のこと）。
種々のPhotorhabdus株からの一種以上の培養ブロース
は幾つかの昆虫に対し異なる殺虫活性（死亡率及び／ま
たは成長抑制、減少された成体発生）を示す。更に詳し
くは、その活性はコーン・ルートワーム（corn rootwor
m）幼虫及びボール・ウィービル（boll weevil）幼虫
（これらは昆虫目コレオプテラ（Coleoptera）の員であ
る）に対して見られる。コレオプテラのその他の員とし
て、コメツキムシ幼虫、花粉カブトムシ、ノミハムシ、
種子カブトムシ及びコロラド・ジャガイモカブトムシが
挙げられる。また、活性がアスター・リーフホッパー
（aster leafhopper）及びコーン・プラント・ホッパー
（corn plant hopper）に対し観察され、これらはホモ
プテラ（Homoptera）目の員である。ホモプテラのその
他の員として、プラントホッパー（planthopper）、ピ
ア・プシラ（pear psylla）、アップル・サッカー（app
le sucker）、カイガラムシ、コナジラミ、スピトル・
バッグ（spittle bugs）並びに多数の宿主特異性アリマ
キ種が挙げられる。また、ブロース及び一種以上の精製
毒素複合体はタバコ・バッドワーム（budworm）、タバ
コ・ホーンワーム（hornworm）及びヨーロピアン・コー
ン・ボラー（European corn borer）（これらはレピド
プテラ（Lepidoptera）目の員である）に対し活性であ
る。この目のその他の典型的な員はビート・アーミィワ
ーム（beet armyworm）、キャベツルーパー（cabbage l
ooper）、ブラック・カットワーム（black cutworm）、
コーンイアーワーム（corn earworm）、コドリング・モ
ス（codling moth）、イガ、インディアン・ミールモス
（Indian mealmoth）、ハマキムシ、アオムシ、コット
ン・ボールワーム（cotton bollworm）、ミノムシ、イ
ースタン・テント・キャタピラー（Eastern tent cater
pillar）、ソッド・ウェブワーム（sod webworm）及び
フォール・アーミィワーム（fall armyworm）である。
また、活性がミバエ幼虫及び蚊幼虫（これらはジプテラ
（Diptera）目の員である）に対して見られる。ジプテ
ラ目のその他の員はピー・ミッジ（pea midge）、カラ
ット・フライ（carrot fly）、キャベツ・ルート・フラ
イ（cabbage root fly）、カブ・ルート・フライ（turn
ipr−oot fly）、タマネギ・フライ（onion fly）、ガ
ガンボ及びイエバエ並びに種々の蚊種である。また、一
種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体による活性
が２斑点クモダニに対して見られ、これはアカリナ（Ac
arina）目の一員であり、これはストロベリークモダ
ニ、ブロードマイト（broad mites）、シトラス・レッ
ド・マイト（Citrus red mite）、ヨーロピアン・レッ
ド・マイト（European red mite）、ピアー・ラスト・
マイト（pear rust mite）及びトマト・ラセット・マイ
ト（tomato russet mite）を含む。
コーン・ルートワーム幼虫に対する活性を以下のよう
にして試験した。一種以上のPhotorhabdus培養ブロース
（０−15倍に濃縮、フィルター滅菌）、２％のプロテオ
ースペプトン＃３、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg
/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を40
μｌのアリコート中の人工食（Rose,R.I.及びMcCabe,J.
M.（1973）.J.Econ.Entomol.66,（398−400））の表面
（約1.5cm2）に直接適用した。毒素複合体を10mMのリン
酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中で希釈した。食事プレー
トを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、ウェルに表
面滅菌卵から孵化されたた単一の新生子ジアブロチカ・
ウンデシムプンクタタ・ホワルジ（Diabrotica undecim
punctata howardi）（サザン・コーン・ルートワーム
（Southern corn rootworm,SCR））を発生させた。プレ
ートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期
間（３〜５日）にわたって27℃に保った。次いで死亡率
及び幼虫重量測定をスコアにつけた。一般に、処理当た
り16匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は一
般に５％未満であった。
ボール・ウィービル（アントモナス・グランジス（An
thomonas grandis）に対する活性を以下のようにして試
験した。濃縮（１〜10倍）Photorhabdusブロース、対照
培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の
精製毒素複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナト
リウム緩衝液、pH7.0を60μｌのアリコート中で人工食
（ストーンビル・イエロー・レピドプテラン（Stonevil
le Yellow lepidopteran）食）0.35gの表面に適用し、
乾燥させた。単一の12〜24時間のボール・ウィービル幼
虫を食事に入れ、ウェルをシールし、25℃で50％RHで５
日間保った。次いで死亡率及び幼虫重量を評価した。対
照死亡率は０〜13％の範囲であった。
蚊幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。そ
のアッセイを96ウェル・ミクロタイタプレート中で行っ
た。夫々のウェルは200μｌの水溶液（10倍濃縮した一
種以上のPhotorhabdus培養ブロース、対照培地（２％の
プロテオースペプトン＃３）、10mMのリン酸ナトリウム
緩衝液、一種以上の毒素複合体0.23mg/mlまたはH2O）及
び約20匹の生後１日の幼虫（アエデス・アエギプチ（Ae
des aegypti））を含んでいた。処理当たり６のウェル
があった。結果を発生後３〜４日に読み取った。対照死
亡率は０〜20％であった。
ミバエに対する活性を以下のようにして試験した。50
％の乾燥培地及び50％の水、対照培地（２％のプロテオ
ースペプトン＃３）、10倍に濃縮した一種以上のPhotor
habdus培養ブロース、一種以上の精製毒素複合体［0.23
mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を
使用して、購入したドロソフィラ・メラノガスター（Dr
osophila melanogaster）培地を調製した。乾燥培地4.0
mlを処理当たり３個の育成バイアルの夫々に入れ、適当
な液体4.0mlを添加することによりこれを行った。次い
で10匹の後期虫齢のドロソフィラ・メラノガスターうじ
を夫々25mlのバイアルに加えた。バイアルを蛍光天井ラ
イトのもとに室温で実験ベンチで保持した。さなぎまた
は成体カウントを露出の15日後に行った。成体発生を水
及び対照培地と比較した（０〜16％の減少）。
アスター・リーフホッパー成体（マクロステルス・セ
ベリニ（Macrosteles severini））及びコーン・プラン
トホッパー若虫（ペレグリヌス・マイジス（Peregrinus
maidis））に対する活性を、その他の外部接触なしに
活性物質の摂取を可能にするように設計した摂取アッセ
イで試験した。活性物質／“食物”溶液の溜を35X10mm
のペトリ皿の底部の中央に２つの孔をつくることにより
つくる。２インチのパラフィルムＭ 正方形を皿の上部
を横切って置き、“Q"リングで固定する。次いで１オン
スのプラスチックカップに約７匹のホッパーを発生さ
せ、溜をカップの上にパラフィルムを下にして置く。次
いで試験液を孔を通って溜に添加する。10倍濃縮した一
種以上のPhotorhabdus培養ブロースを使用する試験にお
いて、ブロース及び対照培地（２％のプロテオースペプ
トン＃３）を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に
対して透析し、蔗糖（５％まで）を得られる溶液に添加
して対照死亡率を低下した。また、一種以上の精製毒素
複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩
衝液、pH7.0を試験した。死亡率を３日目に報告する。
アッセイを16/8光期間で28℃、70％RHでインキュベータ
ー中に保った。アッセイを72時間で死亡率について等級
付けした。対照死亡率は６％未満であった。
レピドプラテン幼虫に対する活性を以下のようにして
試験した。一種以上の濃縮（10倍）Photorhabdus培養ブ
ロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃
３）、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg/ml］または1
0mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を40μｌのアリコ
ート中で通常の人工レピドプテラン食（ストーンビル・
イエロー食）の表面（約1.5cm2）に直接適用した。食物
プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、単一
の新生子幼虫を発生させた。ヨーロピアン・コーン・ボ
ラー（オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilali
s））及びタバコ・ホーンワーム（マンジュカ・セクス
タ（Manduca sexta））を市販源から入手し、ハウス内
で孵化し、一方、タバコ・バッドワーム（ヘリオジス・
ビレセンス（Heliothis virescens））幼虫を内部で供
給した。幼虫を発生させた後、食物プレートをシール
し、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間にわたって
27℃で暗所に保った。死亡率及び体重測定を５日目にス
コアにつけた。一般に、処理当たり16匹の昆虫を全ての
研究に使用した。対照死亡率は対照培地について一般に
４〜12.5％の範囲であり、リン酸緩衝液について10％未
満であった。
２斑点クモダニ（テトラニカス・ウルチカエ（Tetran
ychus urticae））に対する活性を以下のようにして試
験した。若いカボチャ植物を単一子葉にトリミングし、
一種以上の10倍濃縮ブロース、対照培地（２％のプロテ
オースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［0.
23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0
で噴霧して流下させた。乾燥後、植物にクモダニの混合
集団を発生させ、72時間にわたって実験温度及び湿度に
保った。次いで生存ダニをカウントして防除のレベルを
測定した。
実施例14 非Ｗ−14Photorhabdus株： 精製、特性決定及び活性スペクトル 精製 以下のプロトコルはＷ−14の精製について開発された
ものと同様であり、バイオアッセイ（実施例13を参照の
こと）で測定してサザン・コール・ルートワーム（SC
R）に対し最も活性を有するフラクションを精製するこ
とに基いて確立された。典型的には、実施例13に記載さ
れたようにして濾過されたブロース４〜20Lを受け取
り、アミコンＭ−12濾過装置に取り付けられたアミコン
らせん形限外濾過カートリッジ型S1Y100を使用して濃縮
した。保持物は100kDaより大きい分子サイズからなる天
然タンパク質を含み、一方、フロースルー物質は100kDa
未満のサイズの天然タンパク質を含んでいた。SCRに対
する活性の大半が100kDa保持物中に含まれていた。次い
で保持物を、濾液がA280〈0.100に達するまで10mMのリ
ン酸ナトリウム（pH＝7.0）で連続的に透析濾過した。
特にことわらない限り、この時点からの全ての操作を10
mMのリン酸ナトリウム（pH7.0）で特定されるような緩
衝液中で行った。次いで保持物を約0.20Lの最終容積ま
で濃縮し、0.45mmのナルゲンTMフィルムウェア無菌濾過
ユニットを使用して濾過した。濾過された物質をパーセ
プチブ・バイオシステム・スプリント HPLC系を使用し
て緩衝液中で平衡にされたパーセプチブ・バイオシステ
ム・ポロス 50HQ強陰イオン交換マトリックスで詰め込
まれたファーマシアHR16/10カラムに7.5ml/分で装填し
た。装填後、A280〈0.100に達するまでカラムを緩衝液
で洗浄した。次いでタンパク質を50mlの全容積について
20分間にわたって0.4MのNaClを含む緩衝液を使用して2.
5ml/分でカラムから溶離した。1.0MのNaClを含む緩衝液
を使用してカラムを同流量で更に20分間にわたって洗浄
した（最終容積＝50ml）。0.4M及び1.0MのNaClで溶離し
たタンパク質を別々の透析バッグ（スペクトラ／ポー
膜MWCO:2,000）に入れ、12Lの緩衝液中で４℃で一夜透
析した。SCRに対する活性の大半が0.4Mのフラクション
中に含まれていた。0.4Mのフラクションを、0.75ml/分
の流量を使用してセファロースCL4B（ファーマシア）で
予め詰め込まれたファーマシアXK 26/100カラムへの20m
lの適用により更に精製した。フラクションをA280ピー
クプロフィールに基いてプールし、ミリポア・ウルトラ
フリー 15遠心分離フィルター装置バイオマックス−50
K NMWL膜を使用して0.75mlの最終容積まで濃縮した。標
準物質としてウシγグロブリンを用いるバイオラド・タ
ンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測
定した。
特性決定 SCR毒素複合体の天然分子量を、緩衝液中でセファロ
ースCL4Bで予め詰め込まれたファーマシアHR 16/50を使
用して測定した。次いで既知分子サイズのタンパク質を
使用してカラムを較正し、それにより毒素のおよその天
然分子サイズの計算を可能にした。表20に示されるよう
に、毒素複合体の分子サイズは株Hbで777kDaから株WX−
14で1,900kDaまでの範囲であった。また、毒素複合体の
収率は0.8mg/Lを産生する株WX−12から7.0mg/Lを産生す
る株Hbまで変化した。
毒素複合体に見られるタンパク質を、SDS−PAGE分析
を使用して個々のポリペプチドサイズについて試験し
た。典型的には、夫々の株からの毒素複合体のタンパク
質20mgを２〜15％のポリアクリルアミドゲル（インテグ
レーテッド・セパレーション・システムズ）に装填し、
バイオラドSDS−PAGE緩衝液中で20mAで電気泳動にかけ
た。電気泳動の完結後に、ゲルをバイオラド・クーマシ
ーブルーＲ−250（メタノール：酢酸：水;40:10:40v/v/
v）中0.2％）中で一夜染色した。続いて、ゲルをメタノ
ール：酢酸：水;40:10:40（v/v/v）中で脱色した。次い
でゲルを15分間にわたって水ですすぎ、モレキュラー・
ダイナミクス・パーソナル・レーザー・デンシトメータ
ー を使用してスキャンした。レーンを定量し、分子サ
イズをバイオラド高分子量標準物質と比較して計算し、
これは200−45kDaの範囲であった。
夫々の株からのSCR毒素複合体を含む個々のポリペプ
チドのサイズを表21にリストする。個々のポリペプチド
のサイズは株WX−１で230kDaから株WX−７で見られるよ
うな16kDaのサイズまでの範囲であった。株Hbを除く夫
々の株は160−230kDa範囲、100−160kDa範囲、及び50−
80kDa範囲である毒素複合体を含むポリペプチドを有し
ていた。これらのデータは、毒素複合体が株によりペプ
チド組成及び成分を変化し得るが、全ての場合に毒素特
性が大きいオリゴマータンパク質複合体からなることが
明らかであることを示す。
活性スペクトル 表21に示されるように、株Hm及びH9から精製された毒
素複合体を種々の昆虫に対する活性について試験し、株
Ｗ−14からの毒素複合体は比較のためであった。アッセ
イを実施例13に記載されたようにして行った。全ての３
種の株からの毒素複合体はタバコ・バッドワーム、ヨー
ロピアン・コーン・ボラー、サザン・コーン・ルートワ
ーム、及びアスター・リーフホッパーに対し活性を示し
た。更に、株Hm及びＷ−14からの毒素複合体がまた２斑
点クモダニに対し活性を示した。加えて、Ｗ−14からの
毒素複合体が蚊幼虫に対し活性を示した。これらのデー
タは、毒素複合体が、昆虫の或る種の目の間に活性の類
似性を有するとともに、昆虫のその他の目に対し異なる
活性を示し得ることを示す。
実施例15 Photorhabdusタンパク質毒素複合体のサブ−フラクショ
ン Photorhabdusタンパク質毒素複合体を実施例14に記載
されたようにして単離した。次に、毒素約10mgを1ml/分
の流量で20mMのトリス−HCl、pH7.0で平衡にされたモノ
Q5/5カラムに適用した。280nmにおける光学密度が基準
線吸光度に戻るまで、カラムを20mMのトリス−HCl、pH
7.0で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を1ml/分
で30分間にわたって20mMのトリス−HCl、pH7.0中０〜1.
0MのNaClの線形勾配で溶離した。フラクション1mlを集
め、サザン・コール・ルートワーム（SCR）バイオアッ
セイ（実施例13を参照のこと）にかけた。活性のピーク
をSCRバイオアッセイで夫々のフラクションの一連の希
釈液により測定した。SCRに対する二つの活性ピークを
観察し、Ａ（約0.2〜0.3MのNaClで溶離した）及びＢ
（0.3〜0.4MのNaClで溶離した）と称した。活性ピーク
Ａ及びＢを別々にプールし、下記の３工程操作を使用し
て両方のピークを更に精製した。
固体（NH4）2SO4を上記タンパク質フラクションに1.7
Mの最終濃度まで添加した。次いでタンパク質を1ml/分
で50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7中1.7Mの（NH4）2S
O4で平衡にされたフェニル−スペロース5/5カラムに適
用した。カラムに結合したタンパク質を0.5ml/分で1.7M
の（NH4）2SO4、０％のエチレングリコール、50mMのリ
ン酸カリウム、pH7.0〜25％のエチレングリコール、25m
Mのリン酸カリウム、pH7.0（（NH4）2SO4なし）の線形
勾配で溶離した。フラクションを10mMのリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.0に対し一夜透析した。SCRに対する夫々
のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定し
た。
最高の活性を有するフラクションをプールし、1ml/分
で20mMのトリス−HCl、pH7.0で平衡にされたモノQ5/5カ
ラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を20mMの
トリス−HCl、pH7.0中０〜1MのNaClの線形勾配により1m
l/分で溶離した。
精製の最終工程について、上記の最も活性なフラクシ
ョン（SCRバイオアッセイにより測定した）をプール
し、第二のフェニル−スペロース5/5カラムにかけた。
固体（NH4）2SO4を1.7Mの最終濃度まで添加した。次い
でその溶液を1ml/分で50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH
7中1.7Mの（NH4）2SO4で平衡にされたそのカラムに装填
した。カラムに結合したタンパク質を1.7Mの（NH4）2SO
4、50mMのリン酸カリウム、pH7.0〜10mMのリン酸カリウ
ム、pH7.0の線形勾配で0.5ml/分で溶離した。フラクシ
ョンを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に対し一
夜透析した。SCRに対する夫々のフラクション中の活性
をバイオアッセイにより測定した。
ピークＡからの上記の３工程操作による最終精製タン
パク質を毒素Ａと称し、ピークＢからの最終精製タンパ
ク質を毒素Ｂと称した。
毒素Ａ及び毒素Ｂの特性決定及びアミノ酸配列決定 SDS−PAGE中に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は２種の主
要（全クーマシー染色タンパク質の90％より大）ペプチ
ド:192kDa（夫々A1及びB1と称する）及び58kDa（夫々A2
及びB2と称する）を含んでいた。毒素Ａ及び毒素Ｂの両
方は天然PAGE中に唯一の主要バンドを明らかにし、A1及
びA2が一種のタンパク質複合体のサブユニットであり、
かつB1及びB2が一種のタンパク質複合体のサブユニット
であることを示した。更に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方の
天然分子量はゲル濾過クロマトグラフィーにより860kDa
であることが測定された。A1対A2の相対モル濃度はSDS
−PAGEゲルのデンシトメトリー分析により測定して１対
１の当量であると判断された。同様に、B1ペプチド及び
B2ペプチドは同じモル濃度で存在した。
毒素Ａ及び毒素Ｂを10％のSDS−PAGE中で電気泳動に
かけ、PVDF膜にトランスブロットした。ブロットを夫々
ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムに
アミノ酸分析及びＮ末端アミノ酸配列決定のために送っ
た。B1のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１、tcbA遺伝子
のTcbAii領域（配列番号12、位置87−99）と同一である
ことが決定された。特異なＮ末端配列をペプチドB2につ
いて得た（配列番号40）。ペプチドB2のＮ末端アミノ酸
配列はtcbA遺伝子の誘導アミノ酸配列のTcbAiii領域
（配列番号12、位置1935−1945）と同一であった。それ
故、Ｂ毒素は主として２種のペプチド、TcbAii及びTcbA
iiiを含み、これらが同じ遺伝子産物、TcbAから誘導さ
れることが観察された。
A2のＮ末端配列（配列番号41）はTcbAiiiペプチド及
びその他のペプチドと比較して特異であった。A2ペプチ
ドをTcdAiiiと称した（実施例17を参照のこと）。配列
番号６はアミノ酸配列配列番号40及び配列番号41の混合
物であることが決定された。
更に、ペプチドA1及びA2を内部アミノ酸配列決定にか
けた。内部アミノ酸配列決定について、毒素A10μｇを1
0％のSDS−PAGE中で電気泳動にかけ、PVDF膜にトランス
ブロットした。ブロットをアミドブラックで染色した
後、夫々TcdAii及びTczdAiiiと称されるペプチドA1及び
A2をブロットから切除し、ハーバード・ミクロケム及び
ケンブリッジ・プロケムに送った。ペプチドをトリプシ
ン消化、続いてHPLCクロマトグラフィーにかけて個々の
ペプチドを分離した。Ｎ末端アミノ酸分析を選択された
トリプシンペプチドフラグメントについて行った。ペプ
チドA1の二つの内部アミノ酸配列（TcdAii−PK71、配列
番号38及びTcdAii−PK44、配列番号39）はtcbA遺伝子の
TcbAii領域の演繹アミノ酸配列（配列番号12）と有意な
相同性を有することがわかった。同様に、ペプチドA2の
Ｎ末端配列（配列番号41）及び二つの内部配列（TcdA
iii−PK57、配列番号42及びTcdAiii−PK20、配列番号4
3）はまたtcbA遺伝子のTcbAiii領域の演繹アミノ酸配列
（配列番号12）と有意な相同性を示した。
上記結果を要約すると、毒素複合体はSCRに対し少な
くとも二つの活性タンパク質毒素複合体、毒素Ａ及び毒
素Ｂを有する。毒素Ａ及び毒素Ｂはそれらの天然分子量
及びサブユニット分子量が同様であるが、それらのペプ
チド組成が異なる。毒素Ａは主要ペプチドとしてTcdAii
及びTcdAiiiを含み、また毒素Ｂは主要ペプチドとしてT
cbAii及びTcbAiiiを含む。
実施例16 TcbAペプチドの開裂及び活性化 毒素Ｂ複合体において、ペプチドTcbAii及びTcbAiii
は単一遺伝子産物TcbAに由来する（実施例15）。TcbAペ
プチドからTcbAii及びTcbAiiiへのプロセシングはおそ
らく一種以上のPhotorhabdusプロテアーゼ、そしておそ
らく実施例10に記載されたメタロプロテアーゼの作用に
よるものである。或る場合には、PhotorhabdusW−14ブ
ロースをプロセシングした時、TcbAペプチドが、ペプチ
ドTcbAii及びTcbAiiiに加えて主要成分として毒素Ｂ複
合体中に存在することが注目された。毒素Ｂ複合体の精
製について記載された（実施例15）のと同じ操作を使用
してＷ−14ブロースの毒素複合体フラクションからペプ
チドTcbAを濃縮した。最終精製物質を４−20％の勾配の
SDS−PAGE中で分析し、主要ペプチドをデンシトメトリ
ーにより定量した。TcbA、TcbAii及びTcbAiiiは全タン
パク質の夫々58％、36％、及び６％を構成することが測
定された。これらのペプチドの同定をSDS−PAGE及びモ
ノ特異性抗体を使用するウェスタンブロット分析でそれ
らの夫々の分子サイズにより確認した。このフラクショ
ンの天然分子量を測定したところ、860kDaであった。
上記精製物質を精製された38kDa及び58kDaのＷ−14Ph
otorhabdusメタロプロテアーゼ（実施例10）、及び対照
酵素としてのトリプシン（シグマ,MO）で処理すること
により、TcbAの開裂を評価した。標準反応液は100μｌ
の合計容積中に上記精製フラクション17.5μｇ、1.5単
位のプロテアーゼ、及び0.1Mのトリス緩衝液、pH8.0か
らなっていた。対照反応について、プロテアーゼを省い
た。その反応混合物を37℃で90分間インキュベートし
た。反応の終了時に、20μｌを採取し、４−20％の勾配
SDS−PAGE中の電気泳動分析のために直ちにSDS−PAGEサ
ンプル緩衝液とともに沸騰させた。SDS−PAGEから38kDa
及び58kDaのプロテアーゼ処理の両方において、ペプチ
ドTcbAii及びTcbAiiiの量が約３倍増加し、一方、TcbA
ペプチドの量が比例して減少したことが測定された（表
23）。選択されたペプチドの相対減少及び増強をウェス
タンブロット分析により確かめた。更に、開裂された物
質のゲル濾過は、複合体の天然分子量が同じままであっ
たことを明らかにした。トリプシン処理後に、ペプチド
TcbA及びTcbAiiを小さいペプチドに非特異的に消化し
た。これは、38kDa及び58kDaのPhotorhabdusプロテアー
ゼがペプチドTcbAをペプチドTcbAii及びTcbAiiiに特異
的にプロセシングし得ることを示した。残りの80μｌの
反応混合物のプロテアーゼ処理対照及び未処理対照を10
mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で連続希釈し、SCR
バイオアッセイにより分析した。幾つかの希釈液中の活
性を比較することにより、38kDaのプロテアーゼ処理はS
CR殺虫活性を約３〜４倍に増加することが測定された。
プロテアーゼ処理における残存昆虫の成長抑制はまた対
照よりも苛酷であった（表23）。
実施例17 TcdAiiペプチドをコードする遺伝子のライブラリーのス
クリーニング 配列番号17（内部ペプチドTcdAii−PT111N末端配列）
及び配列番号18（内部ペプチドTcdAii−PT79 N末端配
列）として記載されたTcdAiiペプチドをコードする遺伝
子のクローニング及び特性決定を完結した。配列番号17
（表24）及び配列番号18（表25）のアミノ酸配列並びに
これらの配列の逆補体をコードするするように設計され
た縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８に
記載されたようにして合成した。オリゴヌクレオチドの
DNA配列を以下に示す。
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フ
ォワードプライマーとしてP2.3.6.CBまたはP2.3.5.を使
用し、リバースプライマーとしてP2.79.R.1またはP2.79
R.CBを使用し、鋳型としてPhotorhabdusW−14ゲノムDNA
を使用して、実質的に実施例８に記載されたようにして
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。反応の別の組
において、全てのフォワード／リバース組み合わせにお
いて、プライマーP2.79.2またはP2.79.3をフォワードプ
ライマーとして使用し、またP2.3.5R、P2.3.5RI、及びP
2.3R.CBをリバースプライマーとして使用した。リバー
スプライマーとしてのP2.79.R.1またはP2.79R.CBと組み
合わせたフォワードプライマーとしてのP2.3.6.CBを含
む反応のみにおいて、2500塩基対の推定サイズ（アガロ
ースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られ
た。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序
は、ペプチドフラグメントTcdAii−PT111がペプチドフ
ラグメントTcdAii−PT79にアミノ近位にあることを示
す。
2500bp PCR産物を供給業者の指示に従ってプラスミド
ベクターpCRTMII（インビトロゲン,San Diego,CA）につ
なぎ、２種の分離物（HS24及びHS27）のインサートフラ
グメントの末端を横切るDNA配列を、供給業者の推奨し
たプライマー及び前記配列決定方法を使用して測定し
た。両方の単離物の配列は同じであった。新規プライマ
ーを決定された配列に基いて合成し、付加的な配列決定
反応を開始するのに使用してインサート［配列番号36］
の合計2557塩基を得た。配列番号36によりコードされた
部分ペプチドの翻訳が配列番号37として開示された845
アミノ酸配列を生じる。TcdAiiペプチドフラグメントの
この部分のタンパク質相同性分析はタンパク質TcbA［配
列番号12］の残基542−1390に対する実質的なアミノ酸
相同性（68％の類似性;53％の同一性）を明らかにす
る。それ故、配列番号36により一部表される遺伝子が同
様のタンパク質を産生するが、TcbAと同一のアミノ酸配
列を産生しないことが明らかであり、それはおそらくTc
bAタンパク質と同様であるが、同一ではない生物活性を
有する。
更に別の場合、配列番号９（内部ペプチドTcdAii−PK
44配列）、及び配列番号41（TcdAiii58kDaN末端ペプチ
ド配列）として記載されたペプチドTcdAii−PK44及びTc
dAiii58kDaN末端ペプチドをコードする遺伝子を単離し
た。配列番号39（表27）及び配列番号41（表26）、並び
にこれらの配列の逆補体をコードするように設計された
縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８、及
びそれらのDNA配列に記載されたようにして合成した。
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フ
ォワードプライマーとしてA1.44.1またはA1.44.2を使用
し、リバースプライマーA2.3RまたはA2.4Rを使用し、鋳
型としてPhotorhabdusW−14ゲノムDNAを使用して、実質
的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）を行った。反応の別の組において、全ての
フォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマー
A2.1またはA2.2をフォワードプライマーとして使用し、
またA1.44.1R及びA1.44.2Rをリバースプライマーとして
使用した。リバースプライマーとしてのA2.3Rと組み合
わせたフォワードプライマーとしてのA1.44.1またはA1.
44.2を含む反応のみにおいて、1400塩基対の推定サイズ
（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が
見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマー
の順序は、ペプチドフラグメントTcdAii−PK44がTcdA
iiiの58kDaペプチドフラグメントにアミノ近位にあるこ
とを示す。
1400bp PCR産物を供給業者の指示に従ってプラスミド
ベクターpCRTMIIにつないだ。４種の分離物のインサー
トフラグメントの末端を横切るDNA配列を、供給業者の
推奨したプライマーと配列の似ているプライマーを使用
し、また前記配列決定方法を使用して測定した。全ての
分離物の核酸配列は縮重プライマー配列に相当する領域
において予想されたように異なっていたが、これらのデ
ータから演繹されたアミノ酸配列は先に決定されたペプ
チドに関する実際のアミノ酸配列（配列番号41及び配列
番号39）と同じであった。
先に調製したDNA（配列番号36）を含む放射能標識プ
ローブによる実施例８に記載されたＷ−14ゲノムコスミ
ドライブラリーのスクリーニングは５種のハイブリッド
形成性コスミド分離物、即ち、17D9、20B10、21D2、27B
10、及び26D1を同定した。これらのコスミドは配列番号
11または配列番号25として記載された遺伝子に相当する
プローブで先に同定されたものとは異なった。制限酵素
分析及びDNAブロットハイブリダイゼーションは、配列
番号36のDNAを含む領域をスパンするおよそのサイズ3.
7、3.7、及び1.1kbpの３種のEcoR Iフラグメントを同定
した。この実施例で調製された放射能標識された1.4kbp
のDNAフラグメントをプローブとして使用するＷ−14ゲ
ノムコスミドライブラリーのスクリーニングは同じ５種
のコスミド（17D9、20B10、21D2、27B10、及び26D1）を
同定した。また、EcoR I消化コスミドDNAに関するDNAブ
ロットハイブリダイゼーションは2.5kbpのTcdAii遺伝子
プローブで見られたのと同じEcoR Iフラグメントのサブ
セットに関するハイブリダイゼーションを示し、両方の
フラグメントがゲノムDNAでコードされることを示し
た。
クローン化EcoR IフラグメントのDNA配列決定は2516
アミノ酸（配列番号47）の282.9kDaをコードする7551塩
基対（配列番号46）の中断されない読み取り枠を明らか
にした。このタンパク質のアミノ酸配列の分析はペプチ
ドTcdAiiの全ての予想された内部フラグメント（配列番
号17、18、37、38及び39）及びTcdAiiiペプチドＮ末端
（配列番号41）並びに全てのTcdAiii内部ペプチド（配
列番号42及び43）を明らかにした。TcdAii及びTcdAiii
として単離され、同定されたペプチドは、配列番号46と
して開示されたtcdAと称される読み取り枠の夫々の産物
である。更に、配列番号47は位置89で開始することを示
し、配列番号13として開示された配列（これは約201kDa
のサイズのペプチドのＮ末端配列である）は配列番号46
から生じた初期タンパク質が配列番号12について先に開
示されたタンパク質と同様の方法でプロセシングされる
こを示す。加えて、そのタンパク質は更に開裂されて、
配列番号48によりコードされ、配列番号49（TcdAiiペプ
チド）として開示されたサイズ209.2kDaの産物、及び配
列番号50によりコードされ、配列番号51（TcdAiiiペプ
チド）として開示されたサイズ63.6kDaの産物を生じ
る。こうして、配列番号46の産物から誘導された毒素Ａ
（実施例15）として同定された殺虫活性は、配列番号47
として開示された282.9kDaの完全長タンパク質により例
示されるように、プロセシングされて配列番号49及び51
として開示されたペプチドを生じるものと考えられる。
毒素Ｂ（実施例15）として同定された殺虫活性は、配列
番号12として開示された280.6kDaのタンパク質により例
示されるように、配列番号11の産物に由来するものと考
えられる。このタンパク質はタンパク質分解処理されて
配列番号53として開示された207.6kDaのタンパク質（こ
れは配列番号52によりコードされる）、及び配列番号40
として開示され、更に配列番号55として開示されたＮ末
端配列を有する62.9kDaのペプチド（これは配列番号54
によりコードされる）を生じる。
配列番号12及び配列番号47として開示されたタンパク
質のアミノ酸配列比較は、それらが69％の類似性及び54
％の同一性を有することを明らかにする。進化的関係の
この高い程度はこれらのペプチドの全アミノ酸配列中で
一様ではないが、タンパク質のカルボキシ末端に向かっ
て高い。何となれば、配列番号51（配列番号47から誘導
された）及び配列番号55（配列番号12から誘導された）
として開示されたペプチドは76％の類似性及び64％の同
一性を有するからである。
実施例18 Photorhabdus（株Ｗ−14）ブロースの噴霧適用によるト
ウモロコシ植物に関するヨーロピアン・コーンボラー誘
発葉損傷の防除 昆虫幼虫により生じる植物損傷を軽減する一種以上の
Photorhabdus毒素の能力を、Photorhabdusブロースで処
理されたトウモロコシ植物に発生されるヨーロピアン・
コーンボラー（オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia n
ubilalis））により生じる葉損傷を測定することにより
実証した。Photorhabdus株Ｗ−14からの醗酵ブロースを
生産し、実施例13に記載されたようにして限外濾過（1
0,000MW細孔サイズ）を使用して約10倍に濃縮した。次
いで得られる濃縮ブロースを、0.2ミクロンのニトロセ
ルロース膜フィルターを使用してフィルター滅菌した。
未接種の２％プロテオースペプトン＃３の同様に調製し
たサンプルを対照目的で使用した。トウモロコシ植物
（ダウエランコ（DowElanco）所有の同系繁殖系）を温
室（日中27℃；夜間22℃、約50％RH、14時間の日の長
さ、必要により散水／施肥）中で無土壌混合物を含むポ
ット中で種子から栄養成長期７または８まで育成した。
試験植物を日中約22℃；夜間18℃の温度で、人工光を使
用しないで、部分遮蔽し、約50％のRHで必要により散水
／施肥して温室中でランダム化完全ブロック設計（３レ
プ／処理、６植物／処理）で配置した。処理（未接種培
地及び濃縮Photorhabdusブロース）をシリンジスプレー
で適用し、2.0mlを渦巻きで直接（約６インチ）適用
し、追加の2.0mlを渦巻きの上約１フィートから円形運
動で適用した。加えて、植物の１グループは処理を受け
なかった。処理が乾燥した後（約30分間）、12の新生子
のヨーロピアン・コーン・ボラー幼虫（市販源から卵を
入手し、室内で孵化させた）を渦巻きに直接適用した。
１週間後、改良グスリースケール（Guthrie Scale）（K
oziel,M.G.,Beland,G.L.,Bowman,C.,Carozzi,N.B.,Cren
shaw,R.,Crossland,L.,Dawson,J.,Desai,N.,Hill.,M.,K
adwell,S.,Launis,K.,Lewis,K.,Maddox,D.,McPherson,
K.,Meghji,M.Z.,Merlin,E.,Rhodes,R.,Warren,G.W.,Wri
ght,M.及びEvola,S.V.1983）Bio/Technology,11,194−1
95）を使用して、植物を葉への損傷についてスコアをつ
け、スコアを統計上比較した［Ｔテスト（LSD）ｐ〈0.0
5及びタキィスチューデント化レンジ（HSD）テストｐ
〈0.1］。結果を表28に示す。参考として、１のスコア
は損傷なしを表し、２のスコアはピンホール侵入のない
巻かれていない葉に対する“ウィンドーパン”損傷を表
し、また５のスコアは三つより多い葉について明らかな
細長い病変及び／または中ろくフィーディング（feedin
g）を有する葉侵入（病変＜１インチ）を表す。これら
のデータは、フラクションを含むブロースまたはその他
のタンパク質が噴霧可能な配合で送出された時またはタ
ンパク質もしくはその部分をコードする遺伝子またはそ
の誘導体がトランスジェニック植物または微生物を介し
て送出される時に特定の昆虫ペストに対する保護を与え
得ることを示す。
実施例19 E.coli中の発現のための遺伝子の遺伝子操作 構築の要約 一連のプラスミドを構築してエシェリキア・コリ中で
PhotorhabdusW−14のtcbA遺伝子を発現した。プラスミ
ドのリストを表29に示す。夫々の構築並びに得られたE.
coli発現データの要約を以下に簡単に記載する。
pDAB634の構築 実施例９に、TcbAiiプローブにハイブリッドを形成す
る大きいEcoR Iフラグメントが記載される。このフラグ
メントをpBC（ストラタゲン,La Jolla CA）にサブクロ
ーン化した。配列分析は、このフラグメントが8816塩基
対であることを示す。そのフラグメントは位置571に開
始ATGを有し、位置8086に終止TAAを有するtcbA遺伝子を
コードする。それ故、そのフラグメントはATGの上流にP
hotorhabdusDNAの570塩基対を有し、TAAの下流に730塩
基対を有する。
プラスミドpAcGP67B/tcbAの構築 下記のプライマーを使用してtcbA遺伝子をPCR増幅し
た。5'プライマー（S1Ac51）5'TTT AAA CCA TGG GAA AC
T CAT TAT CAA GCA CTA TC 3'及び3'プライマー（S1Ac3
1）5'TTT AAA GCG GCC GCT TAA CGG ATG GTA TAA CGA A
TA TG 3'。下記の反応でパンベラ（Madison,Wisconsi
n）からのタカラLA PCRキットを使用して、PCRを行っ
た。57.5mlの水、10mlの10X LA緩衝液、16mlのdNTP（夫
々2.5mMの原液）、20mlの夫々のプライマー（10pモル/m
l）、300ngのＷ−14 tcbA遺伝子を含むプラスミドpDAB6
34及び1mlのタカラLA Taqポリメラーゼ。サイクル条件
は30サイクルについて98℃/20秒、68℃/5分、72℃/10分
であった。予想される約7526bpのPCR産物をTBE（100mM
のトリス、90mMのホウ酸、1mMのEDTA）緩衝液中0.8％の
アガロースゲル中で単離し、キアゲン（Chatsworth,Cal
ifornia）からのQiaex IIキットを使用して精製した。
精製tcbA遺伝子をNco I及びNot Iで消化し、バキュロウ
イルス移入ベクターpAcGP67B（ファーミンゲン（San Di
ego,California））につなぎ、DH5αE.coliに形質転換
した。次いでtcbAいでんしをpAcGP67Bから切断し、pET2
7bに移入してプラスミドpDAB635をつくった。tcbA遺伝
子中のミスセンス突然変異をpDAB635中で修復した。
修復されたtcbA遺伝子は配列番号11に示された配列か
らの二つの変化；アスパラギン71をセリン71に変化する
212におけるＡ〉Ｇ及びアラニン77をスレオニン77に変
化する229におけるＧ〉Ａを含む。これらの変化は両方
とも提案されたTcbAiiN末端の上流である。
pET15−tcbAの構築 pDAB635のtcbAコード領域をベクターpET15bに移入し
た。ショットガン結合を使用してこれを行い、DNAを制
限酵素Nco I及びXho Iで切断した。得られた組換え体を
pET15−tcbAと称する。
プラスミドpET15−tcbAからE.coli中のTcbAの発現 E.coli中のtcbAの発現を、Studierら（Studier,F.W.,
Rosenberg,A.,Dunn,J.,及びDuben−dorff,J.,（1990）
クローン化遺伝子の発現を誘導するためのT7 RNAポリメ
ラーゼの使用Methods Enzymol.,185:60−89）により既
に記載された方法の改良により得た。コンピテントE.co
li細胞株BL21（DE3）をプラスミドpET15−tcbAで形質転
換し、100μg/mlのアンピシリン及び40mMのグルコース
を含むLB寒天に塗布した。形質転換細胞を数百の単離コ
ロニー／プレートの密度まで塗布した。37℃一夜のイン
キュベーション後に、細胞をプレートからこすり落と
し、100μg/mlのアンピシリンを含むLBブロース中で懸
濁させた。典型的な培養容積は200−500mlであった。０
時に、培養密度（OD600）は実験に応じて0.05−0.15で
あった。0.15−0.5の密度が得られるまで、培養物を三
つの温度（22℃、30℃または37℃）の一つで振とうし、
その時点でそれらを1mMのイソプロピルチオ−β−ガラ
クトシド（IPTG）で誘導した。培養物を指定温度で４〜
５時間インキュベートし、次いで処理するまで４℃に移
した（17〜72時間）。
プラスミドpET15−tcbAからE.coli中で発現されたTcbA
の精製及び特性決定 TcbAペプチドを発現するE.coli培養物を以下のように
して処理した。細胞を17,000 x Gで遠心分離により回収
し、培地をデカントし、別の容器中で保存した。
M12（アミコン,Beverly MA）濾過系及び100kD分子量
カット−オフフィルターを使用して、培地を約８倍に濃
縮した。濃縮培地を陰イオン交換カラムに装填し、結合
したタンパク質を1.0MのNaClで溶離した。1.0MのNaCl溶
離ピークはサザン・コーン・ルートワーム（SCR）幼虫
に対し死亡を生じることがわかった（表30）。1.0MのNa
Clフラクションを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0
に対し透析し、濃縮し、セファロースCL−4B（ファーマ
シア,Piscataway,New Jersey）によるゲル濾過にかけ
た。天然Ｗ−14毒素複合体としての計算分子量（約900k
Da）に相当するCL−4B溶離プロフィールの領域を回収
し、濃縮し、幼虫に対しバイオアッセイを行った。回収
した900kDaのフラクションは殺虫活性を有することがわ
かり（表30を参照のこと）、症候解滅（symptomology）
が天然Ｗ−14毒素複合体により生じた症候解滅と同様で
あった。このフラクションをプロテイナーゼＫ及び熱処
理にかけ、両方の場合の活性を排除または低下し、その
活性が性質上タンパク様であるという証拠を得た。加え
て、試験した活性フラクションは抗TcbAiiモノクローナ
ル抗体で試験した時にイムノブロットアッセイでTcbAペ
プチド及びTcbAiiiペプチドについて免疫学的に陽性で
あった。
細胞ペレットを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH＝
7.0に再度懸濁させ、バイオ−ネブTM細胞ネブライザー
（グラス−コル社,Terra Haute,IN）中の通過により溶
解した。ペレットをDNaseで処理してDNAを除去し、17,0
00 x gで遠心分離して細胞ペレットを細胞上澄みから分
離した。上澄みフラクションをデカントし、0.2ミクロ
ンのフィルターで濾過して大きい粒子を除去し、陰イオ
ン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したタンパク
質を1.0MのNaClで溶離し、透析し、50,000ダルトンの分
子量カット−オフでバイオマックスTM（ミリポア・コー
ポレション,Bedford,MA）濃縮装置を使用して濃縮し
た。濃縮フラクションを、セファロースCL−4Bビードマ
トリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにか
けた。このようにして調製した物質に関するバイオアッ
セイを表30に示し、“TcbA細胞Sup"と称する。
多量の物質を取り扱う別法において、細胞ペレットを
10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH＝7.0に再度懸濁さ
せ、コンテス・グラス社（Vineland,NJ）の40mlの組織
粉砕機を使用することにより充分に均一にした。細胞デ
ブリを25,000 x gで遠心分離によりペレット化し、細胞
上澄みをデカントし、0.2ミクロンのフィルターに通
し、ポロスHQ50ビーズを詰め込んだファーマシア10/10
カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにか
けた。0.0〜1.0MのNaCl勾配を行うことにより結合した
タンパク質を溶離した。TcbAタンパク質を含むフラクシ
ョンを合わせ、50kDa濃縮装置を使用して濃縮し、ファ
ーマシアCL−4Bビードマトリックスを使用してゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。約900kDaの分子量のTcbA
オリゴマーを含むフラクションを回収し、20mMのトリス
緩衝液pH＝7.3で平衡にしたファーマシアモノQ10/10カ
ラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ
た。0.0〜1.0MのNaClの勾配を使用して組換えTcbAタン
パク質を溶離した。組換えTcbAは約0.3−0.4MのNaClの
塩濃度でカラムから溶離し、同じモル濃度で天然TcbAオ
リゴマーがモノQ10/10カラムから溶離される。組換えTc
bAオリゴマーは表30中の実験と同様のバイオアッセイ実
験でSCR死亡率を生じることがわかった。
配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：エンサイン，ジェラルドC. ボーエン，デイビットＪ ペテル，ジェイムズ ファティグ，レーモンド スコクノバー，スー フレンクコンスタント，リチャード オール，グレゴリーＬ メルロ，ドナルドＪ ロバートツ，ジェーンＬ ロチェレアウ，トーマスＡ ブラックバーン，ミカエルＢ ヘイ，チモシーＤ ストリックランド，ジェイムズＡ （ii）発明の名称 ホトルハブダスから得た殺虫性タンパク毒素 （iii）配列数:61 （iv）通信先住所 （Ａ）名宛人：クオールズ＆ブラディ （Ｂ）通り:1サウスピンクネイストリート （Ｃ）町：マジソン （Ｄ）州:WI （Ｅ）国：合衆国 （Ｆ）郵便番号:53703 （ｖ）コンピュータ読込可能形式： （Ａ）媒体：フロッピーデスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Vers
ion ＃1.30 （vi）現行出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US08/063,615 （Ｂ）出願日:1993年05月18日 （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US08/395,497 （Ｂ）出願日:1995年02月28日 （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US60/007,255 （Ｂ）出願日:1995年11月06日 （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US08/608,423 （Ｂ）出願日:1996年02月28日 （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US08/705,484 （Ｂ）出願日:1996年08月28日 （viii）代理人／エージェント情報： （Ａ）氏名：セアイ，ニコルソンJ. （Ｂ）登録番号:27,386 （Ｃ）参照／訴訟人名簿番号:960296.93804 （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話 ：（608）251−5000 （Ｂ）ファクシミリ：（608）251−9166 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:11アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:12アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:19アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:14アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:9アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:15アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号７に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:11アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:9アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号９に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:16アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号10に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:20アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （Ｖ）フラグメントタイプ:N−末端 （xi）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号11に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:7515塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ:DNA（ゲノム） （ix）特性 （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）部位:1.....7515 （xi）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号12に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:2505アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号13に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:12アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号14に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:12アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号15に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:9アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号16に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:5アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:16: （２）配列番号17に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:10アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:17: （２）配列番号18に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:16アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:18: （２）配列番号19に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:21アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:19: （２）配列番号20に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:12アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:20: （２）配列番号21に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:26アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 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フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／７０５，４８４ (32)優先日 平成８年８月28日(1996．8．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 ボーウェン ディヴィッド ジェイ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53575 オレゴン ハイウェイ エイ 5668 (72)発明者 ピーテル ジェームズ アメリカ合衆国 インディアナ州 46077 ジオンズヴィル ハンターズ グレン 1427 (72)発明者 ファティーグ レイモンド アメリカ合衆国 インディアナ州 46077 ジオンズヴィル クレイ コー ト 30 (72)発明者 シューノヴァー スー アメリカ合衆国 インディアナ州 46112 ブラウンズバーグ マーステラ 7142 (72)発明者 フレンチ コンスタント リチャード エイチ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53705 マディソン ユニヴァーシティ ー ベイ ドライヴ 1006 (72)発明者 ロシェロー トーマス エイ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53704 マディソン ブエナ ヴィスタ ストリート 3100 (72)発明者 ブラックバーン マイケル ビー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53713 マディソン ルーアン レーン 2127 (72)発明者 ヘイ ティモシー ディー アメリカ合衆国 インディアナ州 46077 ジオンズヴィル カタリーナ ウェイ 1653 (72)発明者 マーロ ドナルド ジェイ アメリカ合衆国 インディアナ州 46032 カーメル ダービン ドライヴ 11845 (72)発明者 オー グレゴリー エル アメリカ合衆国 インディアナ州 46280 インディアナポリス サラトガ サークル 1028 (72)発明者 ロバーツ ジーン エル アメリカ合衆国 インディアナ州 46030 アーケイディア ステイト ロ ード 19−26035 (72)発明者 ストリックランド ジェームズ エイ アメリカ合衆国 インディアナ州 46052 レバノン マウント ジーオン ロード 780 (72)発明者 グーオ リーニング アメリカ合衆国 インディアナ州 46112 ブラウンズバーグ ネルソン サークル ７ (72)発明者 シーチェ トッド エイ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53705 マディソン チャドボーン ア ベニュー 1609 (56)参考文献 米国特許5039523（ＵＳ，Ａ) 国際公開95／00647（ＷＯ，Ａ２) Ｊ．ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，1995年 ３月, Ｖｏｌ．66，145−155 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A01H 5/00 C07K 7/00 - 7/66 C07K 14/00 - 14/825 C12N 5/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰｕｄＭｅｄ

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】異種プロモーターに機能可能に接続された
    ポリヌクレオチドであって、昆虫に対して経口的毒性を
    有するタンパク質をコードし、配列番号11および配列番
    号46からなる群より選ばれる配列を有する前記ポリヌク
    レオチド。
  2. 【請求項２】昆虫に対して経口的毒性を有するタンパク
    質をコードする、異種プロモーターに機能可能に接続さ
    れたポリヌクレオチドであって、前記タンパク質が配列
    番号12および配列番号47からなる群より選ばれるアミノ
    酸配列を含むタンパク質である、前記ポリヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む
    トランスジェニック植物細胞。
  4. 【請求項４】請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現
    させるトランスジェニック植物細胞。
  5. 【請求項５】配列番号12および配列番号47に記載のアミ
    ノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、
    昆虫に対して経口的に有毒な組換えタンパク質。
  6. 【請求項６】請求項５に記載のタンパク質を与えること
    を含む、昆虫を防除する方法。
  7. 【請求項７】タンパク質が昆虫の接近が可能なトランス
    ジェニック植物によって産生され、前記トランスジェニ
    ック植物中に存在する、請求項６に記載の方法。
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Ｊ．ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９５年 ３月，Ｖｏｌ．６６，１４５−１５５

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