CZ162398A3 - Vektory a způsoby pro genový přenos do buněk - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Chimérický adenovirový obalový protein, který se liší od obalového proteinu divokého typu zavedením nepřirozené aminokyselinové sekvence. Uvedený chimérický adenovirový obalový protein podle vynálezu Je schopen řídit vstup vektoru, který obsahuje obalový protein, do buněk. Vstup vektoru do buněk Je úěinější, Jestliže vektor obsahuje spíše chime) rický adenovirový obalový protein než adenovirový protein divokého typu. Upřednostňuje se chimérický obalový protein, kterým je vláknitý protein, hexonový nebo pentonový protein. Dále se popisuje adenovirový vektor, který obsahuje chimérický adenovirový obalový protein, jeho konstrukce a použití.

CZ 1623-98 A3 • ·

·····« · · v ············

Vektory a způsoby pro genový přenos do buněk

Oblast techniky

Vynález popisuje chimérický adenovirový obalový protein, který je schopný řídit vstup vektoru, který obsahuje tento obalový protein, do buňky. Tento vektor je účinnější než podobný vektor, který má obalový protein adenoviru divokého typu. Uvedený chimérický obalový protein je vláknitý, hexonový nebo pentonový protein. Vynález také popisuje rekombinantní vektor, který obsahuje uvedený chimérický adenovirový obalový protein a způsoby konstrukce a použití tohoto vektoru.

Dosavadní stav techniky

Adenoviry patří k čeledi Adenoviridae, která se dělí na rody Mastadenovirus a Aviadenovirus. Adenoviry nemají virový obal, tvoří pravidelné ikosaedry o přibližné velikosti 65 až 80 nanometrů v průměru (Horné et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Adenovirový kapsid je tvořen 252 kapsomery, z nichž 240 jsou hexony a 12 jsou pentony (Ginsberg et al., Virology, 28, 782-783 (1966)). Hexony a pentony vznikly ze tří různých virových polypeptidů (Maizel et al., Virology, 36, 115-125 (1968); Weber et al., Virology, 76, 709-724 (1977)). Hexon obsahuje tři identické polypeptidy, kdy každý zahrnuje 967 aminokyselin, jmenovitě polypeptid II (Roberts et al., Science, 232, 1148-1151 (1986)). Penton obsahuje pentonovou bázi, která je navázána na kapsid, a vlákno, které se nekovalentně váže na pentonovou bázi a vyčnívá z ní. Vláknitý protein obsahuje tři identické polypeptidy, kdy každý zahrnuje 582 aminokyselin, jmenovitě polypeptid IV. Protein s pentonovou baží adenovirového sérotypu 2 (Ad2) je kruhový komplex, který se skládá z pěti identických proteinových podjednotek, kdy každý zahrnuje 571 aminokyselin, jmenovitě • ·

polypeptid III (Boudin et la., Virology, 92, 125-138 (1979)). Proteiny IX, VI a lila se také nacházejí v adenovirovém obalu a uvažuje se, že stabilizují virový kapsid (Stewart et al., Cell, 67, 145-154 (1991); Stewart et al., EMBO J._z 12(7), 2589-2599 (1993)).

Po té, co se adenovirus přichytí na buňce, dochází k internalizaci, která je zprostředkovaná receptorem, do klathrinem obalených endocytických váčků buňky (Svensson et al., J. Virol., 51, 687-694 (1984); Chardonnet et al., Virology, 40, 462-477 (1970)). Viriony, které vstupují do buňky, se postupně rozkládají, protože řada strukturálních virových proteinů se rozpadá (Greber et al., Cell, 75, 477486 (1993)). Během procesu rozbalování virové partikule způsobují poškození buněčného endosomu mechanizmem závislým na pH (Fitzgerald et al., Cell, 32, 607-617 (1983)), který není stále zcela objasněn. Virové partikule se pak přenášejí do komplexu jaderného póru buňky (Dales et al., Virology, 56, 465-483 (1973)), kde se virový genom dostává do jádra a tak iniciuje infekci.

Adenoviry využívají pro účinné zachycení a infekci buňky dva oddělené buněčné receptory, přičemž musí být oba přítomny (Wickham et al., Cell, 73, 309-319 (1993)). Za prvé, vláknitý protein Ad2 se naváže na ještě neidentifikovaný receptor, čímž zachytí virus na buňce. Pak se pentonová báze naváže na oc_v integriny, které patří do rodiny heterodimerických buněčných povrchových receptorů, které zprostředkovávají buněčnou adhezi na extracelulárních matricových molekulách, stejně jako i na jiných molekulách (Hyneš, Cell, 69, 11-25 (1992)).

Vláknitý protein je trimer (Devaux et al., J. Molec. Biol., 215, 567-588 (1990)), který sestává z oblastí ocasu, střední části a knoflíku (tail, shaft, knob). Vláknitá oblast shaft se skládá z 15 opakovaných aminokyselinových motivů.

Věří se, že tyto motivy tvoři dva alternující β-řetězec a βoblouk (Green et al., EMBO J., 2, 1357-1365 (1983)). Celá délka střední části vlákna a počet 15 aminokyselinových repetic se liší u jednotlivých adenovirových sérotypů. Například střední část vlákna Ad2 je dlouhé 37 nanometrů a obsahuje 22 repetic, zatímco vlákno u sérotypů Ad3 je dlouhé 11 nanometrů a obsahuje 6 repetic. Vazebná oblast receptorů vláknitého proteinu se nachází v oblasti knob, která je kódovaná posledními 200 aminokyselinami proteinu (Henry et al., J. Virology, 68(8), 5239-5246 (1994)). Oblasti nezbytné pro trimerizaci se také nacházejí v oblasti knob proteinu (Henry et al., J. Virology, 68(8), 5239-5246 (1994)). Deleční mutant, kde a také se chybí posledních 40 aminokyselin, neváže na pentonovou

185, 365-376 (1991)).

Virology, proteinu je nezbytná pro navázání lokalizační signály, které směrují netrimerizuj e bázi (Novelli et al., Trimerizace vláknitého pentonové báze. Jaderné protein do jádra, aby došlo k tvorbě virových partikul!, což následuje po syntéze proteinu v cytoplazmě, se nacházejí v oblasti N-konce proteinu (Novelli et al., Virology, 185, 365-376 (1991)).

Vlákno dohromady s hexonem jsou hlavní antigenní determinanty viru a také určují sérotypovou specifitu viru (Watson et al., J. Gen. Virol., 69, 525-535 (1988)).

Rekombinantní adenovirové vektory se používají při přenosu jednoho nebo více rekombinantních genů do nemocných buněk nebo tkáně, které potřebují léčbu. Takové vektory se charakterizují tím, že nevyžadují pro expresi adenovirových proteinů proliferaci hostitelských buněk (Horwitz et al., In Virology, Raven Press, New York, vol. 2, pp. 1679-1721 (1990); Berkner, BioTechniques, 6, 616, (1988)). Avšak v případě, že cílová tkáň pro somatickou genovou terapii jsou plíce, tyto vektory jsou výhodné, protože jsou normálně • ·

trofické pro respirační epitel (Straus, In Adenoviruses, Plenan Press, New Yourk, pp. 451-496 (1984)).

Další výhody adenovirů jako potencionálních vektorů vhodných pro lidskou genovou terapii: (I) při použití takových vektorů řídce dochází k rekombinaci; (II) není známé žádné spojení s tvorbou lidských maligních nádorů a adenovirových infekcí i když lidské adenovirové infekce jsou běžné; (III) adenovirový genom (kterým je lineární, dvouřetězcová DNA) se může manipulovat, tak aby se do něho vnesly cizorodé geny, které odpovídají velikostí; (IV) při použití adenovirového vektoru nedochází k začlenění jeho DNA do chromozómu buňky, což znamená, že jeho účinek je přechodný a interferuje s buněčnými normálními funkcemi; (V) adenovirus může infikovat buňky, které se nedělí, nebo terminálně diferenciované buňky, jako jsou buňky v mozku a v plicích; a (VI) živé adenoviry, jejichž hlavní charakteristikou je schopnost se replikovat, se používají jako lidská vakcína (Horwitz et al., In Virology, Raven Press, New York, vol. 2, pp. 1679-1721 (1990); Berkner et al., BioTechniques, 6, 616, (1988); Straus et al., In Adenoviruses, Plenan Press, New Yourk, pp. 451-496 (1984); Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267, (1986); a Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)); patentová přihláška PCT WO 94/17832).

Nevýhodou genové terapie zprostředkované adenoviry je, že po dvou týdnech od aplikace vektoru se pozorovalo podstatné snížení exprese genu. Při terapeutické aplikaci ztráta exprese vyžaduje novou aplikaci virového vektoru. Avšak při následující opekované aplikaci vznikají proti oběma vláknitým a hexonovým proteinům virového vektoru neutralizující protilátky (Wohlfart, J. Virology, 62, 23212328 (1988); Wohlfart et al., J. ' Virology, 56, 896-903 • · · ♦ (1985)). Tato protilátková odezva proti viru může zabránit efektivní opakované aplikaci virového vektoru.

Jinou nevýhodou při použiti rekombinantniho adenoviru v genové terapii je, že jisté buňky nejsou schopny přijmout gen zavedený prostřednictvím adenovirů. Například lymfocyty, kterým chybí adenovirové receptory pro ct_v integrin, nejsou schopny přijmout adenoviry (Silver et al., Virology, 165, 377-387 (1988); Horvath et al., J. Virology, 62(1), 341-345 (1988)) . Neschopnost infikovat všechny buňky vede k hledáni nové cesty zavedeni adenovirů do buněk, které nemohou být infikovány adenoviry, například z důvodu nepřítomnosti adenovirových receptoru. Virus se může spojovat v DNApolylysinový komplex, který obsahuje ligand (například transferin) vhodný pro savčí buňky (např. Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 6099-6103 (1992); patentová přihláška PCT WO 95/26412). Podobně adenovirový vláknitý protein může být stéricky blokován protilátkami a tkáňově specifické protilátky se mohou chemicky vázat na virové partikule (Cotton et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 6094-6098 (1992)) .

Tyto přístupy jsou nevýhodné . tím, že vyžaduji další kroky, které umožni kovalentně navázat velké molekuly, jako je ροϊγίγζίη, receptorové ligandy a protilátky na virus (Cotten (1992), citace uvedena shora; Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 6099-6103 (1992)), což zvětšuje velikost výsledného vektoru a zvyšuje náklady na produkci. Cílové částicové komplexy nemají homogenní strukturu a jejich účinnost je citlivá na relativní poměr virových partikul!, vázání molekul a používaných cílových molekul. Tento přístup ke zvětšení zastoupení buněk, které jsou přístupny adenoviry zprostředkované genové terapii je méně než optimální.

Účinnost transferu genu zprostředkovaného adenoviry in vivo dokonce i do těch buněk, do nichž vektor vstupuje s • · vysokou účinností, je stále otázkou (Grubb et al., Nátuře, 371, 802-806 (1994); Dupuit et al., Human Gene Therapy, 6, 185-1193 (1995)). Receptor vlákna, prostřednictvím kterého adenovirus v počátku kontaktuje buňky, nebyl identifikován a jeho zastoupení v různých tkáních se nezjišťovalo. Obecně se přijímá, že epiteliální buňky v plicích a ve střevech produkují podstatné množství receptoru vlákna, což umožňuje jejich optimální transdukci. Žádná studie však doposud nepotvrdila tento bod. Ve skutečnosti studie naznačují, že zavedení genu zprostředkované adenoviry do diferenciovaných epiteliálních buněk plic je méně účinné, než zavedení do proliferujících nebo nediferenciovaných buněk (Grubb et al., Nátuře, 371, 802-806 (1994); Dupuit et al., Human Gene Therapy, 6, 185-1193 (1995)).

Podobně se ukázalo, že adenoviry transdukují velké množství tkání, mezi něž patří plicní epiteliální buňky (Rosenfeld et al., Cell, 68, 143-155 (1992)), svalové buňky (Quantin et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 2581-2584 (1992)), endoteliální buňky (Lemarchand et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 6482-6486 (1992), fibroblasty (Anton et al., J. Virol., 69, 4600-4606 (1995) a neuronové buňky (LaSalle et al., Science, 259, 988-990 (1993)). U mnoha těchto studií se za účelem dosažení transdukce používala velmi vysoká hladina virových partikul!, často překračující 100 jednotek tvořících plaky na buňku, což odpovídá multiplicitě infekce (MOI) 100. Požadavek pro dosažení transdukce je vysoké MOI, což je nevýhodou stejně jako libovolná imunní odezva spojená s adenovirovou infekcí, která je aktivovaná použitím vysokých dávek.

Stále však existuje nutnost vytvoření vektorů, jako jsou adenovirové vektory, které jsou schopny infikovat buňky s vysokou účinností, zvláště při nízkých MOI a které jsou schopny infikovat větší rozmezí buněk. Vynález se snaží

obejit nejméně některé popsané problémy rekombinantní adenovirové genové terapie. Předmětem vynálezu je zvláště vektor (takový jako je adenovirový vektor) , který má široké rozmezí hostitelů a schopnost vstupovat do buněk s vysokou účinností, dokonce je-li nízké MOI, přičemž se redukuje množství aplikovaného rekombinantního adenovirového vektoru a libovolné vedlejší účinky/komplikace vyplívající z takové aplikace. Dále vynález popisuje způsob genové terapie, který zahrnuje použití homogenního adenoviru, přičemž virové partikule se modifikují na úrovni adenovirového genomu, aniž jsou nutné další chemické modifikace virových partikul!. Tyto a jiné výhody vynálezu stejně jako další inventivní rysy jsou zřejmé z detalnějšího popisu.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje chimérický adenovirový obalový protein (například vláknitý, hexonový nebo pentonový protein), který se liší od vláknitého proteinu divokého typu (přirozeného) zavedením umělé aminokyselinové sekvence přednostně do nebo blízko karboxylovému konci. Výsledný chimérický adenovirový obalový protein je schopný řídit vstup vektoru do buněk. Uvedený vektor obsahující obalový protein vstupuje do buněk s větší účinností než vektor, který je identický až na skutečnost, že obsahuje adenovirový obalový protein divokého typu. Přímý výsledek této zvýšené účinnosti je, že chimérický adenovirový obalový protein umožňuje adenoviru vázat se a vstupovat do řady typů buněk, do kterých nemůže vstoupit adenovirus, jenž obsahuje obalový protein divokého typu, nebo do nichž vstupuje pouze s nízkou účinností. Vynález popisuje adenovirový vektor, který obsahuje chimérický adenovirový obalový protein a způsoby konstrukce a použití takového vektoru. ·. 9 9 9 9 9

9 9 99

9 9999 9

9 9 9 • · · · ·

4» • · · · · • · · ·· • ······· • · ·· ··· · »99

Vynález popisuje mimo jiné rekombinantní adenovirus, který obsahuje chimérický obalový protein, takový jako je chimérický vláknitý, pentonový a/nebo hexonový protein. Chimérický obalový protein obsahuje umělou aminokyselinovou sekvenci, která je buď přiřazena nebo nahrazuje nativní aminokyselinovou sekvenci. Tato nepřirozená aminokyselinová sekvence umožňuje chimérickému vláknu (nebo vektoru, který obsahuje chimérické vlákno) se účinněji vázat na buňky a vstupovat do nich.

Vynález popisuje chimérický adenovirový obalový protein, který obsahuje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci, přičemž obalový protein je schopný řídit vstup vektoru obsahujícího obalový protein do buněk. Vstup uvedeného vektoru do buněk je účinnější než vstup vektoru do buněk, který je identický mimo to, že obsahuje adenovirový obalový protein divokého typu, spíše než chimérický adenovirový obalový protein (to je při absenci chimérického adenovirového obalového proteinu a v přítomnosti adenovirového obalového proteinu divokého typu).

Chimérický obalový protein podle vynálezu přednostně adenovirový vláknitý adenovirový pentonový adenovirový hexonový obsahuje adenovirový protein. Libovolný ze obsahuj e protein), protein) a protein). vláknitý, sérotypů vláknitý protein (zvlášt pentonový protein (zvlášt hexonový protein (zvlášt

Obalový protein zvláště pentonový nebo hexonový lidského nebo nelidského adenoviru se může použít jako zdroj genu obalového proteinu, optimální se však jeví adenovirus Ad2 nebo Ad5.

Obalový protein je chimérický, jestliže obsahuje aminokyselinové zbytky, které nejsou typické pro protein, jenž se izoloval z adenoviru divokého typu (to je •t ···· • · · • · · · · · ···« ··· · · · ···· • ···· · · · · · ··· · · • · ·»· ··· ···· · ·· · ·· ♦ · obsahujícího nativní protein nebo protein divokého typu). Obalový protein pak obsahuje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci. Nepřirozená aminokyselinová sekvence je libovolná aminokyselinová sekvence, která se nenachází v přirozeném vláknu danného sérotypu adenoviru a která se přednostně zavádí do vláknitého proteinu na úrovni exprese genu (to je zavedením sekvence nukleové kyseliny, která kóduje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci).

Taková nepřirozená aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyselinovou sekvenci (to znamená, že má jednotlivé zbytky v určitém pořadí), která propůjčuje výslednému chimérickému proteinu schopnost vázat se na buňku nebo do ní vstupovat na základě nových buněčných povrchových vazebných míst (to znamená UTV nebo Univerzální sekvence transferového vektoru) a/nebo obsahuje inkorporovanou sekvenci za účelem tvorby nebo udržování jisté konfigurace výsledného chimérického proteinu (to je intergenová sekvence) mezi nativní/nepřirozenou, nepřirozenou/nepřirozenou nebo nativní/nativní sekvencí. Protože nepřirozená aminokyselinová sekvence je začleněna do aminokyselinové sekvence nebo ji nahrazuje a k manipulaci aminokyselinové sekvence chimérického obalového proteinu přednostně dochází na úrovni nukleové kyseliny, aminokyselinová sekvence chimérického obalového proteinu, která se tak liší od sekvence proteinu divokého typu (to je sekvence UTV a intergenová sekvence), může přednostně obsahovat celou nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci nebo směs nativní a nepřirozené aminokyseliny.

Buněčné povrchové vazebné místo znamená receptor (kterým je přednostně protein, sacharid, glykoprotein nebo proteoglykan) stejně jako to může být libovolná opačně nabitá molekula (opačně nabitá vzhledem -k- Chimérickému obalovému proteinu, který přednostně obsahuje nepřirozenou • · · • · · • · · • · · aminokyselinovou sekvenci, která popisuje dále) nebo jiný chimérický obalový protein buňku a tak podporovat vstup buněčných povrchových negativně kyselinu, které je pozitivně nabitá, jak se molekuly, se kterou může interagovat, aby se navázal na do buňky. Příklady potenciálních míst zahrnují, ale nejsou sulfát heparanu, a části sulfátu typ vazebných nabitý sulfát heparin, dermatanu se nacházej í na omezeny na hyaluronovou chondroitinu, glykogaminoglykanu a které dále sialové kyseliny; části sialové na mucinu, glykoproteiny histokompatibilní komplex I komponenty sacharidů, které glykoproteinech, mezi něž galaktosamin, podobně; a kyselinách. způsoby jeho buněčné například obsahují sulfát a/nebo fosfát kyseliny, které se nacházejí gangliosidy; hlavní (MHC I), glykoproteiny; běžné se nacházejí v membránových patří manóza, N-acetylN-acetyl-glukosamin, fukóza, galaktóza a fosfátové části, například na

Chimérický obalový protein použití nejsou interakce (to je povrchovým vazebným místem) a omezeny na interakce s nukleových vynálezu a mechanizmus podle určitý určitým buněčným není tak spojován.

Dále takové buněčné povrchové vazebné místo je nové, protože jde o to místo, které dříve nebylo přístupné pro interakci s adenovirovým obalovým adenovirový obalový protein divokého protein) nebo nebo bylo přístupné na se odráží na snížené proteinem typu, jako velmi nízké (to znamená je vláknitý úrovni, což vektoru, který obsahuje účinnosti vstupu protein divokého typu, ve srovnání s chimérický adenovirový obalový protein, adenovirový obalový vektorem obsahujícím takový jako je vláknitý protein podle vynálezu. Vazebné místo je nové v buňkách, jestliže je přítomna jeho hlavní část, neli celé, bez ohledu na jeho původ. Tím se liší od buněčného vazebného místa, se kterým, jak se. předpokládá, adenovirový vláknitý protein divokého typu interaktuje, které se údajně • · • · • · ··· · · ♦ ···· · · · * · · ·· nachází pouze na některých buňkách nebo je pouze přístupná na některých buňkách, což má za následek redukovanou účinnost vstupu vektoru, který obsahuje adenovirové vlákno divokého typu.

Účinnost vstupu se může kvantifikovat několika způsoby. Účinnost vstupu se může zvláště kvantifikovat zavedením chimérického obalového proteinu do vektoru, přednostně virového vektoru, a monitorováním vstupu do buňky (např. zavedením genu, jako je reportní gen, do buňky zprostředkované vektorem) jako funkce multiplicity infekce (MOI). V tomto případě redukovaná hodnota MOI, která je nutná pro vstup vektoru obsahujícího chimérický adenovirový obalový protein do buňky, což se srovnává s vektorem, který je identický, mimo to, že obsahuje spíše adenovirový obalový protein divokého typu než uvedený chimérický adenovirový obalový protein, indikuje účinější vstup.

Podobně účinnost vstupu se může kvantifikovat na základě schopnosti vektorů, které obsahují chimérický obalový protein nebo obalový protein divokého typu nebo samotný rozpustný chimérický obalový protein nebo obalový protein divokého typu, vázat se na buňky. V tomto případě zvýšená schopnost vázat se vykazuje u vektoru, který obsahuje chimérický adenovirový obalový protein nebo samotný chimérický obalový protein, ve srovnání s vektorem, jenž je identický mimo to, že obsahuje obalový protein divokého typu nebo samotný obalový protein divokého typu, zvýšenou účinnost vstupu nebo účinnější vstup.

Nepřirozená aminokyselinová sekvence podle vynálezu je přednostně začleněna do vnitřní sekvence obalového proteinu nebo tuto sekvenci nahrazuje. V jiném případě nepřirozená aminokyselinová sekvence podle vynálezu se nachází na karboxylovém konci proteinu nebo blízko tomuto konci. Zvláště, je-li obalový protein podle vynálezu vláknitý • · · · • · · ·· · ··· ··· ·· · ·· protein, pak je vhodné, aby se nepřirozená aminokyselinová sekvence nacházela na karboxylovém konci proteinu nebo blízko tomuto konci. V případě, že obalový protein podle vynálezu je pentonový nebo hexonový protein, pak se upřednostňuje, aby nepřirozená aminokyselinová sekvence byla v exponované smyčce proteinu, například jak se popisuje v následujících příkladech, zvláště v hypervariabilní oblasti smyčky 1 a/nebo smyčky 2 adenovirového hexonového proteinu (Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70, 1836-1844 (1996)). Pak je vhodné, aby nepřirozená aminokyselinová sekvence byla v oblasti obalového proteinu, který je schopný interaktovat s buňkou a vázat se na ni.

Způsob podle vynálezu se může použít pro vytvoření adenovirových vektorů, které obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV v prodloužené struktuře, zvláště hexonovém a/nebo pentonovém proteinu, takovém, jehož výsledek je prodloužený protein s hexonovou a/nebo pentonovou bází, kde aminokyselinová inzerce působí směrem ven z kapsidu virionu, ve kterém je protein. Zvláště takové vyčnívající obalové proteiny se mohou začleňovat do rekombinantního adenoviru spolu s krátce stočeným vláknem (short-shafted fiber) (dále se zde popisuje), kde střední část vlákna je zkrácena a oblast knob vláknitého proteinu je nahrazen oblastí knob (zahrnující trimerizační oblast) adenovirového vektoru jiného sérotypu, z kterého se odvodil zbytek vláknitého proteinu.

Vláknitý protein s krátkou střední částí může být přednostně začleněn do adenoviru, který nese chimérický protein s penotnovou bází, který obsahuje UTV nebo sekvenci podobnou UTV. Vláknitý protein s krátkou střední částí se může začlenit do adenoviru, který nese chimérický hexonový protein, který obsahuje UTV nebo sekvenci podobnou UTV nebo nese vyčnívající chimérický hexonový- protein, který se může navíc začlenit UTV nebo sekvenci podobnou UTV.

• · · ♦ · • · ♦ ·· • ······· • · ·· • · · · · · · aminokyselinová nepřirozenou aminokyselinovou sekvencí intergenovou sekvencí.

která se nachází mezi

Nepřirozená proteinem jinou je intervenující je sekvence, proteinu a nepřirozenou sekvencí, mezi a jinou nepřirozenou sekvencí nebo mezi jinou nativní sekvencí.

začleněna sekvence je spojena s , to Intergenová sekvence sekvencí přirozeného nepřirozenou sekvencí přirozenou sekvencí a

Intergenová sekvence je přednostně do proteinu, aby se zaručilo, že nepřirozená která obsahuje buněčné povrchové vazebné místo tří dimenziální struktury chimérického proteinu chimérického proteinu, jak jako část kapsidu) takovým sekvence, vyčnívá z (tří dimenziální struktura existuj e způsobem, vázat. V v přírodě, to je že je schopna interaktovat s buňkou nebo se na ni případě, že intergenová sekvence je začleněna do vnitřní sekvence obalového proteinu nebo ji nahrazuje, chimérickém obalovém proteinu se může nacházet jedna více intergenových sekvencí.

Uprostřed ležící libovolnou délku, vzniká vyčnívající okolo 3 až pak v nebo mít které následuj icich upřednostňuj e sekvence může intergenová sekvence může u přidané intergenové sekvence, z obalový protein,

400 aminokyselin (jak se dále příkladech) . Pro jiné zde popsané délka od 3 do 30 aminokyselin, obsahovat libovolné aminokyseliny.

délka se upřednostňuje popisuje v aplikace se Intergenová V optimálním případě intergenová sekvence obecně neinterferuje s funkcemi obalového proteinu a zvláště s funkcemi jiné nepřirozené aminokyselinové sekvence (to je UTV nebo sekvence podobné UTV) .

Nepřirozená aminokyselinová sekvence, která není intergenovou sekvencí, to je sekvence UTV, také může být libovolně vhodně dlouhá. Upřednostňuje se délka okolo 3 až 30 aminokyselin (ačkoli jako u intergerídvé sekvence, sekvence UTV může být delší, například až 400 aminokyselin) . Tyto • ·

aminokyseliny tvoří libovolné pozitivně nabité zbytky, které jsou schopny vázat se na negativně nabité části, které jsou přítomny na povrchu eukaryontní buňky a v optimálním případě jsou schopny se vázat na negativně nabité části, které se nacházejí na povrchu většiny (ne-li na všech) eukaryontních buněk. Taková negativně nabitá Část přítomna na povrchu eukaryontní buňky, na kterou se váže sekvence UTV, zahrnuje dříve uvedené buněčné povrchové vazebné místo.

Nepřirozená aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny, které jsou vybrány ze skupiny obsahující lyzin, arginin a histidin. V jiném případě tyto kyseliny mohou být negativně nabité zbytky, které jsou schopny se vázat na pozitivně nabitá buněčná povrchová vazebná místa, například nepřirozená aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující aspartát a glutamát.

Nepřirozená aminokyselinová sekvence obalového proteinu přednostně obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:1 (to je Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys), SEQ ID NO: 2 (to je Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ) a SEQ ID NO: 3 (to je Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa, kde Xaa obsahuje Lys nebo Arg) a kde 1, 2, 3, 4 nebo 5 zbytků se může na Ckonci sekvence odstranit. V případě, že obalový protein je vláknitý protein, upřednostňuje se, aby protein obsahoval sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 (to je Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys) a SEQ ID NO:5 (to je Ala Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys) a kde 1, 2, 3, 4 nebo 5 zbytků C-konce sekvence se mohou odstranit.

Sekvence, která se váže na heparin se může účastnit na navázání na receptor podobný heparinu(Sawitzky et al., Med. Microbial. Immunol., 182, 285-92 (1993)). Podobně tzv.

• ·

heparin vázající sekvence mohou zprostředkovat interakci peptidů nebo proteinu, ve kterém jsou obsaženy spolu s jinými buněčnými povrchovými vazebnými místy, jako je buněčný povrchový sulfát heparanu proteoglykanu (Thompson et al., J. Biol. Chem., 269, 2541-9 (1994)). Nepřirozená aminokyselinová sekvence (to je UTV sekvence) přednostně obsahuje tyto sekvence, stejně jako přídavné sekvence, které jsou schopny rozeznávat negativně nabité části, které jsou široce zastoupeny na povrchu eukaryontních buněk.

Zvláště se upřednostňuje nepřirozená aminokyselinová sekvence, která obsahuje dvě základní aminokyseliny (často Arg) lokalizované okolo 20A stranou, obalující v opačném směru alfa šroubovici (Margalit et al., J. Biol. Chem., 268, 19228-31 (1993); Na et al., J. Lipid Res., 35, 2049-2059 (1994)). Jiné základní aminokyseliny jsou rozptýleny mezi těmito dvěma zbytky obalující jednu stranu, zatímco nepolární zbytky obalují druhou stranu, přičemž tvoří amfipatickou strukturu, která v optimálním případě obsahuje motiv XBBXBX (SEQ ID NO:49) nebo XBBBXXBX (SEQ ID NO: 50), kde B je základní aminokyselina (např. Lys, Arg atd.) a X je libovolná další aminokyselina.

UTV nepřirozená aminokyselinová sekvence přednostně obsahuje: sekvenci LIGRKKT (SEQ ID NO: 51), LIGRK (SEQ ID NO: 53), které jsou běžné heparin vázající motivy přítomnéve fibronektinu a v proteinech teplotního šoku (Hansen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1252, 135-45 (1995); inzerci 7 zbytků buď Lys nebo Arg nebo směsi Lys a Arg (Fromm et al., Arch. Biochem. Biophys., 323, 279-87 (1995)); běžnou základní oblast C-konce IGFBP-3 a IGFBP-5 přibližně 18 aminokyselin, která obsahuje heparin vázající sekvenci (Booth et al., Growth Regul., 5, 1-17 (1995)); buď jeden nebo oba dva hyaluronanové (HA) vazebné motivy, · které se nacházejí v oblasti 35 aminokyselin C-konce HA receptorů RHAMM (Yang et • · ··

al., J. Cell. Biochem., 56, 455-68 (1994)); syntetický peptid (Ala347-Arg361) modelovaný po heparin vázající formě vitronektinu ze Staphylococcus aureus, který obsahuje heparin vázající sekvence (Liang et al., J. Biochem., 116, 457-63 (1994)); libovolné jedno nebo více z pěti heparin vázajících míst mezi aminokyselinou 129 a 310 glykoproteinu glll bovinního herpesviru 1 nebo libovolného jednoho ze čtyř heparin vázajících míst mezi aminokyselinami 90 a 275 glykoproteinu glll viru vztekliny (Liang et al., Virol., 194, 233-43 (1993)); aminokyseliny 134 až 141 glykoproteinu glll viru vztekliny (Sawitzky et al., Med. Microbiol. Immunol., 182, 285-92 (1993); heparin vázající oblasti odpovídající nabitým zbytkům v pozicích 279 až 282 a 292 až 304 lidské lipoproteinové lipázy (Ma et al., citace uvedena shora); syntetický peptid obsahující 22 zbytků, N22W se sekvencí NVSPPRRARVTDATETTITISW (SEQ ID NO: 54) nebo zbytky TETTITIS (SEQ ID NO;55) tohoto syntetického peptidu modelovaného po fibronektinu, tento peptid vykazuje vlastnosti vázání heparinu (Ingham et al., Arch. Biochem. Biophys., 314, 242246 (1994)); motiv GVEFVCCP (SEQ ID NO: 56), který se nachází v ektooblasti zinek vázajícího místa prekurzorů Alzheimerova beta-amyloidového proteinu (APP), stejně jako různé jiné proteiny podobné APP, které modulují heparinovou afinitu (Bush et al., J. Biol. Chem., 229, 26618-21 (1994)); pepti obsahující 8 aminokyselin odvozený z křížové oblasti řetězce lamininu A (Tashiro et al., Biochem. J., 302, 73-9 (1994));

syntetické peptidy založené na heparin vázajících oblastech antitrombinu III, což je inhibitor serinové proteázy, zahrnující peptidy F123-G148 a K121-A134 (Tyler-Cross et al., Protein Sci., 3, 620-7 (1994)); 14 K velký fragment N-konce

APP a oblast blízkou N-konci (to je zbytky 96 až 110), které se uvádějí jako heparin vázající oblasti (Smáli et al., J. Neurosci., 14, 2117-27 (1994)); pás 21 aminokyselin růstového • · · · faktoru podobného heparin vázajícímu epidermálnímu růstovému faktoru (HB-EGF), který je charakterizován vysokým obsahem zbytků lyzinu a argininu (Thompson et al., J. Biol. Chem., 269, 2541-9 (1994)); oblast tvořená 17 aminokyselinami obsahující heparin vázající oblast trombospondinu a odpovídající syntetickému peptidů hep 1 (Murphy-Ulrich et al., J. Biol. Chem., 268, 26784-9 (1993)); sekvence 23 aminokyselin (Y565-A587) lidského faktoru von Willebranda, která váže heparin (Tyler-Cross et al., Arch. Biochem. Biophys., 306, 528-33 (1993)); peptid PRARI odvozený od fibronektinu (SEQ ID NO:57) (a větší peptidy obsahující tento motiv, jako je WQPPRARI (SEQ ID NO: 58)), který váže heparin (Woods et al., Mol. Biol. Cell., 4, 605-613 (1993); oblast vázající heparin faktoru krevních destiček 4 (Sáto et al., Jpn. J. Cancer Res., 84, 485-8 (1993); a sekvence K18K v transmembránovém glykoproteinu receptorů fibroblastového růstového faktoru pro tyrosinovou kinázu (Kan et al., Science, 259, 1918-21 (1993)).

Avšak UTV sekvence může obsahovat jiné sekvence, které se popisují v následujících příkladech. UTV sekvence se přednostně vybírá ze skupiny obsahující (SEQ ID NO:1), (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), (SEQ ID NO:4), (SEQ ID NO:5), (SEQ ID NO:20), (SEQ ID NO:22), (SEQ ID NO:24), (SEQ ID NO:26), (SEQ ID NO:28), (SEQ ID NO:30), (SEQ ID NO:32), (SEQ ID NO:34), (SEQ ID NO:36), (SEQ ID NO:38), (SEQ ID NO:40), (SEQ ID NO:42), (SEQ ID NO:46), (SEQ ID NO:48), (SEQ ID NO:49), (SEQ ID NO:50), (SEQ ID NO:51), (SEQ ID NO:52), (SEQ ID NO:53), (SEQ ID NO:54), (SEQ ID NO:55), (SEQ ID NO:56), (SEQ ID NO:57), (SEQ ID NO:58), (SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:78), (SEQ ID N0:90) a (SEQ ID NO:93). Tyto sekvence se také mohou použít v případě, že zbytky 1, 2 nebo 3 z N- nebo C-konce j^Jsou odstraněny. Protože intergenová sekvence může být libovolnou sekvencí ··· ······ · · · · «*· · · · ·«·· ··· ·· · · · · · • ····«· · · · ···· · • · · · · ··· • · · · · ·· · · · · · aminokyselin, které neinterferuji s funkcí proteinu podle vynálezu, libovolná dříve zmiňovaná UTV sekvence také může obsahovat intergenové sekvence.

Také se preferuje, aby nepřirozená aminokyselinová sekvence obsahovala aminokyselinové sekvence, které jsou ekvivalenty libovolných dříve uvedených sekvencí (to je sekvencí podobných UTV). Ekvivalentní může být sekvence, která má stejné funkce (možná se minoritně odlišuje v účinnosti) a ještě se může trochu lišit ve své aminokyselinové sekvenci nebo v jiných strukturálních rysech. Ekvivalentní sekvence je zvláště ta sekvence, která obsahuje jednu nebo více konzervativnívh aminokyselinových substitucí, konzervativní aminokyselinová substituce je aminokyselina substituovaná alternativní aminokyselinou s podobnou hustotou náboje, hydrofilicitou/hydrofobicitou, velikostí a/nebo konfigurací (např. záměna Val za lle). Nekonzervativní aminokyselinová substituce je aminokyselina substituovaná alternativní aminokyselinou, která se liší hustotou náboje, hydrofilicitou/hydrofobicitou, velikostí a/nebo konfigurací (např. záměna Val za lle).

Nukleová kyselina kódující chimérický obalový protein

Jak se uvádí dříve, nepřirozená aminokyselinová sekvence je přednostně zavedena na úrovni DNA. Vynález dála popisuje izolovanou a čištěnou nukleovou kyselinu, která kóduje obalový protein podle vynálezu, kde sekvence nukleové kyseliny, jenž kóduje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 6 (to je GGA TCC AA) , která se nachází před polyadenylačním místem. Podobně vynález přednostně popisuje izolovanou a čištěnou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 7 (to je GGA TCC ΑΆΤ AAA GAA TCG TTTGTG TTA TGT) a SEQ ID NO: 8 (to je GCC GGA TCC AAC AAG ΑΑΤ AAA GAA TCG TTT GTG • · • ·

TTA), (SEQ ID NO: 19), (SEQ ID NO: 21), (SEQ ID NO: 23), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 29), (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 33), (SEQ ID NO: 35), (SEQ ID NO: 37), (SEQ ID NO: 39), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 45), (SEQ ID NO: 47), (SEQ ID NO: 72), (SEQ ID NO: 75), (SEQ ID NO: 77) a (SEQ ID NO: 89) . Vynález dále popisuje konzervetivně modifikované varianty těchto nukleových kyselin.

Konzervativně modifikovaná varianta je variace sekvence nukleové kyseliny, jejímž výsledkem je konzervativní aminokyselinová substituce. Pro srovnání nekonzervativně modifikovaná varianta je variace sekvence nukleové kyseliny, jejímž výsledkem je nekonzervativní aminokyselinová substituce. Způsoby provedení takových modifikací jsou v oboru dobře známy a popisují se v následujících příkladech a také se mohou uskutečnit za použití komerčně dostupných souprav a vektorů (např. New England Biolabs, lne., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA). Způsoby provedení takových substitucí (např. ve smyslu ovlivnění schopnosit vázat se na buňky a vstupovat do nich) se popisují v uvedených příkladech.

Způsoby přípravy takového chimérického obalového proteinu, zvláště pak způsoby zavedení sekvence na úrovni DNA, jsou v oboru dobře známy a jsou zobrazeny pro reprezentativní chimérický protein na obrázku č. 2 a popisují se v následujících příkladech. Způsob zahrnující zavedení sekvence (přednostně sekvence SEQ ID NO: 6 nebo její konzervativně modifikované varianty) do sekvence obalového proteinu. V jednom preferovaném provedení popsaném v následujících příkladech se sekvence zavede před libovolný stop kodon nebo polyadenylační signál tak, aby se indukovala mutace výsledného proteinu posunem rámce, přičemž do chimérického proteinu se inkorporují přídavné aminokyseliny.

Obecně se toho může dosáhnout klonováním sekvence vlákna do plazmidu nebo některého jiného vektoru za účelem zjednodušení manipulace sekvence. Pak se určí restrikční místa, která lemují sekvenci a do kterých se zavede mutace posunem rámce. Dvouřetězcový syntetický oligonukleotid se vytvoří z přesahujících syntetických antisense oligonukleotidů (např.

jednořetězcových sense a ze sense a antisense

GGA TCC AAT

ΆΆΑ GAA TCG oligonukleotidů, respektive TAT GGA

TTT	GTG	TTA	TGT	TTC	AAC	GTG	TTT	ATT	TTT
AAT	TGA	AAA	ATA	AAC	ACG	TTG	AAA	CAT AAC
TTG	GAT	CCT	CCA	(SEQ	ID	NO:	10) ,	j ak	se

C (SEQ

ACA AAC popisuje na obrázku že dvouřetězcový

ID NO: 9) a

GAT TCT TTA nukleotid se začlení do restrikčních míst přesahujících cílovou sekvenci. Plazmid nebo j iný vektor se štěpí restrikčními enzymy a oligonukleotidová sekvence, která konce, se liguje do plazmidu nebo

DNA divokého typu. Mohou se také má kompatibilní kohezivní do vektoru, aby nahradila provést jiné způsoby in vitro místně řízené mutageneze, které jsou známy v oboru (zvláště použitím PCR), např. komerčně dostupné kity se mohou použít pro zavedení mutované sekvence do sekvence kódující obalový protein.

Po té co se sekvence zavede do chimérického obalového proteinu, může se izolovat fragment nukleové kyseliny kódující sekvence, např. pomocí PCR amplifikace za použití 5'a 3' primerů. Například s ohledem na chimérický vláknitý protein se může fragment izolovat PCR za použití primeru TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA (SEQ ID NO: 11) a primeru CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA (SEQ ID NO: 12), jak se ilustruje na obrázku č. 4. Použití těchto primerů uvedeným způsobem vede ke vzniku fragmentu, který obsahuje amplifikované chimérické vlákno, které lemují restrikční místa (to je v tomto případě restrikční místa Ndel a BamHI), které se mohou používat při konvenčním subklónování • · · ·

fragmentu. Mohou se také použit jiné způsoby, při kterých vzniká chimérický obalový protein.

Mutace posunem rámce se může zavést do libovolné části sekvence kódující obalový protein. S ohledem na sekvenci SEQ ID NO: 6 tato sekvence se například může umístit do oblasti genu obalového proteinu, který kóduje C-konec proteinu (to znamená, že se může přidat bezprostředně před ΤΑΆ stop kodón) nebo se může umístit na začátek kódující sekvence tak, aby ležela mezi kodóny kódující Ala (to je A) a Gin (to je Q) a produkovala dříve uvedenou kódující sekvenci SEQ ID NO:8, která kóduje chimérický protein obsahující sekvenci SEQ ID NO: 5. Podobně se může použít tento přístup pro zavedení mutace posunem rámce na začátek kódující sekvence, např. buď zavést do vnitřní sekvence (to je nativního) obalového proteinu nebo tuto sekvenci nahradit.

Avšak dvouřetězcový nukleotid může také obsahovat další restrikční místo, které se také může použít k manipulaci sekvence. Například sekvence SEQ ID NO: 6 se může zavést do vektoru, který obsahuje modifikované místo BamHI, to znamená, že místo je modifikované přidáním nukleotidů do palindromické rozpoznané sekvence. Tato sekvence se také může syntetizovat tak, aby obsahovala libovolné jiné restrikční místo vhodné pro manipulace DNA. Jestliže se uvedená sekvence zavede do sekvence obalového proteinu nedojde pouze ke vzniku mutace posunem rámce, ale může se použít k zavedení jiných kódujících sekvencí do genu obalového proteinu. Kódující sekvence zvláště zavedené tímto způsobem mohou obsahovat kodóny pro lygin, arginin a histidin nebo kodóny pro aspartát a glutamát, buď samotné nebo v libovolné kombinaci. Dále nový translační stop kodón může následovat po těchto kodónech aminokyselin, což umožňuje, aby vznikl chimérický protein, který pouza zahrnuje daný počet -příďavných aminokyselin v nepřirozené aminokyselinové sekvenci. Kodóny pro • · · · · · ···· ··· ·· · · · · · • ···· · · · · · ··· · · • · · · ♦ · · · ···· · · · · · · · · aminokyseliny a translační stop kodón se může zavést do nového restrikčniho místa indukovaného mutací posunem rámce inkorporavaného do obalového proteinu pomocí syntetizujících oligonukleotidů, které obsahují tyto sekvence, jenž jsou lemovány, jak se popisuje v předchozím textu, restrikčním místem (např. obsahují 5' a 3' BamHI místa) nebo jiným způsobem, který je znám v oboru.

Velikost DNA používané k záměně sekvence vázající nativní receptor může být vynucena například bráněním zabalení vlákna nebo nesprávným sestavení komplexu pentonové báze/vlákna. DNA kódující dříve uvedené aminokyselinové sekvence (např. lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát a podobně) se preferuje při inzerci do genové sekvence vlákna, kde se odstranila sekvence vázající nativní receptor nebo došlo k mutaci této sekvence jiným způsobem. Avšak jiné sekvence DNA, takové jako jsou ty, které kódují aminokyseliny sloužící pro inkorporaci do intergenových sekvencí, se přednostně používají k záměně sekvence kódující nativní obalový protein.

Vektor obsahující chimérický obalový protein

Vektor podle vynálezu je nástroj sloužící k přenosu genu. Tak tomuto termínu rozumí odborník. Podle vynálezu jsou čtyři typy vektorů plasmidy, fágy, viry a liposomy. Plasmidy, fágy a viry se přenášejí do buňky ve formě nukleové kyseliny a lipozómy se mohou použít k přenosu nukleových kyselin. Vektory, které se používají pro transfer genů se zde nazývají přenosové vektory.

Přednostně vektor podle vynálezu je virus, speciálně vybraný ze skupiny, která zahrnuje viry bez obalu, to je RNA nebo DNA viry bez obalu. Virus se může také vybrat ze skupiny, která zahrnuje viry s obalem,'/o je obalené RNA nebo DNA viry. Takové viry přednostně obsahují obalový protein.

• · ·· ··· · • · • · * 4 « · · · · · « · · · · · ···· ······ · · · ·· · · · • · ··· · · · ···· · ·· · · · ··

Virový obalový protein vyčnívá z kapsidu tak, že je schopný interakce s buňkami. V případě obalených RNA nebo DNA virů se upřednostňuje, aby obalový protein byl lipidový obalový glykoprotein (tzv. spike nebo peplomer).

Zvláště upřednostňovaný vektor je neobalený virus (to znamená buď RNA nebo DNA virus) z čeledi Hepadnaviridae,

Parvoviri dae,

Papovaviri dae,

Adenoviridae nebo

Picornaviri dae.

Preferovaný neobalený virus podle vynálezu je virus z čeledi Hepadnaviridae, zvláště rod Hepadnavirus. Virus s čeledi Parvoviridae je rodu Parvovirus (např. savčí a ptačí parvoviry) nebo Dependovirus (např. adenoasociované viry (AAV)). Virus z čeledi Papovaviridae je přednostně z podčeledi

Papillomavirinae (např. papilomaviry, které například zahrnují lidské papilomaviry (HPV)

1-48) nebo z podrodiny

Polyomavirinae (např. polyomaviry zahrnující JC,

SV40 a virus BK) . Virus čeledi Adenoviridae je rodu Mastadenovirus (např. savčí adenoviry) nebo Aviadenovirus (např. ptačí adenoviry). Virus z čeledi Picornaviridae je přednostně virus hepapatitidy A (HAV), virus hepapatitidy B (HBV) nebo virus ani hepatitidy A ani hepatitidy B.

Podobně vektorem může být obalený virus čeledi Herpesviridae nebo Retroviridae nebo to může být Sindbis virus. Preferovaným obaleným virem podle vynálezu je virus čeledi Herpesviridae, zvláště podčeledi nebo rodu Alphaherpesvirinae (např. virus podobný viru herpes simplex), Simplexvirus (např. virus podobný viru herpes simplex), Varicellavirus (např. varicella a virus podobný viru vztekliny), Betaherpesvirinae (např. cytomegalovirus) , Cytomegalovirus (např. lidské cytomegaliviry), Gammaherpesvirinae (nepř. lymfocyty-asociované viry) a Lymphocryptovirus (např. virus podobnýEB viru).

»· 9·· ·

Jiným preferovaným obalovým virem je RNA virus čeledi Retroviridae (to je přednostně retrovirus), zvláště virus rodu nebo podčeledi Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae a Lentivirus. RNA virus podčeledi Oncovirinae je lidský T-lymfotropní virus typu 1 nebo 2 (to je HTLV-1 nebo HTLV-2) nebo bovinni virus leukémie (BLV), ptačí virus leukosarkomu (např. Rous sarkoma virus (RSV)), ptačí virus myeloblastózy (AMV) , ptačí virus erytroblasozy (AEV), Rousasociovaný virus (RAV)-1 až 50, RAV-0), savčí virus typ C (např. Moloneyův virus myší leukémie (MuLV), Harveův virus myšího sarkomu (HaMSV), Abelsonův virus myší leukémie (AMuLV), AKR-MuLV, kočičí virus leukémie (FeLV) , opičí virus sarkomu, virus retikuloendotheliózy (REV), viru nekrózy sleziny (SNV)), virus typu B ( např. myší virus nádoru prsní žlázy (MMTV) ) nebo virus typu D (např. Mason-Pfizerův opičí virus (MPMV)), viry SAIDS). RNA virus podčeledi Lentivirus je virus lidské imunonedostatečnosti typ 1 nebo 2 (to je HIV1 nebo HIV 2, kde HIV-1 je formálně nazýván lymfadenopatieasociovaný virus 3 (HTLV-III) a virus získaného syndromu imunitní nedostatečnosti (AIDS) (ARV)) nebo jiný určený virus příbuzný s HIV-1 nebo HIV-2, který je spojovaný s AIDS nebo s nemocemi, které jsou podobné AIDS. Zkratka HIV nebo termíny virus AIDS nebo virus lidské imunonedostatečnosti zde označují obecně viry HIV, viry příbuzné HIV a HlV-asociované viry. Avšak virus RNA podčeledi Lentivirus je přednostně virus Visna/maedi (např. takový, který infikuje ovce), kočičí virus imunonedostatečnosti (FIV), bovinni lentivirus, opičí virus imunonedostatečnosti (SIV), koňský virus infekční anémie (EIAV) nebo kozí artritidový-encefalitidový virus (CAEV) .

Zvláště preferovaným vektorem podle vynálezu je adenovirový vektor (to je virový vektor čeledi Adenoviridae v optimálním případě rodu Mastadenovirus). Takovým vektorem je ·· · ·· ···· • · · · · · ·· ·· • · · · · · • ···· · · · · • · · · · • ·· · · ·« · • · · · • · ·· ··· · ♦ • · · • · · ·♦ ·· vektor Ad2 nebo Ad5, přičemž se mohou použit i adenovirové vektory jiných sérotypů. Adenovirový vektor používaný pro přenos genu může být vektor divokého typu (to je kompetentní k replikaci). V jiném případě adenovirový vektor obsahuje genetický materiál s nejméně jednou modifikací, která způsobuje, že virus se nereplikuje. Modifikace adenovirového genomu může zahrnovat, ale není omezena na přidání segmentu DNA, nové uspořádání segmentu DNA, deleci segmentu DNA, nahrazení segmentu DNA nebo zavedení léze DNA. Velikost segmentu DNA se může pohybovat od 1 nukleotidu do 36 kbp (to je přibližně velikost adenovirového genomu) nebo v jiném případě se může rovnat maximálnímu množství nukleotidů, které lze zabalit do adenovirového virionu (to je okolo 38 kb). Preferované modifikace adenovirového genomu zahrnují modifikace oblastí El, E2, E3 nebo E4. Podobně adenovirový vektor se může kointegrovat, to znamená ligace adenovirových sekvencí, s jinými sekvencemi, jako jsou jiné virové nebo plazmidové sekvence.

Virový vektor (to je zvláště replikačně deficitní adenovirový vektor) může obsahovat buď plné kapsidy (to znamená, že zahrnuje virový genom, jako je adenovirový genom) nebo prázdné kapsidy (to znamená, že neobsahuje virový genom nebo virový genom je degradován, např. fyzikálním nebo chemickým způsobem). Vzhledem k tomu, že existují způsoby přenosu virů, plaSmidů a fágů ve formě sekvencí nukleových kyselin (to je RNA nebo DNA) , vektor (to je přenosový vektor) podobně může obsahovat RNA nebo DNA v nepřítomnosti libovolného asociovaného proteinu, jako je kapsidový protein a v nepřítomnosti libovolného obalového lipidu. Podobně, vzhledem k tomu, že liposomy ovlivňují vstup do buňky fúzováním s buněčnou membránou, transferový vektor může obsahovat lipogomy (např. ty, které'”jsou běžně dostupné, Life Technologies, Bethesda, MD) s konstitutivními nukleovými • · • · ··· ·· ····· ··· ·· 9···· • ···· · · · · · ··· · · • · ···· · · ···· · ·· 9 ···· kyselinami, které kóduji obalový protein. Pak podle vynálezu, zatímco vektor obsahuje chimérický adenovirový obalový protein, transferový vektor kóduje chimérický adenovirový obalový protein; liposomové transferové vektory zvláště kódují ve smyslu, že obsahují nukleovou kyselinu, která ve skutečnosti kóduje protein.

Vektor podle vynálezu může obsahovat přídavné sekvence a mutace, např. některé v samotném obalovém proteinu. Vektor podle vynálezu dále přednostně obsahuje nukleovou kyselinu obsahující cizorodý gen.

Nukleová kyselina je polynukleotid (DNA nebo RNA) . Gen je libovolná sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein nebo nascentní molekulu RNA. Cizorodý gen je libovolný gen, který se podle vynálezu typicky nenachází ve vektoru a není do něho ani subklónován (např. transferový vektor) a který je při zavedení do hostitelské buňky doprovázen zjistitelnou změnou intracelulárního prostředí (např. zvýšeným množstvím DNA, RNA, peptidu nebo proteinu, nebo změněnou rychlostí produkce nebo degradace těchto látek). Genový produkt je buď ještě nepřeložená molekula RNA přepsaná z danného genu nebo kódující sekvence (např. mRNA nebo antisense RNA) nebo polypeptidový řetězec (to je protein nebo polypeptid) přeložený z molekuly mRNA přepsané z danného genu nebo kódující sekvence. Zatímco gen obsahuje kódující sekvence a zároveň libovolné nekódující sekvence, kódující sekvence nezahrnuje žádnou nekódující (např. regulační) DNA. Gen nebo kódující sekvence je rekombinantní, jestliže báze po celé délce molekuly se liší od sekvence, kde se typicky gen nebo kódující sekvence nacházejí v přírodě nebo jestliže se sekvence bází typicky v přírodě nenachází. Podle vynálezu gen nebo kódující sekvence se může připravit zcela nebo částečně synteticky, může • «

obsahovat genomovou nebo komplementární sekvence DNA (cDNA) a může se vyskytovat buď ve formě DNA nebo RNA.

Nekódující sekvence nebo regulační sekvence zahrnuji promotorové sekvence. Promotor je sekvence DNA, která řídi navázáni RNA polymerázy a tím podporuje syntézu RNA.

Zesilovače jsou cís-působici elementy DNA, které stimuluji nebo inhibuji transkripci přilehlých genů. Zesilovač, který inhibuje transkripci se také nazývá tlumič. Zesilovače se liší od DNA vázajících míst určených pro sekvenčně specifické DNA vazajici proteiny, které se nachází pouze v promotoru (které se také nazývají promotorové elementy), ve kterých zesilovače mohou fungovat v libovolné orinetaci a na vzdálenost až několik párů kilobazi dokonce z pozice downstream přepisované oblasti.

Podle vynálezu kódující sekvence je operabilně spojena s promotorem (např.

když kódující sekvence i promotor tvoři cizorodý gen), když promotor je schopný řídit transkripci uvedené kódující sekvence.

Cizorodý gen je libovolný gen a jde buď o terapeutický gen nebo o reportni gen. Preferuje se, aby cizorodý gen byl s výhodou schopný exprese v buňce, do které se vektor internalizoval. Například cizorodý gen může obsahovat reportni gen nebo sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein, jenž se může v buňce určitým způsobem detekovat. Cizorodý gen může také zahrnovat terapeutický gen, který např. ovlivňuje množství RNA nebo proteinu. Například protein kódovaný přeneseným terapeutickým genem se může použít při léčbě dědičných nemoci, jako je např. transmembránové konduktance regulační cDNA u cystická fibrózy při léčbě cystické fibrózy. Protein kódovaný terapeutickým genem může způsobit i odumřeni buňky. Například samotná exprese genu může vést k usmrceni buňky, jako 'např. exprese genu diftériového toxinu A, nebo exprese genu může propůjčit buňkám selektivní senzitivitu k fatálnímu působeni jistých léků, např. exprese genu HSV tymidinové kinázy umožňuje buňkám být citlivé na antivirovou látku, která zahrnuje acyklovir, gancyklovir a FIAU (1-(2-deoxy-2-fluoro-p-Darabinofuranosil) -5-J.odouracil) .

Terapeutický gen může působit na množství RNA, např. kódováním antisense message nebo ribo$ómu, proteinu, který způsobuje sestřih nebo zpracování 3' konce (např. polyadenylace) nebo může kódovat protein, který působí na sílu exprese jiného genu v buňce (kde se uvažuje, že exprese genu zahrnuje všechny kroky od iniciace transkripce přes produkci zpracovaného proteinu) , možná mezi dalšími může zprostředkovat změnu rychlosti akumulace mRNA, změnu transportu mRNA a/nebo změnu v post-transkripční regulaci. Použití termínu terapeutický gen zdůrazňuje tyto a další provedení, které se běžněji nazývají genovou terapií a jsou dobře známy v oboru. Podobně rekombinantní adenovirus se může použít v případě genové terapie nebo ke studiu účinků exprese genu v danné buňce nebo v tkáni in vitro nebo in vivo.

Rekombinantní adenovirus obsahující chimérický obalový protein a rekombinantní adenovirus, který dále obsahuje cizorodý gen nebo geny, které jsou schopné se exprimovat v určité buňce, se připravují použitím transferového vektoru, upřednostňuje se virový nebo transferový vektor v souladu s vynálezem. Takový transferový vektor přednostně obsahuje sekvenci genu chimérického adenovirového obalového proteinu, jak se popisuje shora. Sekvence genu chimérického obalového proteinu obsahuje nepřirozenou sekvenci v místě nativní sekvence, jenž se odstranila nebo vedle uvedené nativní sekvence.

Rekombinantní sekvence genu chimérického obalového proteinu (jako je sekvence genu vlákna) se může za účelem exprese a zhodnocení receptorové a proteinové specifity a avidity, trimerizačního potenciálu, jiných biochemických charakteristik, transferového vektoru do bakuloviru vázání pentonové báze a přenést z adenovirového nebo vhodného eukaryontní expresivní vektory, které obsahují chimérického adenovirového se sekvence genu vlákna).

podle shora obalového proteinu Tyto vektory také uvedené definice.

prokaryontního nebo eukaryontního expresivního vektoru.

Vynález také popisuje rekombinantní bakulovirové a prokaryontní a sekvenci genu (upřednostňuj e jsou transferové vektory

Sekvence genu chimérického obalového proteinu (např. sekvence genu vlákna) zahrnuje nepřirozenou sekvenci vedle nativní aminokyselinové sekvence nebo která je schopna se navázat na protein (např. vláknitý protein) je tomu u nativní sekvence. Přenosem chimérického genu z adenovirového vektoru do bakuloviru nebo prokaryontního nebo eukaryontního expresivního vektoru, je možné dosáhnout vysoké exprese proteinu (přibližně 5 až 50% celkového proteinu je chimérický protein).

Vektor podle vynálezu dále může obsahovat další které ovlivňují schopnost obalového proteinu, jako které obsahují místě nebo vně na místě uvedené sekvence, chimérický obalový vazebném místě než výsledný na jiném

Přenosem chimérického sekvence, je trimerizace vláknitého proteinu nebo proteázovou rozeznávající sekvenci, na kódující sekvence obalového proteinu.

Sekvence, která ovlivňuje schopnost trimerizace je jedna nebo více které umožňují trimerizaci chimérického obalového proteinu,

Sekvence, která sekvence, která odstranění chimérického sekvencí, kterým je vláknitý protein, proteázovou rozeznávací sekvenci je štěpit proteázou, přičemž způsobuje obalového proteinu (nebo rekombinantního adenoviru na jeho buňku obsahuje se může obalového proteinu. V případě, kterým je vláknitý protein, části) a zachycení prostřednictvím jiného používá obalový protein, proteázové rozeznávací místo s že se • · · · ··· · · · ···· • « · ·· · · · · · • ······ · · · · · · · · • · · · · · · · ···· · ·· · ·· · · výhodou neovlivňuje trimerizaci vlákna nebo receptorovou specifitu vláknitého proteinu. Například v jednom provedení vynálezu je s výhodou vláknitý protein nebo jeho část odstraněna prostřednictvím proteázové rozeznávací sekvence a pak se nové vazebné místo na povrchu buňky inkorporovalo buď do pentonové báze nebo do hexonového obalového proteinu, přičemž se upřednostňuje použití intergenové sekvence, jak se popisuje dříve v textu.

Co se týká přípravy vektorů a transferových vektorů podle vynálezu konstruují se za použití standardních molekulových a genetických metod, které jsou známy v oboru. Vektory (např. viriony nebo virové partikule) se připravují za použití virových vektorů. Například virový vektor obsahující chimérický obalový protein podle vynálezu se může zkonstruovat tak, že do buňky, která neobsahuje kompletní E4 sekvence, se zavede (1) lineární vektor obsahující chimérické vlákno a gen E4 divokého typu a (2) lineární vektor, který neobsahuje E4, jak je zobrazeno na Obr. 3. Následující příklady ukazují, že tato metodologie vede k rekombinaci mezi sekvencemi, které generují vektor obsahující část počátečního vektoru bez E4 a část vektoru E4⁺, zvláště oblast obsahující sekvence chimérického vlákna.

Podobně partikule obsahující vláknitou chiméru vznikají ve standardních buněčných liniích, např. v těch, které se používají v případě adenovirových vektorů. Pak následuje produkce a izolace. Partikule, ve kterých má být vlákno odstraněno, se stávají bezvláknové prostřednictvím štěpení partikul! se sekvenčně specifickou proteázou, která štěpí vláknité proteiny a uvolňuje je z virových partikul!, čímž vznikají bezvláknové partikule. Například trombin rozeznává a štěpí známé aminokyselinové sekvence, které se mohou inkorporovat do vektoru (Stenflo eť al.,' J. Biol. Chem., 257, 12280-12290 (1982)). Podobně se při konstrukci vektoru mohou • · • · · · • · ··· ·· ····· • · · ·· ····· • ······ · · · ···· · • · ······ • · · · · ·· · ·· · · použít deleční mutanti, kterým chybí gen vlákna. Jsou to například H2dl802, H2dl807 a H2dll021 (Falgout et al., J.

Virol., 62, 622-625 (1988)). Tyto bezvláknité partikule vykazují stabilitu a schopnost vázat na buňky a infikovat je (Falgout et al., J. Virol., 62, 622-625 (1988)). Tyto výsledné partikule se pak směřují do specifických tkání prostřednictvím pentonové báze nebo jiného obalového proteinu, upřednostňuje se také jiný obalový protein, který obsahuje jednu nebo více nepřirozených aminokyselinových sekvencí podle vynálezu.

V jiném případě může odstraněním nativní oblasti knob, která obsahuje oblast trimerizace a oblast navázání receptorů vláknitého proteinu, a jejím nahrazením nepřirozenou oblastí trimerizace a nepřirozenou aminokyselinovou sekvencí, vzniknout rekombinantní adenovirus obsahující chimérický vláknitý protein, který má další modifikace (Peteranderl et al., Biochemistry, 31, 12272-12276 (1992)) podle vynálezu.

Rekombinantní adenovirus obsahující chimérický vláknitý protein může také vznikat bodovou mutací v oblasti knob a izolací klonů, které jsou schopny trimerizace. V každém případě a také s ohledem na odstranění a nahrazení nativní receptor specifické vazebné sekvence, jak se popisuje shora, k C-konci vláknitého proteinu nebo do exponovaných smyček vláknitého proteinu lze přidat vazebné domény nového proteinu zavedením jedné nebo více kopií sekvence nukleové kyseliny, která kóduje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci, do vhodné polohy. Takový vláknitý protein má s výhodou schopnost trimerizace tak, že je schopný vázat protein na bázi pentonu.

Shora popsaný způsob tvoření chimérického vláknitého proteinu se může použít pro přípravu dalších cimerických obalových proteinů, například chimérického hexonového nebo pentonového proteinu.

Názorná použití • ······ · · · ··· · · • · ··· ··· • · · · · ·· · · · · ·

Vynález popisuje chimérický protein, který je schopný se vázat na buňky a zprostředkovat s vysokou účinností vstup do těchto buněk, stejně jako vektory a transferové vektory. Samotný chimérický obalový protein má několik použití, například může být nástrojem in vitro studií navázání adenoviru na buňky (např. Scatchardovou analýzou, jak dříve v textu popsal Wickham et al. Cell, 73, 309-319 (1993)) za účelem zablokování navázání adenoviru na receptory in vitro (např. použitím protilátek, peptidů a enzymů, jak se popisuje v příkladech) a ochrany proti adenovirové infekci in vivo, přičemž dochází k soutěžení při navázání na vazebná místa, kterými adenovirus vstupuje do buňky.

Vektor obsahující chimérický obalový protein se také může použít při tvorbě kmene a při přípravě nových vektorů. Například nepřirozená aminokyselinová sekvence se může vázat na nukleové kyseliny a může se intracelulárně zavést ve smyslu tvoření nových vektorů prostřednictvím rekombinace. Podobně se vektor může použít při genové terapii. Například vektor podle vynálezu se může použít při léčbě řady nemocí zavedením opravné DNA do cílových buněk. To znamená, že jde o DNA, která kóduje funkci, jenž se buď v buňce nevyskytuje nebo je poškozena, nebo kóduje jednotlivá činidla usmrcující buňky, například DNA kódující cytotoxin, který je aktivní pouze uvnitř buňky. Mezi nemoci, které je možné léčit uvedeným způsobem patří například rakovina, např. melanom, gliom nebo rakovina plic; genetické poruchy, např. cystická fibróza, hemofilie nebo svalová dystrofie; patogenní infekce, např. HIV, tuberkulóza nebo hepatitida; onemocnění srdce, např. prevence restenózy následující angioplastie nebo podpora angiogeneze reperfúzí nekrotické tkáně; a poruchy autoimunity, např. Crohnova nemoc, kolitida nebo revmatická artritida.

• · · · · ···· ·· ·· ··· ·· · ···· ··· ·· · · · · · • ······ · · · ···· · • · · · · » · · • · · · · · · · · · ··

Genová terapie zvláště probíhá při léčbě nemocí, poruch nebo stavů, které jsou spojeny s poruchami různých tkání, kterým chybí vysoké množství receptorů, na něž se váže vláknitý protein adenoviru divokého typu a pro něž současné přístupy ke genové terapii, která je zprostředkována adenoviry, nejsou optimální (např. v případě zavedení do monocytu/makrofágů, fibroblastů, neuronů, buněk hladkého svalstva a epiteliálních buněk). Tkáně obsahující tyto buňky (a onemocnění, poruchy nebo stavy s nimi spojené) zahrnují, ale nejsou omezeny na endotelium (např. angiogenezi, restenózu, zánět a nádory); neuronová tkáň (např. nádory a Alzheimerova nemoc); epitelium (např. poruchy kůže, sítnice, střev a plic); hematopoietické buňky (např. HIV-1, HIV-2, rakovina a anémie); hladké svalstvo (např. restenóza) a fibroblasty (např. zánět).

Avšak místo přenášení terapeutického genu se za použití vektorů (zvláště adenovirových vektorů) může přenést reportní gen nebo některý typ značícího genu. Značící a reportní geny se mohou použít například při diferenciaci buněk a při studiích odumírání buněk, stejně jako pro účely diagnostiky. Standardní reportní gen, jako je β-galaktozidáza, což je gen, který kóduje zelený fluorescenční protein (GFP) nebo gen βglukuronidázy se může použít in vivo, například při testu živého hostitele nebo při odstraňování cílových buněk (např. Minden et al., Biotechniques, 20, 122-129 (1996); Youvan,

Science, 268, 264 (1995); US Patent 5,432,081; Deonarain et al., Br. J. Cancer, 70, 786-794 (1994)).

Podobně může být vhodné k přenesení genu použít hostitele v podstatě jako prostředek in vivo produkce určitého proteinu. Za tímto účelem se používají transgenní zvířata, například pro produkci rekombín.antních polypeptidů v mléce transgenního bovinniho druhu (např. mezinárodní přihláška PCT WO 93/25567) . Dále se geny mohou přenášet za

účelem jiným než jsou terapeutické důvody, jako je studium lidských onemocnění za použití zvířecího modelu (např. použití transgenních myší a jiných transgenních zvířat, jejichž gen nádorového supresoru je vyřazen s funkce, pro účely tumorogenních studií, použití transgenního modelu při poruše tolerance na glukózu a v případě Alzheimerových amyloidových prekurzorových proteinových modelů při studiích metabolizmu glukózy a patogeneze Alzheimerovy nemoci atd.

Tyto názorná použití uvedená shora v textu nejsou zdaleka vyčerpávající a je zřejmé, že vynález zdůrazňuje také další použití, která vycházejí z popisu vynálezu. Podobně zde existuje řada výhod, které jsou spojeny s různými aspekty vynálezu.

Použití univerzálního cíleného vektoru podle vynálezu je výhodné z těchto důvodů: (1) vektor se může potencionálně používat pro všechny buňky a tkáně; (2) ve všech buněčných liniích je možné použít pouze jeden vektor, nemusí se provádět kotransfekce nezávislým vektorem; (3) vektor je schopný umožnit zavedení genu s vyšší účinností, než se pozoruje u vektorů, které obsahují vláknitý protein divokého typu; (4) vektor, podobně jako předchozí vektory, nejsou specifické k určitým buňkám; (5) v případě, že se vektor používá v redukované dávce, dávka se srovnává s vektorem obsahujícím vláknitý protein divokého typu (to je multiplicita infekce (MOI)), je schopný zprostředkovat transfer genu a tak pravděpodobně redukovat s dávkou spojený nedostatek, který doprovází současně dostupné adenovirové vektory; a (6) vektor se může pomnožit a udržovat za použití současně dostupných buněčných linií.

Schopnost univerzálního cíleného vektoru, jako je univerzální cílený adenovirový vektor, potencionálně se vázat na všechny nebo na většinu tkání a vstupovat do nich má několik výhod. Mezi tyto výhody patří zvýšená účinnost zavedeni genu do mnoha tkání, schopnost jednotlivého vektoru zavést geny do všech tkání a zjednodušení produkce komponentů nezbytných pro zavedení genu. Takový univerzální cílený vektor obsahuje potenciál pro zavedení exogenní DNA do buněk způsobem piggy backing, kdy DNA se připojí k vektoru na základě interakce protein/DNA.

Další potencionální výhody takového univerzálního cíleného vektoru zahrnují podstatně zvýšenou účinnost zavádění (např. zvýšení 10 až 100 krát) do buněk, které exprimují nízké množství receptorú vlákna, na který se váže vláknitý protein divokého typu, stejně jako zvýšenou účinnost exprese receptorú vlékna buněk nebo tkání, které exprimují receptor vlákna, na něž se váže vlákno divokého typu. Jestliže se vektory používají v redukované dávce povede to ke snížení výskytu zánětů, které jsou spojeny s adenoviry; ke snížení výskytu humorální odezvy na adenoviry a cytotoxické odezvy T-lymfocytů na adenovirus.

Dále vektor je výhodný v tom, že se může izolovat a čistit běžným způsobem. Vzhledem k tomu, že změny ve vektoru se provádějí na úrovni genomu, nevyžadují se nevhodné a nákladné post-produkční modifikace, které jsou spojeny s jinými vektory (např. Cotten et al., (1992), citace uvedena shora; Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 6099-6103 (1992). Podobně nejsou nutné speciální linie buněk exprimující receptor. UTV vektor se může pomnožit na stejný titr, kterého dosahuje vektor divokého typu, který nemá vláknité modifikace.

Způsoby aplikace

Vektory a transferové vektory podle vynálezu se mohou použít ke kontaktu buněk buď in vitro nebo in vivo. Termín kontaktování podle vynálezu znamená libovolný způsob, kterým je vektor zaveden intracelulárně; způsob nezávisí na • φ φ φ • ······ φ φ φ φφ φ φ φ • · ··· φ φ φ ···· · · · φ φφ φφ jakémkoli určitém způsobu zavedení a není tak vykládán. Způsoby zavedení jsou v oboru dobře známy a jsou také zde uvedeny.

Zavedení může být provedeno buď in vitro (např. způsobem genové terapie typu ex vivo nebo při studiu tkáňových kultur) nebo in vivo elektroporací, transformací, transdukcí, konjugací nebo triparentálním matováním, (ko-)transformací, (ko)infekcí, membránovou fúzí s kationtovými lipidy, bombardováním projektily obalenými DNA při velkých rychlostech, inkubace se sraženinami fosforečnan vápenatýDNA, přímou mikroinjektáží do jednotlivých buněk a podobně. Vektory se mohou podobně zavést pomocí kationtových lipidů, např. liposomů. Takové liposomy jsou běžně dostupné (např. Lipofectin®, Lipofectamine™ a podobně, tyto produkty dodává firma Life technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Podle vynálezu je možno použít liposomů, které mají zvýšenou kapacitu přenosu a/nebo redukovanou toxicitu in vivo (např. patentová přihláška PCT WO 95/21259). Existují i jiné dostupné metody, které jsou dobře známy v oboru.

Termín hostitel podle vynálezu (a pak buňka hostitele) znamená libovolného hostitele, do kterého se může zavést vektor podle vynálezu, což může být např. zvíře, obojživelník, pták, ryba, hmyz, plaz nebo savec např. hlodavec , primáti (jako jsou šimpanz, opice, bezocasá opice, gorila, orangutan nebo gibon), kočkovité šelmy, psovité šelmy, kopytnatci (jako jsou přežvykavci nebo prasata) a zvláště člověk.

Jestliže univerzální cílový vektor zjevně vstupuje do všech buněk, pak buňka může být libovolná buňka, do které takový vektor může vstoupit. Univerzální cílový vektor se může zvláště použít při transferu genu do buňky, která exprimuje nízké nebo nedetekovatelné množství receptoru vlákna. Mezi tyto buňky patří např. endoteliální, neuronové, • · ··· · 9 9 9 9 9 9

999999 9 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 hemato poietické nebo fibroblastové buňky nebo buňky hladkého svalstva.

Je nutné vyvinout vhodnou metodu aplikace vektoru (zvláště adenovirového vektoru) podle vynálezu na zvíře pro účely genové terapie (např. Rosenfeld et al., Science, 252, 431-434 (1991); Jaffe et al., Clin. Res. 39 (2), 302A (1991); Rosenfeld et al., Clin Res., 39(2), 311A (1991); Berkner,

BioTechniques, 6, 616-629 (1988)). Jsou dostupné metody chemoterapie a vakcinace a ačkoli se může použít více jak jedna cesta aplikace, určitý způsob aplikace může umožnit okamžitou nebo účinější reakci ve srovnání s jiným způsobem. Farmaceuticky přijatelné ekcipienty jsou také v oboru dobře známy a jsou dostupné. Volba excipientu se stanoví částečně v závislosti na způsobu aplikace rekombinantího vektoru. Existuje řada vhodných formulací, které se používají v souladu s vynálezem. Následující metody a excipienti jsou pouze příklady a nejsou limitující.

Formulace vhodné pro případ orální aplikace může zahrnovat (a) kapalné roztoky, jako je účinné množství látky rozpuštěné v rozpouštědle, kterým je voda, fyziologický roztok nebo pomerančový džus; (b) kapsule, váčky nebo tablety, kde každá obsahuje převláající množství aktivní látky, jako jsou pevné látky nebo granule; (c) suspenze ve vhodném roztoku; a (d) chodné emulze. Tabletové formy mohou zahrnovat jednu nebo více látek, kterými jsou laktóza, manitol, kukuřičný škrob, bramborový škrob, mikrokrystalickou celulózu, arabskou gumu, želatinu, koloidový silikonový dioxid, karmelóza sodíku, talek, sterát magnézia, stérická kyselina a jiné excipienty, barviva, rozpouštědla, pufrující činidla, zvlhčovači činidla, konzervační činidla, aromatizační přísady a farmaceuticky kompatibilní excipienty. Lozengové formy mohou obsahovat aktivní dochucující látky, obvykle cukrózu a arabskou gumu nebo tragakant, stejně jako • · · · • · pastilky obsahující aktivní ingredience v inertní bázi, jako je želatina a glycerin nebo sachróza a arabská guma, emulze, gely a podobně, které obsahují navíc aktivní látky, jako jsou excipienty dobře známé v oboru.

Samotný vektor nebo transferový vektor podle vynálezu nebo v kombinaci s jinými vhodnými komponenty se mohou připravit jako aerosolové formulace, které se aplikují inhalací. Tyto aerosolové formulace se plní spolu tlakovanými přijatelnými hnacími látkami, jako jsou dichlorodifluorometan, propan, dusík a podobně. Mohou se také připravovat jako léčiva ve formě natlakovaných přípravků, jako jsou zmlžovače nebo atomizéry.

Formulace vhodné pro parenterální aplikaci zahrnuje vodné a nevodné, izotonické, sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty a rozpuštěné látky, které tvoří přípravek izotonický s krví zamýšleného recipienta a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendující činidla, rozpouštědla, stabilizátory, zahušťovadla a konzervační činidla. Přípravky se mohou balit do vzduchotěsně uzavřených kontejnerů v jednotkové dávce nebo v multi-dávkách, jako jsou ampule a láhvičky a mohou se skladovat lyofilizovaném stavu, což vyžaduje pro aplikaci injekcí pouhé přidání sterilního kapalného excipientu, například vody, těsně před použitím. Injekční roztoky a suspenze podle receptu se mohou připravit ze sterilních prášků, granulí a tablet, které jsou popsány dříve v textu.

Navíc vektor nebo transferový vektor podle vynálezu se může připravit ve formě čípků tak, že se smíchá s různými bázemi, jako jsou emulgační báze nebo ve vodě rozpustitelné báze.

Formulace vhodné pro vaginální' aplikaci se mohou připravit jako pesary, tampóny, krémy, gely, pasty, pěny nebo sprayové přípravky obsahující mimo aktivní látky také nosiče, o kterých je známo, že jsou vhodné.

Dávka aplikovaná zvířeti, zvláště pak člověku v souladu s vynálezem kolísá v závislosti na použitém genu, na použité kompozice, na způsobu aplikace a na určitém místě a organizmu, který se léčí. Dávka může být dostatečná pro vyvolání terapeutické odezvy.

Jak se uvádí v předchozím textu, vektor nebo transferový vektor podle vynálezu se také využívá in vitro. Takový vektor se používá jako prostředek výzkumu při studiu zachycení adenoviru na buňkách a jejich infekce a při metodě testování interakce vazebné místo-ligand. Podobně rekombinanntí obalový protein, který obsahuje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci přiřazenou nebo na místě nativní sekvence vázající receptor, se může použít v testech receptor-ligand a jako adhezivní proteiny in vitro nebo in vivo. Následující příklady dále ilustrují tento vynález.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je sloupcový graf zobrazující vázání adenoviru divokého typu (jako procento vstupu) na buňky získané z různých tkání.

Na obrázcích č. 2A až B je znázorněno připojení sekvence nukleové kyseliny na konec genu vlákna adenovirového divokého typu (Obr. 2A) , přičemž vzniká chimérický adenovirový vláknitý protein (Obr. 2B), který obsahuje nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci na karboxylovém konci. Jak je znázorněno, délka polyA ocasu a následně počet lyzinů ve výsledném proteinu může kolísat.

Obrázek č. 3 ukazuje schématický diagram znázorňující konstrukci adenovirového transferového vektoru, který obsahuje chimérický vláknitý protein pAd BS 59-100 UTV způsobem intermediárních transferových vektorů. Zvláště pAd

NS 83-100 (také znám jako pl93NS 83-100 nebo pNS 83-100) se používal pro vnik pAd NS 83-100 bez vlákna (F~) (také znám jako pl93NS (ÁF) nebo pNS (ÁF) ) (cesta A) , pAd NS 83 100 (F”) se použil ke vzniku pAd NS 83-100 UTV (také znám jako pl93NS (F5*) , pl93 (F5*) nebo (pNS (F5*) ) (způsob B) a pAd NS 83-100 UTV se použil pro vznik pAd BS 59-100 UTV (způsob C).

Obrázky č. 4A až D znázorňuji oligonukleotidy, které se používají při konstrukci GV10 UTV, to je primery o sekvenci SEQ ID No: 9 (Obr. č. 4A) , SEQ ID NO: 10 (Obr. 4B) , SEQ ID NO: 11 (Obr. č. 4C) a SEQ ID NO: 12 (Obr. č. 4D).

Obrázek č. 5 znázorňuje analýzu westernovým přenosem, která ukazuje nárůst velikosti chimérického adenovirového vláknitého proteinu (UTV), která se srovnává s vláknitým proteinem divokého typu (WT).

Obrázky č. 6A až B znázorňuji grafy vykazující srovnáni navázání adenovirového vektoru, který obsahuje vláknitý protein divokého typu (to je GV10, prázdný trojúhelník), a adenovirového vektoru, který obsahuje chimérický vláknitý protein (to je GV UTV, plný kruh) na buňky s receptorem (A549, Obr. č. 6A) a bez receptorů (HS 68, Obr. 6B).

Obrázek č. 7 je graf vázaného UTV (počet za minutu (CPM)) proti množství kompetitoru (gg/ml) inhibice navázáni chimérického adenovirového vláknitého proteinu na buňky bez receptorů (to je HS 68 fibroblasty) pomoci rozpustných faktorů sulfát chondrotinu (prázdný kruh); heparin (plný kruh); mucin (plný trojúhelník) a DNA spermatu lososa (prázdný trojúhelník).

Obrázek č. 8 je graf vázaného UTV (CPM) proti ředěni enzymu, který inhibuje navázáni chimérického adenovirového vláknitého proteinu na buňky bez receptorů (to je HS 68 fibroblasty)pomoci enzymů chondboitinázy (prázdný kruh, tečkovaná dráha); heparinázy (otevřený kruh, plná čára) a sialidázy (trojúhelník, plná čára).

« · ·9· ·

Obrázek č. 9 je sloupcový graf znázorňující porovnání transferu reportního genu lacZ pomocí vektoru, který obsahuje vláknitý protein divokého typu (to je GV10), a adenovirového vektoru, který obsahuje chimérický vláknitý protein (to je GV10 UTV), jak se stanovilo pomocí exprese výsledného reportního genu (to je relativní jednotky světla (RLU)) v různých buňkách s receptorem nebo bez receptorů.

Obrázek č. 10 je sloupcový graf znázorňující porovnonání transferu reportního genu lacZ pomocí adenovirového vektoru, který obsahuje vláknitý protein divokého typu (to je GV10), a adenovirového vektoru, který obsahuje chimérický vláknitý protein (to je GV 10 UTV), jak se stanovilo pomocí exprese výsledného reportního genu (to je relativní jednotky světla (RLU)) v myšších plicích.

Obrázek č. 11 je reportního genu (to adenovirového vektoru, divokého typu (to je adenovirového vektoru, sloupcový graf znázorňující je obsaženého v pGUS) který obsahuje vláknitý

GV 10, plné sloupce), a který obsahuje chimérické vlákno (to transfer pomocí protein pomocí je prázdné sloupce) potencionálně vázané přes protein/DNA interakci na buňky 293, Ά549 a H700 T.

Obrázek č. 12 je diagram, který dále znázorňuje plazmid p!93(F5*) (popsaný jako pAd NS 83-100 UTV na Obr. č. 3 a také známý jako pl93 (F5*) nebo pNS (F5*)), který se používá ke konstrukci adenovirových vláknitých chimér, a sekvenci Ckonce mutovaného vláknitého proteinu, který je přítomný v plazmidu (polyadenylační místo).

Obrázek č. 13 je diagram, který znázorňuje plazmid pl93NS(F5*) pGS(K7) (také známého jako p!93 (F5*) pGS(K7) nebo pNS (F5*)pK7), který se používá ke konstrukci adenovirových vláknitých chimér.

Obrázek č. 14 je diagram, který zobrazuje plazmid pBSS

75-100 pGS(null) (také znám jako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(null)).

Obrázek č. 15 je diagram, který znázorňuje plazmid pBSS

75-100 pGS(RK32) (také znám jako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK)₂ nebo pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK2)).

Obrázek č. 16 je diagram, který znázorňuje plazmid pBSS

75-100 pGS(RK33) (také známý jako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK)₃ nebo pBSS 75-100

ΔΕ3 pGS(RKKK3)).

Obrázek č.

je diagram, který znázorňuje plazmid pl93NS F5F2K (také známý jako pl93 F5F2K).

Obrázek č. 18 je diagram, který znázorňuje plazmid

P193NS F5F2K(RKKK)₂ (také známý jako pl93NS F5F2K(RKKK2), pl93NS F5F2K(RK32) nebo pl93 F5F2K(RKKK2)).

Obrázek č. 19 je diagram, který znázorňuje plazmid

P193NS F5F2K(RKKK)₃ (také známý jako pl93NS F5F2K(RKKK3),

P193NS F5F2K(RKKK3) nebo pl93 F5FK(RK33)).

Obrázek	č. 20	je	diagram,	který	znázorňuj e	plazmid	pACT
(RKKK)3 (také	známý	jako pACT(RKKK3) nebo pACT (RK33)).
Obrázek	č. 21	je	diagram,	který	znázorňuj e	plazmid	pACT
(RKKK)2 (také	známý	jako pACT (RKKK2)	nebo pACT	(RK32)).
Obrázek	č. 22	je	diagram,	který	znázorňuj e	plazmid	pACT
Hll.
Obrázek	č. 23	je	diagram,	který	znázorňuj e	plazmid	pACT
Hll(RKKK)2 (také	znám jako	pACT	Hll(RKKK2)	nebo	pACT
Hll(RK32)).
Obrázek	č. 24	je	diagram,	který	znázorňuj e	plazmid	pl93

F5F9sK (také znám jako pl93 F5F9K-Short).

Obrázek č. 25 je diagram, který znázorňuje plazmid pSdelta.

Obrázek č. 26 je diagram, který znázorňuje plazmid pSP2alfa. j označuje poškozená místa PpulOI v plazmidu.

• · · • · • ·

Obrázek č. 27 je diagram, který znázorňuje plazmid pSP2alfa2. j označuje poškozená místa PpulOI v plazmidu.

Obrázek č. 28 je graf, který znázorňuje dny po infekci proti FFU/buňku pro buňky 293 infikované Ad5 (prázdný kruh). AdZ.F(RGD) (plné čtverce) nebo AdZ.F(pK7) (prázdný trojúhelník).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Tento příklad provedení vynálezu popisuje výzkum množství adenovirového receptoru v různých buňkách, což určuje schopnost adenoviru divokého typu vázat se na buňky. Pro účely těchto experimentů se stanovila schopnost adenoviru obsahující vlákno divokého typu vázat se na buňky odvozené z různých tkání. Adenovirové partikule se označily [ ³H] — thymidinem, jak se popisuje dříve v textu (např. Wickham et al., Cell, 73, 309-319 (1993)). Subsaturační množství adenoviru, který je značený thymidinem, se přidalo do 200 ul buněk v množství 10⁶, které se preinkubovaly za přítomnosti 20 gg/ml rozpustného vláknitého proteinu nebo bez jeho přítomnosti po dobu 30 až 60 minut. Buňky se inkubovaly s virem po dobu jedné hodiny při teplotě 4°C a pak se 3 krát promyly chlazeným fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS). Počet spojených buněk se měřil v sintilačním počitadle. Specifické navázání se určilo z odečteného počtu spojených buněk (to je počet za minutu (cpm) za přítomnosti vlákna a z počtu spojených buněk v případě, kdy vlákno nebylo přítomno. Navázání v případech přítomnosti vlákna nebylo nikdy vyšší než 2% celkového vstupu radioaktivních virových partikul!. Výsledky se získaly jako průměr třech měření.

Jak je zobrazeno na obr. 1 podstatné množství buněk odvozených z různých tkání exprimovalo malé množství nebo • · • · ·· *

žádný receptor vlákna, což se projevilo relativní neschopností adenoviru divokého typu vázat se na tyto buňky. Buňky epiteliálního původu (to jsou buňky obsahující receptor, mezi něž patří Changovy buňky, buňky HeLa a buňky A549) vázaly velké množství adenoviru. Pro srovnání buňky, které nejsou epiteliální (to je buňky, které neobsahují receptor, jako jsou monocyty/makrofágy, fibroblasty, neuronové buňky, buňky hladkého svalstva a epiteliální buňky) vykazovaly okolo desetinásobnou nebo vyšší redukci při vázání viru ve srovnání s buňkami, které jsou podobné epiteliálním buňkám.

Tyto výsledky potvrzují, že dříve nerozeznávanou relativní neschopnost adenoviru vázat se na buňky, které nejsou epiteliální a neobsahují receptor, a vstupovat do nich ve srovnání s epiteliálními buňkami, které obsahují receptor. Předpokládá se, že tato schopnost je způsobena nízkým zastoupením receptorú pro adenovirový vláknitý protein divokého typu na těchto buňkách.

Příklad 2:

Tento příklad popisuje konstrukci adenovirového vektoru, který obsahuje chimérický obalový protein, zvláště chimérický adenovirový vláknitý protein.

Za účelem překonání omezení transdukcí způsobené přítomností pouze limitovaného počtu klinicky relevantních tkáních, jako receptorú jsou jiné vlákna na tkáně než epiteliální, se zkonstruoval který je zobrazen na obr. č. odvodit vektor, který se transferovým vektorem nebo adenovirový obalový protein, vlákna, vlákna se provedla mutace posunem rámce.

u adenoviru divokého typu obsahuje modifikovaný adenovirový vektor, 2A a 2B. Účelem konstrukce je zde nazývá univerzálním UTV. V genu, který kóduje v tomto případě jde o gen Nemodifikovaný gen zahnízděný stop • ·

signál translace (TAA) a transkripční polyadenylační signál (AATAAA). Polyadenylační signál řídí adici polyA ocasu na 3'konec transkriptu. PolyA ocas typicky kdekoli obsahuje přibližně od 20 do okolo 200 nukleotidů. Následuje transkripce a výstup z jader. Stop signál TAA řídí ukončení translace na ribozómu.

Modifikovaný gen vlákna u UTV vektoru neobsahuje v rámci translační stop signál. Následuje normální transkripce a adice polyA na mRNA bez přítomnosti stop kodónu, ribozóm pokračuje v translaci transkriptu do oblasti polyA. Vzhledem k tomu, že kodón ΆΆΆ kóduje aminokyselinu lyzin, výsledný translační produkt chimérického genu vlákna produkovaný pomocí UTV zahrnuje adici řady polylyzínových zbytků na Ckonec, to je Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (SEQ ID NO: 1). Je možné, že buněčný proces způsobuje limitaci délky polylyzínové řady. Vzhledem k tomu, že polylyzínové zbytky typicky obsahují v chimérickém vláknitém proteinu od přibližně 3 do 30 zbytků. V každém případě však polylyzínové proteinové modifikace stejně jako další zde popsané modifikace umožňují UTV, účinně se vázat na buňky, kterým chybí velké množství receptorů pro adenovirový vláknitý protein divokého typu (to jsou buňky bez receptorů).

Co se týká konstrukce vektoru a charakterizace, standardních molekulových a genetických metod, jako jsou tvoření kmenů, plazmidů a virů, gelová elektroforéza, manipulace DNA, která zahrnuje izolaci plazmidů, klonování DNA a sekvenování, testování westernovým přenosem a podobně, se uskutečnily způsobem, který je dobře znám v oboru a detailně se popisuje ve standardních laboratorních manuálech (např. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1992); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987)). Restrikční enzymy a jiné enzymy používané pro molekulové • · a Λ Λ ·

manipulace Mannheim, Beverly, Bethesda, výrobce.

se získaly z komerčních zdrojů (např. Boehringer lne., Indinapolis, Indiana; New England Biolabs, Research Laboratories, souladu s doporučeními v experimentech (např.

Indinapolis,

Massachusetts; Bethesda

Maryland) a použily se v Buňky, které se používají buňky transformované buněčné linie 293, což jsou buňky ledvin lidského embrya (CRL 1573) a jiné buňky, které poskytla Američan Type Culture Collection) se kultivovaly a udržovaly za použití standardních sterilních kultivačních činidel, média a metod, které jsou už popsány (Erzerum et al., Nucleic Acids Research, 21, 1607-1612 (1993)).

Zavedením modifikovaného restrikčního místa BamHI (to je GGAT CCAA (SEQ ID NO: 6) ) do adenovirového transferového vektoru došlo k mutaci posunem rámce stop kodónu vlákna. Tato manipulace se provedla jak ilustruje obr. 3. Na počátku je plazmid pAd NS 83-100 (který je znám také jako pl93NS 83-100 nebo pNS 83-100). Plazmid pAd NS 83-100 se zkonstruoval klonováním Ad5 Ndel do Sall fragmentu, který zabírá 83 až 100 mapové jednotkové oblasti genomu Ad5, který obsahuje gen vlákna, do plazmidu pNEB193 (New England Biolabs, Bevrly, MA) .

Fragment Ndel-MunI pAd NS 83-100 se zaměnil za syntetický oligonukleotid, který obsahuje restrikční místo BamHI, které bylo lemováno 5'Ndel místem a 3'MunI místem, které jsou vhodné pro klonování. Dvouřetězcový syntetický oligonukleotidový fragment se vytvořil z přesahujících syntetických jednořetězcových sense a antisense oligonukleotidů. Sense primer je TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C (SEQ ID NO: 9) a antisense primer AAT TGA ΆΆΆ ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA (SEQ ID NO: 10), jak je zobrazeno na obrázku č. 4A a 4B. Konce přesahujících • · • · · · • · oligomérů se připravily tak, aby měly přečnívající konce kompatibilní za účelem přímého klonování do Ndel a MunI míst.

Výsledný transferový plazmid pAd NS 83-100 (F^-) (který je také znám jako pl93NS (AF) nebo pNS (AF))nemá 50 prvních párů baží kódující sekvence genu vlákna (to znamená, že nemá vlákno). Vektor dále obsahuje celou kódující sekvenci adenoviru E4. Plazmid obsahuje polyadenylační signál ΑΑΤΆΑΑ, který se nachází v syntetickém polynukleotidu Ndel/MunI a také zahrnuje nové restrikční místo BamHI.

Mutovaný gen vlákna se začlenil do plazmidu pAd NS 83100, který nemá vlákno, za použití syntetických sense a antisense oligonukleotidových primerů za účelem amplifikace genu vlákna polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), přičemž se inkorporovalo modifikované restrikční místo BamHI, které následuje po posledním kodónu genu vlákna, vznikl tak mutovaný gen vlákna. Toto modifikované restrikční místo BamHI také kóduje aminokyseliny glycin a serin, což vede ke vzniku sekvence chimérické nukleové kyseliny GGA TCC AAT ΆΆΑ GAA TCG TTT GTG TTA TGT (SEQ ID NO:7). Modifikovaný gen vlákna pak kóduje prodloužení výsledného chiemrického vláknitého proteinu Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys (SEQ ID NO:4), kde délka polylyzinové řady se může měnit. Syntetické oligonukleotidy, které se používají při amplifikaci vlákna jsou primery se sekvencemi TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA (SEQ ID NO: 11) a CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA (SEQ ID NO: 12, jak je zobrazeno na obr. 4C a 4D.

Amplifikovaný produkt genu se pak štěpil restrikčními enzymy Ndel a BamHI a klonoval se do restrikčních míst Ndel/BamHI plazmidu pAd NS 83-100, který neobsahuje vlákno, za účelem vytvořit transferový vektor pAd NS 83-100 UTV (který je také zanám jako pl93NS (F5*), pl93 (F5*) nebo pNS (F5*)). Celá adenovirová sekvence pAd NS 83-100 UTV od Ndel do Sáli se klonovala do plazmidu pAd BS 59-100, který neobsahuje vlákno, za účelem vzniku pAd BS 59-100 UTV (který je také znám jako pl93NS (F5*) , pl93 (F5*) nebo pNS (F5*) .

Adenovirový vektor UTV vznikl pomocí homologni rekombinace v buňkách 293. Jmenovitě E4 pAd BS 59-100 UTV transferový vektor se linearizoval restrikčním enzymem Sáli a transfektoval se do buněk 293, které se před tím infikovaly adenovirovým vektorem A2F. Vektor A2F se odvodil od vektoru GV10. Vektor GV10 založený na vektoru Ad5 obsahuje gen lacZ, který řídí promotor viru Rousova sarkomu (to znamená, že obsahuje RSV lacZ). Začlenění reportního genu do GV10 se uskutečnila v oblasti El (to znamená, že vektor je El) . Vektor GV10 také obsahuje deleci oblasti E3, ale je E4⁺. Ve srovnání s GV10 (to je RSV lacZ El” E3” E4⁺) A2F dále obsahuje deleci E4 adenovirových genů, ale je E3⁺ (to je RSV lacZ El E3” E4”) .

Buňky 293 obsahují El komplementární sekvenci, ale neobsahují E4 komplementární sekvenci. Nepřítomnost E4 komplementární sekvence brání replikaci vektoru A2F E4 v buněčné linii 293. Je-li A2F začleněn do buněk 293 spolu s pAd BS 59-100 UTV , proběhne homologni rekombinace mezi UTV vektorem a A2F adenovirovým genomem, přičemž vzniká adenovirový genom E3⁺ E4⁺, který obsahuje chimérický vláknitý protein, který je schopný se replikovat v buňkách 293. Tento výsledný UTV vektor se označil GV10 UTV.

Vektor GV10 UTV se izoloval za použití standardní metody izolace plaků buněk 293. Následují tři cykly úspěšného čištění plaků. Vektor GV10 UTV obsahoval mutaci vlákna a neobsahoval žádné kontaminace vektorem A2F E4. Přítomnost chimérických sekvencí vlákna ve vektoru GV10 UTV se zjistila sekvenováním mRNA vlákna polymerá-zovou _t řetězovou reakcí za použití reverzní transkriptázy (RT-PCR), která potvrdila přítomnost polyadeninového ocasu v chimérické mRNA vlákna.

• · • · · • · ··· ·· · · · · ♦ ··« ·· · · · · · • ···· ♦ · · · · ··· · · • · ··· · · · «· · · · · · · ·· · *

Podobně analýza westernovým přenosem potvrdila produkci chimérického vláknitého proteinu za použití vektoru. Za účelem provedení této analýzy se buňky 293 infikovaly při multiplicitě infekce (MOI) 5 buď vektorem GV10, který obsahuje adenovirový vláknitý protein divokého typu, nebo vektorem GV10 UTV, který obsahuje chimérický vláknitý protein. Dva dni po infekci se buňky promyly a lyžovaly se v PBS ve třech cyklech zmrazení-rozmrazení. Lyzáty se vyčistily centrifugací a nanesly se na gel 10% dodecylsulfátu sodného/polyakrylamid. Následovala elektroforéza. Protein se přenesl na nitrocelulózu a detekoval se chemolumuniscencí za použití polyklonálních protilátek proti vláknu. Analýza westernovým přenosem je znázorněna na obr. č. 5. Jak je zřejmé z obrázku, migrace proteinů ukazuje, že chimérické vlákno UTV je přibližně o 1,5 až 2,0 kilodaltonů větší než nemodifikovaný vláknitý protein divokého typu, který je 62 kilodaltonů velký.

Tyto výsledky potvrzují, že tento způsob se může použít pro zavedení modifikací do vláknitého proteinu za účelem produkce chimérického vláknitého proteinu. Podobně se tento způsob může použít při zavedení modifikací do hexonového nebo pentonového proteinu nebo při zavedení podobných modifikací (např. adice řady aminokyselin, která obsahuje arginin, lyzin a/nebo histidin nebo aspartát a/nebo glutamát nebo adice libovolné z těchto sekvencí do kódující oblasti obalových proteinů).

Příklad 3:

Tento příklad popisuje proces navázání adenovirového vektoru na buňky, přičemž vektor obsahuje chimérický obalový protein, jako je chimérický vláknitý protein při srovnání s adenovirovým vektorem divokého typu, buď je-li přítomen nebo nepřítomen přidaný vláknitý protein divokého typu.

V těchto experimentech se používají buňky popsané v příkladu 1, na které se adenovirus váže buď s vysokou účinností (to jsou buňky, které obsahují receptor) nebo s nízkou účinností (to jsou buňky, které receptor neobsahují). Jako reprezentant buněk, které obsahují receptor, se použila buněčná linie epiteliálních buněk A549 a buňky, které nenesou receptor, reprezentuje buněčná linie fibroblastů HS 68. Konfluentní monovrstvy buněk buď A54 9 nebo HS 68 se preinkubovaly při teplotě 4°C za přítomnosti rozpustného vláknitého proteinu v koncentracích 0 až přibližně 10 gg/ml. Vektory GV10 UTV, který obsahuje chimérický vláknitý protein (UTV), nebo GV10, jenž obsahuje vláknitý protein divopkého typu (WT), se značily tritiovaným thimidinem, jak se popisuje v příkladu 1. Přibližně 20 000 cpm vektoru GV10 UTV nebo GV10 značeného [³H]-thymidinem se inkubovalo společně s buňkami po dobu okolo 2 hodin při teplotě 4°C. Buňky se tři krát promyly chlazeným PBS a scintilačním počítáním se stanovilo cpm spojené s buňkami. Získané výsledky pro buněčné linie A549 a HS 68 jsou průměry zdvojeného měření a jsou znázorněny na obrázcích 6A a 6B.

Jak je možné vidět na obrázcích 6A až B chimérický vláknitý protein vektoru GV10 UTV je schopen se vázat na oba druhy buněk, ať už jde o buňky obsahující receptor (obr. č. 6A) nebo o buňky, které receptor neobsahují (obr. č. 6B) , s vysokou účinností. Naproti tomu vektor GV10, který obsahuje vlákno divokého typu, se váže s vyšší účinností na buňky, jenž nesou receptor. Zvláště radioaktivně značený vektor GV10 UTV vázaný na buňky exprimuje detekovatelné množství receptoru vlákna (použily se alveolární epiteliální buňky A549) . Exprese je přibližně 2 až 2,5 krát silnější než v případě vektoru GV10. Zatímco navázání vektoru GV10 bylo inhibováno rekombinantním vláknitým proteinem, v případě vektoru GV10 UTV se inhibovalo adicí kompetivního vlákna * · • · • · · · · • · · ·· • ······· • · ·· • · · · · · · « · · · · • · · · • · · · · · • · · • · · ·

Při použití buněk HS horní vrstvy kůže, které detekovatelné navázání

68, což nenesou vektoru jsou lidské receptor, se

GV10, jenž typu. Vektor GV10 UTV adice kompetivního . navázání.

pouze 40%. fibroblasty nepozorovalo obsahuje adenovirový protein divokého účinně váže buňky HS 68, přičemž < vláknitého proteinu neměla žádný účinek na

Tyto výsledky potvrzují, že navázání který obsahuje chimérický obalový protein vláknitý protein), se neuskutečňuje adenovirového receptorů vlákna divokého typu, prostřednictvím až dosud nerozeznatelného receptorů vlákna. Výsledky však potvrzují, že začlenění chimérického obalového proteinu, jako je chimérický vláknitý adenovirového vektoru vede ke zdokonalení vektoru GV10 UTV, (to je chimérický prostřednictvím ale místo toho protein, do adenovirového překonat dříve divokého typu zvláště na buňky, Tyto modifikace také umožňují které obsahují receptor, se vektoru. Modifikace vektoru GV10 UTV umožňují zmiňovanou relativní neschopnost adenoviru vázat se na buňky, které nemají receptor, jenž nejsou epiteliální. Tyto modifikace vektoru vázat se na buňky, zvýšenou účinností.

Příklad 4:

Tento rozpustných zablokovat přiklad faktorů navázáni zkoumání schopnosti různých popisuj e a inhibitorů těchto rozpustných faktorů adenoviru, který obsahuje chimérický vláknitý protein, na fibroblastové buňky HS 68, které neobsahují receptor.

V těchto experimentech vektoru GV10 UTV způsobená molekulami, mezi něž patří DNA chondrotinu a heparin. Sulfát negativně nabité molekuly, jejichž náboj udávají skupiny. Mucin nese negativní náboj, který je přítomností částí sialové kyseliny a DNA nese se určuje inhibice navázání různými negativně nabitými spermatu lososa, mucin, sulfát chondrotinu a heparin jsou sulfátové způsobený negativní náboj, který způsobuje začleněni části fosforečnanů. Přibližně 20 000 cpm UTV ve 250 μΐ vazebného pufru (to je Dulbeccovo modifikované Eagle médium (D-MEM)) se inkubovalo při teplotě místnosti po dobu přibližně 30 min s negativně nabitými molekulami, jejichž koncentrace se pohybovala v rozmezí přibližně 1 x 10³ až 1 x 10⁴ μg/ml. Pak následuje inkubace. Směs se zchladila na ledu a pak se přiadala k předchlazeným buňkám HS 68 a nanesla se na plotny s 24 miskami. Buňky se inkubovaly přibližně 1 hodinu a pak se promyly tři krát pufrem PBS. S buňkami spojené cpm se stanovilo scintilačním počítáním a udává se jako průměr dvou měření.

Jak je znázorněno na obrázku č. 7, zatímco přítomnost kompetivního vláknitého proteinu divokého typu nepůsobí na navázání GV10 UTV vektoru (obsahuje chimérické vlákno) na buňky HS 68, negativně nabité kompetivní molekuly jsou schopny blokovat navázání GV10 UTV. Všechny čtyři molekuly vykazují schopnost inhibovat navázání GV10 UTV na buňky HS 68. Nejefektivnější je v tomto ohledu heparin a DNA. Tyto molekuly namají podstatný účinek na navázání vektoru GV10 (obsahuje vlákno divokého typu) na buňky, které exprimují velké množství receptorů vlákna (to jsou buňky A549; data nejsou uvedeny) .

Tyto výsledky potvrzují, že negativně nabité molekuly jsou schopny blokovat navázání vektoru GV10 UTV na buňky, které je zprostředkované chimérickým vláknitým proteinem. Předpokládá se, že tato inhibice je způsobena navázáním negativně nabitých molekul na pozitivně nabité polylyzínové zbytky, které se nacházejí na vlákně GV10 UTV. Určil se účinek enzymů, které štěpí tyto negativně nabité molekuly, na jejich schopnost vázat se na buňky s vektorem GV10 UTV.

Buňky HS 68 se nanesly na plotny s 24 miskami a inkubovaly se s různým ředěním heparinázy (Sigma, St. Louis, • ·

MO) , chondroitinázy (Sigma) a sialidázy (Boehringer Mannheim, lne.), které je v rozpětí 0, 0001 až 1 po dobu 45 minut při teplotě 37°C, pak následuje inkubace po dobu 15 minut při teplotě 4°C. Zatímco chondroitináza štěpí sulfát chondroitinu, heparináza štěpí heparin sulfát heparinu a sialidáza štěpí sialinovou kyselinu. Počáteční koncentrace ředění jsou následující: heparináza 25 U/ml (U=0,l gmolů za hodinu, pH je 7,5, teplota 25°C); chondroitináza 2,5 U/ml (U=l,0 gmolů za minutu, pH je 8,0, teplota 37°C) ; a sialidáza 0,25 U/ml (U=l,0 pmolů za minutu, pH je 5,5, teplota 37°C). Následuje inkubace. Buňky se tři krát promyly chlazeným pufrem PBS a pak se inkubovaly s 20 000 cpm značeného vektoru GV10 UTV po dobu přibližně 1 hodinu při teplotě 4°C. Buňky se pak tři krát promyly chlazeným pufrem PBS a stanovilo se cpm spojené s buňkami pomocí scintilačního počítání. Výsledky se udávaly jako průměr dvou měření.

Jak se ukázalo na obrázku č. 8, jestliže se buňky HS 68 před inkubací upravily enzymy, které odstraňuji negativně nabité molekuly z povrchu buňky, potvrdilo se, že vektor GV10 UTV, který obsahuje chimérický vláknitý protein interaktuje s negativně nabitými místy na povrchu buňky. Zvláště heparináza a sialidáza jsou schopny redukovat navázání GV10 UTV, ačkoli v případě buněk HS 68 je heparináza ve srovnáni se sialidázou účinější.

Pak tyto výsledky potvrzují, že vektor obsahující chimérický vláknitý protein (např. vektor GV10 UTV), který je jiný než adenovirus divokého typu, interaktuje novým způsobem s negativně nabitými molekulami na povrchu buňky a tak ovlivňuje vstup do buňky. Tyto výsledky dále ukazují vektor, který obsahuje negativně nabité zbytky (např. aspartát a glutamát) místo pozitivně nabitých molekul (např. lyzín), které mohou být podobně využity při navázání na buňku • · • · ··· ·· · · · · · • · · ·· · · · · · • ······ · · · ···· · • · · · · · · · • · · · · · · · · · · · a vstupu do buňky prostřednictvím pozitivně nabitých molekul, které se nacházejí na povrchu buňky.

Příklad 5:

Tento příklad hodnotí zavedení genu do různých typů buněk zprostředkovaných adenovirovým vektorem, který obsahuje chimérický obalový protein, jako je chimérický vláknitý protein (např. GV10 UTV), což se srovnává se zaváděním genu zprostředkované adenovirem, který obsahuje obalový protein divokého typu, jako je vláknitý protein (např. GV10).

V těchto experimentech relativní úroveň zavedení genu lacZ vektorem, který obsahuje vláknitý protein divokého typu (to je GV10) a vektorem, který obsahuje chimérický vláknitý protein (to je GV10 UTV) se srovnává za použití buněk, které jsou podobné epiteliálním (to jsou buňky HeLa, A549, HepG2 a H700 T) , buňky hladkého svalstva (to jsou HA SMC a HI SMC) , endoteliální buňky (to jsou buňky HUVEC a CPAE), fibroblasty (HS 68 a MRC-5), buňky gioblastomu (U118) a monocyty makrofágů (THP-1) . Přibližně 2 x 10⁵ buněk se inokulovalo jeden den před transdukcí adenovirem na plotny s 24 miskami. Každá miska se pak infikovala při MOI 1 GV10 (obsahuje adenovirový vláknitý protein divokého typu) nebo GV10 UTV (obsahuje chimérické adenovirové vlákno) v objemu 250 μΐ po dobu přibližně jedné hodiny. Misky se pak promyly a inkubovaly se po dobu dvou dnů, po té se určila lacZ aktivita buněčného lyzátu. Výsledky se uvádějí jako průměrné hodnoty dvou měření.

Jak je zobrazeno na obr. č. 9 použití vektoru GV10 UTV pro transfer reportního genu do různých buněčných linií potvrzuje, že přítomnost chimérického vláknitého proteinu (UTV) zvyšuje přibližně 5 krát až 300 krát zavedení genu lacZ do buněk exprimujících malé množství 'nebo nedetekovatelné množství receptoru vlákna (to je do buněk, které nemají • ·

• · · · · • ······ · • · · · • · · · · · · receptor) , což se srovnává s vektorem divokého typu (GV10). U buněk, které exprimují velké množství receptoru vlákna (to jsou buňky, které obsahují receptor), inkorporace chimérického vláknitého proteinu do vektoru GV10 UTV vede ke zvýšení zavedení genu až přibližně tři krát.

Tato redukce exprese pozorovaná při transdukci neepiteliálních buněk, které neobsahují receptor, ve srovnání s epiteliálními buňkami, které receptor obsahují, adenovirem, jenž obsahuje vláknitý protein divokého typu (to je GV10) přímo koreluje s relativní schopností vektoru vázat se na tyto různé buněčné typy, jak se uvádí v příkladu 3. Tyto výsledky podporují názor, který říká, že slabá exprese receptorů pro adenovirový vláknitý protein divokého typu je podstatný limitující faktor při transdukci buněk adenovirovými vektory.

Podobně se odhaduje schopnost chimérického obalového proteinu (to je chimérický vláknitý protein) zvýšit transfer genu in vivo. Tři Balb/c myši se intranasálně inokulovaly přibližně 1 x 10⁸ pfu GV10 ve fyziologického roztoku o objemu 50 μΐ, který obsahuje lOmM MgCl₂ a 10 mM Tris (pH 7,8). Dalším třem myším se aplikovala stejná dávka GV10 UTV a dvou myším se aplikoval samotný fyziologický roztok. Zvířata se usmrtila dva dny po aplikaci a v plících se testovala aktivita genu lacZ. Pro analýzu se plíce připravily zmrazením v kapalném dusíku, rozmělněním tkáně v třecí misce tloukem a lyžováním rozmělněné tkáně v 1,0 ml lacZ reportního lyzačního pufru (Promega Corp., Madison, WI) . Fluorometric assay se použila pro monitorování aktivity lacZ a výsledky experimentů se uvádějí jako průměr aktivity měřené u každé skuypiny zvířat.

Výsledky těchto experimentů jsou^ znázorněny na obr. č. 10. Jak je z tohoto obrázku zřejmé, transfer genu in vivo zprostředkovaný vektorem GV10 UTV, který obsahuje chimérický • · ·· ····

vláknitý protein (UTV), což se srovnává s vektorem, který obsahuje vláknitý protein divokého typu (GV10), vede k průměrně 8 krát vyššímu zavedení do plic myší.

Tyto výsledky tak potvrzují, že inkorporace chimérického obalového proteinu (v tomto případě chimérický vláknitý protein) do adenovirového vektoru podstatně zvyšuje účinnost zavedení genu zprostředkované vektorem jak in vitro tak in vivo, což se srovnává s adenovirovým vektorem, který obsahuje protein divokého typu. Výsledky podporují závěr, že slabá exprese receptorů vlákna je podstatný faktor, který se podílí na suboptimálním zavádění do plic a do jiných tkání. Tyto výsledky také potvrzují upřednostňování vektoru GV10 UTV nebo jiných vektorů podobných vektorům UTV před jinými současně dostupnými vektory za účelem transferu genu (např. zavedení genu CFTR) do plic a jiných tkání.

Příklad 6:

Tento příklad hodnotí schopnost vektoru podle vynálezu, který obsahuje chimérický obalový protein (např. chimérický vláknitý protein), interaktovat s cizorodou DNA ve smyslu interakce protein/DNA, čímž vnáší DNA do buňky způsobem piggy-back.

V těchto experimentech se použil adenovirový vektor, který obsahuje vlákno divokého typu (to je GV10) a adenovirový vektor, jenž obsahuje chimérické vlákno (to je GV10 UTV), k odhadu transferu genu do epiteliálních buněk, které mají receptor, (to jsou buňky 293, A549 a H700 T) . V kontrolních experimentech se buňky transdukovaly dříve popsanými vektory. Za podmínek experimentu se vektory inkubovaly s plaSmidem pGUS, který obsahuje reportní gen βglukuronidázy, tak, že chimérický adenovirový vláknitý protein je schopný tvořit komplex s plagmidovou DNA. Specificky přibližně 5 x 10⁷ aktivních partikul! (to jsou • · • · fluorescenční ohniskové jednotky (ffu)) GV10 nebo GV10 UTV se inkubovalo po dobu 1 hodiny s přibližně 2,5 μg DNA plagmidu pGUS. Směs se pak přidala k určeným buňkám v množství 2 χ 10⁵ v 250 μΐ DMEM, který obsahuje 10% fetální bovinní sérum, βglukuronidázová a β-galaktozidázová aktivita se pak odhadla fluorometrickým testem desátý den po transdukci. Exprese βglukuronidázy v buňkách se monitorovala způsobem, který je podobný β-galaktozidázovému testu pro expresi lacZ. Jde o monitorování tvoření modré barvy, jestliže β-glukuronidáza katalyzuje reakci se substrátem X-glu.

Výsledky těchto experimentů jsou znázorněny na obrázku č. 11. Srovnatelné síly exprese lacZ se dosáhlo, když se vektor GV10 (obsahuje vláknitý protein divokého typu) nebo vektor GV10 UTV (obsahuje chimérický vláknitý protein) použil pro transfer reportního genu v cis formě do epiteliálních buněk. Pro srovnání vektor divokého typu byl schopen intracelulárně přenést plajmid pGUS pouze v relativně nízkém množství do všech epiteliálních buněk, jak se odhaduje z exprese β-glukuronidázového genu. Této základní úrovně transferu genu se dosáhlo způsobem pojmutím nezúčastněných molekul prostřednictvím receptoru, jak se popisuje v patentové přihlášce PCT WO 95/21259). Použitím vektoru GV10 UTV, který obsahuje chimérický vláknitý protein se podstatně zvýšil transfer plazmidu pGUS. V případě transferu genu do buněk 293 β-glukuronidázová exprese řízená plagmidem pGUS překročila expresi pozorovanou po transferu cis-navázaného reportního genu zprostředkovanou vektorem GV10 UTV.

Tyto výsledky potvrzují, že vektor obsahující chimérický obalový protein, jako je chimérický vláknitý protein podle vynálezu, demonstruje zvýšený transfer nukleové kyseliny, která se nenachází v cis poloze s vektorem. Toto zvýšení transferu genu je zdánlivě ovlivněno výskytem interakce • · protein/DNA mezi negativně nabitými zbytky na chimérickém vlákně (např. zbytky polylySÍnové řady), což vede k navázání nukleové kyseliny na vektor; avšak je možný i další způsob zvýšení.

Příklad 7:

Tento příklad popisuje konstrukci dalších plagmidů, které obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV na C-konci vláknitého proteinu.

Jako počáteční bod pro konstrukci těchto dalších plasmidů se použil transferový plazmid pl93(F5*) (obr. č. 12; také známý jako pl93NS (F5*) a pAd NS 83-100 UTV), který se popisuje v příkladu 2. Tyto plazmidy obsahují chimérický adenovirový vláknitý protein. Jak je znázorněno na obr. 12, plagmid pl93(F5*) obsahuje mutovaný gen vlákna s restrikčním místem BamHI mezi posledním kodonem vláknitého proteinu a v rámci posunutým stop kodónem vláknitého proteinu. Dále se mutantní transferové plasmidy konstruovaly, jak se zde popisuje. Obsahují sekvence C-konce vlákna kódující linker, který obsahuje opakující se aminokyseliny glycin/serin, cílovou sekvenci a stop kodón. Tyto plazmidy se připravily klonováním syntetických oligonukleotidů do restrikčního místa

BamHI	plagmidu	pl93(F5*) za	účelem	vytvořit	transferový
plasmid	pl93NS	(F5‘) pGS(K7)	(také	znám jako pl93(F5*)
pGS(K7)	nebo pNS (F5*) pK7),	který je	znázorněn	na obrázku
č. 13.
Sekvence genu Ad5 vlákna	divokého	typu je:
TCA TAC	ATT GCC	CAA GAA TAA ΑΆΑ AGAA	(SEQ	ID NO:59)
Ser Tyr	Ile Ala	Gin G1U		(SEQ	ID NO:60),

kde TAA je terminačni kodón a polyadenylačni sekvence je zvýrazněna. C-konec mutovaného genu vlákna přítomného v plazmidu pl93(F5*) je:

TCA

TAC ATT GCC

CAA GAA

GGA TCC AATAAA GAA (SEQ ID NO: 19)

Ser

Tyr Ile Ala

Gin Glu

Gly Ser (SEQ ID NO: 20) kde podtržená sekence označuje mutované restrikčni místo

BamHI zavedené do vláknitého proteinu a polyadenylačni sekvence je zvýrazněna. Pro srovnání aminokyselinová sekvence

C-konce genu vlákna, který je přítomný v plazmidu pl93NS (F5‘) pGS(K7) je:

GSGSGSGSGS KKKKKKK (SEQ ID NO:22) kde podtržená sekvence označuje mutované restrikčni místo BamHI zavedené do vláknitého proteinu a zvýrazněná sekvence jindikuje polylygínovou řadu přidanou k C-konci. Tato aminokyselinová sekvence je kódovaná sekvencí nukleové kyseliny: GGA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG ΆΆΆ

AAG AAG AAG TAA (SEQ ID NO:21), kde TAA je terminačni kodón.

Při konstrukci transferového vektoru pl93NS (F5*) pGS(K7) se použily překrývající se syntetické oligonukleotidy, kde pK7s (sense primer) má sekvenci GA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAA TAA G (SEQ ID NO:61); a pK7a (antisense primer) má sekvenci GA TCC TTA CTT CTT CTT TTT CTT CTT TTT AGA GCC ACT CCC TGA TCC T (SEQ ID NO:62). Tyto sense a antisense oligonukleotidy se smísily v equimolárním poměru a klonovaly se do restrikčního místa BamHI pl93NS (F5*) za účelem vytvořit plagmid pl93NS (F5*) pGS(K7). Ověření správné orientace inzertu v plaSmidu pl93NS (F5*) pGS(K7) se uskutečnilo PCR za použití pK7s sense primeru .a. downstream antisense oligonukleotidového primeru A5a32938 se sekvencí CAGGTTGAATAGGGTTCT (SEQ ID NO: 63) . Provedlo se také ověření • · správnosti orientace inzertu v plagmidu sekvenováním sekvence DNA v oblasti inzertu za použití primeru A5a32938.

Transferový plazmid pl93NS (F5*) se použil při konstrukci dalších mutantních transferových plajmidů, které navíc obsahují na C-konci vláknitého proteinu UTV nebo sekvenci podobnou UTV cílových buněk. Tyto plasmidy zahrnují pl93NS (F5*) pGS(null) (který je také znám jako pl93 (F5‘) pGS(null) nebo pl93NS (F5‘) pGS) , pBSS 75-100 pGS (null) , pBS 75-100 pGS(RK32), pBSS 75-100 pGS(RK33) a pBSS 75-100 pGS(tat).

Za účelem konstrukce pl93NS (F5*) pGS(null) se zkonstruovaly komplementárně se překrývající oligonukleotidy pGSs o sekvenci GATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAAA (SEQ ID NO: 64) a pGSa se sekvencí GATCTTTAACTAGTCGAGCCACTGCCAGATCCTGAACCG (SEQ ID NO:65), které se použijí pro přímou ligaci do playmidu pl93NS (F5*) štěpeného restrikčním enzymem BamHI. Ověření správné orientace klonu se provedla PCR za použití pGSs primeru a downstream antisense oligonukleotidového primeru A5a32938. Sekvenováním sekvence DNA v oblasti inzertu za použití primeru A5a32938 se zjistilo, že plasmid se zahrnuje správně orientovaný inzert.

Vektor pBSS 75-100 pGS (null) (také znám jako pBSS 75100 ΔΕ3 pGS(null)) zobrazený na obr. č. 14 se zkonstruoval záměnou fragmentu Nhel až Sáli z pBSS 75-100 za odpovídající fragment z pl93NS (F5*) pGS(null). Restrikční místo Spěl, které se nevyskytuje v genu vláknité chiméry, se pak eliminovalo částečným štěpením plasmidu s restriktázou Spěl, vyplněním Klenow fragmentem a pak se vektor znovu ligoval. Výsledný vektor obsahuje relevantní sekvenci nukleové kyseliny: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAA (SEQ ID NO: 23) (kde TAA je terminační kodón), která kóduje ·· · • · · • · · · • ······ *· ··«· ·· ··

• ·· · aminokyselinovou sekvenci Ala Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser (SEQ ID NO: 24).

Inzerty plasmidů pBSS 75-100 pGS(RK32) (také známé jako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK)₂ nebo pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK2)), pBSS 75-100 pGS (RK33) (také znám jako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK3)) a pBSS 75-100 pGS(tat) se konstruovaly za účelem přímé ligace do plasmidu pBSS 75-100 pGS (null) štěpeného restrikčním enzymem Spěl. Konstrukce plasmidu pBSS 75-100 pGS(RK32) je znázorněna na obr. č. 15. Použily se komplementárně se překrývající oligonukleotidy RK32s se sekvenci CTAGAAAGAAGAAACGCAAAAAGAAGA (SEQ ID NO: 66) a RK32a se sekvenci CTAGTCTTCTTTTTGCGTTTCTTCTTT (SEQ ID NO. 67) . Výsledný vektor obsahuje relevantní sekvenci nukleové kyseliny: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGCATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAGAAACGCAAA AAGAAGACTAGTTAA (SEQ ID NO: 25) (kde TAA je terminačni kodOn), která kóduje aminokyselinovou sekvenci Ala Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (SEQ ID NO: 26).

Konstrukce plazmidu pBSS 75-100 pGS(RK33) je znázorněna na obr. č. 16, kde se použily komplementárně se překrývající oligonukleotidy RK33s se sekvenci

CTAGAAAGAAGAAGCGCAAAAAAAAAAGAAAGAAAGA (SEQ ID NO: 68) a RK33a se sekvenci CTAGTCTTCTTCTTTCTTTTTTTTTTGCGCTTCTTCTTCTTT (SEQ ID NO. 69). Výsledný vektor obsahuje relevantní sekvenci nukleové kyseliny:

GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAGAAGCGAAAAA AAAAGAAAGAAGACTAGTTAA (SEQ ID NO:27) (kde TAA je terminačni kodon), která kóduje aminokyselinovou sekvenci Ala Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Th-r Ser (SEQ ID NO: 28) .

Za účelem konstrukce plasmidu pBSS 75-100 pGS(tat) se použily komplementárně se překrývající oligonukleotidy TATs ·· ·· • 9 9 9

9 99 ·· · ·· ···· • · · 9 9 9 • · · · · · • ···· · · · · • · · · · 9999 9 99 9

9 9 • ·· se sekvenci CT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA AGA CGG GCA T (SEQ ID NO: 70) a TATa se sekvenci CT AGA TGC CCG TCT TCG TTG CCT GCG CTT TTT TCT CCC ATA A (SEQ ID NO. 71) . Výsledný vektor obsahuje sekevnci relevantní nukleové kyseliny: ACT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA TCT AGT (SEQ ID NO:72), která kóduje aminokyselinovou sekvenci Thr Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Ser Ser (SEQ ID NO: 73).

Ověření správné orientace klonu se provedla PCR za použití primerů (RK32s, RK33s nebo TATs) pro každý ze tří plagmidů a dále se použil downstream antisense oligonukleotidového primeru A5a32938. Sekvenováním sekvence DNA v oblasti inzertu za použití primeru A5a32938 se zjistilo, že plagmid se zahrnuje správně orientovaný inzert.

Příklad 8:

Tento příklad popisuje konstrukci plasmidů, které obsahují oblasti UTV ve smyčce vlákna.

Plasmidy obsahující sekvenci UTV (a/nebo intergenovou sekvenci) ve vyčnívající smyčce vláknitého proteinu se konstruovaly začleněním libovolné sekvence uvedené dříve v textu (stejně to mohou dále být sekvence podobné UTV) do vláknitého proteinu. To je provedeno použitím plasmidového transferového vektoru pl93NS (F5*) za účelem konstrukce dalšího transferového vektoru pl93NS F5F2K (také nazývaného pl93 F5F2K) zobrazeného na obr. č. 17. Plasmid pl93NS F5F2K obsahuje jediné restrikční místo Spěl v genu vlákna Ad2, který kóduje v proteinu vyčnívající smyčku. Gen vlákna přítomný v plažmidu pl93NS F5F2K obsahuje sekvenci vlákna: ATT ACA CTT AAT GGC ACT AGT GAA TCC ACA Ile Thr Leu Asn Gly Thr Ser Glu Sej? Thr

GAA ACT

Glu Thr (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 30)

kde podtržená sekvence označuje nové restrikčni místo Spěl, které je zavedené do genu vlákna.

Tento vektor se pak použil ke klonování cílové sekvence do restrikčního místa Spěl. Zvláště sekvence nukleové kyseliny kódující řadu 8 základních aminokyselin RKKKRKKK (Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys (SEQ ID NO: 74)) obsahující oblast vázající heparin se klonovala do restrikčního místa Spěl plazmidu pl93 F5F2K za použití překrývajícího se sense a antisense oligonukleotidů.

Sekvence (RKKK)₂ zčásti obsahuje sekvenci:

TCT AGA AAA ΆΆΑ AAA CGC AAG AAG AAG ACT AGT (SEQ ID NO: 75) Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (SEQ ID NO:76).

27-mér sense oligonukleotid RK32s a 27-mer antisense oligonukleotid RK32a popsaný v příkladu 7 se používá při klonování sekvence PolyGS(RKKK) _2r která obsahuje RKKKRKKK (SEQ ID NO:74) peptidový motiv. Plasmid pl93NS F5F2K(RKKK)₂ se zkonstruoval klonováním sekvence DNA kódující vazebnou oblast do restrikčního místa Spěl plazmidu pl93NS F5FK2. Překrývající se sense a antisense oligonukleotidy, které kódují vazebnou oblast, se nejprve spojily a pak se přímo ligovaly do restrikčního místa Spěl. Vznikl výsledný plasmid pl93NS F5F2K(RKKK)2z jenž je znázorněn na obrázku č. 18. Tento plagmid je také znám jako pl93NS F5F2K(RKKK2), pl93NS F5F2K(RK32) nebo pl93 F5F2K(RKKK2). V plazmidu pl93NS F5F2K(RKKK)₂ je přítomna relevantní část modifikované smyčky oblasti knob vlákna:

ATT	ACA	CTT	AAT	GGC	ACT	AGA	AAG	AAG	AAA	CGC	AAA AAG AAG ACT
Ile	Thr	Leu	Asn	Gly	Thr	Arg	Lys	Lys	Lys	Arg	Lys Lys Lys Thr
AGT	GAA	TCC	ACA	GAA	ACT						(SEQ ID N0:31)
Ser	Glu	Ser	Thr	Glu	Thr						(SEQ ID NO:32)

Sekvence (RKKK)₃ nebo její variace se mohou začlenit do plagmidu pl93NS F5F2K.

Tato sekvence zčásti obsahuje:

TCT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG

Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys ACT AGT (SEQ ID NO:77)

Thr Ser (SEQ ID NO:78).

Sekvence se může začlenit za použití 39-méru sense oligonukleotidu (RKKK)₃(s) (obsahuje sekvenci CT AGA AAG AAG AAG CGC ΆΆΑ AAA AAA AGA AAG AAG AAG A (SEQ ID NO: 79) ) a 39méru antisense oligonukleotidu (RKKK)₃ (a) (obsahuje sekvenci CT AGT CTT CTT CTT TCT TTT TTT TTT GCG CTT CTT CTT T (SEQ ID NO:80)). Výsledný plazmid pl93NS F5F2K(RKKK)₃ je znázorněn na obrázku č. 19. Tento plagmid je také znám jako pl93NS F5F2K(RKKK3), pl93 F5F2K(RKKK3) nebo pl93 F5FK(RK33). Relevantní část modifikované smyčky oblasti knob vlákna přítomného v pla$midu pl93 F5F2K(RKKK)₃ je:

CTT	AAT	GGC	ACT	AGA	AAG	AAG	AAG	CGC	AAA	AAA	AAA AGA AAG AAG
Leu	Asn	Gly	Thr	Arg	Lys	Lys	Lys	Arg	Lys	Lys	Lys Arg Lys Lys
ACT	AGT	GAA	TCC	ACA							(SEQ ID NO:33)
Thr	Ser	Glu	Ser	Trh							(SEQ ID NO:34)

Příklad 9:

Tento příklad popisuje konstrukci plasmidů, které obsahují chimérické proteiny s pentonovou bází, jenž zahrnují UTV nebo sekvence podobné UTV.

Transferový plagmid pACT (ÁRGD) (také popsaný jako plazmid pAT v US patentu 5,559,099) se zčásti získal manipulací plasmidů, který obsahuje jediný fragment BamHI/Pmel (13259 až 21561) genomu Ad5 a dále obsahuje mezi jinými protein s pentonovou bází s delecí 8 aminokyselin, vazebnou doménu a_v integrinu a substituci deletované oblasti pro aminokyseliny obsahující jedno restrikční místo Spěl, jenž je vhodné pro inzerci exogenních sekvencí.

Za účelem konstrukce plagmidu pACT (RKKK)₃ (také je znám jako pACT (RKKK3) nebo pACT (RK33) ) , který je znázorněn na • · obr. 20, se se přímo ligovaly komplementárně se překrývající oligonukleotidy RK33s a RK33a do plagmidu pACT (ÁRGD) štěpeného restrikčním enzymem Spěl, Pro ověření správné orientace klonu se použila metoda PCR s primer RK33a v případě plagmidu a upstream sense oligonukleotidový primer A5sl5002. Sekvenováním sekvence DNA oblasti inzertu za použití primeru A5sl5002 se také zjistilo, že plaSmid obsahuje správně orientovaný inzert. Relevantní část oblasti UTV, která povede ke vzniku chimérického proteinu s pentonovou bází v plagmidu pACT (RKKK)₃ je:

AAC

GAT

ACT

AGA

AAG

AAG

AAG

CGC

AAA

AAA

AAA

AGA AAG AAG

AAG

Asn

Asp

Thr

Arg

Lys

Lys

Lys

Arg

Lys

Lys

Lys

Arg Lys Lys

Lys

ACT

AGT

GCC

ACA

(SEQ ID NO

: 35)

Thr

Ser

Ala

Thr

(SEQ ID NO

: 36) .

Podobně za použití RK32s a RK32a překrývajících se primerů lze zkonstruovat plagmid pACT (RK32) (který je znám jako pACT (RKKK2) nebo pACT (RKKK) ₂), který je znázorněn na obr. č. 21. Relavantní část oblasti UTV přítomné v chimérickém proteinu s pentonovou bází v plagmidu pACT (RKKK) ₂ je

AAC

GAT

ACT

AGA

AAG

AAG

AAG

AGA

AAG

AAG

AAG

ACT AGT

Asn

Asp

Thr

Arg

Lys

Lys

Lys

Arg

Lys

Lys

Lys

Thr Ser

GCC

ACA

(SEQ ID

NO:37)

Ala

Thr

(SEQ ID

NO:38).

Příklad 10:

Příklad popisuje konstrukci plagmidů, které v adenovirovém hexonovém proteinu obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV, a zvláště které obsahují tyto sekvence ve vyčnívajících smyčkách adenovirového hexonového proteinu.

Konstrukce těchto plasmidů dává vznik jiným transferovým plazmidům, jako je plagmid pACT Hll, znázorněný na obr. č.22. Samotný plasmid pACT Hll se odvodil od plagmidu pACT • ·

(obsahuje Ad5 genom od pozice 13259 až 21561), který obsahuje většinu kódující sekvence hexonového proteinu (odpovídající přibližně pozicím 18842 až 21700) . Plazmid pACT Hll se může konstruovat začleněním restrikčního místa Xbal do oblasti smyčky 1 hexonového proteinu Ad5. Podobné způsoby se mohou použít při začlenění restrikčního místa Xbal nebo libovolného vhodného restrikčního místa do oblasti buď smyčky 1 nebo 2 nebo do jiné vyčnívající smyčky hexonového proteinu. Při amplifikaci oblasti smyčky 1 Ad5 DNA pomocí PCR se použily sense a antisense primery a ve stejnou dobu se zavedly mutace, které vedou jednomu mutovanému restrikčnímu místu Xbal v oblasti smyčky 1.

Zvláště se může použít sense primer se sekvencí GGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCA (SEQ ID NO: 81), který obsahuje přirozeně se vyskytující jediné restrikční místo Apal, které se vyskytuje v plagmidu pACT, a antisense primer ATCTTCACTGTACAATACCACTTTAGGAGTCAAGTTATCACCTCTAGATGCGGTCGCCT (SEQ ID NO: 82), který obsahuje jediné restrikční místo BsrGI. Produkt PCR obsahující restrikční místo Xbal se může štěpit restriktázou BsrGI a Apal a klonovat do plagmidu pACT za účelem nahrazení fragmentu Apal až BsrGI. Výsledný plažmid pACTHll obsahuje jediné restrikční místo Xbal, které je vhodné pro začlenění sekvencí UTV do smyčky 1 hexonu. Přítomnost restrikčního místa Xbal v klonu pACTHll se může ověřit restrikčním štěpením za použití Xbal, které může linearizovat plaSmid.

Část nemutované aminokyselinové sekvence hexonové smyčky 1 obsahuje sekvenci TEATGNGDNL (SE ID NO: 83) .

Aminokyselinová sekvence mutované hexonové smyčky 1, která následuje v plagmidu pACT Hll (obr. č. 22) po TEA zbytcích divokého typu, obsahuje sekvenci TASRGDNL (SEQ ID NO: 40)

• · · · (tato sekvence je kódovaná sekvencí nukleové kyseliny ACCGCATCTAGAGGTGATAACTTG (SEQ ID NO:39)).

Restrikční místo plaSmidu pACT Hll se pak může použít jako jediné restrikční místo, kam je možné klonovat univerzální cílové sekvence, jako je RKKKRKKK (SEQ ID NO:74) např. za použití přesahujících oligonukleotidů RK32s a RK32a. Určitý plagmid, který vznikne na základě takových manipulací, pACT Hll (RKKK)₂ (nebo pACT Hll (RK32) nebo pACT Hll (RKKK2) je znázorněn na obr. č. 23. Tento plasmid obsahuje sekvenci : ACC GCA TCT AGA AAG AAG AAA CGC AAA AAG AAG ACT AGA GGT GAT Thr Ala Ser Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Arg Gly Asp AAC TTG (SEQ ID NO:41)

Asn Leu (SEQ ID NO:42).

Jiné UTV nebo sekvence podobné UTV se mohou také klonovat do oblasti smyčky 1 hexonového proteinu a/nebo do oblasti smyčky 2 hexonového proteinu. Podobný přístup se může například použít při mutaci sekvence, která kóduje hexonovou smyčku 2 za vzniku plazmidu pACT H12 (není zobrazen), jenž obsahuje jediné restrikční místo (jako je restrikční místo Xbal), do kterého se mohou klonovat další sekvence UTV.

Plagmid pACT Hll (RKKK) ₃ (nebo pACT Hll (RKKK3) nebo pACT Hll (RK33) ) se může zkonstruovat za použití komplementárně se překrývajících nukleotidů RK33s a RK33a a přímou ligací produktu PCR do plasmidu pACT Hll štěpeného restrikčním enzymem Xbal. Ověření správné orientace klónu může proběhnout pomocí PCR za použití sense primeru RK32 v případě plasmidu a vhodného downstream antisense oligonukleotidového primeru. Sekvenováním sekvence DNA oblasti inzertu za použití downstream antisense primeru se zjistilo, že plasmid obsahuje správně orientovaný inzert. Podobné přístupy se použily při konstrukci analogových transferových vektorů, zvláště analogových transferových vektorů pACT H12 (RKKK)₂ a pACT H12 (RKKK)₃.

Přiklad 11:

Tento příklad popisuje konstrukci pla§midu, který má vláknitý protein s krátkou střední částí. Tento příklad zvláště popisuje konstrukci plasmidu pl93 F5F9sK.

Plazmid pl93 F5F9sK (také znám jako pl93 F5F9K-Short) je znázorněn na obrázku č. 24) . Tento vektor kóduje chimérický vláknitý protein, kde se odstranilo přibližně dvě třetiny střední části vlákna Ad5 a knob vlákna Ad5 se nahradil oblastí knob vlákna Ad9.

Plazmid pl93F5F9K-short se zkonstruoval z plagmidu pl93NS (F5*). Oligonukleotidové primery se sekvencemi GGACTAGTAGCATTTAATAA AAAAGAAGAT AAGCGC (SEQ ID NO: 84) a CCGGATCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG (SEQ IS NO:85) se použily pro amplifikaci sekvence Ad9, která kóduje poslední repetici střední části a oblasti knob genu vlákna. Produkt PCR se pak čistil za použiti standardních metod a štěpil se restrikčními enzymy Nhel a BamHI, což umožňuje klonování produktu PCR do oblasti Nhel/BamHI transferového plagmidu pl93NS (F5*). Výsledný vláknitý protein s krátkou střední částí se může použít při konstrukci adenovirových vektorů, jak se popisuje dále v textu. Do oblasti krátké střední části vlákna se může začlenit jedna nebo více dříve uvedených UTV nebo sekvencí podobných UTV a výsledné vlákno se může vnést do buňky.

Příklad 12:

Příklad popisuje konstrukci plaSmidů, které v prodloužené struktuře obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV, zvláště v proteinu s hexonovou a/nebo pentonovou bází tak, že výsledkem jsou prodloužené proteiny s hexonovou a/nebo pentonovou bází, které jsou schopny lépe kontaktovat buňky a podílet se na cílení buněk. Výsledné chimérické proteiny jsou vyčnívající ve smyslu, že obsahují inzerci sekvence nepřirozené aminokyseliny,

* · která bude vyčnívat z povrchu viru.

Při amplifikaci oblasti pentonového genu, která kóduje 32 aminokyselin α-helikální oblasti, která následuje po sekvenci RGD, se mohou použít primery lalpha(s) se sekvencí GGGCTGCAGGCGGCCGCAGAAGCTGAAGAGGCAGCCACACGGGCTGAGGAGAA (SEQ ID NO: 86) a lalpha(a) se sekvencí

GGGGTGCACACAGCTTCGGCCTTAGCGTTAGCCTGTTTCTTCTGAGGCTTCTCGACCT (SEQ ID NO: 87). Tato sekvence obsahující 32 aminokyselin obsahuje sekvenci ATRAEEDRAEAEAAAEAAAPAAQPEVEKPQKK (SQE IS NO:88). Používaná primery mohou také kódovat na každý konec přidanou α-helikální sekvenci tak, že například konečná amplifikovanásekvence DNA kóduje sekvenci:

CTG CAG GCG GCC

GCA GAA GCT GAA GAG GCA GCC ACA CGG GCT GAG

Leu

-Slfi

Ala

Ala

Ala

Glu Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg Ala

Glu

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

GCT

GCG

CAA

CCC

GAC

GTC

GAG

AAG

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

Glu

Ala

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

CCT

CAG

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAC

[SEQ ID NO:89] bys Lys Gin Ala Asn Ala Lys Ala Glu Ala Val His [SEQ ID NO:90] kde zvýrazněná sekvence odpovídá nepentonové sekvenci, kterou kódují primery, a podtržená sekvence reprezentuje aminokyseliny kódované kompatibilními restrikčními místy SfcI a Apall. Tyto aminokyseliny také chrání integritu alfa helixu, který je navržen standardním počítačovým programem tak, aby tvořil a helixovou strukturu.

• ·

Λ Λ » Λ

Produkt PCR kódující tyto aminokyseliny se může štěpit oběma restrikčníma enzymy SfcI a ApaLI, znovu ligovat a pak opět štěpit oběma enzymy. Ligace podobných míst chrání místa před opětným štěpením; avšak ligace kompatibilních, ale rozdílných míst porušuje tyto restrikční místa. Proto opětným štěpením ligovaného produktu vzniká několik fragmentů, které jsou násobky původní velikosti produktů PCR. Vzniknou kompletně štěpené fragmenty (přibližně 150 bp velké), fragmenty o přibližné velikosti 300 bp (mají porušené jedno restrikční místo) a fragmenty o velikosti 450 bp (mají porušená 2 restrikční místa) a podobně. Uvedený postup umožňuje zdvojit (2alfa), ztrojit (3alfa) a podobně původní sekvenci kódující 50 aminokyselin za účelem klonování velkých neporušených a helikálních oblastí do proteinu za účelem vytvoření většího vyčnívajícího nebo prodlouženého proteinu.

Například zdvojený produkt 2alfa (to je 2alfa2) se může klonovat do prvního re*?(srikčního místa PpulOI plagmidu pSPdelta (zobrazeného na obr. č. 25) za účelem vytvořit plazmid pSP2alfa (označený na obr. č. 26). Plazmid pSPdelta se zkonstruoval na základě báze plágmidu pUC19 nebo z jiného vhodného klónovacího plaSmidu. Transferový plazmid pSPdelta se může použít pro vytvoření dalších modifikací pentonového nebo hexonového proteinu, které umožňují UTV sekvenci (nebo libovolné jiné cílové sekvenci) se pozvednout ven z povrchu virionů. Toto vyzvednutí cílové sekvence ve vyčnívající struktuře (např. typ věž) bude minimalizovat prostorové blokování interakcí pentonu a hexonu s buněčným povrchem pomocí vláknitého proteinu a umožní větší úspěch interakce chimérických pentonových a hexonových proteinů s buněčným povrchem.

Plagmid pSPdelta obsahuje jediné Spěl klónovací místo vhodné pro inkorporaci sekvencí UTV. Klonovací místo Spěl je na obou stranách lemováno klonovacími místy Ppul, které ·· · ·· ····

umožňuji inkorporaci sekvencí DNA kódující aminokyseliny, jenž vyzvednou UTV sekvenci ven z povrchu viriouů. Plazmid pSPdelta se zkonstruoval klonováním přesahujících oligonukleotidů do jediného restrikčního místa Xbal plazmidu pUC19. Tyto nukleotidy jsou vytvořené tak, aby se mohly začlenit přímo do restrikčního místa Xbal. Sense oligonukleotid má sekvenci

CTAGAGCAGCTATGCATGAAGGGACTAGTGGAGAGATGCATGCAGCCT (SEQ ID NO:

91) . Antisense komplementární oligonukleotid má sekvenci CTAGAGGCTGCATGCATCTCTCCACTAGTCCCTTCATGCATAGCTGCT (SEQ ID NO:

92) . Oligonukleotidy se smíchají v ekvimolárních poměrech a klonují se do restrikčního Xbal místa plasmidu pUC19. Přítomnost správného inzertu se může potvrdit sekvenací křížové oblasti inzertu a štěpením plasmidu restrikční enzymem PpulOI. Restrikční místa Xbal umístěná na obou' stranách inzertu umožňují v pozdějších klonech vhodné odstranění této sekce.

Protože v plagmidu pSPdelta existují dvě restrikční místa PpulOI, plaSmid může být částečně rozdělen štěpením restriktázou PpulOI tak, že se štěpí pouze jediné místo. Ligace produktu PCR, který obsahuje restrikční místa ApaLI a SfcI, do kompatibilního restrikčního místa PpulOI poruší první PpulOI restrikční místo plasmidu a také poruší restrikční místa ApaLI a SfcI. Tyto porušená restrikční místa jsou zobrazena na obr. č. 26 (ukazují plazmid pSP2alpha2) jako j. Druhý zdvojený produkt se pak může klonovat do zbývajícího restrikčního místa PpulOI plasmidu pSP2alpha2 za účelem produkce plasmidu pSP2alpha2 znázorněného na obrázku č. 27. Uvedený plasmid obsahuje restrikční místo Spěl vhodné pro inzerci sekvence UTV nebo jiných cílových sekvencí. Počítačová analýza sekundární struktury předvídaného proteinu 2alfa2 potvrdila, že jde o celý a helix mimo oblast klonovacího místa Spěl.

·· ·

Zatímco plasmid pSPdelta obshuje sekvenci:

TCT AGA GCA GCT ATG CAT GAA GGG ACT AGT GGA GAC ATG CAT GCA

Ser Arg Ala Ala Met His Glu Gly Thr Ser Gly Glu Met His Ala

GCC TCT AGA (SEQ ID NO:43)

Ala Ser Arg (SEQ ID NO:44), plaSmid pSP2alpha obsahuje sekvenci:

TCT

AGA

GCA

GCT

ATG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

Ser

Arg

Ala

Ala

Met

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

Glu

Ala

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

Ala

G1U

Ala

Glu

Ala

Ala

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAG

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Val

Gin

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

GCC

ACA

CGG

CCT

GAG

GAG

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

CCT

GAG

AAG

AAA

CAG

GCT

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAT

GAA

GGG

ACT

AGT

GGA

GAG

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Vál

His

Glu

Gly

Thr

Ser

Gly

Glu

ATG

CAT

GCA

GCC

TCT

AGA

[SEQ ID

NO:45]

Met

His

Ala

Ala

Ser

Arg

[SEQ ID

NO:46],

a plaSmid pSP2alpha2 obsahuje sekvenci:

TCT AGA GCA GCT ATG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA GCC

Ser Arg Ala Ala Met Gin Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Ala Ala

ACA CGG GCT GAG GAG AAG CGC GCT GAG GCC GAA GCA GCG GCC GAA

Thr Arg Ala Glu Glu Lys Arg Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Glu

GCT GCC GCC CCC GCT GCC CAA CCC GAG GTC GAG AAG CCT CAG AAG

Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gin Pro Glu Val Glu Lys Pro Gin Lys

AAA CAG GCT AAC GCT AAG GCC GAA GCT GTG CAG GCG GCC GCA GAA

Lys Gin Ala Asn Ala Lys Ala Glu Ala Val Gin Ala Ala Ala Glu

GCT GAA GAG	GCA GCC ACA CGG GCT GAG GAG AAG CGC GCT GAG GCC
Ala	Glu	Glu	Ala Ala Thr Arg Ala	Glu	Glu	Lys	Arg	Ala Glu Ala
GAA	GCA	GCG	GCC GAA GCT GCC GCC	CCC	GCT	GCG	CAA	CCC GAG GTC
Glu	Ala	Ala	Ala Glu Ala Ala Ala	Pro	Ala	Ala	Gin	Pro Glu Val
GAG	AAG	CCT	CAG AAG AAA CAG GCT	AAC	GCT	AAG	GCC	GAA GCT GTG
Glu	Lys	Pro	Gin Lys Lys Gin Ala	Asn	Ala	Lys	Ala	Glu Ala Val
CAT	GAA	GGG	ACT AGT GGA GAG ATG	CAG	GCG	GCC	GCA	GAA GCT GAA
His	Glu	Gly	Thr Ser Gly Glu Met	Gin	Ala	Ala	Ala	Glu Ala Glu
GAG	GCA	GCC	ACA CGG GCT GAG GAG	AAG	CGC	GCT	GAG	GCC GAA GCA
Glu	Ala	Ala	Thr Arg Ala Glu Glu	Lys	Arg	Ala	Glu	Ala Glu Ala
GCG	GCC	GAA	GCT GCC GCC CCC GCT	GCG	CAA	CCC	GAG	GTC GAG AAG
Ala	Ala	Glu	Ala Ala Ala Pro Ala	Ala	Gin	Pro	Glu	Val Glu Lys
CCT	CAG	AAG	AAA CAG GCT AAC GCT	AAG	GCC	GAA	GCT	GTG CAG GCG
Pro	Gin	Lys	Lys Gin Ala Asn Ala	Lys	Ala	Glu	Ala	Val Gin Ala
GCC	GCA	GAA	GCT GAA GAG GCA GCC	ACA	CGG	GCT	GAC	GAG AAG CGC
Ala	Ala	Glu	Ala Glu Glu Ala Ala	Thr	Arg	Ala	Glu	Glu Lys Arg
GCT	GAG	GCC	GAA GCA GCG GCC GAA	GCT	GCC	GCC	CCC	GCT GCG CAA
Ala	Glu	Ala	Glu Ala Ala Ala Glu	Ala	Ala	Ala	Pro	Ala Ala Gin
CCC	GAG	GTC	GAG AAG CCT CAG AAG	AAA	CAG	GCT	AAC	GCT AAG GCC
Pro	Glu	Val	Glu Lys Pro Gin Lys	Lys	Gin	Ala	Asn	Ala Lys Ala
GAA	GCT	GTG	CAT GCA GCC TCT AGA				(SEQ ID NO:47]
Glu	Ala	Val	His Ala Ala Ser Arg				(SEQ ID NO:48]

Cílové sekvence, jako jsou UTV nebo sekvence podobné UTV, se mohou klonovat do restrikčního místa Spěl plasmidu pSP2alpha2. Zvláště překrývající se oligonukleotidy RK32s a RK32a se mohou klonovat do restrikčního místa Spěl za účelem vytvořit plasmid pSP2alpha2 (RKKK)₂ (nebo pSP2alpha2 (RK32) nebo pSPSalpha2 (RKKK2). Podobně se může zkonstruovat pla$mid pSP2alpha2 (RKKK)₃ (nebo pSP2alpha2 (RKK33) nebo pSPSalpha2 (RKKK3)). V jiném případě se může z plaSmidu odstranit celá α-helikální oblast 2alpha2 štěpením restriktázou Xbal a může se klonovat do kompatibilního restrikčního místa Spěl plazmidu pACT (ARGD) za účelem vytvořit plajmid pACT 2alpha2 (RKKK)3 (který se také může nazývat pACT 2alpha2 (RKKK2) nebo pACT 2alpha2 (RK32)). Podobných 'metod se může využít při produkci plaSmidu pACT 2alpha2 (RKKK)₃ (který se také může nazývat pACT 2alpha2 (RKKK3) nebo pACT 2alpha2 (RK33)).

• ·

Podobně se mohou klonováním 2alpha2 a helikální oblasti do restrikčniho místa Xbal plazmidu pACT Hll zkonstruovat vyčnívající chimérické hexonové proteiny (obsahující sekvence, které je prodlouží) za vzniku plazmidu pACT Hll 2alpha2 (RKKK)₂ (který je také znám jako pACT Hll 2alpha2 (RKKK2) nebo pACT Hll 2alpha2 (RK32)). Podobné metody se mohou využít při produkci plagmidu pACT H12 2alpha2 (RKKK)₂ (který je také znám jako pACT H12 2alpha2 (RKKK2) nebo pACT H12 2alpha2 (RK32)).

Příklad 13:

Tento příklad popisuje konstrukci dalších adenovirových vektorů, které obsahují v adenovirovém vláknitém proteinu sekvence UTV nebo sekvence jim podobné.

Při konstrukci adenovirových vektorů ve vláknu, které obsahuje modifikaci UTV, může odborník provést několika způsoby.Jeden způsob jak vytvořit UTV vláknité vektory z plaSmidů, které jsou popsány dřívá v textu, je linearizace plagmidové DNA pomocí restrikčniho enzymu Sáli a transfekce této DNA do buněčné linie 293, která se těsně před transfekci infikovala adenovirem, kterému se odstranila oblast E4. Adenovirové vektory s odstraněnou E4 oblastí nejsou schopny se replikovat v buněčných liniích jako je buněčná linie 293, která poskytuje pouze adenovirus, který obsahuje oblast El v poloze trans. Při rekombinaci plazmidů, které obsahují modifokovaný gen vlákna a oblasti E4 s DNA, jenž se oblast E4 odstranila, vzniká replikační komponent vektor E4, který nese modifikovaný vláknitý protein.

Plasmidy pl93NS(F5*) pGS(K7), pBSS 75-100 pGS(null), pBSS 75-100 pGS (RKKK) ₂, pBSS 75-100 pGS (RKKK) ₃, pBSS 75-100 pGS(tat), pl93NS F5F2K(RK32) a pl93 FF9sK se linearizovaly restrikčním enzymem Sáli a transfekovaly se s nimi buňky 293, které byly infikovány hodinu před transfekci, buď adenovirovým vektorem s deletovanou oblastí E4 GV11A.Z (který nese gen LacZ řízený cytomegalovirovým promotorem (CMV)) nebo GV11A.S (který obsahuje řízen promotorem CMV.

AdZ.F(pGS) ,

AdZ.F(RK32)) ,

AdZ.F(RK33) ) ,

AdZ.F5F2K(RKKK2)

AdZ.F(pK7) ,

AdZ.F(RKKK2) nebo

AdZ.F(RKKK3) (také znám

AdZ.F5F9sK gen alkalické fosfatázy, jenž je Výsledné adenovirové vektory AdZ.F(RKKK)₂ (také známé jako AdZ.F(RKKK)₃ (také znám jako AdZ.F(tat), AdZ.F5F2K(RKKK)₂ nebo AdZ.F5F2K(RK32)) a znám jako AdZ.F5F9K-Short) se získaly a cyklech tvorby plaků na buňkách 293.

Pomocí PCR oblasti inzertu a nebp jako (také čistily ve dvouch restrikční analýzou virové extrakce z buněk 293

DNA získané pomocí Hirtonovy infikovaných vektorem se ověřilo, správnou sekvenci. Westernová analýza (jak se popisuje dříve v textu), velikosti že všechny vektory obsahuji partikuli vektorem je-li to nutné, proteinu. Westernová s vektorem a/nebo se může také použít při testování analýza vláknitého proteinu z z lyzátů buněk infikovaných na polyakrylamidovém gelu v pohyblivosti vláknitého elektroforezováných korespondující posun ve srovnání s nemodifikovaným vláknitým proteinem v vykazuj e proteinu souladu s přítomností přidaných aminokyselinových sekvencí. Například westernová analýza partikul! AdZ.F(pK7) ověřila, že jejich vláknitý protein je posunut výše ve srovnání a který nese nemodifikované přítomností přídavných aminokyselin ve AdZ.F(pK7). Jiné plazmidové mapy, které znázorněné, se mohou vytvořit do (nebo vláknitým vlákno ve proteinem AdZ vektoru, shodě s vláknitém proteinu podobně jsou zde adenovirových vektorů využitím zde uvedených způsobů jejich minoritních variant).

Příklad 14

Tento příklad popisuje konstrukci adenovirových vektorů, které obsahují v adenovirovém proteinu s pentonovou bází UTV «· · · nebo sekvence podobné UTV. Způsob přípravy adenovirového vektoru, který obsahuje chimérický protein s pentonovou bází se popisuje například v publikaci Wickham et al·., J. Virol., 70, 6831-6838 (1996)). Vektor pACT popsaný dříve v textu, který obsahuje chimérický protein s pentonovou bází (např. transferové plazmidy pACT 2alpha2(RKKK) ₂, pACTH12 2alpha2 (RKKK)₂ a pACT (ÁRGD)) se může štěpit například restrikčním enzymem BamHI za účelem linearizace plazmidu. DNA Ad5 se štěpí restrikční endonukleázou Xmnl, která štěpí divoký typ Ad5 v pozicích 14561 a 15710 genomu Ad5. Dva větší fragmenty

se oddělily od menšího	kusu o	velikosti lkb	a	pak se
transfektovaly	spolu s	linearizovaným plazmidem	do	vhodné
buněčné linie	(např.	buněčná	linie 293)	za	vzniku
rekombinantního	viru.

Adenovirové vektory, které vznikají tímto způsobem se izolují od potencionálně kontaminovaných nemodifikovaných vektorů pomocí plakového čištění ve dvouch cyklech na buňkách 293. Restrikční analýzou virové DNA, která se získala následující Hirtonovou extrakcí vektorem infikovaných buněk 293, se ověřilo, že výsledné vektory obsahují správnou sekvenci v oblasti pentonové báze. Sekvenování produktů PCR, které vznikly amplifikací oblasti inzertu z virové DNA, se také mohou použít pro ověření přítomnosti inzertu. Westernová analýza chimérické pentonové báze zpracované elektroforézou na polyakrylovém gelu vykazuje odpovídající posun v pohyblivosti pentonové báze ve srovnání s nemodifikovanou pentonovou bází, což je v souladu s přítomností přidaných aminokyselinových sekvencí v chimérickém proteinu.

Příklad 15:

Tento příklad popisuje konstrukci adenovirových vektorů, které obsahují hexonovém proteinu UTV nebo sekvence podobné

UTV.

·· • ♦ · · • · ·· ·· · ·· ···· • · · · · ·

• · · · · · « ···· · · • · · · · ·»·· t ·· * ··· e ·

Pro konstrukci viru AdZ.H(RKKK)₂ se připravilo levé a pravé rameno vektoru, které obsahují sekvence DNA, které se překrývají a budou se rekombinovat na jedné straně se skevencí pACT H11(RK32) od restrikčního místa Pmel do BamHI za vzniku intaktního genomu AdZ.H(RK32). Při konstrukci levého ramene izolovaná DNA Ad5 je štěpena restrikčním enzymem Agel, který rozeznává v genomu Ad5 pozice 14499, 15283, 19017, 23063, 23656, 23411 a 31102. Fragment 0 až 14499 se může použít jako levé rameno a izoluje se od jiných fragmentů na gelové elektroforéze. Pravé rameno se může připravit štěpením DNA Ad5 s restrikčním enzymem Drdl. Restrikční endonukleáza rozeznává pozice 5458, 7039, 14004, 15593, 17257 a 21023. Fragment 21023 až 35938 bp se pak může použít jako pravé rameno a izoluje se od jiných fragmentů gelovou elektorforézou. Těmito dvěmi fragmenty spolu s fragmentem Pmel/BamHI vektoru pACT H11(RK32) se pak transfektují buňky 293. Restrikční enzym Pmel rozeznává v Ad5 pozici 13258 a BamHI štěpí Ad5 v pozici 21562. Podobné metody se mohou použít při produkci AdZ.H(RKKK)₃.

Příklad 16:

Tento příklad popisuje konstrukci vektorů, které obsahují vláknitý protein s krátkou střední částí.

Zde popsaný způsob konstrukce adenoviru z transferového plazmidu pl93 F5F9kshort se může podobně použít při konstrukci jiných adenovirových vektorů z vláken s krátkou střední částí. Transferový plazmid pl93 F5F9kshort, který obsahuje podstatnou oblast adenoviru E4, se štěpil restrikázou Sáli a transfektovaly se s ním buňky 293, které se hodinu před transfekci infikovaly adenovirovým vektorem AdSE.E4Gus. Vektoru AdSE.E4Gus chybí oblast E4 adenovirového vektoru a nemůže se replikovat v buňkách 293 za nepřítomnosti komplementace genů E4. Pouze jestliže se DNA AdSE.E4Gus

rekombinuje s plazmidovou DNA pl93 F5F9Kshort za účelem získáni genů E4, pak je vektor schopný se replikovat v buňkách 293. Během rekombinace nově vytvořený vektor také nabývá kódující sekvence mutovaného vláknitého proteinu, který je kódován plazmidy. Pět dnů po transfekci se izoloval plakováním lyzátů transfekovaných buněk rekombinantní E4⁺ adenovirus, který obsahuje vláknitou chiméru F5F9Kshort. Výsledný vektor AdSE.F5F9Kshort se izoloval a čistil standardními virologickými metodami, které zahrnují tvorbu plaků ve dvouch cyklech na buňkách 293. Pomocí PCR a restrikční analýzou se ověřilo, že vektor obsahuje správný inzert virové DNA. Oligonukleotidové primery, které jsou na obouch stranách genu vlákna, potvrdily, že produkt PCR má správnou velikost vlána, které kóduje zkrácený chimérický gen vlákna. Restrikční analýza vektoru DNA ukazuje, že nový vektor obsahuje správná restrikční místa, která jsou jediná v oblasti knob vlákna Ad9.

Příklad 17:

Tento příklad popisuje konstrukci adenovirových vektorů, které obsahují vláknité proteiny s krátkou střední částí a chimérické proteiny s pentonovou bází, které mají začleněné TW a sekvence podobné UTV.

V případě této konstrukce virová DNA AdS.F9sK se může štěpit restrikčním enzymem Xmnl jak se popisuje shora vtextu. Plazmid pACT H11(RK32) se pak štěpí restrikčními enzymy Pmel a BamHI. Virová a pla$midová DNA štěpená rstrikčními enzymy se čistí a transfektují se s ní buňky 293. Výsledné vektory se izolují plakovou purifikaci ve dvouch cyklech na buňkách 293 a restrikční analýza virové DNA získané Hirtovou extrakcí z buněk 293 infikovaných vektorem ověřila, že oblast pentonové báze obsahuje správné sekvence.

• · · ·

Sekvenování produktů PCR, oblasti inzertu z virové DNA se které vznikly amplifikací také může použít pro ověření přítomnosti inzertu. Westernová analýza chimérického proteinu s pentonovou bází na polyakrylamidovém gelu by měla odpovídající posun pohyblivosti chimérické srovnání s nemodifikovanou pentonovou bází, přítomností přidaných nepřirozených sekvencí (a nepřítomností nativních vykázat báze ve pentonové což je v aminokyselinových aminokyselinových souladu sekvencí).

Jiné plazmidy nebyly připraveni ve stejné nebo postupu. Zvláště může začlenit do ', jejichž mapa je zde do adenovirových vektorů slabě modifikované verzi uvedena, a které se mohou využívat zde uvedeného vláknitý protein s krátkou střední částí se vyčnívající protein s se může dále adenoviru, který má chimérickou pentonovou bází a do něhož UTV nebo sekvence podobné UTV.

začlenit

Příklad 18:

adenovirových

Tento příklad popisuje konstrukci které obsahují vláknité proteiny s krátkou střední chimérické hexonové proteiny, které inkorporují UTV nebo sekvence podobné UTV.

Virová DNA se může izolovat z vektoru s vektorů, částí a krátkou střední částí, jako restrikčními se štěpit přípravy hexonové i je AdZ.F9sK, a může enzymy za účelem obsahující chimérické jsou podobné těm, jak 17. Výsledný vektor by s krátkou střední částí do něhož j sou měl : shora popsanými vektorů, které proteiny. Všechny popsány obsahovat např. v vláknitý hexonový je začleněn UTV může použít v obsahuji různé a chimérický sekvence podobné UTV. různých transferových chimérické hexonové zahrnují UTV jiné kroky příkladu protein protein,

Tento přístup se plazmidech, které proteiny. Zvláště vláknitý protein s krátkou střední částí se • · · · může začlenit do adenoviru, který má vyčnívající chimérický protein a do něhož se může dále začlenit UTV a sekvence podobná UTV.

Příklad 19:

Tento příklad popisuje hodnocení vektorů, zvláště adenovirových vektorů podle vynálezu, které obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV.

Například v případě potvrzení předpokladu, že přidané UTV nebo sekvence podobné UTV neovlivňují sestavení viru, se musí odhadnout virová růstová kinetika vektoru. U vektoru pAd.F(pK7), který je reprezentant plazmidu, jenž obsahuje sekvenci UTV, se monitorovalo jeho růstové chování a srovnával se s adenovirem divokého typu (Ad5) , stejně jako s adenovirovým vektorem AdZ.F(RGD), který obsahuje inzerci RGD peptidového motivu přítomného v sekvenci SACDCRGDCFCGTS (SEQ ID NO:93). V těchto studiích se buňky 293 infikovaly s multiplicitou infekce 5 aktivních virových partikulí/buňku buď s Ad5, AdZF(RGD) nebo AdZ.F(pK7) a počet infikujících partikul! (fluorescenční ohniskové jednotky (FFU)) na jednu buňku se určilo následujícím shromážděním buněk 1, 2 nebo 3 dny po infekci. Titry AdZ.F(RGD) nebo AdZ.F(pK7) byly nižší než, ale ne významně odlišné od titru Ad5. Jak je možné vidět na obr. č. 28, maximální hodnota tirtů u AdZ.F(RGD) a AdZ.F(pK7) tvoří 80% a 56% titrů Ad5. Tyto výsledky potvryují, že růstové kinetiky dvou vektorů nejsou podstatně ovlivněny adicí sekvencí, zvláště UTV nebo sekvencí podobné UTV, na konec vláknitého proteinu. Výsledky také naznačují, že další vektory, které obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV, nevykazují odlišné růstové chování.

U vektorů, které obsahují UTV nebo sekvence podobné UTV, se může hodnotit, jak je jejich schopnost vázat se na buňky nebo zavádět geny do buňky inhibována negativně nabitými • · · · • ·

	- · · · φ e • · · · · · • ·····» e * * · · · · ···· · ·· ·	• · · · • · · · • · · · · · • · · • · · ·
		81
molekulami	(např.	heparin, sulfát heparanu,	sulfát
chondroitanu,	atd.)	1, rozpustnými adenovirovými	abalovými

proteiny nebo ošetřením buněk činidly (např. chondroitinázou, heparinázou, sialidázou, atd.), které štěpí takové negativně nabité části (např. Wickham et al., Nátuře Biotechnology, 14, 1570-1573 (1996)), stejně jako uvedené příklady). Rozpustný vláknitý protein nebude inhibovat většinu vazeb UTV vektoru na buňku (Wickham et al., Nátuře Biotechnology, 14, 1570-1573 (1996)). Tyto výsledky naznačují, že inkorporace UTV nebo sekvencí podobných UTV do pentonu nebo hexonu nebo do vlákna nebude poškozovat schopnost rekombinantního adenoviru obsahujícího chimérický obalový protein ovlivňovat zavedení genu.

Také studie infekce in vivo nebo in vitro transfekcí provedené v přítomnosti úplné krve se mohou využít k potvrzení, že UTV vektory podle vynálezu se neomezují pouze na systematické zavádění, které je způsobené saturací polykationtů na rekombinantní adenoviry s polyanionty v krvi. Takové vázání ohrožuje schopnost určitého viru tansdukovat cílovou buňku. Virus může být aplikován ve vyšší dávce, upřednostňuje se opatření, které redukuje libovolnou imunitní odezvu spojenou s takovou vyšší dávkou (např. aplikace jiného sérotypu adenovirového vektoru nebo metody popsané v mezinárodní přihlášce PCT WO 96/12406; Mastrangeli et al., Human Gene Therapy, 7, 79-87 (1996)).

SEKVENČNÍ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

5 (2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

5 (2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: peptid ·· ·· • · • · · (iii) Znaky:

(C) jiné informace: Xaa je Lys nebo Arg (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

5 (2) Údaje k SEQ ID NO:4 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: peptid (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4

Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys

15 (2) Údaje k SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) druh řetězce: jednožetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: peptid (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5

Ala Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys

2) Údaje k SEQ ID NO: 6 • · · ·

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 8 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:6

GGA TCC AA 8

Gly Ser (2) Údaje k SEQ ID NO: 7 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 30 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:7

GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT 30

Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Cys 15 10 (2) Údaje k SEQ ID NO: 8 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:8 • · · ·

GCC

GGA TCC AAC AAG AAT AAA GAA TCG

TTT

GTG

TTA

36

Ala

Gly

Ser

Asn

Lys

Asn

Lys

Glu

Ser

Phe

Val

Leu

1

5

10

(2) Údaje k SEQ ID NO: 9 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 55 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:9

TATGGAGGAT CCAATAAAGA ATCGTTTGTG TTATGTTTCA ACGTGTTTAT TTTTC ^J (2) Údaje k SEQ ID NO: 10 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 57 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jendořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:10

AATTGAAAAA TAAACACGTT GAAACATAAC ACAAACGATT CTTTATTGGA TCCTCCA 57 (2) Údaje k SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 43 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární ·· • · ··· · (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:11

TCCCCCCGGG TCTAGATTAG GATCCTTCTT GGGCAATGTA TGA (2) Údaje k SEQ ID NO: 12 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:12

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Chimérický adenovirový obalový protein, zahrnující nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci začleněnou do vnitřní sekvence obalového proteinu nebo místo ní, kde tento chimérický adenovirový obalový protein se efektivně váže na širší rozsah eukaryotických buněk než adenovirový obalový protein divokého typu a kde tento chimérický adenovirový obalový protein není selektivní pro specifický typ eukaryotické buňky.
2. 2. Chimérický adenovirový obalový protein, zahrnující nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci začleněnou do vnitřní sekvence obalového proteinu nebo místo ní, kde tento chimérický adenovirový obalový protein se efektivně váže na epitelovou buňku, buňku hladkého svalu, endotelovou buňku, fibroblastovou buňku, glioblastomovou buňku a monocytovou buňku.
3. 3. Chimérický adenovirový obalový protein, zahrnující nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci začleněnou do vnitřní sekvence obalového proteinu nebo místo ní, kde tento chimérický adenovirový obalový protein se efektivně váže na většinu všech eukaryotických buněk.
4. 4. Chimérický adenovirový obalový protein, zahrnující nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci, kde tento chimérický adenovirový obalový protein se váže na buňky HA SMC, buňky HuVec, buňky CPAE, buňky HS 68, buňky MRC-5, buňky U118 a buňky THP-1 efektivněji než vláknitý protein sérotypu 5 divokého typu
5. 5. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 4, kde tento chimérický adenovirový obalový protein se efektivně váže na v podstatě všechny eukaryotické buňky.
6. 6. Chimérický adenovirový obalový protein, zahrnující nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci, kde tento chimérický • · adenovirový obalový protein se efektivně váže na jednotku přítomnou na povrchu většiny všech eukaryotických buněk.
7. 7. Chimérický adenovirový obalový protein podle nároku 5, kde uvedenou jednotkou je záporně nabitá jednotka.
8. 8. Chimérický adenovirový obalový protein podle nároku 6, kde tento chimérický adenovirový obalový protein se váže na alespoň jednu povrchovou jednotku buněk, vybranou ze skupiny zahrnující heparin, heparinsulfát, kyselinu hyaluronovou, dermatansulfát, kyselinu sialovou, keratinsulfát a chondroitinsulfát.
9. 9. Chimérický adenovirový obalový protein podle nároku 6, kde uvedenou jednotkou je heparinsulfát.
10. 10. Chimérický adenovirový obalový protein podle nároku 6 nebo 7, kde uvedená jednotka je přítomna v podstatě na všech eukaryotických buňkách.
11. 11. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 10, kde uvedená nepřirozená aminokyselinová sekvence zahrnuje tři nebo více kladně nabitých aminokyselinových zbytků.
12. 12. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 11, kde uvedená nepřirozená aminokyselinová sekvence je ve vyčnívající smyčce uvedeného proteinu.
13. 13. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 12, zahrnující přirozenou aminokyselinovou sekvenci a karboxy-terminální nepřirozenou aminokyselinovou sekvenci obsahující 3 až asi 30 polylysinových aminokyselinových zbytků.

    ···* ·· • · · · · • · · · • · · ··· · ♦

    • ·
14. 14. Chimérický adenovirový obalový protein podle nároku

    13, kde uvedená přirozená aminokyselinová sekvence zahrnuje deleci alespoň jedné aminokyseliny.
15. 15. Chimérický adenovirový libovolného z nároků 1 až 14, obalový protein podle kde uvedená nepřirozená aminokyselinová sekvence zahrnuje intergenovou sekvenci.
16. 16. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 15, kde uvedená nepřirozená sekvence zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:1,

    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID

    NO:90 a SEQ ID NO:93.
17. 17. Chimérický adenovirový obalový protein podle nároku 16, kde uvedená nepřirozená aminokyselinová sekvence zahrnuje SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 a uvedené nepřirozené aminokyselinové sekvence zahrnují asi 3 až asi 30 lysinových zbytků.
18. 18. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 17, kde uvedený chimérický adenovirový obalový protein je vláknitý protein.
19. 19. Chimérický adenovirový obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 18, kde uvedený chimérický adenovirový obalový protein je hexonový nebo pentonový protein.
20. 20. Vektor, zahrnující nebo kódující obalový protein podle libovolného z nároků 1 až 19.
21. 21. Vektor podle nároku 20, kde uvedený vektor je virový vektor, vybraný ze skupiny zahrnující viry bez obalu.
22. 22. Vektor podle nároku 21, kde uvedený vektor je adenovirový vektor.
23. 23. Vektor podle libovolného z nároků 20 až 22, kde uvedený vektor zahrnuje cizorodý gen.
24. 24. Hostitelská buňka, zahrnující vektor podle libovolného z nároků 20 až 23.
25. 25. Způsob genetické modifikace buňky, vyznačující se tím, že se uvedená buňka uvádí do styku s vektorem podle libovolného z nároků 19 až 22.