JP2002101880A - 改変したエピトープを有するタンパク質及びその製造のための方法 - Google Patents

改変したエピトープを有するタンパク質及びその製造のための方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の新規タンパク質変異体の提供を課題
とする。 【解決手段】 本発明は低められた免疫応答を喚起する
タンパク質変異体を獲得するためにタンパク質のどのア
ミノ酸を改質させるかを選ぶ方法、及びそれに従って生
産したタンパク質を提供する。この変異体を含む組成
物、並びにそれらの特に洗剤及び医薬品における利用も
開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明はタンパク質、特に工業的に利用されている酵素
及び医薬品において利用されているタンパク質の改質、
並びにこれによって生産される改質タンパク質、かかる
タンパク質変異体を含む組成物、更には医学を含む種々
の分野におけるこの変異体の利用に関する。本発明に関
して、タンパク質を免疫学及びタンパク質化学方法を利
用してエピトープ地図化し、そして遺伝子工学を介して
事実上それらのアミノ酸配列を変え、これによってそれ
らの免疫活性を変えてそれらの抗原性を弱くし、これに
より本発明の酵素に対する暴露にかけられた人間を含む
動物においてアレルギー反応が生ずる危険性が低められ
る。 発明の背景 種々のタンパク質、例えば酵素は工業及び家庭において
ますます利用されてきている。タンパク質であること
で、それらは人間及び動物における免疫反応を刺激する
ことがあるであろう。
【０００２】その他のタンパク質、例えばホルモンは病
気及び疾患の種々の症状の処置及び／又は診断のための
医薬品においてますます利用されており、これらのタン
パク質は人間を含む動物の免疫系に注射されるか、又は
別の方法で提供される。
【０００３】提供の方法に依存して、この刺激は種々の
タイプの抗体の生産及び細胞応答をももたらしうる。こ
れらの経由のうち、少なくとも抗体の一タイプであるも
のは人間及び動物に有害な作用を有しうる。 IgEそして
おそらくIgG４の生産は例えば鼻炎、結膜炎等の症状を
示すアレルギー症状をもたらしうる。
【０００４】このようなタンパク質の利用の増大に伴
い、免疫学を基礎としたその他の有害な反応が見い出さ
れるであろうことを無視することはできない。
【０００５】タンパク質の利用におけるこれらの欠点は
長年知られており、そして種々の解決案がこれらを解決
するために利用されてきた。
【０００６】工業用酵素の分野において、製品に対する
暴露に由来するアレルギー反応による問題を回避するた
めに最も頻繁に利用されている方法は、この酵素を固定
化、粒状化及びコーティングすることによる種々の方法
においてこの酵素を調合してきており、これによって通
常の取扱い及び保存の際のタンパク質材料の任意の放出
を回避してきた。
【０００７】しかしながら、この解決案はこの酵素を、
それが相互作用することを意図する材料に接触させるこ
と、例えばこの酵素を溶液等になじませることを妨げ、
そして更にはこの酵素の若干の放出は暴露に対して感受
性である対象者におけるアレルギー反応の原因となりう
る。
【０００８】医薬品の分野において、数多くの利用され
ている方法は、特に人間もしくは相当の動物起原のタン
パク質、又は少なくとも一次構造が人間（もしくは問題
の動物）のタンパク質と同じであるタンパク質を利用し
ている。
【０００９】これは数多くの状況において有効であると
証明されているが、しかしながら問題のタンパク質に対
する動物の同等物の存在を定着させることが常に可能で
あるわけではなく、又は一定の改質化タンパク質は天然
タンパク質と比べて一定の利点を有することが見い出さ
れている。かかる状況において、処置を受ける又は診断
される対象者においてアレルギー反応が生ずる危険性が
ある。
【００１０】従って、タンパク質であってアレルギー反
応をあまり又は全っく発生させずに、それらの本来の活
性が、それらが機能し続けられる程度にまで保持され、
且つ、それら本来の目的に従って利用されうるタンパク
質の開発の要望がある。
【００１１】認識され、且つ、免疫学的に結合するタン
パク質分子の部分をエピトープと呼んでいる。例えば 3
0000ダルトンの範囲における分子にとっては、12エピト
ープぐらいあることがある。
【００１２】エピトープは免疫学的細胞及び抗体に結合
する。一定のエピトープは他のものより重要であり、こ
れらをマイナーエピトープと対比させてメジャーのもの
と呼んでいる。
【００１３】これらのエピトープにおけるわずかなる変
化はそれらの結合における結合力に影響を及ぼしうるこ
とが見い出されている(Walsh, B.J.とHowden, M.E.H.
(1989)：A method for the detection ofIgE binding s
equences of allergens basedon a modification ofepi
tope mapping, Journal of Immunological Methods,12
1, 275-280；Geysen, H.M., Tainen, J.A., Rodda, S.
J., Mason, T.J., Alexander, H., Getzoff, E.D.とLer
ner, R.A. (1987)：Chemistryof Antibody Binding to
a Protein. Science. 135, 1184-90； Geysen, H.M., M
ason, T.J. とRodda, S.J.(1988)：CognitiveFeatures
of Continuous Antigenic Determinants.Journal ofmol
ecular recognition.1, 32-41。
【００１４】これはおそらくはメジャーからマイナーな
エピトープへと変換された重要性の低められたかかる変
化したエピトープをもたらすことがあり、又はその結合
力を高い可逆性レベルにまで、即ち、有効でない結合に
まで弱めることさえもある。この現象はエピトープロス
と呼ばれることがある。
【００１５】上記の研究は全て、問題のエピトープを擬
態する合成ペプチド及びそれらの変異体に基づいて、研
究されているエピトープにおけるアミノ酸残基の相対的
重要度を立証するために実施されており、従ってこれら
の研究はタンパク質の三次構造においてのみ見い出せる
現象、例えば折りたたみ又は塩架橋の樹立が機能する、
完全タンパク質の一部としてのその自然環境におけるエ
ピトープのあらゆる効果を実証してはいない。 発明の概要 本発明の目的は、低められた免疫応答を喚起するタンパ
ク質変異体を獲得するために、タンパク質のどのアミノ
酸配列を改質するかを選ぶための方法、及びこのような
タンパク質変異体の提供にある。
【００１６】従って、本発明はその第一の観点におい
て、親タンパク質により喚起される応答と比べて、人間
を含む動物において低められた免疫原応答を喚起するタ
ンパク質変異体を生産する方法に関する。
【００１７】このため、このタンパクを免疫学及びタン
パク質化学方法を利用してエピトープ地図化し、そして
種々のエピトープを決定及び特徴付けする。
【００１８】これに続いて、前記エピトープの少なくと
も１つを、前記親タンパク質の発現についてコードする
DNA分子の突然変異を介して、又は前記変異タンパク質
の発現をコードする DNA分子の合成を介して変質させ
る。これはタンパク質工学業界において知られるよく樹
立された技術を利用して実施される。
【００１９】突然変異させた又は作製した DNA分子を次
に適当な宿主へのトランスフェクションの形質転換のた
めのベクターに挿入する。ここでこのベクターは機能的
であり、これにより前記の突然変異させた又は作製した
DNA分子は前記宿主のゲノムの中に機能的に組込まれ、
そして注目のタンパク質変異体はこの宿主の中で発現さ
れる。
【００２０】最後にこのタンパク質変異体を回収し、そ
して精製する。
【００２１】第二の観点において、本発明は上記の方法
により生産されたタンパク質に関する。この観点のもと
で、工業用酵素、例えば洗剤酵素、例えばプロテアー
ゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼもしくはオキシ
ダーゼ、処理酵素、例えばアミラーゼ、リアーゼ、リパ
ーゼもしくはセルラーゼ、医薬タンパク質、例えばホル
モン、例えばインスリン、 HCGもしくは成長ホルモン、
又は医薬酵素、例えばＶ因子、VII 因子、VIII因子、又
はその他のタンパク質、例えばインターロイキンもしく
はインターフェロンが特に注目される。
【００２２】第三の観点において、本発明は第二の観点
のタンパク質を含んで成る組成物、例えば洗剤、又は人
間を含む動物身体における種々の症状の予防及び／もし
くは緩和治療及び／もしくは診断において利用するため
の組成物に関する。
【００２３】第四の観点において、本発明は人間を含む
動物身体における種々の症状の予防及び／又は緩和治療
及び／又は診断におけるかかる組成物の利用に関する。 発明の詳細な説明 本発明の第１の観点に従い、タンパク質において機能的
に存在している種々のエピトープを見つけ、そして特徴
付けするためにエピトープ地図化を利用する。その後、
このエピトープにおけるどのアミノ酸を変えるかを選ぶ
ためにこの情報を利用する。
【００２４】現在よく樹立されている遺伝子工学の技術
を介してこの変化が実行され、そしてタンパク質変異体
が生産されたら、この新しいタンパク質変異体を分析
し、且つ、この変化がメジャーからマイナーへのエピト
ープ性又はエピトープロスへの変換をもたらしかを決定
するために免疫学及びタンパク質工学技術を利用する。
【００２５】この情報は、生産したタンパク質変異体が
そのタンパク質に関して樹立されている要求に対応する
か、又は何らかのその他の変化が実行されたかどうかを
明らかとするために用いる。
【００２６】本発明を介して、問題のタンパク質に対す
る暴露にかけられた環境及び動物に、低められた免疫
性、例えばアレルギー性、潜在的危険性を提供するであ
ろう、タンパク質、特に工業用酵素及び医薬タンパク質
を生産することが可能となった。
【００２７】従って本発明のタンパク質又は酵素の変異
体は、製造、使用に立ち合う人間（及び動物）並びに環
境に対して低い危険性を提供するであろう。
【００２８】タンパク質の地図化の実施において、注目
のタンパク質（対照タンパク質と呼ぶ）及び遺伝子工学
又は化学改質によって作ったその変異体を抗体の生産の
ために利用する。抗体は抗原における種々のエピトープ
を認識し、そしてその他のしばしば対応する抗原と交差
反応するポリクローナル（抗血清のような）、単一の抗
原を認識するモノ特異性、単一のエピトープを認識する
エピトープモノ特異性、又は単一のエピトープを認識
し、そして抗体を生産する細胞と不死細胞、例えば癌細
胞との融合を介して生産されるモノクローナルであるこ
とができる。
【００２９】ポリクローナル抗体はポリ特異的状態にお
いてタンパク質抗原と反応するであろう。即ち、抗原に
おけるそれぞれのエピトープとそれぞれが反応する数多
くの特異性を有するか、又は異なる対応エピトープと異
なる反応性を示すであろう。更に、ポリクローナル抗体
はしばしば対応の抗原と交差反応するであろう。モノ特
異性抗体は一定の抗原に対するその特異性に従って単離
されたポリクローナル抗体であり、かかるモノ特異性抗
体は通常非常に限定された数のエピトープにのみ特異的
であり、そして通常１エピトープにのみ特異的である。
【００３０】エピトープモノ特異性抗体は、一定のエピ
トープに対するその特異性に従って単離したポリクロー
ナル抗体である。かかるエピトープモノ特異性抗体は１
エピトープに対してのみ特異的であるが、しかしながら
それらはしばしばいくつかの種類の抗体生産細胞により
生産されることがあり、従って同一ではない。
【００３１】モノクローナル抗体は、抗体生産細胞と不
死細胞との細胞融合の現在よく樹立された技術によって
生産されたエピトープ特異性抗体である。１クローンよ
り生産されたモノクローナル抗体は全て同一である。
【００３２】生産された抗体は免疫用タンパク質抗原に
結合することができる。更に、もし完全又は部分的に同
一なエピトープが別のタンパク質の中に存在している
と、この抗体はそれらにも結合することが可能であろ
う。もし完全な同一性があるなら、認識及び結合性は同
じであろう。もし部分的に同一なエピトープがあるな
ら、その認識性は異なり、そして結合力は低いであろ
う。もしこのエピトープがないのなら、この抗体は結合
しないであろう。
【００３３】ポリクローナル抗体を利用する地図化は、
２段階に分けることができる： −ｉ）全ての注目のタンパク質に対する抗体調製物の反
応性の測定。
【００３４】−ii）別のものと反応させた後の、ある抗
原と反応するのに残っているその反応性の測定。
【００３５】（ｉ）由来の結果は、調べた変異体の免疫
性及びアレルギー性能力についての情報を提供するであ
ろう。これに従い、低められた能力を示すいくつかの変
異体は注目のタンパク質変異体であると証明されること
ができ、そして増大した能力を示すその他のものは免疫
学的見地から注目に値しないと考えられる。
【００３６】（ii）由来の結果は以下に関する情報を提
供するであろう： −iiａ）どのエピトープが多かれ少なかれ免疫性／アレ
ルギー原であるかを示す、エピトープにおける変化。
【００３７】−iiｂ）エピトープのロス（たとえある抗
原の最大濃度でさえも、対照抗原に対する反応性を完全
に撲滅しないであろう）、又は −iiｃ）新しいエピトープの樹立（たとえ対照抗原の最
大濃度でさえも、変異体に対する反応性を完全に撲滅し
ないであろう）。
【００３８】この情報より、生産のためにどの変異体を
利用できるかが明らかにされうる。
【００３９】特定のタンパク質変異体はタンパク質工学
の業界における当業者に現在よく知られている方法によ
り生産されることができ、そして莫大な数の刊行物、例
えば国際公開番号WO／06279 (NOVO INDUSTRIA／S)及び
国際特許出願 PCT／DK90／00164 (NOVO INDUSTRI A／S)
に記載されており、どちらものその関連の章を、本明細
書に参考として組れている。 実施例 選んだ対照タンパク質抗原はアルカリホスファターゼの
変異体、ズブチリシン309 、 SP436であり、その作製及
び生産はそれが示されている上記した国際公開番号WO／
06279 (NOVO INDUSTRI A／S)に詳しく記載されている
（ｉ）。 SP436変異体は野生型ズブチリシン309 に関し
てアミノ酸において２つの変化、即ち、 G195E＋M222A
を含んで成る。国際特許出願 PCT／DK90／00164 (NOVO
NORDISC A／S)は遺伝子工学によって作った更なる変異
体の生産を示している。野生型酵素は通常の発酵によっ
て生産され、そして抗体はラットに由来するポリクロー
ナルである。
【００４０】SP436分子は 269個のアミノ酸残基を含ん
で成るタンパク質であり、そしてこれはよく知られてい
るズブチリシン BPN′と比べて６つの欠失を有してい
る。種々のズブチリシンのアミノ酸配列についての更な
る参考のため国際公開番号WO／06279 (NOVO INDUSTRI A
／s)及び国際特許出願 PCT／DK90／00164 (NOVO NORDIS
K A／S)を再度参照されたい。ここではいくつかのプロ
テアーゼについてのアミノ酸配列、ズブチリシン BPN′
の配列に基づくズブチリシン酵素についての番号付け、
及びアミノ酸配列における変化を示すための表示法が記
載されている。それに由来する番号付け及び表示法を本
明細書及び添付の請求の範囲に採用する。 免 疫 試験動物としてラットを選び、これはそれらが論文に従
って、ヒト IgEをそのマスト及び好塩基性細胞膜上に結
合させることができ、且つ、ヒトのマスト及び好塩基性
細胞膜上に結合するであろう IgEを同時に有する唯一の
正常な研究室動物であることの事実に基づく。
【００４１】この動物を、３匹のラットづつの12のグル
ープに分けた。免疫のため、野生型(wt)ズブチリシン30
9 及びその11種の変異体を選んだ。これらを以下の表Ｉ
に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】注射量は常に30μｇ／動物／免疫とした。
各動物は６回の注射を受けた。
【００４４】選ばれた12種のタンパク質全てをフロイン
ドの完全アジュバントにおいて１回、フロインドの不完
全アジュバントにおいて１回、そして 0.9％のNaClにお
いて４回注射した。
【００４５】各免疫の１週間後に血液を採取したが、た
だし最終的な全採血に関しては、最後の免疫の５日後に
行った。
【００４６】凝血後、各グループにおける３匹の動物全
てに由来する血清をプールした。
【００４７】本報告において記載する分析作業は、３回
目の血液採取の後の12種の血清プールに基づく。
【００４８】分析作業は２シリーズの分析Ａ及びＤにお
いて行い、両方ともELISA技術である。Ａシリーズ： １又は複数枚のプレートのウェルをコート
するために１種類のタンパク質を利用した。このタンパ
ク質は天然（野生型）又は変異体でありうる。
【００４９】この分析において12種の異なる血清プール
をこのコート化ウェルの中でインキュベートする。この
血清全ては種々のタンパク質に対して喚起させてある。
もし変異体が類似であるなら、この血清はその反応パタ
ーンにおいても類似であると予測される。各血清プール
をそれ自体の一連のウェルの中で希釈系列において試験
した。
【００５０】ラットの抗体の潜在的な結合性は、ペルオ
キシダーゼラベル化抗ラット抗体の結合を介して識別さ
れる。
【００５１】もしラットの抗体がこの酵素コーティング
に結合するなら、それらはペルオキシダーゼラベル化抗
ラット抗体によって比例的な状況において結合されるで
あろう。
【００５２】この手法における色の存在は、酵素特異性
ラット抗体の存在の比例的な識別及び測定可能な表示を
提供する。
【００５３】簡単な手順は以下の通りである： １）固相の酵素コーティング。 ２）固相上の残留結合点のアルブミンブロッキング。 ３）希釈系列における血清をインキュベートし、このコ
ート化酵素に酵素活性抗体を結合させる。 ４）ペルオキシダーゼラベル化抗ラット（IgX)抗体。 ５）発色。 ６）測定。
【００５４】12グループの血清を上記の手順に従って、
１種類のタンパク質（即ち、wt又は変異体）に対する反
応性を調べた。種々のタンパク質を１つづつ、12グルー
プの血清により試験した。
【００５５】この応答を、特定のタンパク質、即ち、対
照によりもとから免疫された血清グループと比較した。
【００５６】これらの結果は個々タンパク質の抗体認識
能力に基づく情報を提供する。対照に対する３種類の反
応性、即ち、同じ／高い／低い反応性に分類することが
できた。以下の表IIを参照のこと。このアッセイのデザ
インのため、エピトープロス及び／又はエピトープ変化
（結合力の低下を示す）の現象は互いに区別できなかっ
た。
【００５７】
【表２】
【００５８】IgG応答（表II）は３通りの効果を示し
た： １）各血清グループ（抗−SP436 を除く) は、その他の
いずれのものよりもそれ自体の免疫原と強く反応する。
特に血清no.12(抗−wt）はその他のタンパク質に対して
劇的に低い応答を示す。 ２）いくつかの血清は他のものよりも一般に高い応答を
示す。ここの後者の特徴は IgG及び IgE分布と共に非常
に重要となる。いづれにせよ、このことは応答性動物に
おけるある種の個性に属することを排除することができ
ない。このような特徴はしばしば少ない動物の数の血清
（このケースのように３匹）のみをプールしたときに現
われる。 ３）S023を除き、試験したタンパク質それぞれに異常な
効果があった。このことは、試験タンパク質でないある
タンパク質によって免疫された動物に由来する血清が、
この試験タンパク質により免疫された動物に由来する血
清よりも強く反応するであろうことを意味する（水平
値）。
【００５９】これは、天然（大きな）タンパク質に対す
る抗体を生産するために用いた小さな合成ペプチドによ
る研究においても見い出させる特徴的な特色である。こ
こでは、天然分子の好ましいコンホメーションにおける
相異によって説明する。
【００６０】IgG応答（表II）は、 IgG応答に関して述
べた（１),（２）及び（３）に匹敵する効果を示す。
【００６１】ある免疫性タンパク質から別の類似のタン
パク質への変換は、SP436 を除く全てに関して低い IgG
及び IgE応答を示した。SP436から別のものへの変換は
これを、非常に顕著であるが、ただしその他のもので見
い出せるものに匹敵するレベルまでにのみ増大させた。
更にこれには異常な効果があり、これは以下のＤシリー
ズに関連して更に説明する。 Ａシリーズ：特定の血清を各分析において全く同一の変
異体により試験した。固相コーティングのためにこの変
異体を50μｇ／mlの濃度（リン酸緩衝液）で利用し、こ
れはほぼ単層の固相化をもたらす。この表層上の残留結
合点を牛血清アルブミン(BSA) によりブロックした。
【００６２】希釈系列において血清を試験し、血清の強
さに依存してまず20〜 800倍に希釈し、次いで２倍の系
列において希釈した。リン酸緩衝液はブロッキング剤 B
SA及び清浄剤を含む。
【００６３】トレーシングは、抗変異体抗体と、ペルオ
キシダーゼにコンジュゲートされた抗ラット抗体(KemEn
-Tecカタログno.Y3300；血清に用いたのと同じ緩衝液に
おいて1000ｘに希釈）との結合により実施する。
【００６４】識別は、存在するラットの抗変異体抗体に
比例して存在しているペルオキシダーゼに比例して色調
変化する、 OPD基質に対するペルオキシダーゼの酵素反
応を介して得られる。
【００６５】反応に関して高い能力を有する血清は他の
ものよりも高い反応を示すであろう。そしてこれは強さ
及び可能な相互反応性の判断をさせるであろう。 4.A.4 Ａシリーズ、分析２＋３ 以下の条件で前述の分析を行った。希釈率の考慮は同等
の応答を提供し、そして対照に対してこれらを「標準
化」させる（即ち、個々の血清のその免疫用変異体との
反応）。
【００６６】低い数値は、その血清が対照ほど希釈する
ことができなく、そして高い数値はその血清が対照より
希釈することができることを意味する。従って、49とは
対照の反応の0.49倍のみに、例えば対照が1000倍に比べ
てそのサンプルについては 490倍しか希釈できないこと
を意味する。
【００６７】これらの実験の結果を以下の表III に示
す。
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５】
【００７１】
【表６】
【００７２】これらの結果の解説を以下の「推論事項」
において詳しく説明する。Ｄシリーズ： ここでも１種のタンパク質を ELISAプレー
トにおけるウェルをコートするために用いた。更に、一
種の血清プールのみを対照として試験した。この血清は
一希釈においてのみ試験した。
【００７３】コート化ウェルに血清を加える前に、それ
らを別の組のウェルの中でタンパク質の野生型又は変異
体とプレインキュベートした。
【００７４】これらの別のウェルの中で、野生型又は変
異体の希釈系列を同じ濃度の対照とインキュベートし
た。従って、各ウェルは血清と、希釈系列に由来する特
定の希釈率の野生型又は変異体のいづれかを含む。
【００７５】タンパク質の濃度は、この希釈系列の一端
において抗原が過剰であり、そして他端において反応が
ほとんどないことを保障するように選んだ。従って、あ
るウェルにおいてはこのタンパク質はもしそれが特異的
に対応するならラットの抗タンパク質反応性の全てをブ
ロックすることができる。別のウェルにおいてはより多
くのラット抗体が未反応のままであり続けるであろう。
一緒にインキュベートしたタンパク質がラット抗体を作
るのに用いたものと非常に異なる場合、未反応の抗体が
利用した濃度に関係なく全てのウェルの中に残り続ける
であろう。
【００７６】血清と希釈タンパク質とのインキュベーシ
ョンの後、この反応混合物をコート化ウェルに移す。
【００７７】もしラットの抗体活性が完全に残っている
なら、これはウェル中のコート化タンパク質に結合し、
そして事実上このラット抗体にペルオキシダーゼラベル
化抗ラット(IgX) 抗体が結合し、そしてＡシリーズに前
記した通り発色が行われるであろう。
【００７８】このアッセイにおける結果は、一緒にイン
キュベートしたタンパク質がコート化のものに対応する
かしないかを示す。両者とも、エピトープ同一性（部分
的又は完全）又はエピトープの存在に対応する。
【００７９】このシリーズにおいて用いた変異体を以下
の表IVに示す： 表 IV Ｄシリーズにおいて利用したズブチリシン309 変異体WT
と比べたアミノ酸配列における変化：
【００８０】
【表７】
【００８１】22のサブアッセイより成るアッセイ当り１
グループの血清を用いた。各サブアッセイにおいて、血
清をwt又は希釈系列における１種の変異体と共に液相に
吸収させた。最後に、全く同じタンパク質に対して残っ
ている抗体を試験した。
【００８２】これにより各サブアッセイは、抗体反応の
除去及び何が残っているかの判定をもたらす。この手順
において、１グループの血清を21種のタンパク質全てに
吸収させ、そして最後に免疫に用いたオリジナルのもの
と同じタイプのものにより試験した。
【００８３】試験したタンパク質と比較した吸収させた
タンパク質におけるエピトープのロスとは、たとえ最大
の濃度でのこの吸収タンパク質によっても陽性の結果と
なることを意味する。図１〜６に示す通り、かかる変異
体に関するプロットは水平となり、対照の絶対吸収にお
いて見られる完全な効果に達しない。
【００８４】エピトープの変化は結合力の低下を意味す
る。従って、このサブアッセイのプロットは濃度の軸に
おいて異なって位置し、対照の絶対吸収に対する力価の
相違を提供するであろう。
【００８５】今までのところ、 SP436に対する抗血清し
か試験していない。
【００８６】図１〜６において、吸収の作用をプロット
した。第１ウェルは吸収すべき変異体又はwtを有さな
い、即ち、内部コントロールである。以降のウェルは濃
度の上昇する吸収性タンパク質を含む。
【００８７】基本的に２通りのタイプのプロットがあ
る。一つは全体的に値が低下するものである。他は水平
となり、最大濃度の吸収性タンパク質の存在にてさえも
ある程度の応答を残すものである。第１のタイプはエピ
トープの変化に対応し、そして第２のタイプはエピトー
プのロス（一般に結合エネルギーを低め、抗体結合にお
ける高い度合いの可逆性を付与する）に対応する。
【００８８】図１〜６より、以下のＳ番号のものが「水
平」となる：S003, S012, S019, S020, S022, S023, S0
24及びS026。S026は変異体E136Rを含み、そしてその位
置において試験した唯一の変異体であり、従ってS026は
判定の中に完全には含ませなかった。
【００８９】表Ｖにおいて、３つの分類に分けた、対照
SP436を含む21種のタンパク質全てに関する吸収の効果
を記載する。
【００９０】第１分類はno.195及び 222の位置における
アミノ酸の変化並びにその他の単独の位置の変化を組合
せたものの効果を示す。
【００９１】第２分類は、試験したその他の変化全てと
組合せたno.170の位置の変化を示す。
【００９２】第３分類は、試験したその他の変化全てと
組合せたno.251の位置の変化を示す。
【００９３】この試験血清はグループno. １の血清であ
る（抗−SP436)。
【００９４】結果はある固定した読取り値での力価とし
て測定し、そして対照に対する吸収容量（パーセントに
おける）へと再計算した。 表 Ｖ Ｄシリーズ、コート：SP436 、血清グループno. １全て
の値は血清グループno. １（＝ref.) に対比。全ての値
は、対照に対する吸収容量。
【００９５】
【表８】
【００９６】表 Ｖ（続き）
【００９７】
【表９】
【００９８】Ｄシリーズの結果 表Ｖから一つ一つのアミノ酸変化を考慮し、吸収容量を
対照と比較した： （ND＝本手順において識別不能）No.36： と 195＋222 (S021) ND と 170＋222 ＋251 ＋ (S022) ND と 120＋170 ＋222 ＋235 (S023) 少ない IgEの吸収 と 120＋170 ＋222 ＋235 ＋251 (S024) 少ない IgEの吸収No.89： と 195＋222 (S027) 多くの IgGを吸収、 且つ、より多くの IgEと吸収No.120： と 195＋222 (S006) NDNo.170： と 195＋222 (S003) NDNo.181： と 195＋222 (S028) 多くの IgGを吸収、 且つ、より多くの IgEと吸収No.195： 単独 (SP458) より少ない IgGを吸 収、且つ、より少な い IgEを吸収 と 222 (SP436) 更に少ない IgGを吸 収、且つ、更に少な い IgEを吸収No.222： 単独 (S001) より少ない IgGを吸 収、且つ、より少な い IgEを吸収No.235： と 195＋222 (S015) NDNo.251： と 195＋222 (S005) わずかに多くの IgG を吸収、且つわずか に多くの IgEを吸収 と 36＋120 ＋170 ＋222 ＋235 (S024) NDNo.271： と 195＋222 (S033) 多くの IgGを吸収 これらの結果を、Ｃα間の原子間距離の列挙した表VIに
おけるデーターと比べなくてはならない。
【００９９】エピトープサイズは典型的には半径10〜15
Åであり、そしてアミノ酸はこの領域において暴露され
がちである。
【０１００】この情報を３次元（３Ｄ）図と合わせるこ
とにより、どのアミノ酸が同じエピトープに属するか、
そしてそれ故同一の抗体が結合するであろうかを判断す
ることが可能となるであろう。
【０１０１】
【表１０】
【０１０２】まず、no.120＋235 は１つのエピトープの
中、そしてno.195＋251は別のエピトープの中で協力し
合うようである。
【０１０３】更に no.89及び 181は共に IgE及び IgGの
両者のより高い吸収を提供するであろう。no.251はわず
かに多くの両者を、そしてno.271はわずかに多くの IgG
をもたらす。
【０１０４】アミノ酸no.170は挙げたno. の全てにおい
て変化され、エピトープのロスをもたらす。これらのタ
ンパク質の最大の濃度にてさえも、この調製品から抗体
を完全に排除することはできないであろう。
【０１０５】単独のエピトープは反応性の約30％原因と
なり、従ってエピトープの総数が少ないことが予想され
うる。
【０１０６】更に、位置 136があたかもメジャーエピト
ープに対応するようである（図４参照）。S026が、位置
136が変化された唯一の変異体であるため、完全な所見
は異なる研究を待たなくてはならない。
【０１０７】以下の表VII に、ここで調べた位置の組が
同一のエピトープに属している可能性を記載する。
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】以上より、ズブチリシン309 の免疫学的能
力に影響及ぼすために以下のアミノ酸残基を変化させる
ように選んだ。
【０１１０】非極性：129, 131, 151, 152, 162, 168,
169, 172, 174, 175,176, 194, 196, 極 性：127, 128, 130, 153, 154, 161, 163, 167, 17
1, 173,193, 195, 荷 電：136, 170, 186, 197, 247, 251, 261, 荷電アミノ酸残基における変化が、ズブチリシン309 の
免疫学的能力に最大の効果を及ぼすであろうことが予測
される。推論事項 Ａシリーズの「データー抽出」の項、表III には、両方
向のアミノ酸（AA）変換に由来する結果が記載されてい
る。即ち、表III においては両方向の変異体に対する抗
血清が記載され、そしてこれらはそれらの免疫原及び同
一の位置に変化を含むその他の変異体により試験されて
いる。
【０１１１】WTから変異体に至る変化を観察することに
より、以下の効果が見い出せる：以下において「必須」
(essential) 「臨界的(critical)及び「存在」(presen
t) なる語は特定の位置におけるアミノ酸に関して用い
ている。これらの表現はGeysenらScience 135(1987)118
4-90に定義されている意味を有する。 Ｉ．AA no.120 はWTにおいて「必須」でないが、しかし
変異体においてはそうなる。
【０１１２】AA no.235 は 120と同じ！AA no.271 は 1
20と同じ！ II．AA no.251 はWTにおいて「必須」であるが、しかし
変異体においてはそうではない。 III ．AA no.181 は、変化 D181Nにおいて異常な効果を
示し、そして逆行変化 N181Dにおいて「必須」である。 IV. AA no.136 は両方向の交換において応答に大きな影
響を示す。
【０１１３】AA no.170 は 136と同じ。
【０１１４】AA no.195 は 136と同じ。
【０１１５】以下の交換データーは少なくとも２グルー
プ（それぞれ13及び11より成る）に分けることができ
る： Ｖ．列９, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 26,
27及び32は、単独突然変異において推測される累積効果
より予測される効果を示す。 VI．列10, 16, 18, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 30及び31
は、単独突然変異において推測される累積効果より予想
されない効果を示す。
【０１１６】Ｖ及びVIはAA no.36を含まずに推測したこ
とに注目すべきであり、なぜならここの変化において二
方向データーはありえないからである。従って、列24,
25,27, 29及び32は、AA no.36の交換を含ませるその後
の推測により異なるようになることがありうる。
【０１１７】両方向のデーターを伴う全てのAAは一定の
エピトープの中に関与してラインアップしている。それ
らの抗体による認識及び結合への影響はかなり異なる
が、しかし効果を全く有さないものはない。
【０１１８】グループＩ. 及びII. はどのAAが必須でな
いか、そして同じ位置においてその他が必須であるかを
例証する。
【０１１９】以上より、AA 120, 235 及び 271における
試験した変化は必須AAをもたらすであろう（おそらくは
変異体のエピトープにおいてさえも）。
【０１２０】更に、no.251の変化は必須AAを排除するよ
うである。
【０１２１】このことは人間において、野生型酵素に対
する反応と比べて低められたアレルギー反応をもたらし
うる。変異体分子に対する新規な抗体の生産の後、WT暴
露移し戻す（スイッチバック）によりそろって復活しう
る低反応性（抗−WT及び抗−変異体抗体による）があり
続けることがある。
【０１２２】最も興味深いグループは、no.181の変化が
異常な効果（即ち、抗−WT血清がそれ自体のWT免疫原よ
りもその変異体とより強く反応すること）を示すIII で
あり、そしてこのAAは抗−変異体血清にとって必須のよ
うである。
【０１２３】従って、これは非常に重要な位置のようで
あり、その変化にもとづいて高められた応答を、第１期
べースにおいて分子に暴露された個体のみでなく、変異
体とより強く反応することさえもあるWT酵素に対する抗
体を既に有している個体においても生じせしめることが
ある。
【０１２４】このことは、免疫学的見地よりこの位置は
避けるべきであることを意味する。
【０１２５】グループVIは、どちらの方向にてもそれ自
体の免疫原と最強に反応する抗血清を提供する変化を示
す。両方向における変化は低められた応答を示し、そし
てこの応答はそれ自体の免疫原に戻すことによって回復
する。
【０１２６】このことは人間において、変異体への転換
に基づく応答の瞬時の低下を意味するが、しかしながら
新たな抗変異体抗体が出現すると、その応答は回復しう
る。
【０１２７】免疫学的見地から、これらの変化は中立的
又は有利でさえもあると考えられる。
【０１２８】表III における残りの列は上記をある程度
実証し、そして効果の単純な累積が多重AA変換変異体に
おいて予測できないことを部分的に例証する。免疫学的
効果の任意の集積を確認するために更なる分析が必要で
ある。
【０１２９】単独又はいくつかのアミノ酸が変化してい
る分子を用いることにより、以下の効果が見い出せる： １．特定の位置における一定のアミノ酸はエピトープに
とって必須でないことあり、そしてその他はそうである
ことがある。 ２．特定の位置においては、試験した全てのアミノ酸が
エピトープにとって必須でありうる。 ３．あるアミノ酸の別のものへの交換は異常な効果をも
たらすことがある。更に、この新たなアミノ酸は「変異
体」分子にとって必須でありうる。
【０１３０】これらの発見から、以下の応答（症状を含
む）が、もとの分子に対して既に感受性である個体が、
改変分子に暴露されたときに見られうる： ｉ 直ちには変化は認められないが、短期間後での強め
られた応答。もとの分子への暴露に移し戻すことに基づ
き、応答が復活する。 ii 変化に基づく応答の低下。もとの分子への暴露に移
し戻すことに基づいて応答は復活。 iii 変化に基づく応答の上昇。もとの分子への暴露に基
づき瞬時の低下が認られる。これは変異体への変化の前
にもとの応答の強さに最終的に戻る。 iv 初期の応答における低下（これは復活する）。もと
の分子への移し戻しによる、応答の低下（これは非常に
早く復活する）。
【０１３１】免疫学的見地より、好ましい変換はグルー
プIIのタイプであろうが、しかしグループIVの変化のタ
イプも許容される。
【０１３２】本発明を特定の態様に関して例証したが、
本発明はこれらの態様に限定されることはなく、添付の
請求の範囲及び本明細書全体により規定される。
【図面の簡単な説明】
本発明を、特定の実施例及び添付図面を含む本明細書以
下の部分において更に詳しく説明及び例示し、ここで
【図１】対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数の、
その濃度の関数としてのプロットを示す。
【図２】対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数の、
その濃度の関数としてのプロットを示す。
【図３】対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数の、
その濃度の関数としてのプロットを示す。
【図４】対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数の、
その濃度の関数としてのプロットを示す。
【図５】対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数の、
その濃度の関数としてのプロットを示す。
【図６】対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数の、
その濃度の関数としてのプロットを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/50 Ａ６１Ｐ 1/14 // Ａ６１Ｋ 38/43 7/04 Ａ６１Ｐ 1/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 7/04 Ａ６１Ｋ 37/48

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 人間を含む動物において、その親タンパ
    ク質により喚起される免疫応答と比べて低められた応答
    を喚起せしめるタンパク質変異体を生産する方法であっ
    て、免疫学及びタンパク質化学方法を利用して前記完全
    タンパク質をエピトープ地図化し、エピトープを決定
    し、次いで前記エピトープのうちの少なくとも１つを、
    前記完全親タンパク質の発現をコードする DNA分子の突
    然変異又は前記タンパク質の発現をコードする DNA分子
    の合成を介して変化させ、次に当該突然変異させたもし
    くは作製した DNA分子をベクターであって当該ベクター
    が機能的である適当な宿主への形質転換又はトランスフ
    ェクションのためのベクターの中に挿入するか、又は前
    記突然変異させたもしくは作製した DNA分子を前記宿主
    のゲノムの中に機能的に組込み、前記タンパク質変異体
    をこの宿主の中で発現させ、そして回収する方法。
  2. 【請求項２】 前記タンパク質が工業用酵素である、請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記酵素が洗剤酵素である、請求項２に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記洗剤酵素がプロテアーゼ、リパー
    ゼ、セルラーゼ、アミラーゼ又はオキシダーゼである、
    請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記酵素がプロテアーゼである、請求項
    ４に記載の方法。
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