JP3311752B2 - 生体特異的多変数検定法 - Google Patents

生体特異的多変数検定法

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JP3311752B2 JP50299394A JP50299394A JP3311752B2 JP 3311752 B2 JP3311752 B2 JP 3311752B2 JP 50299394 A JP50299394 A JP 50299394A JP 50299394 A JP50299394 A JP 50299394A JP 3311752 B2 JP3311752 B2 JP 3311752B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生体特異的多変数（biospecific multipar
ameter）検定法に関する。
免疫検定（immunoassay）は、よく確立されたグルー
プの生体特異的検定であり、そして定例的な診断及び調
査実験において目下広範に使用されている。いまだ開発
中の他のグレープの生体特異的検定は、DNAハイブリダ
イゼーション検定である。生体特異的検定は、１又は数
個の生体特異的な反応体（例えば、抗体、DNAプロー
ブ）を使用し、そして正常には、これらの反応体の１つ
が標識されている。現在使用されている標識は、ラジオ
アソトープの、酵素の、発光性の、蛍光性の標識であ
る。
定例的な診断においては、多変数（多分析物）分析に
ついての増大する必要性が在る。不幸なことに、近年の
方法論は、異なる標識からそのシグナルの分光光度計に
よる分離が十分に効果的であないために、２又は３より
多くの同時標識の使用を許容することができない。異な
るラジオアイソトープ標識及び蛍光光度法標識の放射ス
ペクトルは、有意な重複をもち、そしてその結果、それ
らは、必要な濃度範囲にわたり、異なる分析物の不適切
な分離を提供する。
本発明の目的は、生体特異的な多変数検定のための方
法論を改良することである。
本発明は、検定されるべき異なる分析物に対応する異
なるカテゴリーの微小球（microspheres）の使用に基づ
く生体特異的多変数検定法であって、上記のカテゴリー
が、短い減衰時間（short decay time）をもつ異なる量
の内部蛍光染料を含んで成り、それぞれのカテゴリーの
微小球が、異なる生体特異的反応体により被覆され、以
下の段階： −上記の異なるカテゴリーの微小球を一緒に、懸濁液中
にプールし、そして検定されるべき分析物を含むサンプ
ルを、その懸濁液に添加し、 −標識された生体特異的反応体の混合物を、上記懸濁液
に添加し、上記分析物及び上記標識反応体及び微小球会
合反応体の間の生体特異的反応を開始させ、 −上記の懸濁液を希釈し、上記微小球に結合していない
標識反応体の濃度を減少させ、 −上記の内部蛍光染料を励起させ、そしてその放射蛍光
の強度を測定し、 −上記の蛍光放射を電気的シグナルに変換し、上記の短
い壊変時間の蛍光染料から生じた電気的シグナルの強度
に基づきそれぞれの微小球のカテゴリーを同定するこ
と、 を含んで成る検定法に関する。
この方法は、以下の （ｉ）上記の生体特異的反応体の標識が、化学−若しく
は生物−発光反応を作り出し又は触媒する化合物である
こと、そして、 −活性剤であって、上記の微小球の表面上の標識反応体
から、 化学−若しくは生物−発光を作り出し又は触媒するもの
を、上記の懸濁液に添加し、発光放射を作り出し、そし
て、 −上記の発光標識により作り出された光子放射から生じ
た電気的シグナルの強度に基づき、それぞれの微小球上
の分析物の濃度を測定すること；又は、 （ii）上記の生体特異的反応体の標識が、リン光性の化
合物であること、そして、上記のリン光性標識により作
り出された光子放射から生じた電気的シグナルの強度に
基づき、それぞれの微小球上の分析物の濃度を測定する
こと、 のいずれかを特徴とする。
用語“染料（dye）”を、以下に、微小球の内部蛍光
に対する関連において系統的に使用する。
用語“標識（label）”を、以下に、生体特異的な反
応体の標識付けに対する関連において系統的に使用す
る。この標識は、化学−若しくは生物発光反応又はリン
光性化合物を作り出す化合物である。
上記の発光標識は、活性化試薬を添加することにより
活性化される。上記のリン光性標識は、パルス光源によ
り活性化される。
本多変数検定を、人工的に作った微小球の懸濁液であ
って、本明細書中でカテゴリーという、異なる分析物に
対応する異なる微小球のプールを含んで成るものの中
で、行う。それぞれのカテゴリーの微小球を、最初に特
異的反応体（抗体、DNA、RNA）で被覆する、すなわち、
この微小球は、この特異的反応体及び生体特異的反応の
ための固体支持体として機能する。本発明は、実質的に
異なる時間において光子放射を作り出すシグナルの２つ
の源の使用を組み合わせる。選択の第一の可能性は、蛍
光微小球と発光標識との組み合わせである。本発明は、
特に、異なる分析物に対応するそれぞれのカテゴリーの
個々の微小球を識別するための蛍光染料と、生体特異的
反応の後にその微小球上の特定の分析物の濃度を検出す
るために使用される発光又はリン光性標識とを、組み合
わせるマイクロ光度計測方法論（microphotometric met
hodology）に関する。
直径１〜200μｍ（このサイズに限定されないが）を
もつ単一サイズの微小球を、僅かに親水性の特徴をもつ
適切なポリマー材料から作ることができ、そしてそれ故
に、それらは、水懸濁液に好適である。この微小球の表
面の性質は、物理的吸着により並びにその表面における
OH−基の活性化を通しての共有結合により（L.Johansen
et al.,J.Immunol.Methods 59,255−264,1983）、微小
球の結合をも可能にする。本発明においては、異なる分
析物の全てを含むサンプルを、短時間で可能な限りの完
全な反応を達成するために、可能な最小容量（例えば、
10〜100μｌ）の中で、微小球のプールと、及び標識反
応体のプールと共に、最初にインキュベートする。この
微小球の懸濁液中で、分析物の分子と標識反応体との間
の平均距離が非常に小さいので、この生体特異的反応の
平衡は、このインキュベーションの間に直ぐに達成さ
れ、そして結果として、一般的に文献中で“サンドイッ
チ”といわれる、標識反応体、分析物及び微小球表面に
固定化された反応体からなる結合体が、形成される。こ
のインキュベーションの後、懸濁液を、個々の微小球を
発光計測又はリン光計測により分析するために、適当に
希釈する。しばしば、１オーダーの希釈は、結合及び遊
離の画分の十分に効果的な分離に十分なものであること
ができる。なぜなら、本発明において使用される光度計
検出器は、光学的焦点における微小球起源のシクナル
と、周囲のバッファー溶液中の遊離標識からのシグナル
との間を、光学的に区別することができるからである。
十分な数の微小球を分析し、そしてそれぞれの微小球の
標識からのシグナルの強度を、コンピューター内に記録
する。
蛍光性微小球を、ポリマー材料を好適な短い減衰時間
の蛍光染料と組み合わせて、作ることができる。非常に
短い減衰時間をもつ蛍光染料は、例えば、POPOP、ビスM
SB、蛍光ランタニド（lanthanides）、蛍光無機微結
晶、フルオレセイン（fluorescein）又はローダミン（r
hodamine）等を、いずれかのモノマー（例えば、“Theo
ry and Practice of Scintillation Counting",Ed.J.B.
Birks,Pergamon Press,1967,pp.321−353中に討議され
ているようなもの）に添加することができ、そして固体
蛍光材料を、重合において形成される。この材料を、上
記と同一の段階において微小球に加工する。この蛍光染
料を、あるいは、微小球の表面にしみ込ませ、又は微小
球の表面に結合させることができる。この場合における
染料は、その粒子内に均一に分散されていないけれど
も、用語“内部”は、この場合をもカバーすると理解し
なければならない。この蛍光染料を、例えば、２つの要
因により互いに異なった実質的に異なる濃度における異
なるバッチのモノマーに添加する。選ばれた蛍光染料
が、発光又はリン光標識の放射バンドと重複しない吸収
バンドをもつということが重要である。
特定の多変数生体特異的検定法は、以前に紹介されて
いた。しかしながら、殆どの場合には、その多変数の方
法論は、異なる生体特異的反応体で被覆された空間的に
そして光学的に分離した反応領域をもつ固体支持体の使
用に基づくものであった（例えば、PCT WO 84/01031を
参照のこと）。人工的に作られた微小球の使用に基づく
多変数検定法も公開されている。これらの方法において
は、分析物のカテゴリーの識別は、異なるカテゴリーに
ついての異なるサイズの又は異なる色の微小球の使用に
基づいており、そしてその識別は、その直径又はその粒
子の吸収を光学的に計測することにより、起こる。米国
特許第5,028,545号は、短い減衰時間をもつ蛍光染料を
識別のために使用し、そして長い減衰時間をもつ他の蛍
光化合物をその生体特異的反応体を標識付けするときに
使用するような方法について記載している。しかしなが
ら、本発明は、後者とは異なっている。なぜなら、本発
明における発光標識の検出は、発光標識及び発光計測又
はリン光性標識及びリン光計測の使用に基づいているか
らである。
微小球表面における生体特異的反応体と会合した発光
標識は、それらの反応体及び必要は補因子及び付属の酵
素の光学的濃度の使用に基づく。化学発光（例えば、ペ
ルオキシダーゼ−ルミノール）又は生物発光（例えば、
ルシフェラーゼ−ルシフェリン）の反応のどちらかが、
使用できる。原核生物（ビブリオ（Vibrio）、フォトバ
クテリウム（Photobacterium）、キセノラダス（Xenorh
abdus）種等起源の）の、又は真核生物（例えば、Photi
nus pyralis、Pyrophorus plagiothalamus、Lampyris n
octiluca、Pholas dectylus、Vargula hilgendorfii、
等）の起源のいずれかのルシフェラーゼを、それらの基
質（ルシフェリン）、必要な補酵素、及び定常光タイプ
よりむしろフラッシュである光放射シグナルを作りだす
ための追加の酵素と一緒に、滴定することができる。最
適量の光蛋白、例えば、エクオリン（aequorin）、オベ
リン（obelin）、フォラシン（pholasin）又はオフィオ
フィリシン（ophiophilisin）を使用することもでき
る。ペルオキシダーゼ又はオキシダーゼを、化合物、例
えば、ルミノール又はアクリジン（例えば、ルシゲニン
（lucigenin））と一緒に使用し、本明細書中に記載す
る検出系に好適な発光シグナルを作ることができる。光
放射のエンハンサー及びモジュレーター（波長、放射速
度等）と一緒のこれらの系は、Campbell,A.“Chemilumi
nescence;principles and applications in biology an
d medicine",Weinheim;Deerfield Beach,Fl.;VCH;Chich
ester:Horwood,1988中により詳細に記載されている。酵
素的に作られた化学発光は、免疫検定において、そして
DNA/RNAプローブ検定において、より高い感度及び迅速
な検出を提供する。熱的に安定なジオキセタン（dioxet
anes）（例えば、AMPPD及びLumigen PPD）を、化学的に
そして酵素的に（例えば、アルカリ性ホスファターゼ又
はベータ−ガラクソシダーゼ）引き金を引き、化学発光
を作り出すことができる（Schaap et al.,1989,Clin.Ch
em.,35,1863−64）。先に記載したルシフェラーゼ又は
光蛋白が、組換えDNA技術により、IgG−結合プロテイン
Ａ又はＧに（Nilsson,B.＆ Abrahamsen,L.,in Methods
Enzy mol.,vol.185,pp.144−161,1990）、特異的組換え
抗体蛋白、例えば、一本鎖抗体に直接的に（Chiswell
＆ McCafferty,TibTech,10,80−84,1992）融合されるこ
とができ、それ故さらに、本法の応用性が強化されると
いうことも、強調されるべきである。
微小球表面における生体特異的な反応体と会合する別
のリン光性標識は、長い減衰時間をもつリン光化合物の
使用に基づいている。パルス光励起及び時間−解析検出
法を使用して、リン光性標識により作られたシグナル
を、高感度かつ広いダイナミック・レンジで、測定する
ことができ、そして短い減衰時間の蛍光染料により作ら
れたシグナルから効率的に分離することができる。この
効率的な分離は、その放射が、実質的に異なる時間にお
いて生じているという事実に基づいている。この蛍光染
料の減衰時間は、典型的には、ナノ秒のオーダー内にあ
り、そしてこのリン光染料の減衰時間は、ミリ秒のオー
ダー内にある。
時間解析の測定原理及びリン光の検出のために必要な
装置は、本質的に、長い減衰時間の蛍光の検出のために
正常に使用される装置と同様のものである（E.Soini ＆
al.Clin.Chem.,29/1（1983）65）。リン光は、蛍光の
場合にも同様に蛍光光子放射がその分子の電子軌道の励
起状態に起源をもつが、蛍光放射がそのシングレット状
態の減衰により発生するとき、リン光の光子放射はその
トリプレット状態の減衰により発生するような現象であ
る。これらの現象及び過程は、上記の科学的文献中にお
いて異なるものであることは明らかであり、そしてこの
ような放射を提供する化合物は、異なる構造及び物理化
学的性質をもっている。多数のリン光化合物が知られて
いるが、正常には、それらは、固体であり、又は低温に
おいてのみ有用である。この理由のために、これらの化
合物は、生体分子の標識付けのために使用されてこなか
った。しかしながら、特定のメタロポルフィリン（meta
lloporphyrins）は、室温において、そして有機溶媒中
でリン光性であることが発見されている（M.P.Tsvirko
＆ al.,Optica i Spectroskopia 34,1094−1100,197
3）。プラチナ−コプロポルフィリン（platinum−copro
porphyrin）及びパラジウム−コプロポルフィリン（pal
ladium−coproporphyrin）は、それらの化合物が水及び
酵素のクエンチングのための洗剤で保護される場合に
は、水溶液中でリン光を放射することが最近発見され
た。その結果、生体分子を標識付けするためにそれらを
使用するための考え及び可能性のある方法が導入された
（A.P.Savitsky ＆ ＆ al,Dokl.Acad.Nauk.USSR,304,,
1005,1989）。酸素は、トリプレット状態の強力な消光
剤であるが、酸素結合剤を使用してその測定溶液から除
去されることができる。このような剤の単純は例は、亜
硫酸ナトリウムである（Savitsky ＆ al.USSR特許第420
1377号）。ランタニド（lanthanide）キレートと比較し
た場合のポルフィリンの利点は、380〜400nmの範囲内の
励起光の強い吸収であり、この時、ランタニド・キレー
トは、280と360nmとの間のUVレンジ上にそれらの吸収及
び励起をもっている。後者は、特別な光学装置を必要と
し、そしてより高価な装置導入につながる。プラチナ−
コプロポルフィリン及びパラジウム−コプロポルフィリ
ンの放射波長レンジは、640〜670nmである。
本発明を、添付の図面を参照して、より詳細に説明す
る。図１は、本発明に記載の方法を有効にするための装
置の態様を図示している。液体処理のために、適切なバ
ルブ及びポンプが必要である。しかしながら、これら
を、図１中に示していない。異なる分析物に対応する異
なるカテゴリー内の蛍光微小球を、主要な生体特異的反
応体（抗体、DNA等）で被覆し、そして容器内の懸濁液
中に一緒にプールする。サンプル（２）の10μｌ部分
（例えば、血清）及び発光標識又はリン光標識（３）に
より標識されたもの第二生体特異的反応体の10μｌ部分
を、反応室（４）にインジェクトし、そして正確に制御
された時間にわたり（例えば、数分間以上）適切な温度
（例えば、37℃）でインキュベートする。次に、この微
小球の懸濁液を、容器（５）から取り出したバッファー
溶液（例えば、100mM Na−Ｋ−リン酸塩、pH7.4、0.9％
NaCl、BSA1mg/ml）で、希釈及び洗浄する。この洗浄段
階の間に、この微小球を、フィルター膜、磁気力又は他
の手段により反応室内に固定化する。この微小球の懸濁
液を、蛍光検出器（９）から得られた短い減衰時間の蛍
光染料のシグナル強度に基づき、その微小球のカテゴリ
ーを決定するために、単色光源（８）により投光された
キャピラリー蛍光検出室（７）に移す。次に、この懸濁
液を、この発光反応の活性化剤として又はこのリン光標
識の増強剤として作用する活性化剤溶液（11）の一部と
共にキャピラリー検出室（10）に移す。この微小球と会
合した分析物の濃度を、上記の発光標識から又は上記の
リン光標識からのシグナル強度の決定により測定する。
放射された光子を、上記の検出室（10）に光学的に接続
されている光子カウンタ（12）により検出する。この光
子を、電子計数装置（13）により記録する。
発光標識の場合には、第二試薬をビオチンにより標識
することができ、そしてその結果として、その標識試薬
を発光反応に適切な形態に変換するために、例えば、ホ
タルのルシフェラーゼにより共有結合により標識された
ストレプトアビジンを、反応室（４）内に添加する必要
がある。検出のために使用される他の多くの発光反応
が、類似の追加の段階を必要とするかもしれない。この
発光は、発光活性化剤のインジェクションによる活性化
を必要とし、そして本発明の場合には、その活性化剤溶
液（11）は、ルシフリン、すなわち、ホタルのルシフェ
ラーゼの基質（例えば、0.1M Tris−Cl、pH7.75、0.1mM
D−Luciferin、0.1mM ATP、１μＭピロホスフェート、
1mM MgCl2及び１μＭコエンザイムＡ）を含む。
リン光標識の場合には、上記の第二試薬は、最大シグ
ナル強度及びリン光放射の最小消光の条件を最適化する
たけめに使用される容器（６）又は（11）から取り出さ
れた増強剤（例えば、4mg/mlの亜硫酸ナトリウム及び１
％Triton X−100を含むpH7.2〜7.4のバッファー溶液）
を必要とすることができる。上記の検出室を、パルス光
源（14）により投光し、そして放射された光子を、640
〜670nmレンジ上で検出し、そして時間解析計数機能を
取り込んだ電子計数装置（13）により記録する。検出室
（７）及び（10）を、あるいは、単一の物理的ユニット
に結合することができる。
両方の場合において、微小球内の分析物濃度の検出
を、光電子増倍管又は他の適切な光子検出又は画像検出
器（CCD）を使用してその光子放射のシグナル強度を測
定しながら、行う。上記のキャピラリー検出装置（７）
及び（10）を、１つのユニットに結合することもでき
る。さらに、微小球の分析を、静止状態において、又は
断続−流れ系で行うことができる。それぞれの分析物に
ついての必要な統計的な精度のために十分な量の情報を
得るために、十分な数のランダムに流れる微小球を、同
定し、そして分析する。
上記のマイクロ光度計測検出は、微小球関連放射と溶
液関連放射との間を区別することができる。なぜなら、
そのマイクロ光度計測の焦点における濃度とその希釈さ
れた懸濁液中における濃度のそれぞれが、大きなオーダ
ーの大きさで異なっているからである。この検出の概念
は、遊離及び結合画分の適切な分離を提供するが、必要
により、それは、正常な分離方法（洗浄、濾過、遠心分
離等）を使用して、より効率的にされることができる。
本発明関連の方法は、先に延べた特徴を組み合わせて
おり、そしてその機能を実施する装置を、多くの異なっ
た方法で具現化することができる。本発明の目的は、同
一サンプル中の多変数検定を行うという目的のために、
異なる分析物カテゴリーに対応する個々の微小球のそれ
ぞれを同定することである。この同定は、先に記載した
ような蛍光の検出に基づいている。適切な測定系におい
て、内部蛍光染料の短い減衰時間の蛍光及び標識由来シ
グナルを、別々に検出することができる。なぜなら、そ
れらが、異なる時間に生じるからである。特に、短い減
衰時間の蛍光の減衰時間がナノ秒オーダー内にあるとき
は、その放射シグナルは、発光反応が活性化された時、
又はリン光シグナルが測定される時、完全に減衰され
る。このことが、本発明のきわめて重大な点であり、そ
して、上記の速い減衰蛍光物質を、発光計測又はリン光
計測による分析物の濃度の測定に対するいかなる有意な
妨害を伴わずに、微小球のカテゴリーを同定するため
に、使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/50 - 33/98

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】検定されるべき異なる分析物に対応する異
    なるカテゴリーの微小球の使用に基づく生体特異的多変
    数検定法であって、上記の異なるカテゴリーの微小球
    が、ナノ秒のオーダーの短い減衰時間をもつ異なる量の
    内部蛍光染料を含み、それぞれのカテゴリーの微小球
    が、異なる生体特異的反応体により被覆され、以下の段
    階： −上記の異なるカテゴリーの微小球を、一緒に、懸濁液
    中にプールし、そして検定されるべき分析物を含むサン
    プルを、その懸濁液に添加し、 −標識された生体特異的反応体の混合物を、上記懸濁液
    に添加し、上記分析物及び上記標識反応体及び微小球会
    合反応体の間の生体特異的反応を開始させ、 −上記の懸濁液を希釈し、上記微小球に結合していない
    標識反応体の濃度を減少させ、 −上記の内部蛍光染料を励起させ、そしてその放射蛍光
    の強度を測定し、 −上記の蛍光放射を電気的シグナルに変換し、上記の短
    い減衰時間の蛍光染料から生じた電気的シグナルの強度
    に基づきそれぞれの微小球のカテゴリーを同定するこ
    と、 を含み、 以下の （ｉ）上記の生体特異的反応体の標識が、化学−若しく
    は生物−発光反応を作り出し又は触媒する化合物である
    こと、そして、 −活性剤であって、上記の微小球の表面上の標識反応体
    から、 化学−若しくは生物−発光を作り出し又は触媒するもの
    を、上記の懸濁液に添加し、発光放射を作り出し、そし
    て、 −上記の発光標識により作り出された光子放射から生じ
    た電気的シグナルの強度に基づき、それぞれの微小球上
    の分析物の濃度を測定すること；又は、 （ii）上記の生体特異的反応体の標識が、リン光性の化
    合物であること、そして、上記のリン光性標識により作
    り出された光子放射から生じた電気的シグナルの強度に
    基づき、それぞれの微小球上の分析物の濃度を測定する
    こと、 のいずれかを特徴とする検定法。
  2. 【請求項２】前記の内部蛍光染料が、ナノ秒のオーダー
    の短い減衰時間を時間をもつ蛍光化合物であることを特
    徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記短い減衰時間をもつ蛍光化合物がPOPO
    P又はビス−MSBであることを特徴とする請求項２に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】前記の生体特異的反応体の標識が、化学−
    若しくは生物発光を作り出し又は触媒する化合物である
    ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方
    法。
  5. 【請求項５】前記化学−若しくは生物発光を作り出し又
    は触媒する化合物がペルオキシダーゼ、ルミノール、ル
    シフェラーゼ、レシフェリン又はそれらの誘導体である
    ことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記の生体特異的反応体の標識が、前記の
    内部蛍光染料のものよりも実質的に長い減衰時間をもつ
    リン光性化合物であることを特徴とする、請求項１又は
    ２に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記のリン光性化合物が、白金−コプロポ
    ルフィリン又はパラジウム−コプロポルフィリンの誘導
    体であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】生体特異的な多変数検定法の検定試薬キッ
    トであって、 −検定されるべき異なる分析物に対応する異なるカテゴ
    リーの微小球であって、異なる量の内部蛍光染料を含
    み、それぞれのカテゴリーの微小球が生体特異的な反応
    体で被覆されているもの、の調製懸濁液、及び、 −リン光性化合物により又は化学−若しくは生物発光を
    作り出し又は触媒する化合物により、標識された生体特
    異的な化合物の混合物を含むキット。
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