JP3267333B2

JP3267333B2 - 融合タンパク質

Info

Publication number: JP3267333B2
Application number: JP19264392A
Authority: JP
Inventors: ジョンリップスコウムマーチン; ジョージチャールズイアン; フレイザーフェアーウェザーネイル
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1991-06-11
Filing date: 1992-06-10
Publication date: 2002-03-18
Anticipated expiration: 2017-03-18
Also published as: US5589384A; JPH06206900A; GB9112553D0

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、融合タンパク質、それらのプレ
パレーションおよび使用に関する。

【０００２】コレラトキシン（ＣＴ）および大腸菌の非
耐熱性トキシン（ＬＴ）は、それぞれコレラ菌（Ｖｉｂ
ｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）腸管毒産生株によって産生
される、きわめて類似したタンパク質である（Ｃｌｅｍ
ｅｎｔｓ＆Ｆｉｎｋｅｌ−ｓｔｅｉｎ，１９７
９）。ＣＴ同様、ＬＴは、２８ｋＤａのＡサブユニット
（ＬＴＡ）と、５つの同一の１１．５ｋＤａモノマーか
らなる非共有結合で会合した非耐熱性Ｂサブユニット
（ＬＴＢ）から構成されている。Ａサブユニットが毒性
に関与し、標的細胞のアデニレートシクラーゼ複合体を
不可逆的に活性化するＮＡＤ−リボシル化活性を有する
（Ｍｏｓｓ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９７８）。
毒性のあるＡサブユニットの細胞内への侵入は、非毒性
Ｂサブユニットによって促進される。このＢサブユニッ
トは５６ｋＤａペンタマーからなり、ＧＭ_１、モノシア
ロガングリオシドトキシン受容体に結合する（Ｃｕａｔ
ｒｅｃａｓａｓ，１９７３）。ＧＭ_１は、粘膜上皮を含
めて、哺乳動物の様々な組織の表面上に存在する。

【０００３】ＣＴ、ならびに非毒性サブユニットＣＴＢ
およびＬＴＢは、経口的または経鼻的に投与した場合、
一部はＢサブユニットのＧＭ_１結合性によるものと考え
られる、異例に強力な粘膜免疫原性を示す（Ｐｉｅｒｃ
ｅ，１９７８）。これは、経口的に投与した場合は免疫
原性が弱く、最高でもわずかな分泌性免疫応答を誘導す
るのに大量の抗原を要する大部分のタンパク質とは対照
的である。ＣＴも全身性応答を誘導し、この経路で投与
された可溶性タンパク質に共通した特徴である経口耐性
は誘発されない（ＤｅＡｉｚｐｕｒｕａ＆Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ，１９８８参照）。

【０００４】ＣＴＢおよびＬＴＢは、ワクチンの可能性
について、とくに異種抗原の標的送達用アジュバントと
して、興味がもたれてきた。ＣＴＢは、経口的（Ｃｚｅ
ｒｋｉｎｓｋｙら，１９８９；Ｌｉａｎｇら，１９８
８）または経鼻的（Ｂｅｓｓｅｎ＆Ｆｉｓｃｈｅｔ
ｔｉ，１９８９；Ｔａｍｕｒａら，１９８８）に投与し
た場合いずれも、化学的にカップリングされた抗原への
免疫応答を増強することが明らかにされている。とくに
興味があるのは、経鼻的に投与した場合の、化学的にカ
ップリングされたタンパク質または共投与したタンパク
質に対する粘膜性免疫の刺激である（ＭｃＫｅｎｚｉｅ
＆Ｈａｌｓｅｙ，１９８４；Ｔａｍｕｒａら，１９
８８）。

【０００５】抗原の、キャリヤータンパク質たとえばＬ
ＴＢへの遺伝子融合は、化学的カップリングに比べて多
くの利点がある。抗原、または任意の所望の配列のエピ
トープを特定する短いペプチドフラグメントを、キャリ
ヤーのカルボキシまたはアミノ末端に融合させることが
できる。このようにして、融合タンパク質は、バッチ毎
に一貫した、容易に分析できる特定の組成を有すること
になる。ＬＴＢまたはＣＴＢの、異種抗原への遺伝子融
合については、これまでいくつかの報告がある（Ｇｕｚ
ｍａｎ−Ｖｅｒｄｕｚｃｏ＆Ｋｕｐｅｒｓｚｔｏｃ
ｈ，１９８７；Ｓａｎｃｈｅｚら，１９８８；Ｓｃｈｏ
ｄｅｌ＆Ｗｉｌｌ，１９８９；Ｄｅｒｔｚｂａｕｃ
ｈ＆Ｍａｃｒｉｎａ，１９８９；ＷＯ８６／０６
６３５；ＷＯ９０／０６３６６）。キメラタンパク質
がネイティブなキャリヤーに類似の構造および性質を示
した（Ｄｅｒｔｚｂａｕｃｈら，１９９０）場合もある
が、他の変化またはＬＴＢキャリヤーへの付加では、ネ
イティブな分子の性質の一部またはすべてが破壊された
（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９０；Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ
ら，１９８７）。Ｓｃｈｏｄｅｌ＆Ｗｉｌｌ（１９
８９）は、ＬＴＢに融合したＢ型肝炎ウイルス配列を発
現する弱毒化サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｄ
ｕｂｌｉｎ）を与えたマウスで抗ウイルス抗体を検出す
ることができなかった。

【０００６】本発明によれば、生物活性を有するアミノ
酸配列が、ＧＴＰアーゼをＡＤＰ−リボシル化できるエ
ンテロトキシンのＢサブユニットのアミノ酸配列の十分
なＣ末端に、２〜８個のグリシン−プロリン反復配列か
らなる介在ヒンジを介して融合してなる融合タンパク質
を提供する。

【０００７】融合タンパク質は、正しくフォールディン
グされ、安定なペンタマーに組み立てられる。融合タン
パク質はＧＭ_１−ガングリオシドに結合することが可能
で、一方、生物活性を有するアミノ酸配列を提供する。
したがって、異種エピトープを提供する融合タンパク質
はワクチンとして使用することができる。医薬的活性を
有するアミノ酸配列を提供する融合タンパク質は、医薬
的に活性な配列を患者に送達する手段として使用するこ
とができる。

【０００８】融合タンパク質は、ＧＴＰアーゼをＡＤＰ
−リボシル化できるエンテロトキシンのＢサブユニット
の十分なアミノ酸配列からなり、したがって融合タンパ
ク質はＧＭ_１−ガングリオシドに結合するオリゴマーを
形成することが可能である。融合タンパク質のこの部分
は、Ｂサブユニット残基と呼ぶことができる。したがっ
て、この種のエンテロトキシンの実質的にすべてのＢサ
ブユニットが存在してもよい。融合タンパク質はＬＴＢ
またはＣＴＢから構成されていてもよい。天然のＢサブ
ユニットのアミノ酸配列、ＬＴＢまたはＣＴＢは、実際
には、１個または２個以上のアミノ酸の置換、挿入また
は欠失によって修飾されていてもよい。天然のＢサブユ
ニットに対して作成された抗体は、そのサブユニットの
アミノ酸配列の修飾型からなる融合タンパク質に結合で
きる。

【０００９】このような修飾アミノ酸配列は、その修飾
アミノ酸配列が挿入された融合タンパク質が、ペンタマ
ーを形成し、ＧＭ_１−ガングリオシドに結合する能力を
維持している限り、使用できる。元の配列の物理化学的
性質、たとえば電荷密度、親水性／疎水性、サイズおよ
びコンフィギュレーションが保存されていなければなら
ない。置換の候補を単一文字コード（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１３８，９−７，１９８４）で示せば、Ｇ
のＡによる置換およびその逆、ＶのＡ、ＬまたはＧによ
る置換、ＫのＲによる置換、ＴのＳによる置換およびそ
の逆、ＥのＤによる置換およびその逆、ならびにＱのＮ
による置換およびその逆を挙げることができる。

【００１０】天然のエンテロトキシンＢサブユニットの
配列と修飾アミノ酸配列の間のホモロジーの程度は、８
０％もしくはそれ以上、たとえば９０％もしくはそれ以
上または９５％もしくはそれ以上とすることができる。
天然のＢサブユニットのアミノ酸配列は、たとえば、い
ずれかの末端または両末端において、アミノ酸残基４個
までまたは２個まで、短縮することができる。すなわ
ち、ＬＴＢまたはＣＴＢのＣ末端は、このように短縮す
ることができる。

【００１１】本発明の融合タンパク質においては、Ｂサ
ブユニット残基と異種エピトープまたは医薬的に活性な
配列の間に、ヒンジが設けられる。このヒンジはアミノ
酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏの２〜８個の反復配列からなる。
たとえば、４個までの反復配列を置くことができる。ヒ
ンジはＢサブユニット残基のＣ末端に融合される。

【００１２】Ｇｌｙ−Ｐｒｏ反復配列は他のアミノ酸残
基が隣接していてもよい。適当なものは、非荷電非芳香
性残基である。４個までのアミノ酸残基、たとえば２個
のアミノ酸残基または１個のアミノ酸残基をＢサブユニ
ット残基の後、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ反復配列の前に配置する
ことができる。４個までのアミノ酸残基、たとえば２個
のアミノ酸残基または１個のアミノ酸残基をＧｌｙ−Ｐ
ｒｏ反復配列の後、異種エピトープまたは医薬的に活性
な配列の前に配置することができる。

【００１３】生物活性を有するアミノ酸配列は、ヒンジ
のＣ末端に付着させることができる。この配列の長さに
は特別な重要性はない。しかしながら、この配列は、融
合タンパク質がＧＭ_１−ガングリオシドに結合するオリ
ゴマーを形成する能力を破壊するものであってはならな
い。この配列は、２００残基長まで、１５０残基長ま
で、または１００残基長までとすることができる。長さ
６０まで、たとえば３０または２０までのアミノ酸残基
の短い配列も使用することができる。

【００１４】ヒトまたは動物の疾患に関与する病原体か
らの抗原またはエピトープからなる任意のアミノ酸配列
が融合タンパク質によって提供される。抗原またはエピ
トープは、免疫応答を誘発することができる、たとえば
中和抗体もしくは非中和抗体または細胞性免疫を生じる
ことが可能なものとすることができる。予測される抗原
決定部位も使用できる。

【００１５】したがって、異種アミノ酸配列がＢサブユ
ニット残基に融合される。これは、病原性生物体に対す
る中和抗体を産生させることができる抗原決定部位で構
成されてもよい。病原体は呼吸器または腸関連病原体で
あってもよい。エピトープは、ウイルス、細菌、かび、
酵母または寄生虫から誘導することができる。さらに詳
しくは、エピトープは、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ
Ｖ）のタイプ、たとえばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、
Ａ型もしくはＢ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、
たとえば２型または１４型、単純ヘルペスウイルス、ポ
リオウイルス２または３型、***ウイルス、インフル
エンザウイルス、コクサッキーウイルス、細胞表面抗原
ＣＤ４、クラミジアトラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
ａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、および大腸菌の耐
熱性エンテロトキシン（ＳＴ）から誘導することができ
る。

【００１６】したがって、ＬＴＢをＳＴの免疫原性部分
に融合させることができる。ＬＴＢは、ＳＴのコアおよ
びトキシン領域に、またはトキシン領域のみに融合させ
ることができる。たとえば、ＬＴＢは、ＳＴアミノ酸番
号１９（Ｐｒｏ）またはＳＴアミノ酸番号４９（Ｇｌ
ｙ）に始まるＳＴの部分に連結させることができる。生
成する長短いずれのハイブリッドタンパク質も、ネイテ
ィブなＳＴのコンフィギュレーションに必要な６個のシ
ステイン残基を含有するＳＴの１９個のカルボキシ末端
アミノ酸残基のすべてを包含する。

【００１７】医薬的に活性なペプチドは、ヒンジのＣ末
端に融合させることができる。ヒンジ構築体に遺伝子的
にカップリングさせることができた医薬的に活性なペプ
チドの例には、完全なインターロイキンＩＬ−１Ｂに匹
敵する免疫刺激、免疫修復、抗腫瘍および放射線防御活
性を有する、ヒトインターロイキン１Ｂのフラグメント
１６３〜１７１［単一文字コードでＶＱＧＥＥＳＮＤＫ
（配列番号：１）］がある。他の例には、サイトカイン
およびサイトカインのフラグメントがある。

【００１８】ヒンジにカップリングさせることができた
生物学的に活性なペプチドの他の例には、ヒトＩｇＥの
ＣＨ４ドメインに見出されるＫＴＧＳＧＦＦＶＦ（配列
番号：２）がある。このペプチドに対する応答は、Ｉｇ
Ｅ抗体の形成および血清ヒスタミン濃度を低下させ、ア
レルギー反応の低下を招くのに重要であることが報告さ
れている。

【００１９】すなわち、有用な融合タンパク質は、式
（Ｉ）Ｘ−Ｙ_１−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）_ｎ−Ｙ_２−Ｚ（Ｉ）（式中、ＸはＢサブユニット残基を表し、Ｙ_１およびＹ
_２はそれぞれ独立にペプチド結合またはアミノ酸残基４
個までのアミノ酸配列であり、Ｚは生物活性を有するア
ミノ酸配列を表し、ｎは２、３または４である）で表す
ことができる。好ましくは、Ｙ_１はロイシン（Ｌ）であ
り、Ｙ_２はアミノ酸残基、グルタミン酸−イソロイシン
（ＥＩ）を意味する。

【００２０】融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によ
って製造できる。さらに詳しくは、融合タンパク質は、
宿主を、その宿主中で融合タンパク質を発現できるベク
ターで形質転換し、融合タンパク質が発現される条件下
に保持することからなる方法で製造される。ついで、融
合タンパク質を、通常は生物学的に純粋な型で単離する
ことができる。

【００２１】したがって、融合タンパク質の製造はその
融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の準備状態に依
存する。ＤＮＡ配列は、融合タンパク質が発現される宿
主細胞の細胞質から放出されるように、その５’末端
に、融合タンパク質のリーダーをコードする配列を設け
ることができる。任意の適当なリーダー配列が使用でき
る。しかしながら、通常は、Ｂサブユニット残基の天然
のリーダー配列をコードするＤＮＡが、成熟Ｂサブユニ
ット残基のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのすぐ上流
に配置される。

【００２２】ヒンジの残基を特定するコドンの選択は重
要である。適当には、コドンの少なくとも半分は、融合
タンパク質を発現する宿主においてアミノ酸残基の対し
て希なコドンとする。したがって、コドンは、至適コド
ン、すなわちその宿主における使用に際しての第一選択
コドンであってはならない。一般的には第二の選択コド
ンであってもならない。このヒンジのコドンの少なくと
も７５％、少なくとも９５％またはすべてを希なコドン
とすることができる。大腸菌の場合のこのようなコドン
は、Ｓｈａｒｐ＆Ｌｉ（１９８６）によって報告さ
れている。希なコドンは翻訳時に休止を生じ、これがヒ
ンジおよびヒンジの融合とは独立に、Ｂサブユニット残
基の正しいフォールディングを可能にする。

【００２３】このようにして、所望の融合タンパク質を
コードするＤＮＡ配列が得られる。このＤＮＡ配列が挿
入されて、適当な宿主に付与した場合に融合タンパク質
を発現できる発現ベクターを調製する。そのＤＮＡ配列
に適当な転写および翻訳制御要素、とくにＤＮＡ配列の
ためのプロモーターおよび翻訳終結コドンが与えられ
る。ＤＮＡ配列はベクター中の翻訳開始および停止シグ
ナルの間に配置される。ＤＮＡ配列は、そのベクターに
適合した宿主中での融合タンパク質の発現が可能なよう
に正しいフレームで配置される。

【００２４】本発明における使用が好ましいベクター
は、Ｂサブユニット残基とヒンジをコードする。ヒンジ
のコード配列は、生物活性を有するアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子の挿入が可能な制限部位で終わるように選
択される。この制限部位は、正しい読み取り枠での遺伝
子の挿入を可能にする。

【００２５】Ｂサブユニット残基がＬＴＢである場合に
は、ＬＴＢを発現できるベクターをまず、ＬＴＢ遺伝子
（Ｄａｌｌａｓ，１９８３）を適当な転写および翻訳調
節要素の制御下、ベクター中にクローン化することによ
って得られる。ヒンジに相当するオリゴヌクレオチド
は、合成して、ＬＴＢ遺伝子の３’末端に適合させるこ
とができる。とくに、ヒンジをコードするＤＮＡ配列
は、ＬＴＢ遺伝子の３’末端の自然の終結コドンに位置
するＳｐｅＩ部位にクローン化できる。生物活性を有す
るアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ヒンジをコード
するＤＮＡ配列の３’末端に適当に配置された制限部位
中に同位相でクローン化することができる。

【００２６】融合タンパク質をコードする発現ベクター
を使用して宿主を形質転換する。発現ベクターが繋留さ
れた細胞を培養して融合タンパク質を発現させる。融合
タンパク質はペンタマーに自己集合する。任意の適当な
宿主−ベクター系が使用できる。宿主は原核生物宿主で
も、真核生物宿主でもよい。ベクターはプラスミドとす
ることができる。この場合、紬菌または酵母宿主、たと
えば大腸菌もしくはビブリオ種のようなグラム陰性桿
菌、またはビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
が使用できる。別法として、ベクターはウイルスベクタ
ーとすることもできる。これは、哺乳動物細胞系の細
胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞またはＣＯＳ細胞にトランスフェクトして使用し、発
現させることができる。

【００２７】発現された融合タンパク質は単離すること
ができる。融合タンバク質がリーダー配列とともに発現
された場合には、タンパク質は、発現された細胞の細胞
質から放出されている。したがって、天然のＬＴＢリー
ダー配列とともに発現された融合タンパク質は、たとえ
ば、大腸菌の周辺質から単離、精製できる。

【００２８】精製された融合タンパク質、この融合タン
パク質を発現した大腸菌の毒素産生株の死菌、およびこ
の融合タンパク質を発現できる弱毒化生菌ワクチンは、
それがヒンジを介してＢサブユニット残基に融合した異
種エピトープである場合には、それぞれワクチンとして
使用できる。ワクチンは通常、生理学的に許容される担
体または希釈剤も含有する。慣用の処方、担体および希
釈剤が使用できる。適当な弱毒化生菌ワクチンは、その
芳香族生合成経路における２つの別個の遺伝子のそれぞ
れに非復帰突然変異を有する弱毒化微生物とすることが
できる。このような微生物は、ＥＰ−Ａ−０３２２２３
７に記載されている。典型的な微生物は、たとえばサル
モネラ属からの病原細菌、たとえばＳ．ｔｙｐｈｉ，
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓ．ｄｕｂｌｉｎまたは
Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｓｉｕｓである。

【００２９】非復帰突然変異は通常、ａｒｏＡ，ａｒｏ
Ｂ，ａｒｏＣ．ａｒｏＤおよびａｒｏＥ遺伝子の任意の
２つに起こすことができる。非復帰突然変異の一つはａ
ｒｏＡ遺伝子中にあることが好ましい。適当な弱毒化微
生物には、融合タンパク質がその微生物によって発現さ
れるように、融合タンパク質をコードする発現カセット
を繋留させる。微生物の世代を通しての確実な発現のた
めには、発現カセットは、抗生物質選択の不存在下に、
安定に伝えられねばならない。

【００３０】ワクチンは任意の経路で投与できる。経口
経路、経鼻経路または非経口経路たとえば皮下、静脈内
もしくは筋肉内投与のいずれを採用するかの選択、ワク
チンの用量および摂取の頻度は、ワクチン接種の目的、
ヒトまたは動物のいずれが処置されるか、またはワクチ
ンを投与されるヒトまたは動物の状態に依存する。

【００３１】しかしながら、通常、融合タンパク質は、
経口、経鼻または非経口経路により、１用量あたり、１
〜１０００μｇ、好ましくは１０〜１００μｇ投与され
る。一方、弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉの場合、通常の経口経
路、７０ｋｇの成人患者で、１用量あたりＳ．ｔｙｐｈ
ｉ微生物１０^９〜１０^１１の投与量が一般に便利であ
る。

【００３２】医薬的に活性なポリペプチドがＢサブユニ
ット残基に融合されている場合には、融合タンパク質
は、ポリペプチドを患者に送達するために使用できる。
融合タンパク質は経口的、経鼻的または非経口的に投与
できる。投与量は、投与の目的、その活性、および患者
の状態を含めた多くの因子に依存する。しかしながら通
常、融合タンパク質は、経口、経鼻または非経口経路に
より、１用量あたり１〜１０００μｇ、好ましくは１０
〜１００μｇ投与される。融合タンパク質は、医薬的に
許容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物とし
て投与するために、医薬組成物に処方することができ
る。任意の慣用の担体または希釈剤が使用さできる。

【００３３】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。添付の図面について、以下に説明する。

【００３４】図１はｐＦＶ１およびｐＦＶ１６９プラス
ミドの構築を示す。（Ａ）、プラスミドｐＢＲＤ０２６
をＳｐｅＩで切断し、配列番号：３および４のオリゴヌ
クレオチドを挿入して、ｐＦＶ１（Ｂ）を形成させた。
（Ｃ）、ＤＮＡ配列（配列番号：８および９１０）、な
らびにｐＦＶ１の５’末端によってコードされるアミノ
酸配列（配列番号：９）。ヒンジからなる領域に下線を
付してある。ｐＦＶ１はＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで切
断し、ＢＢ０５モノクローナル抗体によって認識される
エピトープをコードする一対のオリゴヌクレオチドを挿
入して、ＬＴＢ６９タンパク質を発現するｐＦＶ１６９
（Ｄ）を形成させる。（Ｅ）、ＬＴＢ６９タンパク質の
カルボキシ末端におけるアミノ酸配列（配列番号：１
１）。

【００３５】図２は、大腸菌周辺質分画のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析の結果を示す。レーン１：ＨＢ１０１（非煮
沸）、レーン２：ＨＢ１０１（煮沸）、レーン３：ＨＢ
１０１ｐＭＭＢ６８（非煮沸）、レーン４：ＨＢ１０１
ｐＭＭＢ６８（煮沸）、レーン５：ＨＢ１０１ｐＦＶ１
（非煮沸）、レーン６：ＨＢ１０１ｐＦＶ１（煮沸）、
レーン７：ＨＢ１０１ｐＦＶ１６９（非煮沸）、レーン
８：ＨＢ１０１ｐＦＶ１６９（煮沸）。ＬＴＢおよびＬ
ＴＢ６９特異的バンドには矢印で標識した。

【００３６】図３は、プラスミドｐＦＶ１（○、●）、
ｐＦＶ１６９（□、■）およびＨＢ１０１単独（△、
▲）ならびに精製ＬＴＢ（◇）をもつ大腸菌株からの周
辺質抽出物のガングリオシド結合活性を示す。白抜きの
印は、ＧＭ_１でコートしたプレート上に適用したサンプ
ル、黒く塗り潰した印は、コートしていないプレート上
に適用したサンプルを示す。（Ａ）プレートは抗−ＬＴ
Ｂ抗体で試験し、（Ｂ）プレートはＢＢ０５モノクロー
ナル抗体で試験した。

【００３７】図４には、精製ＬＴＢ６９タンパク質のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：ＨＢ１０
１（ｐＦＶ１６９）からの総周辺質タンパク質（濃縮
後）、レーン２：ＤＥＡＥトリスアクリルカラムの通過
液、レーン３：ＤＥＡＥトリスアクリルカラムの溶出
液、レーン４：ＤＥＡＥトリスアクリルカラムの溶出液
（煮沸）。レーン４以外のすべてのサンプルは煮沸しな
いで適用された。ＬＴＢ６９タンパク質は矢印で示す。
分子量マーカー（ｋＤａ）は左側に示す。

【００３８】図５は、ＬＴＢまたはＬＴＢ６９タンパク
質で経鼻的に免疫処置したマウスの血清反応を示す。
（Ａ）抗−ＬＴＢ力価、（Ｂ）抗−Ｐ．６９力価。マウ
スを２０μｇのＬＴＢ（○）またはＬＴＢ６９（●）タ
ンパク質で経鼻的に免疫処置し２８日目にその用量を反
復投与した。免疫処置時経時的に血清サンプルを採取
し、抗−ＬＴＢ力価および抗−Ｐ．６９力価を材料およ
び方法の項に記載したようにして測定した。（Ａ）抗−
ＬＴＢ力価、（Ｂ）抗−Ｐ．６９力価。

【００３９】図６は、経鼻的に免疫処置したマウスの肺
における抗−ＬＴＢ抗体分泌細胞の数を示す。マウスを
ＬＴＢおよびＬＴＢ６９タンパク質で免疫処置し、肺か
らリンパ球を単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い抗
−ＬＴＢ分泌細胞の数を求めた。メジウム単独を用いて
実施したＥＬＩＳＰＯＴアッセイを対照として示す。

【００４０】例材料および方法細菌株、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドすべてのプラスミドの製造に、大腸菌ＨＢ１０１株を用
いた。細菌はルリア培地（ＬＢ）または１．６％（ｗ／
ｖ）アガールで固化したＬＢ中で増殖させた（Ｄａｖｉ
ｓら，１９８０）。プラスミドｐＢＲＤ０２６（Ｍａｓ
ｋｅｌｌら，１９８７）は、ｐＢＲ３２２のＰ１抗−ｔ
ｅｔプロモーターからの、ブタＬＴ−Ｂの構造的発現を
意図した５．２ｋｂのベクターである。ｐＦＶ１の構築
には以下のオリゴヌクレオチド、

【化１】を使用した。これらのオリゴヌクレオチドをリン酸化
し、アニーリングし、ついでｐＢＲＤ０２６のＳｐｅＩ
部位にクローニングして、ｐＦＶ１を形成させた。同様
に、オリゴヌクレオチド

【化２】をｐＦＶ１のＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩ部位にクローニ
ングして、ｐＦＶ１６９を形成させた。ＤＮＡ操作は、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の記載に従って実施し
た。プラスミド構築体のＤＮＡ配列の測定は、関連フラ
グメントのＭ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９へのサブクロ
ーニングによって実施した（Ｍｅｓｓｉｇ＆Ｖｉｅｉ
ｒａ，１９８２）。ＤＮＡの配列決定はＴ７ポリメラー
ゼ（Ｔａｂｏｒ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９８
７）および合成オリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｈａ
ｒｌｅｓら，１９８６）を用いて実施した。

【００４１】酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）ＬＴＢおよびその誘導体のＧＭ_１−結合性の分析には、
以前に報告されているＧＭ_１ＥＬＩＳＡ法（Ｓｖｅｎｎ
ｅｒｈｏｌｍ＆Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，１９７８）によ
って行った。標品として用いた精製ＬＴＢは、Ｔ．Ｈｉ
ｒｓｔ博士から恵与された。ＬＴＢおよびＰ．６９に対
する血清抗体は、常法のＥＬＩＳＡ操作によって検出し
た。ｌｏｇ_１０血清希釈に対してＡ_４５０ｎｍをプロッ
トして、４５０ｎｍにおいて５０％最大吸収を与える力
価を求め、血清希釈の逆数の対数として表した。

【００４２】周辺質抽出物の調製および分析大腸菌の周辺質分画は、Ｈｉｒｓｔら（１９８４）の方
法で調製した。ついで、タンパク質を、クーマシーブリ
リアントブルー染色で可視化するか、またはニトロセル
ロース上に電気ブロットし、ポリクローナルウサギ抗−
ＬＴＢ血清またはＰ．６９−特異的マウスモノクローナ
ル抗体（ｍＡＢ）ＢＢ０５で調べた。ブロットはさら
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏｐａｔｔ
ｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に接合し
た抗−ウサギまたは抗−マウス免疫グロブリンで調べ
て、４−クロロ−１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏ
ｌｅ，Ｕ．Ｋ．）で発色させた。ＬＴＢおよびＬＴＢ融
合タンパク質は、大腸菌の周辺質分画から次のようにし
て部分精製した。すなわち、一夜培養体を収穫し、氷冷
リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で１回洗浄した。つい
で、細胞ペレットを０．１Ｍリン酸塩でｐＨ７．６に緩
衝化した０．３Ｍスクロースの最初の培養容量の１／２
５に再懸濁した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
およびリゾチームをそれぞれ最終濃度５ｍＭおよび２
０μｇ／ｍｌに添加した。懸濁液を、時々撹拌しながら
氷上に２０〜２５分間放置し、ついで２０，０００×ｇ
で１５分間遠心分離して、スフェロプラストをペレット
化した。上清を集め、ＸＭ５０メンブランを装着したＡ
ｍｉｃｏｎＤｉａｆｌｏを用いた限外濾過によって濃
縮した。保持物質を、２５ｍＭトリスによってｐＨ
８．６に緩衝化した５０ｍＭＮａＣｌに対して４℃
で一夜透析した。透析物質をついで、同一の緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥトリスアクリルカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に負荷した。大規模に洗浄した
のち、結合したタンパク質を、前回と同様に緩衝化した
５０〜２５０ｍＭＮａＣｌ勾配で溶出した。溶出液
のＡ_４５０ｎｍを、ＵＶ−１単一光路モニター（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，ＭｉｌｔｏｎＫｅｙｎｅｓ）および
Ｓｅｒｖｏｓｃｒｉｂｅ２１０記録計（Ｃａｍｌａ
ｂ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）で連続的にモニタリングし
た。分画を集め、ニトロセルロース上ドットプロッティ
ングで分析し、ＬＴＢに特異的なポリクローナル抗血清
によって試験した。陽性の分画はさらにＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析した。ＬＴＢまたはＬＴＢ６９の高純度を示す
分画を集めた。総タンパク質含量はＰｉｅｒｃｅＢＣ
Ａアッセイを用いて測定した。

【００４３】免疫処置６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをエーテルで軽く
麻酔し、２０μｇのＬＴＢまたはＬＴＢ６９容量４０μ
ｌとして経鼻的に接種した。４週後、動物に、同一量の
抗原を同一経路でブースター投与した。免疫処置前およ
び以後１〜２週間隔で血清のサンプルを採取した。ブー
スタ投与３週間後にマウスを屠殺し、肺からリンパ球を
単離し、肺ホモジネート（Ｊｏｎｅｓら，１９８６）に
対し抗原−特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイをＣｚｅｒｋ
ｉｎｓｋｙら（１９８３）の記載にしたがって行った。

【００４４】結果１．ｐＦＶ１の構築大腸菌の異種エピトープの担体として使用するために、
大腸菌中でｐＢＲ３２２のＰ１プロモーターの制御下に
ＬＴＢを発現するプラスミドｐＢＲＤ０２６（Ｍａｓｋ
ｅｌｌら，１９８７）を改良した。遺伝子の３’末端に
おける終結コドンに位置するＳｐｅＩ部位を用いて、Ｌ
ＴＢタンパク質を同位相で異種エピトープに連結するこ
とになる「ヒンジ」をコードするアミノ酸の配列を特定
するオリゴヌクレオチド中にクローン化した。このヒン
ジ領域の周囲のＤＮＡ配列はまた、ＢｇｌＩＩおよびＳ
ｐｅＩの制限部位を包含するように設計された（図１参
照）。オリゴヌクレオチド配列はＳｐｅＩ部位の再形成
させない塩基対ミスマッチを含有し、それが正しい方向
で挿入されると、ＬＴＢ遺伝子の末端における停止コド
ンも消失させる。したがって、オリゴヌクレオチドは再
形成されるＳｐｅＩ部位における停止コドンまで翻訳さ
れる。エピトープをコードするオリゴヌクレオチドは唯
一のＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩ部位中にクローン化で
き、エピトープはＬＴＢのカルボキシ末端への融合体と
して発現される。「ヒンジ」オリゴヌクレオチドのプラ
スミドｐＢＲＤ０２６への挿入で融合プラスミドｐＦＶ
１が生じた（図１参照）。ｐＦＶ１は８個のグリシン−
プロリン延長部を有する完全長ＬＴＢを発現する（図
１）。

【００４５】２．ｐＦＶ１６９の構築ＬＴＢへの安定な融合体の構築のためのベクターとして
のｐＦＶ１の有用性を試験するために、明確に定義され
たモノクローナル抗体に対するエピトープを、ＬＴＢカ
ルボキシ末端への連結に選択した。百日咳菌のＰ．６９
タンパク質のアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：７）が、保護モノク
ロナール抗体と反応性のエピトープとして確認されてい
た（ＥＰ−Ａ−０４２５０８２；Ｎｏｖｏｔｎｙら，１
９８５））。この明確に定義されたエピトープが、ｐＦ
Ｖ１への挿入に理想的と考えられた。このエピトープを
コードするオリゴヌクレオチドをＢｇｌＩＩおよびＳｐ
ｅＩ末端によって合成し（図１参照）、ついでこれらの
酵素で消化したｐＦＶ１へ直接クローン化した、新たな
構築体の接合部を越えた配列はｐＦＶ１６９と命名さ
れ、定量により予測通りであることが見出された。

【００４６】３．ＬＴＢ融合タンバク質のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる特徴づけ遺伝子操作によってネイティブなＬＴＢ分子に生じた変
化は、その分子の性質、たとえばペンタマーの形成、Ｇ
Ｍ_１ガングリオシドの結合、ＬＴのＡサブユニットとの
会合（Ｓａｎｄｋｖｉｓｔら，１９８７）の能力に影響
することがある。したがって、構築された融合タンパク
質の性質を様々な方法で調べた。ｐＦＶ１およびｐＦＶ
１６９を含有する培養大腸菌をＬ−培地中で増殖させ、
周辺質分画を調製した。これらの周辺質分画のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により、ネイティブなＬＴＢサブユニット
と同様、ＬＴＢＨおよびＬＴＢ６９は可溶性で、周辺質
空間に輸送されることが明らかにされた（図２参照）。
さらに、両タンパク質はいずれもＬＴＢの特徴的な挙動
を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前に煮沸すればモノマーとし
て、加熱処理をしないでゲル上に負荷するとペンタマー
として移動する。期待されたようにＬＴＢ６９はＬＴＢ
に比べて分子量のかなりの増大を示した。この融合タン
パク質のモノマーの分子量の計算値は１４ｋＤａである
が、分子量に実測値は約１８ｋＤａでそれより高い（図
２、レーン７）。ｐＦＶ１によって発現されるＬＴＢ
「ヒンジ」モノマー（ＬＴＢＨ）もＬＴＢ単独よりもか
なり高い分子量を示した。融合タンパク質の分子量の増
加は、非煮沸サンプルを分析した場合にもっと顕著であ
る。すなわち、ＬＴＢ６９ペンタマーは、期待される分
子量７０ｋＤａに対して約９０ｋＤａで移動する。周辺
質サンプルも、抗−ＬＴＢ血清およびモノクローナル抗
体ＢＢ０５の両者を用いてウエスタンブロッティングで
分析した。これにより、融合タンパク質の同一性が確認
され、ＬＴＢ６９タンパク質の両抗体との交差反応性が
示され、異種エピトープの獲得が親のＬＴＢ分子の抗原
性を破壊していないことが明らかにされた（データは示
していない）。

【００４７】４．融合タンパク質のＧＭ _１への結合ｐＦＶ１（ＬＴＢＨ）およびｐＦＶ１６９（ＬＴＢ６
９）の生成物がＧＭ_１ガングリオシドに対する高い親和
性を維持しているかどうかを調べるため、そのプラスミ
ドを繋留している大腸菌の周辺質分画を、検出抗体とし
て抗−ＬＴＢ血清およびモノクローナル抗体ＢＢ０５の
両者を用いたＧＭ_１ＥＬＩＳＡにより分析した。結果
は、図３Ａに示すように、ＬＴＢＨおよびＬＴＢ６９の
両者がガングリオシドに効率的に結合し、ＬＴＢＨタン
パク質へのＢＢ０５エピトープの付加はそのタンパク質
のＧＭ_１ガングリオシドへの結合程度に見るべき影響を
与えないことが明らかにされた。Ｃ末端の延長がＬＴＢ
特異的抗体による認識を妨害する可能性があるにもかか
わらず、精製されたネイティブなＬＴＢに比べて、ＧＭ
_１結合の有意な阻害はなかった。このタンパク質はＧＭ
_１でコートされていないプレート上でもアッセイが行わ
れ、このアッセイの特異性が明らかにされた（図３Ａお
よびＢ）。タンパク質を、検出抗体としてＢＢ０５を用
いて検定した場合には、ＧＭ_１でコートされたプレート
に適用されたＬＴＢ６９タンパク質のみが反応した（図
３Ｂ）。これは、周辺質分画のＬＴＢ６９タンパク質で
は、その分子がもつ百日咳菌のＰ．６９エピトープの抗
原性が変化していないことを示している。

【００４８】５．ＬＴＢＨおよびＬＴＢ６９タンパク質
の部分精製ＬＴＢＨおよびＬＴＢ６９タンパク質は、中等度のレベ
ルで、周辺質抽出物中の総タンパク質に対して数％、発
現された（図１）。これらのタンパク質についてさらに
詳細に検討するため、ＬＴＢ６９融合タンパク質を、材
料および方法の項に記載したようにして部分生成した。
このプロトコールは周辺質抽出液の濃縮、ついでＤＥＡ
Ｅトリスアクリルクロマトグラフィーを包含し、出発原
料よりも明らかに生成されたＬＴＢ６９融合タンパク質
を生成した（図４）。このＬＴＢ６９プレパレーション
のデンシトメトリースキャンから、このタンパク質は総
タンパク質の２０〜３０％を構成することがわかった
（データは示していない）。

【００４９】６．融合タンパク質の免疫原性ＣＴ、ＣＴＢおよびＬＴＢは、経鼻的に送達した場合、
極めて効果的な免疫原であることが明らかにされている
（Ｂｅｓｓｅｎ＆Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，１９８８；
Ｔａｍｕｒａら，１９８８）。精製されたＬＴＢ６９融
合タンパク質をマウスに経鼻的に送達した場合の免疫原
性について検討することに、とくにそれがガングリオシ
ド結合性を維持し、周辺質中の融合タンパク質であるこ
とから、興味がもたれた。１群５匹のマウスに、２０μ
ｇの精製されたネイティブＬＴＢまたはＬＴＢ６９を経
鼻的に接種し、ついで、４週後に同量の抗原をブースタ
ー投与した。ＬＴＢまたはＬＴＢ６９を接種したマウス
群で、抗−ＬＴＢ血清抗体を検出したが、ＬＴＢ６９融
合タンパク質で免疫処置したマウスの方が一次応答は遅
かった。しかしながら、ブースター投与後には、両群の
抗体レベルは同程度の高レベルに上昇した（図５Ａ）。

【００５０】Ｐ．６９エピトープ自体への血清応答は、
低レベルの一次応答ついでブースター投与後の早い二次
応答による高力価の達成という典型的な順序を示した
（図５Ｂ）。この二次応答はＬＴＢに対する応答よりも
かなり変動が大きかったが、一部のマウスでは、はるか
に高い抗体レベルが達成された。

【００５１】免疫処置マウスは、ＥＬＩＳＰＯＴを用い
て、肺における抗体分泌細胞の存在についても検定し
た。ＬＴＢまたはＬＴＢ６９で免疫処置したマウスに
は、ＬＴＢ特異的なＩｇＧまたはＩｇＭを分泌する細胞
が認められた（図６参照）。また、ＬＴＢ６９で免疫処
置したマウスには、Ｐ．６９に特異的なＩｇＧまたはＩ
ｇＭを分泌する細胞が検出できた。しかしながら、Ｐ．
６９特異的抗体を分泌する細胞の数は、ＬＴＢ特異的抗
体を分泌する細胞の数のほぼ５分の１程度と少なかった
（データは示していない）。

【００５２】引用文献

【表１】

【表２】

【表３】

【００５３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：生物名；ホモサピエンス配列：

【化３】

【００５４】配列番号：２配列の長さ：９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：生物名；ホモサピエンス配列：

【化４】

【００５５】配列番号：３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（合成）配列の特徴：特徴を表す記号；ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置；１．．２７他の特徴；機能＝ＬＴＢタンパク質と異種エピトープ間
の「ヒンジ」配列：

【化５】

【００５６】配列番号：４配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（合成）アンチセンス：Ｙｅｓ配列の特徴：特徴を表す記号；ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置；１．．２７他の特徴；機能＝ＬＴＢタンパク質と異種エピトープ間
の「ヒンジ」配列：

【化６】

【００５７】配列番号：５配列の長さ：７５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（合成）起源：生物名；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）配列：

【化７】

【００５８】配列番号：６配列の長さ：７５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（合成）アンチセンス：Ｙｅｓ起源：生物名；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）配列：

【化８】

【００５９】配列番号：７配列の長さ：６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：生物名；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）配列：

【化９】

【００６０】配列番号：８配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：クローン；ＰＦＶ１（その「ヒンジ」領域）配列の特徴：特徴を表す記号；ＣＤＳ存在位置；１．．３９配列：

【化１０】

【００６１】配列番号：９配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列：

【化１１】

【００６２】配列番号：１０配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ起源：クローン；ＰＦＶ１（その「ヒンジ」領域）配列：

【化１２】

【００６３】配列番号：１１配列の長さ：３３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：特徴を表す記号；Ｒｅｇｉｏｎ存在位置；１．．２他の特徴；ラベル＝ＬＴＢ配列配列の特徴：特徴を表す記号；Ｒｅｇｉｏｎ存在位置；４．．７他の特徴；ラベル＝ヒンジ領域配列の特徴：特徴を表す記号；Ｒｅｇｉｏｎ存在位置；１０．．３１他の特徴；ラベル＝Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ配列のＰ６９ＢＢ０５エピトープ配列：

【化１３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＦＶ１およびｐＦＶ１６９プラスミドの構築
を示す。

【図２】大腸菌周辺質分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結
果を示す。

【図３】プラスミドｐＦＶ１、ｐＦＶ１６９およびＨＢ
１０１単独ならびに精製ＬＴＢをもつ大腸菌株からの周
辺質抽出物のガングリオシド結合活性を示す。

【図４】精製ＬＴＢ６９タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析の結果を示す。

【図５】ＬＴＢまたはＬＴＢ６９タンパク質で経鼻的に
免疫処置したマウスの血清反応を示す。

【図６】経鼻的に免疫処置したマウスの肺における抗−
ＬＴＢ抗体分泌細胞の数を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡ (72)発明者イアンジョージチャールズイギリス国ケント，ベッケンハム，ラングリィコート（番地なし) (72)発明者ネイルフレイザーフェアーウェザーイギリス国ケント，ベッケンハム，ラングリィコート（番地なし) (56)参考文献国際公開90／3437（ＷＯ，Ａ１) ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，1989年 11月６日，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．２, ｐ．347−354 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 19/00 C07K 14/00 - 14/40 A61K 39/385 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の要素（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）
がＮ−末端からＣ−末端方向に連結した融合タンパク
質：（Ａ）コレラトキシンまたは大腸菌の非耐熱性エンテロ
トキシンの十分なＢサブユニットであって、当該融合タ
ンパク質がペンタマー複合体を形成しＧＭ₁−ガングリ
オシドに結合するに十分なＢサブユニット；（Ｂ）直接結合した２〜８個のグリシン−プロリン反復
配列からなるヒンジ；および（Ｃ）ヒトまたは動物の病原体の抗原またはエピトープ
であって免疫応答を引起すことのできる抗原またはエピ
トープ。
【請求項２】抗原またはエピトープが、呼吸器または
腸関連病原体の抗原またはエピトープである請求項１の
融合タンパク質。
【請求項３】抗原またはエピトープが、百日咳菌の抗
原またはエピトープである請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】エピトープが、百日咳菌のＰ６９のＢＢ
０５エピトープである請求項１の融合タンパク質。
【請求項５】ヒンジが、直接結合した２個のグリシン
−プロリン反復配列からなる請求項１から４のいずれか
の融合タンパク質。
【請求項６】融合タンパク質をコードし５’から３’
方向に連結した以下の要素（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）
からなるＤＮＡ分子：（Ａ）コレラトキシンまたは大腸菌の非耐熱性エンテロ
トキシンの十分なＢサブユニットをコードする配列であ
って、当該融合タンパク質がペンタマー複合体を形成し
ＧＭ₁−ガングリオシドに結合するに十分なＢサブユニ
ットをコードする配列；（Ｂ）直接結合した２〜８個のグリシン−プロリン反復
配列からなるヒンジをコードする配列；および（Ｃ）ヒトまたは動物の病原体の抗原またはエピトープ
であって免疫応答を引起すことのできる抗原またはエピ
トープをコードする配列。
【請求項７】抗原またはエピトープが、呼吸器または
腸関連病原体の抗原またはエピトープである請求項６の
ＤＮＡ分子。
【請求項８】抗原またはエピトープが、百日咳菌の抗
原またはエピトープである請求項６のＤＮＡ分子。
【請求項９】エピトープが、百日咳菌のＰ６９のＢＢ
０５エピトープである請求項６のＤＮＡ分子。
【請求項１０】ヒンジが、直接結合した２個のグリシ
ン−プロリン反復配列からなる請求項６から９のいずれ
かのＤＮＡ分子。
【請求項１１】ヒンジのアミノ酸残基をコードするコ
ドンの少なくとも半分が、融合タンパク質を発現する宿
主においてそれらのアミノ酸残基に対して稀なコドンで
ある請求項６から１０のいずれかのＤＮＡ分子。
【請求項１２】融合タンパク質をコードし５’から
３’方向に連結した以下の要素（Ａ）、（Ｂ）および
（Ｃ）を含むベクターであって形質転換宿主細胞におい
て該融合タンパク質を発現できるベクター：（Ａ）コレラトキシンまたは大腸菌の非耐熱性エンテロ
トキシンの十分なＢサブユニットをコードする配列であ
って、当該融合タンパク質がペンタマー複合体を形成し
ＧＭ₁−ガングリオシドに結合するに十分なＢサブユニ
ットをコードする配列；（Ｂ）直接結合した２〜８個のグリシン−プロリン反復
配列からなるヒンジをコードする配列；および（Ｃ）ヒトまたは動物の病原体の抗原またはエピトープ
であって免疫応答を引起すことのできる抗原またはエピ
トープをコードする配列。
【請求項１３】ベクターがプラスミドである請求項１
２のベクター。
【請求項１４】抗原またはエピトープが、呼吸器また
は腸関連病原体の抗原またはエピトープである請求項１
２または１３のベクター。
【請求項１５】抗原またはエピトープが、百日咳菌の
抗原またはエピトープである請求項１４のベクター。
【請求項１６】エピトープが、百日咳菌のＰ６９のＢ
Ｂ０５エピトープである請求項１５のベクター。
【請求項１７】ヒンジが、直接結合した２個のグリシ
ン−プロリン反復配列からなる請求項１２から１６のい
ずれかのベクター。
【請求項１８】ヒンジのアミノ酸残基をコードするコ
ドンの少なくとも半分が、融合タンパク質を発現する宿
主においてそれらのアミノ酸残基に対して稀なコドンで
ある請求項１２から１７のいずれかのベクター。
【請求項１９】融合タンパク質をコードし５’から
３’方向に連結した以下の要素（Ａ）、（Ｂ）および
（Ｃ）を含むベクターで形質転換された宿主細胞：（Ａ）コレラトキシンまたは大腸菌の非耐熱性エンテロ
トキシンの十分なＢサブユニットをコードする配列であ
って、当該融合タンパク質がペンタマー複合体を形成し
ＧＭ₁−ガングリオシドに結合するに十分なＢサブユニ
ットをコードする配列；（Ｂ）直接結合した２〜８個のグリシン−プロリン反復
配列からなるヒンジをコードする配列；および（Ｃ）ヒトまたは動物の病原体の抗原またはエピトープ
であって免疫応答を引起すことのできる抗原またはエピ
トープをコードする配列。
【請求項２０】宿主細胞が大腸菌株である請求項１９
の宿主細胞。
【請求項２１】抗原またはエピトープが、呼吸器また
は腸関連病原体の抗原またはエピトープである請求項１
９または２０の宿主細胞。
【請求項２２】抗原またはエピトープが、百日咳菌の
抗原またはエピトープである請求項２１の宿主細胞。
【請求項２３】エピトープが、百日咳菌のＰ６９のＢ
Ｂ０５エピトープである請求項２２の宿主細胞。
【請求項２４】ヒンジが、直接結合した２個のグリシ
ン−プロリン反復配列からなる請求項１９から２３のい
ずれかの宿主細胞。
【請求項２５】ヒンジのアミノ酸残基をコードするコ
ドンの少なくとも半分が、融合タンパク質を発現する宿
主においてそれらのアミノ酸残基に対して稀なコドンで
ある請求項１９から２４のいずれかの宿主細胞。
【請求項２６】請求項１から５のいずれかの融合タン
パク質または請求項１９から２５のいずれかの宿主細胞
および生理学的に許容しうる担体または希釈剤を含む、
病原体に対してヒトまたは動物をワクチン化するための
薬剤。