ES2236718T3

ES2236718T3 - Proteina portadora de efecto adyuvante, complejo inmunogenico que la contiene, su procedimiento de preparacion, secuencia nucleotidica y vacuna.

Info

Publication number: ES2236718T3
Application number: ES95939335T
Authority: ES
Inventors: Hans Binz; Thierry Baussant; Jean-Francois Haeuw; Thien Nguyen Ngoc
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2015-11-07
Also published as: JPH10508595A; DE69533961D1; AU4119996A; DK0791063T3; DE69533961T2; EP0791063B1; EP0791063A1; FR2726472A1; WO1996014415A1; AU714423B2; FR2726472B1; US6780420B1; ZA959416B; US20060034870A1; US7408044B2; CA2204510A1; NZ296561A; PT791063E; ATE287954T1; US6197929B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PRODUCTO ADYUVANTE DESTINADO A MEJORAR LA ACTIVIDAD DE UNA MOLECULA DURANTE LA ADMINISTRACION EN UN HUESPED, CARACTERIZADO PORQUE COMPRENDE AL MENOS UNA PARTE DE LA PROTEINA P40 DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE O UNA PROTEINA QUE PRESENTA AL MENOS 80% DE HOMOLOGIA CON LA PROTEINA P40 DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN ESTOS PEPTIDOS O PROTEINAS Y A LA UTILIZACION DE ESTAS SECUENCIAS COMO MEDICAMENTO. MAS PARTICULARMENTE, TALES SECUENCIAS DE ADN PUEDEN UTILIZARSE EN COMPOSICIONES DESTINADAS A LA INMUNIZACION POR VIA INTRAMUSCULAR O INTRADERMICA.

Description

Proteína portadora de efecto adyuvante, complejo inmunogénico que la contiene, su procedimiento de preparación, secuencia nucleotídica y vacuna.

La presente invención se refiere a unos adyuvantes destinados a estar asociados a una molécula para mejorar su actividad, en particular para aumentar la intensidad de la respuesta inmunitaria. La invención se refiere asimismo a unos complejos que contienen dicho adyuvante asociado a una molécula activa.

La molécula activa puede ser principalmente una proteína, un péptido, un polisacárido, un oligosacárido o un ácido nucleico, ADN o ARN.

La puesta a punto de las vacunas perfectamente definidas y desprovistas de los efectos secundarios marcados, requiere la utilización de antígenos de vacuna de bajo peso molecular, tales como péptidos u oligosacáridos. Dichos antígenos de bajo peso molecular, pero también determinados antígenos de peso molecular superior tales como los polisacáridos de la pared bacteriana, no pueden por sí solos inducir una respuesta inmunitaria duradera e intensa. Resulta indispensable unir dichos antígenos, por vía química o por ingeniería genética, a unas proteínas portadoras.

Las proteínas portadoras que se utilizan actualmente son de dos tipos:

-: las anatoxinas tetánica y diftérica; el empleo muy frecuente de dichas proteínas portadoras corre el riesgo de ir en contra de una respuesta intensa contra el hapteno y el riesgo de causar problemas de inmunotoxicidad,

-: un extracto de proteína de membrana de Neisseria meningitidis (OMPC): está constituido por una proteína de membrana contaminada por unos lípidos y por unos LPS.

El documento EP-267 204 ha propuesto la utilización de una molécula de soporte destinada a acoplarse a un inmunógeno, y que consiste en una proteína de membrana de E. coli o de Salmonella.

El documento Lawrence et al. (Journal of General Microbiology, 137, 8, 1911-1921, 1991) describe las secuencias nucleotídicas parciales del locus que codifica para la proteína de membrana externa de tipo A (OmpA) de diferentes especies de enterobacterias, como Klebsiella pneumoniae, con el fin de permitir establecer las relaciones filogenéticas entre dichas especies.

El solicitante ha demostrado que una proteína extraída de la membrana externa de Klebsiella pneumoniae permite mejorar considerablemente la respuesta inmunitaria a un antígeno o un hapteno cuando se administra al mismo tiempo que uno de ellos a un huésped. Más particularmente, una proteína OmpA, la proteína 40 de K. pneumoniae, se puede utilizar como adyuvante en unos complejos inmunogénicos, en los que se asocia a un elemento inmunógeno.

Los conjugados químicos resultantes de un acoplamiento de péptidos a la P40 proporcionan buenos resultados, y una evaluación de la respuesta inmunitaria muestra unas respuestas en anticuerpos contra dichos péptidos superiores a las observadas utilizando las proteínas portadoras de referencia, KLH o TT.

Sin embargo, los antígenos peptídicos se implantan de forma preferente sobre la parte C-terminal de la secuencia, la parte de la molécula más inmunógena (Puohiniemi, R et al., 1990, Infect. Immu., 58, 1691-1696. Esto puede representar un problema grave para las proteínas de fusión que contienen la secuencia completa de P40. De este modo, la utilización de un fragmento de la secuencia que presenta la actividad adyuvante, minimizaría más la inmunogenicidad de la proteína portadora y los riesgos asociados a dicho inmunogenicidad.

Así, la presente invención tiene por objeto un complejo inmunogénico del tipo que comprende un elemento inmunógeno, asociado a un adyuvante que aumenta la intensidad de la respuesta inmunitaria, caracterizado porque el elemento inmunógeno es un antígeno o un hapteno, y porque el adyuvante comprende por lo menoss una parte de la proteína P4 de Klebsiella pneumoniae, consistiendo dicha parte en la secuencia comprendida entre los aminoácidos 1 a 179, 108 a 179, o 127 a 179 de la secuencia SEC ID Nº 2.

En particular, la invención describe un adyuvante constituido por una proteína o por un péptido que presenta la secuencia de P40 sustancialmente desprovista de las partes inmunógenas.

Dichos fragmentos de P40 del adyuvante según la invención son principalmente:

-: la secuencia de P40 desprovista de la parte C terminal periplasmática inmunógena,

-: una secuencia que contiene el 3º y el 4º (bucle) extramembranoso que rodea una secuencia intramembranaria,

-: una secuencia que contiene un (bucle) extramembranoso invariable y la secuencia intramembranosa adyacente.

Se definen como bucles extramembranosos invariables las secuencias de P40 homólogas con las secuencias de los bucles conservados entre diferentes especies de enterobacterias. Las secuencias de los bucles extramembranosos no conservados a lo largo de la evolución se denominan bucles variables. La localización de los bucles extramembranosos se realiza según el modelo de VOGEL y JAHNIG (1986, J. Mol. Biol., 190: 191-199) que se refiere al OmpA de E. coli.

La selección de los fragmentos y más particularmente la tercera secuencia (aminoácidos 127 a 179) se funda en la hipótesis según la cual los bucles extramembranosos invariables (conservados entre los OmpA de las diferentes enterobacterias) contienen unas secuencias reconocidas por unas células inmunocompetentes, dichas últimas pueden presentar unos receptores que reconocen dichas secuencias.

El reconocimiento específico de dichas secuencias por unas células presentadoras de antígenos permitirían dirigir unos antígenos hacia dichas células y de este modo inducir un efecto adyuvante.

Por tanto, uno de los objetos de la invención es un producto adyuvante que consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos 1 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae, o una secuencia que presenta por lo menos el 80% y preferentemente por lo menos el 90% de homología con la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 1 y 179 de la secuencia de la proteína P40 de K. pneumoniae de la secuencia SEC ID Nº 2.

Otro objeto de la invención es un adyuvante que consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos 108 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae o una secuencia que presenta por lo menos el 80% de homología y preferentemente por lo menos el 90% de homología con la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 108 y 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae de secuencia SEC. ID Nº 2.

Según otro aspecto, la invención tiene por objeto un adyuvante que consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 127 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae o una secuencia que presenta por lo menos el 80% y preferentemente por lo menos el 90% de homología con la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 127 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae de secuencia SEC ID Nº 2.

Las secuencias ID nº 2, ID nº 4, ID nº 6 e ID nº 8 corresponden a unos adyuvantes según la invención. Dicha proteína y dichos péptidos adyuvantes pueden prepararse principalmente a partir de membranas de bacterias del género Klebsiella pneumoniae. El procedimiento comprende por lo tanto las etapas siguientes:

a): recipitación de los liposacáridos por adición de un detergente y de una sal de un catión divalente y recuperación del sobrenadante,

b): precipitación de las proteínas del sobrenadante y resuspensión del precipitado,

c): cromatografía de la suspensión sobre el intercambiador de aniones y recuperación de las fracciones que contienen el producto adyuvante,

d): cromatografía sobre intercambiador de cationes y recuperación de la fracción que contiene el producto adyuvante,

e): concentración de la fracción obtenida al final de la etapa d) para recuperar un producto adyuvante en forma de proteína o de péptido, esencialmente desprovisto de lipopolisacáridos.

Pueden preverse ventajosamente unas etapas de diálisis entre, respectivamente, las etapas b) y c) y las etapas c) y d).

La invención tiene asimismo por objeto los complejos inmunogénicos que pueden obtenerse a partir de los diferentes adyuvantes.

El adyuvante se puede asociar al elemento inmunógeno por acoplamiento químico.

Dicho acoplamiento covalente del hapteno peptídico con el adyuvante se puede efectuar de una forma bien conocida en la técnica. Unos reactivos adecuados para dicho fin comprenden principalmente los ésteres N-succinimida, las carboimidas, el EEDQ (N-etoxicarbonil -2- etoxi -1,2- dihidroquinoleína) y similares.

Se puede asimismo fusionar por ingeniería genética el fragmento de la proteína P40 implicada y el elemento inmunógeno.

La proteína de fusión obtenida entre el fragmento de la proteína 40 y el elemento inmunógeno puede asimismo fusionarse, por ingeniería genética a una proteína que es un receptor de una proteína sérica, en particular de la albúmina sérica humana.

El elemento inmunógeno, un antígeno o un hapteno, puede principalmente preceder de un virus; se pueden citar las proteínas del RSV (Virus Respiratorio Sincitial) o sus fragmentos, por ejemplo la proteína G del RSV, o el antígeno de la hepatitis B.

En el caso de la proteína G del RSV, se puede utilizar la proteína total o sus fragmentos, eventualmente modificados por mutagénesis puntual o deleción.

El solicitante ha demostrado que la administración de un hapteno acoplado a un fragmento de la proteína P40 según la invención conllevaba un aumento sustancial de la respuesta inmunitaria, limitando los riesgos de reacciones en contra del adyuvante mismo.

Un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno o de un hapteno, caracterizado porque se asocia dicho antígeno o hapteno a un adyuvante que comprende todo o parte de la secuencia de la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae, en forma de un complejo que tal como se ha definido anteriormente forma asimismo parte de la invención.

La invención tiene asimismo por objeto una vacuna, caracterizada porque contiene un elemento inmunógeno asociado a un fragmento de la proteína P40 susceptible de ser preparado mediante el procedimiento según la invención.

La invención comprende asimismo unas composiciones farmacéuticas que contienen un complejo formado entre un adyuvante y un elemento inmunógeno, tal como se ha definido anteriormente y unos excipientes farmacéuticamente aceptables adaptados para su administración por vía parenteral y/u oral.

Los ejemplos que siguen están destinados a ilustrar la invención, sin por ello limitar su alcance.

En dichos ejemplos, se hará referencia a las figuras siguientes:

Figura 1: Estrategia de clonaje mediante amplificación genética de P40.

Figura 2: Clonaje de P40 en pVABBG2\DeltaC.

Figura 3: Selección de los diferentes fragmentos de P40.

Figura 4: Clonaje de \DeltaP40G2\DeltaC en pVABB.

Figura 5: Respuesta del anticuerpo anti-peptídico G1\DeltaC después de unas inmunizaciones con diferentes concentraciones de P40ext-G1\DeltaC.

Figura 6: Respuesta del anticuerpo anti-peptídico G1\DeltaC obtenida utilizando diferentes esquemas de inmunización.

Ejemplo 1 Aislamiento y purificación de la proteína P40 Material y métodos

La biomasa de Klebsiella pneumoniae (cepa 1-145, 40 g de células secas) se ajusta a un pH de 2,5 con la ayuda de ácido ascético puro.

Después de la adición de ½ volumen de una solución que contiene 6% de cetrimida, 60% de etanol, CaCl_{2} 1,5 M cuyo pH se ajusta a 2,5 con ácido ascético, la mezcla se coloca bajo agitación durante 16 horas a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación 20 min. a 15000 g a una temperatura de 4ºC, se precipitan las proteínas del sobrenadante con etanol. Se realizan dos precipitaciones sucesivas con una centrifugación intermedia (10 min., 10000g, 4ºC): del 20 al 50% después del 50 al 80%.

Los precipitados obtenidos después de la segunda precipitación se resuspenden en una solución de zwittergent 3-14, al 1%.

Después de la agitación durante 4 horas a temperatura ambiente, se ajusta el pH a 6,5 con la ayuda de NaOH 1N.

Una centrifugación de la mezcla durante 20 min. a 10000 g a una temperatura de 4ºC permite obtener una fracción enriquecida en proteínas membranosas (fracción MP).

Las proteínas de la fracción MP se dializan contra un tampón Tris/HCl 20 mM pH 8,0; zwittergent 3-14, 0,1%. El dializado se deposita en una columna que contiene un soporte de tipo intercambiador de aniones fuertes (columna de \diameter = 50 mm x H = 250 mm, gel Biorad Macroprep High Q) equilibrado en el tampón descrito anteriormente. La proteína P40 se eluye para una concentración de 50 mM NaCl en el tampón de equilibración.

Las fracciones que contienen la P40 se juntan y se dializan contra un tampón citrato 20 mM pH 3,0; zwittergent 3-14, 0,1%. El dializado se deposita en una columna que contiene un soporte de tipo intercambiador de cationes fuertes (dimensiones de la columna: \diameter = 25 mm x H = 160 mm, gel Biorad Macroprep High Q) equilibrado en el tampón 20 mM pH 3,0; zwittergent 3-14, 0,1%. La proteína P40 se eluye para una concentración de 0,7 M en NaCl. Las fracciones que contienen la P40 se juntan y se concentran mediante ultrafiltración con la ayuda de un sistema de filtración de flujo tangencial Minitan Millipore utilizado con unas placas de membranas que presentan un umbral de corte de 10 kDa.

Resultados

Las fracciones obtenidas después de cada etapa cromatográfica se analizan con SDS-PAGE con el fin de juntar las que contienen la proteína P40.

Las cantidades de proteínas se miden mediante el método de Lowry (tabla 1).

TABLA 1 Tabla recapitulativa de las cantidades de proteína y de LPS de las fracciones obtenidas en las diferentes etapas del procedimiento de purificación de la proteína P40 (n.d. = no determinada)

1

La pureza y la homogeneidad de la proteína P40 se estiman por SDS-PAGE.

Tras la etapa de cromatografía de intercambio de cationes, la proteína P40 está desprovista del contaminante mayor presente en la fracción MP (la proteína que presenta un peso molecular aparente de 18 kDa) y presenta un grado de pureza superior al 95%. Por otra parte, dicha etapa de purificación permite la eliminación de los lipopolisacáridos. Dicha etapa de purificación no existía en el procedimiento de purificación presentado anteriormente.

El perfil electroforético de la P40 revela diversas bandas. Dichas bandas son reconocidas después de inmunoblot por unos anticuerpos monoclonales anti-P40 obtenidos de ratón. La banda mayor superior corresponde a la proteína desnaturalizada (mediante el tratamiento a una temperatura de 100ºC, 15 min. en presencia de SDS), y la banda menor inferior de la proteína en su forma nativa.

La P40 es en efecto una proteína denominada modificable por el calor (heat-modifiable), y dicha propiedad se ha verificado con la ayuda de una cinética de calentamiento a una temperatura de 100ºC en presencia de SDS. Bajo calentamiento la proteína en la forma nativa presenta una estructura en láminas \beta que fija más SDS y por lo tanto migra más lejos hacia el ánodo que la forma desnaturalizada (desnaturalización completa después de 5 min. a una temperatura de 100ºC) que presenta una estructura en hélices \alpha (KELLER, K.B. 1978, J. Bacterial., 134, 1181-1183).

La contaminación por los lipopolisacáridos (LPS) se estima mediante la dosificación por cromatografía en fase gaseosa del ácido \beta-hidroximirístico, ácido graso marcador de los LPS de Klebsiella pneumoniae (tabla 1).

Dicho método sólo se puede utilizar para acercar el contenido en LPS de las muestras resultantes de las diferentes etapas de purificación.

La cantidad de ácido \beta-hidroximirístico presente en la fracción P40 después de la cromatografía de intercambio de cationes es inferior al umbral de cuantificación de la dosificación, se puede estimar que la cantidad de LPS residual es inferior al 1%.

Ejemplo 2 Clonaje y expresión de la proteína P40

El 72% de la secuencia del gen del OmpA de Klebsiella pneumoniae ha sido publicado por LAWRENCE et al., 1991, J. Gen. Microbiol., 137: 1911-1921).

La originalidad de nuestros trabajos reside en la determinación de la totalidad de la secuencia, es decir la que corresponde a los 83 aminoácidos y a los 11 aminoácidos N-terminales (sobre un total de 335 aminoácidos).

Material y método Cepas bacterianas

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  E. coli : \+ RV308: cepa ATCC 31608 (Maurer, R.  et
al .,   1980 , J. Mol. Biol.,  139 ,
147-161)\cr  *  K. pneumoniae : \+ IP 145: cepa
C.I.B.P.F - Patente de invención depositada el 19 de enero
1981.\cr}

Vectores

\text{*}: pRIT 28 (Hultman T. et al., 1988, Nucléosides Nucléotides, 7, 629 - 638): vector de clonaje y de secuenciación que presenta el gen de resistencia a la ampicilina, los orígenes de replicación de E. coli y del fago F1 así como una porción del gen lac-Z de E. coli (\beta-Galactosidasa).

\text{*}: pVABB: vector de expresión de fusión del gen.

Soluciones

\text{*}: Amplificación genética

	Tampón de lisis:	25 mM Taps pH 9,3
		2 mM MgCl_{2}

	Tampón de amplificación:	25 mM de Taps pH 9,3
		2 mM MgCl_{2}
		Tween 20 0,1%
		200 mM dNTP

\text{*}: Purificación de las proteínas

TST (20X):	Tris base	0,5 M
	HCl	0,3 M
	NaCl	4 M
	Tween 20	1%
	EDTA	20 mM

Tampón de lavado:	Tris HCl	20 mM	pH 8,5
	MgCl_{2}	5 mM

Solución de desnaturalización:	Gua-HCl	7,8 M
	Tris- HCl	28 mM	pH 8,5

Solución de renaturalización:	Gua-HCl	0,5 M
	Tris - HCl	25 mM	pH 8,5
	NaCl	150 mM
	Tween 20	0,05%

Síntesis de los oligonucleótidos

Los cebadores nucleotídicos se han determinado a partir de la parte de la secuencia publicada del OMPA de Klebsiella pneumoniae (Lawrence, J.G. et al., 1991, J. Gen. Microbiol., 137, 1911-1921) de la secuencia consenso obtenida del alineamiento de las secuencias de 5 OMPA de enterobacterias (E. coli, S. typhimurium, S.marcescens, S. dysenteriae, E. aeroginosae), así como de las secuencias de péptidos obtenidas por secuenciación manual.

Los oligonucleótidos se han sintetizado según el método químico de los fosforamiditos en el aparato "Gene Assembler Plus" de Pharmacia.

Amplificación genética por PCR del gen P40

El ADN del OMPA de Klebsiella pneumoniae se ha amplificado de la manera siguiente.

Se lisa una colonia de Klebsiella pneumoniae en 10 \mul de tampón de lisis por calentamiento a una temperatura de 95ºC durante 5 minutos.

1 \mul de dicha solución sirve como fuente de ADN para las reacciones de amplificación.

Dichas reacciones se realizan en 100 \mul de tampón de amplificación, con 5 pmoles de cada cebador y una unidad de enzima Taq polimerasa (Perkin Elmer Cetus). Cada ciclo comprende una etapa de desnaturalización de 30 segundos a una temperatura de 95ºC seguida de una hibridación del cebador con el ADN y de una extensión de un minuto a una temperatura de 72ºC. Se han llevado a cabo de este modo 30 ciclos con la ayuda del termociclador "Gen Amp PCR" 9000 Perkin Elmer Cetus.

Las PCR siguientes se realizan a partir de fragmentos de ADN amplificados anteriormente.

Los fragmentos de ADN amplificados se digieren a continuación y se ligan al vector pRIT 28.

Secuenciación

Los fragmentos clonados de este modo se secuencian en un secuenicador automático 373 Secuenciador ADN de Applied Biosystem. Las reacciones de secuenciación se realizan con la ayuda del equipo "dye Terminador" según las recomendaciones del suministrador (Applied Biosystem) o bien del ADN de doble hebra obtenido después de la amplificación genética o resultante de maxiprep o bien del ADN de cadena sencilla resultante de los fragmentos de PCR desnaturalizados (Hultman, T. et al., 1989, Nucleic Acids Rev. 17: 4937 - 4946).

Expresión de la proteína

El gen completo de P40 se clona en el vector de expresión pVABB. Dicho vector permite adjuntar una cola de afinidad "BB" a P40; siendo B la parte de la proteína G del estreptococo que une la albúmina sérica (Nygren, P.A. et al, 1988, J. Mol. Recognit. 1, 69-74).

Las cepas de E. coli RV308 transformadas por el vector pVABBP40 se cultivan una noche a una temperatura de 37ºC bajo agitación, en 100 ml de TSB complementado con extracto de levadura, en ampicilina (200 \mug/ml) en tetratciclina (8 \mug/ml) y en triptófano (100 \mug/ml). Al día siguiente, se prepara un cultivo de D0 =1 para una longitud de onda de 580 nm en TSB + extractos de levadura + ampi + tetra.

Después de 10 minutos de cultivo, se induce la expresión de la proteína mediante la adición de IAA a (25 \mug/ml) en el medio. Se centrifuga el cultivo a una temperatura de 4ºC a 2460 g durante 10 minutos.

El precipitado se resuspende con 20 ml de TST 1x pH 7,4, y entonces se centrifuga la solución a una temperatura de 4ºC a 23000 g durante 30 minutos.

El sobrenadante se pasa por HSA Sefarosa lo que permite aislar las proteínas denominadas solubles. El precipitado se lava con el tampón de lavado y después se centrifuga a 23000 g a una temperatura de 4ºC durante 30 minutos. El precipitado que presenta los cuerpos de inclusión se resuspende entonces con 900 \mul de una solución desnaturalizante + 100 \mul de Ditioteritol 10 mM y se incuba 2 horas a una temperatura de 37ºC.

A continuación, se incuba la solución 1 noche a temperatura ambiente, bajo agitación, en 100 ml de tampón de renaturalización y después se centrifuga a 23000 g a una temperatura de 4ºC durante 30 minutos.

El sobrenadante se pasa por Sefarosa HSA.

En los dos casos las proteínas fijadas se eluyen con ácido ascético 0,5 M pH 2,8 y se recogen por fracción de 1 ml.

Las fracciones recogidas se analizan a continuación sobre un gel de electroforesis en SDS-PAGE y por inmuno blot.

Resultados

El clonaje del gen se efectúa en tres etapas según la estrategia presentada en la figura 1.

En una primera etapa, se ha confirmado la parte de la secuencia publicada a excepción de una T en lugar de una A en la posición 103.

Después se ha determinado la secuencia en 3' del gen y por último la que está en 5'.

El gen completo se ha obtenido por fusión de dos partes 8/4 y 3/14 y después se ha clonado en el vector pRIT 28. La secuencia es la secuencia id nº 1.

La proteína se expresa en la forma BBP40.

Se ha obtenido esencialmente a partir de los cuerpos de inclusión. Para un cultivo de 200 ml, se purifica una quincena de miligramos de proteína.

El perfil electroforético muestra que BBP40, obtenida después de la desnaturalización, es de una gran pureza. El peso molecular aparente, corresponde al peso teórico calculado que es de 63 KDa.

La caracterización por Inmuno blot muestra que la proteína purificada es bien reconocida por el suero de conejo anti-P40.

Ejemplo 3 Proteína de fusión BBP40G2\DeltaC, subgrupo a

Se ha sintetizado un oligonucleótido correspondiente a la parte N Terminal delecionado del codón de parada del gen.

La parte en 5' se ha amplificado mediante PCR, se ha purificado, se ha clonado en el vector pRIT 28 y se ha secuenciado, según la metodología descrita en el ejemplo 2.

En una segunda etapa, las dos partes del gen se han fusionado y se han clonado en el vector pVABBG2\DeltaC (figura nº 2). G2\DeltaC representa la secuencia de un fragmento de 101 aminoácidos de la proteína G del virus respiratorio sincitial G (130-230).

A continuación se han transformado unas bacterias E. coli del cepa RV308 con el vector pVABBG2\DeltaC.

Las proteínas producidas se purifican tal como se ha descrito anteriormente para BBP40.

Resultados

La proteína BBP40G2\DeltaC se ha obtenido esencialmente a partir de los cuerpos de inclusión. Se purifica una docena de mg de proteínas a partir de 200 ml de medio de cultivo.

En electroforésis, la proteína es bastante pura.

El peso molecular aparente corresponde al peso teórico calculado que es de 75 KDa.

Ejemplo 4 Clonaje y expresión de tres fragmentos de P40 Material y métodos Los oligonucleótidos

Se han sintetizado tres oligonucleótidos complementarios de la secuencia de P40: 16-17-18 (ver referencia figura 3).

A continuación se han amplificado mediante PCR unas partes del gen determinadas a partir del ADN de una miniprep (protoclo Applied) de pRIT 28 P40.

De este modo se ha podido clonar la parte del gen correspondiente a la totalidad de la parte transmembrana (8/17, denominada fragmento nº 8) a dos bucles externos - dos porciones transmembranosas (16/17, denominadas fragmento nº 16) y un bucle externo dos porciones transmembranosas (18/17, denominado fragmento nº 18).

Los fragmentos de ADN amplificados de este modo se digieren y después se aíslan y se ligan al vector pRIT 28 y se secuencian (ver referencia BBP40 clonaje de P40).

La proteína de fusión BB\DeltaP40G2\DeltaC

El gen G2\DeltaC se digiere a partir del vector pRIT 28 G2\DeltaC y después se liga al vector digerido pRIT 28 \DeltaP40 (\DeltaP40 representa uno de los fragmentos de P40).

Después, el conjunto \DeltaP40G2\DeltaC se digiere y se clona en el pVABB (ver referencia figura 4).

Las tres proteínas híbridas se expresan según el protocolo descrito para BBP40.

Resultados

Tal como BBP40 y BBP40G2\DeltaC, BB8G2\DeltaC se ha obtenido esencialmente a partir de los cuerpos de inclusión. Un cultivo de 400 ml proporciona una decena de mg de proteínas.

Por el contrario, las proteínas BB18G2\DeltaC, y BB16G2\DeltaC se recuperan mayoritariamente en la etapa de sonicación, en forma soluble. En los dos casos, se obtiene una decena de mg/400 ml de cultivo.

Dichas proteínas se caracterizan por electroforesis SDS -PAGE. Su peso molecular corresponde al peso teórico calculado:

BB8G2\DeltaC	58,03 kDa
BB16G2\DeltaC	46,5 kDa
BB18G2\DeltaC	45,5 kDa

Los tres híbridos son bien reconocidos tanto por un anticuerpo policlonal antiG2 como anti P40 en Transferencia Western.

Ejemplo 5 1. Efectos de la proteína P40 sobre unas células del sistema inmunitario 1.a. Linfocitos B

Se inyectan por vía subcutánea a unos ratones BALB/c (5 por grupo) en los días 0 y 21, 30 \mug de P40 obtenidos por extracción de la membrana (P40 ext) o por recombinación genética (P40 rec, es decir BBP40). Las inmunizaciones se han realizado sin ningún adyuvante. A los 10 días después de la última inmunización, se ha evaluado la respuesta en anticuerpos anti-P40 ext en los sueros individuales por el método ELISA. La tabla 2 proporciona la media de los títulos obtenidos en 5 muestras. Los controles negativos no contenían el anticuerpo anti-P40ext.

TABLA 2 Respuesta anticuerpo anti-P40ext

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2

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En dichas condiciones experimentales, la P40rec es tan inmunógena como la P40ext. Dichas dos proteínas contienen por lo tanto unos epítopos B que intereaccionan con los linfocitos B.

1.b. Linfocitos T

La reacción de hipersensibilidad retardada (HSR) a la P40ext se ha medido mediante el ensayo de hinchazón diferida de la almohadilla. Se han sensibilizado unos ratones BALB/c (5 por grupo) por vía subcutánea con 100 \mug de P40ext sin ningún adyuvante. Después de 6 a 10 días, los ratones se han estimulado por vía subcutánea con 100 \mug de P40 ext/20 \mul en la almohadilla posterior derecha, mientras que la almohadilla posterior izquierda recibía PBS. 24 horas más tarde, se ha medido la hinchazón de la almohadilla. No se observa hipersensibilidad retardada en el control negativo (5 ratones no sensibilizados).

TABLA 3 Reacción de hipersensibilidad retardada inducida por P40ext, medida por la hinchazón de la almohadilla (en mm)

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3

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Los resultados mostrados en la tabla 3 indican que los ratones inmunizados con P40 ext producen unas reacciones de hipersensibilidad retardada altamente cuantitativas en la almohadilla. La reacción HSR refleja la respuesta inmunitaria de mediación celular, necesitando unas células Th 1. Se puede concluir que P40 ext contiene por lo menos un epítopo T que es capaz de favorecer la respuesta Th 1, sin restricción MHC.

1.3. Macrófagos

Se ha determinado el efecto de P40ext sobre unos macrófagos mediante su producción de nitrito. Se han incubado unas células RAW 264,7, que son unos monocitos-macrófagos de ratón, 72 horas a una temperatura de 37ºC en presencia de diferentes concentraciones de P40 ext. Se ha medido la cantidad de nitritos en el sobrenadante de los cultivos celulares mediante la dosificación colorimétrica con el reactivo de Griess-llosvay.

La producción de nitrito refleja la activación de los macrófagos, y juega un papel importante en la actividad anti-microbiana y anti-tumoral de dichas células. Los datos obtenidos muestran que el P40ext estimula la producción de nitritos de las células RAW 264,7, demostrando que P40ext activa los macrófagos.

2. P40 es un portador de efecto adyuvante para un péptido (G1\DeltaC) 2.1. Comparación de P40ext con otros soportes

El péptido utilizado es G1\DeltaC, un péptido obtenido a partir de la proteína G del RSV: (G174-187 \DeltaC) Trudel et al., 1991, J. Virol. 185: 749-757.

Cinética de la respuesta inmunitaria contra G1 \DeltaC

Se inmunizan unos ratones C57BI/6 (5 por grupo) con G1 \DeltaC bajo diferentes formas según un esquema de inmunización idéntico. Las respuestas de los anticuerpos inducidas por las diferentes formas de G1 \DeltaC se comparan en el tiempo: 7, 17, 28, 35, 42 días después del inicio del experimento.

La respuesta anti-G1 \DeltaC es significativamente mayor y más rápida cuando se han inmunizado los ratones con P40/G1 \DeltaC que con las inmunizaciones más clásicas TT/G1 \DeltaC y KLH/G1 \DeltaC + AF. Una sola inyección de P40/G1 \DeltaC permite obtener, en 7 días, un título de anticuerpos anti-G1 \DeltaC de 1000. Dicho título se obtiene con TT/G1 \DeltaC+ AF en 28 días. La respuesta máxima (título = 1/380000), obtenido después de tres inyecciones, en 28 días, es aproximadamente 30 veces superior a la obtenida con KLH/G1 \DeltaC + AF y 70 veces superior a la obtenida con TT/G1 \DeltaC. El título de anticuerpo anti-G1 se mantiene sin disminuir hasta el día 42.

Conclusión

El acoplamiento químico del péptido G1 \DeltaC sobre la proteína P40 ha permitido inducir una respuesta anti-G1 \DeltaC tan importante como en los modelos de referencia KLH/G1 \DeltaC +AF o TT/G1 \DeltaC.

Los resultados obtenidos muestran que P40ext es una molécula portadora a un efecto adyuvante para G1\DeltaC: P40ext es mejor que la toxina tetánica y tan buena como la asociación KLH + adyuvante de Freund.

2.1 Distribución isotópica de los anticuerpos anti-péptido G1\DeltaC

Los isótopos de los sueros obtenidos durante los experimentos descritos anteriormente se han determinado por ELISA. La tabla 4 presenta la media de los valores de A450 de 5 sueros individuales ensayados a la dilución
1/250.

TABLA 4 Distribución isotópica de los anticuerpos anti-péptido G1\DeltaC

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4

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Se ha demostrado que la secreción de isótopo de anticuerpo se regula mediante unos sub-conjuntos de células Th específicos de un antígeno que se pueden dividir en dos sub-conjuntos Th1 y Th2. Los clones Th1 producen Il-2 e IFN-gamma, y unas linfotoxinas, mientras que los clones Th2 producen Il-4 e Il-5. Los clones Th1 y Th2 inducen específicamente la secreción por las células B específicas de un antígeno, respectivamente de IgG2a + IgG3 y de IgG1 + IgG 2b + IgG E. Los datos presentados en la tabla 4 muestran que IgG1 e IgG2b son los dos isótopos mayores de los anticuerpos anti G1\DeltaC, el IgG2a está asimismo representado. Se puede concluir que en los ratones C57B1/6, P40-G1\DeltaC provoca una respuesta Th2 superior a la respuesta Th1.

2.2. Estudio dosis-efecto

Se ha inyectado por vía subcutánea a unos ratones BALB/c (5 por grupo) diferentes concentraciones de P40ext-G1\DeltaC, en los días 0,10 y 21. Una semana después de la inmunización, se extraen unas muestras de sangre y la respuesta anticuerpo anti-péptido G1\DeltaC se estima en los sueros individuales mediante ELISA. Se efectúa la media de los títulos de 5 muestras.

La figura 5 muestra la relación dosis-efecto de P40ext-G1\DeltaC. Una respuesta anticuerpo anti-péptido G1\DeltaC se obtiene con 1 \mug de P40ext-G1\DeltaC. Los títulos de anticuerpos más elevados se observan con 10 a 50 \mug de P40ext-G1\DeltaC.

2.4. Determinación del esquema de inmunización óptima

Se ha inyectado por vía subcutánea a unos ratones BALB/c (5 por grupo) P40ext-G1\DeltaC (equivalente a 10 \mug de G1 \DeltaC) en los días indicados en la figura 6. La respuesta anticuerpo anti-péptido G1\DeltaC se determina en los sueros individuales mediante ELISA. Se han ensayado 4 esquemas de inmunizaciones: una inyección, dos inyecciones en los días 0 y 14, o en los días 0 y 21, y tres inyecciones en los días 0, 21 y 40. La respuesta anticuerpo anti-péptido G1\DeltaC más elevada se obtiene con tres inyecciones.

3. P40ext es un adyuvante eficaz para un antígeno proteico (BBG2\DeltaC)

Se ha inyectado por vía subcutánea a unos ratones BALB/c (5 por grupo) BBG2\DeltaC conjugado químicamente a P40ext (equivalente a 10 \mug de G2 \DeltaC) en los días 0 y 21. Diez días más tarde, la respuesta anticuerpo anti-G2\DeltaC se determina en los sueros individuales mediante ELISA. Se presentan las medias de los títulos de 5 muestras en la tabla 5. El control negativo no contenía el anticuerpo anti-G2\DeltaC.

TABLA 5 Efecto adyuvante de P40ext sobre un antígeno proteico

5

BBG2\DeltaC es débilmente inmunógeno. La utilización del adyuvante de Freund aumenta el título de anticuerpo anti-G2\DeltaC. Cuando BBG2\DeltaC se conjuga por vía química a P40ext, la respuesta anticuerpo anti-G2\DeltaC aumenta aproximadamente 200 veces. P40ext es por lo tanto un buen adyuvante para un antígeno proteico.

4. Actividad adyuvante de los fragmentos de P40

Se ha inyectado por vía subcutánea a unos ratones BALB/c (5 por grupo) el día 0 y se han estimulado el día 21 con las proteínas recombinantes siguientes: la proteína de fusión BBP40G2\DeltaC, la proteína de fusión que contiene el fragmento de P40 nº 8 (BB8G2\DeltaC), la proteína de fusión que contiene el fragmento de P40 nº 16 (BB16G2\DeltaC) y la proteína de fusión que contiene el fragmento de P40 nº 18 (BB18G2\DeltaC) (10 \mug equivalente de G2 \DeltaC).

En el día 31, las respuestas de los anticuerpos anti-G2 \DeltaC, anti-P40 y anti-BB se han determinado mediante ELISA en los sueros individuales. Se ha realizado la media de los títulos de 5 sueros individuales. Los controles negativos no contenían anticuerpos anti-G2 \DeltaC.

TABLA 6 Efecto adyuvante de los fragmentos recombinantes de P40

6

En dicho experimento, se muestra que los fragmentos de P40 conservan las propiedades de la proteína completa. Esto es particularmente espectacular cuando se examina la respuesta de anticuerpo anti-BB.

La respuesta del anticuerpo anti-P40 está considerablemente reducida utilizando los fragmentos P40.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): DEPOSITANTE

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(A): NOMBRE: PIERRE FABRE MEDICAMENTS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 45, PLAZA ABEL GANGE

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(C): CIUDAD: BOLOÑA

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(E): PAIS: FRANCIA

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(F): CÓDIGO POSTAL: 92654

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA P40

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(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOC / MS-DOS

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(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release # 1,0, Versión # 1,25 (OEB)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1008 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucléico

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(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN: 1 ... 1008

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 335 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 537 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\newpage

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1 ... 537

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

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11

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 179 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 216 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1 ... 216

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:

13

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:

14

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 159 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1 ... 159

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:

15

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:

16

Claims

1. Producto adyuvante destinado a mejorar la actividad de una molécula cuando se administra a un huésped, caracterizado porque comprende por lo menos la parte que consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos 1 a 179, 108 a 179 ó 127 a 179 de la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae de la secuencia SEC ID
nº 2.

2. Producto adyuvante según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una proteína que presenta la secuencia ID nº 2 o que presenta por lo menos el 90% de homología con dicha secuencia.

3. Producto adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos 1 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae, o una secuencia que presenta por lo menos el 90% de homología con la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 1 y 179 de la secuencia de la proteína P40 de K. pneumoniae.

4. Producto adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos 108 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae, o una secuencia que presenta por lo menos el 80% de homología con la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 108 y 179 de la secuencia de la proteína P40 de K. pneumoniae.

5. Producto adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque consiste en la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 127 a 179 de la proteína P40 de K. pneumoniae, o una secuencia que presenta por lo menos el 80% de homología con la secuencia comprendida entre los aminoácidos numerados 127 a 179 de la secuencia de la proteína P40 de K. pneumoniae.

6. Proteína o péptido que presenta una de las secuencias ID nº 2, ID nº 4, ID nº 6 o ID nº 8.

7. Complejo inmunogénico del tipo que comprende un elemento inmunógeno, asociado a un adyuvante que aumenta la intensidad de la respuesta inmunitaria, caracterizado porque el elemento inmunógeno es un antígeno o un hapteno, y el adyuvante comprende un producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Complejo inmunogénico según la reivindicación 7, caracterizado porque el elemento inmunógeno está asociado al adyuvante mediante un enlace covalente.

9. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el elemento inmunógeno está constituido por un fragmento de la proteína G del RSV.

10. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el elemento inmunógeno, asociado al adyuvante, se fusiona con una proteína que es un receptor de una proteína sérica, en particular de la albúmina sérica humana.

11. Procedimiento in vitro para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno o de un hapteno, caracterizado porque se asocia dicho antígeno o hapteno a un adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma de un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se asocia el antígeno o el hapteno al adyuvante mediante acoplamiento químico.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque el antígeno o el hapteno se fusiona por ingeniería genética con el adyuvante.

14. Vacuna caracterizada porque contiene un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, susceptible de ser preparada mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. Procedimiento para la preparación de un producto adyuvante, proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, a partir de membranas de bacterias del género Klebsiella pneumoniae, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): precipitación de los lipopolisacáridos mediante adición de detergente y de una sal de catión divalente y recuperación del sobrenadante,

c): cromatografía de la suspensión sobre intercambiador de aniones y recuperación de las fracciones que contienen el producto adyuvante,

\newpage

e): concentración de la fracción obtenida como resultado de la etapa d) para recuperar un producto adyuvante en forma de proteína, esencialmente desprovisto de liposacáridos.