JP2790333B2 - 外来プロモーターおよび／またはリーダーペプチドを用いたコレラトキシンｂサブユニットの組換え発現系 - Google Patents
外来プロモーターおよび／またはリーダーペプチドを用いたコレラトキシンｂサブユニットの組換え発現系Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、組換えDNAを用いて、コレラトキシンの結
合性サブユニットタンパク質（CTB）またはCTBへのハイ
ブリッド遺伝子融合タンパク質を含むその誘導体を外来
（非コレラトキシン）プロモーターの制御下に発現させ
ること、および／または天然リーダーペプチドではなく
外来リーダーペプチドを有するCTBタンパク質またはそ
の誘導体を合成して細胞膜の通り抜けを促進することに
関する。
合性サブユニットタンパク質（CTB）またはCTBへのハイ
ブリッド遺伝子融合タンパク質を含むその誘導体を外来
（非コレラトキシン）プロモーターの制御下に発現させ
ること、および／または天然リーダーペプチドではなく
外来リーダーペプチドを有するCTBタンパク質またはそ
の誘導体を合成して細胞膜の通り抜けを促進することに
関する。
（従来の技術） 血清型01のコレラ菌（Vibrio cholerae）は、感染個
体の腸内で増殖するとき、腸上皮からの活性電解質と水
の排出を誘発するコレラトキシン（CT）を放出すること
により重症の下痢症状を引き起こす。類似の機構によ
り、他の種類の細菌（例えば大腸菌）もCTに関係のある
または関係のない別のエンテロトキシンを放出すること
により下痢を起こす。
体の腸内で増殖するとき、腸上皮からの活性電解質と水
の排出を誘発するコレラトキシン（CT）を放出すること
により重症の下痢症状を引き起こす。類似の機構によ
り、他の種類の細菌（例えば大腸菌）もCTに関係のある
または関係のない別のエンテロトキシンを放出すること
により下痢を起こす。
CTは原型の細菌エンテロトキシンである。それは２つ
の型のサブユニット：すなわち分子量28000のＡサブユ
ニット１個およびそれぞれが分子量11600のＢサブユニ
ット５個から成るタンパク質である。Ｂサブユニットは
強い非共有結合により集合して１個の環を形成してお
り、Ａサブユニットは弱い非共有相互作用によりＢペン
タマー環に結合して、恐らくはその環の中に部分的に入
り込んでいる。これら２つの型のサブユニットは中毒過
程において異なる役割を果たしている：すなわち、Ｂサ
ブユニットは細胞への結合に関与しており、そしてＡサ
ブユニットは直接の毒性活性を担っている。腸および他
の哺乳動物細胞へのヘキシン結合、並びにＡサブユニッ
ト（およびそのA1断片）の細胞内作用によるアデニル酸
シクラーゼの活性化へ導くその後の現象の分子レベルで
の様相はかなり詳細に明らかにされている（J.Holmgre
n,Nature 292:413−417,1981を参照されたい）。コレラ
菌によるコレラトキシンの合成、組立ておよび分泌の遺
伝学および生化学に関するより細菌の情報も利用し得
る。CTはＡおよびＢサブユニットそれぞれの染色体構造
遺伝子によってコードされている。これらの遺伝子はい
くつかの菌株からクローン化され、それらのヌクレオチ
ド配列が決定された。CTのＡおよびＢサブユニットの遺
伝子は単一の転写単位の中に配列されており、Ａシスト
ロン（ctxＡ）がＢシストロン（ctxＢ）の上流にある。
古典生物型とエルトール（El Tor）生物型のコレラ菌株
におけるCT遺伝子の機構に関する研究は、古典生物型の
菌株にCT遺伝子が２コピー数で存在するが、大部分のエ
ルトール菌株には１コピー数しか存在しないことを示唆
している（J.J.Mekalanos et al,Nature306:551−557,1
983を参照されたい）。CTの合成はctx発現の多重性を増
大させる遺伝子toxＲによりポジティブに調節される（V
L Miller and JJ Mekalanos,Proc Natl Acad Sci USA,8
1:3471−3475,1984を参照されたい）。toxＲは転写レベ
ルで作用し、古典生物型とエルトール生物型の両菌株中
に存在している。toxＲは恐らく、ctxプロモーター領域
とポジティブに相互作用する調節タンパク質をコードす
ることによって、ctx転写を増大させるのであろう。大
腸菌の熱不安定性エンテロトキシン（LT）（LTのサブユ
ニット構造および機能はCTと非常に似ているが、同一で
はない）に関する研究は、ＡおよびＢサブユニットが初
めに成熟サブユニットタンパク質に先行してイーダーペ
プチドをもつ前駆物質として合成されることを明らかに
した。これらの全駆物質はすみやかにプロセッシングを
受け（すなわち、リーダーペプチドが除去される）、内
膜を通って細胞周辺腔（Periplasm）へ移り、そこでＢ
サブユニット単量体が５量体化され、１〜２分の活性中
期（Half−time）でＡサブユニットと会合する。トキシ
ン組立ての経路はＢ単量体または小さいオリゴマーとＡ
サブユニットとの会合を経て進行すると思われる。ひと
たび完全なトキシンが組み立てられると、トキシンが細
胞周辺腔に残存する大腸菌とは対照的に、コレラ菌にお
いてはトキシンがＢサブユニットドメインと外膜とのあ
る種の相互作用によりコレラ菌01の外膜を貫通して輸送
（分泌）される（TR Hirst＆J Holmgren,Proc Natl Aca
d Sci USA,84:7418−7422,1987;SJS Hardy et al,ibid,
in press,1988を参照されたい）。CTまたはLTのＢサブ
ユニットがＡサブユニットの不在下で発現される場合
（数種のこのような菌株がctxＡまたはeltＡシストロン
における化学的突然変異誘発または組換えDNA法による
欠失によってつくられている）、Ｂサブユニットはペン
タマーを形成し、その後完全なトキシンと同じ経路を通
って（ただし、細胞周辺腔での組立てプロセスは明らか
に少し遅い）コレラ菌から分泌される（TR Hirst et a
l,Proc Natl Acad Sci USA,81:2645−2649,1984;SJS Ha
rdy et al,ibid,in press,1988を参照されたい）。コレ
ラに対する非経口的ワクチンを注射はささやかな短期間
の防御（一般には６ケ月に満たない期間にわたって50％
を下回る防御）をもたらしたにすぎなかったので、より
効果的に腸免疫を刺激する経口ワクチンの開発へ注意が
向けられた。特に、このような経口コレラワクチンの一
成分としてのCTBペンタマーに注意が集中した（J Holmg
ren,et al.,Nature 269:602−604,1977を参照）。CTB
は、広範囲の実験においてコレラLTエンテロトキシン産
生大腸菌が引き起こす下痢との両方に対して防御を賦与
することが分かった有効な経口免疫化剤である（J Clem
ens et al.,Lancet ii:124−127,1986;J Infect Dis,in
press,1988を参照）。ＡサブユニットからのＢサブユ
ニットの分離は毒性への復帰の危険性を排除し、CTBは
副作用なしで25000人以上の人々に経口投与された。こ
れらの特徴により、CTBは死滅した全コレラビブリオ菌
と共に新しい経口コレラワクチンの重要な成分となっ
た。さらに、CTBは他の多種多様のペプチドまたは炭水
化物抗原用の免疫原性キャリアーとして最近かなり関心
を持たれており、またコレラや大腸菌による下痢の短期
間の予防のためのレセプター遮断薬およびレセプター変
調薬として用いられている（RI Glass et al,J Infect
Die 149:495−500,1984;ST Donta al,ibid 157:557−56
4,1988;SJ Mckenzie and JF Halsey,J Immunol 133:181
8−1824,1984;A−M Svennerholm et al J Clin Microbi
ol 24:585−590,1986）。
の型のサブユニット：すなわち分子量28000のＡサブユ
ニット１個およびそれぞれが分子量11600のＢサブユニ
ット５個から成るタンパク質である。Ｂサブユニットは
強い非共有結合により集合して１個の環を形成してお
り、Ａサブユニットは弱い非共有相互作用によりＢペン
タマー環に結合して、恐らくはその環の中に部分的に入
り込んでいる。これら２つの型のサブユニットは中毒過
程において異なる役割を果たしている：すなわち、Ｂサ
ブユニットは細胞への結合に関与しており、そしてＡサ
ブユニットは直接の毒性活性を担っている。腸および他
の哺乳動物細胞へのヘキシン結合、並びにＡサブユニッ
ト（およびそのA1断片）の細胞内作用によるアデニル酸
シクラーゼの活性化へ導くその後の現象の分子レベルで
の様相はかなり詳細に明らかにされている（J.Holmgre
n,Nature 292:413−417,1981を参照されたい）。コレラ
菌によるコレラトキシンの合成、組立ておよび分泌の遺
伝学および生化学に関するより細菌の情報も利用し得
る。CTはＡおよびＢサブユニットそれぞれの染色体構造
遺伝子によってコードされている。これらの遺伝子はい
くつかの菌株からクローン化され、それらのヌクレオチ
ド配列が決定された。CTのＡおよびＢサブユニットの遺
伝子は単一の転写単位の中に配列されており、Ａシスト
ロン（ctxＡ）がＢシストロン（ctxＢ）の上流にある。
古典生物型とエルトール（El Tor）生物型のコレラ菌株
におけるCT遺伝子の機構に関する研究は、古典生物型の
菌株にCT遺伝子が２コピー数で存在するが、大部分のエ
ルトール菌株には１コピー数しか存在しないことを示唆
している（J.J.Mekalanos et al,Nature306:551−557,1
983を参照されたい）。CTの合成はctx発現の多重性を増
大させる遺伝子toxＲによりポジティブに調節される（V
L Miller and JJ Mekalanos,Proc Natl Acad Sci USA,8
1:3471−3475,1984を参照されたい）。toxＲは転写レベ
ルで作用し、古典生物型とエルトール生物型の両菌株中
に存在している。toxＲは恐らく、ctxプロモーター領域
とポジティブに相互作用する調節タンパク質をコードす
ることによって、ctx転写を増大させるのであろう。大
腸菌の熱不安定性エンテロトキシン（LT）（LTのサブユ
ニット構造および機能はCTと非常に似ているが、同一で
はない）に関する研究は、ＡおよびＢサブユニットが初
めに成熟サブユニットタンパク質に先行してイーダーペ
プチドをもつ前駆物質として合成されることを明らかに
した。これらの全駆物質はすみやかにプロセッシングを
受け（すなわち、リーダーペプチドが除去される）、内
膜を通って細胞周辺腔（Periplasm）へ移り、そこでＢ
サブユニット単量体が５量体化され、１〜２分の活性中
期（Half−time）でＡサブユニットと会合する。トキシ
ン組立ての経路はＢ単量体または小さいオリゴマーとＡ
サブユニットとの会合を経て進行すると思われる。ひと
たび完全なトキシンが組み立てられると、トキシンが細
胞周辺腔に残存する大腸菌とは対照的に、コレラ菌にお
いてはトキシンがＢサブユニットドメインと外膜とのあ
る種の相互作用によりコレラ菌01の外膜を貫通して輸送
（分泌）される（TR Hirst＆J Holmgren,Proc Natl Aca
d Sci USA,84:7418−7422,1987;SJS Hardy et al,ibid,
in press,1988を参照されたい）。CTまたはLTのＢサブ
ユニットがＡサブユニットの不在下で発現される場合
（数種のこのような菌株がctxＡまたはeltＡシストロン
における化学的突然変異誘発または組換えDNA法による
欠失によってつくられている）、Ｂサブユニットはペン
タマーを形成し、その後完全なトキシンと同じ経路を通
って（ただし、細胞周辺腔での組立てプロセスは明らか
に少し遅い）コレラ菌から分泌される（TR Hirst et a
l,Proc Natl Acad Sci USA,81:2645−2649,1984;SJS Ha
rdy et al,ibid,in press,1988を参照されたい）。コレ
ラに対する非経口的ワクチンを注射はささやかな短期間
の防御（一般には６ケ月に満たない期間にわたって50％
を下回る防御）をもたらしたにすぎなかったので、より
効果的に腸免疫を刺激する経口ワクチンの開発へ注意が
向けられた。特に、このような経口コレラワクチンの一
成分としてのCTBペンタマーに注意が集中した（J Holmg
ren,et al.,Nature 269:602−604,1977を参照）。CTB
は、広範囲の実験においてコレラLTエンテロトキシン産
生大腸菌が引き起こす下痢との両方に対して防御を賦与
することが分かった有効な経口免疫化剤である（J Clem
ens et al.,Lancet ii:124−127,1986;J Infect Dis,in
press,1988を参照）。ＡサブユニットからのＢサブユ
ニットの分離は毒性への復帰の危険性を排除し、CTBは
副作用なしで25000人以上の人々に経口投与された。こ
れらの特徴により、CTBは死滅した全コレラビブリオ菌
と共に新しい経口コレラワクチンの重要な成分となっ
た。さらに、CTBは他の多種多様のペプチドまたは炭水
化物抗原用の免疫原性キャリアーとして最近かなり関心
を持たれており、またコレラや大腸菌による下痢の短期
間の予防のためのレセプター遮断薬およびレセプター変
調薬として用いられている（RI Glass et al,J Infect
Die 149:495−500,1984;ST Donta al,ibid 157:557−56
4,1988;SJ Mckenzie and JF Halsey,J Immunol 133:181
8−1824,1984;A−M Svennerholm et al J Clin Microbi
ol 24:585−590,1986）。
これらの発見は、大規模生産のためにCTBの生産量を
高める必要性をもたらし、理想的にはCTBタンパク質を
活性トキシンから精製しなければならない現行の調製方
法（JL Tayot et al,Eur J Biochem 113:249−258,1981
を参照）の欠点をも同時に回避することを必要とした。
高める必要性をもたらし、理想的にはCTBタンパク質を
活性トキシンから精製しなければならない現行の調製方
法（JL Tayot et al,Eur J Biochem 113:249−258,1981
を参照）の欠点をも同時に回避することを必要とした。
従って、本明細書に開示した戦略および手順を用い
て、本発明者らは、CTB遺伝子（またはハイブリッド融
合タンパク質の遺伝子）が強力な外来（非コレラトキシ
ン）プロモーターの制御下にあるCTBおよびCTB融合タン
パク質の過剰発現系を構築した。この異に関する我々の
成功は、我々の実施例の１つに記載されたプロモーター
の１つ（tacＰ）を用いてこの目的を達成するためのJ.
J.Mekalanosら（Nature 306:551−557,1983）の別の方
法による以前の試みが天然ctxプロモーターを用いたと
きよりも少ないCTBを発現して失敗したと報じられてい
るように、これらの以前の試みと対照を成すものであ
る。
て、本発明者らは、CTB遺伝子（またはハイブリッド融
合タンパク質の遺伝子）が強力な外来（非コレラトキシ
ン）プロモーターの制御下にあるCTBおよびCTB融合タン
パク質の過剰発現系を構築した。この異に関する我々の
成功は、我々の実施例の１つに記載されたプロモーター
の１つ（tacＰ）を用いてこの目的を達成するためのJ.
J.Mekalanosら（Nature 306:551−557,1983）の別の方
法による以前の試みが天然ctxプロモーターを用いたと
きよりも少ないCTBを発現して失敗したと報じられてい
るように、これらの以前の試みと対照を成すものであ
る。
（発明の構成） 組換えDNAを用いることにより、本発明者らは、コレ
ラトキシンのＢサブユニット（CTB）またはCTBの融合タ
ンパク質を含む誘導体のための過剰発現系を達成した。
特徴として、これらの系ではCTBまたはCTB誘導体タンパ
ク質をコードする遺伝子の発現が、広い宿主域のプラス
ミドベクター中の強力な外来（非コレラトキシン）プロ
モーターの制御下に置かれた。この遺伝子構築物は天然
CTプロモーターおよびtoxＲ発現調節系と無関係であ
る。このような過剰発現系が２つ例示され、これらのう
ちの一方においてCTBはtacＰプロモーターの制御下にあ
って誘導可能なまたは構成的な方法で発現され、そして
他方においてはCTB発現がT7RNAポリメラーゼ依存性プロ
モーターにより制御される。これらの実施例では、過剰
発現を可能にする遺伝子構築物が広い宿主域のプラスミ
ド中に存在する。これはこれらのプラスミドを保有する
さまざまな細菌種（例えば大腸菌やコレラ菌）からのCT
BまたはCTB誘導体の高レベル生産を可能にする。融合タ
ンパク質の形をしたCTB誘導体を生産するための外来プ
ロモーター過剰発現系の利用可能性もまた、大腸菌の熱
安定性エンテロトキシン（STa）から誘導された非毒性
デカペプチドをコードする合成DNA配列のCTB遺伝子への
融合、およびtacＰプロモーターの制御下でのコレラ菌
による遺伝子融合タンパク質の発現によって例示される
であろう。
ラトキシンのＢサブユニット（CTB）またはCTBの融合タ
ンパク質を含む誘導体のための過剰発現系を達成した。
特徴として、これらの系ではCTBまたはCTB誘導体タンパ
ク質をコードする遺伝子の発現が、広い宿主域のプラス
ミドベクター中の強力な外来（非コレラトキシン）プロ
モーターの制御下に置かれた。この遺伝子構築物は天然
CTプロモーターおよびtoxＲ発現調節系と無関係であ
る。このような過剰発現系が２つ例示され、これらのう
ちの一方においてCTBはtacＰプロモーターの制御下にあ
って誘導可能なまたは構成的な方法で発現され、そして
他方においてはCTB発現がT7RNAポリメラーゼ依存性プロ
モーターにより制御される。これらの実施例では、過剰
発現を可能にする遺伝子構築物が広い宿主域のプラスミ
ド中に存在する。これはこれらのプラスミドを保有する
さまざまな細菌種（例えば大腸菌やコレラ菌）からのCT
BまたはCTB誘導体の高レベル生産を可能にする。融合タ
ンパク質の形をしたCTB誘導体を生産するための外来プ
ロモーター過剰発現系の利用可能性もまた、大腸菌の熱
安定性エンテロトキシン（STa）から誘導された非毒性
デカペプチドをコードする合成DNA配列のCTB遺伝子への
融合、およびtacＰプロモーターの制御下でのコレラ菌
による遺伝子融合タンパク質の発現によって例示される
であろう。
定義および略語 本明細書中で用いる用語“CTB"および“CTB誘導体”
な、本明細書において開示したプラスミドpJS162によっ
て、コードされるCTBタンパク質に対して誘導された免
疫血清（抗血清）により認識され得る時を有するタンパ
ク質またはペプチド（大腸菌LTBを除く）を意味する。
な、本明細書において開示したプラスミドpJS162によっ
て、コードされるCTBタンパク質に対して誘導された免
疫血清（抗血清）により認識され得る時を有するタンパ
ク質またはペプチド（大腸菌LTBを除く）を意味する。
“外来プロモーター”なる用語は天然ctxプロモータ
ーと異なることにより特徴づけられるプロモーターを意
味する。
ーと異なることにより特徴づけられるプロモーターを意
味する。
“外来リーダーペプチド”なる用語は、コレラトキシ
サブユニットの天然リーダーペプチドと異なることによ
り特徴づけられ、細胞膜を貫通するタンパク質の輸送
（本明細書ではCTBまたはCTB誘導体の輸送）を促進する
タンパク質分子のペプチド配列を意味する。
サブユニットの天然リーダーペプチドと異なることによ
り特徴づけられ、細胞膜を貫通するタンパク質の輸送
（本明細書ではCTBまたはCTB誘導体の輸送）を促進する
タンパク質分子のペプチド配列を意味する。
例えば、Ｅ−L Winnacker,From Genes to Clones,VCH
Publishers,New York（1987）において用いられる標準
命名法はDNA制限エンドヌクレアーゼ、制限部位および
制限配列を定義するために堅持される。オリゴデオキシ
ヌクレオチドおよびアミノ酸は慣用の一文字略語および
三文字略語を用いて記述される。
Publishers,New York（1987）において用いられる標準
命名法はDNA制限エンドヌクレアーゼ、制限部位および
制限配列を定義するために堅持される。オリゴデオキシ
ヌクレオチドおよびアミノ酸は慣用の一文字略語および
三文字略語を用いて記述される。
ここで、図面について説明する。
第１図A:LTB遺伝子とCTB遺伝子との融合接点。白の正
方形で下線が施されているヌクレオチドはLTB遺伝子か
らのDNAを示し、黒の正方形で下線が施されているもの
はリンカーの合成オリゴデオキシヌクレオチド部分であ
り、そして三角形で下線が施されているものはCTB遺伝
子のDNAを表す。アミノ酸の番号付けはそれぞれの成熟
タンパク質の第一アミノ酸（＋１）に対してそれらの前
方の位置を示す。星印は２つの融合遺伝子のいずれによ
っても本来コードされないアミノ酸を示す。合成リンカ
ーはSac I部位を修復して、Sma I認識配列を導入した。
融合後に、tacＰからCTBをコードするプラスミドが得ら
れた（以下のＢを参照）。示した配列はジデオキシヌク
レオチド塩基配列決定法により確かめた。B:tacＰプロ
モーターの制御下にあるCTB遺伝子を有するプラスミドp
JS162の地図。このプラスミドはRSF1010複製起点を有
し、約10.2kbの大きさである。大きい矢印はtacＰプロ
モーターの位置を示す。星印のあるボックスは成熟CTB
をコードする遺伝子部分を表す。リーダーペプチド（LT
B由来）をコードする部分は黒のボックスで表される。
アンピシリン耐性およびlac Iq遺伝子のおおよその位置
も示される。
方形で下線が施されているヌクレオチドはLTB遺伝子か
らのDNAを示し、黒の正方形で下線が施されているもの
はリンカーの合成オリゴデオキシヌクレオチド部分であ
り、そして三角形で下線が施されているものはCTB遺伝
子のDNAを表す。アミノ酸の番号付けはそれぞれの成熟
タンパク質の第一アミノ酸（＋１）に対してそれらの前
方の位置を示す。星印は２つの融合遺伝子のいずれによ
っても本来コードされないアミノ酸を示す。合成リンカ
ーはSac I部位を修復して、Sma I認識配列を導入した。
融合後に、tacＰからCTBをコードするプラスミドが得ら
れた（以下のＢを参照）。示した配列はジデオキシヌク
レオチド塩基配列決定法により確かめた。B:tacＰプロ
モーターの制御下にあるCTB遺伝子を有するプラスミドp
JS162の地図。このプラスミドはRSF1010複製起点を有
し、約10.2kbの大きさである。大きい矢印はtacＰプロ
モーターの位置を示す。星印のあるボックスは成熟CTB
をコードする遺伝子部分を表す。リーダーペプチド（LT
B由来）をコードする部分は黒のボックスで表される。
アンピシリン耐性およびlac Iq遺伝子のおおよその位置
も示される。
第２図：プラスミドpJS162中のCTB遺伝子のヌクレオ
チド配列。アンチセンス鎖のみが示されており、コード
されるアミノ酸はそれらのそれぞれのコドンの上に示
す。＋１を付けたThr残基は成熟CTB中に通常見られる第
一アミノ酸であり、一方−７位（またはかっこ内＋１
位）のAla残基は成熟LTBの第一アミノ酸である。２つの
タンパク質のどちらにも本来存在しないアミノ酸には星
印が付いている。存在しうるリボソーム結合部位（シャ
イン−ダルガルノ配列）には下線が引いてある（SD）。
垂直の矢印は成熟組換えCTBを放出するために開裂され
るペプチド結合を示す。我々のCTBDNA配列によって推定
されたアミノ酸と不一致の596B CTBタンパク質中のアミ
ノ酸はかっこ内に示され、我々のものおよび古典569B C
TBのものと異なるエルトール株からのCTB中のアミノ酸
残基は太字でかっこ内に示される。
チド配列。アンチセンス鎖のみが示されており、コード
されるアミノ酸はそれらのそれぞれのコドンの上に示
す。＋１を付けたThr残基は成熟CTB中に通常見られる第
一アミノ酸であり、一方−７位（またはかっこ内＋１
位）のAla残基は成熟LTBの第一アミノ酸である。２つの
タンパク質のどちらにも本来存在しないアミノ酸には星
印が付いている。存在しうるリボソーム結合部位（シャ
イン−ダルガルノ配列）には下線が引いてある（SD）。
垂直の矢印は成熟組換えCTBを放出するために開裂され
るペプチド結合を示す。我々のCTBDNA配列によって推定
されたアミノ酸と不一致の596B CTBタンパク質中のアミ
ノ酸はかっこ内に示され、我々のものおよび古典569B C
TBのものと異なるエルトール株からのCTB中のアミノ酸
残基は太字でかっこ内に示される。
第３図:V.cholerae JBK70（pJS 162）によるCTB発現I
PTG誘導。精製した569B CTBタンパク質の均等物として
発現されたCTBのレベル（縦座標）は特異的モノクロー
ナル抗体を用いるGM1−ELISAにより測定した。細胞ペレ
ット中の実際の濃度はグラフに示されるものより10倍低
かった（細胞×10）。
PTG誘導。精製した569B CTBタンパク質の均等物として
発現されたCTBのレベル（縦座標）は特異的モノクロー
ナル抗体を用いるGM1−ELISAにより測定した。細胞ペレ
ット中の実際の濃度はグラフに示されるものより10倍低
かった（細胞×10）。
第４図：煮沸および非煮沸CTB試料のPAGE。等量の組
換えCTBタンパク質（レーン１および２）または標準569
B CTB（レーン３および４）は、試料緩衝液中100℃（レ
ーン１および３）または室温（レーン２および４）で５
分間処理した後、13.5％ポリアクリルアミド−NaDodSO4
ゲルで電気泳動した。タンパク質標品のおおよその大き
さ（KDa）をも分子量マーカー（Bio−Rad社）が示され
る（MW）。569B CTBと比べたときの組換えCTBの比較的
遅い泳動はモノマー（Bm）として試験したときほんのわ
ずかに気がつくが、オリゴマー（ペンタマー）体（Bp）
ではより明白である。
換えCTBタンパク質（レーン１および２）または標準569
B CTB（レーン３および４）は、試料緩衝液中100℃（レ
ーン１および３）または室温（レーン２および４）で５
分間処理した後、13.5％ポリアクリルアミド−NaDodSO4
ゲルで電気泳動した。タンパク質標品のおおよその大き
さ（KDa）をも分子量マーカー（Bio−Rad社）が示され
る（MW）。569B CTBと比べたときの組換えCTBの比較的
遅い泳動はモノマー（Bm）として試験したときほんのわ
ずかに気がつくが、オリゴマー（ペンタマー）体（Bp）
ではより明白である。
第５図：ウサギ抗血清（ウエルＡおよびE:抗組換えCT
B、ウエルC:抗569B CTB）と反応させた569B CTB（ウエ
ルＢおよびＦ）および組換えCTB（ウエルＧおよびＤ）
のオクテルロニーゲル内二重拡散分析。
B、ウエルC:抗569B CTB）と反応させた569B CTB（ウエ
ルＢおよびＦ）および組換えCTB（ウエルＧおよびＤ）
のオクテルロニーゲル内二重拡散分析。
第６図:CTBへのSTa関連デカペプチドの融合。Sac Iお
よびXma I制限末端に適合しうる一本鎖延長部を有する
合成オリゴデオキシヌクレオチド（肉太の大文字で示
す）は、pJS162中のCTBのアミノ末端をコードするDNA領
域に挿入した。合成オリゴヌクレオチドの挿入はCTB遺
伝子のもとの読み枠を維持するように行い、その結果と
してCTB（第一アミノ酸を番号＋１で示す）のアミノ末
端にSTa関連ペプチド（星印で示す）を含むペプチド延
長部を有する融合タンパク質をコードするハイブリッド
遺伝子が得られた。（＋）で示されるアミノ酸は、STa
関連デカペプチドの部分を構成するとは見なされない上
記オレゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸で
ある。第一アミノ酸（Arg）の上流に、LTBをコードする
遺伝子由来のCTBのためのリーダーペプチド、リボソー
ム結合部位（S/D）、およびハイブリッド遺伝子発現の
ためのtacＰプロモーターが存在する（第1B図のプラス
ミドpJS162を参照）。
よびXma I制限末端に適合しうる一本鎖延長部を有する
合成オリゴデオキシヌクレオチド（肉太の大文字で示
す）は、pJS162中のCTBのアミノ末端をコードするDNA領
域に挿入した。合成オリゴヌクレオチドの挿入はCTB遺
伝子のもとの読み枠を維持するように行い、その結果と
してCTB（第一アミノ酸を番号＋１で示す）のアミノ末
端にSTa関連ペプチド（星印で示す）を含むペプチド延
長部を有する融合タンパク質をコードするハイブリッド
遺伝子が得られた。（＋）で示されるアミノ酸は、STa
関連デカペプチドの部分を構成するとは見なされない上
記オレゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸で
ある。第一アミノ酸（Arg）の上流に、LTBをコードする
遺伝子由来のCTBのためのリーダーペプチド、リボソー
ム結合部位（S/D）、およびハイブリッド遺伝子発現の
ためのtacＰプロモーターが存在する（第1B図のプラス
ミドpJS162を参照）。
第７図：プラスミドpJS8を保有するV.choleraeJBK70
によるSTa関連デカペプチド−CTBハイブリッド遺伝子発
現のIPTG誘導。細胞は誘導物質の不在下に液体培地中で
0D600＝0.5へ増殖させ、次いで表示した濃度でIPTGを加
え、細菌培養をさらに４時間続けた後細菌細胞と溶媒上
清とを本文に記載した通りに収穫した。ハイブリッドタ
ンパク質のレベル（縦座標）は、特異的モノクローナル
抗STa抗体（スウェーデン国イェーテボリ、Ａ−M Svenn
erholm博士から親切にも提供されたST1:3）を用いるGM1
−ELISAにより測定した。精製したSTa関連デカペプチド
−CTBハイブリッドタンパク質調製物を標準として使用
した。星印は上清中のハイブリッドタンパク質の濃度を
示し、白の正方形は超音波処理による細胞の破壊後に測
定した細胞に関連した濃度を表す。
によるSTa関連デカペプチド−CTBハイブリッド遺伝子発
現のIPTG誘導。細胞は誘導物質の不在下に液体培地中で
0D600＝0.5へ増殖させ、次いで表示した濃度でIPTGを加
え、細菌培養をさらに４時間続けた後細菌細胞と溶媒上
清とを本文に記載した通りに収穫した。ハイブリッドタ
ンパク質のレベル（縦座標）は、特異的モノクローナル
抗STa抗体（スウェーデン国イェーテボリ、Ａ−M Svenn
erholm博士から親切にも提供されたST1:3）を用いるGM1
−ELISAにより測定した。精製したSTa関連デカペプチド
−CTBハイブリッドタンパク質調製物を標準として使用
した。星印は上清中のハイブリッドタンパク質の濃度を
示し、白の正方形は超音波処理による細胞の破壊後に測
定した細胞に関連した濃度を表す。
第８図：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、それに続くニトロセルロース紙への分
離したタンパク質の電気的移行後のSTa関連デカペプチ
ド−CTBハイブリッドタンパク質のイムノブロッティン
グ分析。レーンＡ〜Ｄは非煮沸精製569B CTB（レーン
Ａ）、煮沸CTB（レーンＢ）、非煮沸STa関連デカペプチ
ド−CTB（レーンＣ）および煮沸STa関連デカペプチド−
CTB（レーンＤ）についての抗コレラトキシンモノクロ
ーナル抗体Wi7:5による発現後の反応パターンを示す。
レーンＥ〜Ｈは抗STaモノクローナル抗体1:3による発現
後に同一パターン質について得られた反応パターンを示
す、矢印は同一ゲル上を泳動させた既知分子量（キロダ
ルトンで示す）の標準タンパク質の泳動位置を表す。
ドゲル電気泳動、それに続くニトロセルロース紙への分
離したタンパク質の電気的移行後のSTa関連デカペプチ
ド−CTBハイブリッドタンパク質のイムノブロッティン
グ分析。レーンＡ〜Ｄは非煮沸精製569B CTB（レーン
Ａ）、煮沸CTB（レーンＢ）、非煮沸STa関連デカペプチ
ド−CTB（レーンＣ）および煮沸STa関連デカペプチド−
CTB（レーンＤ）についての抗コレラトキシンモノクロ
ーナル抗体Wi7:5による発現後の反応パターンを示す。
レーンＥ〜Ｈは抗STaモノクローナル抗体1:3による発現
後に同一パターン質について得られた反応パターンを示
す、矢印は同一ゲル上を泳動させた既知分子量（キロダ
ルトンで示す）の標準タンパク質の泳動位置を表す。
（実施例） 実施例1.tacP制御下のCTBの誘導可能な過剰発現のた
めの組換え系 1.1 CTB遺伝子を誘導可能なtacPの制御下におくための
遺伝子（DNA）操作 理論的考察および予備実験に基づいて、我々は、外来
（非コレラトキシン）プロモーターからのCTBの過剰発
現が、もしもCTB遺伝子を出来るだけ外来プロモーター
の近くに置き、理想的にはそのプロモーターとCTB遺伝
子との間にコレラ菌由来の非CTBコードDNAを存在させな
いならば、達成しうるかもしれないと考えた。本実施例
では、この戦略を用いて、CTB遺伝子を誘導可能なtacｐ
プロモーターの発現制御下におくことによって、CTB生
産のための好結果の過剰発現系を構築する方法について
説明する。
めの組換え系 1.1 CTB遺伝子を誘導可能なtacPの制御下におくための
遺伝子（DNA）操作 理論的考察および予備実験に基づいて、我々は、外来
（非コレラトキシン）プロモーターからのCTBの過剰発
現が、もしもCTB遺伝子を出来るだけ外来プロモーター
の近くに置き、理想的にはそのプロモーターとCTB遺伝
子との間にコレラ菌由来の非CTBコードDNAを存在させな
いならば、達成しうるかもしれないと考えた。本実施例
では、この戦略を用いて、CTB遺伝子を誘導可能なtacｐ
プロモーターの発現制御下におくことによって、CTB生
産のための好結果の過剰発現系を構築する方法について
説明する。
E.coliのLTBリーダーをコードするDNAは、リボソーム
結合部位の上流近傍のその５′末端に１個のEcoR I制限
部位を有し、この部位はLTB遺伝子を強力なtacＰプロモ
ーターの後に挿入してプラスミドpMMB68を作製するため
に最近使用された （M Sandkvist et al,J Bacteriol 169:4570−4576,198
7）。この戦略的に存在するEcoR I部位（CTB遺伝子中に
は存在しない）を利用してCTB発現を同一プロモーター
の制御下におくために、我々は成熟CTBタンパク質を広
い宿主域のプラスミドpMMB68中のLTBのリーダーペプチ
ドに遺伝子工学的に融合させることに決めた。pCVD30
（V.cholerae 010395株、古典生物型、オガワ血清型に
由来する）からのCTB遺伝子はそのリーダーペプチドの
アミノ酸（aa）18の位置にNde I部位を有し、一方LTB遺
伝子は成熟タンパク質の始めにSac I認識配列を有る。C
TB遺伝子をその５′Nde 末端でLTB遺伝子中の３′Sac I
末端に第1A図に示すような合成リンカーを介して融合さ
せると、CTBリンカーペプチドがLTB中のそれによって置
き換えられた。得られたプラスミドpJS162（第1B図参
照）はtacＰプロモーターの下流にEcoR I−Hind III DN
AセグメントとしてハイブリッドCTB遺伝子を含んでい
た。
結合部位の上流近傍のその５′末端に１個のEcoR I制限
部位を有し、この部位はLTB遺伝子を強力なtacＰプロモ
ーターの後に挿入してプラスミドpMMB68を作製するため
に最近使用された （M Sandkvist et al,J Bacteriol 169:4570−4576,198
7）。この戦略的に存在するEcoR I部位（CTB遺伝子中に
は存在しない）を利用してCTB発現を同一プロモーター
の制御下におくために、我々は成熟CTBタンパク質を広
い宿主域のプラスミドpMMB68中のLTBのリーダーペプチ
ドに遺伝子工学的に融合させることに決めた。pCVD30
（V.cholerae 010395株、古典生物型、オガワ血清型に
由来する）からのCTB遺伝子はそのリーダーペプチドの
アミノ酸（aa）18の位置にNde I部位を有し、一方LTB遺
伝子は成熟タンパク質の始めにSac I認識配列を有る。C
TB遺伝子をその５′Nde 末端でLTB遺伝子中の３′Sac I
末端に第1A図に示すような合成リンカーを介して融合さ
せると、CTBリンカーペプチドがLTB中のそれによって置
き換えられた。得られたプラスミドpJS162（第1B図参
照）はtacＰプロモーターの下流にEcoR I−Hind III DN
AセグメントとしてハイブリッドCTB遺伝子を含んでい
た。
以下の手順は前記の構築物を得るために用いられた。
E:coli HB101株中のpMMB68プラスミドは親切にもウメア
（Ume）大学のM.Sandquist氏から提供された。E.coli
HB101株中のプラスミドpCVD30は米国ボルチモア、メリ
ーランド大学のJ.Kaper博士から得られた。（これらの
プラスミドの詳細な記述については、M.Sandquist et a
l,J Bacteriol 169:4570−4576,1987およびJB Kaper et
al,Biotechnology 2:345−349,1984を参照された
い。）LTBリーダーのSac I 3′末端をCTBの５′Nde I配
列へ接合するために用いた非リン酸化オリゴデオキシヌ
レオチドはウプサラ大学、バイオメディカルセンター、
免疫学部から一本鎖として購入した。これらの鎖は等モ
ル量の各鎖を混合して室温で一晩インキュベートするこ
とにより対合させた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチ
ドはSac IおよびNde I適合性の一本鎖延長部を有し、こ
うしてSac I−Hind III制限pMMB68に直接連結できるだ
ろう。連結反応はプラスミドDNAに対して10倍過剰モル
のオリゴヌクレオチドを４℃て一晩T4リガーゼと共にイ
ンキュベートすることにより行った。その後、この連結
混合物にCTB遺伝子を含むプラスミドpCVD30由来の精製
済みNde I−Hind III断片を、ベクタープラスミドDNAに
対し等モル量で加え、次いでリガーゼ反応を４℃でさら
に18時間続けた。その後、連結DNAはコンピテントE.col
i HB101細胞に形質転換し、アンピシリン耐性（100μg/
ml）について選別した。これらの手法において用いた酵
素はすべてFRG、GmBH、Boehringer Mannhejm社から購入
し、供給社の勧めるとおりに使用した。プラスミドDNA
の精製はアルカリ溶菌法を用いて行い、大腸菌への形質
転換はT.Manniatis et al,Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982の詳
細な記述に従って塩化カルシウム−ルビジウム法を用い
て行った。
E:coli HB101株中のpMMB68プラスミドは親切にもウメア
（Ume）大学のM.Sandquist氏から提供された。E.coli
HB101株中のプラスミドpCVD30は米国ボルチモア、メリ
ーランド大学のJ.Kaper博士から得られた。（これらの
プラスミドの詳細な記述については、M.Sandquist et a
l,J Bacteriol 169:4570−4576,1987およびJB Kaper et
al,Biotechnology 2:345−349,1984を参照された
い。）LTBリーダーのSac I 3′末端をCTBの５′Nde I配
列へ接合するために用いた非リン酸化オリゴデオキシヌ
レオチドはウプサラ大学、バイオメディカルセンター、
免疫学部から一本鎖として購入した。これらの鎖は等モ
ル量の各鎖を混合して室温で一晩インキュベートするこ
とにより対合させた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチ
ドはSac IおよびNde I適合性の一本鎖延長部を有し、こ
うしてSac I−Hind III制限pMMB68に直接連結できるだ
ろう。連結反応はプラスミドDNAに対して10倍過剰モル
のオリゴヌクレオチドを４℃て一晩T4リガーゼと共にイ
ンキュベートすることにより行った。その後、この連結
混合物にCTB遺伝子を含むプラスミドpCVD30由来の精製
済みNde I−Hind III断片を、ベクタープラスミドDNAに
対し等モル量で加え、次いでリガーゼ反応を４℃でさら
に18時間続けた。その後、連結DNAはコンピテントE.col
i HB101細胞に形質転換し、アンピシリン耐性（100μg/
ml）について選別した。これらの手法において用いた酵
素はすべてFRG、GmBH、Boehringer Mannhejm社から購入
し、供給社の勧めるとおりに使用した。プラスミドDNA
の精製はアルカリ溶菌法を用いて行い、大腸菌への形質
転換はT.Manniatis et al,Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982の詳
細な記述に従って塩化カルシウム−ルビジウム法を用い
て行った。
予測した配列がクローニング後に生成されたことを確
かめるために、ハイブリッド遺伝子はM13にサブクロー
ニングしてF.Sangerらのジデオキシヌクレオチド法（Pr
oc Natl Acad Sci,USA 74:5463−5467,1977）によりそ
の塩基配列を決定した。決定された配列はLTBリーダー
部分について報告された配列を確証するものであり（J
Leong et al,Infect Immun 48:73−77,1985）かつ以前
に報じられたエルトールおよび古典CTB成熟配列との高
度な全体的相同を示すものであった。（ML Gennaro＆P
Greenaway,Nucleic Acids Res 11:3855−3861,1983;H L
ockman＆JB Kaper,J Biol Chem 258:13722−13726,198
3;JJ Makalanos el al,Nataure306:551−557,1983;A Ku
rosky et al,J Biol Chem 252:7257−7264,1977;CY La
i,J Biol Chem 252:7249−7256,1977）。我々の組換えC
TB（V.cholerae 0395古典株から）とこれらの他の配列
との比較を第２図に示す。
かめるために、ハイブリッド遺伝子はM13にサブクロー
ニングしてF.Sangerらのジデオキシヌクレオチド法（Pr
oc Natl Acad Sci,USA 74:5463−5467,1977）によりそ
の塩基配列を決定した。決定された配列はLTBリーダー
部分について報告された配列を確証するものであり（J
Leong et al,Infect Immun 48:73−77,1985）かつ以前
に報じられたエルトールおよび古典CTB成熟配列との高
度な全体的相同を示すものであった。（ML Gennaro＆P
Greenaway,Nucleic Acids Res 11:3855−3861,1983;H L
ockman＆JB Kaper,J Biol Chem 258:13722−13726,198
3;JJ Makalanos el al,Nataure306:551−557,1983;A Ku
rosky et al,J Biol Chem 252:7257−7264,1977;CY La
i,J Biol Chem 252:7249−7256,1977）。我々の組換えC
TB（V.cholerae 0395古典株から）とこれらの他の配列
との比較を第２図に示す。
1.2 コレラ菌によるtacP制御CTB遺伝子の発現 tacＰの制御下にCTB遺伝子を含むプラスミドpJS162
（第１図参照）はヘルパーE.coli S17−１株（R Simon
et al,Biotechnology 2:784−791,1983）からV.cholera
e 01JBK70株（エルトール生物型）（JB Kaper et al,Na
ture 308:655−658,1983）または他のエルトールもしく
は古典コレラ菌株へ接合により転移した。この転移を達
成するために、pJS162プラスミドDNA初めにE.coli HB10
1から再度単離し、そして上記セクション1.1において記
載したManniatisら（1982）からの同じ手法を用いて形
質転換によりE.coli S17−１に導入した。その後形質転
換したS17−１細胞は種々のV.cholerae受容菌株との接
合実験において供与菌として使用した。接合は次のよう
に行った。形質転換S17−１供与細胞およびV.cholerae
受容細胞は、適当な抗生物質を補給したLB培地10ml中で
振とうせずに37℃で一晩生育させた。それぞれの培養物
から、細菌懸濁体3mlをミリポア（MilliporeR）フィル
ターGS 0.22型を通してシリジンを使って、初めに供与
細胞培養物を、その後受容細胞培養物を押し出し、これ
によりフィルター表面上でこれらの細胞を互いに緊密接
触させた。その後、このフィルターを抗生物質不含LB寒
天平板上に静置し、37℃で約３時間インキュベートし
た。次いでフィルターLB培地5mlを含む試験管の中に移
し、その試験管を振とうして細菌を懸濁換し、その後混
合細菌懸濁体約0.1ml供与細胞の適当な抗生物質による
逆選択を可能にするLB培地中でインキュベートした。エ
ルトール生物型のV.colerae菌株がpJS162の受容菌であ
る場合、細菌混合物は供与菌の逆選択のために50U/mlポ
リミキシンＢおよび100μg/mlアンピシリンを含むLB培
地中で生育させた。プラスミドが古典生物型のV.choler
ae菌株に転移される場合は、初めにこれらの菌株のリフ
ァンピシン耐性ビブリオ株を単離し、その後これらの場
合における受容リファピシン耐性ビブリオ株についての
選択を、50μg/mlリファンピシンおよび100μg/mlアン
ピシリンを含むLB培地を用いて行った。
（第１図参照）はヘルパーE.coli S17−１株（R Simon
et al,Biotechnology 2:784−791,1983）からV.cholera
e 01JBK70株（エルトール生物型）（JB Kaper et al,Na
ture 308:655−658,1983）または他のエルトールもしく
は古典コレラ菌株へ接合により転移した。この転移を達
成するために、pJS162プラスミドDNA初めにE.coli HB10
1から再度単離し、そして上記セクション1.1において記
載したManniatisら（1982）からの同じ手法を用いて形
質転換によりE.coli S17−１に導入した。その後形質転
換したS17−１細胞は種々のV.cholerae受容菌株との接
合実験において供与菌として使用した。接合は次のよう
に行った。形質転換S17−１供与細胞およびV.cholerae
受容細胞は、適当な抗生物質を補給したLB培地10ml中で
振とうせずに37℃で一晩生育させた。それぞれの培養物
から、細菌懸濁体3mlをミリポア（MilliporeR）フィル
ターGS 0.22型を通してシリジンを使って、初めに供与
細胞培養物を、その後受容細胞培養物を押し出し、これ
によりフィルター表面上でこれらの細胞を互いに緊密接
触させた。その後、このフィルターを抗生物質不含LB寒
天平板上に静置し、37℃で約３時間インキュベートし
た。次いでフィルターLB培地5mlを含む試験管の中に移
し、その試験管を振とうして細菌を懸濁換し、その後混
合細菌懸濁体約0.1ml供与細胞の適当な抗生物質による
逆選択を可能にするLB培地中でインキュベートした。エ
ルトール生物型のV.colerae菌株がpJS162の受容菌であ
る場合、細菌混合物は供与菌の逆選択のために50U/mlポ
リミキシンＢおよび100μg/mlアンピシリンを含むLB培
地中で生育させた。プラスミドが古典生物型のV.choler
ae菌株に転移される場合は、初めにこれらの菌株のリフ
ァンピシン耐性ビブリオ株を単離し、その後これらの場
合における受容リファピシン耐性ビブリオ株についての
選択を、50μg/mlリファンピシンおよび100μg/mlアン
ピシリンを含むLB培地を用いて行った。
pJS162プラスミドを保有するV.cholerae菌株からのCT
Bの生産は次のようにして調べた。イソプルピル−β−
Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（IPTG）による誘導のた
めに、抗生物質を補給したLB培地中37℃で培養物を所望
の光学密度（A6OO）へ増殖させ、その後IPTGを所望の濃
度で加えた。増殖を４時間続け、細胞と培養上清を遠心
により分離した。細胞ペレットを静かに洗い、等容量の
冷リン酸緩衝溶液（pH7.2）中に再懸濁し、そしてミニ
プローブを使って２回の30秒音波処理（Bransonソニフ
ァイアー）により細胞を破壊した。培養上清および破壊
細胞中のCTBの含量はその後モノクローナル抗体LT39を
用いてGM1−ELISA報により測定した（Ａ−M Svennerhol
m＆J Holmgren,Curr Microbiol 1:19−23,1978）。トキ
シン欠損JBK70 V.cholerae菌株へのpJS162の接合転移
は、LB培地での増殖およびIPTGによる誘導後に、この菌
株からの40〜50μg/mlのCTBの生産へ導いた。このCTBの
うち95％以上は培地中に分泌された（第３図参照）。ま
た、50〜100μg/mlまでのCTBの発現レベルも、pJS162プ
ラスミドを転移させた他のトキシン欠損またはCTA欠損
古典およびエルトール菌株をIPTGの存在下で増殖させる
場合に、これらの菌株によって達成された（第１参
照）。これは試験された多くの野生型または組換えV.ch
olerae菌株（ワクチン製造用のCTBの生産のために現在
用いられている高毒素生産性569B株を含む）により生産
されたレベルと比較してCTBの著しい過剰発現を表して
いた。pJS162によってコードされる組換えCTBは、V.cho
leraeによって生産されるとき細胞外に分泌されたの
で、その後例えばリゾ−GM1ガングリオシド（17）によ
るレセプター特異的アフィニティークロマトグラフィー
を用いて、これらの菌株のいずれの培養上清からも高収
率で容易に精製することができた（以下の実施例４を参
照されたい）。
Bの生産は次のようにして調べた。イソプルピル−β−
Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（IPTG）による誘導のた
めに、抗生物質を補給したLB培地中37℃で培養物を所望
の光学密度（A6OO）へ増殖させ、その後IPTGを所望の濃
度で加えた。増殖を４時間続け、細胞と培養上清を遠心
により分離した。細胞ペレットを静かに洗い、等容量の
冷リン酸緩衝溶液（pH7.2）中に再懸濁し、そしてミニ
プローブを使って２回の30秒音波処理（Bransonソニフ
ァイアー）により細胞を破壊した。培養上清および破壊
細胞中のCTBの含量はその後モノクローナル抗体LT39を
用いてGM1−ELISA報により測定した（Ａ−M Svennerhol
m＆J Holmgren,Curr Microbiol 1:19−23,1978）。トキ
シン欠損JBK70 V.cholerae菌株へのpJS162の接合転移
は、LB培地での増殖およびIPTGによる誘導後に、この菌
株からの40〜50μg/mlのCTBの生産へ導いた。このCTBの
うち95％以上は培地中に分泌された（第３図参照）。ま
た、50〜100μg/mlまでのCTBの発現レベルも、pJS162プ
ラスミドを転移させた他のトキシン欠損またはCTA欠損
古典およびエルトール菌株をIPTGの存在下で増殖させる
場合に、これらの菌株によって達成された（第１参
照）。これは試験された多くの野生型または組換えV.ch
olerae菌株（ワクチン製造用のCTBの生産のために現在
用いられている高毒素生産性569B株を含む）により生産
されたレベルと比較してCTBの著しい過剰発現を表して
いた。pJS162によってコードされる組換えCTBは、V.cho
leraeによって生産されるとき細胞外に分泌されたの
で、その後例えばリゾ−GM1ガングリオシド（17）によ
るレセプター特異的アフィニティークロマトグラフィー
を用いて、これらの菌株のいずれの培養上清からも高収
率で容易に精製することができた（以下の実施例４を参
照されたい）。
全菌株は30℃で同一期間増殖させた。pJS162を保有す
る菌株はA600＝1.0まで増殖させ、その後100μg/mlのIP
TGを加えてさらに４時間インキュベートした。
る菌株はA600＝1.0まで増殖させ、その後100μg/mlのIP
TGを加えてさらに４時間インキュベートした。
★非機能的（CTA−）または機能的（CIA＋）CTA遺伝子
および／または非機能的（CTB−）または機能的（CTB
＋）CTB遺伝子を示す。菌株は遺伝子欠損によりつくら
れた。
および／または非機能的（CTB−）または機能的（CTB
＋）CTB遺伝子を示す。菌株は遺伝子欠損によりつくら
れた。
＋JS1569株およびJS1395株はそれぞれCVD 103およびCVD
101（0395 CIA−誘導体）からのリファンピシン耐性誘
導株である。IPTG不在下でのこれらの菌株のCTB生産量
は0.5μg/mlより少なく、従って誘導物質の存在下での
その値に有意に寄与しなかった。
101（0395 CIA−誘導体）からのリファンピシン耐性誘
導株である。IPTG不在下でのこれらの菌株のCTB生産量
は0.5μg/mlより少なく、従って誘導物質の存在下での
その値に有意に寄与しなかった。
実施例2.構成的tacPプロモーターの使用によるCTBの過
剰発現 この構築においては、上記実施例１に記載したプラス
ミドpJS162中のCTB遺伝子を切り出して、tacＰプロモー
ターを含むがIPTG依存に応答しうるpJS162中に存在する
Iac I ｑ遺伝子を含まないプラスミドベクターpKK223−
１に挿入した。
剰発現 この構築においては、上記実施例１に記載したプラス
ミドpJS162中のCTB遺伝子を切り出して、tacＰプロモー
ターを含むがIPTG依存に応答しうるpJS162中に存在する
Iac I ｑ遺伝子を含まないプラスミドベクターpKK223−
１に挿入した。
プラスミドDNAの単離、DNAの切り出し、連結、E.coli
への形質転換、およびV.choleraeへの接合には実施例１
に記載した方法と同じ標準方法が用いられた。プラスミ
ドpJS162中のCTB遺伝子はEcoR I−Hind III断片として
切り出し、その後EcoR I部位の上流にtacＰプロモータ
ーを含むEcoR I−Hind III制限プラスミドpKK223−１
（スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia社）に連結され
た、得られたプラスミドpJS7523−１はE.coli HB101へ
形質転換し、またヘルパーE.coli S17P1株の助けをかり
て接合によりV.cholerae JBK70およびJS1395株へ移入さ
せた。pJS162中のlac Iq遺伝子は大量のlac Iリプレッ
サーをコードしており、プラスミドpJS7523−１中のこ
の遺伝子の不在はpJS7523−１プラスミドを保有する細
菌株によるtacＰの制御下のCTBの発現をほとんどIPTG非
依存性にする。これはpJS7523−１を有するE.coli 101
細胞を２等りの組の試験管にて100μg/mlアンピシリン
を補給したLB培地中37℃でA600＝1.0の光学密度へ増殖
させ、その後１つの組へ100μg/mlのIPTGを加え、他の
組はへは加えず、そして細菌培養物のインキュベーショ
ン37℃でさらに４時間続けることにより試験した。その
後、培養物のサンプルはミニプローブを用いて２回の30
秒音波処理（Bransonソニファイアー）により超音波に
さらして細胞を破壊し、遠心後に超音波処理培養物のCT
B含量を実施例１に記載したGM1−ELISA法を用いて分析
した。得られた結果は、比較的高レベル（２〜７μg/m
l）のCTBがIPTGの不在下で生産され、これらのレベルが
IPTGの存在下で得られたものよりほんの２〜３倍低いだ
けであることを示した。このことは、IPTGの不在下でCT
Bのレベルが検出不能であるpJS162中のtacＰの制御下で
のCTB発現に対するIPTGの効果と劇的に対照を成すもの
である（実施例１、第２図参照）。従って、pJS7523−
１でのCTB発現はまだlac Iラクトース オペロン リプ
レッサーによって調節されているが、これらの結果はそ
の発現が実際上構成的であることを示している。これは
恐らく染色体によってコードされるlac Iリプレッサー
が染色体中のlacオペレーターと高コピー数プラスミドp
JS7523−１中のtacＰの両方に効果的に結合するのに十
分な量で生産されないためであると考えられる。
への形質転換、およびV.choleraeへの接合には実施例１
に記載した方法と同じ標準方法が用いられた。プラスミ
ドpJS162中のCTB遺伝子はEcoR I−Hind III断片として
切り出し、その後EcoR I部位の上流にtacＰプロモータ
ーを含むEcoR I−Hind III制限プラスミドpKK223−１
（スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia社）に連結され
た、得られたプラスミドpJS7523−１はE.coli HB101へ
形質転換し、またヘルパーE.coli S17P1株の助けをかり
て接合によりV.cholerae JBK70およびJS1395株へ移入さ
せた。pJS162中のlac Iq遺伝子は大量のlac Iリプレッ
サーをコードしており、プラスミドpJS7523−１中のこ
の遺伝子の不在はpJS7523−１プラスミドを保有する細
菌株によるtacＰの制御下のCTBの発現をほとんどIPTG非
依存性にする。これはpJS7523−１を有するE.coli 101
細胞を２等りの組の試験管にて100μg/mlアンピシリン
を補給したLB培地中37℃でA600＝1.0の光学密度へ増殖
させ、その後１つの組へ100μg/mlのIPTGを加え、他の
組はへは加えず、そして細菌培養物のインキュベーショ
ン37℃でさらに４時間続けることにより試験した。その
後、培養物のサンプルはミニプローブを用いて２回の30
秒音波処理（Bransonソニファイアー）により超音波に
さらして細胞を破壊し、遠心後に超音波処理培養物のCT
B含量を実施例１に記載したGM1−ELISA法を用いて分析
した。得られた結果は、比較的高レベル（２〜７μg/m
l）のCTBがIPTGの不在下で生産され、これらのレベルが
IPTGの存在下で得られたものよりほんの２〜３倍低いだ
けであることを示した。このことは、IPTGの不在下でCT
Bのレベルが検出不能であるpJS162中のtacＰの制御下で
のCTB発現に対するIPTGの効果と劇的に対照を成すもの
である（実施例１、第２図参照）。従って、pJS7523−
１でのCTB発現はまだlac Iラクトース オペロン リプ
レッサーによって調節されているが、これらの結果はそ
の発現が実際上構成的であることを示している。これは
恐らく染色体によってコードされるlac Iリプレッサー
が染色体中のlacオペレーターと高コピー数プラスミドp
JS7523−１中のtacＰの両方に効果的に結合するのに十
分な量で生産されないためであると考えられる。
実施例3.T7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターからの
CTBの発現 本実施例では、別の強力な外来（非コレテトキシン）
プロモーターであるT7 RNAポリメラーゼ依存性プモータ
ーの発現制御下にCTB遺伝子をおくことによって、CTBの
過剰発現を達成できることを証明する。
CTBの発現 本実施例では、別の強力な外来（非コレテトキシン）
プロモーターであるT7 RNAポリメラーゼ依存性プモータ
ーの発現制御下にCTB遺伝子をおくことによって、CTBの
過剰発現を達成できることを証明する。
プラスミドpJS162に含まれるCTBの製造遺伝子（LTBリ
ーダーペプチドのコード配列を含む）は切り出して、高
度に特異的でかつ強力なT7−RNAポリメラーゼ依存性プ
ロモーターを含むT7−５プラスミドベクターに挿入した
（S Tabor and CC Richardson,Proc Natl Acad Sci USA
82:1074−1078,1985）。このプロモーターからの発現
は補助プラスミド（pGP1−２）の助けを借りて供給され
るT7 RNAポリメラーゼの存在を必要とし、このプラスミ
ドによってコードされるRNAポリメラーゼそれ自体は、
生育温度の変化（通常30℃から42℃へ）により誘導され
るプロモーターの制御下で発現される。
ーダーペプチドのコード配列を含む）は切り出して、高
度に特異的でかつ強力なT7−RNAポリメラーゼ依存性プ
ロモーターを含むT7−５プラスミドベクターに挿入した
（S Tabor and CC Richardson,Proc Natl Acad Sci USA
82:1074−1078,1985）。このプロモーターからの発現
は補助プラスミド（pGP1−２）の助けを借りて供給され
るT7 RNAポリメラーゼの存在を必要とし、このプラスミ
ドによってコードされるRNAポリメラーゼそれ自体は、
生育温度の変化（通常30℃から42℃へ）により誘導され
るプロモーターの制御下で発現される。
プラスミドDNAの単離、DNAの切り出し、連結、E.coli
への形質転換、およびV.choleraeへの接合転換のために
用いた方法は本質的に実施例１に記載した方法と同じで
あった。pJS162中のCTBはEcor I−Hind III断片として
切り出し、その後EcoR I−Hind III消化プラスミドベク
ターpT7−５（米国マサチューセッツ州、ハーバード大
学のS.Tabor博士から入手）に挿入した。得られた新し
いプラスミドは次いでプラスミドpGP1−２を含むE.coli
101（S.Tabor博士から入手）に形質転換した。これらの
形質転換E.coliを細胞中に含まれる２種類のプラスミド
に関して適当な抗生物質（カナマイシン50μg/ml;アン
ピシリン100μg/ml）を補給したLB培地中で生育させた
とき、細胞は30℃において検出可能なレベルのCTBを生
産しなかったが、生育温度を30℃から42℃に変えると、
GM1−ELISAで検定してE.coliによる２〜３μg/mlのCTB
の発現が得られた。その後、T7 RNAポリメラーゼ依存性
プロモーターと組み合わせたCTB遺伝子はPvu II−Hind
III挿入物としてEcoR V−Hind III消化プラスミドpBR32
5にサブクローニングした。次いでこの新しいプラスミ
ド（pJS7525）はpRK2013を含むE.coli株からV.cholerae
JBK70（プラスミドpGP1−２を同一のE.coli供与菌から
接合により前もって転移されている）へ移した。２つの
プラスミドの存在は、それらが適合性の複製起点を有
し、しかもpJS7525がクロラムフェニコール（およびア
ンピシリン）耐性をコードし、一方pGP1−２がカナマイ
シン耐性遺伝子を有するために可能であった。プラスミ
ドpJS7525およびpGP1−２を含むV.cholerae JBK70は、2
5μg/mlのクロラムフェニコールと50μg/mlのカナマイ
シンを補給したLB培地中で高光学密度へ30℃において生
育させた場合、検出可能なレベルのCTBを生産しなかっ
たが、生育温度42℃を変えると、V.cholerae培養上清中
に75〜100μg/mlのCTBレベルの予測されたT7 RNAポリメ
ラーゼ依存性CTB発現の増加が見られた。本実施例の結
果は明らかに、種々の外来（非コレラトキシン）プロモ
ーターによるCTBの過剰発現が実際に可能であること、
および過剰発現がtoxＲ調節系に依存しないこと（toxＲ
が作用する場合、CTBの高発現へ導く要因の１つは約30
℃の生育温度である）の両方を立証した（MJ Betley et
al,Ann Rev Microbiol 40:577−605,1986）。ここに記
載した誘導可能な発現系はtoxＲの最適温度において最
少であり、そしてtoxＲ−非最適温度において最高であ
った。
への形質転換、およびV.choleraeへの接合転換のために
用いた方法は本質的に実施例１に記載した方法と同じで
あった。pJS162中のCTBはEcor I−Hind III断片として
切り出し、その後EcoR I−Hind III消化プラスミドベク
ターpT7−５（米国マサチューセッツ州、ハーバード大
学のS.Tabor博士から入手）に挿入した。得られた新し
いプラスミドは次いでプラスミドpGP1−２を含むE.coli
101（S.Tabor博士から入手）に形質転換した。これらの
形質転換E.coliを細胞中に含まれる２種類のプラスミド
に関して適当な抗生物質（カナマイシン50μg/ml;アン
ピシリン100μg/ml）を補給したLB培地中で生育させた
とき、細胞は30℃において検出可能なレベルのCTBを生
産しなかったが、生育温度を30℃から42℃に変えると、
GM1−ELISAで検定してE.coliによる２〜３μg/mlのCTB
の発現が得られた。その後、T7 RNAポリメラーゼ依存性
プロモーターと組み合わせたCTB遺伝子はPvu II−Hind
III挿入物としてEcoR V−Hind III消化プラスミドpBR32
5にサブクローニングした。次いでこの新しいプラスミ
ド（pJS7525）はpRK2013を含むE.coli株からV.cholerae
JBK70（プラスミドpGP1−２を同一のE.coli供与菌から
接合により前もって転移されている）へ移した。２つの
プラスミドの存在は、それらが適合性の複製起点を有
し、しかもpJS7525がクロラムフェニコール（およびア
ンピシリン）耐性をコードし、一方pGP1−２がカナマイ
シン耐性遺伝子を有するために可能であった。プラスミ
ドpJS7525およびpGP1−２を含むV.cholerae JBK70は、2
5μg/mlのクロラムフェニコールと50μg/mlのカナマイ
シンを補給したLB培地中で高光学密度へ30℃において生
育させた場合、検出可能なレベルのCTBを生産しなかっ
たが、生育温度42℃を変えると、V.cholerae培養上清中
に75〜100μg/mlのCTBレベルの予測されたT7 RNAポリメ
ラーゼ依存性CTB発現の増加が見られた。本実施例の結
果は明らかに、種々の外来（非コレラトキシン）プロモ
ーターによるCTBの過剰発現が実際に可能であること、
および過剰発現がtoxＲ調節系に依存しないこと（toxＲ
が作用する場合、CTBの高発現へ導く要因の１つは約30
℃の生育温度である）の両方を立証した（MJ Betley et
al,Ann Rev Microbiol 40:577−605,1986）。ここに記
載した誘導可能な発現系はtoxＲの最適温度において最
少であり、そしてtoxＲ−非最適温度において最高であ
った。
実施例4.V.cholerae中のプラスミドpJS162によりコード
される組換えCTBの特性決定 我々は、先の実施例に記載した構築物により生産され
た組換えCTBの性質の一部を決定した。我々の結果は、
プラスミドpJS162によりコードされ、V.cholerae JBK70
により発現されて精製されたCTBについてここに例示す
るように、組換えCTBが、数個のアミノ酸の相違にもか
かわらず、試験した構造機能特性および免疫学的特性の
いずれにおいても、野生型V.cholerae 569Bコレラトキ
シンから精製されたCTBとあまり違っていないことを示
している。
される組換えCTBの特性決定 我々は、先の実施例に記載した構築物により生産され
た組換えCTBの性質の一部を決定した。我々の結果は、
プラスミドpJS162によりコードされ、V.cholerae JBK70
により発現されて精製されたCTBについてここに例示す
るように、組換えCTBが、数個のアミノ酸の相違にもか
かわらず、試験した構造機能特性および免疫学的特性の
いずれにおいても、野生型V.cholerae 569Bコレラトキ
シンから精製されたCTBとあまり違っていないことを示
している。
4.1 CTBの精製およびアミノ末端の決定 V.choleraeエルトール JBK70（プラスミドpJS162を有
する）は100μg/mlのアンピシリンと100μg/mlのIPTGを
含むLB培地２中で連続振とう下に30℃で生育させた。
培養後、細菌と細菌破片を遠心により除き、組換えCTB
はJL Tayot et al,EurJ Biochem 113:249−258,1981に
記載の方法を用いてリゾーGM1ガングリオシド−スフェ
ロジル（SpherosilR）カラムでのアフィニティークロマ
トグラフィーによって精製した。精製CTBはH von Bahr
−iLndstrm et al,J Prot Chem 1:257−262,1982に記
載されるとおりにアミノ末端残基を決定した。
する）は100μg/mlのアンピシリンと100μg/mlのIPTGを
含むLB培地２中で連続振とう下に30℃で生育させた。
培養後、細菌と細菌破片を遠心により除き、組換えCTB
はJL Tayot et al,EurJ Biochem 113:249−258,1981に
記載の方法を用いてリゾーGM1ガングリオシド−スフェ
ロジル（SpherosilR）カラムでのアフィニティークロマ
トグラフィーによって精製した。精製CTBはH von Bahr
−iLndstrm et al,J Prot Chem 1:257−262,1982に記
載されるとおりにアミノ末端残基を決定した。
組換えCTBの前駆体ペプチドの開裂は、LTBまたはCTB
中の本来のリーダーペプチダーゼ認識部位の１つまたは
両方において起こることが当然予測された。精製タンパ
ク質の第一アミノ酸の同定はTyr残基とAla残基の両方を
与えた。この事実および組換えCTBがドデシル硫酸ナト
リウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（NaDodSO4/P
AGE）で測定したとき天然CTBよりもわずかに大きい（第
４図参照）という事実は、リーダーペプチドの加水分解
プロセッシングがリンカーによってコードされるGly
（−５位）とTyr（−４位）の間、および後者のアミノ
酸とAla（−３位）の間で起こったことを示唆した（第
２図参照）。処理したCTBの残部を再びアミノ末端決定
に付したとき、今度はAla残基とHis残基とが同定され、
これは仮定した開裂位置が正しかったことを確信させ、
また組換えCTBが３または４個のアミノ酸から成る短い
ペプチド延長部をそのアミノ末端にもつ証拠を提供す
る、 4.2 レセプター認識およびレセプター遮断特性 CTB中の数個の追加アミノ酸の存在はGM1レセプターの
その認識に影響を与えなかった。プラスチックに被覆し
たGM1ガングリオシドに対する結合親和性は、GM1−ELIS
A法を用いて異なる濃度を試験することにより、組換えC
TBと569B株由来の精製標準CTB（仏国Ｍrieux研究所、
J.Armand博士から贈与）とを比較した。差異は全く現れ
なかった。GM1ガングリオシドに対する高い結合親和性
の保持は実際に、上記のようなリゾーGM1−スフェロジ
ルＲによるCTBの精製にも有利であった。
中の本来のリーダーペプチダーゼ認識部位の１つまたは
両方において起こることが当然予測された。精製タンパ
ク質の第一アミノ酸の同定はTyr残基とAla残基の両方を
与えた。この事実および組換えCTBがドデシル硫酸ナト
リウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（NaDodSO4/P
AGE）で測定したとき天然CTBよりもわずかに大きい（第
４図参照）という事実は、リーダーペプチドの加水分解
プロセッシングがリンカーによってコードされるGly
（−５位）とTyr（−４位）の間、および後者のアミノ
酸とAla（−３位）の間で起こったことを示唆した（第
２図参照）。処理したCTBの残部を再びアミノ末端決定
に付したとき、今度はAla残基とHis残基とが同定され、
これは仮定した開裂位置が正しかったことを確信させ、
また組換えCTBが３または４個のアミノ酸から成る短い
ペプチド延長部をそのアミノ末端にもつ証拠を提供す
る、 4.2 レセプター認識およびレセプター遮断特性 CTB中の数個の追加アミノ酸の存在はGM1レセプターの
その認識に影響を与えなかった。プラスチックに被覆し
たGM1ガングリオシドに対する結合親和性は、GM1−ELIS
A法を用いて異なる濃度を試験することにより、組換えC
TBと569B株由来の精製標準CTB（仏国Ｍrieux研究所、
J.Armand博士から贈与）とを比較した。差異は全く現れ
なかった。GM1ガングリオシドに対する高い結合親和性
の保持は実際に、上記のようなリゾーGM1−スフェロジ
ルＲによるCTBの精製にも有利であった。
さらに、ウサギの腸内でコレラトキシンレセプターを
遮断する組換えCTBの能力を、569B CTBと比較して調べ
る実験も行った。これらの実験は、CTB調製物のいずれ
かを動物の結紮した腸ループの中に注入し、その約10分
後に特異的レセプター遮断の不在下で大量の腸液分泌
（実験的コレラ）を誘導することが知られている精製コ
レラトキシンの一定用量（0.2μｇ）を注入するという
手順で行った（詳細な方法はJ Holmgren et al,Infect
immun38:424−433,1982に記載されている）。得られた
結果は、組換えCTBおよび569B CTBの調製物が同様のレ
セプター遮断活性をもつことを示した。両調製物はルー
プへのコレラトキシン（V.cholerae569B由来）の注入直
前に1ml容量中50μｇの量で長さ約5cmの結紮した腸ルー
プに加える場合、コレラによる分泌を完全に阻止するこ
とができた。CTBの代わりに緩衝液単独で予備処理し、
その後同一用量のコレラトキシンを注入した対照ループ
においては著しい腸液の蓄積（1.7±0.2ml/cm）が見ら
れたが、トキシンチャレンジ前に10μｇまたはそれ以下
の量のCTBで予備処理したループでは、緩衝液予備処理
対照と比べて腸液蓄積の部分的減少が見られたか、また
は蓄積が全く見られなかった。
遮断する組換えCTBの能力を、569B CTBと比較して調べ
る実験も行った。これらの実験は、CTB調製物のいずれ
かを動物の結紮した腸ループの中に注入し、その約10分
後に特異的レセプター遮断の不在下で大量の腸液分泌
（実験的コレラ）を誘導することが知られている精製コ
レラトキシンの一定用量（0.2μｇ）を注入するという
手順で行った（詳細な方法はJ Holmgren et al,Infect
immun38:424−433,1982に記載されている）。得られた
結果は、組換えCTBおよび569B CTBの調製物が同様のレ
セプター遮断活性をもつことを示した。両調製物はルー
プへのコレラトキシン（V.cholerae569B由来）の注入直
前に1ml容量中50μｇの量で長さ約5cmの結紮した腸ルー
プに加える場合、コレラによる分泌を完全に阻止するこ
とができた。CTBの代わりに緩衝液単独で予備処理し、
その後同一用量のコレラトキシンを注入した対照ループ
においては著しい腸液の蓄積（1.7±0.2ml/cm）が見ら
れたが、トキシンチャレンジ前に10μｇまたはそれ以下
の量のCTBで予備処理したループでは、緩衝液予備処理
対照と比べて腸液蓄積の部分的減少が見られたか、また
は蓄積が全く見られなかった。
4.3 オリゴマー化およびＡサブユニットとの会合能 他の実験において、組換えCTBはそのオリゴマー化能
力およびコレラトキシンのＡサブユニット（CTA）との
会合能力の両方に影響を受けていないことが明らかにな
った。これらの実験のために、精製CTA（569B CTから調
製;List Biological Laboratories）を精製組換えＣま
たは569B CTBと、完全なCT中に通常見られるCTB対CTAの
モル比で混合し、200μg/mlの総タンパク質濃度を得
た。混合後、試料を0.2Mグリシン緩衝液（pH2.7）で酸
性化し、次いで0.05Mトリス緩衝液（pH8.0）（数回取り
換えた）に対して一晩透析することにより中和した。中
和した試料はその後SJS Hardy et al,Proc Natl Acad S
ci USA,in press 1988に記載されるとおりにサブユニッ
ト特異的モノクローナル抗体を用いたGM1−ELISAにより
試験した。ホロトキシンを与えるべく組換えCTBまたは5
69B CTBと会合した569B CTAの量は、標準として未処理
の相同コレラトキシンを用いて算出した。結果を表２に
示す。それらは、検出用CTB特異的モノクローナル抗体
がペンタマー体とのみ反応することが知られているの
で、モノマーCTBよりもむしろペンタマーCTBの直接的測
定である免疫反応性CTBの高い回収を示す。それらはま
た免疫反応性CTAの高い回収を示し、これらは非会合CTA
がGM1被覆プラスチックウエルに結合しないために検出
されないので、CTBと会合したCTA量の直接的測定であ
る。組換えCTBおよび精製した標準569B CTBはこれらの
実験において非常に類似した挙動を示す（表２参照）。
力およびコレラトキシンのＡサブユニット（CTA）との
会合能力の両方に影響を受けていないことが明らかにな
った。これらの実験のために、精製CTA（569B CTから調
製;List Biological Laboratories）を精製組換えＣま
たは569B CTBと、完全なCT中に通常見られるCTB対CTAの
モル比で混合し、200μg/mlの総タンパク質濃度を得
た。混合後、試料を0.2Mグリシン緩衝液（pH2.7）で酸
性化し、次いで0.05Mトリス緩衝液（pH8.0）（数回取り
換えた）に対して一晩透析することにより中和した。中
和した試料はその後SJS Hardy et al,Proc Natl Acad S
ci USA,in press 1988に記載されるとおりにサブユニッ
ト特異的モノクローナル抗体を用いたGM1−ELISAにより
試験した。ホロトキシンを与えるべく組換えCTBまたは5
69B CTBと会合した569B CTAの量は、標準として未処理
の相同コレラトキシンを用いて算出した。結果を表２に
示す。それらは、検出用CTB特異的モノクローナル抗体
がペンタマー体とのみ反応することが知られているの
で、モノマーCTBよりもむしろペンタマーCTBの直接的測
定である免疫反応性CTBの高い回収を示す。それらはま
た免疫反応性CTAの高い回収を示し、これらは非会合CTA
がGM1被覆プラスチックウエルに結合しないために検出
されないので、CTBと会合したCTA量の直接的測定であ
る。組換えCTBおよび精製した標準569B CTBはこれらの
実験において非常に類似した挙動を示す（表２参照）。
CTAに対する組換えCTBまたは569B CTBの親和性は、in
vitroで会合してコレラホロトキシンを形成するそれら
の能力により試験した。モル比1:5のCTAとCTBの混合物
はpH2.7に酸性化してCTBペンタマーを解離させた。CTA
と添加CTBの会合はトリス（pH8.0）に対する透析による
溶液の中和により有利に行われた。中和した試料はCTA
−およびCTB−特異的モノクローナル抗体を用いたGM1−
ELISAにより直接検定した。
vitroで会合してコレラホロトキシンを形成するそれら
の能力により試験した。モル比1:5のCTAとCTBの混合物
はpH2.7に酸性化してCTBペンタマーを解離させた。CTA
と添加CTBの会合はトリス（pH8.0）に対する透析による
溶液の中和により有利に行われた。中和した試料はCTA
−およびCTB−特異的モノクローナル抗体を用いたGM1−
ELISAにより直接検定した。
≠％で表される値は理論的にホロトキシンを形成しう
る最大量に対して計算されたCTとして見出されたサブユ
ニットの部分を意味する。
る最大量に対して計算されたCTとして見出されたサブユ
ニットの部分を意味する。
4.4組換えCTBの免疫学的性質 成熟ウサギに30μｇの組換えCTBまたは569B CTBによ
る皮下免疫感作を２週間おきに３回与えた。タンパク質
は第１回目の接種では完全フロインドアジュバンドと共
に投与し、その後は不完全アデュバントと共に投与し
た。３回目の免疫感作の２週間後に、動物から血液を採
取し、そして分析のために血清を集めた。
る皮下免疫感作を２週間おきに３回与えた。タンパク質
は第１回目の接種では完全フロインドアジュバンドと共
に投与し、その後は不完全アデュバントと共に投与し
た。３回目の免疫感作の２週間後に、動物から血液を採
取し、そして分析のために血清を集めた。
二重ゲル内拡散免疫沈降分析法、とりわけオクテルロ
ニー法（Ouchterlony）がC.Wadsworth,Int Arch Allerg
y 17:165−177,1957に記載のマイクロチャンバー系を用
いて行われた。この実験は反応体として精製組換えCTB
および569B CTB並びに対応するウサギ免疫血清を用いて
実施された。結果は組換えCTBと天然CTBとの間でいかな
る“支線（spur）”もない融合の沈降線を示し、免疫学
的同一性を示した（第５図参照）。
ニー法（Ouchterlony）がC.Wadsworth,Int Arch Allerg
y 17:165−177,1957に記載のマイクロチャンバー系を用
いて行われた。この実験は反応体として精製組換えCTB
および569B CTB並びに対応するウサギ免疫血清を用いて
実施された。結果は組換えCTBと天然CTBとの間でいかな
る“支線（spur）”もない融合の沈降線を示し、免疫学
的同一性を示した（第５図参照）。
組換えCTBおよび569B CTBのそれぞれの対するウサギ
免疫血清中の抗毒性抗体の滴定には、GM1被覆プレート
に結合された抗原としての精製組換えCTBおよび569B CT
Bを用いたGM1−ELISAにより行われた（Ａ−M Svennerho
lm et al,J Infect Dis 147:514−521,1983）。GM1−EL
ISAでは抗CTBの力価は、固相抗原として２種類のCTB調
製物のいずれかを用いて試験した抗組換えCTBおよび抗5
69B CTBに関して類似しており、４×104〜１×106の範
囲であった。
免疫血清中の抗毒性抗体の滴定には、GM1被覆プレート
に結合された抗原としての精製組換えCTBおよび569B CT
Bを用いたGM1−ELISAにより行われた（Ａ−M Svennerho
lm et al,J Infect Dis 147:514−521,1983）。GM1−EL
ISAでは抗CTBの力価は、固相抗原として２種類のCTB調
製物のいずれかを用いて試験した抗組換えCTBおよび抗5
69B CTBに関して類似しており、４×104〜１×106の範
囲であった。
中和抗体は試験トキシンとして精製569B CTを用いて
J.P.Craigの皮膚テスト（Nature 207:614−616,19651）
により検定した。熱不活性血清は10mg/mlのウシ血清ア
ルブミンを補給した生理学的リン酸緩衝溶液中の40ng/m
lの精製569B CTの等容量と連続希釈により混合し、その
後この混合物0.1mlは皮内注射により残留毒性について
試験した。中和抗毒性の力価も組換えCTBまたは569B CT
Bに対する血清間に差異がなかった。両方の型の抗血清
は１×10-4までの濃度で2ngのCTを完全に中和すること
ができた。
J.P.Craigの皮膚テスト（Nature 207:614−616,19651）
により検定した。熱不活性血清は10mg/mlのウシ血清ア
ルブミンを補給した生理学的リン酸緩衝溶液中の40ng/m
lの精製569B CTの等容量と連続希釈により混合し、その
後この混合物0.1mlは皮内注射により残留毒性について
試験した。中和抗毒性の力価も組換えCTBまたは569B CT
Bに対する血清間に差異がなかった。両方の型の抗血清
は１×10-4までの濃度で2ngのCTを完全に中和すること
ができた。
実施例5.ハイブリッドCTB遺伝子融合タンパク質のtacP
誘導過剰発現 CTB遺伝子をtacＰ制御下におくための実施例１に記載
した操作は、設計により、CTBアミノ末端への遺伝子融
合用の単一酵素制限部位の導入を含んでいた。これらの
部位へのクローニングは、先の実施例においてCTBそれ
自体について記載したものと同じ外来プロモーター
（例．tacＰ）の発現制御下にある、例えば推定上のワ
クチンペプチド抗原を有するCTB誘導ハイブリッドタン
パク質の構築を可能にする。この方法の実施可能性は、
tacＰ誘導過剰発現系中のCTBのアミノ末端への合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドによりコードされる熱安定性E.
coliエンテロトキシン（Sta）関連プペチドの融合によ
ってここに例示される。
誘導過剰発現 CTB遺伝子をtacＰ制御下におくための実施例１に記載
した操作は、設計により、CTBアミノ末端への遺伝子融
合用の単一酵素制限部位の導入を含んでいた。これらの
部位へのクローニングは、先の実施例においてCTBそれ
自体について記載したものと同じ外来プロモーター
（例．tacＰ）の発現制御下にある、例えば推定上のワ
クチンペプチド抗原を有するCTB誘導ハイブリッドタン
パク質の構築を可能にする。この方法の実施可能性は、
tacＰ誘導過剰発現系中のCTBのアミノ末端への合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドによりコードされる熱安定性E.
coliエンテロトキシン（Sta）関連プペチドの融合によ
ってここに例示される。
5.1構築の説明 リーダーペプチドと成熟CTBとの接合点に１つのSac I
およびXma I（Sma I）制限部位（第1B図参照）を含むプ
ラスミドpJS162に対応する２つの酵素で消化し、STa関
連デカペプチドCys−Ala−Glu−Leu−Cys−Cys−Asn−P
ro−Ala−Cysをコードする合成オリゴデオキシヌクレオ
チドにSac IおよびXma I適合性末を介して連結した（第
６図参照）。これにより得られたpJS8プラミドはtacＰ
プロモーターの制御下にある融合タンパク質（両端に数
個の追加アミノ酸をもつSTa関連デカペプチドが、第６
図に示すように成熟CTBのアミノ末端に共有結合で連結
されたもの）をコードするハイブリッド遺伝子をもたら
した。融合されたSTa関連デカペプチドの配列は、シス
テイン残基がアラニンによって置換されたことを除い
て、天然STa中の領域と同じであった。選ばれた配列
は、このアミノ酸置換を含む無毒性合成ノナデカペプチ
ドがE.coli STaを中和する能力のある抗STaモノクーナ
ル抗体と特異的に結合することができるという以前の発
見に基づいていた（Ａ−M Svennerholm et al,FEMS Mic
robiol Lett,in press 1988）。しかしながら、ここで
融合された配列はそれよりも短く、４個のシステイン含
む10個のみのアミノ酸から成っていた。
およびXma I（Sma I）制限部位（第1B図参照）を含むプ
ラスミドpJS162に対応する２つの酵素で消化し、STa関
連デカペプチドCys−Ala−Glu−Leu−Cys−Cys−Asn−P
ro−Ala−Cysをコードする合成オリゴデオキシヌクレオ
チドにSac IおよびXma I適合性末を介して連結した（第
６図参照）。これにより得られたpJS8プラミドはtacＰ
プロモーターの制御下にある融合タンパク質（両端に数
個の追加アミノ酸をもつSTa関連デカペプチドが、第６
図に示すように成熟CTBのアミノ末端に共有結合で連結
されたもの）をコードするハイブリッド遺伝子をもたら
した。融合されたSTa関連デカペプチドの配列は、シス
テイン残基がアラニンによって置換されたことを除い
て、天然STa中の領域と同じであった。選ばれた配列
は、このアミノ酸置換を含む無毒性合成ノナデカペプチ
ドがE.coli STaを中和する能力のある抗STaモノクーナ
ル抗体と特異的に結合することができるという以前の発
見に基づいていた（Ａ−M Svennerholm et al,FEMS Mic
robiol Lett,in press 1988）。しかしながら、ここで
融合された配列はそれよりも短く、４個のシステイン含
む10個のみのアミノ酸から成っていた。
この構築において用いた実験方法および試薬類は以下
で詳述するとおりであった。E.coli HB101株はプラミド
単離のための一時的宿主として使用した。V.cholerae J
S 1569株はCVD 103株リファンピシン耐性誘導株であ
る。E.coli S17−１はJS1569株へのプラスミドの接合転
移のために使用した。これらの菌株の供給源およびさら
なる特性は実施例１に記載した。CsCl/エチジウムブロ
ミド勾配での延伸を含むアルカリ溶菌法によるプラスミ
ドDNAの単離、E.coliへのDNA形質転換およびV.cholerae
への接合はManiatis et al（1982）に従って行われ、実
施例１に詳述したとおりであった。DNAの制限および連
結のために用いた条件はそれぞれの酵素の供給者の勧め
に従った。酵素はBoehringer−Mannheim社およびNew En
gland Biologics社から購入した。STa関連デカペプチド
および隣接アミノ酸をコードする合成オリゴデオキシヌ
クレオチドはスウェーデン国ウプサラ、バイオメディカ
ルセンター、免疫学部（Lena Samuelsson博士）から相
補的な一本鎖として購入した。実施例１に記載の条件下
に室温で対合させた後、合成二本鎖オリゴデオキシヌク
レオチドはその５′末端にSac Iと適合しうる一本鎖末
端およびその３′末端にXma Iと適合しうる一本鎖末端
を有していた。
で詳述するとおりであった。E.coli HB101株はプラミド
単離のための一時的宿主として使用した。V.cholerae J
S 1569株はCVD 103株リファンピシン耐性誘導株であ
る。E.coli S17−１はJS1569株へのプラスミドの接合転
移のために使用した。これらの菌株の供給源およびさら
なる特性は実施例１に記載した。CsCl/エチジウムブロ
ミド勾配での延伸を含むアルカリ溶菌法によるプラスミ
ドDNAの単離、E.coliへのDNA形質転換およびV.cholerae
への接合はManiatis et al（1982）に従って行われ、実
施例１に詳述したとおりであった。DNAの制限および連
結のために用いた条件はそれぞれの酵素の供給者の勧め
に従った。酵素はBoehringer−Mannheim社およびNew En
gland Biologics社から購入した。STa関連デカペプチド
および隣接アミノ酸をコードする合成オリゴデオキシヌ
クレオチドはスウェーデン国ウプサラ、バイオメディカ
ルセンター、免疫学部（Lena Samuelsson博士）から相
補的な一本鎖として購入した。実施例１に記載の条件下
に室温で対合させた後、合成二本鎖オリゴデオキシヌク
レオチドはその５′末端にSac Iと適合しうる一本鎖末
端およびその３′末端にXma Iと適合しうる一本鎖末端
を有していた。
5.2 STデカペプチド−CTB融合タンパク質のtacP誘導発
現 pJS8プラスミドを保有するE.coli 101またはV.choler
ae JS1569の培養物は、適宜にアンピシリン（100μg/m
l）および／またはリファンピシン（50μg/ml）を含む
溶液LB培地中で37℃（E.coli）でまたは30℃（V.choler
ae）で連続振とうしながら、一晩あるいは希望の光学密
度（600nm）に達するまで増殖させた。イソプロピル−
β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（IPTG）によるtac
Ｐプロモーターからの発現誘導は、培養開始時にそれを
加える（最終濃度0.4mM）ことにより、あるいは初めに
誘導物質の不在下で0D600＝0.5へ菌株を増殖させ、次い
でIPTGを加えて収穫前にさらに４時間培養を続けること
により達成した。増殖後、細菌細胞と培養上清とは微量
遠心機（Eppendorf）で５分間遠心することにより分離
した。細胞ペレットは冷リン酸緩衝溶液（pH7.2）中に
再懸濁し、２回の30秒音波処理（Bransonソニファイア
ー）により破壊した。上清および音波処理細胞中のSTa
とCTB抗原の検出は、天然STaおよびCTBに対してそれぞ
れ誘導されたモノクローナル抗体を用いてGM1−ELISAに
より行った（J Sanchez et al,FEBS Letters208:194−1
98,1986）。
現 pJS8プラスミドを保有するE.coli 101またはV.choler
ae JS1569の培養物は、適宜にアンピシリン（100μg/m
l）および／またはリファンピシン（50μg/ml）を含む
溶液LB培地中で37℃（E.coli）でまたは30℃（V.choler
ae）で連続振とうしながら、一晩あるいは希望の光学密
度（600nm）に達するまで増殖させた。イソプロピル−
β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（IPTG）によるtac
Ｐプロモーターからの発現誘導は、培養開始時にそれを
加える（最終濃度0.4mM）ことにより、あるいは初めに
誘導物質の不在下で0D600＝0.5へ菌株を増殖させ、次い
でIPTGを加えて収穫前にさらに４時間培養を続けること
により達成した。増殖後、細菌細胞と培養上清とは微量
遠心機（Eppendorf）で５分間遠心することにより分離
した。細胞ペレットは冷リン酸緩衝溶液（pH7.2）中に
再懸濁し、２回の30秒音波処理（Bransonソニファイア
ー）により破壊した。上清および音波処理細胞中のSTa
とCTB抗原の検出は、天然STaおよびCTBに対してそれぞ
れ誘導されたモノクローナル抗体を用いてGM1−ELISAに
より行った（J Sanchez et al,FEBS Letters208:194−1
98,1986）。
pJS8によりコードされるSTa関連デカペプチド−CTBハ
イブリッドは初めに、上記のようにIPTGの存在下で増殖
させた形質転換E.coli 101において同定された。その
後、プラスミドpJS8はヘルパーE.coli株（S17−１）か
らV.cholerae JS1569へ（実施例１に記載の同一方法を
用いて）接合により転移させた。この生物によるハイブ
リッド遺伝子の発現は、対数増殖期の間さまざまな濃度
のTPTGを加えて培養した後に試験し、そしてデカペプチ
ド−CTBタンパク質の細胞局在化も実施例１でCTB単独に
ついて記載した方法と類似した方法により調べた。第７
図に示す結果は、ハイブリッドタンパク質が明らかにIP
TGに存在した関係で生産され、細胞外環境に十分に分泌
されたことを表している。デカペプチド−CTBのこの所
在は、実施例４に組換えCTB単独について記載した方法
と同じ方法でイゾーGM1アフィニティークロマトグラフ
ィーによりそれを精製することを可能にした。
イブリッドは初めに、上記のようにIPTGの存在下で増殖
させた形質転換E.coli 101において同定された。その
後、プラスミドpJS8はヘルパーE.coli株（S17−１）か
らV.cholerae JS1569へ（実施例１に記載の同一方法を
用いて）接合により転移させた。この生物によるハイブ
リッド遺伝子の発現は、対数増殖期の間さまざまな濃度
のTPTGを加えて培養した後に試験し、そしてデカペプチ
ド−CTBタンパク質の細胞局在化も実施例１でCTB単独に
ついて記載した方法と類似した方法により調べた。第７
図に示す結果は、ハイブリッドタンパク質が明らかにIP
TGに存在した関係で生産され、細胞外環境に十分に分泌
されたことを表している。デカペプチド−CTBのこの所
在は、実施例４に組換えCTB単独について記載した方法
と同じ方法でイゾーGM1アフィニティークロマトグラフ
ィーによりそれを精製することを可能にした。
5.3遺伝子融合デカペプチド−CTBハイブリッドタンプク
質の性質 デカペプチド−CTBの性質を調べるために、ハイブリ
ッドタンパク質はJL Tayot et al ,Eur JBiochem,113:2
49−258,1981に記載の一段階アフィニティークロマトグ
アフィーによりプラスミドpJS8を保有するV.choleraeJS
1569株の培養上清から精製した。
質の性質 デカペプチド−CTBの性質を調べるために、ハイブリ
ッドタンパク質はJL Tayot et al ,Eur JBiochem,113:2
49−258,1981に記載の一段階アフィニティークロマトグ
アフィーによりプラスミドpJS8を保有するV.choleraeJS
1569株の培養上清から精製した。
５μｇの精製タンパク質または標準CTBはその後β−
メルカプトエタノールの不在下で13.5％SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。タンパク質試料はそ
れらのペンタマーおよびモノマー体を分析するために、
電気泳動前に煮沸するか、あるいは試料緩衝液中に室温
で静置した（TR Hirst＆J Holmgren,Proc Natl Acad Sc
i USA,84:7418−7422,1987を参照されたい）。分離した
タンパク質はその後抗STaまたは抗CTBモノクローナル抗
体との反応、続いてペルオキシダーゼに結合した抗マウ
スIgG（Jackson Biologicals社）とのインキュベーショ
ンのために、ニトロセルロースに電気移行させた。最後
に、免疫反応性タンパク質バンドはα−クロロナフトー
ル基質を用いて発現させた。結果を第８図に示す。抗CT
Bとの反応は、対照CTBまたはSTa関連デカペプチド−CTB
ハイブリッドタンパク質のペンタマー体について予期さ
れた位置にバンドを出現させた。それぞれの煮沸および
非煮沸試料と抗STaモノクローナル抗体とのインキュベ
ーションは、デカペプチド−CTBタンパク質のぺンタマ
ーおよびモノマー体に相当するバンドを発現させたが、
対照CTBのペンタマーまたはモノマー体の場合にはネガ
ティブな反応を与えた。CTBのモノマー体は抗CTBと反応
しなかったが、デカペプチド−CTBのモノマー体とこの
抗体とのわずかな反応が観察された。
メルカプトエタノールの不在下で13.5％SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。タンパク質試料はそ
れらのペンタマーおよびモノマー体を分析するために、
電気泳動前に煮沸するか、あるいは試料緩衝液中に室温
で静置した（TR Hirst＆J Holmgren,Proc Natl Acad Sc
i USA,84:7418−7422,1987を参照されたい）。分離した
タンパク質はその後抗STaまたは抗CTBモノクローナル抗
体との反応、続いてペルオキシダーゼに結合した抗マウ
スIgG（Jackson Biologicals社）とのインキュベーショ
ンのために、ニトロセルロースに電気移行させた。最後
に、免疫反応性タンパク質バンドはα−クロロナフトー
ル基質を用いて発現させた。結果を第８図に示す。抗CT
Bとの反応は、対照CTBまたはSTa関連デカペプチド−CTB
ハイブリッドタンパク質のペンタマー体について予期さ
れた位置にバンドを出現させた。それぞれの煮沸および
非煮沸試料と抗STaモノクローナル抗体とのインキュベ
ーションは、デカペプチド−CTBタンパク質のぺンタマ
ーおよびモノマー体に相当するバンドを発現させたが、
対照CTBのペンタマーまたはモノマー体の場合にはネガ
ティブな反応を与えた。CTBのモノマー体は抗CTBと反応
しなかったが、デカペプチド−CTBのモノマー体とこの
抗体とのわずかな反応が観察された。
デカペプチド−CTBタンパク質は、Ａ−M Svennerholm
et al,FEMS Microbiol Letters,in press,1988に記載
のとおりに行った未成熟マウス胃内注入検定において10
μｇまでの量で試験したとき、毒性を全く示さなかっ
た。平行して試験した精製天然STa（Ａ−M Svennerholm
博士から入手）は下限1ngの量（すなわち、10,000倍低
い用量）でポジティブの未成熟マウステストを与えた。
STa関連デカペプチド−CTBハイブリッドタンパク質はGM
1−ELISAおよびイムノブロット分析の両方において抗ST
aモノクローナル抗体と効率よく結合することができた
（第７図および８図参照）。さらに、ハイブリッドタン
パク質はCTB成分に特徴的な数多くの性質、例えべ５量
体化する能力、GM1レセプターに結合する能力、および
V.choleraeから分泌される能力を示した。これらの性質
は組換えCTB単独について実施例４に記載した方法を用
いて調べた。
et al,FEMS Microbiol Letters,in press,1988に記載
のとおりに行った未成熟マウス胃内注入検定において10
μｇまでの量で試験したとき、毒性を全く示さなかっ
た。平行して試験した精製天然STa（Ａ−M Svennerholm
博士から入手）は下限1ngの量（すなわち、10,000倍低
い用量）でポジティブの未成熟マウステストを与えた。
STa関連デカペプチド−CTBハイブリッドタンパク質はGM
1−ELISAおよびイムノブロット分析の両方において抗ST
aモノクローナル抗体と効率よく結合することができた
（第７図および８図参照）。さらに、ハイブリッドタン
パク質はCTB成分に特徴的な数多くの性質、例えべ５量
体化する能力、GM1レセプターに結合する能力、および
V.choleraeから分泌される能力を示した。これらの性質
は組換えCTB単独について実施例４に記載した方法を用
いて調べた。
精製したタンパク質をウサギの免疫感作に用いたと
き、天然STaと交差反応する抗体が誘起された。固相抗
原として合成のプラスチック被覆STaを用いてELISAによ
り測定した抗STaの力価は、前免疫感作血清における検
出不能レベルから３回の皮下免疫感作後に1:2000の力価
に上昇し、これは化学的に誘導された天然STa含有ハイ
ブリッドタンパク質を用いてウサギを免疫化したときに
得られた力価と比べて優れていた。STa関連デカペプチ
ド−CTBタンパク質の免疫原性を、その毒性の消失およ
びGM1腸レセプターを認識するその能力と合わせて考え
ると、このハイブリッドタンパク質は動物およびヒトに
おけるSTa関連大腸菌下痢に対する経口免疫感作用の候
補トキソイドとなるであろう。
き、天然STaと交差反応する抗体が誘起された。固相抗
原として合成のプラスチック被覆STaを用いてELISAによ
り測定した抗STaの力価は、前免疫感作血清における検
出不能レベルから３回の皮下免疫感作後に1:2000の力価
に上昇し、これは化学的に誘導された天然STa含有ハイ
ブリッドタンパク質を用いてウサギを免疫化したときに
得られた力価と比べて優れていた。STa関連デカペプチ
ド−CTBタンパク質の免疫原性を、その毒性の消失およ
びGM1腸レセプターを認識するその能力と合わせて考え
ると、このハイブリッドタンパク質は動物およびヒトに
おけるSTa関連大腸菌下痢に対する経口免疫感作用の候
補トキソイドとなるであろう。
第１図Ａは、LTB遺伝子とCTB遺伝子との融合接点の配列
を示す配列図である。 第１図Ｂは、tacＰプロモーターの制御下にあるCTB遺伝
子を有するプラスミドpJS162を表わす模式図である。 第２図は、プラスミドpJS162中のCTB遺伝子のヌクレオ
チド配列を示す配列図である。 第３図は、コレラ菌をIPTG誘導した場合のCTB発現を表
わす図面である。 第４図は種々のCTB試料について、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写
真である。 第５図は569BCTB及び組換えCTBとウサギ抗血清とについ
てのオクテルロニー分析の結果を示す写真である。 第６図は、CTBにSTa関連デカペプチドを融合した場合の
融合部の配列を示す配列図である。 第７図は、pJS8を有するコレラ菌をIPTG誘導した場合の
デカペプチド−CTBハイブリッド蛋白質の発現を示す図
面である。 第８図は種々のCTB試料について、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、引続いて分
離した蛋白試料をニトロセルロース紙上で電気的移行し
た後のSTa関連デカペプチド−CTBハイブリッド蛋白質の
免疫ブロッテング分析の結果を示す写真である。
を示す配列図である。 第１図Ｂは、tacＰプロモーターの制御下にあるCTB遺伝
子を有するプラスミドpJS162を表わす模式図である。 第２図は、プラスミドpJS162中のCTB遺伝子のヌクレオ
チド配列を示す配列図である。 第３図は、コレラ菌をIPTG誘導した場合のCTB発現を表
わす図面である。 第４図は種々のCTB試料について、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写
真である。 第５図は569BCTB及び組換えCTBとウサギ抗血清とについ
てのオクテルロニー分析の結果を示す写真である。 第６図は、CTBにSTa関連デカペプチドを融合した場合の
融合部の配列を示す配列図である。 第７図は、pJS8を有するコレラ菌をIPTG誘導した場合の
デカペプチド−CTBハイブリッド蛋白質の発現を示す図
面である。 第８図は種々のCTB試料について、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、引続いて分
離した蛋白試料をニトロセルロース紙上で電気的移行し
た後のSTa関連デカペプチド−CTBハイブリッド蛋白質の
免疫ブロッテング分析の結果を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:63） (56)参考文献 Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｖｏｌ．20，Ｎｏ. １ （1988），Ｐ．42−53 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．３ （1983），Ｐ．1167−1174
Claims (7)
- 【請求項１】コレラトキシの結合性サブユニットタンパ
ク質（CTB）またはその誘導体の生産方法であって、 組換えDNA法によって、CTB遺伝子またはCTB誘導体タン
パク質が外来のリーダーペプチドと共に合成され、そし
てCTB遺伝子またはCTB誘導体遺伝子の発現が外来のプロ
モーターの転写制御下にあり、且つCTB遺伝子またはCTB
誘導体遺伝子と上記外来プロモーターとの間の結合鎖が
該プロモーターとリボソーム結合部位との間にコレラ菌
（Vibrio cholerae）由来のDNAを含まないように操作さ
れたDNAを用いることを特徴とする、上記方法。 - 【請求項２】CTBまたはCTB誘導体遺伝子の発現が誘導可
能な形態あるいは構成的形態のいずれかでtacPプロモー
ターの制御下におかれていることを特徴とする、請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】CTBまたはCTB誘導体遺伝子の発現がT7 RNA
ポリメラーゼ依存性プロモーターの制御下におかれてい
ることを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】天然リーダーペプチドを含まない成熟CTB
の遺伝子を、LTBのリーダーペプチドをコードするDNAに
結合させるために、合成オリゴデオキシヌクレオチドを
用いることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項５】オリゴヌクレオチド５′−CCC GGG−３′
および５′−TAC CCG GGA GCT−３′のいずれか一方ま
たは両方を用いることを特徴とする、請求項１乃至３の
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】コレラ毒素を合成する能力を欠くコレラ菌
（Vibrio cholerae）または他のビブリオナセア（Vibri
onaceae）を用いることを特徴とする、請求項１乃至５
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】オリゴヌクレオチド５′−AGA ATT CAC TG
C GCT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCA TGCC−３′、５′
−CCG GGG CAT GCA GGA TTA CAA CAC AAT TCA GCG CAG
TGA ATT CTA GCT−３′またはデカペプチドNH2−Cys Al
a Glu Leu Cys Cys Asn Pyo Ala Cys−COOHをコードす
るオリゴヌクレオチドのいずれか一つを用いることを特
徴とする、CTB由来のアミノ酸並びにSTa由来のアミノ酸
からなるCTB誘導体を得るための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8803291-7 | 1988-09-16 | ||
| SE8803291A SE462285B (sv) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322997A JPH0322997A (ja) | 1991-01-31 |
| JP2790333B2 true JP2790333B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=20373364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1239733A Expired - Lifetime JP2790333B2 (ja) | 1988-09-16 | 1989-09-14 | 外来プロモーターおよび／またはリーダーペプチドを用いたコレラトキシンｂサブユニットの組換え発現系 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0368819B1 (ja) |
| JP (1) | JP2790333B2 (ja) |
| AT (1) | ATE161885T1 (ja) |
| AU (1) | AU633842B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340577C (ja) |
| DE (1) | DE68928529T2 (ja) |
| DK (1) | DK175694B1 (ja) |
| ES (1) | ES2113342T3 (ja) |
| FI (1) | FI104496B (ja) |
| GR (1) | GR3025846T3 (ja) |
| IS (1) | IS1804B (ja) |
| NO (1) | NO301175B1 (ja) |
| SE (1) | SE462285B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03187383A (ja) * | 1989-09-04 | 1991-08-15 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現プラスミドおよびその用途 |
| CA2123675A1 (en) * | 1991-11-15 | 1993-05-27 | David W. Niesel | Membrane expression of heterologous genes |
| US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| US5932714A (en) * | 1995-02-23 | 1999-08-03 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of Bordetella |
| US5998168A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of bordetella |
| US6008329A (en) * | 1998-03-06 | 1999-12-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for purifying cholera toxin |
| WO2007117339A2 (en) * | 2006-01-11 | 2007-10-18 | The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy | Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli |
| DE102011111688A1 (de) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Bioserv Analytik Und Medizinprodukte Gmbh | Verfahren zur schnellen Isolation bzw. Aufreinigung von rekombinanten Proteinen mit einer (nicht toxischen) Choleratoxin-Domäne |
| CN109096403B (zh) * | 2018-07-04 | 2020-06-30 | 浙江工商大学 | 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4666837A (en) * | 1982-05-24 | 1987-05-19 | Smithkline-Rit | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits |
| US5135862A (en) * | 1983-03-04 | 1992-08-04 | University Of Maryland | Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio cholerae, products thereof |
| US4882278A (en) * | 1983-04-29 | 1989-11-21 | President And Fellows Of Harvard College | Non-toxinogenic vibrio cholerae mutants |
| EP0251579A3 (en) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| DE3856199T2 (de) * | 1987-04-29 | 1999-02-04 | Harvard College | Impfstoff gegen cholera |
-
1988
- 1988-09-16 SE SE8803291A patent/SE462285B/sv not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-09-04 IS IS3505A patent/IS1804B/is unknown
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- 1989-09-11 ES ES89850295T patent/ES2113342T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-14 JP JP1239733A patent/JP2790333B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-15 DK DK198904569A patent/DK175694B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-09-15 AU AU41349/89A patent/AU633842B2/en not_active Expired
- 1989-09-15 FI FI894368A patent/FI104496B/fi active IP Right Grant
- 1989-09-15 NO NO893702A patent/NO301175B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-09-15 CA CA000611596A patent/CA1340577C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-08 GR GR970402939T patent/GR3025846T3/el unknown
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．３ （１９８３），Ｐ．１１６７−１１７４ |
| Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１ （１９８８），Ｐ．４２−５３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO893702L (no) | 1990-03-19 |
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