JP3228419B2 - セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素 - Google Patents

セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、セルロースまたはヘミセルロース分解性酵
素、その酵素をコードするDNA構成物、その酵素の生産
方法およびその酵素を含んでなるセルロースまたはヘミ
セルロースの分解剤に関する。
発明の背景 セルロースを分解できる酵素がバイオマスを液体燃
料、ガスおよび飼料タンパク質に転化することはすでに
示唆されている。しかしながら、セルロース分解酵素に
よるバイオマス由来の発酵性糖の製造は、例えば、今日
使用されているセルロース分解性酵素の効率の悪さに起
因して、いまだα−アミラーゼによる殿粉からのグルコ
ースの製造と経済的に競合できない。さらに、セルロー
ス分解性酵素は、β−グルカンの分解用として醸造業
で、小麦粉の性質を改良するために製パン業で、セルロ
ースの非結晶部分を除去してパルプの結晶セルロースの
割合を高めるために製紙業で、そしてグルカンの消化を
改善するために飼料業で使用されているようである。セ
ルロース分解性酵素のさらに重要な用途は、例えば綿含
有織物の硬さを低減する目的で(例えば、英国特許第1,
368,599号または米国特許第4,435,307号参照)、土質の
除去および織物の色の澄明化をする目的で(例えば、ヨ
ーロッパ特許第220016号参照)の使用または「ストーン
ウォッシュ」様の外観を織物に付与するために色の局所
的変化をもたらす目的で(例えば、ヨーロッパ特許第30
7564号参照)生地を処理することにある。
セルロース分解性酵素の実用上の検討は、既知セルラ
ーゼ調製物が各種の単一セルラーゼ成分の複雑な混合物
として存在し、そしてかなり比活性が低い可能性がある
などの性質により抑制されてきた。多酵素系で単一成分
の生産の最適化は困難であるため、セルロース分解性酵
素の工業的に有効な原価での生産が困難であり、そして
それらの実用化は、所望の効果を達成するにはかなり多
量の酵素を使用する必要があることに起因する困難性に
よって妨げられてきた。
上記に指摘したセルロース分解性酵素の短所は、高比
活性の単一成分の酵素を選択使用することによって改善
される可能性がある。
単一成分のセルロース分解性酵素は、例えばトリコデ
ルマ・レーセイ(Trichoderma reesei)から単離された
(Teeriら、Gene 51,1987,43〜52ページ、P.M.Abuja,Bi
ochem.Biophys.Res.Comm.156,1988,180〜185ページ、お
よびP.J.Kraulis,Biochemistry 28,1989,7241〜7257ペ
ージ、参照)。ティー・レーセイ(T.reesei)のセルラ
ーゼは、セルロースへのバインディングに役立つターミ
ナルA領域、酵素のコアーにA領域を連結するB領域お
よび触媒活性ドメインを含むコアーから構成されている
ことが見い出された。別のティー・レーセイのセルラー
ゼのA領域は強く保持されていることが見い出されてお
り、そしてファネロシェーテ・クリソスポリウム(Phan
erochaete chrysosporium)により生産されるセルラー
ゼとも強い相同性を有することが観察された(Simsら、
Gene 74,1988,411〜422ページ)。
発明の要約 驚くべきことに、トリコデルマ・レーセイまたはファ
ネロシェーテ・クリソスポリウムのいずれとも近似しな
い他の糸状菌は、ティー・レーセイのセルラーゼのA領
域に相同性のある領域を含む酵素を生産しうることが見
い出された。
従って、本発明は、トリコデルマ(Trichoderma)ま
たはファネロシェーテ(Phanerochaete)以外の糸状菌
から誘導される可能性があり、そしてトリコデルマ・レ
ーセイ(Trichoderma reesei)のセルラーゼのターミナ
ルA領域に相同的な糖バインディングドメインを含んで
なるセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素に関す
る。この酵素では、糖バインディングドメインが、次の
アミノ酸配列 または不溶性のセルロース性基質もしくはヘミセルロー
ス性基質に対して酵素をバインディングしうる前記配列
の副配列を含んでなる。「Xaa」は、別の酵素の糖バイ
ンディングドメインのアミノ酸配列における変異を示す
ことを意図する。ハイフンは、(他の類似の酵素との比
較で)アミノ酸配列における「大きな相違点」を示すこ
とを意図する。
本明細書の文脈上、「セルロース」の語は、可溶性お
よび不溶性、非晶質および結晶性状のセルロースを含む
ことを意図している。「ヘミセルロース」の語は、グル
カン(澱粉の一部分)類、マンナン類、キシラン類、ア
ラビナン類、ポリグルクロン酸またはポリガラクツロン
酸を含むことを意図している。「糖バインディングドメ
イン」(「CBD」)は、糖基質、特に前記のようなセル
ロースまたはヘミセルロースに対して酵素をバインディ
ングさせうるアミノ酸配列を示すことを意図している。
「相同」の語は、本発明の酵素の糖バインディングドメ
インを構成するアミノ酸配列と、ティー・レーセイのセ
ルラーゼにみられるA領域(「A領域」はティー・レー
セイのセルラーゼのセルロース(すなわち、糖)バイン
ディングドメインを表わすのに使用される語である)を
構成するアミノ酸配列との同一性の程度が高いことを示
すことが意図されている。
現在のところ、セルロースまたはヘミセルロース分解
性酵素は、固体基質(セルロースを含む)へのバインデ
ィングを介する結果、そのような基質に対する酵素活性
を高める酵素分子中の糖バインディングドメインの機能
により一定の望ましい特性をもつティー・レーセイのセ
ルラーゼのA領域に対するその相同性に基づき糖バイン
ディングドメイン(または「A領域」)と同一視できる
アミノ酸配列を含むものと信じられている。従って、各
種微生物に由来する糖バインディングドメイン含有酵素
の同定および調製は相当な興味がもたれている。
本発明のセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素
は、ティー・レーセイのセルラーゼのA領域をコードす
るDNAの少なくとも一部を含むプローブにより別の糸状
菌のゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングす
ることにより都合よく同定されうる。種内(すなわち、
異なるティー・レーセイのセルラーゼ)および種間で異
なるセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素の糖バ
インディングドメインとの相同性が観察されることが、
前記スクリーニング方法が現に興味のある酵素を単離す
る簡便な方法であると信じられる理由である。
発明の詳細な記述 本発明の酵素に含まれる糖バインディングドメイン
(CBD)は、特に、フミコーラ(Humicola)、例えばフ
ミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、フザ
リウム(Fusarium)、例えばフザリウム・オキシスポラ
ム(Fusarium oxysporum)、またはミセリオプトーラ
(Myceliopthora)、例えばミセリオプトーラ・サーモ
フィル(Myceliopthora thermophile)の菌株より誘導
可能である。
上記に示されるアミノ酸配列における変化のいくつか
は、「保存的(conservative)」、すなわち本発明の各
種CBD含有酵素間のこれらの位置では、一定のアミノ酸
が好ましい。従って、先に示した配列の1位のアミノ酸
はTrp又はTyrが好ましい。2位のアミノ酸はGlyまたはA
laが好ましい。7位のアミノ酸はGln,IleまたはAsnが好
ましい。8位のアミノ酸はGlyまたはAsnが好ましい。9
位のアミノ酸はTrp,PheまたはTyrが好ましい。10位のア
ミノ酸はSer,Asn,ThrまたはGlnが好ましい。12位のアミ
ノ酸はPro,AlaまたはCysが好ましい。13位のアミノ酸は
Thr,ArgまたはLysが好ましい。14位のアミノ酸はThr,Cy
sまたはAsnが好ましい。18位のアミノ酸はGlyまたはPro
が好ましい。19位のアミノ酸(存在するとすれば)はSe
r,Thr,Phe,LeuまたはAlaが好ましい。20位のアミノ酸は
ThrまたはLysが好ましい。24位のアミノ酸はGlnまたはI
leが好ましい。26位のアミノ酸はGln,AspまたはAlaが好
ましい。27位のアミノ酸はTrp,PheまたはTyrが好まし
い。29位のアミノ酸はSer,HisまたはTyrが好ましい。32
位のアミノ酸はLeu,Ile,Gln,ValまたはThrが好ましい。
本発明の特定のCBD含有酵素の例は、以下のアミノ酸
配列の1つを含むものである。
本発明のセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素
は、前記糖バインディングドメインに隣接し、そしてそ
れを酵素の触媒活性ドメインに結合する連結B領域(テ
ィー・レーセイのセルラーゼについて確立されている命
名法を使用)を特定するアミノ酸配列をさらに含むこと
ができる。本発明の酵素に関して確認された前記B領域
の配列は、このような配列が親水性で非荷電の一定のア
ミノ酸が優先的であり、そして特にグリシンおよび/ま
たはアスパラギンおよび/またはプロリンおよび/また
はセリンおよび/またはスレオニンおよび/またはグル
タミンに富むことにより特徴付けられることを示す。こ
のB領域の特異な構造は、特に、主としてグリシンとア
スパラギンからなる短い反復単位を含む配列によって配
列に柔軟性を付与する。このような反復単位は、セリン
/スレオニン型のB領域を含むティー・レーセイまたは
ピー・クリソスポリウム(P.chrysosporium)のB領域
配列には見い出されていない。この柔軟構造が、不溶性
基質に対してA領域を介してバインディングした酵素の
触媒活性ドメインの作用を促進し、そのため本発明の酵
素に有益な特性を付与するものと考えられる。
本発明の酵素に含まれるB領域の具体例は、次のアミ
ノ酸配列を有する。
もう一つの態様では、本発明はトリコデルマ・レーセ
イのセルラーゼのターミナルA領域に相同的な糖バイン
ディングドメインに関する。そしてこの糖バインディン
グドメインは次のアミノ酸配列または不溶性セルロース
性もしくはヘミセルロース性の基質に対する一部分にバ
インディングさせることのできるそれらの副配列を含ん
でなる。
具体的な糖バインディングドメインの例は、前記のア
ミノ酸配列を有するものである。
さらなる態様では、本発明はセルロースまたはヘミセ
ルロース分解性酵素から誘導される連結B領域であっ
て、アミノ酸類グリシンおよび/またはアスパラギンお
よび/またはプロリンおよび/またはセリンおよび/ま
たはスレオニンおよび/またはグルタミンに豊んだアミ
ノ酸配列を含んでなる領域に関する。前述のように、こ
れらのアミノ酸は、しばしば短い反復単位を生じる場合
がある。B領域の配列の具体例は前記に示したものであ
る。
本発明は、異なるセルロースまたはヘミセルロース分
解性酵素のいろいろな領域を混ぜる機会を提供し、そう
することでCBD,B領域および触媒活性ドメインの新規な
組み合わせを創製することでこのタイプの酵素の新規な
活性プロフィールをもたらす。従って、本発明の酵素
は、アミノ酸配列がある天然のセルロースまたはヘミセ
ルロース分解性酵素から誘導されるCBDを特定するアミ
ノ酸配列、アミノ酸配列が他の天然のセルロースまたは
ヘミセルロース分解性酵素から誘導される連結B領域を
特定するアミノ酸配列、ならびに前記CBDもしくはB領
域のいずれかを供給する酵素または第三の酵素から誘導
される触媒活性ドメインを含んでなるものであることが
できる。具体的な態様では、触媒活性ドメインが天然に
存在しない酵素がCBDまたはB領域のいずれかを含んで
なる。この態様では、CBDおよびB領域が欠失する酵素
から改善された性質をもつ酵素を構成できる。
本発明の酵素は、エンドグルカナーゼ(セルロース繊
維における低結晶質の非晶質領域を加水分解できる)、
セロビオヒドロラーゼ(またエンドクルカナーゼとして
も知られている。セロビオース単位を除去することによ
って非還元鎖端からセルロースを分解できる)またはβ
−グルコシダーゼのようなセルラーゼであることが好ま
しい。
またさらなる態様では、本発明は前記のようなセルロ
ースまたはヘミセルロース分解性酵素をコードするDNA
配列を含んでなるDNA構成物に関する。
例えば、本発明の酵素をコードするDNA配列、セルロ
ースまたはヘミセルロース分解性酵素を産生する、フミ
コーラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、または
ミセリオプトラ(Myceliopthora)の1菌株のような微
生物のcDNAまたはゲノムライブラリーを作製し、そし
て、前記のような、酵素の全もしくは部分アミノ酸配列
に基づき合成されるオリゴヌクレオチドプローブまたは
ティー・レーセイのセルラーゼに由来るすA領域の部分
もしくは全DNA配列に基づくプローブにハイブリダイゼ
ーションすることによる常法、あるいは適当な酵素活性
を発現するクローンの選別法、あるいは天然のセルロー
スまたはヘミセルロース分解性酵素に対して産生される
抗体と反応性のタンパク質を生産するクローンの選別法
による陽性クローンのスクリーニングにより単離でき
る。
また、本発明の酵素をコードするDNA配列は、確立さ
れた標準法、例えば、S.L.BeaucageおよびM.H.Caruther
s,Tetrahedron Letters 22,1981,1859〜1869ページに記
載されたホスホアミジト法またはMatthesら、The EMBO
J.,1984,801〜805ページに記載された方法により合成
的に調製できる。ホスホラミド法によれば、オリゴヌク
レオチド類は、例えば自動DNAシンセサイザーにより合
成され、精製され、アニール化され、連結され、次いで
適当なベクターにクローニングされる。
最後に、DNA配列は、標準的な技法に従う、合成起
源、ゲノム起源またはcDNA起源のフラグメント、適する
場合には、完全なDNA構成物のいろいろな部分に対応す
るフラグメントの連結によって調製されたゲノムと合成
の混合起源、合成とcDNAの混合起源またはゲノムとcDNA
の混合起源からなることができる。従って、本発明の酵
素CBDをコードするDNA配列は、ゲノム起源であるが、本
発明の酵素のB領域をコードするDNA配列は合成起源で
あることができ、あるいはその逆であってもよく、本発
明の酵素の触媒活性ドメインをコードするDNA配列はゲ
ノムまたはcDNA起源からなることが都合よい。DNA構成
物はまた、例えば米国特許第4,683,202号明細書または
R.K.Saikiら、Science 239,1988,487〜491ページに記載
されるような特定のプライマーを使用するポリメラーゼ
連鎖反応によって調製することもできる。
また、本発明は前記のような挿入DNA構成物を担持す
る発現ベクターにも関する。この発現ベクターは、好ま
しくは、特定の宿主有機体で酵素の発現を可能にする適
当なプロモーター、オペレーターおよびターミネーター
配列、ならびに問題の宿主有機体でベクターの復製を可
能にする復製起源を含んでもよい。
次に、得られた発現ベクターを、糸状菌細胞のような
適当な宿主細胞に形質転換する。宿主細胞の好ましい例
としては、アスペルギルス(Aspergillus)の−の種で
あり、最も好ましくはアスペルギルスオリーゼ(Asperg
illus oryzae)またはアスペルギルスニガー(Aspergil
lus niger)が挙げられる。糸状菌細胞は、プロトプラ
ストの形成、プロトプラストの形質転換、次いで細胞壁
の再生を伴うそれ自体既知の方法で形質転換できる。宿
主微生物としてのアスペルギルスの使用は、ヨーロッパ
特許第238,023号(Novo Industri A/S)に記載されてお
り、その内容は引用することにより本明細書の内容とな
る。
また、宿主細胞は細菌、特にストレプトミセス(Stre
ptomyces)およびバチルス(Bacillus)、さらにイー・
コリー(E.coli)の菌株であってもよい。細菌細胞の形
質転換は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1989、に記載
されるような常法に従って実施することができる。
適当なDNA配列およびベクターの構成物のスクリーニ
ングは、標準的技法(Sambrookら、上記参照)により実
施してもよい。
本発明はさらに、前記のようなセルロースまたはヘミ
セルロース分解性酵素の生産方法であって、本発明の発
現ベクターで形質転換された細胞を酵素の生産を行う条
件下で培養し、次いで培養物から酵素を回収することか
らなる方法に関する。形質転換された宿主細胞の培養に
使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するのに適す
るいずれの常用されている培地であってもよい。発現さ
れた酵素は培地中に分泌されるものが都合よく、そして
培地からの遠心もしくは濾過による細胞の分離および硫
酸アンモニウムのような塩による培地のタンパク質成分
の沈殿、次いでイオン交換クロマトグラフィーまたはア
フィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフ
操作を始めとする周知の方法で回収できる。
前記のような組換えDNA技法、ならびに当該技術分野
で周知の発酵法および変異または他の方法を使用するこ
とにより、高純度のセルロースまたはヘミセルロース分
解性酵素を高収率で提供することができる。
さらに本発明は、セルロースまたはヘミセルロースの
分解剤であって、前記のようにセルロースまたはヘミセ
ルロース分解性酵素を含んでなる剤に関する。酵素の特
異性に応じて、前記用途の一つ(または一つ以上であっ
てもよい)に使用されることが予期されている。特定の
態様では、前記分解剤は本発明の2種以上の組み合わせ
またはセルロースもしくはヘミセルロース分解性活性を
有する1種以上の他の酵素と本発明の1種以上の酵素と
の組み合わせを含んでよい。
図面の簡単な説明 図1はプラスミドpSX224の構築を示し、 図2はプラスミドpHW485の構築を示し、 図3はプラスミドpHW697およびpHW704の構築を示し、 図4はプラスミドpHW768の構築を示し、 図5はプラスミドpSX320の制限地図を示し、 図6はプラスミドpSX777の構築を示し、 図7はプラスミドpCaHj170の構築を示し、 図8はプラスミドIM4の構築を示し、 図9は〜43kDのエンドグルカナーゼシグナルペプチド
とEndo1のN末端のSOE融合を示し、 図10はプラスミドpCaHj180の構築を示し、 図11はエフ・オキシスポラム(F.oxysporum)のC−
ファミリーセロビオヒドロラーゼのDNA配列および誘導
されたアミノ酸配列を示す、 図12はエフ・オキシスポラムF−ファミリー セルラ
ーゼのDNA配列および誘導されたアミノ酸配列を示す、 図13はエフ・オキシスポラムのC−ファミリー エン
ドクルカナーゼのDNA配列および誘導されたアミノ酸配
列を示す、 図14.A〜Eはエッチ・インソレンス(H.insolens)エ
ンドヌクレアーゼ1(EG1)のDNA配列および誘導された
アミノ酸配列を示す、ならびに 図15.A〜Dはビー・ロウタス(B.lautus)(NCIMB402
50)Endo1触媒ドメインとエッチ・インソレンス〜43kD
のエンドクルカナーゼのCBDおよびB領域の融合のDNA配
列および誘導されたアミノ酸配列を示す。
本発明は、以下の実施例によりさらに具体的に説明す
るが、いずれかの方法に特許請求された発明の範囲を限
定することを意図しない。
実施例1 エッチ・インソレンス(H.insolens)由来のA領域含有
クローンの単離 セルロース上で生育されたH.insolens DSM1800株(例
えば、国際公開第WO89/09259号に記載されている)か
ら、Koplanら、Biochem.J.183(1979)181〜184ページ
に記載される方法に準じmRNAを調製した。20,000クロー
ン含有のcDNAライブラリーを、OkayamaおよびBerg,Meth
ods in Enzymology 154,1987,3〜28ページの方法にほぼ
従って得た。
cDNAライブラリーは、4種のT.reeseiセルラーゼ遺伝
子におけるA領域のN末端部分の公表された配列(Pent
tilら、Gene 45,(1986),253〜63;Saloheimoら、Ge
ne 63,(1988),11〜21;Shoemakerら、Biotechnology,
1983年10月,691〜696;Teeriら、Gene 51(1987)43〜5
2)に従って設計されたアンチセンス構造のオリゴヌク
レオチドプローブを使用して、Gergenら、Nucl.Acids R
es.(8),1979,2115〜2136ページに記載されるよう
にスクリーニングされた。これらのプローブの配列は次
のとおりであった。
スクリーニングでA領域のプローブによくハイブリダ
イズする多数の候補を得た。制限マッピングで興味深い
クローンを17個に減し、その中の8個を十分に配列決定
(Haltinerら、Nucl.Acids Res.13,1985,1015〜1025ペ
ージに記載されるように)し、ターミナルCBDならびに
B領域の存在を確認した。
CBDについて得られた推定アミノ酸配列は以下のとお
りである。
B領域について得られた推定アミノ酸配列は次のとお
りである。
実施例2 エッチ・インソレンス(H.insolens)由来のCBH2型のセ
ルラーゼのエー・オリーゼ(A.oryzae)における発現 CBDクローンの1つの完全な配列は、T.reesei由来の
セロビオヒドロラーゼ(CBH2)と著しい類似性を示す。
A.oryzaeで発現しそしてそれからの分泌用H.insolens
CBH2遺伝子を担持する発現ベクターpSX224の構築を、
図1に概述する。pUC19レプリコンを含むベクターp77
7、A.oryzae由来のTAKAアミラーゼプロモーターの調整
領域およびA.niger由来のグルコアミラーゼターミネー
ターは、ヨーロッパ特許第238,023号明細書に記載され
ている。pSX217は、1.8kbフラグメント上にH.insolens
CBH2遺伝子を担持するクローニングベクターpcDV1−pL1
(OkayamaおよびBerg、上記、参照)から構成されてい
る。CBH2遺伝子は、構築に際して使用される3種の制限
部位、すなわち、単一配列におけるメチオニン開始コド
ンにおけるBal I部位、このBal I部位の下流620bpのBst
B I部位およびBstB Iの下流860bpのAva II部位を含む。
Ava II部位は、ポリA領域の遺伝子上流の非翻訳C末端
部分に位置しており、そしてこれは最終の構築に際して
不必要である。クローニングベクターの遺伝子の上流に
ポリG領域は存在しない。この領域は、切除されそして
TAKAプロモーターの末端のBamH I部位近くに翻訳開始コ
ドンを置くオリゴヌクレオチドリンカーによって置き換
えられている。
発現ベクターpSX224で、ヨーロッパ特許第238,023号
明細書に記載されるように選択マーカーとし、エー・ニ
ドランス(A.nidulans)由来のamdS遺伝子を使用してA.
oryzae IFO 4177を形質転換した。形質転換体をYPD培地
(Shermanら、Methods on Yeast Genetics,Cold Spring
Harbor Laboratory,1981)で3〜4日間生育し、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で
上澄の新規タンパク質類について分析した。H.insolens
由来のCBH2は、相当なグリコシル化を有するタンパク質
鎖を示す65kDの見かけのMwを有するバンドを形成し、こ
のタンパク質はアミノ酸成分を基準とする51kDのMwをも
つものと算出されている。この完全な酵素はセルロース
によくバインディングするが、A領域の除去およびB領
域が除去された可能性のある55kDおよび40kDの酵素分解
産物はバインディングしない。この酵素は濾紙に対して
一定の活性を有し、グルコースを放出する。予想される
ように、カルボキシメチルセルロースの形態の可溶性セ
ルロースについて測定したところでは非常に限定された
エンドグルカナーゼ活性を有している。
実施例3 フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)ゲ
ノムDNAの単離 フザリウム・オキシスポラムの凍結乾燥培養物、をリ
ン酸緩衝液で元へ戻し、5枚のフォックス(FOX)培地
(酵母エキス6%、K2HPO4 1.5%、MgSO4・7H2O 0.75
%、グルコース22.5%、寒天1.5%、pH5.6)プレートの
各々に5度スポットし、37℃でインキュベーションし
た。インキュベーションの6日後、プレートからコロニ
ーをかきとり、0.001%のツウィーン(Tween)−80 15m
Lに入れ、濃く曇った懸濁液を得た。
それぞれ液体フォックス培地300mLを含む4個の1リ
ットルフラスコに前記胞子懸濁液2mLを接種し、30℃お
よび240rpmでインキュベーションした。インキュベーシ
ョン4日目に培養物を4層の滅菌ガーゼを介して濾過
し、次いで滅菌水で洗浄した。菌体をワットマン濾紙上
で乾燥し、流体窒素で凍結し、冷却乳鉢中で微粉砕し、
新鮮な溶菌緩衝液(10mM Tris−Cl,pH7.4,1%SDS,50mM
EDTA,100μL DEPC)75mLに加えた。十分に混合された懸
濁液を1時間65℃の水浴中でインキュベートし、次いで
ベンチトップ遠心機により4000rpmおよび5℃で10分間
遠心した。上澄をデカントしエタノール沈殿した。氷上
で1時間後、溶液を20分間19,000rpmにて遠心した。上
澄をデカントしイソプロパノール沈殿した。10分間10,0
00rpmにて遠心した後、上澄をデカントしペレットを乾
燥した。
TER溶液(10mM Tris−HCl,pH7.4,1mM EDTA,100μg RN
Ase A)1mLを各チューブに加え、これらのチューブを2
日間4℃で保存した。これらのチューブを集め、30分間
65℃の水浴に置き、不溶性のDNAを浮遊させた。溶液
を、フェノール/CHCl3/イソアミルアルコールで2度、C
HCl3/イソアミルアルコールで2度抽出し、次いでエタ
ノール沈殿した。ペレットを定着させてエタノールを除
去した。70%EtOHを加え、DNAを−20℃で1夜保存し
た。デカントおよび乾燥後、TER 1mLを加え、1時間65
℃でチューブをインキュベーションすることでDNAを溶
解した。ゲノムDNA 1.5mgを得た。
ディジェネレートプライマーによる増幅、クローニング
および増幅されたDNAの配列決定 PCR(米国特許第4,683,195号および同4,683,202号参
照)を使用するC−ファミリー(命名は、Henrissat
ら、Gene 81(1),1989,83〜96ページによる)セルラ
ーゼ由来のDNAを増幅するため、各「センス」オリゴヌ
クレオチドを、各「アンチセンス」オリゴヌクレオチド
と組み合わせて使用した。従って、以下のプライマーの
組み合わせが使用された。
PCR反応では、フザリウム・オキシスポラム(Fusariu
m oxysporum)ゲノムDNA 1μgを鋳型に使用した。10倍
のPCR緩衝液は、100mM Tris−HCl,pH8.3,500mM KCl,15m
M MgCl,0.1%ゼラチン(Perkin−Elmer Cetus)であ
る。反応液は以下の成分を含めた。
脱イオン水 35.75μL 10X PCR緩衝液 5 μL 鋳型DNA 5 μL プライマー1 2 μL(40ピコモル) プライマー2 2 μL(40ピコモル) Taqポリメラーゼ 0.25μL(1.25U) 合計 50 μL PCR反応は次の条件で40サイクル行った。
94℃ 1.5分 45℃ 2.0分 72℃ 2.0分 各反応液5μLをアガロースゲル電気泳動で分析し
た。DNAフラグメントの大きさは、DNA分子量マーカーか
ら推定した。反応をZC3220およびZC3221でプライムし、
C−ファミリー セルラーゼのフラグメントに対する候
補である適当なサイズの2種のDNAフラグメントを生成
した。これらの2つのフラグメントを含むアガロース区
分を切り取り、DNAを溶離し、制限酵素Kpn1およびZba1
により消化した。これらのフラグメントを、前記2種の
制限酵素で切断したベクターpUC18に連結した。E.coli
を連結体で形質転換し、得られたコロニーからミニプレ
プ(mini prep)DNAを調製した。これらのインサートの
DNA配列を測定し、2つの新規なC−ファミリー セル
ラーゼ(1つが新規なセロビオヒドロラーゼでもう1つ
が新規なエンドクルカナーゼ)が同定されたことが明か
らにされた。
C−ファミリー セルラーゼに対して、前記のような
PCRクローニング手順を、既知のF−ファミリー セル
ラーゼ内に保存されたセルラーゼ配列をコードする他の
プライマーを使用して利用した(Henrissatら、上記、
参照)。以下のプライマーの組み合わせをフザリウム
(Fusarium)ゲノムDNAの増幅に使用した。
PCR反応は、次のように40サイクル行った。
94℃ 1.5分 50℃ 2.0分 72℃ 2.0分 180bpのバンドを、アガロースゲルフラグメントから
溶離し、制限酵素をHind IIIおよびCla Iで消化し、次
いでHind IIIおよびAcc Iで消化した。pUC19に連結し
た。連結されたDNAでE.coliを形質転換し、単離された
コロニーからミニプレプDNAを調製した。クローンニン
グされたDNAのDNA配列を決定した。このフラグメント
は、F−ファミリー セルラーゼの新たな構成員に相当
する配列をコードしていた。
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)cD
NAライブラリーの構築 フザリウム・オキシスポラムを発酵によって生育し、
いろいろな時間に試料を採取してRNAを抽出し、セルラ
ーゼ活性を分析した。活性の分析は、総セルラーゼ活性
のアッセイと色澄明化のアッセイを含む。最高の色澄明
化を示すフザリウム・オキシスポラム試料は、ポリ
(A)+RNAが単離された全RNAから抽出された。
フザリウム・オキシスポラムのcDNAライブラリーを構
築するために、第一鎖cDNAを2種の反応液(一つは放射
能標識したdATPで、他の一つは放射能標識しないdATP)
で合成した。2.5X反応混合物を、以下の試薬を次の順序
で混合することにより室温で調製した。5Xの逆転写酵素
緩衝液(Gibco−BRL,Gaithersburg,Maryland)10μL,20
0mMのジチオスレイトール(−70℃で保蔵された原液由
来または新たに調製)2.5μLおよび各オリゴヌクレオ
チドミリン酸(dATP,dGTP,dTTPおよび5−メチルdCTP,P
harmacia LKB Biotechnology,Alamada,CA.から得た)10
mMを含む混合物2.5μL。反応混合物を2つのチューブ
に7.5μLずつ分注した。10μCi/μLの32Pα−dATP(A
mersham,arlington Heights,IL)1.3μLを一つのチュ
ーブに加え、もう一方のチューブには水1.3μLを加え
た。各混合物の7μLを最終反応チューブに移した。そ
れぞれのチューブで、5mMのTris−HCl(pH7.4)および5
0μMのEDTA 14μL中フザリウム・オキシスポラムのポ
リ(A)+RNA 5μgを、1μg/μLの第一鎖プライマ
ー(ZC2938:GACAGAGCACAGAATTCACTAGTGAGCTCT15)2μ
Lと混合した。このRNAプライマー混合物を4分間65℃
に加熱し、氷水で冷却し、次いで微量遠心管で短時間遠
心した。RNAプライマー混合物8μLを最終反応チュー
ブに加えた。200U/μLのSuperscript(商標)逆転写酵
素(Gibco−BRL)5μLを各チューブに加えた。ゆるや
かに攪拌した後、チューブを30分間45℃でインキュベー
ションした。10mMのTris−HCl(pH7.4),1mMのEDTA 80
μLを各チューブに加え、試料を回転させて、簡単に遠
心した。各チューブから3μLを採取し、TCA沈殿によ
り取り込まれたカウントと反応液中の総カウントを測定
した。各チューブからの試料2μLをゲル電気泳動で分
析した。各試料の残りを、オイスターグリコーゲンの存
在下でエタノール沈殿処理た。核酸を遠心によりペレッ
ト化し、次いでこれらのペレットを80%エタノールで洗
浄した。エタノール洗浄後、試料を10分間通気乾燥し
た。第一鎖の合成は、ポリ(A)+RNAからDNAの転換率
33%に相当するフザリウム・オキシスポラムcDNA 1.6μ
gを与えた。
第二鎖cDNAの合成は、ヘアピンDNAをもたらす第二鎖
合成の第一鎖プライミングを促進する条件下で第一鎖反
応液由来のRNA−DNAハイブリダイゼーションによって行
った。2つの第一鎖反応液のそれぞれに由来する第一鎖
生成物を、水71μLに再懸濁した。次の試薬、5X第二鎖
緩衝液(100mM Tris,pH7.4,450mM KCl,23mM MgCl2およ
び50mM(NH42SO4)20μL,5mM β−NAD 3μLおよび
各10mMのデオキシヌクレオチド三リン酸混合物3μL
を、室温で上記反応チューブに添加した。α−32PdATP1
μLを、第一鎖合成用の未標識dATPを含む反応混合物に
加え、一方、第一鎖合成用の標識DATPを含むチューブに
は水1μLを含めた。次に、各チューブに、7U/μLの
E.coli DANリガーゼ(Boehringer−Mannheim,Indianapo
lis,IN)0.6μL,8U/μLのE.coli DNAポリメラーゼI
(Amersham)3.1μLおよび2u/μLのRNase H(Gibco−
BRL)を加えた。反応液を2時間16℃でインキュベーシ
ョンした。インキュベーション後、各反応液由来の2μ
Lを使用してTCA沈殿性カウントと反応液の総カウント
を測定し、次いで各反応液由来の2μLをゲル電気泳動
により分析した。各試料の残りに、2.5μg/μLのオイ
スターグリコーゲン2μL,0.5のEDTA 5μLおよび10mM
のTris−HCl(pH7.4),1mMのEDTA 200μLを加えた。試
料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いでイソプ
ロパノール沈殿させた。遠心後、ペレットを80%エタノ
ール100μLで洗浄し、通気乾燥した。反応の各々によ
って得られた二本鎖cDNAは、約2.5μgであった。
ムングビーン(mung been)ヌクレアーゼ処理により
ヘアピンの一本鎖DNAを切り取った。各cDNAペレットを
水15μLに再懸濁し、次いで各チューブに10Xムングビ
ーン緩衝液(0.3M酢酸ナトリウム、pH4.6,3M NaClおよ
び10mM ZnSO4)2.5μL,10mMのDTT 2.5μL50%のグリセ
ロール2.5μLおよび10U/μLのムングビーンヌクレア
ーゼ(New England Biolabs,Beverly MA)2.5μLを加
えた。反応液を30分間30℃でインキュベーションシ、各
チューブに10mMのTris−HCl(pH7.4)および1mM EDTA 7
5μLを加えた。2μLのアリコートをアルカリ性アガ
ロースゲル分析により分析した。1MのTris−HCl(pH7.
4)100μLを各チューブに加え、試料をフェノール−ク
ロロホルムで2度抽出した。DNAをイソプロパノールで
沈殿させ、次いで遠心によりペレット化した。遠心後、
DNAのペレットを80%エタノールで洗浄し、通気乾燥し
た。2つの反応のそれぞれからのDNAの収量は、約2μ
gであった。
このDNAの末端をT4 DNAポリメラーゼで処理して平滑
にした。水24μLの合計容量で2つの試料に由来するDN
Aを再懸濁した後、合わせた。このDNAに、10XT4緩衝液
(330mM Tris−酢酸塩、pH7.9,670mM KAc,100mM MgAcお
よび1mg/mLのゼラチン)4μL,1mMのdNTP 4μL,50mMのD
TT 4μLおよび1U/μLのT4 DNAポリメラーゼ(Boehrin
ger−Mannheim)4μLを加えた。これらの試料を1時
間15℃でインキュベーションした。インキュベーション
後、10mMのTric−HCl(pH7.4)および1mMのEDTA 160μ
Lを加え、次いで試料をフェノール−クロロホルムで抽
出した。DNAをイソプロパノールで沈殿させ、次いで遠
心によりペレット化した。遠心後、DNAを80%エタノー
ルで洗浄し、次いで通気乾燥した。
このDNAを水6.5μLで再懸濁、Eco R Iアダプターを
平滑化されたDNAに付加した。このDNAに、1μg/μLの
Eco R Iアダプター(Invitrogen,San Diego,CAカタログ
#409−20)1μL,10Xリガーゼ緩衝液(0.5M Tris,pH7.
8および50mM MgCl2)1μL,10mMのATP 0.5μL,100mMのD
TT 0.5μLおよび1U/μLのT4 DNAリガーゼ(Boehringe
r−Mannheim)1μLを加えた。この試料を室温で1夜
インキュベーションした後、リガーゼを15分間65℃で変
性した。
第一鎖プライマーによってコードされたSs Iクローニ
ング部位を、Ss Iエンドヌクレアーゼで消化することに
より露出させた。このDNAに水33μL,10X Ss I緩衝液
(0.5M Tris,pH8.0,0.1M MgCl2および0.5M NaCl)5μ
Lおよび5U/μLのSs I 2μLを加え、この試料を2時
間37℃でインキュベーションした。10mMのTris−HCl(p
H7.4)および1mMのEDTA 150μLを加え、試料をフェノ
ール−クロロホルムで抽出し、次いでDNAをイソプロパ
ノールで沈殿させた。
cDNAをセファロースCL2B(Pharmacia LKB Biotechnol
ogy)カラムでクロマト処理してcDNAのサイズを選択
し、そしてアダプターを含まないものを除去した。セフ
ァロースCL2Bカラム1.1mLを1mLのプラスチックス使い捨
てピペットに流し込み、そのカラムを50倍カラム容量の
緩衝液(10mM Tris,pH7.4および1mM EDTA)で洗浄し
た。試料をのせ、1滴ずつ画分を集め、ボイド容積中の
DNAを集めた。分画したDNAをイソプロパノールで沈殿さ
せた。遠心後、DNAを80%エタノールで洗浄し、次いで
通気乾燥した。
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
のcDNAライブラリーを、Eco R IおよびSst Iで消化した
ベクターpYcDE8′(国際公開第WO90/10698号参照)にそ
のcDNAを連結することにより樹立した。10Xリガーゼ緩
衝液8μL,10mMのATP 4μL,200mMのDTT 4μLおよび1
単位のT4 DNAリガーゼ(Boehringer−Mannheim)を含む
リゲーション反応溶液80μL中、cDNA 400ngに390ngの
ベクターを連結した。室温で1夜インキュベーション
後、オイスターグリコーゲン5μgおよび10mMのTris−
HClおよび1mMのEDTA 120μgを加え、試料をフェノール
−クロロホルムで抽出した。DNAをエタノールで沈殿さ
せ、DNAペレットを80%エタノールで洗浄した。通気乾
燥後、DNAを水3μLに再懸濁した。電気穿孔法成分DH1
0B細胞(Gibco−BRL)37μLを上記DNAに加え、Bio−Ra
d Gene Pulser(Model#1652076)およびBio−Rad puls
e Controller(Model #1652098)エレクトロポレーシ
ョンユニット(Bio−Rad Laboratories,Richmond,CA)
により電気穿孔法を完了した。SOC(Hanahan,J.Mol.Bio
l.166(1983),557〜580)の4mLを電気穿孔法で処理し
た細胞に加え、次いで細胞懸濁液400μLを10枚の150mm
LBアンピシリンプレートの各々に広げた。1夜インキ
ュベーション後、LB amp培地10mLを各プレートに加え、
細胞を培地から採取しこ。グリセロール原液とプラスミ
ド調製物を各プレートから作製した。ライブラリーのバ
ックグランド(インサートを含まないベクター)を、イ
ンサートを含まないベクターの連結と電気穿孔法後の数
個のクローンの力価測定により約1%において確認し
た。
cDNAライブラリーのスクリーニング 完全鎖長のセルラーゼcDNAクローンを、PCRで生成し
たゲノムオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイ
ゼーションによりフザリウム・オキシスポラム(Fusari
um oxysporum)cDNAライブラリーから単離した。
PCRで生成したオリゴヌクレオチド類:ZC3309,C−ファ
ミリー セロビオヒドロラーゼの一部分をコードする40
mer ATT ACC AAC ACC AGC GTT GAC ATC ACT GTC AGA GG
G CTT C;ZC3310 C−ファミリー エンドグルカナーゼを
コードする28mer,AAC TCC GTT GAT GAA AGG AGT GAC GT
A G;およびZC3311,F−ファミリー セルラーゼをコード
する40mer,CGG AGA GCA GCA GGA ACA CCA GAG GCA GGG
TTC CAG CCA CをT4ポリヌクレオチドキナーゼで32
ATPを使用して末端標識した。キナーゼ反応では、各オ
リゴヌクレオチド17ピコモルを脱イオン水で12.5μLに
調整した。これらに、10Xキナーゼ緩衝液(1X:10mM塩化
マグネシウム、0.1mM EDTA,50mM Tris,pH7.8)2μL,20
0mMのジチオスレイトール0.5μL,32PγATP(150mCi/mL,
Amersham)1μL,T4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μ
L,BRL)2μLを加えた。次に、これらの試料を混合
し、37℃で30分間インキュベーションした。オリゴヌク
レオチド類を、組み込みが起っていないヌクレオチド類
よりTE(10mM Tris,pH8.0,1mM EDTA)180μL,7.5M酢酸
アンモニウム100μL、イガイのグリコーゲン(20mg/m
L,Gibco−BRL)2μLおよび100%エタノール750μLを
使用する沈殿によって分離した。ペレットを蒸留水200
μLに溶解した。これらのオリゴヌクレオチドに取り込
まれた放射能量を測定するために、1:1000希釈のオリゴ
ヌクレオチド10μLをBeckman LS1800液体シンチレーシ
ョンシステムで読み取った。活性は、ZC3309について11
5×106 cpm,ZC3310について86×106 cpmおよびZC3311に
ついて79×106 cpmであった。
最初に、20,000cDNAクローンを、C−ファミリー セ
ロビオヒドロラーゼ,C−ファミリー エンドグルカナー
ゼおよびF−ファミリー セルラーゼのクローンに相当
する3種のオリゴヌクレオチドのそれぞれの混合物で探
査した。−70℃で保存された力価測定済みのグリセロー
ル原液からcDNAライブラリーをとり出した。150mmのLB
アンピシリン(1000μg/mL)プレート5枚に、それぞれ
4000クローンをまいた。Biotrans 0.2μm 137mmフィル
ターを使用して標準的な方法(Sambrookら、Molecular
Cloning,1989)によりリフト(lift)を複写した。これ
らのフィルターを減圧下にて2時間80℃で焼き、次いで
80mLの予備ハイブリダイゼーション溶液C5X Denhardt's
(1X:0.02%Ficoll,0.02%ポリビニルピロリドン、0.02
%ウシ血清アルブミンPentax Fraction 5(Sigma,St.Lo
uis,MO),5XSSC(1X:0.15M塩化ナトリウム、0.15Mクエ
ン酸ナトリウム,pH7.3))、100μg/mL変性超音波処理
サケの***DNA、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、1mM
ピロリン酸ナトリウム、100μM ATP,20%ホルムアミ
ド、1%ドデシル硫酸ナトリウム)中、37℃にて結晶化
皿(Pharmacia LKB Biotechnology,Alameda,CA)で一夜
処理した(Ulrichら、EMBO J.(1984)361〜364ペー
ジ)。
予備ハイブリダイゼーションされたフィルターの1つ
を、80×106 cpm ZC3309,86×106 cmp ZC3310および79
×106 cmp ZC3311を含む予備ハイブリダイゼーション溶
液80mLを入れた結晶化皿に入れ、次いで37℃に一夜放置
しプローブ処理した。次に、フィルターを高緊縮まで洗
浄した。これらのプローブ処理されたフィルターを、結
晶化皿中室温で低緊縮洗液(2XSSC,0.1%SDS)400mLで
3度洗液した。このとき、4個の1リットル容積のプラ
スチック箱を使用した。塩化テトラメチルアンモニウム
洗浄(TMACL:3M塩化テトラメチルアンモニウム、50mM T
ris−HCl,pH8.0,2mM EDTA,1g/L SDS)で68℃にて20分間
さらに洗浄し、その塩基組成1585〜1588と無関係に28me
r ZC3310について高緊縮洗浄を行った(Woodら、Proc.N
atl.Acad.Sci.82(1985))。次に、これらのフィルタ
ーを乾式ブロットし、ワットマン3MM紙に固定し、オー
トラジオグラフィー用プラスチックラップで被覆した。
これらを増感紙とKodak XAR−5フィルムを使用して−7
0℃で一夜さらした。
複写フィルター上に2つの推定上の陽性物が現われ
た。コロニーを有するプレート上の対応する領域を採取
し、1Xポリメラーゼ連鎖反応(PCR)緩衝液(100mM Tri
s HCl,pH8.3,500mM KCl,15mM MgCl,0.1%ゼラチン,Perk
in Elmer Cetus)に入れ、70μg/mLアンピシリンを含む
100mm LBプレート上に10倍希釈物5個をのせた。これら
のプレートを一夜37℃で生育した。各推定クローンの希
釈物2つを上述のように再スクリーニングして選択し
た。単離されたクローンの1つからpZFH196が見い出さ
れた。これを、2XYTブロス(1リットル当り:16gバクト
−トリプトン、10gバクト−酵母エキス、10gNaCl)中で
一夜生育した。迅速沸騰法(HolmesおよびQuigley,Ana
l.Biochem.114(1981),193〜197)により23μgのDNA
が精製された。制限酵素分析により、このクローンの鎖
長は約2,000塩対であることがわかった。配列分析は、
それがPCRによってC−ファミリー セロビオヒドロラ
ーゼフラグメントに相同的なフラグメントを含むことを
示した。
追加のセルラーゼcDNAクローンを単離する験みに際
し、2×106 クローンのcDNAライブラリーを、約100,00
0cDNAクローンを含む20枚の150mm LBプレート(100μg/
mLアンピシリン)上にまいた。第一スクリーニング法と
同様にリフトを複写した。ハイブリダイゼーションを予
備ハイブリダイゼーション緩衝液中30℃の温度にてホル
ムアミドにより実施したことを除き、上記と同様に3種
のセルラーゼに相当するオリゴヌクレオチドで前記ライ
ブラリーをスクリーニングした。TMACLにより洗浄を67
℃で20分間2度行った。8と20との間のシグナルが20枚
のプレートの各複写フィルター上に見い出された。パス
テルピペットの大きい方の端で第一のプレートから15個
のプラークを採取し、1XPCR緩衝液(Perkin−Elmer Cet
us)1mLに入れた。3種のオリゴヌクレオチド混合物を
使用し、前記細菌プラークに対してPCRを行った。各混
合物には、ベクター特異的オリゴヌクレオチドZC2847
と、さらに各混合物中には異なる特異的オリゴヌクレオ
チド(ZC3309,ZC3310またはZC3311)を含めた。Pharmac
ia Ultrapure dNTPと共にAmplitaqポリメラーゼ(Perki
n−Elmer Cetus)を使用し、そしてPerkin Elmer Cetus
法に従った。各プライマー16ピコモルを反応容量40μL
で使用した。1XPCR緩衝液中20μLを、DNAを除きPCRに
必要なすべての試薬類を含むマスター混合物20μLに加
えた。最初に94℃で1分45秒変性後、94℃45秒、45℃1
分および72℃10分の最終伸長を伴う72℃2分の28サイク
ルを、パーキンエルマー(Perkin Elmer)サーモサーク
ラーで行った。15プラークのうち10個が、C−ファミリ
ー特異的オリゴヌクレオチドZC3309およびZC2847でプラ
イムしたとき1つのバンドを得た。他の混合物は、特異
的な生成物を与えなかった。従って、PCRによって最大
のバンドを生成された5個のプラーク(すなわち、完全
鎖長Cファミリー セロビオヒドロラーゼである可能性
がある)とPCRバンドを生成しない5個のプラークと
を、70μg/mLアンピシリンを含む100mm LBプレート上に
5つの10倍希釈物としてまいて、1夜生育した。複写リ
フトを各10倍希釈物2つのとった。3種のオリゴヌクレ
オチド混合物を使用し前記のように予備ハイブリダイゼ
ーションおよびハイブリダイゼーションを行った。単離
されたクローンが接種した10個すべてに見られた。これ
らをつまようじで希釈プレートから採取し、70μg/mLア
ンピシリンを含む100mm LBプレート上で単一コロニーを
単離した。C−ファミリー セロビオヒドロラーゼに対
して特異的な2種のオリゴヌクレオチド(ZC3409(CCG
TTC TGG ACG TAC AGA)およびZC3411(TGA TGT CAA GTT
CAT CAA))を使用し単離された細菌コロニーについて
PCRを行った。条件は、25μL反応容積で各プライマー1
0ピコモルを使用すること以外前記条件と同じにした。
マスター混合物25μLを含むPCRチューブにつまようじ
でコロニーを加えた後、サイクルを行った。10個のうち
5個が、C−ファミリー セロビオヒドロラーゼと予想
されるサイズの強いバンドを与えた。次に、単離された
コロニーをTerrificブロス(Sambrookら、上記、A2)20
mLで生育し、迅速沸騰法でDNAを単離した。これらのク
ローンを、サンガージデオキシシーケンシングにより部
分的に配列決定を行った。配列分析から、PCRによりC
−ファミリー セロビオヒドロラーゼに特異的なバンド
を与えない5個のクローンは、F−ファミリー セルラ
ーゼクローンであることを示した。
C−ファミリー エンドグルカナーゼのクローニング
のため、2×106クローンをZC3310のみで再スクリーニ
ングした。予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリ
ダイゼーションの条件は先に使用したものと同様であっ
た。ホルムアミドを含まない予備ハイブリダイゼーショ
ン溶液1mL当り1×106 CPMの末端標識ZC3310で30℃にて
10時間フィルターをハイブリダイゼーションした。60℃
で2分間のTMACL洗浄を2回行った。複写フィルター上
に7個の弱いシグナルが見られた。プラークをピペット
の大きい端で採取し、LBブロス1mL中に入れた。これら
を、70μg/mLアンピシリンを含む100mm LBプレート上に
5つの10倍希釈物としてそれぞれまいた。複写リフトを
各2つの希釈物から採取し、前記のように処理した。予
備ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションお
よび洗浄を第一水準のスクリーニングとして行った。単
一コロニーハイブリダイゼーションの目的で単離された
3つのコロニーを同定しそして画線培養した。単離され
たものを、Terrificブロス(1リットル当り:12gトリプ
トン、24g酵母エキス、4mLグリセロール、オートクレー
ブおよび0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4の100mL)(Sambro
okら、上記、A2)50mLで一夜生育し、標準的な方法によ
るアルカリ溶菌およびPEG沈殿(Maniatis 1989,1.38〜
1.41)でDNAを単離した。制限酵素分析から、一つのク
ローン(pZFH223)は他のものより長かったので完全配
列決定用に選んだ。配列分析は、初めてクローニングさ
れたPCRフラグメントを含むことを示した。
DNA配列分析 これらのcDNAを酵母発現ベクターpYCDE8′において配
列決定した。New England Nuclearからの35−SdATP(M.
D.Bigginら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1983,3963〜3
965ページ参照)を使用するジデオキシチェインターミ
ネーション法(F.Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
4,1977,5463〜5467ページ)を、すべての配列決定反応
に使用した。これらの反応は、Pharmaciaからの変性t7
DNAポリメラーゼ(S.TaborおよびC.C.Richardson,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 84,1987,4767〜4771ページ、参照)
で触媒され、そしてADH1プロモーター(ZC996:ATT GTT
CTC GTT CCC TTT CTT)に相補的なオリゴヌクレオチ
ド、CYC1ターミネーター(ZC3635:TGT ACG CAT GTA ACA
TTA)に相補的なオリゴヌクレオチドまたは目的のDNA
に相補的なオリゴヌクレオチドによりプライムされた。
二本鎖鋳型は、NaOHで変性(E.Y.ChenおよびP.H.Seebur
g,DNA ,1985,165〜170ページ)した後、配列決定用オ
リゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた。オ
リゴヌクレオチド類は、Applied Biosystems Model 380
A DNAシンセサイザーにより合成した。配列決定反応に
使用したオリゴヌクレオチド類を下記シーケンシングオ
リゴヌクレオチド表に列挙する。
C−ファミリー セロビオヒドロラーゼ配列決定用プラ
イマー F−ファミリー セルラーゼ特異的配列決定用プライマ
C−ファミリーエンドグルカナーゼ特異的配列決定用プ
ライマー 完全鎖長cDNAクローンのDNA配列ならびに誘導される
アミノ酸配列を、添付図11(C−ファミリー セロビオ
ヒドロラーゼ)、同12(F−ファミリー セルラーゼ)
および同13(C−ファミリーエンドグルカナーゼ)に示
す。
実施例4 エッチ・インソレンス(H.insolens)に由来するエンド
グルカナーゼEGI遺伝子の単離 実施例1に記載したcDNAライブラリーを、配列: のアンチセンス構造の35bpオリゴヌクレオチドプローグ
でもスクリーニングした。
この配列は、H.insolensにおける本発明者らのコドン
の偏りの知見を利用し、その微生物から精製されたEGI
アルカラーゼフラグメントのアミノ酸配列から誘導し
た。1.6kbの完全なクローンは、図14A−Eに示されるよ
うに1.3kbの完全なコーディング配列を含んでいた。こ
のプローブ配列NOR−770は、Met344−Ala355に位置して
いた。
EGI(完全鎖長)およびEGI′(短縮鎖長)の発現プラス
ミドの構築 図2に概述されるように、ポリAテールをさらに含む
EGI遺伝子をエー・オリーゼ(A.oryzae)発現プラスミ
ドに挿入した。EGIのコーティング領域を、開始Metコド
ン中のNco I部位からpHW480由来の1450bpフラグメント
のようなポリA領域のBamH I部位下流まで切除した。こ
れを、TAKAプロモーターとpUC19の大部分を含むpSX224
由来の3.6kb Nco I−Nar Iフラグメント、およびAMGタ
ーミネーターと共に残余部を含む960bpのNar I−BamH I
フラグメントに連結した。この96bpフラグメントは、挿
入された遺伝子以外はp777(ヨーロッパ特許第238,023
号明細書に記載)と等価であるp960から採取した。こう
して得られた発現ベクターをpHW485と命名した。
ポリAテールをもたない完全鎖長EGI遺伝子による発
現プラスミドpHW704は図3に示す。BstE II部位から下
流のNco I部位の1300bpが、そのベクターのBgl IIの部
位に連結された102bpのBstE II−BamH Iリンカー(2645
/2646)に挿入された。このリンカーは、末端とCBDおよ
びB領域の付加に使用するC末端に近いPvu I部位に2
つの停止コドンを有するBstE II部位の下流コーディン
グ領域を含む。
短縮EGI′遺伝子を有する発現プラスミドpHW697は、6
9bpのBstE II−BamH Iリンカー(2492/2493)を使用し
て同様に構築された。このリンカーでは、本発明者らは
Val421をLeu421に代えたPst1部位を挿入し、そして少な
くとも13個のアミノ酸のコーディング領域:K423PKPKPGH
GPRSD435を除去した。むしろあまり有用でない配列を有
する短いテールは、A領域およびB領域のわずかに上流
のT.reeseiで見られるものに対応するC末端を切除して
EGI′を提供した。
〜43kDエンドグルカナーゼ由来のCBDおよびB領域がC
末端に付加されたEGI′の発現プラスミドの構築 デンマーク特許出願第736/91号明細書に記載されるエ
イチ・イソレンス(H.isolens)の〜43kDエンドグルカ
ナーゼは、良好な洗浄特性を示した。触媒ドメインのほ
かに、43kDセルラーゼはC−末端CBDとB領域を有する
ので、この領域をEGI′(それ自体CBDまたはB領域をも
たない)に移した。この構築は、図4に概述されるよう
に2工程で行った。43kDセルラーゼのB領域にEGI′の
C末端を結合することが意図されているPst I−Hinc II
リンカー(028/030M)を、PSX320中の43kDセルラーゼ遺
伝子由来のC末端Hinc2−EcoR I 100bpフラグメントと
共にPst I−EcoR IでpUC19にサブクローニングした(図
5;DK736/91の記載に従う)。サブクローンpHW767からCB
DおよびB領域を、250bpのPst I−Bgl IIフラグメント
として切り取り、5.7kbのpHW485(図2)のBstE II−Bg
l IIフラグメントとpHW697(図3)由来の残在するBstE
II−Pst Iフラグメント55bpに連結した。得られた発現
プラスミドpHW768は、EGI′のGln422に付加された〜43k
DエンドグルカナーゼのCBDおよびB領域を有する。
〜43kDエンドグルカナーゼ由来のCBDおよびB領域がC
末端に付加されたEGIの発現プラスミドの構築 このプラスミドは、このケースではC末端リンカーが
EGIの完全配列を提供すること以外は、pHW768と同様に
構築された。図3に3段階の工程を示す。Pvu I−Hinc
IIリンカー(040M/041M)をpUC18にサブクローニングし
てpHW775を得た。pHW755中に、pSX320(図5)由来のHi
nc II−EcoR Iの1000bpフラグメントを挿入してpHW776
を得た。これからCBDおよびB領域を、250bpのPvu I−B
gl IIフラグメントとして切り取り、次いでpHW485(図
2)由来の5.7kbのBstE II−Bgl IIフラグメントとpHW7
04(図3)由来の90bpのBstE II−Pvu1フラグメントに
連結した。得られた発現プラスミドpHW777は、完全なEG
I配列中のAsp435に付加された〜43kDエンドグルカナー
ゼのCBDおよびB領域を含む。
〜43kDエンドグルカナーゼ由来のCBDおよびB領域を含
むEGIおよびEGI′と含まないもののエー・オリーゼ(A.
oryzae)による発現 実施例2に記載したように、発現プラスミドpHW485,p
HW704,pHW697,pHW768およびpHW777でA.oryzae IFO 4177
を形質転換した。前記のようにYPD培地で生育させた形
質転換体に由来する上澄を、SDS−PAGEで分析した(も
とのEGIは見かけMw53kDを示す)。EGI′は予想されるよ
うにわずかに小さな分子量を示し、そしてCBDとB領域
が付加された種は、一定の糖の付加と共にCBDおよびB
領域の大きさに対応して分子量が増大する。〜43kDのエ
ンドグルカナーゼに対して産生されるポリクローナル抗
体AS169は、〜43kDのCBDおよびB領域が付加されたEGI
とEGI′だけを認識した。一方、H.insolens由来のセル
ラーゼ調製物に対して産生されたポリクローナル抗体AS
78は、4種のすべてを認識した。カルボキシメチルセル
ロース形態の可溶性セルロースについて測定したとこ
ろ、4種すべてがエンドグルカナーゼ活性を示した。
リンカー 実施例5 異なるCBDおよびB領域を含む〜43kDのエンドグルカナ
ーゼ A領域クローン由来の各種CBDおよびB領域の〜43kD
エンドグルカナーゼに対する影響を試験するために、本
発明者らは〜43kDエンドグルカナーゼのオリジナルCBD
およびB領域を他のC−末端CBD類およびB領域類、す
なわちA−1,A−8,A−9,A−11およびおよびA−19(実
施例1、参照)で置き換えた。また、作用を試験するた
めに、本発明者らは43kDエンドグルカナーゼのB領域を
削除した構成物も創製した。
フラグメント: すべてのフラグメントは、製造元の指示に従い、(Pe
rkin−Elmer/Cetus)パーキン・エルマー/シータスDNA
アンプリフィケーションシステム(Amplification Syst
em)を使用するPCR増幅によって作製した。
1)PCRフラグメントは、pSX320(図5)のBam H I部位
の上流56bpから〜43kDエンドグルカナーゼ遺伝子のコー
ディング領域内の717bpまでのDNAをカバーし、そして同
時に、B領域の非常に初期のコーディング領域の708位
にKpn I部位と702位にSma I部位を導入するように作製
された。このPCRフラグメントは、プライマーNOR1542と
NOR3010(下記オリゴヌクレオチドの一覧を参照)で作
製した。
2)PCRフラグメントは、1)で導入されたKpn I部位と
共にフレーム中のB領域の非常に初期にKpn I部位が導
入されているA−1のCBDおよびB領域を含み、そして
遺伝子のコーディング領域の下流にXho I部位を導入す
るように作製された。使用したプライマー:NOR3012上流
およびNOR3011下流。
3)PCRフラグメントがA−8由来のCBDおよびB領域を
カバーし、そして発現ベクターのXho I部位が遺伝子の
下流にあることを除き、2)と同様。プライマー:NOR30
17およびNOR2516。
4)プライマーがA−9由来のCBDおよびB領域をカバ
ーするNOR3016およびNOR3015であること以外、2)と同
様。
5)プライマーがA−11由来のCBDおよびB領域をカバ
ーするNOR3021およびNOR2516であること以外、3)と同
様。
6)プライマーがA−19由来のCBDおよびB領域をカバ
ーするNOR3032およびNOR3022であること以外、2)と同
様。
7)〜43kDエンドグルカナーゼ由来のCBDを含み、そし
てpSX320上の遺伝子に由来するXho I部位の下流がB領
域の非常に後期にPvu II部位を導入しているPCRフラグ
メント。
プライマー:NOR3023およびNOR2516。
組み合わせ: 1)+2)は、pToC68(DK736/91に記載されている)
のBamH I−Xho I中に、BamH I−Kpn IおよびKpn I−Xho
Iとして挿入されているので、43kDのコアー酵素をA−
1由来のCBDおよびB領域と共にコードする。
1)+3):A−8CBD/B領域と共に43kD酵素を提供するこ
と以外、前記と同様。
1)+4):A−9CBDおよびB領域を含むこと以外、前記
と同様。
1)+5):A−11CBDおよびB領域を含むこと以外、前
記と同様。
1)+6):A−19CBDおよびB領域を含むこと以外前記
と同様。
1)+7)は、pToC68のBamH I−Xho Iに、BamH I−Sma
IおよびPvu II−Xho Iとして挿入されているので、B
領域を含まない43kD酵素をコードする。
オリゴヌクレオチド類: 実施例6 糸状菌CBDへの細菌触媒ドメインの融合 バチルス・ロータス(Bacillus lautus)NCIMB40250
(PCT/DK91/00013に記載)によって生産されるエンドグ
ルカナーゼEndo 1は、触媒ドメイン(コア)(Ala(3
2)−Val(555))とビー・ズブチリス(B.subtilis)
エンドグルカナーゼ(R.M.Mackayら、1986,Nucleic Aci
ds Res.14,9159〜70)のCBDに相同的なC末端セルロー
スバインディングドメイン(CBD)(Gln556−Pro700)
からなる。酵素が、CMC分解性コア酵を産生するB.subti
llisまたはE.coliで発現される場合には、前記CBDはタ
ンパク質分解的に開裂される。この例では、このコアタ
ンパク質は、フミコーラインソレンス(Humicola insol
ens)(DK736/91に記載)由来の〜43kDエンドグルカナ
ーゼのB領域とCBDと融合された。
融合物の構築 〜43kDエンドグルカナーゼをコードするcDNA遺伝子を
含むプラスミドpCaHj170は、図7に示すように構築し
た。pCaHj170をXho IIおよびSal Iで消化した。223bpの
Xho II−Sal Iフラグメントを単離し、次いでBamH Iお
よびSal Iで消化したpUC19(Yanisch−Perronら、1985,
Gene 33,103〜119)に連結した。このXho II−BamH I連
結によりBamH I部位を再生した。得られたプラスミド
(IM2)を、EcoR1およびBamH Iで消化し、次のリンカー
NOR3045−NOR3046と連結した。
こうして得られたプラスミド(IM3)は、EcoR Vおよ
びSac IIで消化し、445bp Hinc II−Sac IIのpPL517フ
ラグメントに連結した。pPL517は、完全なバチルス(Ba
cillus)Endo 1遺伝子を含む(PCT/DK91/00013)。この
連結生成物を、IM4と命名した。43kdalエンドグルカナ
ーゼ由来の糸状菌シグナルペプチドでバチルスのEndo 1
シグナルペプチドを置き換えるために、4種のPCRプラ
イマーを、“スプライシングバイオバーラップエキステ
ンション(Splicing by Overlap Extension)”(SOE)
融合用に設計した(R.M.Hortonら、(1989):Gene,77,6
1〜68)。5′プライマーNOR3270および3′プライマー
NOR3275を使用し、プラスミドpCaHj109(DK 736/91)由
来の43kDシグナル配列を増幅し、5′末端のBcl I部位
にそしてバチルスendo 1遺伝子と21bp相同体を3′末端
に導入した。43kdal遺伝子に21bpの相同性を導入する
5′プライマーNOR3276およびSac II部位をカバーする
3′プライマーNOR3271を使用して、特有のSac II部位
までのEndo I遺伝子5′部分を増幅した。これらの2つ
のPCRフラグメントを混合し、溶融し、アニール化し次
いでtaqポリメラーゼで埋めた(図9)。得られたハイ
ブリッドを、プライマーNOR3270およびNOR3271を使用し
て増幅した。ハイブリッドフラグメントを、Bc1およびS
ac IIで消化し、IM4に由来する676bpのSac II−Sal Iフ
ラグメントに連結し、アスペルギルス(Aspergillus)
発現ベクターpToc68(DK736/91)をBamH Iで消化した。
この連結生成物、pCaHj180(図10)、は43kDシグナルペ
プチドをコードする読み取り枠を含め、そして成熟〜43
kDエンドグルカナーゼの最初の4つのN末端アミノ酸
(Met(1)−Arg(25))をEndo 1のコア(Ser(34)
−Val(549))に融合し、次いで43kDのB領域およびCB
D(Ile(233)−Leu(285))にペプチドIle−Ser−Glu
(リンカーによってコードされている)を融合した。pC
aHj180は、ヨーロッパ特許出願公開第238,023号明細書
に記載されるようにpToC90との同時形質転換によるアセ
トアミド上の選択を使用してアスペルギルスオリーゼ
(Aspergillus oryzae)の形質転換に使用した。
Endo 1コアならびに〜43kDのCBDおよびB領域の配列
は、添付の図15A−Dに示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12N 15/09 ZNA C12R 1:77) C12R 1:645) 1:645) (72)発明者 ヒョルト,カーステン マイランド デンマーク国,デーコー―4000 ロスキ ルデ,スボゲルスレフ,ガーセアゲレン 43 (72)発明者 ハストルプ,スベン デンマーク国,デーコー―2400 コペン ハーゲン エンベー,3テーホー,フレ デリクスボルグバイ 10 (56)参考文献 特開 昭60−149387(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/56 C12N 9/42 BIOSIS(DIALOG) MEDLINE(STN) WPI(DIALOG)

Claims (69)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】トリコデルマ(Trichoderma)またはファ
    ネロシエーテ(Phanerochaete)にとって生来的でな
    い、単離されたセルロース−又はヘミセルロース分解酵
    素であって、触媒活性ドメイン、炭水化物バインディン
    グドメイン及び連結B領域を含んで成り、この連結B領
    域は前記触媒活性ドメインと炭水化物バインディングド
    メインとを連結しており、ここで前記炭水化物バインデ
    ィングドメインが次のコアー配列: (上記配列中、 1位におけるアミノ酸がTrpまたはTyrであり、 2位におけるアミノ酸がGlyまたはAlaであり、 7位におけるアミノ酸がGln,IleまたはAsnであり、 8位におけるアミノ酸がGlyまたはAsnであり、 9位におけるアミノ酸がTrp,PheまたはTyrであり、 10位におけるアミノ酸がSer,Asn,ThrまたはGlnであり、 12位におけるアミノ酸がPro,AlaまたはCysであり、 13位におけるアミノ酸がThr,ArgまたはLysであり、 14位におけるアミノ酸がThr,CysまたはAsnであり、 18位におけるアミノ酸がGlyまたはProであり、 19位におけるアミノ酸がSer,Thr,Phe,LeuまたはAlaであ
    るか、あるいは不存在であり、 20位におけるアミノ酸がThrまたはLysであり、 22位におけるアミノ酸がVal,Thr,Arg,GluまたはLysであ
    り、 23位におけるアミノ酸がLys,GlnまたはAlaであり、 24位におけるアミノ酸がGlnまたはIleであり、 26位におけるアミノ酸がGln,AspまたはAlaであり、 27位におけるアミノ酸がTrp,PheまたはTyrであり、 29位におけるアミノ酸がSer,His,TyrまたはAlaであり、 そして 32位におけるアミノ酸がLeu,Ile,Gln,ValまたはThrであ
    る) を有することを特徴とするセルロース又はヘミセルロー
    ス分解酵素。
  2. 【請求項2】前記炭水化物バインディングドメインが下
    記のコアー配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求
    項1に記載の酵素。
  3. 【請求項3】前記連結B領域が、下記配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求
    項1又は2に記載の酵素。
  4. 【請求項4】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ(Hu
    micola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプトラ
    (Myceliophtora)から成る群から選択された属に属す
    る株から得られる、請求項1〜3のいずれか1項に記載
    の酵素。
  5. 【請求項5】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ(Hu
    micola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプトラ
    (Myceliophtora)から成る群から選択された属に属す
    る株又は該株の同じ機能特性を有する変異株に内因性で
    ある、請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵素。
  6. 【請求項6】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ(Hu
    micola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプトラ
    (Myceliophthora)から成る群から選択された属に属す
    る株の変異株であって同じ機能特性を有するものに内因
    性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵素。
  7. 【請求項7】前記触媒活性ドメインが、天然には炭水化
    物バインディングドメインを含有しない酵素から得られ
    る、請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵素。
  8. 【請求項8】セルラーゼである、請求項1〜7のいずれ
    か1項に記載の酵素。
  9. 【請求項9】エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラー
    ゼ又はβ−グルコシダーゼである、請求項1〜7のいず
    れか1項に記載の酵素。
  10. 【請求項10】触媒活性ドメイン、炭水化物バインディ
    ングドメイン及び連結B領域を含んで成り、該連結B領
    域が前記触媒活性ドメインと炭水化物バインディングド
    メインとを作用可能に連結しており、そして前記連結B
    領域が下記アミノ酸配列: から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求
    項1に記載の酵素。
  11. 【請求項11】修飾されたセルロース−又はヘミセルロ
    ース分解酵素であって、触媒活性ドメイン、炭水化物バ
    インディングドメイン及び連結B領域を含んで成り、こ
    の連結B領域は前記触媒活性ドメインと炭水化物バイン
    ディングドメインとを連結しており、ここで前記炭水化
    物バインディングドメインが次のコアー配列: (上記配列中、 1位におけるアミノ酸がTrpまたはTyrであり、 2位におけるアミノ酸がGlyまたはAlaであり、 7位におけるアミノ酸がGln,IleまたはAsnであり、 8位におけるアミノ酸がGlyまたはAsnであり、 9位におけるアミノ酸がTrp,PheまたはTyrであり、 10位におけるアミノ酸がSer,Asn,ThrまたはGlnであり、 12位におけるアミノ酸がPro,AlaまたはCysであり、 13位におけるアミノ酸がThr,ArgまたはLysであり、 14位におけるアミノ酸がThr,CysまたはAsnであり、 18位におけるアミノ酸がGlyまたはProであり、 19位におけるアミノ酸がSer,Thr,Phe,LeuまたはAlaであ
    るか、あるいは不存在であり、 20位におけるアミノ酸がThrまたはLysであり、 22位におけるアミノ酸がVal,Thr,Arg,GluまたはLysであ
    り、 23位におけるアミノ酸がLys,GlnまたはAlaであり、 24位におけるアミノ酸がGlnまたはIleであり、 26位におけるアミノ酸がGln,AspまたはAlaであり、 27位におけるアミノ酸がTrp,PheまたはTyrであり、 29位におけるアミノ酸がSer,His,TyrまたはAlaであり、 そして 32位におけるアミノ酸がLeu,Ile,Gln,ValまたはThrであ
    る) を有することを特徴とするセルロース又はヘミセルロー
    ス分解酵素をコードするDNA。
  12. 【請求項12】前記炭水化物バインディングドメイン
    が、下記配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求
    項11に記載のDNA。
  13. 【請求項13】前記連結B領域が、下記配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求
    項11に記載のDNA。
  14. 【請求項14】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株から得られる、請求項11〜13のいずれか1項に
    記載のDNA。
  15. 【請求項15】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株又は該株の同じ機能特性を有する変異株に内因
    性である、請求項11〜13のいずれか1項に記載のDNA。
  16. 【請求項16】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株の変異株であって同じ機能特性を有するものに
    内因性である、請求項11〜13のいずれか1項に記載のDN
    A。
  17. 【請求項17】前記触媒活性ドメインが、天然には炭水
    化物バインディングドメインを含有しない酵素から得ら
    れる、請求項11〜16のいずれか1項に記載のDNA。
  18. 【請求項18】前記酵素がセルラーゼである、請求項11
    〜17のいずれか1項に記載のDNA。
  19. 【請求項19】前記酵素がエンドグルカナーゼ、セロビ
    オヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼである、請求項
    11〜17のいずれか1項に記載のDNA。
  20. 【請求項20】請求項11〜19のいずれか1項に記載のDN
    Aを含んで成る発現ベクター。
  21. 【請求項21】請求項20に記載の発現ベクターにより形
    質転換されており、ヘミセルロース又はセルロース分解
    酵素を発現する宿主細胞。
  22. 【請求項22】前記細胞がアスペルギルス(Aspergillu
    s)属の細胞である請求項21の細胞。
  23. 【請求項23】前記細胞が、アスペルギルス・ニガー
    (Aspergillus niger)又はアスペルギルス・オリゼー
    (Aspergillus oryzae)の細胞である請求項22の細胞。
  24. 【請求項24】前記細胞がサッカロミセス(Saccharomy
    ces)属の細胞である請求項21の細胞。
  25. 【請求項25】前記細胞が、サッカロミセス・セレビニ
    エー(Saccharomyces cerevisiae)の細胞である請求項
    24の細胞。
  26. 【請求項26】セルロース又はヘミセルロース分解酵素
    の生産方法であって、請求項21に記載の細胞を前記酵素
    の生産を行うことのできる条件下で培養し、次いで培養
    物から前記酵素を回収する方法。
  27. 【請求項27】修飾されたセルロース又はヘミセルロー
    ス分解酵素であって、触媒活性ドメイン、炭水化物バイ
    ンディングドメイン及び連結B領域を含んで成り、該連
    結B領域が前記触媒活性ドメインと炭水化物バインディ
    ングドメインとを作用可能に連結している酵素をコード
    するDNAであって、前記連結B領域が、下記の配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有することを
    特徴とするDNA。
  28. 【請求項28】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株から得られる、請求項27に記載のDNA。
  29. 【請求項29】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株又は該株の同じ機能特性を有する変異株に内因
    性である、請求項27に記載のDNA。
  30. 【請求項30】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株の変異株であって同じ機能特性を有するものに
    内因性である、請求項27に記載のDNA。
  31. 【請求項31】前記触媒活性ドメインが、天然には炭水
    化物バインディングドメインを含有しない酵素から得ら
    れる、請求項27に記載のDNA。
  32. 【請求項32】酵素がセルラーゼである、請求項27〜30
    のいずれか1項に記載のDNA。
  33. 【請求項33】前記酵素がエンドグルカナーゼ、セロビ
    オヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼである、請求項
    27〜30のいずれか1項に記載のDNA。
  34. 【請求項34】請求項27〜33のいずれか1項に記載のDN
    Aを含んで成る発現ベクター。
  35. 【請求項35】請求項34に記載の発現ベクターにより形
    質転換されており、ヘミセルロース又はセルロース分解
    酵素を発現する宿主細胞。
  36. 【請求項36】前記細胞がアスペルギルス(Aspergillu
    s)の細胞である請求項35の細胞。
  37. 【請求項37】前記細胞が、アスペルギルス・ニガー
    (Aspergillus niger)又はアスペルギルス・オリゼー
    (Aspergillus oryzae)の細胞である請求項36の細胞。
  38. 【請求項38】前記細胞がサッカロミセス(Saccharomy
    ces)属の細胞である請求項35の細胞。
  39. 【請求項39】前記細胞が、サッカロミセス・セレビニ
    エー(Saccharomyces cerevisiae)の細胞である請求項
    38の細胞。
  40. 【請求項40】セルロース又はヘミセルロース分解酵素
    の生産方法であって、請求項35に記載の細胞を前記酵素
    の生産を行うことのできる条件下で培養し、次いで培養
    物から前記酵素を回収する方法。
  41. 【請求項41】トリコデルマ(Trichoderma)又はファ
    ネロシエート(Phanerochaete)にとって生来的でない
    修飾されたセルロース又はヘミセルロース分解酵素であ
    って、触媒活性ドメイン、炭水化物バインディングドメ
    イン及び連結B領域を含んで成り、該連結B領域が前記
    触媒活性ドメインと炭水化物バインディングドメインと
    を作用可能に連結している酵素をコードするDNAであっ
    て、前記炭水化物バインディングドメインが、下記の配
    列: (上記配列中、 1位におけるアミノ酸がTrpまたはTyrであり、 2位におけるアミノ酸がGlyまたはAlaであり、 7位におけるアミノ酸がGln,IleまたはAsnであり、 8位におけるアミノ酸がGlyまたはAsnであり、 9位におけるアミノ酸がTrp,PheまたはTyrであり、 10位におけるアミノ酸がSer,Asn,ThrまたはGlnであり、 12位におけるアミノ酸がPro,AlaまたはCysであり、 13位におけるアミノ酸がThr,ArgまたはLysであり、 14位におけるアミノ酸がThr,CysまたはAsnであり、 18位におけるアミノ酸がGlyまたはProであり、 19位におけるアミノ酸がSer,Thr,Phe,LeuまたはAlaであ
    るか、あるいは不存在であり、 20位におけるアミノ酸がThrまたはLysであり、 22位におけるアミノ酸がVal,Thr,Arg,GluまたはLysであ
    り、 23位におけるアミノ酸がLys,GlnまたはAlaであり、 24位におけるアミノ酸がGlnまたはIleであり、 26位におけるアミノ酸がGln,AspまたはAlaであり、 27位におけるアミノ酸がTrp,PheまたはTyrであり、 29位におけるアミノ酸がSer,His,TyrまたはAlaであり、 そして/あるいは 32位におけるアミノ酸がLeu,Ile,Gln,ValまたはThrであ
    る) を有することを特徴とするDNA。
  42. 【請求項42】前記炭水化物バインディングドメイン
    が、下記のコアー配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求
    項41に記載のDNA。
  43. 【請求項43】前記連結B領域が、下記の配列: から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求
    項41に記載のDNA。
  44. 【請求項44】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から成る群から選択
    された属に属する株から得られる、請求項41〜43のいず
    れか1項に記載のDNA。
  45. 【請求項45】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から成る群から選択
    された属に属する株又は該株の同じ機能特性を有する変
    異株に内因性である、請求項41〜43のいずれか1項に記
    載のDNA。
  46. 【請求項46】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から成る群から選択
    された属に属する株の変異株であって同じ機能特性を有
    するものに内因性である、請求項41〜43のいずれか1項
    に記載のDNA。
  47. 【請求項47】酵素がセルラーゼであり、請求項41〜46
    のいずれか1項に記載のDNA。
  48. 【請求項48】酵素がエンドグルカナーゼ、セロビオヒ
    ドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼである、請求項41〜
    46のいずれか1項に記載のDNA。
  49. 【請求項49】トリコデルマ(Trichoderma)またはフ
    ァネロシェーテ(Phanerochaete)にとって生来的でな
    い、単離されたセルロース−又はヘミセルロース分解酵
    素であって、触媒活性ドメイン、炭水化物バインディン
    グドメイン及び連結Bドメインを含んで成り、この連結
    Bドメインは前記触媒活性ドメインと炭水化物バインデ
    ィングドメインとを連結している酵素をコードするDNA
    であって、前記連結B領域が次のコアー配列: から成る群から選択されるアミノ酸配列を有することを
    特徴とするDNA。
  50. 【請求項50】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株から得られる、請求項49に記載のDNA。
  51. 【請求項51】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株又は該株の同じ機能特性を有する変異株に内因
    性である、請求項49に記載のDNA。
  52. 【請求項52】前記触媒活性ドメインが、フミコーラ
    (Humicola)、フザリウム(Fusarium)及びミセリオプ
    トラ(Myceliophtora)から成る群から選択された属に
    属する株の変異株であって同じ機能特性を有するものに
    内因性である、請求項49に記載のDNA。
  53. 【請求項53】前記触媒活性ドメインが、天然には炭水
    化物バインディングドメインを含有しない酵素から得ら
    れる、請求項49〜52のいずれか1項に記載のDNA。
  54. 【請求項54】前記酵素がセルラーゼである、請求項49
    〜52のいずれか1項に記載のDNA。
  55. 【請求項55】前記酵素がエンドグルカナーゼ、セロビ
    オヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼである、請求項
    49〜52のいずれか1項に記載のDNA。
  56. 【請求項56】請求項49〜55のいずれか1項に記載のDN
    Aを含んで成る発現ベクター。
  57. 【請求項57】請求項56に記載の発現ベクターにより形
    質転換されており、ヘミセルロース又はセルロース分解
    酵素を発現する宿主細胞。
  58. 【請求項58】前記細胞がアスペルギルス(Aspergillu
    s)属の細胞である請求項57の細胞。
  59. 【請求項59】前記細胞が、アスペルギルス・ニガー
    (Aspergillus niger)又はアスペルギルス・オリゼー
    (Aspergillus oryzae)の細胞である請求項58の細胞。
  60. 【請求項60】前記細胞がサッカロミセス(Saccharomy
    ces)属の細胞である請求項57の細胞。
  61. 【請求項61】前記細胞が、サッカロミセス・セレビニ
    エー(Saccharomyces cerevisiae)の細胞である請求項
    60の細胞。
  62. 【請求項62】セルロース又はヘミセルロース分解酵素
    の生産方法であって、請求項57に記載の細胞を前記酵素
    の生産を行うことのできる条件下で培養し、次いで培養
    物から前記酵素を回収する方法。
  63. 【請求項63】請求項15〜49のいずれか1項に記載のDN
    Aを含んで成る発現ベクター。
  64. 【請求項64】請求項63に記載の発現ベクターにより形
    質転換されており、ヘミセルロース又はセルロース分解
    酵素を発現する宿主細胞。
  65. 【請求項65】前記細胞がアスペルギルス(Aspergillu
    s)属の細胞である請求項64の細胞。
  66. 【請求項66】前記細胞が、アスペルギルス・ニガー
    (Aspergillus niger)又はアスペルギルス・オリゼー
    (Aspergillus oryzae)の細胞である請求項65の細胞。
  67. 【請求項67】前記細胞がサッカロミセス(Saccharomy
    ces)属の細胞である請求項64の細胞。
  68. 【請求項68】前記細胞が、サッカロミセス・セレビニ
    エー(Saccharomyces cerevisiae)の細胞である請求項
    67の細胞。
  69. 【請求項69】セルロース又はヘミセルロース分解酵素
    の生産方法であって、請求項64に記載の細胞を前記酵素
    の生産を行うことのできる条件下で培養し、次いで培養
    物から前記酵素を回収する方法。
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