KR20040029122A - 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분 - Google Patents

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마이클 비. 라나한
쉬브 산카 바수
크리스토퍼 제이. 바티
웬 첸
조이스 크라이그
마크 킨케마
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Abstract

본 발명은 식물에서의 발현에 대해 최적화된 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 합성 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 적합한 활성화 조건 하에 활성화시켜 목적 기질에 작용하는 중온성, 호열성, 또는 초호열성 프로세싱 효소를 코딩한다. 또한, 하나 이상의 이들 효소를 발현하고 식물 및 곡물 프로세싱을 촉진하는 개질된 조성물을 갖는 "자가-프로세싱" 유전자이전 식물, 및 식물 부분, 예컨대 곡물을 제공한다. 이들 식물의 제조 방법 및 사용 방법, 예컨대 개선된 맛을 갖는 식품의 제조 방법 및 에탄올 및 발효 음료 제조용 발효가능한 기질의 제조 방법을 또한 제공한다.

Description

자가-프로세싱 식물 및 식물 부분 {Self-Processing Plants and Plant Parts}
<관련 출원>
본 출원은 2001년 8월 27일자로 출원된 미국 출원 번호 제60/315,281호를 우선권으로 주장하며, 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
효소는 나무, 열매, 야채, 전분 및 쥬스 등과 같은 다양한 농산물을 가공하는 데 사용된다. 통상적으로, 프로세싱 효소는 미생물 발효 (바실러스 (Bacillus) α-아밀라제), 또는 식물로부터의 단리 (커피 β-갈락토시다제 또는 식물 부분으로부터의 파파인)와 같은 다양한 출처로부터 산업적 규모로 생산 및 회수된다. 효소 제제는 효소와 기질을 적당한 습도, 온도, 시간 및 기계적 혼합 조건 하에서, 효소 반응이 상업적으로 허용되는 방식으로 달성되도록 혼합함으로써 다양한 가공 분야에 사용되고 있다. 이 방법은 효소 생산, 효소 제제의 제조, 효소와 기질의 혼합,및 상기 혼합물의 적당한 효소 반응 촉진 조건에의 적용이라는 개별 단계를 포함한다. 시간 소모, 에너지 소모, 혼합 공정, 자본 지출 및(또는) 효소 생산 비용을 감소시키거나 없애는 방법, 또는 개선되거나 신규한 산물을 제조하게끔 하는 방법은 유용하고 유익할 것이다. 그러한 개선이 필요한 예로는 옥수수 제분 분야가 있다.
현재, 옥수수를 제분하여 콘스타치 및 기타 콘-제분 부산물, 예를 들어 옥수수 글루텐 사료, 옥수수 글루텐 가루 및 옥수수 오일을 얻고 있다. 이 공정으로부터 얻은 전분은 종종 유도체화 전분 및 당과 같은 다른 산물로 추가 가공되거나, 또는 발효를 통해 알콜 또는 락트산을 비롯한 다양한 산물로 제조된다. 콘스타치의 가공은 종종 효소, 특히 전분을 발효가능한 당 또는 프락토스로 가수분해 및 전환시키는 효소 (α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제 및 글루코스 이소메라제 등)의 사용을 포함한다. 현재 상업적으로 이용되는 공정은, 적당한 비용 효율성을 위해 필요한 규모로 옥수수를 가공하는 데에 대규모의 제분 장치를 구축해야하기 때문에 자본 집약적이다. 또한, 상기 공정은 전분-가수분해 또는 개질 효소를 제조하는 별도의 단계를 필요로 하며, 그 후 가수분해된 전분 산물을 제조하기 위해 효소와 기질을 혼합하는 기계를 필요로 한다.
옥수수 곡물로부터 전분을 회수하는 방법은 공지되어 있으며, 이는 습식 제분 공정을 포함한다. 옥수수 습식 제분은 옥수수 낟알을 침지시키는 단계, 옥수수 낟알을 분쇄하는 단계, 및 낟알의 성분을 분리하는 단계를 포함한다. 낟알은 약 120℉ (48.9℃)의 물이 향류하는 침지 탱크 중에 침지되며, 낟알은 침지 탱크에서24 내지 48시간 동안 유지된다. 침지수는 통상 약 0.2 중량% 농도의 이산화황을 함유한다. 이산화황은 미생물 성장 감소를 돕고, 또한 내배유 단백질의 이황결합을 감소시켜 보다 효율적인 전분-단백질 분리를 촉진하기 위해 상기 공정에 사용된다. 일반적으로, 옥수수 1 부셸 (bushel; 8 갤런) 당 약 0.59 갤런 (2.23 ℓ)의 침지수가 사용된다. 침지수는 폐액으로 간주되며, 종종 바람직하지 않은 양의 잔류 이산화황을 함유한다.
침치된 낟알은 그 후에 탈수되고, 마찰형 밀의 세트들에 가해진다. 제1 마찰형 밀 세트는 낟알을 파열시켜 낟알의 나머지로부터 배(胚)가 방출되도록 한다. 습식 제분 산업에 적합한 상업적인 마찰형 밀은 바우어 (Bauer)라는 상표명으로 판매되고 있다. 이어서, 원심분리를 이용하여 낟알의 나머지로부터 배를 분리한다. 통상적인 상업용 원심분리기로는 머코 (Merco) 원심분리기가 있다. 마찰형 밀 및 원심분리기는 에너지를 사용하여 작동되는 매우 값비싼 품목들이다.
공정의 다음 단계에서는, 전분, 외피, 섬유 및 글루텐을 포함하는 잔여 낟알 성분들을 다른 마찰 밀 세트에 가하고, 세척 스크린 세트를 통과시킴으로써, 전분 및 글루텐 (내배유 단백질)으로부터 섬유 성분들을 분리한다. 전분 및 글루텐은 스크린을 통과하지만 섬유는 통과하지 않는다. 원심 분리 또는 제3 분쇄 이후에 원심분리를 수행하여, 내배유 단백질로부터 전분을 분리한다. 원심분리에 의해 전분 슬러리가 생성되는데, 이 슬러리를 탈수시킨 후에 신선한 물로 세척하고 습도가 약 12%가 되도록 건조시킨다. 실질적으로 순수한 전분은 통상 효소를 사용하여 추가로 가공한다.
종자 껍질, 배 및 내배유 단백질을 제거하면, 전분을 프로세싱 효소와 효율적으로 접촉시킬 수 있고, 생성된 가수분해 산물에 다른 낟알 성분들로부터의 오염물이 비교적 없기 때문에, 곡물의 다른 성분들로부터 전분을 분리하는 공정을 수행한다. 또한 이와 같이 분리하면, 곡물의 다른 성분들이 효과적으로 회수되고, 이후에 밀로부터의 수익을 증가시키는 부산물로서 이를 판매할 수 있다.
전분이 습식 제분 공정으로부터 회수된 후에, 통상 이 전분은 말토덱스트린 제조를 위해 젤라틴화 단계, 액화 단계 및 덱스트린화 단계를 거치게 되고, 그 이후에 글루코스, 말토스 및 프락토스 제조를 위해 당화 단계, 이성질체화 단계 및 정제 단계를 거치게 된다.
현재 입수가능한 효소는 결정질 전분을 신속하게 가수분해할 수 없기 때문에, 전분의 가수분해에 젤라틴화 단계를 이용한다. 가수분해 효소가 전분을 이용하도록 하기 위해, 전분은 통상 물과의 슬러리 (20 내지 40%의 건조 고체)로 만들어지며, 적당한 겔형성 온도로 가열된다. 콘스타치의 경우 겔형성 온도는 105 내지 110℃이다. 젤라틴화된 전분은 통상 점도가 매우 높기 때문에, 액화라 불리우는 다음 단계에서 점도를 낮춘다. 액화는 전분의 글루코스 분자들 사이에 있는 결합을 일부 파괴하는 것으로, 효소적 방법으로 수행하거나 산을 이용하여 수행한다. 열 안정성 엔도 α-아밀라제 효소를 이 단계 및 이후의 덱스트린화 단계에 사용한다. 가수분해 정도는 목적하는 덱스트로스 백분율의 가수분해 산물을 수득하기 위해 덱스트린화 단계에서 조절된다.
액화 단계를 거친 덱스트린 산물의 추가 가수분해는 다수의 상이한 엑소-아밀라제 및 탈분지화 효소에 의해, 원하는 산물의 종류에 따라 수행한다. 그리고 마지막으로, 프락토스를 원하는 경우에는 통상 고정된 글루코스 이소메라제 효소를 사용하여 글루코스를 프락토스로 전환시킨다.
콘스타치로부터 발효가능한 당 (및, 예를 들어 이후의 에탄올)을 제조하는 건식 제분 공정은 외인성 효소의 전분과의 효율적인 접촉을 촉진한다. 이러한 공정은 습식 제분에 비해 자본 집약성은 낮지만, 종종 이들 공정으로부터 유도된 부산물이 습식 제분으로부터 유도된 부산물만큼 가치가 없기 때문에, 상당한 비용상의 이점이 여전히 요망되고 있다. 예를 들어 건식 옥수수 제분에 있어서, 낟알을 분말로 분쇄하여 분해 효소에 의한 전분의 효율적인 접촉을 촉진한다. 옥수수 가루의 효소 가수분해 후에 얻어진 잔류 고체는 단백질 및 몇몇 다른 성분들을 함유하기 때문에, 상당한 사료적 가치가 있다. 최근, 에크호프 (Eckhoff)는 논문 ["Fermentation and costs of fuel ethanol from corn with quick-germ process" (Appl. Biochem. Biotechnol., 94: 41 (2001)]에 건식 제분에 대한 잠재적 개선 가능성 및 관련 쟁점들에 대해 기재한 바 있다. "속성 배 (quick germ)" 방법은 침지 시간을 단축시키고도 전분으로부터 오일-풍부 배의 분리를 가능하게 한다.
식물에서 내인성 프로세싱 효소의 조절 및(또는) 상기 효소의 양에 의해 원하는 산물을 생성할 수 있는 한 예로는 스위트 옥수수 (sweet corn)가 있다. 통상적인 스위트 옥수수 품종은 스위트 옥수수가 전분 생합성을 정상적인 양으로 수행할 수 없다는 사실에 의해 야생 옥수수 품종과 구별된다. 통상적으로, 전분 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자에서의 유전자 돌연변이를 스위트 옥수수 품종에 이용하여 전분 생합성을 제한한다. 그러한 돌연변이로는 전분 신타제 및 ADP-글루코스 포스포릴라제를 코딩하는 유전자에 있어서의 돌연변이 (예를 들어, 슈가리 (sugary) 및 수퍼-스위트 돌연변이)가 있다. 신선한 식용 옥수수의 소비자들이 원하는 맛 좋은 감미를 제조하는 데 필수적인 단순한 당인 프락토스, 글루코스 및 수크로스는 그러한 돌연변이체의 발생중인 내배유에 축적된다. 그러나, 전분 축적량이 너무 많으면 (예를 들어, 옥수수가 너무 오랫동안 (수확 후기까지) 성숙한 채로 남아 있는 경우, 또는 옥수수가 소비되기 전에 너무 오랜 기간 동안 보관되는 경우), 그러한 산물은 감미성을 손실하여 전분의 맛과 미각만을 나타낸다. 따라서, 스위트 옥수수의 수확 기간 범위는 매우 협소하고 저장 수명이 제한되어 있다.
스위트 옥수수 품종을 경작하는 농장주가 직면하는 다른 중요한 단점은 이들 품종의 유용성이 식용 음식으로만 제한된다는 것이다. 농장주가 종자 발생 동안에 식용 음식으로 사용하기 위해 스위트 옥수수를 미리 수확하려고 하면, 이 농작물은 본질적으로 손실될 것이다. 스위트 옥수수의 곡물 수율 및 품질은 2가지 기본적인 이유 때문에 불량하다. 첫번째 이유는 전분 생합성 경로의 돌연변이가 전분 생합성 기구를 무능력하게 만들어 곡물이 완전하게 재배되지 않기 때문에, 수율과 품질이 손상된다는 것이다. 두번째 이유는, 곡물에 당이 다량으로 존재하고 이들 당을 전분으로서 분리해 낼 수 없기 때문에, 종자의 전반적인 침수 강도 (sink strength)이 감소하여 곡류 내의 영양분 저장량이 감소한다는 것이다. 스위트 옥수수 품종의 내배유는 수축하여 붕괴되고, 적당한 탈수 작용을 거칠 수 없으며, 질병에 걸리기 쉽다. 스위트 옥수수 곡류의 품질이 불량하다는 것은, 종자 생존률 불량, 발아 불량, 묘목의 질병 이환율, 및 부적절한 전분 축적에 의해 유발된 인자들의 조합으로 인한 초기 묘목 생장력 불량이라는 추가의 농업적 내포 의미를 갖는다. 따라서, 불량한 품질은 소비자, 농장주/경작자, 중간 분배상 및 종자 생산자에게 악영향을 끼친다.
따라서, 건식 제분의 경우에는 공정의 효율성를 개선시키고(시키거나) 부산물의 가치를 증가시키는 방법이 필요한 실정이다. 습식 제분의 경우에는 장기간의 침지, 분쇄, 제분 및(또는) 낟알 성분들의 분리에 필수적인 장비들을 필요로 하지 않는 전분 가공 방법이 필요한 실정이다. 예를 들어, 습식 제분에서의 침지 단계를 변형시키거나 제거하는 방법이 요구되고 있는데, 이와 같은 단계의 변형이나 제거가 처분에 필요한 폐수의 양을 감소시킴으로써, 에너지와 시간 소모를 줄여주고 제분 용량을 증가 (낟알이 침지 탱크에 있는 시간이 줄어듬)시킬 수 있기 때문이다. 또한, 배로부터 전분-함유 내배유를 분리하는 공정을 제거하거나 개선시키는 것도 요구되고 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분, 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분 효소(들) (중온성, 호열성, 및(또는) 초호열성 효소)을 발현하고 활성화시킬 수 있다. 효소(들) (중온성, 호열성 또는 초호열성)의 활성화시, 상기 식물 또는 식물 부분은 원하는 결과를 얻기 위해 작용할 때 기질을 자가-프로세싱시킬 수 있다.
본 발명은 a) 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 또는 59 또는 이들의 상보물, 또는 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 또는 59 중 어느 하나의 상보물과 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 b) 서열 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 또는 51을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 효소적 활성 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하며, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 제2 펩티드가 제1 폴리펩티드를 식물의 액포, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 종자 또는 세포벽으로 표적화시킬 수 있는 신호 서열 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 신호 서열은 왁시 (waxy)로부터 유도된 N-말단 신호 서열, γ-제인 (zein)으로부터 유도된 N-말단 신호 서열, 전분 결합 도메인, 또는 C-말단 전분 결합 도메인일 수 있다. 서열 2, 9 또는 52 중 어느 하나의 상보물과 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며, α-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열 4 또는 25의 상보물과 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며, 풀루란아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열 6의 상보물과 혼성화되며, α-글루코시다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열 19, 21, 37, 39, 41 또는 43 중 어느 하나의 상보물과 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며, 글루코스 이소메라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열 46, 48, 50 또는 59 중 어느 하나의 상보물과 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 고려된다.
또한, 본 발명은 a) 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 또는 59를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보물, 또는 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 또는 59 중 어느 하나의 상보물과 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 b) 서열 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 또는 51을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 효소적 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 카세트가 유도가능한 프로모터, 조직-특이성 프로모터, 또는 바람직하게는 내배유-특이성 프로모터와 같이 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 내배유-특이성 프로모터가 옥수수 γ-제인 프로모터 또는 옥수수 ADP-gpp 프로모터이다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 서열 11 또는 서열 12를 포함한다. 또한 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 대해 센스 배향으로 배향되어 있다. 본 발명의 발현 카세트는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 신호 서열을 추가로 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 신호 서열은 작동적으로 연결된 폴리펩티드를 식물의 액포, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 종자 또는 세포벽으로 표적화시킨다. 바람직한 신호 서열로는 왁시로부터 유도된 N-말단 신호 서열, γ-제인으로부터 유도된 N-말단 신호 서열, 또는 전분 결합 도메인이 포함된다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 세포에 관한 것이다. 세포는 아그로박테륨 (Agrobacterium), 단자엽 (monocot) 세포, 쌍자엽 (dicot) 세포, 백합강 (Liliopsida) 세포, 기장아과 (Panicoideae) 세포, 옥수수 세포, 및 곡류 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 세포가 옥수수 세포이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터로 안정하게 형질전환된 식물을 포함한다. 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 또는 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 2 또는 9 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-아밀라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물이 제공된다. 바람직하게는, α-아밀라제가 초호열성이다.
다른 실시양태에서, 서열 24 또는 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 4 또는 25 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 풀루란아제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물이 제공된다. 서열 26 또는 27 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 6을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-글루코시다제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물이 추가로 제공된다. 바람직하게는, α-글루코시다제가 초호열성이다. 서열 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42 또는 44 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 19, 21, 37, 39, 41 또는 43 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코스 이소메라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물이 본원에 추가로 기재된다. 바람직하게는, 글루코스 이소메라제가 초호열성이다. 다른 실시양태에서, 서열 45, 47 또는 49 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 46, 48, 50 또는 59 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코스 아밀라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물이 기재되어 있다. 바람직하게는, 글루코스 아밀라제가 초호열성이다.
본 발명의 안정하게 형질전환된 식물로부터 얻은 종자, 열매 또는 곡물과 같은 식물 산물이 추가로 제공된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물에 관한 것이며, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 식물에서의 발현에 최적화되어 있다. 식물은 옥수수와 같은 단자엽 식물, 또는 쌍자엽 식물일 수 있다. 바람직하게는 식물이 곡류 식물, 또는 상업적으로 재배된 식물이다. 프로세싱 효소는 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, 글루카나제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제, 아밀로풀루란아제, 셀룰라제, 엑소-1,4-β-셀로비오히드롤라제, 엑소-1,3-β-D-글루카나제, β-글루코시다제, 엔도글루카나제, L-아라비나제, α-아라비노시다제, 갈락타나제, 갈락토시다제, 만나나제, 만노시다제, 크실라나제, 크실로시다제, 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 에스테라제, 피타제 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제 및 아밀로풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택된 전분-프로세싱 효소이다. 보다 바람직하게는, 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제 및 풀루란아제로부터 선택된다. 추가로 바람직하게는, 프로세싱 효소가 초호열성이다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 효소는 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 에스테라제, 피타제 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-전분 분해 효소일 수도 있다. 추가로, 상기 효소도 초호열성일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 효소는 식물의 액포, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 종자 또는 세포벽에 축적된다. 또한, 다른 실시양태에서는 식물의 게놈이 비-초호열성 효소를 포함하는 제2 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제 및 풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물이 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 식물에서의 발현에 최적화되어 있다. 바람직하게는, 프로세싱 효소가 초호열성 옥수수 효소이다.
다른 실시양태는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제 및 풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 옥수수 식물에 관한 것이며, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 옥수수 식물에서의 발현에 최적화되어 있다. 바람직하게는, 프로세싱 효소가 초호열성이다.
프로모터 및 신호 서열에 작동적으로 연결된 서열 2, 9 또는 52를 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물이 제공된다. 또한, 프로모터 및 신호 서열에 작동적으로 연결된 서열 4 또는 25를 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물이 기재되어 있다. 다른 실시양태는 프로모터 및 신호 서열에 작동적으로 연결된 서열 6을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물에 관한 것이다. 또한, 서열 19, 21, 37, 39, 41 또는 43을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물이 기재되어 있다. 서열 46, 48, 50 또는 59를 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 게놈이 증대된 형질전환 식물도 기재되어 있다.
형질전환된 식물의 산물은 추가로 본원에서 계획된다. 예를 들어, 상기 산물로는 종자, 열매 또는 곡물이 포함된다. 또는, 상기 생성물이 프로세싱 효소, 전분 또는 당일 수도 있다.
본 발명의 안정하게 형질전환된 식물로부터 얻은 식물도 추가로 기재되어 있다. 이 측면에서, 상기 식물은 하이브리드 식물 또는 근교배 식물일 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태는, 프로테아제, 글루카나제 또는 에스테라제인 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 전분 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 효소가 초호열성이다.
본 발명의 다른 실시양태는 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제 또는 글루코스 이소메라제인 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 곡물에 관한 것이다. 바람직하게는, 효소가 초호열성이다.
다른 실시양태에서는, 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 곡물을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여, 전분 과립과 비-전분 분해 산물을 포함하는 혼합물을 수득하고 (여기서, 상기 곡물은 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 상기 혼합물로부터 전분 과립을 분리하는 것을 포함하는, 전분 과립을 제조하는 방법이 제공된다. 여기서, 효소는 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 피타제 또는 에스테라제가 바람직하다. 또한, 효소는 초호열성인 것이 바람직하다. 곡물은 분쇄 곡물일 수도 있고(있거나), 저습 또는 고습 조건 하에서 처리된 것일 수도 있다. 별법으로, 곡물은 이산화황으로 처리될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명은 상기 혼합물로부터 비-전분 산물을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 방법에 의해 얻은 전분 산물 및 비-전분 산물이 추가로 기재된다.
또다른 실시양태에서는, 하나 이상의 전분-분해 또는 전분-이성질체화 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대되고 이것이 내배유에서 발현되는 형질전환 옥수수 또는 그의 부분을, 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 옥수수의 다당류를 당으로 전환시킴으로써 고감미 옥수수를 수득하는 것을 포함하는, 고감미 옥수수를 제조하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 발현 카세트가 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 프로모터는, 예를 들어 구성적 프로모터, 종자-특이성 프로모터 또는 내배유-특이성 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 효소가 초호열성이다. 보다 바람직하게는, 효소가 α-아밀라제이다. 본원에 사용되는 발현 카세트는 하나 이상의 상기 효소에 작동적으로 연결된 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 초호열성 효소가 아포플라스트 또는 소포체로 이동하도록 안내할 수 있다. 바람직하게는, 효소가 서열 13, 14, 15, 16, 33 또는 35 중 어느 하나를 포함한다.
가장 바람직한 실시양태에서, α-아밀라제를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대되고 이것이 내배유에서 발현되는 형질전환 옥수수 또는 그의 부분을, 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 옥수수의 다당류를 당으로 전환시킴으로써 고감미 옥수수를 수득하는 것을 포함하는, 고감미 옥수수를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 바람직하게는 효소가 초호열성이고, 초호열성 α-아밀라제는 서열 10, 13, 14, 15, 16, 33 또는 35 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 α-아밀라제 활성을 갖는 이들의 효소적 활성 단편을 포함한다.
전분 과립 및 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 전분 과립이 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 형성하도록 프로세싱하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 수집하는 것을 포함하는, 가수분해된 전분 산물의 수용액을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 가수분해된 전분 산물은 덱스트린, 말토올리고당, 글루코스 및(또는) 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 효소가 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 아밀로풀루란아제, 글루코스 이소메라제 또는 이들의 임의의 조합이다. 또한, 효소는 초호열성인 것이 바람직하다. 다른 측면에서, 식물 부분의 게놈은 비-초호열성 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 추가 증대될 수 있다. 비-초호열성 전분 프로세싱 효소는 아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또다른 측면에서, 프로세싱 효소는 내배유에서 발현되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 식물 부분이 곡물이며, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 사탕수수 또는 쌀로부터 유도된 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 프로세싱 효소가 상기 효소를 전분 과립 또는 소포체로, 또는 세포벽으로 표적화시키는 신호 서열 및 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 이 방법은 가수분해된 전분 산물을 단리하고(하거나) 가수분해된 전분 산물을 발효시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 전분 과립이 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 형성하도록 프로세싱하고(여기서, 식물 부분은 하나 이상의 α-아밀라제를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 수집하는 것을 포함하는, 가수분해된 전분 산물을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 바람직하게는 α-아밀라제가 초호열성이며, 보다 바람직하게는 초호열성 α-아밀라제가 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 또는 35 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 α-아밀라제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을 포함한다. 바람직하게는, 발현 카세트가 서열 2, 9, 46 또는 52 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드, 이들의 상보물, 또는 서열 2, 9, 46 또는 52 중 어느 하나와 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 혼성화되며 α-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명은 비-초호열성 전분-프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 형질전환 식물의 게놈을 추가로 제공한다. 별법으로, 식물 부분은 비-초호열성 전분-프로세싱 효소로 처리될 수 있다.
추가로, 본 발명은 식물 세포에 존재하는 하나 이상의 전분-프로세싱 효소를 포함하는 형질전환 식물 부분에 관한 것이며, 여기서 식물 부분은 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻는다. 바람직하게는, 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제 및 아밀로풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택된 전분-프로세싱 효소이다. 또한, 효소는 초호열성인 것이 바람직하다. 식물은 임의의 식물일 수 있으나, 옥수수가 바람직하다.
본 발명의 다른 실시양태는 식물의 세포벽이나 세포에 존재하는 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환 식물 부분에 관한 것이며, 여기서 식물 부분은 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소 또는 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻는다. 바람직하게는, 효소가 초호열성이다. 또한, 비-전분 프로세싱 효소는 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 에스테라제, 피타제 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 식물 부분은 임의의 식물 부분일 수 있으나, 이삭 (ear), 종자, 열매, 곡물, 마초, 여물 또는 깍지인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 형질전환된 식물 부분에 관한 것이다. 예를 들어, 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 또는 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 2, 9, 46 또는 52 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-아밀라제를 포함하는 형질전환 식물 부분; 서열 5, 26 또는 27 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 6을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-글루코시다제를 포함하는 형질전환 식물 부분; 서열 28, 29, 30, 38, 40, 42 또는 44 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 19, 21, 37, 39, 41 또는 43 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코스 이소메라제를 포함하는 형질전환 식물 부분; 서열 45, 서열 47 또는 서열 49의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 46, 48, 50 또는 59 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코아밀라제를 포함하는 형질전환 식물 부분; 및 서열 4 또는 25 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 풀루란아제를 포함하는형질전환 식물 부분이 기재되어 있다.
다른 실시양태는 형질전환 식물 부분에 함유된 전분 프로세싱 효소를 활성화시키는 것을 포함하는, 형질전환 식물 부분에서 전분을 전환시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법에 따라 생산된 전분, 덱스트린, 말토올리고당 또는 당이 추가로 기재되어 있다.
추가로, 본 발명은 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 비-전분 다당류를 분해함으로써 올리고당 및(또는) 당을 포함하는 수용액을 형성하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 올리고당 및(또는) 당을 포함하는 수용액을 수집하는 것을 포함하는, 식물 부분의 세포벽 또는 세포에 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분을 이용하는 방법을 기재하고 있다. 바람직하게는, 비-전분 다당류 프로세싱 효소가 초호열성이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 프로테아제 또는 리파제를 포함하는 형질전환된 종자를 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 아미노산 및 지방산을 포함하는 수성 혼합물을 수득하고 (여기서, 종자는 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 상기 수성 혼합물을 수집하는 것을 포함하는, 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 종자를 이용하는 방법에 관한 것이다. 아미노산, 지방산, 또는 이들 둘 다가 바람직하게는 단리된다. 바람직하게는, 하나 이상의 프로테아제 또는 리파제가 초호열성이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 다당류를 분해함으로써 올리고당 또는 발효가능한 당을 형성하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 발효가능한 당 또는 올리고당의 에탄올로의 전환을 촉진시키는 조건 하에서 상기 발효가능한 당을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 식물 부분이 곡물, 열매, 종자, 줄기, 나무, 야채 또는 뿌리이다. 바람직하게는, 식물 부분이 귀리, 보리, 밀, 장과, 포도, 호밀, 옥수수, 쌀, 감자, 사탕무, 사탕수수, 파인애플, 목초 및 나무로 이루어진 군으로부터 선택된 식물에서 얻는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 다당류 프로세싱 효소는 α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 풀루란아제 또는 이들의 조합이다.
또한, α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제 또는 풀루란아제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 소정의 시간 동안 열로 처리하여 다당류를 분해함으로써 발효가능한 당을 형성하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 발효가능한 당의 에탄올로의 전환을 촉진시키는조건 하에서 상기 발효가능한 당을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 에탄올을 제조하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 하나 이상의 상기 효소가 초호열성 또는 중온성이다.
다른 실시양태에서는, 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 비-전분 다당류를 올리고당 및 발효가능한 당으로 분해하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 발효가능한 당의 에탄올로의 전환을 촉진시키는 조건 하에서 상기 발효가능한 당을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 에탄올을 제조하는 방법이 제공된다. 바람직하게는 비-전분 프로세싱 효소가 글루카나제, 크실라나제 또는 셀룰라제이다.
α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제 또는 풀루란아제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 다당류를 분해함으로써 발효가능한 당을 형성하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 발효가능한 당의 에탄올로의 전환을 촉진시키는 조건 하에서 상기 발효가능한 당을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 에탄올을 제조하는 방법이 추가로 제공된다. 바람직하게는, 효소가 초호열성이다.
또한, 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 식물 부분의 전분 과립을 당으로 프로세싱함으로써 감미화된 산물을 형성하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 감미화된 산물을 곡분 식품으로 프로세싱하는 것을 포함하는, 추가의 감미제를 첨가하지 않고 감미화된 곡분 식품을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 곡분 식품은 감미화된 산물 및 물로부터 형성될 수 있다. 또한, 곡분 식품은 맥아, 풍미제, 비타민, 미네랄, 착색제 또는 이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 상기 효소가 초호열성이다. 효소는 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 추가로, 식물은 대두, 호밀, 귀리, 보리, 밀, 옥수수, 쌀 및 사탕수수로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 곡분 식품이 곡류 음식, 조반, 즉석 식품 또는 베이킹된 음식이다. 프로세싱으로는 베이킹, 비등, 가열, 스티밍, 방전 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
추가로, 본 발명은 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 전분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 전분을 당이 형성되도록 분해함으로써 감미화된 전분을 형성하고 (여기서, 전분은 하나 이상의 상기 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 상기 감미화된 전분을 산물에 첨가하여 감미화된 전분을 함유하는 산물을 제조하는 것을 포함하는, 추가의 감미제를 첨가하지 않고 전분-함유 산물을 감미화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 형질전환 식물이 옥수수, 대두, 호밀, 귀리, 보리, 밀, 쌀 및 사탕수수로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 하나 이상의 상기효소가 초호열성이다. 보다 바람직하게는, 하나 이상의 상기 효소가 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제 또는 이들의 임의의 조합이다.
본원에서는 곡분 식품 및 감미화된 전분 함유 산물이 제공된다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 열매 또는 야채를 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 열매 또는 야채의 다당류를 당이 형성되도록 프로세싱하고 (여기서, 열매 또는 야채는 하나 이상의 상기 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음), 이로써 감미화된 열매 또는 야채를 수득하는 것을 포함하는, 다당류-함유 열매 또는 야채를 감미화시키는 방법에 관한 것이다. 열매 또는 야채는 감자, 토마토, 바나나, 호박, 완두콩 및 강남콩으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 하나 이상의 상기 효소가 초호열성이다.
추가로, 본 발명은 식물 부분으로부터 얻은 전분 과립을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하고, 이로써 당을 포함하는 수용액을 수득하는 것을 포함하는, 당을 포함하는 수용액의 제조 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태는, 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 전분 과립이 덱스트린 또는 당을 포함하는 수용액을 형성하도록 프로세싱하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 전분 유도의 산물을 포함하는 수용액을 수집하는 것을포함하는, 전분-유도의 산물을 회수하기 전에 습식 제분 또는 건식 제분 곡물을 포함하지 않는 곡물로부터 전분 유도의 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 전분 프로세싱 효소가 초호열성이다.
추가로, 형질전환된 식물을 배양하고, 이로부터 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제 및 풀루란아제를 단리하는 것을 포함하는, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제 및 풀루란아제를 단리하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 효소가 초호열성이다.
또한, 본 발명은 유전자이전 곡물을 물과 혼합하고, 상기 혼합물을 가열하고, 생성된 덱스트린 시럽으로부터 고체를 분리하고, 말토덱스트린을 수집하는 것을 포함하는, 말토덱스트린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 유전자이전 곡물이 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함한다. 바람직하게는, 전분 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제 및 글루코스 이소메라제이다. 또한, 이 방법에 의해 제조된 말토덱스트린이 제공되며, 또한 이 방법에 의해 제조된 조성물도 제공된다.
전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 전분 과립을 덱스트린 또는 당을 포함하는 수용액이 형성되도록 프로세싱하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 상기 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 당 및(또는) 덱스트린을 포함하는 수용액을 수집하는 것을 포함하는, 전분-유도 산물의 회수 전에 곡물의 기계적 분열을 포함하지 않고 곡물로부터 덱스트린 또는 당을 제조하는 방법이 제공된다.
추가로, 본 발명은 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 상기 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 전분 과립을 덱스트린 또는 당을 포함하는 수용액이 형성되도록 프로세싱하고 (여기서, 식물 부분은 하나 이상의 상기 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 게놈이 증대된 형질전환 식물로부터 얻음); 발효가능한 당을 포함하는 수용액을 수집하는 것을 포함하는, 발효가능한 당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본원에서는 초호열성 α-아밀라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 옥수수 식물이 제공된다. 예를 들어 바람직하게는, 서열 1 또는 서열 51에 대한 상동성이 60% 초과인 α-아밀라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 옥수수 식물이 본 발명에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 식물 분자생물학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 식물 또는 그의 산물에 원하는 특성을 제공하는 프로세싱 효소를 발현하는 식물의 생성에 관한 것이다.
도 1A 및 1B는 pNOV6201 식물의 분리 T1 낟알 및 6종의 pNOV6200 계통에서 유도된, 옥수수 낟알 및 내배유에서 발현된 α-아밀라제의 활성을 나타낸다.
도 2는 pNOV6201 계통에서 유도된 분리 T1 낟알에서의 α-아밀라제 활성을 나타낸다.
도 3은 85℃ 및 95℃에서 60분 이하의 액화 시간에 적용된, 열안정성 797GL3 알파 아밀라제를 함유하는 유전자이전 옥수수의 매쉬 (mash)를 발효시켜 제조된 에탄올의 양을 도시한다. 이 도면은 발효 72시간에서의 에탄올 수율이 액화 15분에서 60분까지 거의 변하지 않음을 나타낸다. 또한, 95℃에서의 액화에 의해 제조된매쉬가 85℃에서의 액화에 의해 제조된 매쉬보다 각 시점에서 보다 많은 에탄올을 생성한다는 것을 보여준다.
도 4는 열에 안정한 알파 아밀라제를 함유하는 유전자이전 옥수수의 매쉬를 85℃ 및 95℃에서 60분까지 액화하여 발효시킨 후 남아 있는 잔존 전분의 양(%)을 도시한 것이다. 이 도면은 발효 후 72시간째의 에탄올 수율이 액화 15분 내지 60분 사이에서 거의 변화가 없음을 보여 준다. 또한, 95℃에서 액화하여 만든 매쉬가 85℃에서 액화하여 만든 매쉬보다 매 시간 더 많은 에탄올을 생산함을 보여 준다.
도 5는 85℃ 및 95℃에서의 유전자이전 옥수수, 대조군 옥수수, 및 이들의 다양한 혼합물들의 매쉬에 대한 에탄올 수율을 도시한다. 이 도면은 발효 후 남아 있는 전분이 감소한 것으로 보아 α-아밀라제를 포함하는 유전자이전 옥수수가 발효에 사용할 수 있는 전분을 만드는데 있어서 상당한 향상을 가져옴을 보여 준다.
도 6은 85℃ 및 95℃에서 준비한 유전자이전 곡물, 대조군 옥수수, 및 이들의 다양한 혼합물들의 매쉬를 발효시킨 후 건조 받침대에서 측정한 잔존 전분의 양을 도시한다.
도 7은 에탄올 수율을 20 내지 80 시간 및 다양한 pH 범위 5.2-6.4에서 3% 유전자이전 옥수수를 포함하는 샘플의 발효 시간의 함수로 도시한 것이다. 이 도면은 낮은 pH에서 발효시키는 것이 pH 6.0 이상에서 발효시키는 것보다 빨리 진행됨을 나타낸다.
도 8은 다양한 중량비(0-12 중량%)의 유전자이전 옥수수를 포함하는 매쉬를발효시키는 동안 에탄올의 수율을 다양한 pH 범위 5.2 내지 6.4에서 도시한 것이다. 이 도면은 에탄올 수율은 샘플에 포함된 유전자이전 곡물의 양과 관계 없음을 보여준다.
도 9는 pNOV 7005로 형질전환시킨 다양한 경우로부터 얻은 T2 종자의 분석 결과를 나타낸다. 많은 경우에 있어서 비유전자이전 대조군에 비해 높은 풀루란아제 활성의 발현을 관측할 수 있다.
도 10A 및 10B는 발현된 풀루란아제에 의해 유전자이전 옥수수 가루의 전분으로부터 형성된 가수분해 산물의 HPLC 분석 결과를 도시한다. 옥수수를 발현하는 풀루란아제의 가루를 75℃에서 30분 동안 반응 완충액에서 인큐베이션하면 콘스타치로부터 중간 쇄 올리고당(중합도(DP) 약 10-30) 및 짧은 아밀로스 쇄(DP 약 100-200)를 얻을 수 있다. 또한 도 10A 및 10B는 첨가된 칼슘 이온이 풀루란아제의 활성에 미치는 영향을 보여준다.
도 11A 및 11B는 2개의 반응 혼합물로부터 생성된 전분 가수분해 산물의 HPLC 분석으로 얻은 데이타를 도시한다. '아밀라제'로 표시된 제1 반응물은 유전자이전 옥수수 및 비유전자이전 옥수수 A188을 발현하는 α-아밀라제의 옥수수 가루 샘플의 혼합물[1:1(w/w)]을 함유한다. 제2 반응 혼합물 '아밀라제 + 풀루란아제'는 유전자이전 옥수수를 발현하는 α-아밀라제 및 유전자이전 옥수수를 발현하는 풀루란아제의 옥수수 가루 샘플[1:1(w/w)]을 함유한다.
도 12는 2개의 반응 혼합물 25 ㎕에서 생성된 당의 양을 ㎍으로 나타낸 것이다. '아밀라제'로 표시된 제1 반응물은 유전자이전 옥수수 및 비유전자이전 옥수수 A188을 발현하는 α-아밀라제의 옥수수 가루 샘플의 혼합물[1:1(w/w)]을 함유한다. 제2 반응 혼합물 '아밀라제 + 풀루란아제'는 유전자이전 옥수수를 발현하는 α-아밀라제 및 유전자이전 옥수수를 발현하는 풀루란아제의 옥수수 가루 샘플[1:1(w/w)]을 함유한다.
도 13A 및 13B는 85℃ 및 95℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 2개의 반응 혼합물 세트로부터 얻은 전분 가수분해 산물을 도시한다. 각각의 세트에는 2개의 반응 혼합물이 있다. '아밀라제 X 풀루란아제'로 표시된 제1 반응물은 α-아밀라제 및 풀루란아제 둘 다를 발현하는 유전자이전 옥수수로부터 얻은 가루(교차 수분으로 얻음)를 함유하고, '아밀라제'로 표시된 제2 반응물은 유전자이전 옥수수 및 비유전자이전 옥수수 A188을 발현하는 α-아밀라제의 옥수수 가루 샘플을 교차 수분(아밀라제 X 풀루란아제)에서 관찰할 수 있는 정도의 α-아밀라제 활성을 얻을 수 있는 비율로 혼합한 것이다.
도 14는 비유전자이전 옥수수 종자(대조군), 797GL3 α-아밀라제를 포함하는 유전자이전 옥수수 종자, 및 797GL3 유전자이전 옥수수 종자와 Mal A α-글루코시다제의 조합을 사용하여 전분을 글루코스로 분해시키는 것을 도시한다.
도 15는 실온 또는 30℃에서 원료 전분의 전환을 도시한다. 이 도면에서 반응 혼합물 1 및 2는 실온 및 30℃에서 물과 전분의 조합이다. 반응 혼합물 3 및 4는 실온 및 30℃에서 보리 α-아밀라제와 전분의 조합이다. 반응 혼합물 5 및 6은 실온 및 30℃에서 써모아나에로박테륨 글루코아밀라제와 전분의 조합이다. 반응 혼합물 7 및 8은 실온 및 30℃에서 보리 α-아밀라제(시그마)와 써모아나에로박테륨 글루코아밀라제와 전분의 조합이다. 반응 혼합물 9 및 10은 실온 및 30℃에서보리 알파-아밀라제(시그마) 대조군과 전분의 조합이다. 써모아나에로박테륨 글루코아밀라제의 생성물의 중합 정도(DP)를 나타내었다.
도 16은 실시예 19에 기재한 글루코스 이소메라제, 알파 글루코시다제, 및 알파 아밀라제의 조합을 사용하여 아밀라제 유전자이전 옥수수 가루로부터 프락토스를 생산하는 것을 도시한다. 아밀라제 옥수수 가루는 효소 용액과 물 또는 완충액을 합한 것과 혼합하였다. 모든 반응물은 아밀라제 가루 60 mg 및 총 600 ㎕의 액체를 함유하였고, 90℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
도 17은 자가 프로세싱 낟알로부터 얻은 아밀라제 가루 100%와의 반응 생성물의 피크 영역을 90℃에서 0-1200분 사이의 인큐베이션 시간에 대한 함수로 도시한 것이다.
도 18은 자가 프로세싱 낟알로부터 얻은 유전자이전 아밀라제 가루 10% 및 대조군 옥수수 가루 90%와의 반응 생성물의 피크 영역을 90℃에서 0-1200분 사이의 인큐베이션 시간에 대한 함수로 도시한 것이다.
도 19는 전분 가수분해에 미치는 온도의 영향을 평가하기 위해 70℃, 80℃, 90℃ 또는 100℃에서 90분까지 인큐베이션한 유전자이전 아밀라제 가루의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
도 20은 다양한 반응 조건 하에서 효소 용액과 물 또는 완충액을 합한 것과 혼합한 유전자이전 아밀라제 가루 60 mg을 함유하는 샘플의 ELSD 피크를 도시한 것이다. 반응의 한 세트는 실온에서 pH가 7.0인 50 mM MOPS와 10 mM MgS04및 1 mM CoCl2를 합한 것으로 완충하였다. 반응의 두 번째 세트에서는 금속 함유 완충액을 물로 치환하였다. 모든 반응물을 90℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
본 발명에 의하면 '자가-프로세싱' 식물 또는 식물 부분은 식물의 전분, 다당류, 지질, 단백질 등을 프로세싱, 즉 개질시킬 수 있는 프로세싱 효소를 코딩할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 여기서 상기 프로세싱 효소는 중온성, 호열성 또는 초호열성일 수 있고, 갈거나 물을 첨가하거나 열을 가하거나 기타 효소가 작용할 수 있는 적당한 조건을 공급하여 활성화시킬 수 있다. 상기 프로세싱 효소를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 식물 또는 식물 부분 내에서 발현되기 위해 식물 또는 식물 부분 내에 포함시킨다. 프로세싱 효소가 발현되고 활성화되면 본 발명의 식물 또는 식물 부분은 프로세싱 효소가 작용하는 기질을 프로세싱한다. 따라서 본 발명의 식물 또는 식물 부분은 기질을 프로세싱하기 위해 일반적으로 필요한 외부 요인이 없거나 부족한 상태에서 그 내부에 포함되어 있는 프로세싱 효소를 활성화시켜 효소의 기질을 자가 프로세싱할 수 있다. 따라서 형질전환된 식물, 형질전환된 식물 세포, 형질전환된 식물 부분은 본 발명에 따라 내부에 포함된 효소를 통해 원하는 기질을 프로세싱하는 '빌트-인' 프로세싱 능력을 갖는다. 상기 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 '유전적으로 안정'한 것, 다시 말해 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 형질전환된 식물 또는 식물 부분에서 안정적으로 유지되고, 연속한 세대에서 자손들에게 안정적으로 유전되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 상기 식물 및 식물 부분을 이용하는 방법은 전분에서 유도된 제품을 재생하기 위해 제분하거나 기타 식물 부분의 일체성을 물리적으로 파괴할 필요가 없어진다. 예를 들면, 본 발명은 전분에서 유도된 제품을 재생하기 위해 옥수수나 다른 곡물을 프로세싱하는 향상된 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 외부에서 생산된 전분 가수분해 효소를 첨가할 필요 없이 전분 내의 특정 결합을 가수분해하기에 적합한 전분 분해 효소를 그 내부 또는 표면에 함유하는 전분 과립의 재생을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻은 자가 프로세싱 식물 또는 식물 부분에서 얻은 향상된 제품을 제공한다.
또한, 상기 '자가 프로세싱' 형질전환된 식물 부분, 예를 들면 곡물, 및 형질전환된 식물은 현존하는 기술의 주요 문제점, 즉 프로세싱 효소는 주로 미생물을 발효시켜 생산하는데 이것은 효소를 배양 상청액으로부터 단리해야 할 필요성이 있고, 따라서 비용이 증가하고, 단리된 효소는 특정 응용을 위해 제형화되어야 하고, 효소를 기질과 첨가하고, 혼합하고 반응시킬 공정 및 기계를 개발해야 한다는 문제점을 해결한다. 본 발명의 형절전환된 식물 또는 식물 부분은 프로세싱 효소 그 자체의 출처이고, 또한 이 효소의 기질 및 생성물, 예를 들면 당, 아미노산, 지방산, 전분 및 비전분 다당류의 출처이다. 본 발명의 식물은 하이브리드 또는 근교배와 같은 자손 식물을 만들기 위해 이용할 수도 있다.
프로세싱 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
프로세싱 효소(중온성, 호열성, 또는 초호열성)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 식물 또는 식물 부분 내로 도입한다. 상기 프로세싱 효소는 이 효소가 식물 또는 유전자이전 식물 내에서 작용하는 것으로 밝혀진 소정의 기질 및(또는) 소정의 최종 생성물에 근거하여 선택한다. 예를 들면, 프로세싱 효소는 전분 분해 효소 또는 전분 이성질체화 효소와 같은 전분 프로세싱 효소, 또는 비전분 프로세싱 효소일 수 있다. 적절한 프로세싱 효소에는 α-아밀라제, 엔도 또는 엑소-1,4, 또는 1,6-α-D, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 및 기타 엑소-아밀라제와 같은 전분 분해 또는 이성질체화 효소; 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제, 아밀로풀루란아제와 같은 전분 탈분지화 효소; 시클로덱스트린 글리코실트랜스페라제와 같은 글리코실트랜스페라제, 엑소-1,4-β-셀로비오히드롤라제, 엑소-1,3-β-D-글루카나제, 헤미셀룰라제, β-글루코시다제와 같은 셀룰라제; 엔도-1,3-β-글루카나제 및 엔도-1,4-β-글루카나제와 같은 엔도글루카나제; 엔도-1,5-α-L-아라비나제, α-아라비노시다제와 같은 L-아라비나제; 엔도-1,4-β-D-갈락타나제, 엔도-1,3-β-D-갈락타나제, β-갈락토시다제, α-갈락토시다제와 같은 갈락타나제; 엔도-1,4-β-D-만나나제, β-만노시다제, α-만노시다제와 같은 만나나제; 엔도-1,4-β-크실라나제, β-D-크실로시다제, 1,3-β-D-크실라나제와 같은 크실라나제; 펙티나제; 및 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 티오레독신/티오레독신 리덕타제, 에스테라제, 피타제, 및 리파제와 같은 비전분 프로세싱 효소가 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 프로세싱 효소는 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 아밀로풀루란아제, 글루코스 이소메라제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 전분 분해 효소이다. 이 실시양태에 의하면, 식물 또는 식물 부분 내에 포함된 효소가 활성화되면 전분 분해 효소는 자가 프로세싱 식물 또는 식물 부분이 전분을 분해할 수 있게 해 준다. 여기에 대해서는 아래에 더 자세히 설명해 두었다. 전분 분해 효소는 소정의 최종 생산물에 따라 선택한다. 예를 들면, 글루코스-이소메라제는 글루코스(헥소스)를 프락토스로 전환시키기 위해 선택할 수 있다. 또는, 상기 효소는 예를 들면 프로세싱 정도의 작용에 따라 다양한 쇄 길이 또는 다양한 소정의 분지화 패턴을 갖는 소정의 전분 유도 최종 생성물에 따라 선택할 수도 있다. 예를 들면, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 또는 아밀로풀루란아제는 짧은 인큐베이션 시간 하에서는 덱스트린 생산물을 만들기 위해, 그리고 긴 인큐베이션 시간 하에서는 짧은 쇄 생산물 또는 당을 만들기 위해 이용할 수 있다. 풀루란아제는 전분에서 분지 지점을 특이적으로 가수분해하여 고아밀로스 전분을 얻기 위해 사용할 수 있고, 네오풀루란아제는 α1,4 결합의 스트레치 및 산재된 α1,6 결합을 갖는 전분을 얻기 위해 사용할 수 있다. 글루코시다제는 리미트 덱스트린을 생산하기 위해 이용할 수 있다. 다른 효소의 조합을 이용하여 다른 전분 유도체를 얻을 수도 있다.
다른 실시양태에서, 프로세싱 효소는 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 및 에스테라제에서 선택된 비전분 프로세싱 효소일 수 있다. 이들 비전분 분해 효소는 본 발명의 상기 자가 프로세싱 식물 또는 식물 부분의 표적 부분에 도입되어활성화되면 식물을 파괴하여 전분 과립을 손상되지 않은 채로 남길 수 있다. 예를 들면, 한 바람직한 실시양태에서, 비전분 분해 효소는 식물 세포의 내배유 매트릭스를 표적화하고, 활성화되면 내배유 매트릭스를 파괴하여 손상되지 않은 전분 과립을 남기고, 생성된 생성 물질에서 더 쉽게 재생될 수 있다.
상기 프로세싱 효소의 조합도 본 발명의 범위에 포함한다. 예를 들면, 전분 프로세싱 효소 및 비전분 프로세싱 효소를 조합하여 사용할 수 있다. 각 효소를 코딩하는 다중 유전자 작제를 사용하여 프로세싱 효소를 조합할 수 있다. 또는, 상기 효소로 안정하게 형질전환한 각 유전자이전 식물은 공지의 방법으로 교잡하여 두 효소를 포함하는 식물을 얻을 수 있다. 또 다른 방법은 유전자이전 식물과 함께 외인성 효소를 이용하는 것을 포함한다.
상기 프로세싱 효소는 임의의 출처로부터 유도하거나 단리할 수 있고, 여기에 대응하는 폴리뉴클레오티드는 당업자가 확인할 수 있다. 예를 들면, 프로세싱 효소, 바람직하게는 α-아밀라제는 피로코쿠스(예를 들면, 피로코쿠스 푸리오수스), 써무스, 써모코쿠스(예를 들면, 써모코쿠스 하이드로테르말리스), 술폴로부스(예를 들면, 술폴로부스 솔파타리쿠스) 써모토가(예를 들면, 써모토가 마리티마 및 써모토가 네아폴리타나), 써모아나에로박테륨(예를 들면, 써모아나에로박터 텡콘젠시스), 아스페르길루스(예를 들면, 아스페르길루스 쉬로우사미 및 아스페르길루스 니게르), 리조푸스(예를 들면, 리조푸스 오리자에), 써모프로테알레스, 데술푸로코쿠스(예를 들면, 데술푸로코쿠스 아밀로리티쿠스), 메타노박테륨 써모오토프로피큠, 메타노코쿠스 자나쉬이, 메타노피루스 칸들레리, 써모시네코코쿠스 엘롱가투스, 써모플라스마 아시도필륨, 써모플라스마 볼카늄, 아에로피륨 페르닉스 및 옥수수, 보리, 및 쌀과 같은 식물로부터 유도할 수 있다.
본 발명의 프로세싱 효소는 도입된 후 활성화되고 식물의 게놈에서 발현될 수 있다. 효소를 활성화시키는 방법은 각 효소의 종류에 따라 달라지고, 온도, pH, 수화, 금속의 존재, 활성화 물질, 불활성화 물질과 같은 다양한 조건을 포함할 수 있다. 예를 들면 온도 의존성 효소에는 중온성, 호열성, 및 초호열성 효소가 포함된다. 중온성 효소는 20 내지 65℃에서 최대 활성을 갖고, 70℃보다 높으면 불활성화된다. 중온성 효소는 30 내지 37℃에서 큰 활성을 갖고, 30℃에서의 활성은 최대 활성의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상인 것이 좋다.
호열성 효소는 50 내지 80℃에서 최대 활성을 갖고, 80℃보다 높은 온도에서는 불활성화된다. 호열성 효소는 30℃에서의 활성이 최대 활성의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만인 것이 좋다.
'초호열성' 효소는 높은 온도에서 활성을 갖는다. 초호열성 효소는 80℃보다 높은 온도에서 최대 활성을 갖고, 80℃ 이상에서, 바람직하게는 90℃ 이상에서, 가장 바람직하게는 95℃ 이상에서 활성을 유지한다. 초호열성 효소는 또한 낮은 온도에서는 활성이 작아진다. 초호열성 효소는 30℃에서 최대 활성의 10%보다 작은 활성, 바람직하게는 5%보다 작은 활성을 갖는 것이 좋다.
상기 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선택된 유기체, 예를 들면 식물에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하도록 변형되는 것이 바람직하다(예를 들면, 문헌[Wada et al.,Nucl. Acids Res., 18:2367(1990)], 문헌[Murray et al.,Nucl. Acids Res., 17:477(1989)], 미국 특허 제5,096,825호, 제5,625,136호, 제5,670,356호 및 제5,874,304호] 참조). 코돈 최적화된 서열은 합성 서열이다. 다시 말해 자연적으로 발생하지 않는다. 코돈 최적화된 서열은 프로세싱 효소를 코딩하는 비코돈 최적화 모폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드(또는 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 전장 폴리펩티드의 효소적으로 활성인 단편)와 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 출처 모폴리펩티드와는 생화학적으로 구별되거나 향상된 성질을 가져서(예를 들면, 특정 프로세싱 효소를 코딩하는 DNA의 순환 돌연변이를 통해) 프로세싱 응용에서의 성능이 향상되는 것이 바람직하다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 표적 숙주 식물에서의 발현을 위해 최적화되고 프로세싱 효소를 코딩한다. 이러한 효소를 생산하는 방법에는 돌연변이화, 예를 들면 돌연변이화 및 선택의 반복이 포함된다. 돌연변이화 및 뉴클레오티드 서열의 변형은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면 문헌[Kunkel,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82:488, (1985)], 문헌[Kunkel et al.,Methods in Enzymol., 154:367(1987)]; 미국 특허 제4,873,192호; 문헌[Walker and Gaastra, eds. (1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York)] 및 여기에 인용되어 있는 문헌들; 문헌[Arnold et al.,Chem. Eng. Sci.,51:5091(1996)] 참조). 목표 식물 또는 유기체 내에서 핵산 단편의 발현을 최적화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 간단히 말하면, 목표 유기체에 의해 사용된 최적 코돈을 나타내는 코돈 사용표을 얻고, 최적 코돈을 선택하여 표적 폴리뉴클레오티드 내에 있는 것들과 치환한 후, 최적화된 서열을 화학적으로 합성한다. 옥수수를 위한 바람직한 코돈은 미국 특허 제5,625,136호에 기재되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 상보성 핵산도 또한 본 발명에 포함된다. 써던 또는 노던 블롯에서 필터에 남는 상보성 잔존물이 100개보다 많은 상보성 핵산의 혼성화를 위한 덜 엄격한 조건은 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 37℃에서 1% SDS, 그리고 60 내지 65℃에서 0.1X SSC로 세척하는 것이다. 덜 엄격한 조건의 예에는 30 내지 35%의 포름아미드 완충액을 사용한 혼성화, 1 M NaCl, 37℃에서 1% SDS(소듐 도데실 술페이트), 그리고 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC(20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 트리소듐 시트레이트)로 세척하는 것이 포함된다. 온화한 조건의 예에는 40 내지 45% 포름아미드로 혼성화, 1.0 M NaCl, 37℃에서 1% SDS, 그리고 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC로 세척하는 것이 포함된다.
더욱이, 프로세싱 효소의 "효소적 활성" 단편 폴리뉴클레오티드가 추가로 계획된다. 본 명세서에서, "효소적 활성"은 적절한 조건 하에 프로세싱 효소가 통상적으로 작용하는 기질을 개질시키는 프로세싱 효소와 실질적으로 같은 생물학적 활성을 갖는, 프로세싱 효소의 폴리펩티드 단편을 의미한다.
바람직한 실시양태에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 2, 9, 46 및 52으로 제공된 것과 같은, α-아밀라제를 코딩하는, 옥수수 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 4 및 25으로 제공된 것과 같은, 풀루란아제를 코딩하는, 옥수수 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 6으로제공된, α-글루코시다제를 코딩하는, 옥수수 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 19, 21, 37, 39, 41 또는 43을 갖는, 글루코스 이소메라제를 코딩하는, 옥수수 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서는, 서열 46, 48, 또는 50으로 제시된, 글루코아밀라제를 코딩하는, 옥수수 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또한, 글루카나제/만나나제 융합 폴리펩티드에 대한, 옥수수 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드가 서열 57로 제공된다. 본 발명은 추가로 상기 폴리뉴클레오티드들의 상보물을 제공하는데, 이것은 온화한 조건 하에서, 바람직하게는 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고, 가능한 경우, α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 글루코아밀라제, 글루카나제 또는 만나나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 "핵산 또는 "폴리핵산"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일- 또는 이중가닥 형태인 그의 고분자(당, 인산염 및 염기(퓨린 또는 피리미딘임)를 함유하는 단량체(뉴클레오티드)로 구성됨)를 말한다. 특별히 한정하지 않으며, 상기 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체(상기 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사됨)를 함유하는 핵산들을 포함한다. 달리 지적하지 않는다면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 개질된 변이체(예; 퇴화 코돈 치환체) 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 암시적으로 포함한다. 자세히는, 퇴화 코돈 치환체는 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및(또는) 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 발생시켜 이루어질 수 있다.
"변이체(variants)" 또는 실질적으로 유사한 서열들이 추가로 본원에 포함된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 변이체는 유전자 코드의 퇴화 때문에 천연 단백질의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열들을 포함한다. 이와 같은 자연적으로 발생하는 유전자 변이체는 공지된 분자생물학 기술, 예를 들면, 중합효소연쇄반응(PCR), 혼성화 기술 및 결찰 재조립 기술을 이용하여 동정할 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한 합성적으로 유도된 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 천연 단백질을 코딩하는, 자리 지정 돌연변이유발을 이용하여 발생하는 것들 뿐만 아니라, 아미노산 치환체를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는, 이러한 부류에 기초한 천연 뉴클레오티드 서열에 대한 단일 단위 서열 동일성이 적어도 40%, 50%, 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 99%일 것이다. 예를 들면, 71%, 72%, 73% 등에서 적어도 90% 부류까지. 변이체들은 또한 동정된 유전자 단편에 상응하는 전장 유전자를 포함할 수 있다.
조절 서열: 프로모터/신호 서열/선택가능한 마커
본 발명의 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 식물 내의 특정 구획에 초호열성 효소를 표적화하기 위해, 편재화 신호 또는 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에(폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서) 작동적으로 연결될 수 있다. 상기 표적들의 예로는, 액포, 소포체, 엽록체, 백색체, 전분 과립, 또는 세포벽, 또는 특정 조직(예; 종자)이 있지만, 이에 한하지 않는다. 식물 내에, 특히 조직-특이성 또는 유도가능한 프로모터의 사용과 결부된, 신호 서열을 갖는 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현은 그 식물에서 국지화된 고농도의 프로세싱 효소를 생성할 수 있다. 수많은 신호 서열들이 특정 구획 외부 또는 특정 구획에 대한 폴리뉴클레오티드의 표적화 또는 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 적합한 신호 서열 및 표적 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 제시된 것들을 포함하지만, 이에 한하지 않는다.
예를 들면, 특정 조직 또는 기관에서의 발현이 바람직한 경우, 조직-특이성 프로모터가 사용될 수 있다. 대조적으로, 자극에 대한 반응으로의 유전자 발현이 바람직한 경우, 유도가능한 프로모터가 선택을 조정하는 요소이다. 식물 세포를 통한 지속적 발현이 바람직한 경우, 구성적 프로모터가 이용된다. 코어 프로모터 서열로부터 상류 및(또는) 하류의 추가적 조절 서열이 유전자이전 식물에서 이형(heterologus) 뉴클레오티드 서열의 발현도의 변화를 가져오는 변형 벡터의 발현 구성에 포함될 수 있다.
다수의 식물 프로모터들이 다양한 발현 특성을 갖는 것으로 기술되고 있다. 기술된 일부 구성적 프로모터의 예는 쌀 액틴 1(Wang et al., Mol. Cell. Biol. , 12: 3399 (1992); 미국 특허 제5,641,876호), CaMV 35S(Odell et al., Nature, 313: 810 (1985)), CaMV 19S(Lawton et al., 1987), nos(Ebert et al., 1987), Adh(Walker et al., 1987), 수크로스 신타제(Yang & Russell, 1990), 및 유비퀴틴프로모터가 있다.
유전자이전 식물에서 유전자의 조직-특이성 표적화에 사용하기 위한 벡터는 대체로 조직-특이성 프로모터를 포함할 것이고, 또한 인핸서 서열과 같은 기타 조직-특이성 조절 요소를 포함할 수 있다. 특정 식물 조직에서 특이적 또는 증대된 발현을 지시하는 프로모터들은 본원의 개시내용의 견지에서 당업계의 숙련자에게 공지될 것이다. 이들은, 예를 들어 rbcS 프로모터(그린(green) 조직에 특이적); ocs, nos 및 mas 프로모터(뿌리 또는 상처가 있는 잎 조직에서 더 고활성); 뿌리에서 증대된 발현을 지시하는 일부절단된 (-90 내지 +8) 35S 프로모터, 뿌리에서 발현을 지시하는 α-튜불린 유전자 및 내배유에서 발현을 지시하는 제인 저장 단백질(zein storage protein)로부터 유도된 프로모터들을 포함한다.
조직 특이적 발현은, 유전자 생성을 원치 않는 경우 조직에서만 발현되는 안티센스 유전자와 조합된 구성적으로 발현된 유전자(모든 조직)을 도입하여 기능적으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 리파제에 대한 코딩 유전자를 도입하여 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터 35S 프로모터를 이용하여 모든 조직에서 발현되게 할 수 있다. 예를 들어, 제인 프로모터를 이용한 옥수수 낟알 중의 리파제 유전자의 안티센스 전사의 발현은 종자에서 리파제 단백질의 축적을 방지할 것이다. 따라서, 도입 유전자에 의해 코딩된 단백질은 낟알을 제외한 모든 조직에 존재할 것이다.
더욱이, 몇몇 조직-특이성 조절 유전자 및(또는) 프로모터들이 식물들에서 보고되고 있다. 일부 보고된 조직-특이성 유전자들은 종자 저장 단백질(예; 나핀,크루시페린, 베타-콘글리시닌 및 파제올린) 제인 또는 오일 바디 단백질(올레오신)을 코딩하는 유전자 또는 지방산 생합성에 포함된 유전자(아실 캐리어 단백질, 스테아로일-ACP 불포화효소(fad 2-1)를 포함), 및 기타 배발생 과정에서 발현된 유전자들(예; Bce4, 예를 들면, EP 255378 및 문헌[Kridl et al., Seed Science Research, 1: 209 (1991)] 참조). 기술된 조직-특이성 프로모터의 예로는 렉틴(Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res. , 138; 87 (1983); Lindstrom et al., Der. Genet., 11: 160 (1990)), 옥수수 알코올 디히드로게나제 1(Vogel et al., 1989; Dennis et al., Nucleic Acids Res., 12: 3983 (1984)), 옥수수 집광 복합체(Simpson, 1986; Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3654 (1992)), 옥수수 열처리 단백질(Odell et al., 1985; Rochester et al., 1986), 완두 스몰 서브유닛 RuBP 카르복실라제(pea small subunit RuBP carboxylase)(Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), Ti 플라스미드 만노핀 신타제(Langridge et al., 1989), Ti 플라스미드 노팔린 신타제(Langridge et al., 1989), 페튜니아 칼콘 이소메라제(vanTunen et al., EMBO J., 7; 1257 (1988)), 강남콩 글리신 풍부 단백질(bean glycine rich protein) 1 (Keller et al., Genes Dev., 3: 1639 (1989)), 일부절단 CaMV 35s(Odell et al., Nature, 313: 810 (1985)), 감자 파타틴(Wenzler et al., Plant Mol. Biol., 13: 347 (1989)), 뿌리 세포 (Yamamoto et al., Nucleic Acids Res., 18: 7449 (1990)), 옥수수 제인(Reina et al., Nucleic Acids Res., 18: 6425 (1990); Kriz et al., Mol. Gen. Genet., 207: 90 (1987); Wandelt et al., Nucleic Acids Res., 17:2354 (1989); Langridge et al., Cell, 34: 1015 (1983); Reina et al., Nucleic Acids Res., 18: 7449 (1990)), 글로불린-1(Belanger et al., Genetics, 129: 863 (1991)), α-튜불린, cab(Sullivan et al., Mol. Gen. Genet., 215: 431 (1989)), PEPCase(Hudspeth & Grula, 1989), R 유전자 복합체-관련 프로모터(Chandler et al., Plant Cell, 1: 1175 (1989)), 및 칼콘 합성효소 프로모터(Franken et al., EMBO J., 10: 2605 (1991))가 있다. 종자-특이성 발현에 특히 유용한 것은 완두 비실린 프로모터 (Czako et al. , Mol. Gen. Genet., 235: 33 (1992)이다. (본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,625,136호도 참조) 성숙한 잎에서의 발현에 유용한 기타 프로모터는 아기장대(Arabidopsis)로부터의 SAG 프로모터와 같은, 노화 개시에서 교환되는 것들이다(Gan et al., Science, 270: 1986 (1995)).
열매 발생을 통하여, 늦어도 익기 시작할 때까지, 개화기에 또는 개화기 동안에 발현되는 일군의 열매-특이성 프로모터들이 미국 특허 제4,943,674호(그 개시내용이 본 명세서에 참고로 인용됨)에서 논의된다. 면섬유에서 주로 발현되는 cDNA 클론이 단리된 바 있다(John et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5769 (1992)). 열매 발생 동안 차별적 발현을 보이는 토마토로부터의 cDNA 클론이 단리되고 특성화되었다(Mansson et al., Gen. Genet., 200: 356 (1985), Slater et al., Plant Mol. Biol., 5: 137 (1985)). 폴리갈락투로나제 유전자를 위한 프로모터는 열매가 익는데 있어서 활성이다. 폴리갈락투로나제 유전자는 미국 특허 제4,535,060호, 제4,769,061호, 제4,801,590호 및 제5,107,065호(그 개시내용들이 본 명세서에 참고로 인용됨)에서 기술하고 있다.
조직-특이성 프로모터의 다른 예는 (예를 들어, 저작 곤충으로부터의) 잎의 손상 후의 잎 세포, 괴경(예를 들어, 파타틴 유전자 프로모터) 및 섬유 세포(발생상-조절되는 섬유 세포 단백질의 예는 E6임(John et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5769 (1992))에서 발현을 지휘하는 것들을 포함한다. E6 유전자는 섬유에서 가장 활성이나, 잎, 배주 및 꽃에서는 낮은 농도의 전사물이 발견된다.
일부 "조직-특이성" 프로모터의 조직-특이성은 절대적이지 않을 수 있고, 디프테리아 독소 서열을 사용하여 당업자에 의해 시험될 수 있다. 상이한 조직-특이성 프로모터의 조합에 의한 "리키(leaky)" 발현으로 조직-특이성 발현을 달성할 수도 있다(Beals et al., Plant Cell, 9:1527 (1997)). 기타 조직-특이성 프로모터가 당업자에 의해 단리될 수 있다(미국 특허 제5,589,379호 참조).
일 실시양태에서, α-아밀라제와 같은 다당류 가수분해 유전자로부터의 산물이 세포질보다는 아포플라스트와 같은 특정 세포 기관으로 표적화될 수 있다. 이것은단백질에 아포플라스트-특이성 표적화를 부여하는 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열(서열 17)의 사용에 의해 예시된다. 단백질 또는 효소를 특정 구획으로 보냄으로써, 효소가 기질과 접촉하지 않도록 하는 방식으로 효소를 특정 장소에 배치할 수 있다. 이렇게 하여, 효소의 효소적 작용이 그 효소가 기질과 접촉할 때까지 일어나지 않을 것이다. 제분(세포 온전성의 물리적 파괴), 또는 세포 또는 식물 조직을 효소를 함유하는 식물 세포 또는 기관의 물리적 온전성이 파괴될 때까지 가열함으로서 효소를 그의 기질과 접촉시킬 수 있다. 예를 들면, 중온성 전분-가수분해 효소를 아포플라스트 또는 소포체로 표적화하여, 아밀로플라스트에 존재하는 전분 과립과 접촉하지 않게 할 수 있다. 과립의 제분은 과립의 온전성을 파괴할 것이고, 그러면 전분 가수분해 효소는 전분 과립과 접촉할 것이다. 이렇게 하여, 효소와 그의 기질의 공동-편재화의 잠재적 음성 효과를 우회할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 조직-특이성 프로모터는 옥수수 γ-제인 프로모터 (예, 서열 12에 의해 예시됨) 또는 옥수수 ADP-gpp 프로모터(5' 비번역 및 인트론 서열을 포함하는 서열 11에 의해 예시됨)와 같은 내배유-특이성 프로모터를 포함한다. 따라서, 본 발명은 서열 11 또는 12를 포함하는 프로모터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 그의 상보물와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 11 또는 12를 갖는 프로모터의 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 프로모터 활성을 갖는 그의 단편을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 엽록체(아밀로플라스트) 운반 펩티드(CTP) 및 예를 들어왁시유전자로부터의 전분 결합 도메인에 작동적으로 연결된 초호열성 프로세싱 효소를 코딩한다. 이 실시양태에서 예시적 폴리뉴클레오티드는 서열 10(왁시로부터의 전분 결합 도메인에 연결된 α-아밀라제)을 코딩한다. 다른 예시적 폴리뉴클레오티드는 효소를 소포체로 표적화하고 아포플라스트로 분비하는 신호 서열에 연결된 초호열성 프로세싱 효소(각각 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제에 작동적으로 연결된 옥수수 γ-제인으로부터의 N-말단 서열을 포함하는, 서열 13, 27 또는 30을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 예시됨), 소포체 내에 효소를 보유하는 신호 서열에 연결된 초호열성 프로세싱 효소(SEKDEL에 작동적으로 연결된 초호열성 효소인 α-아밀라제, malAα-글루코시다제,티. 마리티마글루코스 이소메라제,티. 네아폴리타나글루코스 이소메라제에 작동적으로 연결된 옥수수 γ-제인으로부터의 N-말단 서열을 포함하는, 서열 14, 26, 28, 29, 33, 34, 35 또는 36을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 예시됨), 효소를 아밀로플라스트로 표적화하는 N-말단 서열에 연결된 초호열성 프로세싱 효소(α-아밀라제에 작동적으로 연결된왁시로부터의 N-말단 아밀로플라스트 표적화 서열을 포함하는, 서열 15를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 예시됨), 효소를 전분 과립으로 표적화하는 초호열성 융합 폴리펩티드(왁시전분 결합 도메인을 포함하는 α-아밀라제/왁시융합 폴리펩티드에 작동적으로 연결된왁시로부터의 N-말단 아밀로플라스트 표적화 서열을 포함하는, 서열 16를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 예시됨), ER 보류 신호에 연결된 초호열성 프로세싱 효소(서열 38 및 39를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 예시됨)를 코딩한다. 게다가, 초호열성 프로세싱 효소는 아미노산 서열(서열 53)을 갖는 생-전분 결합 자리에 연결될 수 있고, 여기서 상기 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이 결합 자리를 코딩하는 옥수수-최적화된 핵산 서열(서열 54)에 연결된다.
몇 몇 유도가능한 프로모터가 보고되었다. 다수가 검토 문헌[Gatz, inCurrent Opinion in Biotechnology,7:168 (1996) 및 Gatz, C.,Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,48:89 (1997)]에 기재되어 있다. 예는 테트라사이클린 억제 시시템, Lac 억제 시스템, 구리-유도가능 시스템, 살리실레이트-유도가능 시스템(예, PRla 시스템), 글루코코르티코이드-유도가능(Aoyama T. et al.,N-H Plant Journal,11:605 (1997)) 및 엑디손-유도가능 시스템을 포함한다. 기타 유도가능한 프로모터는 ABA- 및 팽압-유도가능한 프로모터, 옥신-결합 단백질 유전자 프로모터(Schwob et al.,Plant J.,4:423 (1993)), UDP 글루코스 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자 프로모터(Ralston et al.,Genetics,119:185 (1988)), MPI 단백분해효소 억제제 프로모터(Cordero et al.,Plant J.,6:141 (1994)), 및 글리세르알데히드-3-포스포네이트 탈수소효소 유전자 프로모터(Kohler et al.,Plant Mol. Biol.,29;1293 (1995); Quigley et al.,J. Mol. Evol.,29:412 (1989); Martinez et al.,J. Mol. Biol.,208:551 (1989)). 벤젠 술폰아미드-유도가능(미국 특허 제5,364,780호) 및 알콜-유도가능(WO 97/06269 및 WO 97/06268) 시스템 및 글루타치온 S-전이효소 프로모터도 포함된다.
다른 연구들은 염도의 증가, 가뭄, 병소 및 손상과 같은 환경적 스트레스 또는 자극에 반응하여 유도가능하게 조절되는 유전자에 집중되었다(Graham et al.,J. Biol. Chem.,260:6555 (1985); Graham et al.,J. Biol. Chem.,260:6561 (1985), Smith et al.,Planta,168:94 (1986)). 손상된 감자 식물의 잎에서 메탈로카르복시펩티다제-억제제 단백질의 축적이 보고되었다(Graham et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,101:1164 (1981)). 기타 식물 유전자들이 메틸 자스모네이트, 유도인자, 열-충격, 혐기 스트레스 또는 제초제 완화제에 의해 유도되는 것으로 보고되었다.
키메라 상호작용 바이러스 복제 단백질의 조절된 발현은 다른 유전적 전략, 예를 들면, Cre-매개된 유전자 활성화에 의해 더 조절될 수 있다(Odell et al.Mol. Gen. Genet.,113:369 (1990)). 따라서, 프로모터와, 상기 프로모터로부터키메라 복제 유전자의 발현을 차단하는 복제 단백질 코딩 서열 사이의 lox 자리에 의해 결합된 3' 조절 서열을 함유하는 DNA 단편이 Cre-매개된 절제에 의해 제거될 수 있고, 상호작용 복제 유전자의 발현을 가져온다. 이 경우, 키메라 Cre 유전자, 키메라 상호작용 복제 유전자, 또는 둘 다는 조직- 및 발생-특이성 또는 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 다른 유전적 전략은 tRNA 억제 유전자의사용이다. 예를 들면, tRNA 억제 유전자의 조절된 발현은 적당한 종결 코돈을 함유하는 상호작용 복제 단백질 코딩 서열의 발현을 조건부로 조절할 수 있다(Ulmasov et al.Plant Mol. Biol.,35:417 (1997)). 거듭, 키메라 tRNA 억제 유전자, 키메라 상호작용 복제 유전자, 또는 둘 다는 조직- 및 발생-특이성 또는 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.
바람직하게는, 다세포 유기체의 경우, 프로모터가 특정 조직, 기관 또는 발생 단계에 특이성일 수 있다. 상기 프로모터의 예는제아 마이스ADP-gpp 및제아 마이스γ-제인 프로모터 및제아 마이스글로불린 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자이전 식물에서 유전자의 발현은 식물의 발생 동안 일정 시기에만 요구될 수 있다. 발생 시기 조정은 특정 유전자 발현과 상호관련되어 있는 경우가 종종 있다. 예를 들면, 제인 저장 단백질의 발현은 수분 15분 후에 내배유에서 개시된다.
또한, 유전자이전 식물 세포 내에서 특정 유전자 산물의 세포내 표적화 또는 단백질의 세포외 환경으로의 송달에 벡터를 작제하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 이것은 운반 또는 신호 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 특정 유전자의 크딩 서열에 결합함으로써 달성될 것이다. 생성된 운반 또는 신호 펩티드는 각각 단백질을 특정 세포내 또는 세포외 목적지로 운반할 것이고, 이어서 번역후 제거될 것이다. 운반 또는 신호 펩티드는 세포내 막, 예를 들면, 액포, 소포, 색소체 및 미토콘드리아 막을 통한 단백질의 운반을 촉진하는 반면, 신호 펩티드는 세포외 막을 통해 단백질을 송달한다.
소포체로의 표적화 및 아포플라스트로의 분비를 위한 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열과 같은 신호 서열은 본 발명에 따른 초호열성 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결될 수 있다(Torrent et al., 1997). 예를 들면, 서열 13, 27 및 30은 옥수수 γ-제인 단백질로부터의 N-말단 서열에 작동적으로 연결된 초호열성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또다른 신호 서열은 폴리펩티드를 소포체에 보유하기 위한 아미노산 서열 SEKDEL이다(Munro 및 Pelham, 1987). 예를 들면, 서열 14, 26, 28, 29, 33, 34, 35 또는 36을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEKDEL에 작동적으로 연결된 처리 효소에 작동적으로 연결된 옥수수 γ-제인으로부터의 N-말단 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 왁시 아밀로플라스트 표적화 펩티드(Klosgen et al., 1986) 또는 전분 과립에 융합되어 아밀로플라스트로 표적화될 수도 있다. 예를 들면, 초호열성 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 엽록체(아밀로플라스트) 운반 펩티드 (CTP) 및 예를 들어 왁시 유전자로부터의 전분 결합 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 서열 10은 왁시로부터의 전분 결합 도메인에 연결된 α-아밀라제를 예시한다. 서열 15는 α-아밀라제에 작동적으로 연결된 왁시로부터의 N-말단아밀로플라스트 표적화 서열을 예시한다. 게다가, 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 왁시 전분 결합 도메인을 사용하여 전분 과립으로 표적화되도록 융합될 수 있다. 예를 들면, 서열 16은 왁시 전분 결합 도메인을 포함하는 α-아밀라제/왁시 융합 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 왁시로부터의 N-말단 아밀로플라스트 표적화 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 예시한다.
프로세싱 신호 이외에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지되어 있는, 다른 조절 서열을 더 포함할 수 있다. "조절 서열" 및 "적당한 조절 서열"은 각각 코딩 서열의 상류(5' 비코딩 서열), 내부 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치하고, 관련된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 서열을 말한다. 조절 서열은 인핸서, 프로모터, 번역 선도 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 이들은 천연 및 합성 서열, 및 합성 및 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함한다.
당업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 형질전환된 식물 및 식물 조직의 선택을 허용하기 위해 선택가능한 마커가 본 발명에 사용될 수도 있다. 관심있는 발현가능한 유전자로서, 또는 이에 더하여, 선택가능한 또는 선별가능한 마커 유전자를 사용할 수도 있다. "마커 유전자"는 마커 유전자를 발현하는 세포에 독특한 표현형을 부여하여, 상기 형질전환된 세포가 마커를 갖지 않는 세포로부터 구별되게 하는 유전자이다. 상기 유전자는 마커가 예를 들어 선택 약제(예, 제초제, 항생제 등)의 사용을 통한 화학적 수단에 의해 선택될 수 있는 특징을 부여하느냐,또는 마커가 단순히 관찰 또는 시험, 즉, 스크리닝에 의해 확인할 수 있는 특징(예, R-자리 특징)이냐에 따라, 선택가능한 또는 선별가능한 마커를 코딩할 수 있다. 물론, 적당한 마커 유전자의 많은 예가 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 사용될 수 있다.
그의 선택이 형질전환된 세포를 확인하거나 선택하는 수단으로서 검출될 수 있는 "분비가능한 마커"를 코딩하는 유전자도 선택가능한 또는 선별가능한 마커 유전자 내에 포함된다. 그 예는 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는 분비가능한 항원, 또는 심지어 그의 촉매적 활성에 의해 검출될 수 있는 선택가능한 효소를 코딩하는 마커를 포함한다. 분비가능한 단백질은, 예를 들어 ELISA에 의해 검출가능한 확산가능한 소 단백질; 세포외 용액에서 검출가능한 활성 소 효소(α-아밀라제, β-락타마제, 포스피노트리신 아세틸전이효소); 및 세포벽에 삽입되거나 트래핑되는 단백질(예, 엑스텐신 또는 담배 PR-S의 발현 단위에서 발견되는 것과 같은 선도 서열을 포함하는 단백질)을 비롯하여, 다수의 군으로 분류된다.
선택가능한 분비가능한 마커에 있어서, 세포벽에 격리되고 독특한 에피토프를 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자의 사용은 특히 유리한 것으로 여겨진다. 이론상, 상기 분비된 항원 마커는 식물 조직에 낮은 배경을 제공하는 에피토프 서열, 효과적인 발현 및 원형질 막을 가로지른 표적화를 부여하는 프로모터-선도 서열을 사용할 것이고, 세포벽에 결합되나 항체에 접근가능한 단백질을 생성할 것이다. 독특한 에피토프를 포함하도록 변경된 정상적으로 분비된 벽 단백질은 상기 모든 요건을 만족할 것이다.
이러한 변경에 적당한 단백질의 한 예는 엑스텐신, 또는 히드록시프롤린이 풍부한 당단백질(HPRG)이다. 예를 들면, 옥수수 HPRG(Steifel et al.,The Plant Cell,2:785 (1990)) 분자는 분자 생물학, 발현 및 단백질 구조 면에서 잘 특성화되어 있다. 그러나, 다양한 엑스텐신 및(또는) 글리신이 풍부한 벽 단백질(Keller et al.,EMBO Journal,8:1309 (1989)) 중 임의의 것도 항원성 자리의 첨가에 의해 선별가능한 마커를 생성하도록 변경될 수 있다.
a. 선택가능한 마커
본 발명과 관련하여 사용할 수 있는 선택가능한 마커는 가나마이신 내성을 코딩하고, 가나마이신, G418 등을 사용하여 선택될 수 있는 neo 또는 nptII 유전자(Potrykus et al.,Mol. Gen. Genet.,199:183 (1985)); 제초제 포스피노트리신에 내성을 부여하는 bar 유전자; 변경된 EPSP 합성효소 단백질(Hinchee et al.,Biotech.,6:915 (1988))을 코딩하여 글리포세이트 내성을 부여하는 유전자; 브로목시닐에 대한 내성을 부여하는Klebsiella ozaenae로부터의 bxn과 같은 니트릴라제 유전자(Stalker et al.,Science,242:419 (1988)); 이미다졸리논, 술포닐유레아 또는 기타 ALS-억제 화학물질에 대한 내성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 합성효소 유전자(ALS)(유럽 특허 출원 154,204, 1985); 메토트렉세이트-저항 DHFR 유전자(Thillet et al.,J. Biol. Chem., 263:12500 (1988)); 제초제 달라폰에 대한 내성을 부여하는 달라폰 탈수소효소 유전자; 포스포만노스 이소메라제(PMI) 유전자; 5-메틸 트립토판에 대한 내성을 부여하는 돌연변이 안트라닐레이트 합성효소 유전자; 항생제 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자; 또는 만노스를 대사시킬 수 있는 능력을 제공하는 만노스-6-포스페이트 이소메라제 유전자(본원에서, 포스포만노스 이소메라제 유전자로도 지칭됨)(미국 특허 제5,767,378호 및 제5,994,629호)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적당한 선택가능한 마커 유전자를 선택할 수 있다. 돌연변이 EPSP 합성효소 유전자가 사용될 경우, 적당한 엽록소 운반 펩티드, CTP의 혼입을 통해 부가의 이점이 실현될 수 있다(유럽 특허 출원 0,218,571, 1987).
형질전환체를 선택하기 위해 시스템에 사용될 수 있는 선택가능한 마커 유전자의 예시적 실시양태는 포스피노트리신 아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자, 예를 들면,스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스로부터의 bar 유전자 또는스트렙토마이세스 비리도크로모제네스로부터의 pat 유전자이다. 포스피노트리신 아세틸 전이효소(PAT)는 제초제 비알라포스, 포스피노트리신(PPT) 중의 활성 성분을 불활성화시킨다. PPT는 글루타민 합성효소를 억제하여(Murakami et al.,Mol. Gen. Genet.,205:42 (1986); Twell et al.,Plant Physiol.,91:1270 (1989)), 암모니아의 축적 및 세포사를 일으킨다. 단자엽과 함께 이 선택적 시스템을 사용하는데 있어서의 성공은 곡물의 형질전환에서 보고된 대다수의 어려움으로 인해 특히 놀라웠다(Potrykus,Trends Biotech., 7:269 (1989)).
본 발명의 실시에 비알라포스 저항 유전자를 사용하고자 할 경우, 이 목적에 특히 유용한 유전자는 스트렙토마이세스 종으로부터 얻을 수 있는 bar 또는 pat 유전자이다(예, ATCC No. 21,705). bar 유전자의 클로닝은 단자엽이 아닌 식물(De Block et al.,EMBO Journal,6:2513 (1987); De Block et al.,Plant Physiol.,91:694 (1989))과 관련하여 bar 유전자가 사용된 것으로 기술되었다(Murakami et al.,Mol. Gen. Genet.,205:42 (1986); Thompson et al.,EMBO Journal,6:2519 (1987)).
b. 선별가능한 마커
사용될 수 있는 선별가능한 마커는 다양한 색소형성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자(GUS); 식물 조직에서 안토시아닌 색소의 생성을 조절하는 산물을 코딩하는 R-자리 유전자(Dellaporta et al., inChromosome Structure and Function, 263-282면 (1988)); 다양한 색소형성 기질(예, PADAC, 색소형성 세팔로스포린)이 알려져 있는 효소를 코딩하는 β-락타마제 유전자(Sutcliffe,PNAS USA,75:3737 (1978)); 색소형성 카테콜을 전환할 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자(Zukowsky et al.,PNAS USA,80:1101 (1983)); α-아밀라제 유전자(Ikuta et al.,Biotech.,8:241 (1990)); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논(이는 다시 축합하여 쉽게 검출가능한 화합물인 멜라닌을 형성함)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자(Katz et al.,J. Gen. Microbiol.,129:2703 (1983)); 색소형성 기질이 존재하는 효소를 코딩하는 β-갈락토시다제 유전자; 생물발광 검출을 허용하는 루시페라제(lux) 유전자(Ow et al.,Science,234:856 (1986)); 또는 칼슘-민감성 생물발광 검출에 사용될 수 있는 에쿼린 유전자(Prasher et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,126:1259 (1985)), 또는 녹색 형광 단백질 유전자(Niedz et al.,Plant Cell Reports,14:403 (1995))를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
옥수수 R 유전자 복합체로부터의 유전자가 선별가능한 마커로서 특히 유용할 것으로 여겨진다. 옥수수의 R 유전자 복합체는 대부분의 종자 및 식물 조직에서 안토시아닌 색소의 생성을 조절하는 단백질을 코딩한다. R 유전자 복합체로부터의 유전자는 옥수수 형질전환에 적당한데, 형질전환된 세포에서 이 유전자의 발현이 세포를 손상시키지 않기 때문이다. 따라서, 상기 세포에 도입된 R 유전자는 적색 색소의 발현을 일으킬 것이고, 안정하게 삽입된 경우, 적색 영역으로서 육안으로 평가될 수 있다. 옥수수 계통이 안토시아닌 생합성 경로에서 효소적 중간체를 코딩하는 유전자(C2, Al, A2, Bzl 및 Bz2)에 대한 우성 대립유전자를 지니지만, R 자리에서 열성 대립유전자를 지니는 경우, R을 갖는 계통으로부터 임의의 세포의 형질전환은 적색 색소 형성을 가져올 것이다. 예시적 계통은 rg-Stadler 대립유전자, 및 r-g, b, P1인 K55 유도체인 TR112를 함유하는 위스콘신 22를 포함한다. 별법으로, C1 및 R 대립유전자가 함께 도입되는 경우, 임의의 옥수수 유전형이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 추가의 선별가능한 마커는 lux 유전자에 의해 코딩된 반딧불이 루시페라제이다. 형질전환된 세포에서 lux 유전자의 존재는, 예를 들어, X-선 필름, 섬광 계수, 형광 분광광도법, 저-광 비디오 카메라, 양자 계수 카메라 또는 멀티웰 발광법을 사용하여 검출될 수 있다. 이 시스템은 조직 배양판 상에서와 같은 생물발광을 위한 집단 스크리닝, 또는 심지어 전체 식물 스크리닝을 위해 개발될 수 있을 것으로 생각된다.
식물을 형질전환시키는데 사용되는 폴리뉴클레오티드는 식물 유전자로부터의 DNA, 및 박테리아, 효소, 동물 또는 바이러스로부터의 유전자와 같은 비-식물 유전자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 도입된 DNA는 변형된 유전자, 유전자의 일부, 또는 동일하거나 상이한 옥수수 유전형으로부터의 유전자를 비롯한 키메라 유전자를 포함할 수 있다. 용어 "키메라 유전자" 또는 "키메라 DNA"는 천연 조건 하에서 DNA를 결합시키지 않는 종으로부터의 2개 이상의 DNA 서열 또는 부분을 포함하는 유전자 또는 DNA 서열 또는 부분, 또는 DNA 서열 또는 부분이 형질전환되지 않은 식물의 천연 게놈에서 일반적으로 일어나지 않는 방식으로 배치되거나 연결된 유전자 또는 DNA 서열 또는 부분으로 정의된다.
초호열성 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트가 추가로 제공된다. 발현 카세트 중의 폴리뉴클레오티드가 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 인트론, 종결 서열 또는 이들의 임의의 조합, 및 임의로, 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 효소를 특정 세포 또는 하위세포 위치로 송달하는 신호 서열(N- 또는 C-말단)을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터 및 하나 이상의 신호 서열은 식물, 식물 조직 또는 식물 세포의 특정 위치에서 효소의 높은 수준의 발현을 제공할 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터, 유도가능(조건부) 프로모터 또는 조직-특이성 프로모터, 예를 들면, 옥수수 γ-제인 프로모터(서열 12에 의해 예시됨) 또는 옥수수 ADP-gpp 프로모터(5' 비번역 및 인트론 서열을 포함하는 서열 11에 의해 예시됨)와 같은 내배유-특이성 프로모터일 수 있다. 본 발명은 또한 서열 11 또는 12를 포함하는 프로모터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 그의 상보물과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 11 또는 12를 갖는 프로모터의 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상과 같은 프로모터 활성을 갖는 그의 단편을 제공한다. 또한, 본 발명의 발현 카세트 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 형질전환된 세포도 제공된다. 본 발명의 벡터는 하나를 넘는 본 발명의 초호열성 프로세싱 효소를 코딩하는, 센스 또는 안티센스 배향일 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 형질전환된 세포는 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함할 수 있다. 핵산을 식물 세포에 도입하기에 유용한 벡터가 바람직하다.
형질전환
발현 카세트, 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터 구조물이 세포에 삽입될 수 있다. 발현 카세트 또는 벡터 구조물은 에피좀으로 함유되거나, 또는 세포의 게놈에 혼입될 수 있다. 이어서, 형질전환된 세포는 유전자이전 식물로 성장될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유전자이전 식물의 산물을 제공한다. 상기 생성물은 유전자이전 식물의 종자, 열매, 자손, 및 자손의 생성물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구조물을 세포 숙주에 도입하기 위한 다양한 기술이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있다. 박테리아및 다수의 진핵 세포의 형질전환은 폴리에틸렌 글리콜, 염화칼슘, 바이러스 감염, 파아지 감염, 전기천공 및 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 식물 세포 또는 조직을 형질전환하기 위한 기술은에이. 투메파시엔스또는에이. 리조제네스를 형질전환 물질로 사용하는 DNA를 이용한 형질전환, 전기천공, DNA 주입, 마이크로프로젝트 충격, 입자 가속 등을 포함한다(예를 들어, EP 295959 및 EP 138341 참조).
일 실시양태에서, 아그로박테륨 종 Ti-유도된 벡터의 Ti 및 Ri 플라스미드의 이중 형태 벡터를 사용하여 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예를 들면, 대두, 면, 평지, 담배 및 쌀과 같은 광범위한 고등 식물을 형질전환시킨다(Pacciotti et al.Bio/Technology,3:241 (1985): Byrne et al.Plant Cell Tissue and Organ Culture,8:3 (1987); Sukhapinda et al.Plant Mol. Biol.,8:209 (1987); Lorz et al.Mol. Gen. Genet.,199:178 (1985); PotrykusMol. Gen. Genet.,199:183 (1985); Park et al.,J. Plant Biol.,38:365 (1985): Hiei et al.,Plant J.,6:271 (1994)). 식물 세포를 형질전환시키기 위한 T-DNA의 사용이 집중적으로 시험되었으며, 상세하게 기재되어 있다(EP 120516; Hoekema, In:The Binary Plant Vector System. Offset-drukkerij Kanters B. V.; Alblasserdam (1985), Chapter V; Knauf, et al., Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium In:Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed., Springer-Verlag, New York, 1983, p.245; 및 An. et al.,EMBO J., 4:277 (1985)).
다른 형질전환 방법, 예를 들면, 외부 DNA 구조물의 직접 흡수(EP 295959 참조), 전기천공 기술(Fromm et al.Nature (London),319:791 (1986)), 또는 핵산 구조물로 코딩된 금속 입자를 사용한 고속 탄도 충격(Kline et al.Nature (London) 327:70 (1987) 및 미국 특허 제4,945,050호)이 당업자에게 이용가능하다.형질전환되면, 세포는 당업자에 의해 재생될 수 있다. 최근 기재된 방법은 외부 유전자를 상업적으로 중요한 작물, 예를 들면, 평지씨(De Block et al.,Plant Physiol. 91:694-701 (1989)), 해바라기(Everett et al.,Bio/Technology,5:1201 (1987)), 대두(McCabe et al.,Bio/Technology,6:923 (1988); Hinchee et al.,Bio/Technology,6:915 (1988); Chee et al.,Plant Physiol.,91:1212 (1989); Christou et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA,86:7500 (1989); EP 301749), 쌀(Hiei et al.,Plant J.,6:271 (1994)), 및 옥수수 (Gordon Kamm et al.,Plant Cell, 2:603 (1990); Fromm et al.,Biotechnology,8: 833, (1990)) 내로 형질전환시키는 것과 특히 관련되어 있다.
게놈 또는 합성 단편을 함유하는 발현 벡터는 원형질체, 또는 곤충 조직 또는 단리된 세포로 도입될 수 있다. 발현 벡터가 곤충 조직으로 도입되는 것이 바람직하다. 식물 조직을 배양하는 일반적인 방법이, 예를 들면, 문헌[Maki et al. "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al. (Eds.), pp. 67-88 CRC Press (1993); 및 Phillips et al."Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" in Corn & Corn Improvement, 3rd Edition 10, Sprague et al. (Eds.) pp. 345-387, American Society of Agronomy Inc. (1988)]에 의해 제공된다.
일 실시양태에서, 발현 벡터는 마이크로프로젝트-매개된 전달, DNA 주입, 전기천공 등과 같은 직접 유전자 전달 방법을 사용하여 옥수수 또는 다른 식물 조직에 도입될 수 있다. 발현 벡터는 탄도 장치로 마이크로프로젝트 매개 전달을 사용하여 식물 조직으로 도입된다. 예를 들면, 문헌[Tomes et al. "Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment" in Gamborg and Phillips (Eds.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer Verlag, Berlin (1995)]을 참조한다. 그럼에도, 본 발명은 공지된 형질전환 방법에 따른 초호열성 프로세싱 효소를 사용한 식물의 형질전환을 고려한다. 또한, 문헌[Weissinger et al.,Annual Rev. Genet.,22:421 (1988); Sanford et al.,Particulate Science and Technology,5:27 (1987) (양파); Christou et al.,Plant Physiol.,87:671 (1988) (대두); McCabe et al.,Bio/Technology,6:923 (1988) (대두); Datta et al.,Bio/Technology,8:736 (1990) (쌀); Klein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85:4305 (1988) (옥수수); Klein et al.,Bio/Technology,6:559 (1988) (옥수수); Klein et al.,Plant Physiol.,91:440 (1988) (옥수수); Fromm et al.,Bio/Technology,8:833 (1990) (옥수수); 및 Gordon-Kamm et al.,Plant Cell,2, 603 (1990) (옥수수); Svab et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:8526 (1990) (담배 엽록체); Koziel et al.,Biotechnology,11:194 (1993) (옥수수); Shimamoto et al.,Nature,338:274 (1989) (쌀); Christou et al.,Biotechnology,9:957 (1991) (쌀); 유럽 특허 출원 EP 0 332 581 (orchardgrass and other Pooideae); Vasil et al.,Biotechnology,11:1553 (1993) (밀); Weeks et al.,Plant Physiol.,102:1077 (1993) (밀); Methods in Molecular Biology, 82. Arabidopsis Protocols Ed. Martinez-Zapater and Salinas 1998 Humana Press (Arabidopsis)]을 참조한다.
식물의 형질전환은 단일 DNA 분자 또는 복수 DNA 분자(즉, 공동-형질전환)로 수행될 수 있고, 이들 둘 다의 기술은 본 발명의 발현 카세트 및 구조물과 사용하기에 적합하다. 다수의 형질전환 벡터가 식물 형질전환에 이용가능하고, 본 발명의 발현 카세트가 상기 임의의 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환의 표적 종에 의존할 것이다.
궁극적으로, 단자엽 게놈으로의 도입에 가장 바람직한 DNA 부분은 바람직한 특성(예, 단백질, 지질 또는 다당류의 가수분해)을 코딩하고 신규 프로모터 또는 인핸서 등, 또는 심지어 동종 또는 조직 특이성(예, 뿌리-, 경령/엽초-, 윤생체-, 줄기-, 꼭지-, 씨- 또는 잎-특이성) 프로모터 또는 조절 요소의 조절 하에 도입되는 동종 유전자 또는 유전자 족일 수 있다. 실제로, 본 발명의 특정 용도는 유전자를 구성적 방식 또는 유도가능 방식으로 표적화하는 것일 것으로 여겨진다.
적합한 형질전환 벡터의 예
식물 형질전환에 사용할 수 있는 많은 형질전환 벡터는 식물 형질전환 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고, 본 발명에 적절한 유전자는 당업계에 공지된 이러한 벡터와 결합하여 사용될 수 있다. 벡터의 선별은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환을 위한 표적 종에 의존할 것이다.
a. 아그로박테륨 형질전환에 적합한 벡터
많은 벡터가 아그로박테륨 투메파시엔스를 사용한 형질전환에 사용될 수 있다. 이는 통상적으로 하나 이상의 T-DNA 보더 서열(border sequence)을 운반하고 pBIN19(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))와 같은 벡터를 포함한다. 이하에서, 아그로박테륨 형질전환에 적합한 두 개의 통상적인 벡터의 제작에 대해 기술한다.
pCIB200 및 pCIB2001
2원 벡터 pCIB200 및 pCIB2001은 아그로박테륨과 함께 사용하기 위한 재조합 벡터의 제작에 사용되고 하기와 같은 방법으로 제작된다. pTJS75kan은 테트라시클린-저항 유전자를 절단하게 하는 pTJS75(Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol., 164: 446 (1985))의 NarI 분해에 이어 NPTII를 운반하는 pUC4K로부터 AccI 단편을 삽입함으로써 제조된다(Messing & Vierra, Gene, 19: 259 (1982); Bevan et al., Nature, 304: 184 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology, 14: 266 (1990)). 왼쪽 및 오른쪽 T-DNA 보더, 식물 선별가능한 nos/nptII 키메라 유전자, 및 pUC 폴리링커(Rothstein et al., Gene, 53: 153 (1987))를 함유하는 PCIB7의 EcoRV 단편에 XhoI 링커를 결찰시키고, Xhol-분해된 단편을 SalI-분해된 pTJS75kan으로 클로닝시켜서 pCIB200을 생성시킨다(EP 0 332 104, 실시예 19를 또한 참조). pCIB200은 하기의 독특한 폴리링커 제한 부위를 함유한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, 및 SalI. pCIB2001은 추가적 제한 부위의 폴리링커 내로 삽입됨으로써 생성되는 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커 내의 독특한 제한 부위는 EcoRI, SstI, Kpnl, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI, 및 StuI이다. pCIB2001은 이러한 독특한 제한 부위를 함유하는 것 이외에, 식물 및 세균 카나마이신 선별, 아그로박테륨-매개 형질전환을 위한 왼쪽 및 오른쪽 T-DNA 보더, 이. 콜라이 및 다른 숙주 사이의 이동을 위한 RK2-유도 trfA 기능, 및 역시 RK2로부터의 OriT 및 OriV 기능도 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 그 자신의 조절신호를 함유하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.
pCIB10 및 그의 하이그로마이신 선별 유도체:
2원 벡터 pCIB10은 식물에서의 선별을 위한 카나마이신 저항을 코딩하는 유전자 및 T-DNA 오른쪽 및 왼쪽 보더 서열을 함유하고 이. 콜라이 및 아그로박테륨 모두에서 복제될 수 있게 하는 넓은 숙주 범위의 플라스미드 pRK252로부터의 서열을 혼입한다. 그 제작은 문헌[Rothstein et al. Gene, 53: 153 (1987)]에 기재되어 있다. 문헌[Gritz et al. Gene, 25: 179 (1983)]에 기재된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 혼입하는 pCIB10의 다양한 유도체가 제작된다. 이 유도체들은 하이그로마이신 단독(pCIB743), 또는 하이그로마이신 및 카나마이신(pCIB715, pCIB717) 상에서 유전자이전 식물 세포의 선별을 가능하게 한다.
b. 비-아그로박테륨 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테륨 투메파시엔스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터에서 T-DNA 서열을 필요로 하지 않으므로, T-DNA 서열을 함유하는 상기한 것과 같은 벡터 이외에 이 서열이 없는 벡터를 사용할 수 있다. 아그로박테륨에 의존하지 않는 형질전환 기술은 입자 충격(particle bombardment), 원형질체 흡수(protoplast uptake)(예를 들면, PEG 및 전기천공법) 및 마이크로인젝션을 통한 형질전환을 포함한다. 벡터의 선택은 형질전환되는 종에 대한 선호되는 선별에 크게 의존한다. 비-아그로박테륨 형질전환에 적합한 통상의 벡터의 제작의 비제한적 예에 대해 더 기재한다.
pCIB3064
pCIB3064는 제초제 바스타(또는 포스피노트리신)에 의한 선별과의 조합으로 직접 유전자 전달 기술에 적합한 pUC-유도 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 이. 콜라이 GUS 유전자에 대한 작동적 융합(operational fusion)에서의 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 종결자를 포함하고, PCT 공개 출원 WO 93/07278호에 기재되어 있다. 이 벡터의 35S 프로모터는 출발 부위의 5'에 2 개의 ATG 서열을 함유한다. 이 부위를 ATG를 제거하고 제한 부위 SspI 및 PvuII를 생성시키는 방식으로 표준 PCR 기술을 사용하여 돌연변이시킨다. 새로운 제한 부위는 독특한 SalI 부위로부터 96 및 37 bp 떨어지고, 실제 출발 부위로부터 101 및 42 bp 떨어져 있다. 생성된 pCIB246의 유도체는 pCIB3025로 지칭한다. 그 후 SalI 및 SacI으로 분해시켜서 GUS 유전자를 pCIB3025로부터 절단하고, 말단을 블런트(blunt)하게 하고 재결찰하여 플라스미드 pCIB3060을 생성시킨다. 플라스미드 pJIT82는 노르위치(Norwich)의 존 인스 센터(John Innes Centre)에서 얻을 수 있고, 스트렙토마이세스 비리도크로모젠스(Streptomyces viridochromogenes)로부터의 bar 유전자를 함유하는 400 bp의 SmaI 단편을 절단하고, pCIB3060의 HpaI 부위로 삽입한다(Thompson et al., EMBO J, 6: 2519 (1987)). 이로써 제초제 선별에 대한 CaMV 35S 프로모터및 종결자의 조절 하에 있는 bar 유전자, 암피실린 내성에 대한 유전자(이. 콜라이에서의 선별을 위한) 및 독특한 부위 SphI, PstI, HindIII, 및 BamHI를 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064가 생성된다. 이 벡터는 자체 조절 신호를 함유하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.
pSOG19 및 pSOG35:
플라스미드 pSOG35는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선별가능한 마커로서 이. 콜라이 유전자 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 사용하는 형질전환 벡터이다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(-800 bp), 옥수수 Adh1 유전자(-550 bp)로부터의 인트론 6 및 pSOG10으로부터의 18 bp의 GUS 미번역 선도 서열을 증폭한다. 이. 콜라이 디히드로폴레이트 환원효소 타입 II 유전자를 코딩하는 250-bp의 단편을 또한 PCR에 의해 증폭하고, 이 두 개의 PCR 단편을 pUC19 벡터 골격 및 노팔린 생성효소 종결자를 포함하는 pB1221으로부터의 SacI-PstI 단편(Clontech)과 조립한다. 이 단편의 조립체는 인트론 6 서열, GUS 선도, DHFR 유전자 및 노팔린 생성효소 종결자와 융합한 35S 프로모터를 함유하는 pSOG19를 생성시킨다. pSOG19 내의 GUS 선도를 메이즈 클로로틱 모틀 바이러스(Maize Chlorotic Mottle Virus)(MCMV)로부터의 선도 서열로 교체하여 벡터 pSOG35를 생성시킨다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성에 대한 pUS 유전자를 운반하고, 외부 물질의 클로닝에 사용될 수 있는 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 갖는다.
c. 엽록체 형질전환에 적합한 벡터
식물 색소체에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여, 색소체 형질전환 벡터 pPH143 (WO 97/32011, 실시예 36)를 사용한다. 뉴클레오티드 서열을 pPH143으로 삽입함으로써 PROTOX 코딩 서열을 교체한다. 그 후 이 벡터를 색소체 형질전환 및 스트렙토마이신 내성에 대한 형질전환체의 선별에 사용한다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열을 pPH143에 삽입하여 aadH 유전자를 교체하게 할 수 있다. 이 경우, 형질전환체는 PROTOX 억제제에 대한 내성에 대해 선별된다.
형질전환 방법에 사용되는 식물 숙주
기관형성 또는 배형성에 의해, 추후의 클론 번식이 가능한 식물 조직을 본 발명의 구조물을 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 기관형성이라는 용어는 슈트(shoot) 및 뿌리가 분열 중심으로부터 순차적으로 발생하는 과정을 의미하고, 배형성이라는 용어는 체세포 또는 생식세포로부터 슈트 및 뿌리가 일제히 (순차적이 아님) 함께 발생하는 과정을 의미한다. 선택된 특정 조직은 형질전환되는 특정 종에 사용할 수 있고 가장 적합한 클론 번식 시스템에 의존하여 변할 것이다. 예시적 조직 표적은 잎 디스크, 뿌리, 줄기, 슈트, 잎, 꽃가루, 종자, 배, 떡잎, 배축, 대배우체, 칼루스 조직, 기존의 분열 조직(예를 들면, 정단분열조직, 부아, 및 뿌리 분열조직), 및 유도된 분열 조직(예를 들면, 자엽 분열조직 및 하배축 분열조직), 종양 조직 및 다양한 형태의 세포 및 배양물, 예를 들면 단일 세포, 원형질체, 배, 및 칼루스 조직을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 분화 및 미분화 조직 또는 식물을 포함한다.
본 발명의 식물은 다양한 형태를 취할 수 있다. 식물은 형질전환 세포 및 비-형질전환 세포의 키메라일 수 있고; 식물은 클론 형질전환체(예를 들면, 형질전환되어 발현 카세트를 함유하는 모든 세포)일 수 있고; 식물은 형질전환 및 비형질전환 조직의 그래프트(예를 들면, 시트러스 종에서 비형질전환된 접순에 그래프트된 형질전환된 뿌리 스톡)를 포함할 수 있다. 형질전환된 식물은 다양한 방법, 예를 들면 클론 번식 또는 고전적 육종 기술에 의해 번식될 수 있다. 예를 들면, 제1 대(또는 T1) 형질전환 식물을 자가수분시켜서 동형접합 제2 대(또는 T2) 형질전환 식물을 제공할 수 있고, T2 식물을 고전적 육종 기술을 통해 더 번식시킬 수 있다. 우세한 선별가능한 마커(예를 들면, npt II)가 육종을 돕기 위하여 발현 카세트와 결합될 수 있다.
본 발명은 옥수수 (Zea mays), 브라시카 종 (예를 들면, B. napus, B. rapa, B. juncea), 특히 종자유의 공급원으로서 유용한 브라시카 종, 알팔파 (Medicago sativa), 쌀 (Oryza sativa), 호밀 (Secale cereale), 수수 (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 기장 (예를 들면, 진주 기장 (Pennisetum glaucum), 프로소(proso) 기장 (Panicum miliaceum), 팍스테일 기장(foxtail millet)(Setaria italic), 핑거 기장 (Eleusine coracana), 해바라기 (Helianthus annuus), 홍화 (Carthamus tinctorius), 밀 (Triticum aestivum), 대두 (Glycine max), 담배 (Nicotiana tabacum), 감자 (Solanum tuberosum), 땅콩 (Arachis hypogaea), 면 (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), 고구마 (Ipomoea batatus), 카사바 (Manihot esculenta), 커피 (Cofea spp.), 코코넛 (Cocos nucifera), 파인애플 (Ananas comosus), 시트러스 나무 (Citrus spp.), 코코아 (Theobroma cacao), 차 (Camellia sinensis), 바나나 (Musa spp.), 아보카도 (Persea americana), 무화과 (Ficus casica), 구아바 (Psidium guajava), 망고 (Mangifera indica), 올리브 (Olea europaea), 파파야 (Carica papaya), 캐슈 (Anacardium occidentale), 마카다미아 (Macadamia integrifolia), 아몬드 (Prunus amygdalus), 사탕무 (Beta vulgaris), 사탕수수 (Saccharum spp.), 귀리, 보리, 야채, 관상용수, 목본 식물, 예를 들면 침엽수 및 낙엽수, 호박, 펌프킨, 대마, 서양호박, 사과, 배, 모과, 멜론, 서양자두, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 라스베리, 블랙베리, 강남콩, 수수, 사탕수수, 평지씨, 클로버, 당근 및 아기장대(Arabidopsis thaliana)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단자엽 또는 쌍자엽식물을 비롯한 모든 식물 종의 형질전환을 위해 사용될 수 있다.
야채는 토마토 (Lycopersicon esculentum), 양상추 (예를 들면, Lactuca sativa), 그린빈 (Phaseolus vulgaris), 리마콩 (Phaseolus limensis), 완두콩 (Lathyrus spp.), 콜리플라워, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 및 쿠쿠미스(Cucumis) 속의 식물, 예를 들면 오이 (C. sativus), 칸탈루프 (C. cantalupensis), 및 머스크 멜론 (C. melo)을 포함한다.
관상용수는 진달래 (Rhododendron spp.), 수국 (Macrophylla hydrangea), 히비스커스 (Hibiscus rosasanensis), 장미 (Rosa spp.), 튤립 (Tulipa spp.), 수선화 (Narcissus spp.), 페튜니아 (Petunia hybrida), 카네이션 (Dianthus caryophyllus), 포인세티아 (Euphorbia pulcherrima), 및 국화를 포함한다. 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 침엽수는 예를 들면 로브롤리 소나무 (Pinus taeda), 슬래시 소나무 (Pinus elliotii), 폰데로사 소나무 (Pinus ponderosa), 로지폴 소나무 (Pinus contorta), 및 몬테레이 소나무 (Pinus radiata), 미송(Douglas-fir) (Pseudotsuga menziesii); 웨스턴 헴록 (Tsuga canadensis); 시트카 스프러스 (Picea glauca); 아메리카삼나무 (Sequoia sempervirens); 전나무(true fir), 예를 들면 실버 퍼 (Abies amabilis) 및 발삼 퍼 (Abies balsamea); 및 씨더(cedar), 예를 들면 웨스턴 레드 씨더 (Thuja plicata) 및 알라스카 옐로우 씨더 (Chamaecyparis nootkatensis)를 포함한다. 콩과 식물은 강남콩 및 완두콩을 포함한다. 강남콩은 구아, 로커스트 콩(locust bean), 호로파, 대두, 가든(garden) 콩, 멍빈(mungbean), 리마콩, 파바(fava) 콩, 렌즈콩, 병아리콩(chick pea) 등을 포함한다. 콩과식물은 아라키스(Arachis), 예를 들면 땅콩, 비시아(Vicia), 예를 들면 크라운 베치(crown vetch), 헤어리 베치(hairy vetch), 아주키(adzuki) 콩, 멍빈, 및 병아리콩(chickpea), 루피누스(Lupinus), 예를 들면, 루핀(lupine), 달구지풀, 파세올러스(Phaseolus), 예를 들면, 커먼 빈(common bean) 및 리마콩, 피섬(Pisum), 예를 들면, 필드빈(field bean), 멜리로터스(Melilotus), 예를 들면, 클로버, 메디카고(Medicago), 예를 들면, 알팔파, 로터스(Lotus), 예를 들면, 개미자리, 렌즈(lens), 예를 들면, 렌즈콩, 및 폴스 인디고(false indigo)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 마초(forage) 및 목초는 알팔파, 오차드 그라스(orchard grass), 톨 페스큐(tall fescue), 퍼레니알 라이그라스(perennial ryegrass), 크리핑 벤트 그라스 (creeping bent grass), 및 레드톱(redtop)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 식물은 작물, 예를 들면, 옥수수, 알팔파, 해바라기, 브라시카, 대두, 면, 홍화, 땅콩, 수수, 밀, 기장, 담배, 보리, 쌀, 토마토, 감자, 호박, 멜론, 강남콩 작물 등을 포함한다. 다른 바람직한 식물은 백합강 및 기장아과를 포함한다.
원하는 DNA 서열이 특정 식물 종으로 형질전환되면, 통상적 육종 기술을 사용하여 그 종 내에서 또는 특히 상업적 변종을 비롯한 동일한 종의 다른 변종으로번식될 수 있다.
하기는 쌍자엽식물 및 단자엽식물 모두를 형질전환하기 위한 대표적 기술, 및 대표적 색소체 형질전환 기술이다.
a. 쌍자엽 식물의 형질전환
쌍자엽식물에 대한 형질전환 기술은 당업계에 공지되어 있고 아그로박테륨-기반 기술 및 아그로박테륨을 필요로 하지 않는 기술을 포함한다. 비-아그로박테륨 기술은 원형질체 또는 세포에 의한 직접적 외인성 유전 물질의 흡수를 수반한다. 이는 PEG 또는 전기천공 매개 흡수, 입자 충격 매개 운반, 또는 마이크로인젝션에 의해 달성될 수 있다. 이 기술의 예는 문헌[Paszkowski et al. , EMBO J, 3: 2717 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199: 169 (1985), Reich et al., Biotechnology, 4: 1001 (1986), 및 Klein et al., Nature, 327: 70 (1987)]에 기재되어 있다. 각 경우, 형질전환된 세포는 당해 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 전체 식물로 재생된다.
아그로박테륨-매개 형질전환은 쌍자엽 식물의 형질전환에 바람직한 기술인데, 이는 형질전환의 높은 효율 및 많은 상이한 종에 대한 광범위한 사용성 때문이다. 아그로박테륨 형질전환은 통상적으로 숙주 아그로박테륨 종에 의해 공동 존재하는 Ti 플라스미드상에서 또는 염색체에서 운반되는 vir 유전자의 보충에 의존할 수 있는(예를 들면, pCIB200 및 pCIB2001에 대해서는 스트레인 CIB542 (Uknes et al., Plant Cell, 5: 159 (1993)) 적절한 아그로박테륨 스트레인으로 관심있는 외부 DNA를 운반하는 2원 벡터(예를 들면, pCIB200 또는 pCIB2001)를 전달하는 것을수반한다. 재조합 2원 벡터의 아그로박테륨으로의 전달은 재조합 2원 벡터를 운반하는 이. 콜라이, pRK2013과 같은 플라스미드를 운반하며 재조합 2원 벡터를 표적 아그로박테륨 스트레인으로 이동시킬 수 있는 헬퍼 이. 콜라이 스트레인을 사용하는 트리페어렌탈(triparental) 교배에 의해 달성될 수 있다. 별법으로, 재조합 2원 벡터는 DNA 형질전환에 의해 아그로박테륨으로 전달될 수 있다(Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16: 9877 (1988)).
재조합 아그로박테륨에 의한 표적 식물 종의 형질전환은 보통 아그로박테륨과 식물로부터의 외식편의 공동-경작을 수반하고 당업계에 공지된 프로토콜을 따른다. 형질전환된 조직은 2원 플라스미드 T-DNA 보더 사이에 존재하는 항생제 또는 제초제 내성 마커가 들어 있는 선별가능한 배지 상에서 재생된다.
벡터는 공지의 방식으로 식물 세포로 도입될 수 있다. 형질전환에 바람직한 세포는 백합강 세포 및 기장아과 세포를 비롯하여 아그로박테륨, 단자엽 세포 및 쌍자엽 세포를 포함한다. 바람직한 단자엽 세포는 곡류 세포, 예를 들면, 옥수수 (콘 (corn)), 보리, 및 밀, 및 전분 축적 쌍자엽 세포, 예를 들면 감자이다.
식물 세포를 유전자로 형질전환시키기 위한 또다른 접근 방법은 불활성 또는 생물학적 활성 입자를 식물 조직 및 세포에서 추진(propelling)시키는 것을 수반한다. 이 기술은 미국 특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호에 기재되어 있다. 일반적으로, 이 과정은 불활성 또는 생물학적 활성 입자를 세포에서 세포의 외부 표면을 투과하여 그 내부 내로의 혼입을 가능하게 하기에 효과적인 조건 하에서 추진시키는 것을 수반한다. 불활성 입자가 사용될 때, 원하는 유전자를함유하는 벡터로 입자를 코팅함으로써 벡터를 세포 내로 도입할 수 있다. 별법으로, 표적 세포를 벡터로 둘러싸서 벡터가 입자의 웨이크(wake)에 의해 세포 내로 운반되도록 할 수 있다. 생물학적 활성 입자(예를 들면, 각각 도입하려는 DNA를 함유하는 건조 효모 세포, 건조 세균 또는 박테리오파지)를 식물 세포 조직으로 추진시킬 수도 있다.
b. 단자엽식물의 형질전환
대부분의 단자엽식물 종의 형질전환도 현재 일상적인 일이 되었다. 바람직한 기술은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 전기천공 기술을 사용하여 원형질체로의 직접 유전자 전달, 및 칼루스 조직으로의 입자 충격을 포함한다. 형질전환은 단일 DNA 종 또는 복수 DNA 종을 사용하여 수행될 수 있으며(예를 들면 공동-형질전환), 이들 기술 모두가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 공동-형질전환은 완전한 벡터 제작을 피할 수 있고 관심있는 유전자에 대한 링크되지 않은 위치 및 선별가능한 마커를 갖는 유전자이이전 식물을 생성시키는 장점이 있을 수 있고, 연이은 생성에서 선별가능한 마커의 제거가 가능하다는 점이 바람직하게 여겨진다. 그러나, 공동-형질전환의 사용의 단점은 별도의 DNA 종이 게놈 내로 통합되는 빈도가 100% 미만인 것이다 (Schocher et al., Biotechnology, 4: 1093 1986)).
특허 출원 EP 0 292 435호, EP 0 392 225호, 및 WO 93/07278호에는 옥수수의 우량 근교배 계통으로부터 칼루스 및 원형질체의 제조, PEG 또는 전기천공을 사용하는 원형질체의 형질전환, 및 형질전환된 원형질체로부터 옥수수 식물의 재생을 위한 기술이 기재되어 있다. 문헌[Gordon-Kamm et al. Plant Cell, 2: 603(1990)] 및 [Fromm et al., Biotechnology, 8: 833 (1990)]에서는 입자 충격을 사용하는 A-188-유도 옥수수 계통의 형질전환에 대한 기술이 발표되었다. 또한 WO 93/07278호 및 문헌[Koziel et al., Biotechnology, 11: 194 (1993)]에는 입자 충격에 의한 옥수수의 우량 근교배 계통의 형질전환을 위한 기술이 기재되어 있다. 이 기술은 수분 후 14-15일에 옥수수 이삭에서 절단한 1.5-2.5 mm 길이의 미성숙 옥수수 배 및 충격을 위한 PDS-1000He 바이오리스틱스(Biolistics) 기구를 사용한다.
쌀의 형질전환도 원형질체 또는 입자 충격을 사용하는 직접 유전자 전달 기술에 의해 수행될 수 있다. 원형질체-매개 형질전환은 자포니카(Japonica)-유형 및 인디카(Indica)-유형에 대해 기재되어 있다(Zhang et al., Plant Cell Rep, 7: 379 (1988); Shimamoto et al., Nature, 338: 274 (1989); Datta et al., Biotechnology, 8: 736 (1990)). 두 유형 모두 입자 충격을 이용하여 일상적으로 형질전환될 수 있다(Christou et al., Biotechnology, 9: 957 (1991)). 또한, WO 93/21335호에는 전기천공법을 통한 쌀의 형질전환 기술에 대해 기재되어 있다. 특허 출원 EP 0 332 581호에는 푸이대(Pooideae)과 원형질체의 생성, 형질전환 및 재생을 위한 기술이 기재되어 있다. 이 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀의 형질전환을 가능하게 한다. 추가로, 밀 형질전환은 유형 C 장기간 재생가능한 칼루스의 세포 내로의 입자 충격을 사용하는 방법으로 문헌[Vasil et al., Biotechnology, 10: 667 (1992)]에 기재되어 있고, 또한 미성숙 배 및 미성숙 배-유도 칼루스의 입자 충격을 사용하는 방법으로 문헌[Vasil et al., Biotechnology, 11: 1553(1993)] 및 [Weeks et al., Plant Physiol., 102: 1077 (1993)]에 기재되어 있다. 그러나, 밀 형질전환을 위한 바람직한 기술은 미성숙 배의 입자 충격에 의한 밀의 형질전환을 수반하고, 유전자 전달 전 고 수크로스 또는 고 말토스 단계를 포함한다. 충돌 전, 임의의 수의 배 (길이 0.75-1 mm)를 3% 수크로스(Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum, 15: 473 (1962)) 및 체세포 배의 유도를 위한 3 mg/l 2,4-D를 함유하는 MS 배지 상에 놓고, 어두운 곳에서 진행되도록 하였다. 충격을 위해 선택된 날, 배를 유도 배지에서 꺼내고 오스모티큠(osmoticum) (즉, 수크로스 또는 말토스를 원하는 농도, 통상적으로 15%로 첨가한 유도 배지) 상에 놓는다. 2 내지 3 시간 동안 배의 원형질 분리가 일어나게 한 후, 충격을 준다. 임계적이진 않지만 표적 플레이트 당 20 개의 배가 통상적이다. 적절한 유전자-운반 플라스미드 (예를 들면 pCIB3064 또는 pSG35)를 표준 방법을 사용하여 마이크로미터 크기 금 입자 상에 침전시킨다. 약 1000 psi의 발사 압력 및 표준 80 메쉬 스크린을 사용하는 듀폰 바이오리스틱스(등록상표) 헬륨 기구로 배의 각 플레이트에 쏘았다. 충격 후, 배를 다시 암소에 두어 약 24 시간 동안 회복시켰다(여전히 오스모티큠 상임). 24 시간 후, 배를 오스모티큠에서 꺼내고 다시 유도 배지 상에 약 한 달 동안 둔 후 재생시켰다. 약 한 달 후 발생하는 배형성 칼루스를 갖는 배 외식편을 적절한 선별 제제(pCIB3064의 경우 10 mg/l 바스타, 및 pSOG35의 경우 2 mg/l 메토트렉세이트)를 추가로 함유하는 재생 배지(MS + 1 mg/리터 NAA, 5 mg/리터 GA)로 옮겼다. 약 한 달 후, 발생된 슈트를 절반 강도의 MS, 2% 수크로스, 및 동일한 농도의 선별 제제를 함유하는 "GA7s"로 알려진 더 큰 멸균 용기로 옮겼다.
아그로박테륨을 사용하는 단자엽식물의 형질전환도 기재되어 있다. 본원에 인용함으로써 삽입되는 WO 94/00977호 및 미국 특허 제 5,591,616호를 참조하라.
c. 색소체의 형질전환
니코티아나 타바큠(Nicotiana tabacum) c.v. 'Xanthi nc'의 종자를 T 한청 배지에서 1 인치 원형 배열로 플레이트 당 7 개 발아시키고 문헌[Svab and Maliga, PNAS, 90: 913 (1993)]에 본질적으로 기재된 바와 같이 플라스미드 pPH143 및 pPH145로부터의 DNA로 코팅한 1 ㎛ 텅스텐 입자(M10, Biorad, Hercules, CA)와 함께 파종한 지 12-14일 후 충격을 가하였다. 충격을 가한 묘목을 T 배지 상에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 잎을 절단하고 밝은 빛 (350-500 μmol 광자/m2/s)에서 배축 쪽을 위로 하여 500 ㎍/ml 스펙티노마이신 이염산염 (Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 RMOP 배지 (Svab, Hajdukiewicz and Maliga, PNAS, 87: 8526 (1990))의 플레이트 상에 놓았다. 충격을 가한 지 3 내지 8 주 후 탈색된 잎 아래에 나타나는 내성 슈트를 동일한 선별 배지 상으로 서브클로닝하여, 칼루스가 형성되게 하고, 두 번째 슈트를 분리하고 서브클로닝하였다. 독립 서브클론 내에서 형질전환된 색소체 게놈 카피(호모플라스미시티(homoplasmicity))의 완전한 분리를 써던 블로팅의 표준 기술로 평가하였다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989)). BamHI/EcoRI-분해된 총 세포 DNA (Mettler, I. J. Plant Mol Biol Reporter, 5: 346 (1987))를 1% 트리스-보레이트 (TBE) 아가로스 겔 상에서분리하고, 나일론 막 (Amersham)으로 옮기고 rps7/12 색소체 표적 서열의 일부를 함유하는 pC8로부터 0.7 kb BamHI/HindIII DNA 단편에 상응하는32P-표지된 랜덤 프라임된 DNA 서열 탐침으로 검사하였다. 호모플라스믹 슈트를 스펙티노마이신-함유 MS/IBA 배지 (McBride et al., PNAS, 91: 7301 (1994)) 상에서 무균적으로 뿌리내리게 하였고 온실로 옮겼다.
안정하게 형질전환된 식물의 생산 및 특성 확인
그 후 형질전환된 식물 세포를 유전자이전 세포의 선별을 위하여 적절한 선별 배지에 두고, 칼루스로 성장시켰다. 칼루스로부터 슈트를 성장시키고 루팅(rooting) 배지에서 성장시킴으로써 슈트로부터 작은 식물을 생성시켰다. 식물 세포 내에서의 선별을 위하여 보통 다양한 구조물을 마커와 결합시킨다. 편리하게는, 마커는 살생물제에 내성일 수 있다(특히, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신, 클로람페니콜, 제초제 등과 같은 항생제). 사용된 특정 마커는 도입된 DNA가 없는 세포와 비교하여 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 한 것이다. 본 발명의 전사/발현 카세트를 비롯한 DNA 구조물의 구성성분을 숙주에 대해 천연(내인성) 또는 외래(외인성)인 서열로부터 제조할 수 있다. "외래"는 구조물이 도입되는 야생형 숙주에서 서열이 발견되지 않는 것을 의미한다. 이종접합 구조물은 전사-개시 영역이 유도된 유전자에 대해 자생이 아닌 하나 이상의 영역을 함유할 것이다.
유전자이전 세포 및 식물에서 이전유전자의 존재를 확인하기 위하여, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 써던 블롯 분석을 수행할 수 있다. 써던 블롯에 의하여 폴리핵산 절편의 게놈으로의 통합을 검출하고 정량할 수 있는데, 이는 이들이 적절한 제한 효소의 사용을 통해 절편을 함유하는 구조물로부터 쉽게 구별될 수 있기 때문이다. 이전유전자의 발현 생성물은 생성물의 성질에 따라 웨스턴 블롯 및 효소 분석을 포함하는 다양한 방식 중 하나를 사용하여 검출할 수 있다. 단백질 발현을 정량하고 상이한 식물 조직에서 복제를 검출하기 위한 특히 유용한 방식은 GUS와 같은 리포터 유전자를 사용하는 것이다. 유전자이전 식물이 얻어지면, 이들을 원하는 표현형을 갖는 식물 조직 또는 부분을 생성하기 위하여 성장시킬 수 있다. 식물 조직 또는 식물 부분을 수확하고(하거나) 종자를 수거할 수 있다. 종자는 원하는 특성을 갖는 조직 또는 부분을 갖는 추가의 식물을 성장시키기 위한 공급원으로서 기능할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 형질전환된 식물 또는 식물 부분, 예를 들면 이삭, 종자, 열매, 곡물, 마초, 여물, 또는 깍지, 이러한 식물을 만드는 방법 및 이러한 식물 또는 그의 부분을 이용하는 방법을 제공한다. 형질전환된 식물 또는 식물 부분은 특정 조직의 특정 세포 또는 세포이하(subcellular)의 구획에 또는 발생하는 곡물내로 임의로 위치되는 프로세싱 효소를 발현한다. 예를 들면, 본 발명은 식물의 세포에 존재하는 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분을 제공하고, 여기서 식물 부분은 형질전환된 식물로부터 얻어지고, 그 게놈은 상기 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트를 사용하여 증대된다. 프로세싱 효소는 효소가 활성있는 조건 하에서 기질과 효소를 접촉하게 하는 가열, 그라인딩, 또는 기타 방법과 같은 방법에 의해 활성화되지 않는다면 표적 기질에 작용하지 않는다.
본 발명의 바람직한 방법
본 발명의 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분은 거기서 발현되고 활성화된 프로세싱 효소(중온성, 호열성, 또는 초호열성)를 사용하는 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 게놈이 하나 이상의 프로세싱 효소를 사용하여 증대되는 유전자이전 식물로부터 얻은 유전자이전 식물 부분을 프로세싱 효소가 발현되고 활성화되는 조건 하에 놓는다. 활성화시, 프로세싱 효소는 원하는 결과를 얻기 위하여 정상적으로 작용하는 기질 상에서 작용하도록 활성화되고 기능한다. 예를 들면, 전분-프로세싱 효소는 전분에 작용하여 활성화시 원하는 결과를 얻기 위하여 분해, 가수분해, 이성질체화 또는 달리 변형시킨다. 비-전분 프로세싱 효소는 식물로부터 전분, 지질, 아미노산 또는 다른 식물 산물의 추출을 용이하게 하기 위하여 식물 세포막을 파괴하는데 사용될 수 있다. 또한, 비-초호열성 및 초호열성 효소는 본 발명의 자가-프로세싱 식물 또는 식물 부분과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 중온성 비-전분 분해 효소는 활성화되어 전분 추출을 위하여 식물 세포막을 파괴하고, 이어서 초호열성 전분-분해 효소는 자가 프로세싱 식물에서 활성화되어 전분을 분해할 수 있다.
곡물에서 발현된 효소는 상기 효소를 포함하는 식물 또는 식물 부분을 상기 효소의 활성이 촉진되는 조건하에 위치시킴에 의해 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 하기 기술이 사용될 수 있다: 식물 부분을 물과 접촉시켜 가수분해 효소에 대한 기질을 제공함으로서 효소를 활성화시킬 수 있다. 식물 부분을 물과 접촉시켜 효소가 식물 부분의 성장 동안 효소가 적층되는 콤파트먼트(compartment)로부터 이동하는 것을 가능하게 하여 효소의 기질과 결합될 수 있다. 성숙, 곡물의 건조 및 재-수화 동안 콤파트먼트화가 파괴되기 때문에 효소의 이동이 가능하다. 온전하거나 분쇄 곡물을 물과 접촉시켜 식물 부분의 성장 동안 효소가 적층되는 콤파트먼트로부터 효소가 이동하는 것을 가능하게 하여 효소의 기질과 결합될 수 있다. 또한, 효소는 활성 화합물의 첨가에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들어, 칼슘-의존성 효소는 칼슘의 첨가에 의해 활성화될 수 있다. 기타의 활성 화합물이 당업자에 의해 측정될 수 있다. 효소는 불활성화의 제거에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들어, 아밀라제 효소의 펩티드 억제제가 공지되어 있는데, 아밀라제는 아밀라제 억제제와 공동발현된 후 프로테아제의 첨가에 의해 활성화될 수 있다. 효소는 효소가 가장 활성화되는 조건으로 pH를 변경함으로써 활성화될 수 있다. 효소는 또한 온도를 증가시켜 활성화될 수 있다. 일반적으로 효소는 해당 효소에 대한 최대 온도까지 활성이 증가된다. 중온성 효소는 활성 주변 온도의 수준으로부터 일반적으로 70℃ 이하인 활성을 잃는 온도까지 활성이 증가될 것이다. 유사하게, 호열성 및 초호열성 효소는 또한 온도의 증가에 의해 활성화될 수 있다. 호열성 효소는 활성의 최대 온도 또는 안정성의 최대 온도이하의 온도까지 가열함에 의해 활성화시킬 수 있다. 호열성 효소에 대하여, 안정성 및 활성의 최대 온도는 일반적으로 70 내지 85℃이다. 초호열성 효소는 25℃부터 85℃ 내지 95℃, 심지어100℃의 온도까지 더 큰 잠재적인 변화 때문에 중온성 또는 호열성 효소보다 더 상대적으로 훨씬 높은 활성을 가질 것이다. 증가된 온도는 예를 들어, 베이킹, 비등, 가열, 스티밍, 방전 또는 이들의 임의의 조합과 같은 가열 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 중온성 또는 호열성 효소를 발현하는 식물에서 효소의 활성화는 그라인딩에 의해 수행될 수 있고, 이에 의해 효소는 기질과 접촉하는 것이 가능해진다.
최적 조건, 예를 들어, 온도, 수화, pH 등은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 이용되는 개개의 효소 및 효소의 요망되는 용도에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 추가로 특정 공정을 보조할 수 있는 외인성 효소의 사용에 대해 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 자가-프로세싱 식물 또는 식물 부분의 이용은 반응을 촉진하는 외인성 효소와 혼합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자이전 α-아밀라제 옥수수는 전분을 가수분해하거나 에탄올을 생산하는 다른 전분-프로세싱 효소, 예를 들어, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 만나나제, 헤미셀룰라제 등과 혼합하여 사용될 수 있다. 실제적으로 이러한 효소와 유전자이전 α-아밀라제 옥수수의 혼합물은 유전자이전 α-아밀라제 옥수수 단독 사용에 비해 기대이상으로 우수한 정도의 전분 전환을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 고려될 수 있는 적절한 방법의 예를 제시한다.
a. 식물로부터 전분 추출
본 발명은 식물로부터의 전분 추출을 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 물리적으로 제한된 내배유의 매트릭스(세포벽, 비-전분 다당류, 및 단백질 매트릭스)를 파괴하는 프로세싱 효소를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 식물로 도입시켜 효소가 식물 중에서 전분 과립과 물리적으로 아주 근접하여 있게 한다. 바람직하게는, 본 발명의 실시양태에서는 형질전환된 식물이 전분 과립의 온전성(integrity)이 유지될 정도로 1종 이상의 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 티오레독신/티오레독신 환원제, 에스테라제 등을 포함하나 임의의 전분 파괴활성을 갖는 효소는 아닌 효소를 발현한다. 따라서, 곡물과 같은 식물 부분에서의 이들 효소의 발현은 곡물의 프로세싱 성질을 개선시킨다. 프로세싱 효소는 중온성, 호열성, 또는 초호열성일 수 있다. 일례로, 본 발명의 형질전환된 식물로부터의 곡물은 비-초호열성 프로세싱 효소의 불활성화 및 종자 완전성을 개선될 수 있도록 가열건조시켰다. 곡물 (또는 분쇄 곡물) 이산화황의 존재 또는 부재하에서 저온 또는 고온(여기서, 시간이 중요함)에서 고습 또는 저습 함유 또는 조건(문헌[Primary Cereal Processing, Gordon and Willm, eds. , pp. 319-337 (1994)] 참고; 상기 문헌은 본원에 포함됨)에서 침지시켰다. 승온에 도달하자, 임의로 습기 조건에서, 그 안의 전분 과립을 온전하거나 생성된 물질로부터 회복가능하게 하는 내배유에 존재하는 비-전분 다당류 및 단백질을 분해하는 효소, 예를 들어, 프로테아제, 크실라나제, 피타제 또는 글루카나제를 활성화시켜 내배유 매트릭스의 온전성이 파괴되었다. 추가로, 유출물(effluent) 중의 단백질 및 비-전분 다당류는 적어도 부분적으로 분해되고 고도로 농축시켜 개선된 동물 사료, 음식을 위해서, 또는 미생물의 발효의 배지 성분으로서 사용될 수 있다. 유출물은 개선된 조성물을 갖는 옥수수-침지 리큐르로 생각된다.
따라서, 본 발명은 전분 과립을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에서 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 곡물, 예를 들어, 분쇄 곡물을 처리하여 전분 과립 및 비 전분 분해 산물, 예를 들어, 분해되는 내배유 매트릭스 생성물을 포함하는 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. 비-전분 프로세싱 효소는 중온성, 호열성, 또는 초호열성일 수 있다. 효소의 활성화 후, 전분 과립은 혼합물로부터 분리시킨다. 곡물은 게놈이 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는(이에 의해 증대되는) 형질 전환된 식물로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 효소는 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 피타제, 티오레독신/티오레독신 환원제 또는 에스테라제일 수 있다. 바람직하게는, 프로세싱 효소는 초호열성이다. 곡물은 이산화황의 존재 또는 부재하에서 저습 또는 고습 하에서 처리될 수 있다. 유전자이전 식물로부터 곡물 내의 프로세싱 효소의 활성 및 발현 수준에 따라 유전자이전 곡물은 프로세싱 전 또는 프로세싱 중에 미가공(commodity) 곡물과 혼합될 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 얻어진 생성물, 예를 들어, 1종 이상의 추가 성분을 포함하는 전분, 비-전분생성물 및 개선된 침지수를 제공한다.
b. 전분-프로세싱 방법
본 발명의 형질전환된 식물 또는 식물 부분은 전분 과립을 덱스트린, 다른 개질된 전분 또는 헥소스(hexose)(예를 들어, α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 아밀로풀루란아제)로 분해시키거나 글루코스를 프락토스(예를 들어, 글루코스 이소메라제)로 전환시키는 본원에 개시 전분-분해 효소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 전분-분해 효소는 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 네오풀루란아제, 아밀로풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되고, 곡물을 형질전환하도록 이용된다. 또한, 바람직하게는, 효소를 전분 과립, 백색체, 아포플라스트, 또는 소포체로 표적화시키는 프로모터 및 신호 서열에 효소가 작동적으로 연결된다. 가장 바람직하게는, 효소가 내배유에서, 특히, 옥수수 내배유에서 발현되고, 1종 이상의 세포성 콤파트먼트 또는 전분과립 그자체로 위치시킨다. 바람직한 식물 부분은 곡물이다. 바람직한 식물 부분은 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 사탕수수 또는 쌀로부터 유래된 것이다.
본 발명의 한가지 전분-분해 방법에 따르면, 형질전환된 곡물이 전분 과립에서 전분-분해 효소를 축적하고, 50℃ 내지 60℃의 통상적인 온도에서 침지시키고, 당업계에 공지된 방식으로 습식-분쇄시킨다. 바람직하게는, 전분-분해 효소는 초호열성이다. 효소가 전분 과립으로의 서브-세포성 표적화로 인해서, 효소와 전분 과립의 결합에 의해서, 통상의 온도에서 습식-제분 프로세싱 동안의 효소 및 전분 과립의 접촉에 의해서 프로세싱 효소는 전분 과립과 공동 정제시켜 전분 과립/효소 혼합물을 얻는다. 전분 과립/효소 혼합물의 회수에 이어서, 효소는 효소의 활성에 대해 유리한 조건을 제공함으로써 활성화된다. 예를 들어, 전분을 헥소스로 부분적(유도화된 전분 또는 덱스트린을 생산하기 위함) 또는 완전한 가수분해를 촉진하는 습기 및(또는) 온도의 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 고-덱스트로스 또는 프락토스 등가체를 포함하는 시럽이 이러한 방식으로 얻어진다. 이러한 방법은 시간, 에너지, 효소 비용을 효과적으로 절감하고, 전분을 대응 헥소스로 전환시키는 효율 및 고-당 침지수 및 고-덱스트로스 등가체 시럽과 같은 생성물의 생산 효율이 증가된다.
다른 실시양태에서, 식물, 또는 식물의 생산물, 예를 들어, 열매 또는 곡물, 또는 효소를 발현하는 곡물로부터 생산된 가루를 처리하여 효소를 활성화시키고, 식물내에 포함되고 발현된 다당류를 당으로 전환시킨다. 바람직하게는, 효소를 전분 과립, 백색체, 아포플라스트, 또는 본원에 개시된 바와 같은 소포체로 표적화하는 신호 서열과 접합시킨다. 이어서, 생산된 당은 식물 또는 식물의 생산물로부터 단리되거나 회수될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다당류를 당으로 전환시킬 수 있는 프로세싱 효소를 당업계에서 공지되고 본원에서 개시된 방법을 따라 유도가능한 프로모터의 조절하에 배치한다. 프로세싱 효소는 중온성, 호열성 또는 초호열성일 수 있다. 식물을 목적하는 단계로 성장시키고, 프로모터가 효소의 발현 및 식물 또는 식물의 생산물 내에서 다당류의 당으로의 전환을 유발하도록 유도된다. 바람직하게는, 효소를 전분 과립, 백색체, 아포플라스트 또는 소포체로 표적화하는 신호 서열에 효소가 작동적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 형질전환된 식물은 생산되어 전분을 당으로 전환시킬 수 있는 프로세싱 효소를 발현한다. 효소는 효소를 식물내 전분 과립으로 표적화시키는 신호 서열과 접합된다. 이어서, 형질전환된 식물에 의해 발현된 효소를 포함하는 형질전환된 식물로부터 단리된다. 이어서, 단리된 전분 중에 포함된 효소는 전분을 당으로 전환시키도록 활성화될 수 있다. 효소는 중온성, 호열성, 또는 초호열성일 수 있다. 전분을 당으로 전환시킬수 있는 초호열성 효소의 예가 본원에서 제공된다. 상기 방법은 다당류를 제공하고 다당류를 당 또는 가수분해된 전분 산물, 예를 들어, 덱스트린, 말토올리고당, 글루코스 및(또는) 그의 혼합물으로 전환시킬 수 있는 효소를 발현시킬 수 있는 임의의 식물과 함께 이용될 수 있다.
본 발명은 다당류의 특정 공유 결합을 가수분해시켜 다당류 유도체를 형성하는 프로세싱 효소를 이용하여 형질전환시킨 식물로부터 생성물, 식물로부터 변경된전분 또는 덱스트린을 제공하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 식물 또는 식물의 생산물, 예를 들어, 열매 또는 곡물, 또는 효소를 발현하는 곡물로부터 생산된 가루를 효소를 활성화시키고 식물내 포함된 다당류를 감소된 분자량의 다당류로 전환시키는데 충분한 조건하에 위치시킨다. 바람직하게는, 효소는 효소를 전분 과립, 백색체, 아포플라스트 또는 본원에 개시된 소포체로 표적화시키는 신호 서열과 접합시킨다. 이어서, 덱스트린 또는 생산된 유도화 전분은 식물 또는 식물의 생산물로부터 단리되거나 회수될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다당류를 덱스트린 또는 변경된 전분으로 전환시킬 수 있는 프로세싱 효소를 당업계에 공지되고 본원에 개시된 방법을 따라 유도가능한 프로모터의 조절 하에 배치시킨다. 식물은 목적하는 단계로 성장시키고, 프로모터는 효소의 발현 또는 식물 또는 식물의 생산물내 다당류를 덱스트린 또는 변경된 전분으로의 전환을 유발한다. 바람직하게는, 효소는 α-아밀라제, 풀루란아제, 이소- 또는 네오-풀루란아제이고, 효소를 전분 과립, 백색체, 아포플라스트 또는 소포체로 표적화하는 신호 서열과 작동적으로 연결된다. 일 실시양태에서, 효소는 아포플라스트 또는 소포체로 표적화시킨다. 또다른실시양태에서는 형질전환된 식물이 생산되어 전분을 덱스트린 또는 개질된 전분을 전환시킬 수 있는 효소를 발현한다. 효소는 효소를 식물내 전분 과립으로 표적화하는 신호서열과 접합된다. 이어서, 전분을 형질전환된 식물에 의해 발현된 효소를 포함하는 형질전환 식물로부터 단리시킨다. 이어서, 단리된 전분 중에 포함된 효소는 전분을 덱스트린 또는 변경된 전분으로 전환시키는 활성화에 충분한 조건하에서 활성화시킬 수 있다. 전분을 가수분해된 전분 생성물로 전환시킬 수 있는 초호열성 효소의 예들이 본원에서 제공된다. 상기 방법은 다당류를 생산하고 다당류를 당으로 전환시킬 수 있는 효소를 발현시킬 수 있는 임의의 식물과 함께 이용될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 전분 과립 중의 결합을 덱스트린, 변경된 전분 또는 헥소스(예를 들어, α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 아밀로풀루란아제)으로 분해시키는 전분-분해 효소를 축적하는 본 발명의 형질전환된 식물로부터의 곡물을 전분 분해 효소의 활성에 유리한 조건하에서 다양한 시간동안 침지시킨다. 생성된 혼합물은 높은 수준의 전분-유래 생성물을 포함할 수 있다. 이러한 곡물을 이용하면: 1) 곡물을 분쇄하거나 곡물을 먼저 전분 과립으로 얻기 위해 가공할 필요가 없어지고, 2) 곡물의 내배유 조직 내 직접적으로 효소를 위치시킴으로써 전분을 효소에 더 접근가능하게 할 수 있고, 3) 미생물적으로 생산된 전분 가수분해 효소에 대한 필요가 없어진다. 따라서, 헥소스 회수 전에 습식-제분의 공정이 전부 효소를 전분상에서 작용하는 것을 가능하게 하는 물의 존재하에서 곡물, 바람직하게는 옥수수 곡물을 단순 가열시킴에 의해 제거된다.
상기 공정은 에탄올, 고-프락토스 시럽, 발효배지를 포함하는 헥소스(글루코스)의 생산을 위해 또는 곡물 성분의 정제가 필요하지 않은 전분의 임의의 다른 용도로 사용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에서 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 처리하여 그에 의해 전분 과립을 분해시켜 당을 포함하는 슈용액을 형성하는 것을 포함하는 덱스트린, 말토올리고당, 및(또는) 당을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득된다. 이어서, 덱스트린, 말토올리고당 및(또는) 당을 포함하는 수용액을 수거한다. 일 실시양태에서, 프로세싱 효소는 α-아밀라제, α-글루코시다제, 풀루란아제, 글루코아밀라제, 아밀로풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합이다. 바람직하게는, 효소는 초호열성이다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 덱스트린, 말토올리고당 및(또는) 당을 단리시키는 것을 추가로 포함한다.
c. 개선된 옥수수 변이체
본 발명은 또한 전분 축적의 보통 수준을 가지고, 충분한 정도의 내배유 중의 전분가수분해(amylolytic) 효소 또는 전분 축적 기관을 축적하여 초호열성 효소의 경우 식물 또는 그의 부분을 비등시키거나 가열시킴으로서 그 안에 포함된 효소를 활성화시키면 상기 효소는 활성화되어 전분을 단순 당으로 빠르게 전환시키는 것을 촉진하도록 하는 개선된 옥수수 변이체(및 다른 작물의 변이체)의 생산에 대해 제공한다. 이러한 단순 당(주로 글루코스)은 처리된 옥수수에 감미를 제공할것이다. 생성된 옥수수 식물은 곡물 생산 하이브리드로서와 감미 옥수수로서의 이중의 용도에 대한 개선된 변이체이다. 따라서, 본 발명은 게놈이 하나 이상의 전분가수분해 효소를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드로 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 내배유 중에서 발현시키고 증대된 형질감염된 옥수수 또는 그의 부분을 고감미 옥수수를 수득하는 옥수수 내의 다당류를 당으로 전환시키도록 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에서 처리하여 고감미 옥수수를 수득하는 것을 포함하는 고감미 옥수수를 제공하는 방법을 제공한다. 프로모터는 α-아밀라제와 같은 프로세싱 효소, 예를 들어, 서열 13, 14 또는 16을 포함하는 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 연결된 구성적 프로모터, 종자-특이성 프로모터, 또는 내배유-특이성 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 효소는 초호열성이다. 일 실시양태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소에 작동적으로 연결된 신호 서열을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본 발명의 상기 실시양태에서 예시적인 신호서열은 효소를 아포플라스트, 소포체, 전분 과립 또는 백색체로 연결해준다. 옥수수 식물은 성장하여 낟알을 갖는 이삭이 형성된 후 프로모터가 효소가 발현되도록 하고 식물내에 포함된 다당류를 당으로 전환시키도록 유도된다.
d. 자가-발효 식물
본 발명의 다른 실시양태에서, 식물, 예를 들어, 옥수수, 쌀, 밀 또는 사탕수수는 세포벽 중의 대량의 프로세싱 효소, 예를 들어, 크실라나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 글루카나제, 펙티나제 등(비-전분 다당류 분해 효소)을 축적되도록 처리된다. 곡물 성분(또는, 사탕수수의 경우는 당)의 수확에 이어서, 마초, 여물, 또는 깍지를 발현 및 세포벽내 축적을 목적으로 하는 효소의 공급원으로서 및 생물자원의 공급원으로서 사용된다. 마초(또는 다른 나머지 조직)은 발효가능한 당을 회수하는 방법에 공급원료로서 사용된다. 발효가능한 당을 얻는 방법은 비-전분 다당류 분해 효소를 활성화시키는 것으로 구성된다. 예를 들어, 활성화는 비-전분 다당류를 생성된 당으로 가수분해시키기에 적당한 시간 동안 물의 존재하에서 식물 조직을 가열하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 자가-프로세싱 마초는 공급 원료의 일 성분이기 때문에 본질적으로 추가 비용없이 다당류를 단당류로 전환시키는데 필요한 효소를 제공한다. 추가로, 온도-의존성 효소는 식물 성장 및 발생에 어떠한 해로운 영향도 없으며, 세포벽 표적화, 심지어 단백질에 접합된 셀룰로오스/크실로스 결합 도메인에 의해 다당류 마이크로피브릴로의 표적화는 기질의 효소에 대한 접근가능성을 개선시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 식물 부분의 세포의 세포벽에 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에서 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분을 처리하여 그에 의해 전분 과립을 분해시켜 당을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서, 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것이고, 당을 포함하는 수성 용액을 수집하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 식물 또는 식물 부분의 세포의 세포 또는세포벽 중에 존재하는 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 또는 식물 부분을 포함한다. 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소, 예를 들어, 크실라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 페크티나제 또는 그들의 조합을 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득된다.
e. 단백질 및 당 함유물 중의 높은 수성상
다른 실시양태에서, 프로테아제 및 리파제는 종자, 예를 들어, 대두 종자 중에 축적되도록 처리된다. 프로테아제 또는 리파제의 활성화, 예를 들어, 가열, 후, 종자 내의 상기 효소는 프로세싱 중의 대두 중에 존재하는 지질 및 저장 단백질을 가수분해한다. 따라서, 먹이, 음식 또는 발효 배지로서 사용될 수 있는 아미노산 및 지방산을 포함하는 가용성 생성물을 얻을 수 있다. 다당류는 통상적으로 가공된 곡물의 불가용성 부분에서 발견된다. 그러나, 다당류 분해 효소 발현 및 종자 내 축적을 결합시킴에 의해 단백질 및 다당류는 가수분해될 수 있고, 수성상에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 옥수수로부터의 제인 및 대두로부터의 저장 단백질 및 비전분 다당류는 이러한 방식으로 용해화될 수 있다. 수성상 및 소수성상의 성분은 유기 용매 또는 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출하여 쉽게 분리시킬 수 있다. 따라서, 제공되는 것은 높은 수준의 단백질, 아미노산, 당 또는 당류를 포함하는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 방법이다.
f. 자가-프로세싱 발효
본 발명은 에탄올, 발효 음료 또는 다른 발효-유도 생성물을 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 식물 또는 생산물 또는 식물 부분 또는 곡물 가루와 같은 식물 유도체를 얻는 것을 포함하고, 여기서, 다당류를 당으로 전환시키는 프로세싱 효소가 발현된다. 식물 또는 그의 생산물은 상기 정의된 바에 따라 당을 다당류로 전환시켜 제조하도록 처리된다. 이어서, 당 및 식물의 다른 성분은 당업계에서 공지된 방식을 따라 발효되어 에탄올 또는 발효시킨 음료 또는 다른 발효-유래 생산물을 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,929,452호 참고. 간단히, 다당류의 전환에 의해 생산되는 당은 당을 에탄올로 전환시키는 것을 촉진하는 조건하에서 효모를 이용하여 인큐베이션시킨다. 적절한 효모는 효모의 고-알콜 내성이고 고-당 내성 균주, 예를 들어, 효모, 에스. 세레비시아에 (S. cerevisiae) 기탁번호 20867을 포함한다. 상기 균주는 1987년 9월 17일자로 메릴랜드 록빌의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었고, 기탁번호 20867로 지정되었다. 이어서, 발효시킨 생성물 또는 발효 음료를 증류시켜 에탄올 또는 증류 음료를 단리시키거나 발효 생성물을 회수한다. 상기 방법에 사용된 식물은 다당류를 포함하는 임의의 식물일 수 있고, 본 발명의 효소를 발현시킬 수 있다. 다수의 이러한 식물이 본원에 개시된다. 바람직하게는, 상기 식물은 상업적으로 재배되는 것이다. 더 바람직하게는, 식물은 일반적으로 에탄올 또는 발효음료 또는 발효생산물, 예를 들어, 밀, 보리, 옥수수, 호밀, 감자, 포도 또는 쌀을 생산하는데 사용된다. 가장 바람직하게는, 상기 식물은 옥수수이다.
상기 방법은 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에서 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 처리하여 식물 부분내 다당류를 분해시켜 발효가능한 당을 형성하는 것을 포함한다. 다당류 프로세싱 효소는 중온성, 호열성 또는 초호열성일 수 있다. 바람직하게는, 효소는 초호열성이다. 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된 형질전환된 식물로부터 수득된다. 본 발명의 실시양태에 대한 식물 부분은 곡물, 열매, 종자, 줄기, 나무, 야채 또는 뿌리를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 식물은 귀리, 보리, 밀, 장과, 포도, 호밀, 옥수수, 쌀, 감자, 사탕무, 사탕수수, 파인애플, 목초 및 나무를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 식물 부분은 미가공 곡물 또는 다른 상업적으로 이용가능한 기질과 결합될 수 있고; 프로세싱을 위한 기질의 공급원이 자가-프로세싱 식물이외의 공급원일 수 있다. 이어서, 발효가능한 당은 발효가능한 당을 에탄올로 전환시키는 것을 촉진하는 조건하에서, 예를 들어, 효모 및(또는) 다른 미생물을 이용하여 인큐베이션시킨다. 바람직한 실시양태에서, 식물 부분은 α-아밀라제로 형질전환시킨 옥수수로부터 얻으며, 이는 발효의 시간 및 비용을 절감하는 것이 밝혀졌다.
예를 들어 열안정성의 α-아밀라제를 발현시키는 본 발명에 따라 제조된 유전자이전 옥수수를 발효에 사용하는 경우 잔류 전분의 양이 감소된다고 밝혀졌다. 이는 발효동안 더 많은 전분이 용해된다는 것을 나타낸다. 잔류 전분의 감소된 양은 중량 및 고급 가에 의해 고급 단백질 함유량을 갖는 증류기의 낟알을 제공한다. 게다가, 본 발명의 유전자이전 옥수수의 발효는 액화 공정이 저급 pH에서 수행되는 것을 가능하게 하여 고온에서, 예를 들어 85℃에서, 바람직하게는, 90℃에서, 더 바람직하게는 95℃이상에서 pH를 조절하는데 사용하는 화학물질의 비용을 절감하게하고, 감소된 액화시간 및 전분의 더 완전한 용해화 및 액화시간의 감소를 제공하고, 이들 모두에 의해 에탄올의 고수율을 갖는 효율적인 발효 반응이 제공된다.
또한, 통상적인 식물 부분을 본 발명을 따라 제조된 유전자이전 식물의 심지어 작은 부분과라도 접촉시키면 발효 시간 및 그와 관련된 비용이 감소될 수 있다고 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 다당류 프로세싱 효소를 포함하지 않는 식물 부분의 사용에 비해 다당류를 당으로 전환시키는 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 식물로부터 유전자이전 식물 부분을 작업하는 것을 포함하는 식물에 대한 발효시간의 감소에 관한 것이다.
g. 생 전분 프로세싱 효소 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
중온성 프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 식물 또는 식물 부분로 도입시킨다. 바람직한 실시양태에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 서열 47 및 49에 제공되는 바와 같은 글루코아밀라제를 코딩하는 서열 48, 50 및 59에 제공된 바와 같은 옥수수-최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 바람직한 실시양태에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 51에 제공되는 바와 같은 알파-아밀라제를 코딩하는 서열 52에 제공된 바와 같은 옥수수-최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 또한, 프로세싱 효소의 접합 생성물이 추가로 고려될 수 있다. 하나의 바람직한 실시양태에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 서열 45에 제공되는 바와 같은 알파-아밀라제 및 글루코아밀라제 접합을 코딩하는 서열 46에 제공되는 바와 같은 옥수수-최적화된 폴리뉴클레오티드이다. 프로세싱 효소의 조합은 본 발명에 의해 추가로 예측될 수 있다. 예를 들어, 전분-프로세싱 효소 및 비-전분 프로세싱 효소의 조합이 본원에서 고려될 수 있다. 이러한 프로세싱 효소의 조합은 각 효소를 코딩하는 다수유전자 구조를 사용함에 의해 수득될 수 있다. 별법으로, 효소에 의해 안정하게 형질전환된 개개의 유전자이전 식물을 공지된 방법에 의해 교접시켜 효소를 둘다 포함하는 식물을 얻을 수 있다. 다른 방법은 유전자이전 식물과 함께 외인성 효소의 사용을 포함한다.
전분-프로세싱 및 비-전분 프로세싱 효소의 공급원은 임의의 공급원으로부터 단리되거나 유래될 수 있고, 이에 상응하는 폴리뉴클레오티드는 당업자에 의해 확인될 수 있다. 바람직하게는, α-아밀라제는 아스페르길루스 (Aspergillus)(예를 들어, 아스페르길루스 시로우사미 (Aspergillus shirousami) 및 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)), 리조푸스(Rhizopus)(예를 들어, 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae)), 및 식물, 예를 들어, 옥수수, 보리, 및 쌀로부터 유래되었다. 바람직하게는, 글루코아밀라제는 아스페르길루스(예를 들어, 아스페르길루스 시로우사미 및 아스페르길루스 니게르), 리조푸스(예를 들어, 리조푸스 오리자에) 및 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)(예를 들어, 써모아나에로박터 써모사카롤리티큠)으로부터 유래된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 53으로 제공된 생 전분 결합 도메인을 코딩하는 서열 54에 의해 제공된 옥수수-최적화 폴리뉴클레오티드로 작동적으로 연결된 중온성 전분-프로세싱 효소를 코딩한다.
다른 실시양태에서, 조직-특이성 프로모터는 내배유-특이성 프로모터, 예를 들어, 옥수수γ-제인 프로모터(서열 12에 의해 예시됨) 또는 옥수수 ADP-gpp 프로모터(서열 11에 의해 예시됨, 5' 미번역서열 및 인트론서열을 포함함)을 포함한다. 따라서, 서열 11 또는 12를 포함하는 프로모터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 그의 상보물로 혼성화시킨 폴리뉴클레오티드, 또는 프로모터의 활성, 예를 들어, 10% 이상 및 바람직하게는 50% 이상의 서열 11 또는 12를 갖는 프로모터의 활성을 갖는 그의 단편을 포함한다.
일 실시양태에서, 전분-가수분해 유전자로부터의 생산물, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 또는 α-아밀라제/글루코아밀라제 접합물을 세포질보다는 소포체 또는 아포플라스트 같은 특정 세포기관 또는 장소로 표적화시킬 수 있다. 이는 아포플라스트- 단백질의 특이적 표적을 제공하는 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (서열 17)의 사용 및 소포체에 보유를 위한 서열 SEKDEL로 작동적으로 연결된 프로세싱 효소에 작동적으로 연결된 γ-제인 N-말단 신호 서열 (서열 17)의 사용에 의해 예시화된다. 특이적 콤파트먼트로 단백질 또는 효소를 연결시키는 것은 효소가 기질과 접촉하게 되지 않는 방식으로 배치하는 것을 가능하게 할 것이다. 이러한 방식으로 효소의 효소작용은 효소가 그의 기질을 접촉하지 않을 때까지 발생하지 않을 수 있다. 효소는 분쇄(세포 온전성의 물리적인 분열) 및 수화의 공정에 의해 그의 기질과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 중온성 전분-가수분해 효소는 아포플라스트 또는 소포체에 표적화시킬 수 있고, 따라서, 백색체에 전분 과립과 접촉하게 되지 않을 것이다. 곡물의 분쇄는 곡물의 온전성을 파괴할 수 있고, 이어서, 전분 가수분해 효소는 전분 과립을 접촉시킬 수 있다. 이러한 방식으로 효소 및 그의 기질의 공동-편재화의 잠재적인 부정적 영향을 회피할 수 있다.
h. 첨가된 감미제가 없는 식품
추가적인 감미제를 첨가하지 않은 감미화된 곡분 식품을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 곡분 제품의 예는 조반, 즉석 식품, 베이킹한 음식, 파스타 및 곡류 제품 예를 들면 조반 곡물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그 방법은 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 전분 프로세싱 효소를 활성화하는 조건하에서 처리하고, 그리하여 예를 들면 초호열성 효소를 포함하지 않는 식물 부분으로부터 전분 과립을 프로세싱하여 제조된 제품에 대하여 상대적으로 감미화된 제품을 형성하기 위해 식물 부분 전분 과립을 당으로 프로세싱하는 것을 포함한다. 바람직하게, 전분 프로세싱 효소는 초호열성이고, 가열, 예를 들면 베이킹, 비등, 가열, 스티밍, 방전, 또는 그들의 조합에 의해 활성화된다. 식물 부분은 형질전환된 식물, 예를 들면 형절변환된 대두, 호밀, 귀리, 보리, 밀, 옥수수, 쌀 또는 사탕수수로부터 수득되며, 그의 게놈은 하나 이상의 초호열성 전분 프로세싱 효소, 예를 들면, α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합을 코딩하는 발현 카세트로 증대된다. 가미된 제품은 이어서 곡분 식품으로 프로세싱된다. 또한 본 발명은 그 방법에 의해 제조된 곡분 식품, 예를 들면 곡류 음식, 조반, 즉석 식품 또는 베이킹된 음식을 제공한다. 곡분 식품은 감미화된 제품 및 물로부터 형성될 수 있고, 맥아, 풍미제, 비타민, 미네랄, 착색제 또는 그들의 조합을 함유할 수 있다.
효소가 활성화되어 곡물 제품의 프로세싱 중 또는 식물 물질의 곡류 제품내로의 봉입(inclusion)되기 전에 식물 물질 내에 함유된 다당류를 당으로 전환시킬수 있다. 따라서, 식물 물질 내에 함유된 다당류는 물질을 활성화시켜, 예를 들면 초호열성 효소의 경우 가열에 의해 곡분 제품 내에 봉입되기 전에 당으로 전환될 수 있다. 다당류의 전환에 의해 제조된 당을 함유하는 식물 물질은 이어서 제품에 첨가되어 감미화된 제품으로 제조될 수 있다. 별법으로, 다당류는 곡분 제품의 프로세싱 도중에 효소에 의해 당으로 전환될 수 있다. 곡류 제품을 만들기 위해 사용되는 프로세스의 예는 당분야에 잘 알려져있고, 미국 특허 제6,183,788호; 제6,159,530호; 제6,149,965호; 제4,988,521호 및 제5,368,870호에 기술된 것과 같이 가열, 베이킹, 비등 등등을 포함한다.
간단히, 도우(dough)는 다양한 건조 원료를 물과 함께 블렌딩하고, 전분 성분을 젤라틴화시키고, 조리된 향이 나도록 조리하여 제조할 수 있다. 이어서 조리된 물질을 기계적으로 처리하여 조리된 도우, 예를 들면 곡류 도우를 형성할 수 있다. 건조 원료는 다양한 첨가제, 예를 들면, 슈거, 전분, 염류, 비타민, 착색제, 조리료, 염류 등등을 포함할 수 있다. 물에 더하여, 다양한 액체 성분, 예를 들면 콘 (corn) (옥수수) 또는 맥아 시럽을 첨가할 수 있다. 곡분 물질은 곡류 곡물, 커트 곡물, 밀로부터의 그릿(grits) 또는 가루, 쌀, 옥수수, 귀리, 보리, 호밀, 또는 본 발명의 형질전환된 식물의 그것으로부터 기타 곡류 곡물 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 이어서, 도우는 압출 또는 스탬핑 같은 프로세스를 통해 원하는 모양으로 프로세스될 수 있고, 제임스 쿠거(James cooker), 오븐 또는 방전 장치같은 수단을 사용하여 추가로 조리될 수 있다.
추가로, 감미제가 첨가되지 않은 전분 함유 제품의 감미화 방법이 제공된다.그 방법은 하나 이상의 효소를 활성화시키는 하나 이상의 전분 프로세싱 효소 조건을 포함하여 전분을 처리하고, 그리하여 전분을 당으로 소화시키고, 그리하여 처리된(감미화된) 전분, 예를 들면 초호열성 효소를 포함하지 않는 전분을 처리해서 제조된 제품에 비해 상대적인 것을 형성하는 것을 포함한다. 본 발명의 전분은 형질전환된 식물로부터 수득하며, 그것의 게놈은 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된다. 바람직한 효소는 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합을 포함한다. 바람직하게, 효소는 초호열성이고, 열에 의해 활성화된다. 바람직하게 형질전환된 식물은 옥수수, 대두, 호밀, 귀리, 보리, 밀, 쌀 및 사탕수수를 포함한다. 처리된 전분은 이어서 제품에 첨가되어 감미화된 전분 함유 제품, 예를 들면 곡분 식품으로 제조된다. 또한, 그 방법에 의해 제조된 감미화된 전분 함유 제품이 제공된다.
본 발명은 이하를 포함하는 열매 또는 야채를 함유하는 다당류를 감미화하는방법을 제공한다: 추가로 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에서 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 열매 또는 야채를 처리하여, 열매 또는 야채 중 다당류를 프로세싱하여 당을 형성하고, 감미화된 열매 또는 야채, 예를 들면 다당류 프로세싱 효소를 포함하지 않는 식물로부터의 열매 또는 야채에 비해 상대적인 것을 수득함. 본 발명의 열매 또는 야채는 형질전환된 식물로부터 수득하며, 그것의 게놈은 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된다. 바람직한 열매 및 야채는 감자, 토마토, 바나나, 호박, 완두콩, 및 강남콩을 포함한다. 바람직한 효소는 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합을 포함한다. 바람직하게, 효소는 초호열성이다.
i.다당류 함유 식물 또는 식물 제품의 감미
본 방법은 상기에서 기술된 것처럼 다당류를 당으로 전환시키는 다당류 프로세싱 효소를 발현하는 식물을 수득하는 것을 포함한다. 따라서, 효소는 식물 내 및 식물의 제품 내, 예를 들면, 열매 또는 야채 내 발현된다. 일 실시양태에서, 효소는 유도가능한 프로모터의 조절하에 놓여, 효소의 발현은 외부 자극으로부터 유도될 수 있다. 그러한 유도가능한 프로모터 및 구조물은 당 분야에 널리 알려졌고, 본원에서 기술된다. 식물 또는 그의 제품 내 효소의 발현은 식물 또는 그의 제품 내에 함유된 다당류를 당으로 전환시키고, 식물 또는 그의 제품을 감미화한다. 다른 실시양태에서, 다당류 프로세싱 효소가 구성적으로 발현된다. 따라서, 식물 및 그의 제품을 감미화하는 효소의 작용을 통해 다당류를 당으로 전환시키도록 효소를 활성화시키기에 충분한 조건하에서 식물 또는 그의 제품은 활성화될 수 있다. 그 결과, 열매 또는 야채 내 다당류의 이러한 자가-프로세싱은 당을 형성시켜 감미화된 열매 또는 야채, 예를 들면 다당류 프로세싱 효소를 포함하지 않은 식물로부터의 열매 또는 야채에 대해 상대적인 것을 수득한다. 본 발명의 열매 또는 야채는 형질전환된 식물로부터 수득하며, 그의 게놈은 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된다. 바람직한 열매 및 야체는 감자, 토마토, 바나나, 호박, 완두콩, 및 강남콩을 포함한다. 바람직한 효소는 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합을 포함한다. 바람직하게, 다당류 프로세싱 효소는 초호열성이다.
j.내배유 매트릭스를 방해(disrupt)하는 효소를 함유하는 형질전환된 곡물로부터의 적분의 단리
본 발명은 형질전환된 곡물로부터 전분을 단리하는 방법을 제공하며, 여기서 효소는 내배유 매트릭스를 방해하는 것이 발현된다. 본 방법은 예를 들면 세포벽, 비-전분 다당류 및(또는) 단백질의 개질에 의해 내배유 매트릭스를 방해하는 효소를 발현한다. 그러한 효소의 예는 프로테아제, 글루카나제, 티오레독신, 티오레독신 환원효소 및 에스테라제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러한 효소는 전분 과립의 통합(integrity)을 유지하기 위해 전분-분해 활성을 나타내는 임의의 효소를 포함하지 않는다. 바람직하게 효소는 전분 과립에 대한 효소를 표적화하는 신호 서열로 융합된다. 일 실시양태에서, 곡물을 가열 건조하여 그 효소를 활성화시키고, 곡물 내 함유된 내생성 효소를 불활성화시킨다. 가열 처리는 효소의 활성화를 일으키고, 전분 과립으로부터 쉽게 분리되는 내배유 매트릭스를 방해하는 작용을 한다. 다른 실시양태에서, 곡물은 높거나 낮은 습도함량, 이산화황과 함께 또는 없이, 낮거나 높은 온도에서 침지된다. 이어서, 곡물을 열처리하여 내배유 매트릭스를 방해하고, 전분 과립이 쉽게 분리되도록 한다. 다른 실시양태에서, 적절한 온도 및 습기 조건은 프로테아제가 전분 과립내에 들어가고, 과립 내에 함유된 단백질을 분해하도록 한다. 그러한 처리를 통해 높은 수율 및 낮은 단백질 오염으로 전분 과립을 제조할 수 있다.
k.높은 당량을 갖는 시럽 및 에탄올 또는 발효된 음료를 제조하기 위한 시럽의 용도
본 방법은 상기에 기술된 것처럼 다당류를 당으로 전환시키는 다당류 프로세싱 효소를 발현하는 식물을 수득하는 것을 포함한다. 식물 또는 그의 제품은 발현된 효소가 식물 또는 그의 제품 내에 함유된 다당류를 덱스트린, 말토올리고당, 및(또는) 당으로 전환하는 조건하에서 수성 스트림 중에 침지된다. 다당류의 전환을 통해 제조된 덱스트린, 말토올리고당, 및(또는) 당을 함유하는 수성 스트림은 이어서 분리되어 높은 당량을 갖는 시럽으로 제조된다. 본 방법은 전분 과립을 수득하기 위한 식물 또는 그의 제품을 습식 제분하는 추가적인 단계를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 본 방법 중에 사용될 수 있는 효소의 예는 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루란아제 및 α-글루코시다제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 효소는 초호열성이다. 본 방법에 따라 제조된 당은 육탄당, 글루코스 및 과당을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 방법에 사용될 수 있는 식물의 예는 옥수수, 밀 또는 보리를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 식물 제품의 예는 열매, 곡물 및 야채를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 다당류 프로세싱 효소는 유도가능한 프로모터의 조절하에 놓인다. 따라서, 침지 공정 전 또는 그 동안, 프로모터는 효소의 발현을 유도하고, 이는 이어서 다당류의 당으로의 전환을 제공한다. 유도가능한 프로모터 및 그를 함유하는 구조물의 예는 당 분야에 잘 알려져 있고, 본원에서 제공된다. 따라서, 다당류 프로세싱이 초호열성이면, 침지는 초호열성 효소를 활성화시키고, 식물 또는 그의 제품 내에서 발견되는 불활성 내생성효소를 불활성화시키기 위해 높은 온도에서 실시된다. 다른 실시양태에서, 다당류를 당으로 전환시킬 수 있는 초호열성 효소가 구성적으로 발현된다. 이 효소는 신호 서열의 사용을 통해 식물 내의 구획(compartment)로 표적화되거나 또는 되지않을 수 있다. 식물, 또는 그의 제품은 식물내에 함유된 다당류를 당으로 전환시키기 위해 높은 온도 조건하에서 침지된다.
또한, 높은 당량을 갖는 시럽으로부터 에탄올 또는 발효된 음료수를 제조하는 방법이 제공된다. 본 방법은 시럽내에 함유된 당의 에탄올 또는 발효된 음료로의 발효를 허용하는 조건하에서 효모와 함께 인큐베이션 한다. 그러한 발효된 음료의 예는 맥주 및 포도주를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 발효 조건은 당 분야에 잘 알려져 있고, 미국 특허 제 4,929,452호 및 본원에 기재되어 있다. 바람직하게 효모는 높은 알콜-인성(tolerant) 및 높은-당 인성 종인 효모, 예를 들면 에스. 세레비시아에 ATCC 번호 20867 이다. 발효된 제품 또는 발효된 음료는 증류되어 에탄올 또는 증류된 음료로 단리될 수 있다.
l.식물의 세포벽 내의 초호열성 효소의 축적
본 발명은 식물의 세포벽 내의 초호열성 효소를 축적하는 방법을 제공한다. 이 방법은 표적화된 효소가 세포벽 내에 축적되도록 세포벽 표적화 신호에 융합되는 초호열성 효소를 식물내에서 발현하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 효소는 다당류에서 단당류로 전환시킬 수 있다. 표적화 서열의 예는 셀룰로스 또는 크실로스 결합 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 초호열성 효소의 예는 서열 1,3, 5,10, 13, 14, 15 또는 16에 열거된 것을 포함한다. 세포벽을 함유하는 식물물질은 원료로부터 당을 회수하는 프로세스에서 바람직한 효소의 공급원로서 또는 다른 공급원에서 기인하는 다당류의 단당류로의 전환을 위한 효소의 공급원으로서 첨가될 수 있다. 게다가, 세포벽은 그로부터 효소가 정제될 수 있는 공급원으로서 역할을 할 수 있다. 효소를 정제하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 등전(isoelectric)포커싱, 친화 크로마토그래피, FPLC, HPLC, 염 침전, 투석 및 기타 등등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 또한 식물의 세포벽으로부터 단리된 정제된 효소를 제공한다.
m.프로세싱 효소의 제조 및 단리 방법
본 발명에 따라, 재조합으로 제조된 본 발명의 프로세싱 효소는 형질전환된 식물 조직 또는 세포용으로 선택되고, 식물에서 활성화될 수 있는 본 발명의 프로세싱 효소를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 식물 조직 또는 세포를 형질전환된 식물로 성장시키고, 형질전환된 식물 또는 그의 일부로부터 프로세싱 효소를 단리시켜 제조될 수 있다. 바람직하게, 재조합으로 제조된 효소는 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제이다. 가장 바람직하게, 효소는 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 또는 59 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로 코딩된다.
본 발명은 이하의 실시예에 의해 추가로 기술될 것이며, 이는 임의의 방법으로 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니다.
실시예 1
초호열성 전분-프로세싱/이성질체화 효소용 옥수수-최적화된 유전자의 작제.
전분 분해 또는 글루코스 이성질체화에 포함된 효소, α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 및 글루코스 이소메라제를 그들의 요구되는 활성 프로파일에 따라 선택했다. 이들은 예를 들면 주위 온도에서의 최소 활성, 고온 활성/안정성 및 낮은 pH에서의 활성 등을 포함한다. 이어서 해당하는 유전자를 미국 특허 제5,625,136호에서 기술된 것처럼 옥수수 선호 코돈을 사용하여 디자인하고, 인터그레이티드 DNA 테크놀로지, 인크(Integrated DNA Technologies, Inc.) (Coralville, IA)에서 합성했다.
아미노산 서열 서열 1을 갖는 797GL3 α-아밀라제는 그의 초호열성 활성 때문에 선택했다. 이 효소의 핵산 서열을 유추하였고(deduced), 서열 2에서 나타내진 것처럼 옥수수-최적화하였다. 유사하게, 서열 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 6gp3 풀루란아제를 선택하였다. 풀루란아제의 핵산 서열을 유추하였고, 서열 4에 나타낸 것처럼 옥수수 최적화하였다.
술폴로부스 솔파타리쿠스로부터의 malA α-글루코시다제용 아미노산 서열을 문헌[J. Bact. 177: 482-485 (1995); J. Bact. 180: 1287-1295 (1998)]으로부터 수득했다. 단백질의 공개된 아미노산 서열(서열 5)을 기초로 α-글루코시다제를 코딩하는 옥수수-최적화된 합성 유전자(서열 6)를 디자인했다.
몇몇 글루코스 이소메라제 효소를 선택했다. 써모토가 마리티마로부터 유도된 글루코스 이소메라제용 아미노산 서열 (서열 18)를 엑세션 번호 NC_000853를 갖는 공개된 DNA 서열을 기초로 예측하고, 옥수수-최적화된 합성 유전자(서열 19)를 디자인했다. 유사하게 써모토가 네아폴리타나로부터 유도된 글루코스 이소메라제용 아미노산 서열 (서열 20)을 문헌[Appl. Envir. Microbiol. 61 (5): 1867-1875 (1995)]으로부터 공개된 DNA서열, 억세션 번호 L38994에 기초하여 예측하고, 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제를 코딩하는 옥수수-최적화된 합성 유전자(서열 21)를 디자인했다.
실시예 2
이. 콜라이 중 전분 캡슐화 영역 및 797GL3 α-아밀라제 융합의 발현
옥수수 과립에 결합된 전분 신타아제 (왁시)로부터 전분 캡슐화 영역(SER)에 융합된 초호열성 797GL3 α-아밀라제를 코딩하는 구조물은 이. 콜라이에서 도입되고 발현된다. 아미노산 서열 (서열 8) (Klosgen RB, et al. 1986)cDNA를 GenBank 엑세션 번호 X03935로부터 디자인된 프라이머 SV57 (5'AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT 3') (서열 22) 및 SV58 (5'AGCTAAGCTTCAGGGCGCGGCCACGTTCT 3') (서열 23)를 사용한 옥수수 종자로부터 제조된 RNA로부터 RT-PCT에 의해 증폭시켰다. 완전한 cDNA를 pNOV4022로 나타낸 플라스미드 및 EcoRI/HindE 단편로서 pBluescript에 클로닝시켰다.
전분-결합 도메인을 포함하는 왁시 cDNA의 C-말단 부분 (bp 919-1818에 의해 코딩됨)을 pNOV4022로부터 증폭시키고 완전한 길이의 옥수수-최적화된 797GL3 유전자 (서열 2)의 3' 말단에 프레임 내 융합시켰다. 핵산 서열 9를 갖고, 아미노산서열, 서열 10을 코딩하는 융합된 유전자 생성물, 797GL3/왁시를 NcoI/NheI로 절단된 pET28b (NOVAGEN, Madison, WI)에 NcoI/XbaI 단편으로서 클로닝시켰다. 또한 NcoI/XbaI 단편으로서 pET28b 벡터에 797GL3 유전자를 단독으로 클로닝했다.
pET28/797GL3 및 pET28/797GL3/왁시 벡터를 BL21/DE3 이. 콜라이 세포 (NOVAGEN)로 형질전환시키고, 제조자의 지시에 따라 성장시키고 촉진시켰다(induced). PAGE/코마시에 (Coomassie) 염색에 의한 분석은 융합된 및 비융합된 아밀라제의 예측된 크기에 따른 각 추출물 중 촉진된 단백질을 각각 밝혔다.
총 세포 추출물을 이하와 같이 초호열성 아밀라제 활성에 대해 분석했다: 5 mg의 전분을 20 ㎕의 물에 분산시키고, 이어서 25 ㎕의 에탄올로 희석시켰다. 표준 아밀라제 양성 대조군 또는 아밀라제 활성을 시험할 시료를 그 혼합물에 첨가하고, 최종 반응 부비가 500 ㎕가 되도록 물을 첨가했다. 반응은 15-45분동안 80℃에서 실시했다. 이어서 반응을 실온까지 냉각시키고, 500 ㎕의 o-디아니시딘 및 글루코스 옥시다제/퍼옥시다제 혼합물 (Sigma)을 첨가했다. 혼합물을 30분간 37℃에서 인큐베이션시켰다. 500 ㎕의 12 N 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 540 nm에서의 흡수를 측정하여 아밀라제/시료에 의한 글루코스 방출 양을 정량적으로 측정했다. 융합된 및 비융합된 아밀라제 추출물 모두의 분석은 유사한 수준의 초호열성 아밀라제 활성을 보였다. 여기서, 대조군 추출물은 음성이었다. 이것은 797GL3 아밀라제가 왁시 단백질의 C-말단 부분에 융합되었을 때에도 여전히 활성 (고온에서) 임을 나타낸다.
실시예 3
옥수수 중 내배유-특이성 발현용 프로모터 단편의 단리
제아 메이스 ADP-gpp (ADP-글루코스 피로포스포릴라제)의 큰 서브단위로부터의 5' 비코딩 영역 I (제1 인스트론을 포함함) 및 프로모터를 Genbank 억세션 M81603로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 옥수수 게놈 DNA로부터 1515 염기쌍 단편 (서열 11)로서 증폭시켰다. ADP-gpp 프로모터는 내배유-특이성을 보인다(Shaw 및 Hannah, 1992).
제아 메이스 γ-제인 유전자로부터의 프로모터를 플라스미드 pGZ27.3 (브라이언 라킨스 박사(Dr. Brian Larkins)로부터 수득함)로부터 673 bp 단편 (서열 12)로서 증폭시켰다. γ-제인 프로모터는 내배유-특이성을 보인다(Torrent et al. 1997).
실시예 4
797GL3 초호열성 α-아밀라제용 형질전환 벡터의 작제
옥수수 내배유 중 797GL3 초호열성 아밀라제를 발현하기 위해 여러가지 표적화 신호를 사용하여 이하와 같이 발현 카세트를 작제했다:
pNOV6200 (서열 13)는 소포체를 표적으로 하고, 아포플라스트 (Torrent et al. 1997)로 분비하기 위한, 실시예 1에서 기술된 것 같은 합성 797GL3 아밀라제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)를 포함한다. 그 융합을 내배유에 특이적으로 발현하기 위해 옥수수 ADP-gpp 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
pNOV6201 (서열 14)는 소포체(ER)를 표적으로 하고, 그것에 보유(retention)되기 위한, 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 797GL3 아밀라제에 융합된 γ-제인 N-말단 신호 서열을 포함한다(Munro 및 Pelham, 1987). 그 융합을 내배유에 특이적으로 발현하기 위해 옥수수 ADP-gpp 프로모터 후방에서 클로닝시켰다.
pNOV7013은 소포체 (ER)를 표적으로 하고, 그것에 보유되기 위한, 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 797GL3 아밀라제에 융합된 γ-제인 N-말단 신호 서열을 포함한다. PNOV7013는 내배유 중 융합을 발현하기 위해 옥수수 ADP-spp 프로모터 대신 옥수수 γ-제인 프로모터 (서열 12)가 사용된 것을 제외하고는 pNOV6201과 동일하다.
pNOV4029 (서열 15)는 아밀로플라스트를 표적으로 하기 위한, 합성 797GL3 아밀라제에 융합된 옥사 아밀로플라스트 표적화 펩티드 (Klosgen et al. , 1986)를 포함한다. 그 융합을 내배유에 특이적으로 발현하기 위해 옥수수 ADP-gpp 프로모터 후방에서 클로닝시켰다.
pNOV4031 (서열 16)는 전분 과립을 표적으로 하기 위한, 합성 797GL3/왁시 융합 단백질에 융합된 왁시 아밀로플라스트 표적화 펩티드를 포함한다. 그 융합을 내배유에 특이적으로 발현하기 위해 옥수수 ADP-gpp 프로모터 후방에서 클로닝시켰다.
더 높은 수준의 효소 발현을 수득하기 위해 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝된 이러한 융합으로 추가적인 작제가 이루어진다. 모든 발현 카세트는 아그로박테륨 감염을 통해 옥수수로 형질전환시키기 위한 이원(binary) 벡터로 옮겨진다. 이원 벡터는 만노스로 유전자이전 세포의 선택을 할 수 있도록 포스포만노스 이소메라제 (PMI) 유전자를 함유한다. 형질전환된 옥수수 식물을 자가 수분 시키거나 또는 이종교배시키고, 분석을 위해 종자를 수집했다.
α-아밀라제에 대해 기술된 것과 매우 같은 방법으로 6gp3 풀루란아제 또는 340g12α-글루코시다제에 대해 상기에 기술된 것처럼 융합된 표적화 신호로 추가적인 작제물을 만들었다. 이러한 융합은 옥수수 ADP-gpp 프로모터 및(또는) γ-제인 프로모터 후방에서 클로닝했고 상기에 기술된 것처럼 옥수수로 형질전환시켰다. 형질전환된 옥수수 식물을 자가 수분 시키거나 또는 이종교배시키고, 분석을 위해 종자를 수집했다.
효소의 조합은 개별 효소를 발현하는 식물을 교배하거나, 공동형질전환(cotransformation)을 가능하도록 몇몇 발현 카세트를 동일한 이원 벡터에 클로닝시켜 이루어질 수 있다.
실시예 5
6GP3 호열성 풀루란아제용 식물 형질전환 벡터의 작제
옥수수 내배유의 소포체 중 호열성 풀루란아제를 발현하기 위한 발현 카세트를 이하와 같이 작제했다:
pNOV7005 (서열: 24 및 25)는 소포체 (ER)를 표적으로 하고, 그것에 보유되기 위한, 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 6GP3 풀루란아제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열을 포함한다. 합성 유전자를 증폭시키기 위해 디자인된 프라이머로 PCR을 사용하여 아미노산 펩티드 SEKDEL을 효소의 C-말단 끝(end)에 융합시키고, 동시에 단백질의 C-말단 끝에 6 아미노산을 첨가했다. 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
실시예 6
malA 초호열성 α-글루코시다제용 식물 형질전환 벡터의 작제
옥수수 내배유 중 술폴로부스 솔파타리쿠스 malA 초호열성 α-글루코시다제룰 발현하기 위해 이하와 같이 여러가지 표적화 신호로 발현 카세트를 작제했다:
pNOV4831 (서열 26)는 소포체 (ER)를 표적으로 하고, 그것에 보유되기 위한, 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 malA α-글루코시다제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다(Munro 및 Pelham, 1987). 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
pNOV4839 (서열 27)는 소포체를 표적으로 하고, 아포플라스트로 분비하기 위한 합성 malA α-글루코시다제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다. 융합은 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
pNOV4837는 ER을 표적으로 하고, 그것에 보유되기 위한 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 malA α-글루코시다제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다. 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 ADPgpp 프로모터 후방에 클로닝시켰다. 이 클론을 위한 아미노산 서열은 pNOV4831 (서열 26)의 그것과 동일하다.
실시예 7
초호열성 써모토가 마리티마 및 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제용 식물 형질전환 벡터의 작제
옥수수 내배유 중 써모토가 마리티마 및 써모토가 네아폴리타나 초호열성 글루코스 이소메라제를 발현하기 위해 이하와 같이 여러가지 표적화 신호로 발현 카세트를 작제했다:
pNOV4832 (서열 28)은 ER을 표적으로 하고, 그것에 보유되기 위한 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 써모토가 마리티마 글루코스 이소메라제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다. 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
pNOV4833 (서열 29)은 ER을 표적화하고, 그것에 보유되기 위한 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열(MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다. 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
pNOV4840 (서열 30)은 소포체를 표적으로 하고, 아포플라스트로 분비를 위한 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다(Torrent et al. 1997). 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수γ-제인 프로모터 후방에 클로닝시켰다.
pNOV4838은 ER을 표적으로 하고, 그것에 보유되기 위해 서열 SEKDEL의 C-말단 첨가로 합성 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제에 융합된 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열(MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함한다. 융합을 내배유에서 특이적인 발현을 위해 옥수수 ADPgpp 프로모터 후방에 클로닝시켰다. 이 클론을 위한 아미노산 서열은 pNOV4833 (서열 29)의 그것과 동일하다.
실시예 8
초호열성 글루카나제 Egl1A의 발현을 위한 식물 형질전환 벡터의 작제
pNOV4800 (서열 58)는 아포플라스트에 위치하기 위한 Egl1A 성숙 단백질과 융합된 보리 알파 아밀라제 AMY32b 신호 서열 (MGKNGNLCCFSLLLLLLAGLASGHQ) (서열 31)을 포함한다. 융합물은 특히 내배유에서 발현되도록 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝되었다.
실시예 9
다중 초호열성 효소의 발현을 위한 식물 형질전환 벡터의 작제
pNOV4841은 797GL3 α-아밀라제 융합물 및 6GP3 풀루란아제 융합물의 이중 유전자 구조물을 포함한다. 797GL3 융합물 (서열 33) 및 6GP3 융합물 (서열 34) 둘 모두는 ER로의 표적 및 보유를 위한 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 및 SEKDEL 서열을 가지고 있다. 각각의 융합물은 특히 내배유에서 발현되도록 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝되었다.
pNOV4842은797GL3 α-아밀라제 융합물 및 malA α-글루코시다제 융합물의 이중 유전자 구조물을 포함한다. 7GL3 융합 폴리펩티드 (서열 35) 및 malA α-글루코시다제 융합 폴리펩티드 (서열 36) 둘 모두는 ER로의 표적 및 보유를 위한 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 및 SEKDEL 서열을 가지고 있다. 각각의 융합물은 특히 내배유에서 발현되도록 단리된 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝되었다.
pNOV4843은 797GL3 α-아밀라제 융합물 및 malA α-글루코시다제 융합물의 이중 유전자 구조물을 포함한다. 797GL3 융합물 및 malA α-글루코시다제 융합물 둘 모두는 ER로의 표적 및 보유를 위한 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 및 SEKDEL 서열을 가지고 있다. 특히 내배유에서 발현되도록 797GL3 융합물은 옥수수 γ-제인 프로모터 후방에 클로닝되었고 malA 융합물은 옥수수 ADPgpp 프로모터 후방에 클로닝되었다. 797GL3 융합물 및 malA 융합물의 아미노산 서열은 pNOV4842 (각각 서열 35 및 36)의 것과 동일하다.
pNOV4844는 797GL3 α-아밀라제 융합물, 6GP3 풀루란아제 융합물, 및 malA α-글루코시다제 융합물의 삼중 유전자 구조물을 포함한다. 797GL3, malA, 및 6GP3 모두는 ER로의 표적 및 보유를 위한 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 및 SEKDEL 서열을 가지고 있다. 특히 내배유에서 발현되도록 797GL3 및 malA 융합물은 두 개의 분리된 옥수수 γ-제인 프로모터의 후방에 클로닝되었고, 6GP3 융합물은 옥수수 ADPgpp 프로모터의 후방에 클로닝되었다. 797GL3 및 malA 융합물의 아미노산 서열은 pNOV4842 (각각 서열 35 및 36)의 것과 동일하다. 6GP3 융합물의 아미노산 서열은 pNOV4841에서의 6GP3 융합물 (서열 34)의 것과 동일하다.
모든 발현 카세트는 아그로박테륨 감염을 통하여 옥수수로의 형질전환을 위하여 이원 벡터 pNOV2117로 이동되었다. pNOV2117는 만노스를 이용하여 유전자이전 세포를 선택하는 것을 허락하는 포스포만노스 이소메라제 (PMI)유전자를 함유한다. pNOV2117은 pVS 1 및 ColEl 복제개시점 둘 모두를 갖는 이원벡터이다. 상기 벡터는 pAD1289 [Hansen, G., 등, PNAS USA 91: 7603-7607 (1994)]로부터의 구성적 VirG 유전자 및 Tn7으로부터의 스펙티노마이신 내성 유전자를 함유한다. 옥수수 유비퀴틴 프로모터, PMI 코딩 지역 및 pNOV117의 노팔린 합성효소 종결자 [Negrotto, D. 등, Plant Cell Reports 19: 798-803 (2000)]가 우측 및 좌측 경계상에 있는 폴리링커로 클로닝되었다. 형질전환된 옥수수 식물은 자가 수분되거나또는 이종교배되고 종자는 분석을 위해 수집된다. 상이한 효소의 조합은 개개의 효소를 발현하는 식물을 이종교배하거나 또는 다중 유전자 카세트의 하나를 이용하여 식물을 형질전환하는 것에 의하여 생산될 수 있다.
실시예 10
박테리아 및 피치아 ( Pichia ) 발현 벡터의 작제
발현 카세트가 피치아 또는 박테리아에서 초호열성 α-글루코시다제 및 글루코스 이소메라제를 발현하도록 하기와 같이 작제되었다:
pNOV4829 (서열: 37 및 38)는 박테리아 발현 벡터 pET29a에서 ER 보유 신호를 가지는 합성 써모토가 마리티나 글루코스 이소메라제 융합물을 포함한다. 글루코스 이소메라제 융합물 유전자를 pET29a의 NcoI 및 SacI 위치로 클로닝하고, 상기로 인하여 단백질 정제를 위한 N-말단 S-태그가 추가되었다.
pNOV4830 (서열:39 및 40)는 박테리아 발현 벡터 pET29a에서 ER 보유 신호를가지는 합성 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제 융합물을 포함한다. 글루코스 이소메라제 융합물 유전자를 pET29a의 NcoI 및 SacI 위치로 클로닝하고, 상기로 인하여 단백질 정제를 위한 N-말단 S-태그가 추가되었다.
pNOV4835 (서열 41 및 42)는 박테리아 발현 벡터 pET28C의 BamHI 및 EcoRI 위치로 클로닝된 합성 써모토가 마리티마 글루코스 이소메라제 유전자로 이루어진다. 상기로 인하여 글루코스 이소메라제의 N-말단에 His-태그 (단백질 정제를 위함) 융합물이 추가되었다.
pNOV4836 (서열 43 및 44)는 박테리아 발현 벡터 pET28C의 BamHI 및 EcoRI 위치로 클로닝된 합성 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제 유전자로 이루어진다. 상기로 인하여 글루코스 이소메라제의 N-말단에 His-태그 (단백질 정제를 위함) 융합물이 추가되었다.
실시예 11
미성숙 옥수수 배의 형질전환은 본질적으로 문헌 [Negrotto 등, Plant Cell Reports 19: 798-803]에 기술된 것과 같이 실행되었다. 예를 들면, 모든 배지 성분은 상기 문헌에 기술된 것과 같다. 그러나, 문헌에 기술된 다양한 배지 성분은 대체될 수 있다.
A. 플라스미드 및 선택 마커의 형질전환
형질전환에 사용되는 유전자를 옥수수 형질전환에 적합한 벡터로 클로닝되었다. 본 실시예에 사용된 벡터는 유전자이전 주를 선택하기 위하여 포스포만노스 이소메라제 (PMI) 유전자를 함유하였다 [Negrotto 등, (2000) Platn Cell Reports19: 798-803].
B. 아그로박테륨 투메파시엔스의 제조
식물 형질전환 플라스미드를 함유하는 아그로박테륨 종 LBA4404 (pSB1)을 28℃에서 2 내지 4일 동안 YEP (효모 추출물 (5 g/l), 펩톤 (lO g/l), NaCl (5 g/l), 15 g/l agar, pH 6.8) 고체 배지에서 키웠다. 약 0.8X 109아그로박테륨을 100 μM As를 이용하여 보충된 LS-inf 배지에 현탁하였다 [Negrotto 등, (2000) Plant Cell Rep 19: 798-803]. 박테리아는 30 내지 60 분 동안 상기 배지에서 전유도되었다.
C. 접종
A188로부터의 미성숙 배아 또는 다른 적합한 유전자형을 8 내지 12일된 이삭으로부터 절단하여 액체 LS-inf + 100 μM As에 넣었다. 배아를 신선한 감염 배지를 이용하여 한 번 헹구었다. 그 후 아그로박테륨 용액을 첨가하고 배를 30 초 동안 볼텍싱하고 5 분동안 박테리아와 정주시켰다. 그 후 배를 LSAs 배지로 배반을 위로 하여 옮기고 이틀 내지 사흘 동안 암실에서 배양하였다. 이어서 페트리 접시당 20과 25 사이의 배를 세포탁심 (250 mg/l) 및 실버 니트레이트 (1.6 mg/l)로 보충된 LSDc 배지로 옮겨서 10 일 동안 28℃에서 배양하였다.
D. 형질전환된 세포의 선택 및 형질전환된 식물의 재생
배의 유합조직을 생산하는 미성숙 배를 LSD1M0.5S 배지로 옮겼다. 배양물을 3주가 되었을 때 부배양하여 6 주 동안 상기 배지에서 선택하였다. 생존 유합조직을 만노스를 이용하여 보충된 Regl 배지로 옮겼다. 밝은 곳에서 (16 시간 빛/8 시간 어두운 요법) 배양 한 후에, 그린 조직을 그 때 성장 조절인자가 없는 Reg2 배지로 옮기고 1 내지 2 주 동안 배양하였다. 식물을 Reg3 배지를 함유하고 있는 마젠타 (Magenta) GA-7 상자 (마젠타 코르프 (Magenta Corp), 일리노이 시카고)로 옮기고 밝은 곳에서 키웠다. 2 내지 3 주 후에, PCR로 식물에서 PMI 유전자 및 다른 관심 갖고 있는 유전자가 존재하는지 시험하였다. PCR 분석에서 양성인 식물을 온실로 옮겼다.
실시예 12
아포플라스트 또는 ER로 표적된 α-아밀라제를 발현하는 옥수수 식물로부터의 T1의 분석
실시예 4에 기술된 pNOV6200 또는 pNOV6201로 형질변환된 자가 수분된 옥수수 식물로부터 T1 종자를 얻었다. 가시 점검 및 고온에 노출시키키 전에 요오드 용액을 이용한 전분 염색에 근거하여서 상기 낟알에서의 전분 축적은 정상으로 보였다. 미성숙 낟알을 분해하고 정제된 내배유를 개별적으로 소형 원심분리기에 넣고 50 mM NaP04 완충액의 200 μl에 담구었다. 튜브를 20 분 동안 85℃ 수조에 넣고 그 후 얼음에서 냉각시켰다. 분리 낟알의 약 25%가 전분에 대하여 정상적으로 염색되었다. 잔여 75%는 염색하는데 실패하였는데, 이는 상기 전분이 요오드와 염색되지 않는 저분자량 당으로 분해된 것을 나타냈다. pNOV6200 및 pNOV6201의 T1 낟알은 옥수수 전분을 자가 가수분해하고 있었다. 37℃에서 배양을 한 후에 전분 감소는 검출되지 않았다.
아밀라제의 발현을 PAGE/코마시에로 염색 한 후에 내배유로부터의 초호열성단백질 분획을 분리하여 추가로 분석하였다. 적합한 분자량 (50 kD)의 분리 단백질 밴드를 관찰하였다. 시판되는 염색된 아밀로스 (아일랜드 메가자임 (Megazyme)으로부터의 아밀라자임 (AMYLAZYME))를 사용하여 α-아밀라제 분석을 하였다. 높은 수준의 초호열성 아밀라제 활성은 50 kD 단백질의 존재와 상관이 있었다.
아밀로플라스트로 표적된 초호열성 α-아밀라제를 발현하는 대부분의 유전자이전 옥수수로부터의 낟알에 있는 전분이 상기 효소가 전분 과립과 직접적인 접촉을 하게 두면 상기 전분의 대부분을 등온에서 가수분해하기에 충분히 활성적이라는 것을 추가로 밝혀내었다.
아밀로플라스트에 표적된 초호열성 α-아밀라제를 갖는 80 개의 주에서, 4 개 주가 낟알에서 전분을 축적하는 것으로 확인되었다. 상기 주 중 세 개 주를 발색 아밀라자임 (메가자임) 분석을 사용하여 열안정적인 α-아밀라제 활성에 대하여 분석하였다. 상기 아밀라제 효소 분석은 상기 3 개 주가 낮은 수준의 열안정적인 아밀라제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 상기 3 개 주로부터 정제된 전분을 적절한 조건의 습기 및 열로 처리하였을 때, 상기 전분은 가수분해되는데, 이는 상기 주로부터 생산된 전분의 자가 가수분해를 용이하게 하는 α-아밀라제의 적정한 수준의 존재를 나타냈다.
pNOV6200 및 pNOV6201 형질전환체 둘 모두의 다중 독립적 주로부터 T1 종자를 었었다. 각각의 주로부터 개별적인 낟알을 분해하고 정제된 내배유를 개벽적으로 50 mM NaP04완충액의 300 μl에서 균질화하였다. 내배유 현택물의 분취량을 85℃에서 α-아밀라제의 활성에 대하여 분석하였다. 상기 주의 약 80%가 초호열성 활성에 대하여 분리되었다 (도 1A, 1B, 및 2 참조).
야생형 식물 또는 pNOV6201를 이용하여 형질전환된 식물로부터의 낟알을 1, 2, 3, 또는 6 시간 동안 100℃에서 가열하고 요오드 용액을 이용하여 전분에 의하여 염색하였다. 각각 3 또는 6 시간 후에 성숙한 낟알에서는 전분이 검출되지 않거나 적게 검출되었다. 따라서 소포체로 표적된 초호열성 아밀라제를 발현하는 유전자이전 옥수수로부터의 성숙한 낟알의 전분은 고온에서 인큐베이션될 때 가수분해되었다.
다른 실험에서, 16시간 동안 50℃에서 흠뻑 적셔진 부분적으로 정제된 pNOV6201 식물로부터의 성숙한 T1 낟알의 부분적으로 정제된 전분이 5분 동안 85℃에서 가열 후에 가수분해되었다. 상기는 소포체를 표적으로 하는 α-아밀라제가 낟알을 분쇄한 후에 전분에 결합한다는 것을 예증하고 가열시 전분을 가수분해 할 수 있다는 것을 예증하였다. 요오드 염색은 전분이 50℃에서 16 시간 동안 흠뻑 적셔진 후에 성숙한 종자에서 손상되지 않는다는 것을 나타냈다.
다른 실험에서 pNOV6201을 이용하여 형질전환된 식물로부터 성숙한 낟알을 분리하여 낟알을 16 시간 동안 95℃에서 가열하였다. 초호열성 α-아밀라제를 발현하는 종자에서, 전분을 당으로 가수분해하여 건조한 후에 주름진 외양이 결과로 생겼다.
실시예 13
아밀로플라스트로 표적된 α-아밀라제를 발현하는 옥수수 식물로부터의 T1분석
실시예 4에 기술된 것과 같이 pNOV4029 또는 pNOV4031로 형질전환된 자가 수분된 옥수수 식물로부터의 T1 종자를 얻었다. 상기 주로부터 낟알에 축적된 전분은 명확하게 정상적이지 않았다. 심한 정도에 차이가 있는 모든 주들이 극소량의 전분 또는 전분이 없는 표현형으로 분리되었다. 미성숙한 낟알로부터 정제된 내배유는 고온에 노출되기 전에 요오드를 이용하여 단지 약하게 염색되었다. 85℃에서 20 분 후에, 염색이 없었다. 이삭이 건조되었을 때, 낟알이 오그라들었다. 상기 특정한 아밀라제는 명확하게 온실 온도에서 과립과 직접적인 접촉을 하도록 하면 전분을 가수분해하는 충분한 활성을 가졌다.
실시예 14
α-아밀라제를 발현하는 옥수수 식물로부터의 곡물의 발효
100% 유전자이전 곡물 85℃ 대 95℃, 다양화된 액화 시간.
열안정적 α-아밀라제를 함유하는 유전자이전 옥수수 (pNOV6201)은 외인성 α-아밀라제를 첨가하지 않는 발효에서 잘 작동하여 액화하는데 시간이 더 적게 들고 전분을 더 완전하게 액화시킨다. 실험실 규모의 발효는 하기 단계를 갖는 공정에 의하여 실행된다 (하기에 상술): 1) 분쇄, 2) 습기 분석, 3) 분쇄된 옥수수, 물, 백셋 (backset) 및 α-아밀라제, 4) 액화 및 5) 동시 당화 및 발효 (SSF). 본 실시예에서 액화 단계의 온도 및 시간은 하기된 것과 같이 변화되었다. 추가로 유전자전이 옥수수는 외인적 α-아밀라제를 이용하여 액화되고 α-아밀라제를 이용하지 않고 액화되고 에탄올 생산에서의 작동을 시판되는 α-아밀라제로 처리된 대조군 옥수수에 비교하였다.
본 실시예에서 사용된 유전자이전 옥수수를 α-아밀라제 유전자 및 PMI 선택 유전자, 즉 pNOV6201을 포함하는 벡터를 사용하여 실시예4에 설명된 공정에 따라서 제조하였다. 유전자이전 옥수수는 시판되는 하이브리드 (N3030BT)와 열안정적인 α-아밀라제를 높은 수준으로 발현하는 유전자이전 주로부터의 화분을 수분하여 생산되었다. 상기 옥수수를 11% 습도로 건조시키고 실온에 저장하였다. 유전자이전 옥수수 분말의 α-아밀라제 함량은 효소 1 유닛이 pH 6.0인 MES 완충액 85℃에서 옥수수 분말로부터 분당 1 마이크로몰 환원 말단부를 산출할 때 95 유닛/g이었다. 사용된 대조군 옥수수는 에탄올 생산에서 작동이 잘 되는 것은 공지된 옐로우 덴트 옥수수 (yellow dent corn)이었다.
1) 분쇄: 유전자이전 옥수수 (1180 g)를 2.0 mm 스크린이 장착된 페르텐 (Perten) 3100 해머 제분기로 분쇄하여 유전자이전 옥수수 분말을 산출하였다. 대조군 옥수수를 유전자이전 옥수수에 의한 오염을 방지하지 하기 위하여 세척 후에 동일한 제분기에서 분쇄하였다.
2) 습기 분석: 유전자이전 및 대조군 옥수수의 샘플 (20 g)을 알루미늄 중량 보트에서 칭량을 하고 4 시간 동안 100℃에서 가열하였다. 샘플을 다시 칭량을 하고 습기 함량을 중량 손실로부터 계산하였다. 유전자이전 분말의 습기 함량은 9.26%였고, 대조군 분말의 습기 함량은 12.54%였다.
3) 슬러리의 제조: 슬러리의 조성물은 SSF 개시에서 36% 고체를 가지는 매쉬를 수득하도록 디자인되었다. 대조군 샘플을 100 ml 플라스틱 병에서 제조하고 대조군 옥수수 분말 21.50 g, 탈이온화수 23 ml, 백셋 6.0 ml (중량으로 8% 고체) 및 물로 1/50 희석된 시판되는 α-아밀라제 0.30 ml을 함유하였다. 상기 α-아밀라제 용량은 공업용도의 전형으로서 선택되었다. 유전자이전 α-아밀라제의 분석을 위하여 상기에서 기술된 조건에서 분석되었을 때, 대조군 α-아밀라제 용량은 2 U/g 옥수수 분말이었다. pH를 암모늄 히드록시드의 첨가하에 6.0으로 조절되었다. 유전자이전 샘플을 같은 방식으로 제조하였으나 유전자이전 분말의 더 낮은 습기 함량때문에 옥수수 분말 20 g을 함유하였다. 유전자이전 분말의 슬러리를 대조군 샘플과 같은 용량에서 α-아밀라제를 이용하거나 또는 외인성 α-아밀라제 없이 제조하였다.
4) 액화: 유전자이전 옥수수 분말을 함유하는 병을 5, 15, 30, 45 또는 60 분의 시간 동안 85℃ 또는 95℃에서 수조에 담구었다. 대조군 슬러리를 85℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 고온 인큐베이션 동안에 슬러리를 격렬하게 매 5 분마다 손으로 혼합하였다. 고온 단계 후에 슬러리를 얼음에서 냉각시켰다.
5) 동시 당화 및 발효: 액화에 의하여 생산된 매쉬를 글루코아밀라제 (시판되는 L-400 글루코아밀라제 1/50 희석의 0.65 ml), 프로테아제 (시판되는 프로테아제 1,000 배 희석의 0.60 ml), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (50% 우레아 액의 10-배 희석의 0.85 ml)와 혼합되었다. 매쉬를 함유하고 있는 100 ml 병의 뚜껑에 구멍을 내어 CO2를 통풍시켰다. 그 후 매쉬를 효모 (1.44 ml)로 접종하고 90℉수조에서 인큐베이션하였다. 발효 24 시간 후에 온도가 86℉로 저하되었고 48 시간에 온도가82℉로 맞추어졌다.
접종을 위한 효모를 70 그램 말토덱스트린, 230 ml 물, 100 ml 백셋, 글루코아밀라제 (시판되는 글루코아밀라제의 10배 희석의 0.88 ml), 프로테아제 (시판되는 효소의 100배 희석의 1.76 ml), 우레아 (1.07 그램), 페니실린 (0.67 mg) 및 황산아연 (0.13 g)를 이용하여 효모 (0.12 g)를 함유하는 혼합물을 제조하여 접종을 위한 효모를 증식하였다.
증식 배양은 필요하기 전에 개시하였고 90℉에서 혼합과 함께 인큐베이션되었다.
24, 48 및 72 시간에서 샘플을 각각의 발효조로부터 취하고, 0.2 μm 필터를 통하여 여과하고 에탄올 & 당을 HPCL로 분석하였다. 72 h에 샘플에서 전체 용해된 고체 및 잔류 전분을 분석하였다.
HPLC 분석을 굴절 지수 검출기, 컬럼 가열기 & 바이오-래드 (Bio-Rad) 아미넥스 (Aminex) HPX-87H 컬럼이 장착된 이중 구배 시스템에서 실행하였다. 상기 시스템을 1 ml/분에서 물에서의 0.005 M H2SO4를 이용하여 평형화하였다. 컬럼 온도는 50℃였다. 샘플 주입 부피는 5 μl이고; 용출을 동일한 용액으로 하였다. RI 반응은 공지의 스탠다드의 주입에 의하여 조절되었다. 에탄올 및 글루코스 둘 모두가 각 주입에서 측정되었다.
잔류 전분은 하기와 같이 측정되었다. 샘플 및 스탠다드를 오븐에서 50℃에서 건조하고 그 후 샘플 제분기에서 가루로 분쇄되었다. 가루 (0.2 g)를 눈금이 새겨진 15 ml 원심분리 튜브에서 칭량하였다. 가루를 볼텍싱으로 10 ml 수성 에탄올 (80% v/v)을 이용하여 3 번 세척하고 그 후 원심분리 및 상청액을 폐기하였다. DMSO (2.0 ml)를 펠렛에 첨가하고 그 후 MOPS 완충액에서 열안정적인 알파-아밀라제 (300 유닛) 3.0 ml을 첨가하였다. 격렬한 혼합 후에 튜브를 60 분 동안 85℃에서 수조에서 인큐베이션하였다. 샘플을 냉각하고 소듐 아세테이트 완충액 (200 mM, pH 4.5)을 추가하고 그 후 글루코아밀라제 (20 U) 0.1 ml을 첨가하였다. 샘플을 2 시간 동안 50℃에서 인큐베이션하고, 혼합하고 그 후 3,500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2 μm 여과지를 통하여 여과하고 상기된 대로 HPLC 방법에 의하여 글루코스를 분석하였다. 50 μl의 주입 크기를 저잔류 전분 ( < 고체의 20%)을 가진 샘플에 대하여 사용하였다.
결과유전자이전 옥수수는 추가된 α-아밀라제 없이 발효에서 잘 작동하였다. 72 h에서 에탄올의 수율은 표 1에서 보여진 것과 같이 외인성 α-아밀라제를 가진 것 또는 가지지 않은 것과 본질적으로 동일하였다. 하기 자료는 또한 액화 온도가 높을수록 에탄올의 더 높은 수율이 달성된다는 것을 보여주고; 유전자이전 옥수수에서 발현된 본 효소는 바실러스 리퀘파시엔스 (Bacillus liquefaciens) α-아밀라제와 같은 상용되는 다른 효소보다 더 높은 온도에서 활성을 가진다.
액화 온도℃ 액화 시간분 외인성α-아밀라제 레플리카 수 평균 에탄올% v/v 표준 편차% v/v
85 60 예 4 17.53 0.18
85 60 아니오 4 17.78 0.27
85 60 예 2 18.22 ND
85 60 아니오 2 18.25 ND
액화 시간이 다양해질 때 효과적인 에탄올 생산을 위해 필요로 하는 액화 시간은 통상적인 방법에 의하여 필요로 하는 시간보다 휠씬 적었다. 도 3은 72 시간 발효에서 에탄올 수득율은 15 분 내지 60 분 액화에서 거의 변하지 않았다는 것을 보여준다. 추가로 95℃에서의 액화는 85℃에서의 액화보다 각각의 시간점에서 더 많은 에탄올을 내었다. 상기 관찰은 초호열성 효소의 사용에 의하여 달성되는 공정의 향상을 보여준다.
대조군 옥수수가 유전자이전 옥수수보다 더 높은 최종 에탄올 수율을 내나, 대조군은 발효에서 작동을 아주 잘하기 때문에 선택된 것이었다. 반대로 유전자이전 옥수수는 형질전환을 용이하게 하기 위하여 선택된 유전자 배경을 가지고 있다. 공지인 교배 기술로 정예의 옥수수 점플라즘으로 α-아밀라제-특징을 도입하여 상기 차이를 제거할 것이다.
72 시간 (표 4)에 생산된 맥주의 잔류 전분 수준의 검사는 유전자이전 α-아밀라제가 발효에 이용할 수 있는 전분 생산을 주요하게 향상시킨 결과를 낳는다는 것을 보여주는데, 발효 후에 휠씬 더 적은 전분이 남아 있었다.
에탄올 수준 및 잔류 전분 수준 모두를 사용하여 적정한 액화 시간은 95℃에서 15분이고 85℃에서 30분이었다. 본 실험에서 상기 시간은 발효조가 수조에 있는 시간이고 따라서 샘플의 온도가 실온으로부터 85℃ 또는 95℃로 상승하고 있는 시간을 포함한다. 더 짧은 액화 시간은 제트쿠커 (jet cooker)와 같은 장비를 사용하여 매쉬를 신속하게 가열하는 대규모의 공업 규모에서 최적일 수 있다. 통상적인 공업적 액화 공정은 매쉬가 한 시간 이상 고온에서 인큐베이션 되도록 홀딩탱크 (holding tank)를 필요로 한다. 본 발명은 상기 홀딩탱크에 대한 필요를 없애고 액화 장비의 생산성을 증가시킬 것이다.
발효 공정에서 α-아밀라제의 한 중요한 기능은 매쉬의 점도를 감소시키는 것이다. 모든 시간점에서 유전자이전 옥수수 분말을 함유하는 샘플은 대조군 샘플보다 두드러지게 끈적거렸다. 추가로 유전자이전 샘플은 모든 대조군 샘플에서 관찰되는 젤라틴상을 경험하지 않는 것으로 나타났는데, 젤라틴화는 일반적으로 옥수수 슬러리가 삶아질 때 일어난다. 따라서 내배유의 단편을 통하여 분산된 α-아밀라제를 갖는다는 것은 확산을 지연시키고 매쉬를 혼합하고 펌프하는 에너지 비용을 상승시키는 큰 겔의 형성을 예방하여 삶는 동안 매쉬에 유리한 물리적 성질을 제공한다.
유전자이전 옥수수에서 높은 용량의 α-아밀라제는 또한 유전자이전 매쉬의 바람직한 성질에 기여할 수 있다. 85℃에서, 유전자이전 옥수수의 α-아밀라제의 활성은 대조군에서 사용된 외인성 α-아밀라제의 용량보다 여러 배 컸다. 후자는 상용 등급의 표준으로서 선택되었다.
실시예 15
대조군 옥수수와 혼합될 경우, 유전자이전 옥수수의 효과적 기능
유전자이전 옥수수 분말의 5% 내지 100%의 다양한 양으로 유전자이전 옥수수 분말을 대조군 옥수수 분말과 혼합하였다. 상기를 실시예 14에서와 같이 처리하였다. 유전자이전적으로 발현된 α-아밀라제를 함유하는 매쉬를 85℃에서 30분 동안또는 95℃에서 15분간 액화하고; 대조군 매쉬를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 제조하고, 85℃에서 30분 또는 60분 동안(각각의 하나) 또는 95℃에서 15분 또는 60분 동안(각각의 하나) 액화하였다.
48시간 및 72시간에서 에탄올에 대한 자료 및 잔류 전분에 대한 자료를 표 2에서 나타내었다. 48시간에서의 에탄올 양을 도 5에서 도시하고, 잔류 전분 결정을 도 6에서 나타내었다. 이들 자료는 유전자이전적으로 발현된 열안정적인 α-아밀라제는 유전자이전 곡물이 매쉬에서 총 곡물의 매우 작은 부분(5%만큼 낮음)인 경우에서조차 매우 양호한 에탄올 생산을 수행함을 보여준다. 상기 자료는 또한 유전자이전 곡물이 총 곡물의 40% 이상을 포함하는 경우 잔류 전분이 두드러지게 대조군 매쉬의 경우보다 낮음을 보여준다.
85℃ 액화 95℃ 액화
유전자이전 곡물wt% 잔류 전분 에탄올48 h 에탄올% v/v72 h 잔류 전분 에탄올48 h 에탄올% v/v72 h
100 3.58 16.71 18.32 4.19 17.72 21.14
80 4.06 17.04 19.2 3.15 17.42 19.45
60 3.86 17.16 19.67 4.81 17.58 19.57
40 5.14 17.28 19.83 8.69 17.56 19.51
20 8.77 17.11 19.5 11.05 17.71 19.36
10 10.03 18.05 19.76 10.8 17.83 19.28
5 10.67 18.08 19.41 12.44 17.61 19.38
0* 7.79 17.64 20.11 11.23 17.88 19.87
* 대조구 샘플, 수치는 2번 측정한 평균이다.
실시예 16
총 옥수수의 1.5 내지 12%의 비율에서 유전자이전 옥수수를 사용한 액화 pH의 함수로서의 에탄올 생산
유전자이전 옥수수는 발효 시에 총 옥수수의 5-10%의 양에서 잘 작동하기 때문에, 유전자이전 옥수수가 총 옥수수의 1.5 내지 12%를 구성하는 추가의 일련의 발효가 수행되었다. pH는 6.4 내지 5.2으로 변화하고, 유전자이전 옥수수에서 발현된 α-아밀라제 효소는 통상적으로 산업에 사용되는 것보다 더 낮은 pH에서 활성을 최적화되었다.
실험을 하기 예외를 두고 실시예 15에서 기술된 바와 같이 수행하였다:
1) 유전자이전 분말을 총 건조 중량의 백분율로 1.5% 내지 12.0%의 수준으로 대조군 분말과 혼합하였다.
2) 대조군 옥수수는 실시예 14 및 15에서 사용되는 대조구보다 유전자이전 옥수수와 더 유사한 N3030BT였다.
3) 외인성 α-아밀라제를 유전자이전 분말을 함유하는 샘플에 첨가하지 않았다.
4) 샘플을 액화 이전에 pH 5.2, 5.6, 6.0 또는 6.4로 조절하였다. 유전자이전 옥수수 분말 0% 내지 유전자이전 옥수수 분말 12%에 걸치는 적어도 5개의 샘플을 각 pH에 대하여 제조하였다.
5) 모든 샘플에 대한 액화를 85℃에서 60분간 수행하였다.
에탄올 함량의 변화를 발효 시간의 함수로 도 7에서 나타내었다. 상기 도는 3% 유전자이전 옥수수를 함유하는 샘플으로부터 얻은 자료를 보여준다. 더 낮은 pH에서, 발효가 pH 6.0 및 이상에서보다 더 빨리 진행하고, 유사한 거동이 다른 용량의 유전자이전 곡물의 샘플에서 발견되었다. 높은 수준의 발현으로 결합된 유전자이전 효소의 활성의 pH 프로파일은 더 낮은 PH 액화를 허용할 수 있어 더 빠른 발효를 야기하고, 따라서 통상적인 pH 6.0 공정에서 가능한 것 보다 더 높은 산출량을 야기한다.
72시간에서 에탄올 수득율을 도 8에서 나타내었다. 도에서 알 수 있듯이, 에탄올 수율을 기초로 하여 결과들은 샘플에 포함된 유전자이전 곡물의 양에 의존하지 않음을 보여준다. 따라서, 곡물은 풍부한 아밀라제를 함유하여 에탄올의 발효 생산을 용이하게 된다. 또한 낮은 pH로 액화시 더 높은 에탄올 수율을 얻을 수 있음을 증명하고 있다.
액화 후의 점도를 모니터링하고, pH 6.0에서 6% 유전자이전 곡물은 점도를 적절하게 감소시키기에 충분하다는 것을 관찰하였다. pH 5.2 및 5.6에서 12% 유전자이전 곡물에서 점도는 대조군의 점도와 동등하지만 더 낮은 백분율에서의 유전자이전 곡물에서는 그렇지 않았다.
실시예 17
옥수수 분말로부터 호열성 효소를 사용한 과당 제조
초호열성 α-아밀라제, 797GL3을 발현하는 옥수수는 α-글루코시다제 (MalA) 및 a 크실로스 이소메라제 (XylA)와 혼합되는 경우, 과당의 제조를 용이하게 하는 것으로 나타났다.
797GL3을 발현하는 pNOV6201 유전자이전 식물로부터의 종자를 클레코(Kleco) 세포 중 분말로 분쇄하여 아밀라제 분말을 형성시켰다. 비-유전자이전 옥수수 낟알을 동일한 방식으로 분쇄하여 대조군 분말을 형성하였다.
α-글루코시다제, MalA (에스. 솔파타리쿠스로부터)를 대장균 중에서 발현시켰다. 인큐베이션된 세균을 1 mM 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드를 포함하는 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.0 중에서 현탁시킨 다음, 고압력 셀(French pressure cell) 중에서 용균시켰다. 용균액을 4℃에서 15 분 동안 23,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 70℃로 10 분 동안 가열하고, 얼음에서 10 분 동안 냉각시킨 다음, 4℃에서 30 분 동안 34,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 센트리콘(centricon) 10 장치에서 MalA를 2 배 농축시켰다. MalA에 대한 음성 대조군으로서 사용하기 위해 센트리콘 10 단계의 여액을 보유하였다
티. 네아폴리타나의 xylA 유전자를 대장균 중에서 발현시킴으로써, 크실로스 (글루코스) 이소메라제를 제조하였다. 세균을 100 mM 인산나트륨 pH 7.0에서 현탁시키고, 고압력 세포를 통하여 용균시켰다. 세포 잔해가 침전된 후, 추출물을 80℃에서 10 분 동안 가열한 다음, 원심분리하였다. 상청액은 XylA 효소 활성을 포함하였다. 공벡터 대조군 추출물을 XylA 추출물과 유사하게 제조하였다.
옥수수 분말 (샘플 당 60 mg)을 완충제 및 대장균으로부터의 추출물과 혼합하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 샘플들은 아밀라제 옥수수 분말 (아밀라제) 또는 대조 옥수수 분말 (대조군), 50 ㎕의 MalA 추출물 (+) 또는 여액 (-), 및 20 ㎕의 XylA 추출물 (+) 또는 공 벡터 대조군 (-)를 포함하였다.
또한, 모든 샘플들은 230 ㎕의 50 mM의 MOPS, 10 mM의 MgS04, 및 1 mM CoCl2를 포함하였다; 완충제의 pH는 실온에서 7.0이었다.
샘플들을 85℃에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간의 종점에서, 샘플들을 85℃에서 0.9 ml의 물로 희석시키고, 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 그 다음, 상청액 분획물을 센트리콘 3 한외여과 장치를 통하여 여과하고, ELSD 검출을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다.
구배 HPLC 시스템에 아즈텍 폴리머 아미노 칼럼(Astec Polymer Amino Column), 5 미크론 입도, 250 X 4.6 mm 및 알테크(Alltech) ELSD 2000 검출기를 장착시켰다. 시스템은 15:85의 물 혼합물:아세토니트릴로 예비평형되어 있었다. 유량은 1 ml/분이었다. 주입 후 초기 조건을 5 분 동안 유지시키고, 뒤이어 20 분 동안 50:50의 물:아세토니트릴의 구배로 하고, 뒤이어 동일한 용매로 10 분 동안 두었다. 시스템을 20 분 동안 80:20의 물:아세토니트릴로 세척한 다음, 출발 용매로 재평형시켰다. 과당을 5.8 분에서 용리시키고, 글루코스를 8.7 분에서 용리시켰다.
또한, HPLC 결과는 α-아밀라제를 포함하는 모든 샘플 중에 보다 큰 말토올리고당이 존재함을 나타내었다. 이들 결과는 세가지 호열성 효소들이 함께 기능하여 고온에서 옥수수 분말로부터 과당을 생성시킴을 증명한다.
실시예 18
아밀라제 분말과 이소메라제
또다른 실시예에서, 아밀라제 분말을 정제된 MalA 및 2 개의 세균성 크실로스 이소메라제 각각(티. 마리티마의 XylA 및 디버사(Diversa)로부터 얻은 BD8037로 명명되는 효소)과 혼합하였다. 아밀라제 분말을 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조하였다.
에스. 솔파타리쿠스MalA와 6His 정제 태그를 대장균에서 발현시켰다. 세포 용균액을 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조한 다음, 니켈 친화성 수지(프로본드(Probond), 인비트로겐(Invitrogen))를 사용하고 본래의 단백질 정제에 대한 제조자 지시에 따라 정제하여 겉보기 균질을 얻었다.
S 태그가 첨가된티. 마리티마XylA 및 ER 보유 신호를 대장균에서 발현시키고, 실시예 18에 기재된티. 네아폴리타나XylA와 동일한 방식으로 제조하였다.
크실로스 이소메라제 BD8037을 동결건조된 분말로서 얻고, 물의 원래 부피의 0.4배에서 재현탁시켰다.
아밀라제 옥수수 분말을 효소 용액과 물 또는 완충제와 혼합하였다. 모든 반응물은 60 mg의 아밀라제 분말 및 총 600 ㎕의 액체를 포함하였다. 반응물 중한 세트를 50 mM MOPS, pH 7.0 및 실온에서, 및 10 mM MgS04및 1 mM CoCl2로 완충시키고; 반응물 중 제 2 세트를 금속-함유 완충제 용액을 물로 대체시켰다. 이소메라제 효소량을 표 4에 나타낸 바와 같이 변화시켰다. 모든 반응물을 2 시간 동안 90℃에서 인큐베이션하였다. 반응 상청액 분획물을 원심분리에 의해 제조하였다. 펠릿을 추가의 600 ㎕의 H20로 세정하고, 재원심분리하였다. 각 반응으로부터 상청액 분획물들을 한데 합치고, 센트리콘 10을 통하여 여과시키고, 실시예 17에 기재된 바와 같이 ELSD 검출을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 관찰된 글루코스 및 과당의 양을 도 15에 그래프로 나타낸다.
각 이소메라제를 사용하여, α-아밀라제 및 α-글루코시다제가 반응에 존재하는 경우, 과당을 옥수수 분말로부터 투여량 의존 방식으로 제조하였다. 이들 결과는 금속 이온의 첨가 또는 첨가 없이, 곡물-발현 아밀라제 797GL3이 MalA 및 다양한 상이한 호열성 이소메라제들과 기능하여 고온에서, 옥수수 분말로부터 과당을 제조한다는 것을 입증한다. 첨가된 2가 금속 이온의 존재 하에서, 이소메라제는예상되는 과당을 얻게 할 수 있다: 90℃에서, 약 55% 과당의 글루코스 평형. 이는 과당 농도를 증가시키기 위해 크로마토그래피 분리가 요구되는 중온성 이소메라제를 사용하는 현재의 공정에 비하게 개선된 것이다.
실시예 19
옥수수 중 풀루란아제의 발현
pNOV7013 또는 pNOV7005에 대해 동형접합체인 유전자이전 식물을 교배하여 97GL3 α-아밀라제 및 6GP3 풀루란아제 모두를 발현하는 유전자이전 옥수수 종자를 생성시켰다.
pNOV 7005 또는 pNOV 4093로 형질전환된 자가 수분 옥수수 식물로부터 T1 또는 T2 종자를 얻었다. pNOV4093은 6GP3 (서열: 3, 4)에 대한 옥수수 최적화 합성 유전자와 융합 단백질의 백색체로의 편재화를 위한 백색체 표적 서열 (서열 7, 8)과의 융합체이다. 이 융합 단백질은 내배유에서 특이적으로 발현되기 위한 ADPgpp 프로모터 (서열 11)의 조절 하에 있다. pNOV7005 구조물은 내배유의 소포체 중에서 풀루란아제의 발현을 표적으로 한다. ER 중에서 이 효소의 편재화는 낟알 중 전분이 정상 축적되게 한다. 또한, 고온노출 전, 요오드 용액으로 정상 착색시킨 전분을 관찰하였다.
α-아밀라제의 경우에 대해 기재된 바와 같이, 백색체 (pNOV4093)를 표적화하는 풀루란아제의 발현은 낟알 중에 비정상적인 전분 축적을 야기하였다. 옥수수-이삭이 건조되는 경우, 낟알은 움츠러들었다. 분명히, 이 호열성 풀루란아제 저온에서 충분히 활성화되고, 종자 내배유 중에서 전분 과립과 직접 접촉하게되는 경우 전분을 가수분해한다.
효소 제조 또는 옥수수 분말로부터의 효소 추출: 유전자이전 종자로부터 이를 클레코 그라인더로 분쇄시키고, 이어서 1 시간 동안 실온에서 분말을 연속 진탕하면서 50 mM NaOAc pH 5.5 완충제에서 인큐베이션함으로써 풀루란아제 효소를 추출하였다. 그 다음, 인큐베이션된 혼합물을 15 분 동안 14000 rpm에서 회전시켰다. 상청액을 효소원으로서 사용하였다.
풀루란아제 분석시험: 분석시험 반응을 96 개의 웰 플레이트에서 수행하였다. 옥수수 분말 (100 ㎕)로부터 추출된 효소를 40 mM CaCl2를 포함하는 900 ㎕의 50mM NaOAc pH5.5 완충제로 10 배 희석시켰다. 혼합물을 볼텍싱시키고, 1 정제의 리미트-덱스트리자임(Limit-Dextrizyme)(메가자임으로부터의 아주린 (azurine)-가교-풀루란)을 각 반응 혼합물에 첨가하고, 75℃에서 30 분 동안 (또는 언급한 바와 같이) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종점에서, 반응 혼합물 을 15 분 동안 3500 rpm에서 회전시켰다. 상청액을 5 배 희석시키고, 590 nm에서 흡광도 측정을 위해 96개 웰의 평바닥 플레이트로 옮겼다. 풀루란아제에 의한 아주린-가교-풀루란 기질의 가수분해는 수용성 염료 단편을 생성시키고, 이들의 해리 속도(590 nm에서 흡광도 증가로서 측정됨)는 효소 활성과 직접적으로 연관되어 있다.
도 9는 다양한 경우들로부터의 pNOV 7005로 형질전환된 T2 종자의 분석을 나타낸다. 비-유전자이전 대조군에 비교한 풀루란아제 활성의 높은 발현은 수많은 경우들에서 검출될 수 있다.
유전자이전 (풀루란아제, 또는 아밀라제 또는 양쪽 효소를 발현함) 및(또는) 대조군 (비유전자이전)으로부터의 계측된 양 (~100 ㎕)의 건조 옥수수 분말에 40 mM CaCl2를 포함하는 1000 ㎕의 50mM NaOAc pH 5.5 완충제를 첨가하였다. 반응 혼합물을 볼텍싱하고, 진탕기에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 혼합물을 도에서 지시한 바와 같은 시간 동안 고온 (75℃, 풀루란아제에 대한 최적 반응 온도 또는 도에서 언급한 바와 같음)으로 이전시킴으로써 효소 반응을 출발하였다. 이들을 얼음에서 냉각시킴으로써 반응을 정지시켰다. 그 다음, 반응 혼합물을 10 분 동안 14000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액 중 한 분취량 (100 ㎕)을 3 배 희석시키고, HPLC 분석을 위해 0.2-미크론 필터를 통해 여과시켰다.
샘플을 하기 조건을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다:
칼럼: 알테크 프리베일 카르보하이드레이트(Alltech Prevail Carbohydrate) ES 5 미크론 250 X 4.6 mm
검출기: 알테크 ELSD 2000
펌프: 길슨(Gilson) 322
주입기: 길슨 215 주입기/희석기
용매: HPLC용 아세토니트릴(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 및 물(워터스 밀리포어 시스템(Waters Millipore System)에 의해 정제됨)
저 중합도(DP 1-15)의 올리고당에 사용되는 구배.
시간 % 물 % 아세토니트릴
0 15 85
5 15 85
25 50 50
35 50 50
36 80 20
55 80 20
56 15 85
76 15 85
고 중합도(DP 20-100 이상)의 당에 사용되는 구배.
시간 % 물 % 아세토니트릴
0 35 65
60 85 15
70 85 15
85 35 65
100 35 65
데이타 분석에 사용되는 시스템: 길슨 유니포인트 소프트웨어 시스템 버젼 3.2(Gilson Unipoint Software System Version 3.2)
도 10A 및 10B는 유전자이전 옥수수 분말 중에서 전분으로부터의 발현된 풀루란아제에 의해 생성된 가수분해 생성물의 HPLC 분석을 나타낸다. 옥수수를 발현하는 풀루란아제 분말을 반응 완충제 중에서 75℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 결과, 콘스타치로부터 중간 쇄 올리고당(DP-10-30) 및 아밀로스 단쇄(DP-100-200)가 제조되었다. 또한, 이 도는 칼슘 이온이 존재에 대한 풀루란아제 활성의 의존성을 나타낸다.
풀루란아제를 발현하는 유전자이전 옥수수는 탈분지된 (분절된 α1-6 연결) 개질 전분/덱스트린을 생성시키는 데 사용될 수 있고, 따라서 많은 양의 아밀로스/직쇄 덱스트린을 가질 것이다. 또한, 사용되는 전분 (예를 들면, 왁시, 높은 아밀로스 등)의 종류에 따라, 풀루란아제에 의해 생성되는 아밀로스/덱스트린의 쇄 길이 분포가 변할 것이고, 이로써 개질 전분/덱스트린 성질도 변할 것이다.
또한, α1-6 연결의 가수분해도 기질로서 풀루란의 사용을 증명하였다. 옥수수 분말로부터 단리된 풀루란아제는 유효하게 풀루란을 가수분해하였다. 옥수수로부터 효소에 의한 풀루란 분자 중 α1-6 연결의 가수분해 때문에, 인큐베이션 종점에서 생성된 생성물의 HPLC 분석 (기재한 바와 같음)은 예상한 바와 같이 말토트리오스가 생성되었음을 보여주었다.
실시예 20
옥수수 중 풀루란아제의 발현
옥수수 분말로부터의 추출에 이어 PAGE 및 코마시에 염색에 의하여, 6gp3 풀루란아제의 발현을 추가 분석하였다. 30 분 동안 클레코 그라인더에서 종자를 분쇄시킴으로써 옥수수-분말을 제조하였다. 약 150 mg의 분말로부터 1 ml의 50 mM NaOAc pH 5.5 완충제를 사용하여 효소를 추출하였다. 혼합물을 볼텍싱시키고, 실온에서 1 시간 동안 진탕기에서 인큐베이션하고, 이어서 70℃에서 추가로 15 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 혼합물을 회전시키고(14000 rpm, 15 분 동안, 실온에서), 상청액을 SDS-PAGE 분석으로서 사용하였다. 적절한 분자량 (95 kDal)의 단백질 밴드가 관찰되었다. 이들 샘플들은 상업적으로 입수가능한 염료 결합(dye-conjugated) 한계-덱스트린 (아일랜드 소재의 메가자임으로부터의 리미트-덱스트리자임)을 사용한 풀루란아제 분석시험을 받게 된다. 고도의 호열성 풀루란아제 활성은 95 kD 단백질의 존재와 상호관련되어 있다.
또한, 유전자이전 옥수수 종자의 웨스턴 블럿(Western blot) 및 ELISA 분석은 풀루란아제 (대장균에서 발현됨)에 대해 형성되는 항체와 반응하는 ~95 kD 단백질의 발현을 증명하였다.
실시예 21
옥수수를 발현하는 풀루란아제의 첨가에 의한 개선된 단쇄 (발효가능한) 올리고당의 수율 및 전분 가수분해 속도의 증가
상기와 같이, 도 11A 및 11B에 나타낸 데이타를 2 가지 반응 혼합물로부터의 전분 가수분해 생성물의 HPLC 분석으로부터 얻었다. '아밀라제'로서 표시된 제1 반응물은 비-유전자이전 옥수수 A188 및 예를 들면, 실시예 4에 기재된 방법에 따라 제조된 유전자이전 옥수수를 발현하는 α-아밀라제의 옥수수 분말 샘플의 혼합물 [1:1 (w/w)]을 포함하고; 제2 반응 혼합물 '아밀라제 + 풀루란아제'는 유전자이전 옥수수를 발현하는 α-아밀라제의 옥수수 분말 샘플 및 실시예 19에 기재된 방법에 따라 제조된 유전자이전 옥수수를 발현하는 풀루란아제의 혼합물 [1:1 (w/w)]을 포함한다. 얻어진 결과들은 전분 가수분해 공정 동안 풀루란아제와 α-아밀라제를 함께 사용하는 것이 유리하다는 것을 뒷받침한다. 전분 가수분해 속도 증가 (도 11A) 및 낮은 DP를 갖는 발효가능한 올리고당의 수율 증가(도 11B)로부터 상기 이점이 발생한다.
옥수수에서 발현되는 α-아밀라제 단독 또는 α-아밀라제 및 풀루란아제 (또는 전분 가수분해 효소의 다른 조합)가 말토덱스트린(직쇄 또는 분지된 올리고당)을 생성하는 데에 사용될 수 있다는 것을 발견하였다(도 11A, 11B, 12, 및 13A). 반응 조건에 따라, 가수분해 효소의 타입 및 그들의 조합, 및 사용되는 전분의 타입, 생성되는 말토덱스트린의 조성물, 및 이에 의한 그들의 성질은 변할 것이다.
도 12는 도 11에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 수행된 실험 결과를 도시한다. 반응물을 인큐베이션하는 동안 다양한 온도 및 시간 도해를 도에 나타낸다. 풀루란아제에 대한 최적 반응 온도는 75℃이고, α-아밀라제에 대한 경우는 > 95℃이다. 따라서, 상기 도해는 풀루란아제 및(또는) α-아밀라제가 그들 각각의 최적 반응 온도에서 촉매작용을 수행할 수 있는 범주를 제공하는 것으로 이해된다. 60 분 인큐베이션 기간의 종점에서 α-아밀라제 및 풀루란아제의 혼합물이 콘스타치의 가수분해를 보다 우수하게 수행한다는 것을 보여준 결과로부터 명백히 도출할 수 있다.
30 분간 인큐베이션의 종점에서, 반응 혼합물 두 세트로부터 상기와 같이 (이들 반응에 ~150 mg의 옥수수 분말을 사용한 경우 제외) 전분 가수분해 생성물을 HPLC 분석한 결과를 도 13A 및 13B에 도시한다. 반응물의 제1 세트를 85℃에서 인큐베이션하고, 제2 세트를 95℃에서 인큐베이션하였다. 각 세트에 2 가지 반응 혼합물이 존재한다; '아밀라제 X 풀루란아제'로서 표시된 제1 반응물은 α-아밀라제 및 풀루란아제 모두를 발현하는 유전자이전 옥수수 (타가수분에 의해 생성됨)으로부터의 분말을 포함하고, '아밀라제'로서 표시되는 제2 반응물은 유전자이전 옥수수를 발현하는 α-아밀라제의 옥수수 분말 샘플 및 비-유전자이전 옥수수 A188의 혼합물을 교배시(아밀라제 X 풀루란아제) 관찰되는 것과 동일한 양의 α-아밀라제 활성을 얻을 수 있는 비로 포함한다. 저 DP 올리고당의 총 수율은 옥수수 분말 샘플을 85℃에서 인큐베이션한 경우, α-아밀라제를 단독으로 발현하는 옥수수보다 α-아밀라제 및 풀루란아제 교배물(cross)의 경우가 더 많았다. 95℃의 인큐베이션 온도는 (적어도 부분적으로) 풀루란아제 효소를 불활성화시키기 때문에, '아밀라제 X 풀루란아제' 및 '아밀라제' 간에 약간의 차이를 관찰할 수 있다. 그러나, 인큐베이션 온도 양쪽 모두에 대한 데이타는 α-아밀라제 및 풀루란아제 교배물의 옥수수 분말이 사용된 경우, 인큐베이션 기간의 종점에서 생성되는 글루코스의 양(도 13B) 측면에서 α-아밀라제만을 단독으로 발현하는 옥수수에 비해 상당히 개선되었음을 나타낸다. 따라서, α-아밀라제 및 풀루란아제 모두를 발현하는 옥수수의 사용은 글루코스에 대한 전분의 완전한 가수분해가 중요시 되는 공정의 경우 특히 유리할 수 있다.
상기 실시예들은 옥수수 종자에서 발현되는 풀루란아제가 α-아밀라제와 함께 사용되는 경우 전분 가수분해 공정을 개선시킨다는 점에 대한 충분한 지지를 제공한다. α1-6 연결 특이적인 풀루란아제 효소 활성은 α-아밀라제 (α-1-4 연결 특이 효소)보다 훨씬 더 유효하게 전분을 탈분지화시킴으로써 분지된 올리고당(예를 들면, 한계-덱스트린, 판노스(panose); 이들은 대개 발효가능하지 않음)의 양을 감소시키고, 직쇄의 짧은 올리고당 (에탄올 등으로 용이하게 발효가능함)의 양을 증가시킨다. 또한, 풀루란아제 촉매된 탈분지에 의한 전분 분자의 단편화는 α-아밀라제에 대한 기질 접근성을 증가시켜서, α-아밀라제 촉매된 반응 결과의 효율을 증가시킨다.
실시예 22
유사한 pH 및 온도 조건 하에서, 797GL3 알파 아밀라제 및 malA α-글루코시다제 중 어느 것이 효소 단독에 의해 생성되는 것에 비해 증가된 양의 글루코스를 생성하도록 기능할 수 있는지 결정하기 위하여, 약 0.35 ㎍의 malA 알파 글루코시다제 효소 (세균 중에서 생성됨)를 1% 전분 및 비-유전자이전 옥수수 종자 (대조군) 또는 797GL3 유전자이전 옥수수 종자 (797GL3 옥수수 종자 중에서, 알파 아밀라제를 전분과 함께 공정제함)로부터 정제된 전분을 포함하는 용액에 첨가하였다. 또한, 임의의 malA 효소의 부재 하에서, 비-유전자이전 및 797GL3 유전자이전 옥수수 종자로부터 정제된 전분을 1% 옥수수 전분에 첨가하였다. 혼합물을 pH 6.0 및 90℃에서, 1 시간 동안 인큐베이션하고, 회전시켜 임의의 불용성 물질을 제거하고, 가용성 분획물을 글루코스 수치에 대하여 HPLC 분석하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 797GL3 α-아밀라제 및 malA α-글루코시다제는 유사한 pH 및 온도에서 전분을 글루코스로 분해하는 기능을 한다. 생성된 글루코스의 양은 효소 단독에 의하여 생성된 경우보다 상당히 많았다.
실시예 23
생 전분 가수분해에 대한 써모아나에로박테륨 글루코아밀라제의 유용성을 측정하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 생 전분의 가수분해 전환을 물로 시험하고, 보리 α-아밀라제 (시그마로부터의 상업적 제제), 써모아나에로박터륨 글루코아밀라제, 및 그들의 혼합물을 실온 및 30℃에서 확인하였다. 나타낸 바와 같이, 보리 α-아밀라제와 써모아나에로박테륨 글루코아밀라제의 혼합물이 생 전분을 글루코스로 가수분해하였다. 또한, 보리 아밀라제 및 써모아나에로박터 GA에 의해 생성된 글루코스의 양도 효소 단독에 의하여 생성된 것보다 상당히 많았다.
실시예 24
생 전분 가수분해를 위한 옥수수 최적화 유전자 및 서열 및 식물 형질전환을 위한 벡터
약 20-50℃의 범위의 온도에서 생 전분을 가수분해시키는 능력에 기준하여 효소를 선택하였다. 그 다음, 실시예 1에 나타낸 바와 같이 합성 유전자 구성을 위한 옥수수에 바람직한 코돈을 사용하여 상응하는 유전자 또는 유전자 단편을 작제하였다.
아스페르길루스 쉬로우사미α-아밀라제/글루코아밀라제 융합 폴리펩티드 (신호 서열 없음)를 선택하였고, 이는 문헌[Biosci. Biotech. Biochem., 56: 884-889 (1992); Agric. Biol. Chem. 545: 1905-14 (1990); Biosci. Biotechnol. Biochem. 56: 174-79 (1992)]에서와 같이 서열 45에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 옥수수 최적화 핵산을 작제하였고 서열 46에 나타낸다.
유사하게, 문헌[Biosci. Biotech. Biochem., 62: 302-308 (1998)]에서 공개된 바와 같이, 서열 47의 아미노산을 갖는써모아나에로박테륨 써모사카롤리티큠글루코아밀라제를 선택하였다. 옥수수 최적화 핵산을 작제하였다(서열 48).
문헌[Agric. Biol. Chem. (1986) 50, pg 957-964]에 기재된 바와 같이, 아미노산 서열(신호 서열 없음)을 갖는리조푸스 오리자에글루코아밀라제를 선택하였다(서열 50). 옥수수 최적화 핵산을 작제하였고 서열 51에 나타낸다.
또한, 옥수수 α-아밀라제를 선택하고, 아미노산 서열 (서열 51) 및 핵산 서열 (서열 52)을 문헌으로부터 얻었다. 예를 들면, 문헌[Plant Physiol. 105: 759-760 (1994)] 참조.
서열 46에 나타낸 바와 같이 작제된 옥수수 최적화 핵산으로부터아스페르길루스 쉬로우사미α-아밀라제/글루코아밀라제 융합 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 서열 48에 나타낸 바와 같이 작제된 옥수수 최적화 핵산으로부터써모아나에로박테륨 써모사카롤리티큠글루코아밀라제를 발현시키기 위해, 서열 50에 나타낸 바와 같이 작제된 옥수수 최적화 핵산으로부터 아미노산 서열 (신호 서열 없음) (서열 49)을 갖는 것으로 선택된리조푸스 오리자에글루코아밀라제를 발현시키기 위해, 및 옥수수 α-아밀라제를 발현시키기 위해 발현 카세트들을 구성한다.
옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함하는 플라스미드를 효소를 코딩하는 합성 유전자에 융합시킨다. 임의적으로, 서열 SEKDEL은 표적을 위한 합성 유전자의 C-말단에 융합되고 ER 중에서 보유된다. 식물 형질전환 플라스미드 중 내배유에서 융합체는 특이적 발현을 위한 옥수수 γ-제인 프로모터 뒤에서 클로닝된다. 융합체는 아그로박테륨 형질감염을 통하여 옥수수 조직으로 전달된다.
실시예 25
효소를 발현시키기 위해, 선택된 효소를 포함하는 발현 카세트를 구성한다.
생 전분 결합 부위 서열을 포함하는 플라스미드를 효소를 코딩하는 합성 유전자에 융합시킨다. 생 전분 결합 부위는 효소 융합체가 비젤라틴화 전분에 결합하게 한다. 생 전분 결합 부위 아미노산 서열 (서열 53)을 문헌을 기준으로 결정하고, 핵산 서열은 옥수수 최적화되어 서열 54를 제공하였다. 옥수수 최적화 핵산 서열은 식물 내 발현을 위한 플라스미드 중에서 효소를 코딩하는 합성 유전자에 융합된다.
실시예 26
식물 형질전환을 위한 옥수수 최적화 유전자 및 벡터의 구성
실시예 1에 나타낸 바와 같이 합성 유전자의 구성을 위해 옥수수에 바람직한 코돈을 사용함으로써 유전자 또는 유전자 단편을 작제하였다.
피로코쿠스 푸리오수스EGLA, 초호열성 엔도글루카나제 아미노산 서열 (신호 서열 없음)을 선택하였고, 이는 문헌[Journal of Bacteriology (1999) 181, pg 284-290]에서와 같이 서열 55에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 옥수수 최적화 핵산을 작제하였고 서열 56에 나타낸다.
써무스 플라부스(Thermus flavus)크실로스 이소메라제를 선택하였고, 이는 문헌[Applied Biochemistry 및 Biotechnology 62: 15-27 (1997)]에 기재된 바와 같이, 서열 57에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
옥수수 최적화 핵산 (서열 56)으로부터피로코쿠스 푸리오수스EGLA (엔도글루카나제)를 발현시키기 위해, 아미노산 서열 서열 57을 코딩하는 옥수수 최적화 핵산으로부터써무스 플라부스크실로스 이소메라제를 발현시키기 위해 발현 카세트를 구성한다. 옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (MRVLLVALALLALAASATS) (서열 17)을 포함하는 플라스미드는 효소를 코딩하는 합성 옥수수 최적화 유전자에 융합된다. 임의적으로, 서열 SEKDEL은 표적을 위한 합성 유전자의 C-말단에 융합되고 ER에서 보유된다. 식물 형질전환 플라스미드 중 내배유에서 융합체는 특이적 발현을 위한 옥수수 γ-제인 프로모터 뒤에서 클로닝된다. 융합체는 아그로박테륨 형질감염을 통하여 옥수수 조직으로 전달된다.
실시예 27
옥수수 중의 발현된 호열성 효소를 사용한 옥수수 분말로부터 글루코스의 제조
수용액에서 혼합하고 90℃에서 배양될 때, 호열성 α-아밀라제, 797GL3 및 α-글루코시다제 (MalA)가 발현하여 글루코스의 제조를 야기하는 것을 나타낸다.
p-니트로페닐-α-글루코시드의 가수분해에 의해 나타나는 α-글루코시다제를 측정함으로써 MalA 효소를 발현하는 유전자이전 옥수수 계통 (168A1OB, pNOV4831주)가 동정되었다.
797GL3을 발현하는 옥수수 낟알을 크레코 셀(Kleco cell) 내에서 분말로 갈아서 아밀라제 가루로 만들었다. MalA를 발현하는 유전자이식 식물로부터의 옥수수 낟알을 크레코 셀 내에서 갈아서 MalA 분말을 생성하였다. 비-유전자이식 옥수수 낟알을 동일한 방식으로 갈아서 대조 분말을 생성하였다.
완충액은 50 mM MES 완충액, pH 6.0이었다.
옥수수 분말 가수분해 반응: 샘플을 아래의 표 5에서 나타낸 바와 같이 제조하였다. 옥수수 분말(샘플당 약 60 mg)을 50 mM MES 완충액, pH 6.0과 혼합하였다. 샘플을 90℃의 수조 세트에서 2.5시간 및 14시간 동안 배양하였다. 지정한 배양 시간에 샘플을 빼내고 글루코스 함량을 위하여 분석하였다.
샘플을 글루코스 산화효소/호스 래디쉬 퍼록시다제 기초 검정법에 의하여 글루코스에 대하여 검정하였다. GOPOD 시약은 0.2 mg/ml o-디아니시딘, 100 mM 트리스 pH 7.5, 100 U/ml 글루코스 산화효소 및 10 U/ml 호스 래디쉬 퍼록시다제를 포함한다. 20 ㎕의 샘플 또는 희석 샘플을 글루코스 표준(0 내지 0.22 mg/ml까지 다양함)과 함께 96웰 플레이트에 배열시켰다. GOPOD 시약 100 ㎕을 혼합하면서 각 웰에 첨가하고 이 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 9M 황산 100 ㎕을 첨가하였고, 540nm에서 흡광도를 읽었다. 샘플의 글루코스 농도를 기준 대 표준 곡선에 의하여 결정하였다. 각 샘플에서 글루코스의 양을 표 5에서 나타내었다.
샘플 WT 분말mg 아밀라제 분말mg MalA 분말mg 완충액ml 글루코스2.5 hmg 글루코스14 hmg
1 66 0 0 40 0 0
2 31 30 0 40 0.26 0.50
3 30 0 31.5 40 0 0.09
4 0 32.2 30.0 40 2.29 12.30
5 0 6.1 56.2 40 1.16 8.52
이들 데이터는 초호열성 α-아밀라제 및 α-글루코시다제를 옥수수에서 발현하면 적당한 조건하에서 가수화하고 가열할 경우 글루코스를 생성할 수 있는 옥수수 산물을 야기함을 증명해준다.
실시예 28
말토덱스트린의 제조
호열성 α-아밀라제를 발현하는 곡물을 사용하여 말토덱스트린을 제조하였다. 예시된 방법은 전분의 미리 단리하는 것을 요하지 않고 또한 외인성 효소의 부가를 요하지도 않는다.
797GL3을 발현하는 유전자이전 식물로부터의 옥수수 낟알을 크레코 셀에서 갈아 분말로 만들어 "아밀로스 분말"을 생성하였다. 10% 유전자이전/90% 비유전자 이전 낟알의 혼합물을 동일한 방식으로 갈아 "10% 아밀로스 분말"을 생성하였다.
아밀로스 분말 및 10% 아밀라제 분말(약 60 mg/샘플)을 물과 분말 1 mg 당 물 5 ㎕의 비율로 혼합하였다. 얻어진 슬러리를 표 6에서 나타낸 바와 같이 90℃에서 20시간 이하까지 배양하였다. 85℃에서 50 mM EDTA 0.9 ml를 첨가하여 반응을 멈추고 피페팅하여 혼합하였다. 0.2 ml의 슬러리의 샘플을 빼내고 원심분리하여 불용 물질을 제거하고 물로 3번 희석하였다.
샘플을 ELSD 검출기를 갖는 HPLC로 당 및 말토덱스트린에 대하여 분석하였다. 구배 HPLC 시스템은 아스텍 폴리머 아미노 칼럼(Astec Polymer Amino Column), 5 마이크론 입자 크기, 250X 4.6mm, 및 알테크 ELSD 2000 디덱터(Altech ELSD detector)를 장착하였다. 이 시스템은 물:아세토니트릴 15:85 혼합물로 미리 평형시켰다. 유속은 1 ml/분이었다. 주입후 개시 조건을 5분간 유지한 후 20분간구배를 주어 50:50 물:아세토니트릴로 맞추고 다음에 10분간 동일 용매로 유지하였다. 시스템을 80:20 물:아세토니트릴로 20분간 세척하고 다음에 상기 출발 용매로 다시 평형되게 하였다.
얻어진 피크 면적을 분말의 체적 및 무게에 대해 정규화하였다. 탄수화물의 ㎍ 당 ELSD의 반응 인자는 DP가 증가할수록 감소하였고 DP가 높을수록 말토덱스트린은 피크 면적에서 나타낸 것 보다 더 높은 전체 백분율을 나타내었다.
100% 아밀라제 분말과의 반응 산물의 상대 피크 면적을 도 17에서 나타내었다. 10% 아밀라제 분말과의 반응 산물의 상대 피크 면적을 도 18에서 나타내었다.
이들 데이터는 가열 시간을 변화함으로써 다양한 말토덱스트린 혼합물을 생성할 수 있다는 것을 증명하고 있다. 유전자이전 α-아밀라제 발현 옥수수와 야생형 옥수수를 혼합함으로써 말토덱스트린 프로파일을 변경하여 α-아밀라제 활성의 수준을 변화할 수 있다.
이 실시예에서 기술된 가수분해 반응의 산물을 음식용 및 기타 적용을 위해 원심분리, 여과, 이온 교환, 겔 투과, 초여과, 나노여과, 역삼투, 탄소입자를 사용한 탈색, 스프레이 건조 및 당업계에서 알려진 다른 표준 기술을 포함하는 잘 정립된 다수의 방법을 사용하여 농축하고 정제할 수 있다.
실시예 29
호열성 α-아밀라제를 포함하는 곡물의 자동가수분해(autohydrolysis)의 말토덱스트린 산물의 조성물을 반응 시간 및 온도를 변화함으로써 변경할 수 있다.
다른 실험에서, 상기 실시예 28에서 기술된 바와 같이 제조된 아밀라제 분말을 물과 분말 60 mg 당 물 300 ㎕의 비율로 혼합하였다. 샘플을 90분 이하 동안 70℃, 80℃, 90℃ 또는 100℃로 배양하였다. 90℃에서 50 mM EDTA 900 ml를 첨가하여 반응을 멈추고, 원심분리하여 불용 물질을 제거하고, 0.45μm 나일론 필터를 통해 여과하였다. 여과물을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 HPLC로 분석하였다.
이들 분석 결과를 도 19에서 나타내었다. DP 수 명명법은 중합정도를 나타낸다. DP2는 말토스, DP3는 말토트리오스, 등이다. 더많은 DP 말토덱스트린이 용출의 끝 가까이에서 단일 피크에서 용출되었고 ">DP12"로 표지되었다. 이 응집물(aggregate)은 0.45μm 필터 및 가드 칼럼에는 통과하는 덱스트린을 포함하고 필터 또는 가드 칼럼에 갇히지 않는 매우 큰 전분 단편을 포함하지 않는다.
이 실험은 온도 및 배양시간 모두를 변화하여 산물인 말토덱스트린 조성물을 변경하여 원하는 말토올리고당 또는 말토덱스트린 산물을 얻을 수 있음을 증명하고 있다.
실시예 30
말토덱스트린 제조
열로 처리하기 이전에 수성 분말 혼합물에 염을 포함함으로써 뿐만 아니라 α-글루코시다제 및 크실로스 이소메라제와 같은 다른 효소를 첨가함으로써 호열성 α-아밀라제를 함유하는 유전자이전 옥수수로부터의 말토덱스트린 산물의 조성물을 변경할 수 있다.
다르게는, 앞서 기술한 바와 같이 제조한 아밀라제 분말을 정제된 MalA 및(또는) BD8037로 지정된 박테리아 크실로스 이소메라제와 혼합한다. 6His 정제 태그를 갖는 에스. 술포타리쿠스 MalA를 이. 콜라이 내에서 발현하였다. 세포 용해물을 실시예 28에서 기술된 바와 같이 제조하고 니켈 친화성 레진(프로본드, 인비트로겐(Probond, Invitrogen))을 사용하여 정제하여 분명한 균질성이 되게 하고, 천연 단백질 정제에 대한 제조자의 교시에 따랐다. 디버사(Diversa)로부터 크실로스 이소메라제 BD8037을 동결건조 분말로 얻었고, 원래 체적의 0.4배의 물에서 재분산시켰다.
아밀라제 옥수수 분말을 물 또는 완충액을 더한 효소 용액과 혼합하였다. 모든 반응은 60 mg 아밀라제 분말 및 총 600 ㎕의 액체를 포함한다. 반응물의 한 세트를 10 mM MgSO4및 1 mM CoCl2를 더한, 50 mM MOPS, pH 7.0으로 실온에서 완충시키고, 반응물의 다른 세트에서는 금속 함유 완충액을 물로 대체하였다. 모든 반응물을 90℃에서 2시간 동안 배양하였다. 반응 상청액 부분을 원심분리에 의하여 제조하였다. 펠렛을 추가의 600 ㎕ H2O로 세척하고 재원심분리하였다. 각 반응의 상청액 부분을 합하고, 센트리콘 10을 통과시켜 여과하고, 앞서 기술한 ELSD 검출기를 갖는 HPLC에 의하여 분석하였다.
결과를 도 20에서 그래프로 나타내었다. 이들은 곡물-발현 아밀라제 797GL3이 다른 호열성 효소와 함께 금속 이온의 첨가 또는 첨가하지 않고 작용하여 고온에서 옥수수 분말로부터 다수의 말토덱스트린 혼합물을 생성할 수 있음을 증명하고 있다. 특히, 글루코아밀라제 또는 α-글루코시다제의 포함으로 더 많은 글루코스를 갖는 산물 및 다른 낮은 DP 산물을 야기할 수 있다. 글루코스 이소메라제 활성을 갖는 효소의 포함으로 프락토스를 갖는 산물을 야기하고 따라서 아밀라제 단독으로, 또는 α-글루코시다제와 아밀라제 함께로써 생성한 것보다 더 달 수 있다. 게다가, 데이터는 이가 양이온 염, 예컨대 CoCl2및 MgSO4를 포함시킴으로써 DP5, DP6, 및 DP7 말토올리고당의 비율을 증가할 수 있음을 나타낸다.
여기서 기술되는 것과 같은 반응에 의하여 생성된 말토덱스트린 조성물을 변경하는 다른 방법으로서 반응 pH를 변화하는 것, 유전자이전 또는 비유전자이전 곡물의 전분 형태를 바꾸는 것, 고체 비율을 바꾸는 것, 또는 유기 용매를 첨가하는 것을 포함한다.
실시예 31
전분 유도 산물의 회수 전에 곡물의 기계적 붕괴없이 곡물로부터 덱스트린, 또는 당의 제조
α-아밀라제, 797GL3을 발현하는 유전자이전 곡물을 물과 접촉시키고 90℃에서 밤새 (>14시간) 가열함으로써 당 및 말토덱스트린을 제조하였다. 다음에, 액체를 여과로써 곡물과 분리하였다. 액체 산물을 실시예 15에서 기술된 방법에 의하여 HPLC에 의하여 분석하였다. 표 6은 검출된 산물의 프로파일을 나타낸다.
분자 종 산물의 농도 ㎍/25 ㎕ 주입
프락토스 0.4
글루코스 18.0
말토스 56.0
DP3* 26.0
DP4* 15.9
DP5* 11.3
DP6* 5.3
DP7* 1.5
*DP3의 정량은 말토트리오스를 포함하고 하나의 α(1→4) 결합 대신에 하나의 α(1→6)결합을 갖는 말토트리오스의 이성질체를 포함한다. 유사하게 DP4 내지 DP7 정량은 하나 이상의 α(1→4) 결합 대신에 α(1→6)결합의 하나 이상을 갖는 이성질체뿐만 아니라 주어진 쇄 길이의 선형 말토올리고당을 포함한다.이들 데이터는 당 및 말토덱스트린을 그대로의(intact) α-아밀라제 발현 곡물을 물 및 열에 접촉시킴으로써 제조할 수 있다. 다음에 산물을 여과 또는 원심분리 또는 중력 정치에 의하여 그대로의 곡물을 단리할 수 있다.
실시예 32
리조푸스 오리자에 글루코아밀라제를 발현하는 옥수수에서 생 전분의 발효
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 29에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 이 낟알을 분말로 갈았다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 리조푸스 오리자에(서열 49)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다.
실시예 15에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트(backset) 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아(Lactocide & urea) (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼(Urea Liquor)). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 33
리조푸스 오리자에 글루코아밀라제를 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효의 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 이 낟알을 분말로 갈았다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 리조푸스 오리자에(서열 49)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다.
실시예 15에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 34
외인성 α-아밀라제의 첨가한, 리조푸스 오리자에 글루코아밀라제를 발현하는 완전 옥수수 낟알 내에서 비가공 전분의 발효의 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 29에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 소포체에 표적된 리조푸스 오리자에(서열 49)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다.
옥수수 낟알을 20 g의 옥수수 분말, 23 ml의 탈이온수, 6.0 ml의 백세트(고체 8 중량%)와 접촉시켰다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 시그마로부터 구입한 보리 α-아밀라제 (2 mg), 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 35
리조푸스 오리자에 글루코아밀라제 및 제아 마이스 아밀라제를 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 리조푸스 오리자에(서열 49)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다. 이 낟알은 또한 실시예 28에서 기술된 바와 같은 비가공 전분 결합 도메인을 갖는 옥수수 아밀라제를 발현한다.
실시예 14에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 36
써모아나에로박터 써모사카롤리티큠 글루코아밀라제를 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효의 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 써모아나에로박터 써모사카롤리티큠(서열 47)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다.
실시예 15에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 37
아스페르길러스 니게르 글루코아밀라제를 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효의 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 아스페르길러스 니게르(문헌[Fiil, N.P. "Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs"EMBO J. 3 (5), 1097-1102 (1984)], 엑세션 번호 P04064)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다. 글루코아밀라제를 코딩하는 옥수수에 최적화된 핵산은 서열 59를 갖고 소포체를 표적으로 한다.
실시예 15에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 38
아스페르길러스 니게르 글루코아밀라제 및 제아 마이스 아밀라제를 발현하는 옥수수에서의 비가공 전분의 발효 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만든 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 아스페르길러스 니게르(문헌[Fiil, N.P. "Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs"EMBO J. 3 (5), 1097-1102 (1984)], 엑세션 번호 P04064)(서열 59: 옥수수에 최적화된 핵산)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현하고 소포체를 표적으로 한다. 낟알은 또한 실시예 28에서 기술된 비가공 전분 결합 도메인을 갖는 옥수수 아밀라제를 발현한다.
실시예 14에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼).매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 39
써모아나에로박터 써모사카롤리티큠 글루코아밀라제 및 보리 아밀라제를 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 써모아나에로박터 써모사카롤리티큠(서열 47)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다. 이 옥수수 낟알은 또한 소포체로의 단백질의 발현을 표적으로 하도록 변형된 저 pI 보리 아밀라제 아밀 유전자(문헌[Rogers, J. C. and Milliman, C. "Isolation and sequence analysis of a barley alpha-amylase cDNA clone" J. Biol. Chem. 258 (13), 8169-8174 (1983)])를 발현한다.
실시예 14에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20 g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 40
써모아나에로박터 써모사카롤리티큠 글루코아밀라제 및 보리 아밀라제를 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 써모아나에로박터 써모사카롤리티큠(서열 47)의 글루코아밀라제의 활성 단편을 포함하는 단백질을 발현한다. 이 옥수수 낟알은 또한 소포체로의 단백질의 발현을 표적으로 하도록 변형된 저 pI 보리 아밀라제 아밀 유전자(문헌[Rogers, J. C. and Milliman, C. "Isolation and sequence analysis of a barley alpha-amylase cDNA clone" J. Biol. Chem. 258 (13), 8169-8174 (1983)])를 발현한다.
실시예 14에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를 제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
실시예 41
알파-아밀라제 및 글루코아밀라제 융합을 발현하는 옥수수에서 비가공 전분의 발효 실시예
유전자이전 옥수수 낟알을 실시예 28에서 기술한 바와 같이 만들어진 유전자이전 식물로부터 수확하였다. 옥수수 낟알은 소포체를 표적으로 하는 서열 45에서 제공된 바와 같은 알파-아밀라제 및 글루코아밀라제 융합을 코딩하는 서열 46에서 제공되는 바와 같은 옥수수에 최적화된 폴리뉴클레오티드를 발현한다.
실시예 14에서 기술된 바와 같이 옥수수 낟알을 분말로 갈았다. 다음에, 옥수수 분말 20g, 탈이온수 23 ml, 백세트 6.0 ml(고체 8 중량%)를 포함하는 매쉬를제조하였다. 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절하였다. 다음의 성분들을 매쉬에 첨가하였다: 프로테아제(0.60 ml의 1000배 희석한 구입가능한 프로테아제), 0.2 mg 락토시드 & 우레아 (0.85 ml의 10배 희석한 50% 우레아 리쿼). 매쉬를 담은 100 ml 병의 캡에 구멍을 잘라내어 CO2가 환기되게 하였다. 다음에 이 매쉬를 효모(1.44 ml)로 접종시키고, 수조에서 90˚F에서 접종하였다. 24시간의 발효 후에 온도를 86˚F로 낮추고, 48시간에 82˚F로 세팅하였다.
접종한 효모를 실시예 14에서 기술한 바와 같이 증식하였다.
샘플을 실시예 14에서 기술한 바와 같이 빼내고 다음에 실시예 14에서 기술된 방법으로 분석하였다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에서 참고로 인용된다. 앞선 명세서에서 본 발명을 특정 바람직한 실시양태에 관련하여 기술하였고 상세한 설명의 많은 부분이 예시의 목적으로 개시하였지만, 당업자에게는 본원에 기술된 추가의 실시양태를 이해할 수 있고, 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않으면서 상세한 설명의 특정부분이 상당히 변화할 수 있음이 분명할 것이다.
797GL3 α-아밀라제 아미노산 서열 (서열 1)
797GL3 α-아밀라제 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열 2)
6gp3 풀루란아제 아미노산 서열 (서열 3)
6gp3 풀루란아제 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열 4)
술폴로부스 솔파타리쿠스 malA α-글루코시다제 아미노산 서열 (서열 5)
술폴로부스 솔파타리쿠스 malA α-글루코시다제 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열 6)
왁시 cDNA 서열 (서열 7)
왁시 아미노산 서열 (서열 8)
797GL3/왁시 핵산 서열 (서열 9)
797GL3/왁시 아미노산 서열 (서열 10)
제아 메이스 ADP-gpp 프로모터 핵산 서열 (서열 11)
제아 메이스 γ-제인 프로모터 핵산 서열 (서열 12)
pNOV6200 아밀라제 융합 아미노산 서열 (서열 13)
pNOV6201 아밀라제 융합 아미노산 서열 (서열 14)
pNOV4029 아밀라제 융합 아미노산 서열 (서열 15)
pNOV4031 아밀라제 융합 아미노산 서열 (서열 16)
옥수수 γ-제인 N-말단 신호 서열 (서열 17)
써모토가 마리티마 글루코스 이소메라제 아미노산 서열 (서열 18)
써모토가 마리티마 글루코스 이소메라제 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열 19)
써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제 아미노산 서열 (서열 20)
써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열21)
SV57 (서열 22)
SV58 (서열 23)
pNOV7005 6GP3 융합 아미노산 서열 (서열 24)
pNOV7005 6GP3 융합 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열 25)
pNOV4831 malA 융합 아미노산 서열 (서열 26)
pNOV4839 malA 융합 아미노산 서열 (서열 27)
pNOV4832 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 28)
pNOV4833 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 29)
pNOV4840 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 30)
보리 알파 아밀라제 AMY32b 신호 서열 (서열 31)
PR1a 신호 서열 (서열 32)
797GL3 융합 (서열 33)
6GP3 융합 (서열 34)
797GL3 융합 (서열 35)
malA 융합 (서열 36)
pNOV4829 글루코스 이소메라제 융합 뉴클레오티드 서열 (서열 37)
pNOV4829 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 38)
pNOV4830 글루코스 이소메라제 융합 뉴클레오티드 서열 (서열 39)
pNOV4830 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 40)
pNOV4835 써모토가 마리티마 글루코스 이소메라제 융합 뉴클레오티드 서열 (서열 41)
pNOV4835 써모토가 마리티마 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 42)
pNOV4836 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제 융합 뉴클레오티드 서열 (서열 43)
pNOV4836 써모토가 네아폴리타나 글루코스 이소메라제 융합 아미노산 서열 (서열 44)
아스페르길루스 쉬로우사미 α-아밀라제/글루코아밀라제 융합 아미노산 서열(신호 서열 없음) (서열 45)
아스페르길루스 쉬로우사미 α-아밀라제/글루코아밀라제 융합 옥수수-최적화 핵산 서열 (신호 서열 없음) (서열 46)
써모아나에로박테륨 테르모사카롤리티큠 글루코아밀라제 아미노산 서열 (신호 서열 없음) (서열 47)
써모아나에로박테륨 테르모사카롤리티큠 글루코아밀라제 옥수수-최적화 핵산서열 (신호 서열 없음) (서열 48)
리조푸스 오리자에 글루코아밀라제 아미노산 서열 (신호 서열 없음) (서열49)
리조푸스 오리자에 글루코아밀라제 옥수수-최적화 핵산 서열 (신호 서열 없음) (서열 50)
옥수수 알파 아밀라제 아미노산 서열 (서열 51)
옥수수 알파 아밀라제 핵산 서열 (서열 52)
생-전분 결합 부위 아미노산 서열 (서열 53)
생-전분 결합 부위 옥수수-최적화 핵산 서열 (서열 54)
피로코쿠스 푸리오수스 EGLA 아미노산 서열 (신호 서열 없음) (서열 55)
피로코쿠스 푸리오수스 EGLA 옥수수-최적화 핵산 서열 (신호 서열 없음) (서열 56)
써무스 풀라부스 크실로스 이소메라제 아미노산 서열 (서열 57)
pNOV4800 뉴클레오티드 서열 (EGLA를 갖는 Amy32B 신호 서열) (서열 58)
아스페르길루스 니게르 옥수수-최적화 핵산 (서열 59)

Claims (234)

  1. a) 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 또는 59 또는 이들의 상보물, 또는 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 및 59 중 어느 하나의 상보물에 혼성화되고 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는
    b) 서열 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 또는 51 또는 이들의 효소적 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는
    단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리펩티드 및 제2 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하며, 여기서 상기 제1 폴리펩티드가 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제2 펩티드가 신호 서열 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 신호 서열 펩티드가 식물의 액포, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 종자 또는 세포벽에 제1 폴리펩티드를 표적화시키는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서, 상기 신호 서열이 왁시 (waxy)로부터의 N-말단 신호 서열, γ-제인으로부터의 N-말단 신호 서열, 전분 결합 도메인 또는 C-말단 전분 결합 도메인인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 2, 9, 및 52 중 어느 하나의 상보물에 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고 α-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 4 및 25 중 어느 하나의 상보물에 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고, 풀루란아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 6의 상보물에 혼성화되고, α-글루코시다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 19, 21, 37, 39, 41, 및 43 중 어느 하나의 상보물에 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고, 글루코스 이소메라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 46, 48, 50, 및 59 중 어느 하나의 상보물에 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고, 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 서열 2 또는 9, 또는 그의 상보물을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 서열 4 또는 25, 또는 그의 상보물을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 서열 6 또는 그의 상보물을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 서열 19, 21, 37, 39, 41, 또는 43, 또는 그의 상보물을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  15. 서열 46, 48, 50, 또는 59, 또는 그의 상보물을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  16. a) 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 또는 59 또는 이들의 상보물, 또는 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 서열 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 또는 59 중 어느 하나의 상보물에 혼성화되고 α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는
    b) 서열 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 또는 51 또는 이들의 효소적 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 발현 카세트.
  17. 제16항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결되는 발현 카세트.
  18. 제17항에 있어서, 프로모터가 유도가능한 프로모터인 발현 카세트.
  19. 제17항에 있어서, 프로모터가 조직-특이성 프로모터인 발현 카세트.
  20. 제19항에 있어서, 프로모터가 내배유-특이성 프로모터인 발현 카세트.
  21. 제20항에 있어서, 내배유-특이성 프로모터가 옥수수 γ-제인 프로모터 또는옥수수 ADP-gpp 프로모터인 발현 카세트.
  22. 제21항에 있어서, 프로모터가 서열 11 또는 서열 12를 포함하는 것인 발현 카세트.
  23. 제16항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 대해 센스 배향으로 배향되는 것인 발현 카세트.
  24. 제16항에 있어서, a)의 폴리뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 신호 서열을 추가로 코딩하는 것인 발현 카세트.
  25. 제24항에 있어서, 신호 서열이 식물의 액포, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 종자 또는 세포벽에 작동적으로 연결된 폴리펩티드를 표적화시키는 것인 발현 카세트.
  26. 제25항에 있어서, 신호 서열이 왁시로부터의 N-말단 신호 서열 또는 γ-제인으로부터의 N-말단 신호 서열인 발현 카세트.
  27. 제25항에 있어서, 신호 서열이 전분 결합 도메인인 발현 카세트.
  28. 제16항에 있어서, b)의 폴리뉴클레오티드가 조직-특이성 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 발현 카세트.
  29. 제28항에 있어서, 조직-특이성 프로모터가 제아 메이스 (Zea mays) γ-제인 프로모터 또는 제아 메이스 ADP-gpp 프로모터인 발현 카세트.
  30. 서열 2 또는 9, 또는 그의 상보물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  31. 서열 6 또는 그의 상보물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  32. 서열 19, 21, 37, 39, 41, 또는 43, 또는 그의 상보물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  33. 서열 46, 48, 50, 또는 59 또는 그의 상보물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  34. 서열 4 또는 25 또는 그의 상보물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  35. 서열 10, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 및 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이들의 효소적 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  36. 서열 10, 13, 14, 15, 16, 33, 35, 및 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 α-아밀라제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  37. 서열 3, 24, 및 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 풀루란아제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  38. 서열 5, 26 및 27 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 α-글루코시다제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  39. 서열 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42, 및 44 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 글루코스 이소메라제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  40. 서열 45, 47, 및 49 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  41. 제16항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  42. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  43. 제16항의 발현 카세트를 함유하는 세포.
  44. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 함유하는 세포.
  45. 제44항에 있어서, 아그로박테륨, 단자엽 세포, 쌍자엽 세포, 백합강 세포, 기장아과 세포, 옥수수 세포, 및 곡식 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
  46. 제45항에 있어서, 옥수수 세포인 세포.
  47. 제45항에 있어서, 아그로박테륨, 단자엽 세포, 쌍자엽 세포, 백합강 세포,기장아과 세포, 옥수수 세포, 및 곡식 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
  48. 제47항에 있어서, 옥수수 세포인 세포.
  49. 제41항의 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  50. 제42항의 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  51. 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33, 또는 35의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 2 또는 9를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-아밀라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  52. 제51항에 있어서, α-아밀라제가 초호열성인 식물.
  53. 서열 24 또는 34의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 4 또는 25를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 풀루란아제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  54. 서열 26 또는 27의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 6을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-글루코시다제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  55. 제54항에 있어서, α-글루코시다제가 초호열성인 식물.
  56. 서열 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42, 또는 44의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 19, 21, 37, 39, 41, 또는 43을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코스 이소메라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  57. 제56항에 있어서, α-글루코시다제가 초호열성인 식물.
  58. 서열 45, 47, 또는 49의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 46, 48, 50, 또는 59를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코스 아밀라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 식물.
  59. 제58항에 있어서, 글루코스 아밀라제가 초호열성인 식물.
  60. 제49항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  61. 제50항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  62. 제51항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  63. 제53항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  64. 제54항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  65. 제56항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  66. 제58항의 식물로부터의 종자, 열매 또는 곡물.
  67. 게놈이 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되며, 여기서 폴리뉴클레오티드의 서열이 식물에서의 발현에 대해 최적화되는 형질전환된 식물.
  68. 제67항에 있어서, 단자엽인 식물.
  69. 제68항에 있어서, 단자엽이 옥수수인 식물.
  70. 제67항에 있어서, 쌍자엽인 식물.
  71. 제67항에 있어서, 곡류 식물 또는 상업적으로 재배된 식물인 식물.
  72. 제67항에 있어서, 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, 글루카나제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제, 아밀로풀루란아제, 셀룰라제, 엑소-1,4-β-셀로비오히드롤라제, 엑소-1,3-β-D-글루카나제, β-글루코시다제, 엔도글루카나제, L-아라비나제, α-아라비노시다제, 갈락타나제, 갈락토시다제, 만나나제, 만노시다제, 크실라나제, 크실로시다제, 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 에스테라제, 피타제, 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 식물.
  73. 제72항에 있어서, 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제, 및 아밀로풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 전분-프로세싱 효소인 식물.
  74. 제73항에 있어서, 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제로부터 선택되는 것인 식물.
  75. 제74항에 있어서, 효소가 초호열성인 식물.
  76. 제72항에 있어서, 효소가 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 에스테라제, 피타제, 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-전분 분해 효소인 식물.
  77. 제76항에 있어서, 효소가 초호열성인 식물.
  78. 제67항에 있어서, 효소가 식물의 액포, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 종자 또는 세포벽 중에 축적되는 것인 식물.
  79. 제78항에 있어서, 효소가 소포체 중에 축적되는 것인 식물.
  80. 제78항에 있어서, 효소가 전분 과립 중에 축적되는 것인 식물.
  81. 제67항에 있어서, 게놈이 비-초호열성 효소를 포함하는 제2 재조합 폴리뉴클레오티드로 추가로 증대된 것인 식물.
  82. 게놈이 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되며, 여기서 폴리뉴클레오티드의 서열이 식물에서의 발현에 대해 최적화되는 형질전환된 식물.
  83. 제82항에 있어서, 프로세싱 효소가 초호열성인 형질전환된 식물.
  84. 제82항에 있어서, 식물이 옥수수인 형질전환된 식물.
  85. 게놈이 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되며, 여기서 폴리뉴클레오티드의 서열이 옥수수 식물에서의 발현에 대해 최적화되는 형질전환된 옥수수 식물.
  86. 제85항에 있어서, 프로세싱 효소가 초호열성인 형질전환된 옥수수 식물.
  87. 게놈이 프로모터 및 신호 서열에 작동적으로 연결된 서열 2, 9, 또는 52를 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되는 형질전환된 식물.
  88. 게놈이 프로모터 및 신호 서열에 작동적으로 연결된 서열 4 또는 25를 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되는 형질전환된 식물.
  89. 게놈이 프로모터 및 신호 서열에 작동적으로 연결된 서열 6을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되는 형질전환된 식물.
  90. 게놈이 서열 19, 21, 37, 39, 41, 또는 43을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되는 형질전환된 식물.
  91. 게놈이 서열 46, 48, 50, 또는 59를 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드로 증대되는 형질전환된 식물.
  92. 제82항의 형질전환된 식물의 산물.
  93. 제85항의 형질전환된 식물의 산물.
  94. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항의 형질전환된 식물의 산물.
  95. 제92항에 있어서, 종자, 열매, 또는 곡물인 산물.
  96. 제92항에 있어서, 프로세싱 효소, 전분 또는 당인 산물.
  97. 제82항의 식물로부터 수득한 식물.
  98. 제85항의 식물로부터 수득한 식물.
  99. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항의 식물로부터 수득한 식물.
  100. 제97항에 있어서, 하이브리드 식물인 식물.
  101. 제98항에 있어서, 하이브리드 식물인 식물.
  102. 제99항에 있어서, 하이브리드 식물인 식물.
  103. 제97항에 있어서, 근교배 식물인 식물.
  104. 제98항에 있어서, 근교배 식물인 식물.
  105. 제99항에 있어서, 근교배 식물인 식물.
  106. 프로테아제, 글루카나제, 또는 에스테라제인 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 전분 조성물.
  107. 제106항에 있어서, 효소가 초호열성인 전분 조성물.
  108. α-아밀라제, 풀루란아제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 또는 글루코스 이소메라제인 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 곡물.
  109. 제108항에 있어서, 효소가 초호열성인 곡물.
  110. a) 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 곡물을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에 처리하여 전분 과립 및 비-전분 분해 산물을 포함하는 혼합물을 수득하며, 여기서 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된 형질전환된 식물로부터 곡물을 수득하는 것인 단계; 및
    b) 혼합물로부터 전분 과립을 분리하는 단계
    를 포함하는 전분 과립의 제조 방법.
  111. 제110항에 있어서, 효소가 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 피타제, 또는 에스테라제인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 효소가 초호열성인 방법.
  113. 제110항에 있어서, 곡물이 분쇄 곡물인 방법.
  114. 제110항에 있어서, 곡물을 저습 조건 하에 처리하는 방법.
  115. 제110항에 있어서, 곡물을 고습 조건 하에 처리하는 방법.
  116. 제110항에 있어서, 곡물을 이산화황으로 처리하는 방법.
  117. 제110항에 있어서, 혼합물로부터 비-전분 산물을 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  118. 제110항의 방법으로 수득한 전분.
  119. 제112항의 방법으로 수득한 전분.
  120. 제110항의 방법으로 수득한 비-전분 산물.
  121. 제112항의 방법으로 수득한 비-전분 산물.
  122. 게놈이 하나 이상의 전분-분해 또는 전분-이성질체화 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되고 내배유에서 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에 발현시키고 옥수수 중의 다당류를 당으로 전환시켜 고감미 옥수수를 수득하는 형질전환된 옥수수 또는 그의 부분을 처리하는 것을 포함하는 고감미 옥수수의 생산 방법.
  123. 제122항에 있어서, 발현 카세트가 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 프로모터가 구성적 프로모터인 방법.
  125. 제123항에 있어서, 프로모터가 종자-특이성 프로모터인 방법.
  126. 제123항에 있어서, 프로모터가 내배유-특이성 프로모터인 방법.
  127. 제123항에 있어서, 효소가 초호열성인 방법.
  128. 제127항에 있어서, 효소가 α-아밀라제인 방법.
  129. 제122항에 있어서, 발현 카세트가 하나 이상의 효소에 작동적으로 연결된 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  130. 제129항에 있어서, 신호 서열이 초호열성 효소를 아포플라스트로 지시하는것인 방법.
  131. 제129항에 있어서, 신호 서열이 초호열성 효소를 소포체에 지시하는 것인 방법.
  132. 제122항에 있어서, 효소가 서열 13, 14, 15, 16, 33, 및 35 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
  133. 게놈이 α-아밀라제를 코딩하는 발현 카세트로 증대되고 내배유에서 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건하에 발현시키고 옥수수 중의 다당류를 당으로 전환시켜 고감미 옥수수를 수득하는 형질전환된 옥수수 또는 그의 부분을 처리하는 것을 포함하는 고감미 옥수수의 생산 방법.
  134. 제133항에 있어서, 효소가 초호열성인 방법.
  135. 제134항에 있어서, 초호열성 α-아밀라제가 서열 10, 13, 14, 15, 16, 33, 또는 35의 아미노산 서열, 또는 α-아밀라제 활성을 갖는 이들의 효소적 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
  136. 제134항에 있어서, 발현 카세트가 서열 2, 9, 및 52로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드, 이들의 상보물, 또는 서열 2, 9, 또는 52에 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고 α-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  137. a) 전분 과립 및 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 전분 과립을 프로세싱하여 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 수집하는 단계
    를 포함하는, 가수분해된 전분 산물 용액의 제조 방법.
  138. 제137항에 있어서, 가수분해된 전분 산물이 덱스트린, 말토올리고당, 당, 및(또는) 이들의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  139. 제137항에 있어서, 효소가 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 아밀로풀루란아제, 글루코스 이소메라제, β-아밀라제, 이소아밀라제, 네오풀루란아제, 이소-풀루란아제, 또는 그들의 조합인 방법.
  140. 제137항에 있어서, 하나 이상의 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  141. 제139항에 있어서, 하나 이상의 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  142. 제137항에 있어서, 식물 부분의 게놈이 비-초호열성 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 추가로 증대되는 것인 방법.
  143. 제142항에 있어서, 비-초호열성 전분 프로세싱 효소가 아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  144. 제137항에 있어서, 하나 이상의 프로세싱 효소를 내배유에서 발현시키는 방법.
  145. 제137항에 있어서, 식물 부분이 곡물인 방법.
  146. 제137항에 있어서, 식물 부분이 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 사탕수수 또는 쌀로부터 선택되는 것인 방법.
  147. 제137항에 있어서, 하나 이상의 프로세싱 효소가 전분 과립 또는 소포체, 또는 세포벽에 효소를 표적화시키는 신호 서열 및 프로모터에 작동적으로 연결된 것인 방법.
  148. 제137항에 있어서, 가수분해된 전분 산물을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  149. 제137항에 있어서, 가수분해된 전분 산물을 발효시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  150. a) 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 전분 과립을 프로세싱하여 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 α-아밀라제를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 가수분해된 전분 산물을 포함하는 수용액을 수집하는 단계
    를 포함하는, 가수분해된 전분 산물의 제조 방법.
  151. 제150항에 있어서, α-아밀라제가 초호열성인 방법.
  152. 제151항에 있어서, 초호열성 α-아밀라제가 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33, 또는 35의 아미노산 서열, 또는 α-아밀라제 활성을 갖는 이들의 활성 단편을포함하는 것인 방법.
  153. 제151항에 있어서, 발현 카세트가 서열 2, 9, 46, 및 52로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드, 이들의 상보물, 또는 서열 2, 9, 46, 또는 52에 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에 혼성화되고 α-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  154. 제150항에 있어서, 형질전환된 식물의 게놈이 비-호열성 전분-프로세싱 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  155. 제150항에 있어서, 비-초호열성 전분-프로세싱 효소로 식물 부분을 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  156. 식물의 세포에 존재하는 하나 이상의 전분-프로세싱 효소를 포함하며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된 형질전환된 식물로부터 수득되는 형질전환된 식물 부분.
  157. 제156항에 있어서, 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, β-아밀라제, α-글루코시다제, 이소아밀라제, 풀루란아제, 네오-풀루란아제, 이소-풀루란아제, 및 아밀로풀루란아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 전분-프로세싱 효소인 식물 부분.
  158. 제156항에 있어서, 효소가 초호열성인 식물 부분.
  159. 제156항에 있어서, 식물이 옥수수인 식물 부분.
  160. 식물의 세포벽 또는 세포에 존재하는 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소 또는 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대된 형질전환된 식물로부터 수득되는 형질전환된 식물 부분.
  161. 제160항에 있어서, 효소가 초호열성인 식물 부분.
  162. 제160항에 있어서, 비-전분 프로세싱 효소가 프로테아제, 글루카나제, 크실라나제, 에스테라제, 피타제, 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 식물 부분.
  163. 제156항 또는 제160항에 있어서, 이삭, 종자, 열매, 곡물, 마초, 여물, 또는 깍지인 식물 부분.
  164. 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33, 또는 35의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 2, 9, 46, 또는 52를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-아밀라제를 포함하는 형질전환된 식물 부분.
  165. 서열 5, 26 또는 27의 아미노산을 가지거나, 또는 서열 6을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-글루코시다제를 포함하는 형질전환된 식물 부분.
  166. 서열 28, 29, 30, 38, 40, 42, 및 44 중 어느 하나의 아미노산을 가지거나, 또는 서열 19, 21, 37, 39, 41, 및 43 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코스 이소메라제를 포함하는 형질전환된 식물 부분.
  167. 서열 45, 서열 47, 또는 서열 49의 아미노산을 가지거나, 또는 서열 46, 48, 50, 또는 59를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 글루코아밀라제를 포함하는 형질전환된 식물 부분.
  168. 서열 4 또는 25를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 풀루란아제를 포함하는 형질전환된 식물 부분.
  169. 함유되어 있는 전분 프로세싱 효소를 활성화시키는 것을 포함하는, 제156항의 형질전환된 식물 부분에서 전분을 전환시키는 방법.
  170. 함유되어 있는 효소를 활성화시키는 것을 포함하는, 제164항 내지 제168항 중 어느 한 항의 형질전환된 식물 부분에서 전분을 전분-유도 산물로의 전환시키는 방법.
  171. 제169항의 방법에 따라 생산된 전분, 덱스트린, 말토올리고당 또는 당.
  172. 제170항의 방법에 따라 생산된 전분, 덱스트린, 말토올리고당 또는 당.
  173. a) 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 비-전분 다당류를 분해시켜 올리고당 및(또는) 당을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 비-전분 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 올리고당 및(또는) 당을 포함하는 수용액을 수집하는 단계
    를 포함하는, 식물 부분의 세포벽 또는 세포에 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 식물 부분의 사용 방법.
  174. 제173항에 있어서, 비-전분 다당류 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  175. a) 하나 이상의 프로테아제 또는 리파제를 포함하는 형질전환된 종자를 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 아미노산 및 지방산을 포함하는 수성 혼합물을 수득하며, 여기서 종자는 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 수성 혼합물을 수집하는 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 프로세싱 효소를 포함하는 형질전환된 종자의 사용 방법.
  176. 제175항에 있어서, 아미노산, 지방산 또는 모두가 단리되는 것인 방법.
  177. 제175항에 있어서, 하나 이상의 프로테아제 또는 리파제가 초호열성인 방법.
  178. a) 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 다당류를 분해시켜 올리고당 또는 발효가능한 당을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 발효가능한 당 또는 올리고당의 에탄올로의 전환을 촉진하는 조건하에 발효가능한 당을 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 에탄올의 제조 방법.
  179. 제178항에 있어서, 식물 부분이 곡물, 열매, 종자, 줄기, 나무, 야채 또는 뿌리인 방법.
  180. 제178항에 있어서, 식물 부분이 귀리, 보리, 밀, 장과, 포도, 호밀, 옥수수, 쌀, 감자, 사탕무, 사탕수수, 파인애플, 목초 및 나무로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 수득되는 것인 방법.
  181. 제178항에 있어서, 다당류 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 풀루란아제, 또는 그들의 조합인 방법.
  182. 제178항에 있어서, 다당류 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  183. 제178항에 있어서, 다당류 프로세싱 효소가 중온성인 방법.
  184. 제181항에 있어서, 다당류 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  185. a) α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 및 풀루란아제, 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 소정의 시간 동안 열로 처리하여 그에 의해 다당류를 분해시켜 발효가능한 당을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 발효가능한 당의 에탄올로의 전환을 촉진하는 조건하에 발효가능한 당을 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  186. 제185항에 있어서, 하나 이상의 효소가 초호열성인 방법.
  187. 제185항에 있어서, 하나 이상의 효소가 중온성인 방법.
  188. 제185항에 있어서, α-아밀라제가 서열 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33, 또는 35의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 2 또는 9를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  189. 제185항에 있어서, α-글루코시다제가 서열 5, 26 또는 27의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 6을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  190. 제185항에 있어서, 글루코스 이소메라제가 28, 29, 30, 38, 40, 42, 및 44중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 19, 21, 37, 39, 41, 및 43 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  191. 제185항에 있어서, 글루코아밀라제가 서열 45의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 46, 48, 또는 50을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  192. 제185항에 있어서, 풀루란아제가 서열 24 또는 34의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 4 또는 25를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  193. a) 하나 이상의 비-전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 비-전분 다당류를 올리고당 및 발효가능한 당으로 분해시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 발효가능한 당의 에탄올로의 전환을 촉진하는 조건하에 발효가능한 당을 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  194. 제193항에 있어서, 비-전분 프로세싱 효소가 글루카나제, 크실라나제 또는셀룰라제인 방법.
  195. a) α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 글루코스 이소메라제, 및 풀루란아제, 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 다당류를 분해시켜 발효가능한 당을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 발효가능한 당의 에탄올로의 전환을 촉진하는 조건하에 발효가능한 당을 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  196. 제195항에 있어서, 하나 이상의 효소가 초호열성인 방법.
  197. a) 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 식물 부분 중의 전분 과립을 당으로 프로세싱하여 감미화된 생성물을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 감미화된 생성물을 곡분 식품으로 프로세싱시키는 단계
    를 포함하는, 추가 감미제의 첨가 부재하에 감미화된 곡분 식품의 제조 방법.
  198. 제197항에 있어서, 곡분 식품이 감미화된 생성물 및 물로부터 형성되는 것인 방법.
  199. 제197항에 있어서, 곡분 식품이 맥아, 풍미제, 비타민, 미네랄, 착색제 또는 그들의 조합을 함유하는 것인 방법.
  200. 제197항에 있어서, 하나 이상의 효소가 초호열성인 방법.
  201. 제197항에 있어서, 효소가 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합인 방법.
  202. 제197항에 있어서, 식물이 대두, 호밀, 귀리, 보리, 밀, 옥수수, 쌀 및 사탕수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  203. 제197항에 있어서, 곡분 식품이 곡류 식품인 방법.
  204. 제197항에 있어서, 곡분 식품이 조반용 곡류 식품인 방법.
  205. 제197항에 있어서, 곡분 식품이 즉석 식품인 방법.
  206. 제197항에 있어서, 곡분 식품이 조리 식품인 방법.
  207. 제197항에 있어서, 프로세싱이 베이킹, 비등, 가열, 스티밍, 방전 또는 그들의 조합인 방법.
  208. a) 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 전분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 전분을 분해시켜 당을 형성시키고 감미화된 전분을 형성시키며, 여기서 전분은 게놈이 하나 이상의 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 감미화된 전분을 산물에 첨가하여 산물을 함유한 감미화된 전분을 생산하는 단계
    를 포함하는, 감미제 첨가의 부재하에 전분-함유 산물의 감미화 방법.
  209. 제208항에 있어서, 형질전환된 식물이 옥수수, 대두, 호밀, 귀리, 보리, 밀, 쌀 및 사탕수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  210. 제208항에 있어서, 하나 이상의 효소가 초호열성인 방법.
  211. 제208항에 있어서, 하나 이상의 효소가 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제, 풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합인 방법.
  212. 제197항의 방법으로 수득된 곡분 식품.
  213. 제208항의 방법으로 수득된 생성물을 함유하는 감미화된 전분.
  214. 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 포함하는 열매 또는 야채를 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 열매 또는 야채 중의 다당류를 프로세싱하여 당을 형성시켜 감미화된 열매 또는 야채를 수득하며, 여기서 열매 또는 야채는 게놈이 하나 이상의 다당류 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것을 포함하는, 다당류-함유 열매 또는 야채의 감미화 방법.
  215. 제214항에 있어서, 열매 또는 야채가 감자, 토마토, 바나나, 호박, 완두콩, 및 강남콩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  216. 제214항에 있어서, 하나 이상의 효소가 초호열성인 방법.
  217. 제214항에 있어서, 효소가 α-아밀라제, α-글루코시다제, 글루코아밀라제,풀루란아제, 글루코스 이소메라제, 또는 그들의 조합인 방법.
  218. 제156항의 식물 부분으로부터 수득되는 전분 과립을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 당을 포함하는 수용액을 수득하는 것을 포함하는, 당을 포함하는 수용액의 제조 방법.
  219. a) 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 전분 과립을 프로세싱하여 덱스트린 또는 당을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 전분 유도 산물을 포함하는 수용액을 수집하는 단계
    를 포함하는, 전분-유도 산물의 회수 전에 습식 또는 건식 제분 곡물을 수반하지 않은 곡물로부터의 전분 유도 산물의 제조 방법.
  220. 제219항에 있어서, 하나 이상의 전분 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  221. 제82항의 형질전환된 식물을 배양시키는 것 및 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제를 그로부터 단리하는 것을 포함하는, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제의 단리 방법.
  222. 제221항에 있어서, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 이소메라제, α-글루코시다제, 및 풀루란아제가 초호열성인 방법.
  223. a) 유전자이전 곡물을 물과 혼합하는 단계;
    b) 상기 혼합물을 가열하는 단계;
    c) (b)에서 생성된 덱스트린 시럽으로부터 고형물을 분리하는 단계; 및
    d) 말토덱스트린을 수집하는 단계
    를 포함하는 말토덱스트린의 제조 방법.
  224. 제223항에 있어서, 유전자이전 곡물이 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 것인 방법.
  225. 제224항에 있어서, 전분 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 및 글루코스 이소메라제인 방법.
  226. 제225항에 있어서, 하나 이상의 전분 프로세싱 효소가 초호열성인 방법.
  227. 제223항 내지 제226항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 말토덱스트린.
  228. 제223항 내지 제226항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 말토덱스트린 조성물.
  229. a) 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 전분 과립을 프로세싱하여 덱스트린 또는 당을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된 식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    b) 당 및(또는) 덱스트린을 포함하는 수용액을 수집하는 단계
    를 포함하는, 전분-유도 산물의 회수 전에 기계적 분열을 수반하지 않은 곡물로부터의 덱스트린 또는 당의 제조 방법.
  230. 제229항에 있어서, 전분 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 및 글루코스 이소메라제인 방법.
  231. a) 전분 과립 및 하나 이상의 전분 프로세싱 효소를 포함하는 식물 부분을 하나 이상의 효소를 활성화시키는 조건 하에 처리하여 그에 의해 전분 과립을 프로세싱하여 덱스트린 또는 당을 포함하는 수용액을 형성시키며, 여기서 식물 부분은 게놈이 하나 이상의 프로세싱 효소를 코딩하는 발현 카세트로 증대되는 형질전환된식물로부터 수득되는 것인 단계; 및
    c) 발효가능한 당을 포함하는 수용액을 수집하는 단계
    를 포함하는, 발효가능한 당의 생산 방법.
  232. 제249항에 있어서, 전분 프로세싱 효소가 α-아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, 및 글루코스 이소메라제인 방법.
  233. 초호열성 α-아밀라제를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 옥수수 식물.
  234. 서열 1 또는 서열 51에 대한 상동성이 60%를 초과하는 α-아밀라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환된 옥수수 식물.
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