JP3202029B2 - インターロイキン５の微量定量 - Google Patents
インターロイキン５の微量定量Info
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- JP3202029B2 JP3202029B2 JP03282991A JP3282991A JP3202029B2 JP 3202029 B2 JP3202029 B2 JP 3202029B2 JP 03282991 A JP03282991 A JP 03282991A JP 3282991 A JP3282991 A JP 3282991A JP 3202029 B2 JP3202029 B2 JP 3202029B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antibody
- buffer
- interleukin
- hybridoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
５（ヒトIL−５と称する）に対するモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法に
よるヒトIL−５の測定方法、及びこの測定方法のために
使用する測定キットに関する。
５（ヒトIL−５と称する）に対するモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法に
よるヒトIL−５の測定方法、及びこの測定方法のために
使用する測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】IL−５はＴ細胞代替因子（T cell-repla
cing factor)とも称され、最初、活性化されたＢ細胞が
免疫グロブリン分泌細胞に分化するための最終段階のた
めに必要な因子として記載された(J.Immunol. 125 , 26
46, 1980, Kiyoshi Takatsu ら）。最近、マウス及びヒ
トについてIL−５をコードするcDNAが単離され(Nature
324 , 70, 1986, Tatsuo Kinashiら；Cell 14, 9148, 1
986, Chihiro Azuma ら）、精製されたIL−５が入手可
能になったことから、広範な研究が可能となり、この結
果IL−５が種々の生物学的活性、例えば好中球の分化の
誘導(J.Exp.Med. 167 , 43, 1988, Yuji Yamaguchi
ら）、Ｂ細胞の増殖の刺激(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
3, 437, 1986, Colin J.Sandersonら）、細胞傷害(cyto
toxic) Ｔ細胞形成の増強(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,
4234, 1987, Kiyoshi Takatsu ら）等、を有すること
が明らかになった。しかしながら、正常状態及び疾患状
態におけるIL−５の正確な役割は解明されていない。
cing factor)とも称され、最初、活性化されたＢ細胞が
免疫グロブリン分泌細胞に分化するための最終段階のた
めに必要な因子として記載された(J.Immunol. 125 , 26
46, 1980, Kiyoshi Takatsu ら）。最近、マウス及びヒ
トについてIL−５をコードするcDNAが単離され(Nature
324 , 70, 1986, Tatsuo Kinashiら；Cell 14, 9148, 1
986, Chihiro Azuma ら）、精製されたIL−５が入手可
能になったことから、広範な研究が可能となり、この結
果IL−５が種々の生物学的活性、例えば好中球の分化の
誘導(J.Exp.Med. 167 , 43, 1988, Yuji Yamaguchi
ら）、Ｂ細胞の増殖の刺激(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
3, 437, 1986, Colin J.Sandersonら）、細胞傷害(cyto
toxic) Ｔ細胞形成の増強(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,
4234, 1987, Kiyoshi Takatsu ら）等、を有すること
が明らかになった。しかしながら、正常状態及び疾患状
態におけるIL−５の正確な役割は解明されていない。
【０００３】IL−５の測定のため、ネズミＢ細胞リンパ
腫 BCL１細胞の IgM分泌を誘導するその能力に基くバイ
オアッセイが用いられているが、この方法は感度が低
く、そして日常的測定法としてはふさわしくない。しか
も、 BCL１細胞はIL−４、GM−CSF 等の他のサイトカイ
ン類にも応答する。従って、IL−５の生物学的研究及び
実用のためには、前記の方法に代る、特異性が高く、高
感度でありそして信頼性の高いIL−５の測定方法が必要
である。
腫 BCL１細胞の IgM分泌を誘導するその能力に基くバイ
オアッセイが用いられているが、この方法は感度が低
く、そして日常的測定法としてはふさわしくない。しか
も、 BCL１細胞はIL−４、GM−CSF 等の他のサイトカイ
ン類にも応答する。従って、IL−５の生物学的研究及び
実用のためには、前記の方法に代る、特異性が高く、高
感度でありそして信頼性の高いIL−５の測定方法が必要
である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、日常
的に使用することができ、IL−５に対して特異性が高
く、しかも高感度の、IL−５の測定方法及び該方法の実
施のためのキットを提供するものであり、さらにこの技
術の前提となるIL−５に対するモノクローナル抗体を提
供するものである。
的に使用することができ、IL−５に対して特異性が高
く、しかも高感度の、IL−５の測定方法及び該方法の実
施のためのキットを提供するものであり、さらにこの技
術の前提となるIL−５に対するモノクローナル抗体を提
供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、IL−５の測
定のために有用な抗IL−５モノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマを得ることに成功し、IL−５の高感度
で且つ特異的なサンドイッチ測定法及びそのためのキッ
トを開発することに成功した。従って、本発明は、IL−
５に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体及び
IL−５に対するポリクローナル抗体を使いるサンドイッ
チ法によるIL−５の測定方法、並びに該測定方法に使用
するための測定キットを提供する。
定のために有用な抗IL−５モノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマを得ることに成功し、IL−５の高感度
で且つ特異的なサンドイッチ測定法及びそのためのキッ
トを開発することに成功した。従って、本発明は、IL−
５に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体及び
IL−５に対するポリクローナル抗体を使いるサンドイッ
チ法によるIL−５の測定方法、並びに該測定方法に使用
するための測定キットを提供する。
【０００６】
【具体的な説明】本発明のモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマを作製するための免疫系としては任意
のIL−５含有標品を用いることができるが、組換えイン
ターロイキン５を用いるのが好ましく、その製造方法は
例えば特開昭63−185387に詳細に記載されており、IL−
５をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが導入さ
れた大腸菌は微工研条寄第1477号(FERM BP-1477)として
寄託されている。
るハイブリドーマを作製するための免疫系としては任意
のIL−５含有標品を用いることができるが、組換えイン
ターロイキン５を用いるのが好ましく、その製造方法は
例えば特開昭63−185387に詳細に記載されており、IL−
５をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが導入さ
れた大腸菌は微工研条寄第1477号(FERM BP-1477)として
寄託されている。
【０００７】ハイブリドーマの作製は、Milsteinら、 N
ature, 256, 495, 1975 により最初に記載された常法に
従って行うことができる。具体的な方法は実施例１に記
載する。
ature, 256, 495, 1975 により最初に記載された常法に
従って行うことができる。具体的な方法は実施例１に記
載する。
【０００８】モノクローナル抗体の調製は、ハイブリド
ーマを常用の培地中で培養するか、又は動物の腹腔に感
染させ、腹水を回収することにより行うことができ、後
者の方法がより好ましい。この方法においては、ハイブ
リドーマをまずBALB／c マウス等の動物の腹腔に接種
し、該動物から腹水を回収する。次に、この腹水を遠心
分離等の常法に従って清澄にした後、免疫グロブリンを
特異的に吸着するプロテインＡを固定化した担体、例え
ばプロテインＡ−セファロースCL4Bに適用し、吸着した
抗体を常法に従って溶出することにより精製されたモノ
クローナル抗体が得られる。
ーマを常用の培地中で培養するか、又は動物の腹腔に感
染させ、腹水を回収することにより行うことができ、後
者の方法がより好ましい。この方法においては、ハイブ
リドーマをまずBALB／c マウス等の動物の腹腔に接種
し、該動物から腹水を回収する。次に、この腹水を遠心
分離等の常法に従って清澄にした後、免疫グロブリンを
特異的に吸着するプロテインＡを固定化した担体、例え
ばプロテインＡ−セファロースCL4Bに適用し、吸着した
抗体を常法に従って溶出することにより精製されたモノ
クローナル抗体が得られる。
【０００９】ポリクローナル抗体の調製も常法に従って
行うことができる。例えば精製された組換えヒトIL−５
をフロインドの完全アジュバント中に懸濁し、これを動
物、例えばウサギに注射して免疫及び追加免疫を行う。
最終追加免疫の１〜２週間後に採血し、常法に従って血
清を得、硫酸アンモニウム塩析により、例えば硫酸アン
モニウム０〜50％飽和画分として目的のポリクローナル
抗体を含有する蛋白質画分を得る。次にこれを、担体結
合プロテインＡ、例えばプロテインＡ−セファロースCL
−4Bに適用することにより免疫グロブリンを吸着せしめ
る。次に、この結合した免疫グロブリンを常法に従って
溶出した後、IL−５を固定した担体、例えばIL−５を固
定したセファロース４Ｂに適用し、IL−５に対するポリ
クローナル抗体のみを吸着せしめ、次にそれを常法に従
って溶出し、精製ポリクローナル抗体を得る。
行うことができる。例えば精製された組換えヒトIL−５
をフロインドの完全アジュバント中に懸濁し、これを動
物、例えばウサギに注射して免疫及び追加免疫を行う。
最終追加免疫の１〜２週間後に採血し、常法に従って血
清を得、硫酸アンモニウム塩析により、例えば硫酸アン
モニウム０〜50％飽和画分として目的のポリクローナル
抗体を含有する蛋白質画分を得る。次にこれを、担体結
合プロテインＡ、例えばプロテインＡ−セファロースCL
−4Bに適用することにより免疫グロブリンを吸着せしめ
る。次に、この結合した免疫グロブリンを常法に従って
溶出した後、IL−５を固定した担体、例えばIL−５を固
定したセファロース４Ｂに適用し、IL−５に対するポリ
クローナル抗体のみを吸着せしめ、次にそれを常法に従
って溶出し、精製ポリクローナル抗体を得る。
【００１０】本発明のサンドイッチ測定法は常法に従っ
て行うことができる。すなわち、まず、適当な固体担体
の表面にIL−５に対するモノクローナル抗体を吸着固定
し、次にこの抗体をヒトIL−５を含有すると予想される
サンプルと接触せしめる。これによりサンプル中のヒト
IL−５が、固体担体に固定されているモノクローナル抗
体と特異的に結合し、この結果、サンプル中のヒトIL−
５があらかじめ固定されているモノクローナル抗体を介
して固体担体に固定される。
て行うことができる。すなわち、まず、適当な固体担体
の表面にIL−５に対するモノクローナル抗体を吸着固定
し、次にこの抗体をヒトIL−５を含有すると予想される
サンプルと接触せしめる。これによりサンプル中のヒト
IL−５が、固体担体に固定されているモノクローナル抗
体と特異的に結合し、この結果、サンプル中のヒトIL−
５があらかじめ固定されているモノクローナル抗体を介
して固体担体に固定される。
【００１１】次に、前記担体を、二次担体としてIL−５
に対するポリクローナル抗体を含有する溶液と接触せし
める。これにより該ポリクローナル抗体はIL−５の、モ
ノクローナル抗体との結合に利用されなかった第二のエ
ピトープと結合し、該ポリクローナル抗体はあらかじめ
固定されているモノクローナル抗体及びIL−５を介して
固体担体に結合し、この場合ポリクローナル抗体の固定
量がサンプル中のIL−５の量、すなわち固定されている
IL−５の量を反映する。
に対するポリクローナル抗体を含有する溶液と接触せし
める。これにより該ポリクローナル抗体はIL−５の、モ
ノクローナル抗体との結合に利用されなかった第二のエ
ピトープと結合し、該ポリクローナル抗体はあらかじめ
固定されているモノクローナル抗体及びIL−５を介して
固体担体に結合し、この場合ポリクローナル抗体の固定
量がサンプル中のIL−５の量、すなわち固定されている
IL−５の量を反映する。
【００１２】従って、固定されたポリクローナル抗体の
量を測定することによりサンプル中のIL−５の量を決定
することができる。固定されたポリクローナル抗体の量
の測定法は後で詳細に記載する。
量を測定することによりサンプル中のIL−５の量を決定
することができる。固定されたポリクローナル抗体の量
の測定法は後で詳細に記載する。
【００１３】上記の方法において、固体担体としては、
例えば、マイクロタイタープレート、例えばポリ塩化ビ
ニル製マイクロタイタープレート、又はポリスチレン製
マイクロタイタープレート等を用いることができる。モ
ノクローナル抗体の固定は、例えば、モノクローナル抗
体を適当な緩衝液、例えば炭酸緩衝液、リン酸緩衝液等
に希釈した後、これを固体担体の表面に適用し、そして
４℃〜37℃にて30分間以上インキュベートすることによ
り行うことができる。
例えば、マイクロタイタープレート、例えばポリ塩化ビ
ニル製マイクロタイタープレート、又はポリスチレン製
マイクロタイタープレート等を用いることができる。モ
ノクローナル抗体の固定は、例えば、モノクローナル抗
体を適当な緩衝液、例えば炭酸緩衝液、リン酸緩衝液等
に希釈した後、これを固体担体の表面に適用し、そして
４℃〜37℃にて30分間以上インキュベートすることによ
り行うことができる。
【００１４】次に、固体担体を、洗浄液、例えばTween
20のごとき界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸
緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等により数回洗浄
して、未吸着のモノクローナル抗体を除去する。
20のごとき界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸
緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等により数回洗浄
して、未吸着のモノクローナル抗体を除去する。
【００１５】次に、固体担体表面上の遊離結合基をブロ
ックするため、ブロッキング緩衝液により固体担体を処
理する。ブロッキング緩衝液として、例えば、１〜数％
のウシ血清アルブミン(BSA) 、卵白アルブミン、スキム
ミルク等を含有する緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いることができ、処理は
４℃〜37℃にて30分間以上のインキュベーションにより
行うことができる。
ックするため、ブロッキング緩衝液により固体担体を処
理する。ブロッキング緩衝液として、例えば、１〜数％
のウシ血清アルブミン(BSA) 、卵白アルブミン、スキム
ミルク等を含有する緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いることができ、処理は
４℃〜37℃にて30分間以上のインキュベーションにより
行うことができる。
【００１６】次に、固体担体を洗浄することよりブロッ
キング緩衝液を除去する。この洗浄は、前記モノクロー
ナル抗体の固定後の洗浄と同様に行うことができる。こ
うして、固体担体が調製される。
キング緩衝液を除去する。この洗浄は、前記モノクロー
ナル抗体の固定後の洗浄と同様に行うことができる。こ
うして、固体担体が調製される。
【００１７】次に、この固体担体を、適当な緩衝液、例
えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の中
に希釈されたサンプルと接触せしめる。この接触は、４
℃〜37℃にて30分間以上のインキュベーションにより行
うことができる。次に前記のようにして固体担体を洗浄
する。
えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の中
に希釈されたサンプルと接触せしめる。この接触は、４
℃〜37℃にて30分間以上のインキュベーションにより行
うことができる。次に前記のようにして固体担体を洗浄
する。
【００１８】次に、二次抗体、すなわちIL−５に対する
ポリクローナル抗体を含有する緩衝液に前記固体担体を
接触せしめる。この場合の緩衝液としては、例えばリン
酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いること
ができる。この接触は４℃〜37℃にて30分間以上のイン
キュベーションにより行う。次に、前記のようにして固
体担体を洗浄する。
ポリクローナル抗体を含有する緩衝液に前記固体担体を
接触せしめる。この場合の緩衝液としては、例えばリン
酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いること
ができる。この接触は４℃〜37℃にて30分間以上のイン
キュベーションにより行う。次に、前記のようにして固
体担体を洗浄する。
【００１９】次に、上記のようにして結合固定された二
次抗体の検出・測定は任意の常法に従って行うことがで
きる。二次抗体自体を例えば放射性核種、蛍光物質、酵
素等により標識しておき、直接検出・測定することも可
能である。しかしながら、本発明の好ましい方法におい
ては、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この
三次抗体を種々の方法により標識しておく。
次抗体の検出・測定は任意の常法に従って行うことがで
きる。二次抗体自体を例えば放射性核種、蛍光物質、酵
素等により標識しておき、直接検出・測定することも可
能である。しかしながら、本発明の好ましい方法におい
ては、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この
三次抗体を種々の方法により標識しておく。
【００２０】三次抗体としては、二次抗体の調製に用い
た動物の種と異る種の動物の抗体であって、二次抗体の
調製に用いた動物種の免疫グロブリンに対するもの又は
その断片が用いられる。例えば、二次抗体がウサギを用
いて調製された場合、三次抗体としてウサギ免疫グロブ
リンに対するヤギの抗体を用いることができる。
た動物の種と異る種の動物の抗体であって、二次抗体の
調製に用いた動物種の免疫グロブリンに対するもの又は
その断片が用いられる。例えば、二次抗体がウサギを用
いて調製された場合、三次抗体としてウサギ免疫グロブ
リンに対するヤギの抗体を用いることができる。
【００２１】三次抗体を標識するため、常用の標識物
質、例えば放射性核種、例えば 125Ｉ， 3Ｈ，14Ｃ；蛍
光物質、例えばフルオレッセインイソチオシアネート(F
ITC)、ローダミン、テキサスレッド；酵素、例えば西洋
ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ等を用いることができる。本発明の好ましい態
様においては三次抗体の標識として酵素が用いられ、本
発明のサンドイッチ法は酵素免疫測定法(ELISA）として
行われる。酵素の検出には、その酵素に対応する基質、
好ましくは発色性の酵素基質が用いられ、例えば酵素と
してパーオキシダーゼが用いられる場合、その基質とし
て過酸化水素、発色試薬として、例えばオルソフェニレ
ンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジ
ジン等が用いられる。
質、例えば放射性核種、例えば 125Ｉ， 3Ｈ，14Ｃ；蛍
光物質、例えばフルオレッセインイソチオシアネート(F
ITC)、ローダミン、テキサスレッド；酵素、例えば西洋
ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ等を用いることができる。本発明の好ましい態
様においては三次抗体の標識として酵素が用いられ、本
発明のサンドイッチ法は酵素免疫測定法(ELISA）として
行われる。酵素の検出には、その酵素に対応する基質、
好ましくは発色性の酵素基質が用いられ、例えば酵素と
してパーオキシダーゼが用いられる場合、その基質とし
て過酸化水素、発色試薬として、例えばオルソフェニレ
ンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジ
ジン等が用いられる。
【００２２】本発明はIL−５の測定用キットをも提供
し、このキットは少なくともIL−５に対するモノクロー
ナル抗体、及びIL−５に対するポリクローナル抗体を含
んで成る。モノクローナル抗体は溶液状又は凍結乾燥品
でもよく、あるいは固体担体に固定されたものでもよ
い。キットが固体担体に固定されたモノクローナル抗体
を含む場合、この固体担体は好ましくはブロッキング剤
により処理された後のものである。
し、このキットは少なくともIL−５に対するモノクロー
ナル抗体、及びIL−５に対するポリクローナル抗体を含
んで成る。モノクローナル抗体は溶液状又は凍結乾燥品
でもよく、あるいは固体担体に固定されたものでもよ
い。キットが固体担体に固定されたモノクローナル抗体
を含む場合、この固体担体は好ましくはブロッキング剤
により処理された後のものである。
【００２３】測定キットはさらに、第三の要素として前
記ポリクローナル抗体（二次抗体）に特異的に結合する
標識された三次抗体を含むことができる。この場合の三
次抗体の標識が酵素である場合はさらに、該酵素の基質
を含む発色試薬をキットに含めることもできる。しかし
ながら、酵素標識された三次抗体及び対応する発色試薬
は市販品を使用することができ、本発明のキットの必須
要素ではない。
記ポリクローナル抗体（二次抗体）に特異的に結合する
標識された三次抗体を含むことができる。この場合の三
次抗体の標識が酵素である場合はさらに、該酵素の基質
を含む発色試薬をキットに含めることもできる。しかし
ながら、酵素標識された三次抗体及び対応する発色試薬
は市販品を使用することができ、本発明のキットの必須
要素ではない。
【００２４】本発明の測定キットはまた、任意的要素と
して、サンプル希釈用緩衝液、各種の試薬希釈用緩衝
液、洗浄液等を含むことができる。
して、サンプル希釈用緩衝液、各種の試薬希釈用緩衝
液、洗浄液等を含むことができる。
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２５】実施例１ ハイブリドーマの作製 ハイブリドーマの作製は、Milsteinら、Nature, 256 ,
495, 1975 により最初に記載された常法に従って行うこ
とができる。すなわち、例えば精製された組換えヒトIL
−５をフロインドの完全アジュバント中に懸濁し、マウ
ス（BALB／c)の腹腔内に７〜10日毎に３回注射しマウス
を免疫する。最終免疫の３日後該マウスの脾臓の細胞
（脾細胞）とマウスミエローマ細胞とポリエチレングリ
コールを用いて融合させ、常法に従いＨＡＴ培地(RPMI
1640＋10％血清にヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジンを含む培地）による融合細胞（ハイブリドーマ）
の選択的培養後、その培養上清について ELISA法を用い
ヒトIL−５に対する反応により第一次スクリーニングを
行った。
495, 1975 により最初に記載された常法に従って行うこ
とができる。すなわち、例えば精製された組換えヒトIL
−５をフロインドの完全アジュバント中に懸濁し、マウ
ス（BALB／c)の腹腔内に７〜10日毎に３回注射しマウス
を免疫する。最終免疫の３日後該マウスの脾臓の細胞
（脾細胞）とマウスミエローマ細胞とポリエチレングリ
コールを用いて融合させ、常法に従いＨＡＴ培地(RPMI
1640＋10％血清にヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジンを含む培地）による融合細胞（ハイブリドーマ）
の選択的培養後、その培養上清について ELISA法を用い
ヒトIL−５に対する反応により第一次スクリーニングを
行った。
【００２６】上記のスクリーニングで陽性(positive)と
判定されたハイブリドーマは、さらに限界希釈法による
サブクローニングによって単クローン（モノクローン）
とした。単一クローン化されたハイブリドーマの産生す
る抗体（即ちMoAb）のサブクラスは市販のマウスグロブ
リン同定キットを用いて同定した。
判定されたハイブリドーマは、さらに限界希釈法による
サブクローニングによって単クローン（モノクローン）
とした。単一クローン化されたハイブリドーマの産生す
る抗体（即ちMoAb）のサブクラスは市販のマウスグロブ
リン同定キットを用いて同定した。
【００２７】上記のようにして４個のハイブリドーマク
ローンD138，C213，D171、及びE060を得た。なお、この
明細書においては、便宜上、ハイブリドーマの標示及び
そのハイブリドーマにより生産されたモノクローナル抗
体の標示を同じ記号により行う。なお、上記ハイブリド
ーマD138は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
第3289号(FERM BP-3289)として寄託されている。
ローンD138，C213，D171、及びE060を得た。なお、この
明細書においては、便宜上、ハイブリドーマの標示及び
そのハイブリドーマにより生産されたモノクローナル抗
体の標示を同じ記号により行う。なお、上記ハイブリド
ーマD138は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
第3289号(FERM BP-3289)として寄託されている。
【００２８】実施例２ モノクローナル抗体の調製 得られたハイブリドーマをBALB／c マウスの腹腔に接種
し、腹水を回収した。上記のようにして得た腹水20mlを
遠心分離して清澄化した後、35mlのプロテインＡ−セフ
ァロースCL−4Bカラム(Pharmacia LKB Biotechnology,
Uppsala,スェーデン）に適用し、カラムを３Ｍ NaCl を
含有する1.５Ｍグリシン緩衝液（pH8.９）で洗浄した
後、カラムに吸着したモノクローナル抗体を0.１Ｍクエ
ン酸緩衝液（pH4.０）により溶出した。他のハイブリド
ーマについても同様の操作を行い、それぞれ対応するモ
ノクローナル抗体を得た。
し、腹水を回収した。上記のようにして得た腹水20mlを
遠心分離して清澄化した後、35mlのプロテインＡ−セフ
ァロースCL−4Bカラム(Pharmacia LKB Biotechnology,
Uppsala,スェーデン）に適用し、カラムを３Ｍ NaCl を
含有する1.５Ｍグリシン緩衝液（pH8.９）で洗浄した
後、カラムに吸着したモノクローナル抗体を0.１Ｍクエ
ン酸緩衝液（pH4.０）により溶出した。他のハイブリド
ーマについても同様の操作を行い、それぞれ対応するモ
ノクローナル抗体を得た。
【００２９】上記のようにして得られた４種類のモノク
ローナル抗体D138, C213, D171、及びE060はそれぞれ I
gG2a, IgG1, IgG2a 、及びIgG1のイムノグロブリンサブ
クラスに属する。これらの抗体の結合性はヒトIL−５に
特異的であり、他のサイトカイン、例えばインターフェ
ロンγ、IL−４、TNF−α及びGM−CSF 、並びにマウス
の組換IL−５には交差反応を示さない。さらに、これら
の抗体が認識するエピトープ（抗原決定基）はすべての
ペプチド部位である。
ローナル抗体D138, C213, D171、及びE060はそれぞれ I
gG2a, IgG1, IgG2a 、及びIgG1のイムノグロブリンサブ
クラスに属する。これらの抗体の結合性はヒトIL−５に
特異的であり、他のサイトカイン、例えばインターフェ
ロンγ、IL−４、TNF−α及びGM−CSF 、並びにマウス
の組換IL−５には交差反応を示さない。さらに、これら
の抗体が認識するエピトープ（抗原決定基）はすべての
ペプチド部位である。
【００３０】実施例３ ポリクローナル抗体の調製 50μｇの組換えIL−５をフロインドの完全アジュバント
中に懸濁し、これをウサギに３〜５週間毎に３回免疫
し、最終免疫の７日後に採血し、そして常法に従って血
清を得た。こうして得られた血清20mlに硫酸アンモニウ
ムを加えて50％飽和とした後、遠心分離により蛋白質画
分の沈澱を回収し、そしてＰＢＳに対して透析すること
により硫酸アンモニウムを除去した。次に、この蛋白質
画分をプロテインＡ−セファロースCL−4Bカラムに適用
することにより免疫グロブリンを吸着せしめ、モノクロ
ーナル抗体の精製の場合と同様にして免疫グロブリン画
分を溶出した。
中に懸濁し、これをウサギに３〜５週間毎に３回免疫
し、最終免疫の７日後に採血し、そして常法に従って血
清を得た。こうして得られた血清20mlに硫酸アンモニウ
ムを加えて50％飽和とした後、遠心分離により蛋白質画
分の沈澱を回収し、そしてＰＢＳに対して透析すること
により硫酸アンモニウムを除去した。次に、この蛋白質
画分をプロテインＡ−セファロースCL−4Bカラムに適用
することにより免疫グロブリンを吸着せしめ、モノクロ
ーナル抗体の精製の場合と同様にして免疫グロブリン画
分を溶出した。
【００３１】次に、この免疫グロブリン画分をIL−５を
固定したセファロース４Ｂ（IL−５セファロース４Ｂ；
ファルマシア製のCNBr−活性化セファロース４Ｂを用
い、常法に従ってIL−５を結合させたもの；200μｇ hI
L−５／0.３ｇセファロース）に適用してＩＬ−５に対
する抗体を特異的に吸着させ、次にこれを0.１Ｍグリシ
ン緩衝液（pH2.５）により溶出した。こうして、IL−５
に対する精製されたポリクローナル抗体を得た。
固定したセファロース４Ｂ（IL−５セファロース４Ｂ；
ファルマシア製のCNBr−活性化セファロース４Ｂを用
い、常法に従ってIL−５を結合させたもの；200μｇ hI
L−５／0.３ｇセファロース）に適用してＩＬ−５に対
する抗体を特異的に吸着させ、次にこれを0.１Ｍグリシ
ン緩衝液（pH2.５）により溶出した。こうして、IL−５
に対する精製されたポリクローナル抗体を得た。
【００３２】実施例４ ELISA法によるIL−５の測定 96−ウエルのポリ塩化ビニルマイクロプレート(Falcon
3912）の中央部の60個のウエルに、緩衝液Ａ（0.１Ｍ炭
酸緩衝液、pH9.５）に溶解したモノクローナル抗体（10
μｇ／ml）の溶液 100μｌを入れ、プラスチック製カバ
ー(Falcon 3913）でマイクロプレートを覆った後４℃に
て一夜インキュベートした。
3912）の中央部の60個のウエルに、緩衝液Ａ（0.１Ｍ炭
酸緩衝液、pH9.５）に溶解したモノクローナル抗体（10
μｇ／ml）の溶液 100μｌを入れ、プラスチック製カバ
ー(Falcon 3913）でマイクロプレートを覆った後４℃に
て一夜インキュベートした。
【００３３】前記マイクロプレートのウエルから液を注
ぎ出した後、ウエルに200μｌの緩衝液Ｂ（0.１％のTwe
en 20を含有するリン酸緩衝液）を加え、３分間の後、
前記のようにして液を除去した。これをさらに３回繰返
すことによりウエルの洗浄を行った。
ぎ出した後、ウエルに200μｌの緩衝液Ｂ（0.１％のTwe
en 20を含有するリン酸緩衝液）を加え、３分間の後、
前記のようにして液を除去した。これをさらに３回繰返
すことによりウエルの洗浄を行った。
【００３４】次にリン酸緩衝液中の１％ウシ血清アルブ
ミンの溶液 200μｌを各ウエルに加え、室温にて30分間
インキュベートすることによりウエルの非特異的結合部
位のブロッキングを行った。次に前記の様にして３回洗
浄した。緩衝液Ｃ（10％ウシ胎児血清を含有する緩衝液
Ｂ）中に希釈されたIL−５の溶液（濃度 500〜7.８pg／
ml)(標準溶液）又は緩衝液Ｂ中に希釈された被験サンプ
ル 100μｌをウエルに加え、カバーを付した後室温にて
一夜インキュベートし、そして前記の方法により５回洗
浄した。
ミンの溶液 200μｌを各ウエルに加え、室温にて30分間
インキュベートすることによりウエルの非特異的結合部
位のブロッキングを行った。次に前記の様にして３回洗
浄した。緩衝液Ｃ（10％ウシ胎児血清を含有する緩衝液
Ｂ）中に希釈されたIL−５の溶液（濃度 500〜7.８pg／
ml)(標準溶液）又は緩衝液Ｂ中に希釈された被験サンプ
ル 100μｌをウエルに加え、カバーを付した後室温にて
一夜インキュベートし、そして前記の方法により５回洗
浄した。
【００３５】次に、緩衝液Ｄ（３％のポリエチレングリ
コール6000を含有する緩衝液Ｂ）中に希釈したIL−５に
対するポリクローナル抗体（二次抗体)(濃度40ng／ml)1
00μｌを各ウエルに加え、カバーを付した後、室温にて
４時間インキュベートした。次に、前記の方法により２
回洗浄した。次に、ヤギの抗−ウサギ免疫グロブリン抗
体にパーオキシダーゼを結合している標識された三次抗
体の緩衝液Ｄ中の溶液 100μｌに入れ、そしてカバーを
付した後室温にて４時間インキュベートした。次に前記
の方法により５回洗浄した。
コール6000を含有する緩衝液Ｂ）中に希釈したIL−５に
対するポリクローナル抗体（二次抗体)(濃度40ng／ml)1
00μｌを各ウエルに加え、カバーを付した後、室温にて
４時間インキュベートした。次に、前記の方法により２
回洗浄した。次に、ヤギの抗−ウサギ免疫グロブリン抗
体にパーオキシダーゼを結合している標識された三次抗
体の緩衝液Ｄ中の溶液 100μｌに入れ、そしてカバーを
付した後室温にて４時間インキュベートした。次に前記
の方法により５回洗浄した。
【００３６】0.１Ｍ酢酸緩衝液（pH5.５）中に0.0027％
の過酸化水素及び0.55nMの３，３′，５，５′−テトラ
メチルベンジジンを含有する、新しく調製した基質溶液
100μｌを各ウエルに加え、室温にて10分間インキュベ
ートして酵素反応させた後、100μｌの１N HCl を加え
て反応を停止させた。次に、 ELISAプレートリーダーに
より 450nmでの吸収を読み取った。
の過酸化水素及び0.55nMの３，３′，５，５′−テトラ
メチルベンジジンを含有する、新しく調製した基質溶液
100μｌを各ウエルに加え、室温にて10分間インキュベ
ートして酵素反応させた後、100μｌの１N HCl を加え
て反応を停止させた。次に、 ELISAプレートリーダーに
より 450nmでの吸収を読み取った。
【００３７】上記の方法により、モノクローナル抗体と
して、D138，C213，D171、及びE060を用いて種々の濃度
のIL−５標準サンプルを測定した場合、測定感度は次の
表１に示す通りであった。
して、D138，C213，D171、及びE060を用いて種々の濃度
のIL−５標準サンプルを測定した場合、測定感度は次の
表１に示す通りであった。
【００３８】
【表１】
【００３９】モノクローナル抗体D138又はD171を一次抗
体（捕捉抗体）として使用することにより検出限界7.８
pg／mlという、従来法では得られない高い感度の測定を
行うことができる。一例として図１にモノクローナル抗
体D138を使用した場合の、IL−５濃度（pg／ml）と 450
nmにおける吸光度との間の検量線を示す。
体（捕捉抗体）として使用することにより検出限界7.８
pg／mlという、従来法では得られない高い感度の測定を
行うことができる。一例として図１にモノクローナル抗
体D138を使用した場合の、IL−５濃度（pg／ml）と 450
nmにおける吸光度との間の検量線を示す。
【００４０】次に、本発明のサンドイッチ法の特異性を
調べるため、捕捉抗体としてD138を用い、種々のサイト
カイン類、細胞培養上清、及びヒト血清を測定し、これ
らが本発明の方法により検知されるか否かを調べた。そ
の結果を表２に示す。
調べるため、捕捉抗体としてD138を用い、種々のサイト
カイン類、細胞培養上清、及びヒト血清を測定し、これ
らが本発明の方法により検知されるか否かを調べた。そ
の結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】この表から明らかな通り、本発明の測定法
は、IL−５以外のヒトのサイトカインを検知せず、また
マウスのIL−５を検知しなかった。また、健常人の血清
中の成分も検知しなかった。従って、本発明のサンドイ
ッチ測定法はヒトIL−５に対して極めて特異性が高い。
は、IL−５以外のヒトのサイトカインを検知せず、また
マウスのIL−５を検知しなかった。また、健常人の血清
中の成分も検知しなかった。従って、本発明のサンドイ
ッチ測定法はヒトIL−５に対して極めて特異性が高い。
【００４３】次に、本発明の測定方法の同時再現性（同
時に同一のサンプルについて複数個の測定を行った場合
のバラツキの程度）、及び日差再現性（同一サンプルを
日を替えて測定した場合の測定結果の差）を調べた。
時に同一のサンプルについて複数個の測定を行った場合
のバラツキの程度）、及び日差再現性（同一サンプルを
日を替えて測定した場合の測定結果の差）を調べた。
【００４４】IL−５の濃度を異にする３種類のサンプル
Ａ，Ｂ及びＣを５連で測定し、他方、同じサンプルを１
日１回ずつ別々の日に５回測定した。各サンプルにつ
き、平均値及び標準偏差、並びに平均値に対する標準偏
差の割合（CV％）を表３に示す。
Ａ，Ｂ及びＣを５連で測定し、他方、同じサンプルを１
日１回ずつ別々の日に５回測定した。各サンプルにつ
き、平均値及び標準偏差、並びに平均値に対する標準偏
差の割合（CV％）を表３に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】上記の通り、同時再現性及び日差再現性共
に良好であった。
に良好であった。
【図１】図１は、捕捉抗体としてヒトIL−５に対するモ
ノクローナル抗体D138を用いてサンドイッチ ELISA法に
よりヒトIL−５を測定した場合のヒトIL−５濃度と吸光
度との関係の一例を示す。
ノクローナル抗体D138を用いてサンドイッチ ELISA法に
よりヒトIL−５を測定した場合のヒトIL−５濃度と吸光
度との関係の一例を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 中西 俊博 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社 生物医学研究 所内 (56)参考文献 特開 昭59−39832（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−307666（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−59068（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開367596（ＥＰ，Ａ １) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．106, （1989），ｐ．23−28 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/12 - 5/28 G01N 33/53 G01N 33/577 C12N 15/06 - 15/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 マウスインターロイキン５と実質的に反
応せず、ヒトインターロイキン５を測定する方法におい
て検出限界値が 500pg／mL以下であるヒトインターロイ
キン５に対するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 前記検出限界値が31pg／mL以下である請
求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ハイブリドーマ（微工研条寄第3289号）
により生産される請求項１又は２に記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒ
トインターロイキン５に対するモノクローナル抗体、及
びヒトインターロイキン５に対するポリクローナル抗体
を用いるサンドイッチアッセイ法であることを特徴とす
るヒトインターロイキン５の測定方法。 - 【請求項５】 固体担体に固定されていてもよい、請求
項１〜３のいずれか１項に記載のヒトインターロイキン
５に対するモノクローナル抗体、及びヒトインターロイ
キン５に対するポリクローナル抗体を含んで成る、ヒト
インターロイキン５測定用キット。 - 【請求項６】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03282991A JP3202029B2 (ja) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | インターロイキン５の微量定量 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03282991A JP3202029B2 (ja) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | インターロイキン５の微量定量 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04271795A JPH04271795A (ja) | 1992-09-28 |
| JP3202029B2 true JP3202029B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=12369718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03282991A Expired - Fee Related JP3202029B2 (ja) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | インターロイキン５の微量定量 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3202029B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0723179D0 (en) * | 2007-11-27 | 2008-01-02 | Immunovia Ab | Diagnostic methods and arrays for use in the same |
| JP5136147B2 (ja) * | 2008-03-25 | 2013-02-06 | 住友ベークライト株式会社 | 生理活性物質の検出方法および測定キット |
| WO2020200099A1 (zh) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途 |
-
1991
- 1991-02-27 JP JP03282991A patent/JP3202029B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１０６，（１９８９），ｐ．２３−２８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04271795A (ja) | 1992-09-28 |
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