JP3148029B2 - 多糖誘導体モノマーの製造法 - Google Patents
多糖誘導体モノマーの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多糖誘導体モノマーの
製造法に関する。本発明により得られるモノマーは、重
合，共重合あるいはハイドロシリレイション等の方法を
用いることにより、新規細胞培養基材，ドラッグデリバ
リーの原料，分解性プラスチック，分離膜，電気泳動用
ゲルの材料，光学分割用分離剤等としての利用が期待さ
れるものである。
製造法に関する。本発明により得られるモノマーは、重
合，共重合あるいはハイドロシリレイション等の方法を
用いることにより、新規細胞培養基材，ドラッグデリバ
リーの原料，分解性プラスチック，分離膜，電気泳動用
ゲルの材料，光学分割用分離剤等としての利用が期待さ
れるものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】これ
までにオリゴ糖の還元末端側のＣ１の炭素にクロロメチ
ルスチレンより誘導したビニルベンジルアミンを結合さ
せたモノマーは、小林一清等によって合成されており、
このモノマーをラジカル重合させたポリマー〔Polymer
Journal, vol. 15, NO. 9, p667-671(1983) 、Polymer
Journal, vol. 17, NO. 4, p567-575(1985) 、高分子論
文集，vol. 45, NO. 12, p919-924(1988) 〕について肝
細胞の培養材料等として有用性が高いことが報告されて
いる。しかし、このモノマーを用いた場合、反応性の点
で重合度の高い、糖鎖をもつポリマーを合成するのは困
難であった。
までにオリゴ糖の還元末端側のＣ１の炭素にクロロメチ
ルスチレンより誘導したビニルベンジルアミンを結合さ
せたモノマーは、小林一清等によって合成されており、
このモノマーをラジカル重合させたポリマー〔Polymer
Journal, vol. 15, NO. 9, p667-671(1983) 、Polymer
Journal, vol. 17, NO. 4, p567-575(1985) 、高分子論
文集，vol. 45, NO. 12, p919-924(1988) 〕について肝
細胞の培養材料等として有用性が高いことが報告されて
いる。しかし、このモノマーを用いた場合、反応性の点
で重合度の高い、糖鎖をもつポリマーを合成するのは困
難であった。
【０００３】また、シリカゲルにセルロースやアミロー
スなどの多糖やその誘導体を担持させたものが分離剤と
して用いられ、光学分割等に有用なことは知られてい
る。しかしながら、この化合物は耐溶媒性が低く、液体
クロマトグラフィー法等に用いる場合、使用できる溶離
液が限られる。さらに、上記問題点を克服するために、
各種の多糖誘導体をシリカゲルに化学結合させたものも
提案されている。しかし、このものは、シリカゲルに化
学結合させる部位が選択できないため、糖自体の高次構
造に影響を与え、多糖の持つ有用な性質を低下させると
いう欠点を有している。また、結合部位が不特定である
ことに起因して、得られるシリカゲル化合物は品質のば
らつきが大きいという欠点もある。
スなどの多糖やその誘導体を担持させたものが分離剤と
して用いられ、光学分割等に有用なことは知られてい
る。しかしながら、この化合物は耐溶媒性が低く、液体
クロマトグラフィー法等に用いる場合、使用できる溶離
液が限られる。さらに、上記問題点を克服するために、
各種の多糖誘導体をシリカゲルに化学結合させたものも
提案されている。しかし、このものは、シリカゲルに化
学結合させる部位が選択できないため、糖自体の高次構
造に影響を与え、多糖の持つ有用な性質を低下させると
いう欠点を有している。また、結合部位が不特定である
ことに起因して、得られるシリカゲル化合物は品質のば
らつきが大きいという欠点もある。
【０００４】なお、オリゴ糖としてマルトペンタオース
を用いる場合は、この還元末端をラクトン化し、ビニル
基及びアミノ基を有する化合物とアミド結合を介して化
学結合させることができ、また該ラクトンを、アミノ基
を有し、かつビニル基を導入できるような反応性基を有
する化合物と、そのアミノ基部でアミド結合を介して結
合させた後にビニル基を導入させることも可能である。
を用いる場合は、この還元末端をラクトン化し、ビニル
基及びアミノ基を有する化合物とアミド結合を介して化
学結合させることができ、また該ラクトンを、アミノ基
を有し、かつビニル基を導入できるような反応性基を有
する化合物と、そのアミノ基部でアミド結合を介して結
合させた後にビニル基を導入させることも可能である。
【０００５】さらには、ＮａＢＨ3 ＣＮ等のボラン化合
物を還元剤として用いてオリゴ糖の還元末端のアルデヒ
ド基を、アミノ基及びビニル基を有する化合物あるいは
アミノ基を有し、かつビニル基を導入できるような反応
性基を有する化合物と、そのアミノ基部で還元アミノ化
法により化学結合させて下記の式（３）で表される化合
物を得ることも可能である（高分子学会年次大会要旨集
１９９２．５、糖鎖を有するポリカチオンの合成と肝細
胞特異的gene carrier参照）。
物を還元剤として用いてオリゴ糖の還元末端のアルデヒ
ド基を、アミノ基及びビニル基を有する化合物あるいは
アミノ基を有し、かつビニル基を導入できるような反応
性基を有する化合物と、そのアミノ基部で還元アミノ化
法により化学結合させて下記の式（３）で表される化合
物を得ることも可能である（高分子学会年次大会要旨集
１９９２．５、糖鎖を有するポリカチオンの合成と肝細
胞特異的gene carrier参照）。
【０００６】
【化３】
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、上
記課題が解消された多糖誘導体を開発すべく鋭意検討を
重ねた結果、上記のようにして得られたオリゴ糖が化学
結合したモノマーをプライマーとし、酵素（マルトペン
タオースの場合は、ホスホリラーゼ）を用いて、オリゴ
糖鎖を多糖誘導体モノマー（平均重合度１５〜５００）
まで合成することに成功した。また、酵素合成の際に多
糖誘導体モノマーの老化を防止するためにジメチルスル
ホキシドを１０〜２５％（ｖ／ｖ）程度添加することが
有効であることを知見した。
記課題が解消された多糖誘導体を開発すべく鋭意検討を
重ねた結果、上記のようにして得られたオリゴ糖が化学
結合したモノマーをプライマーとし、酵素（マルトペン
タオースの場合は、ホスホリラーゼ）を用いて、オリゴ
糖鎖を多糖誘導体モノマー（平均重合度１５〜５００）
まで合成することに成功した。また、酵素合成の際に多
糖誘導体モノマーの老化を防止するためにジメチルスル
ホキシドを１０〜２５％（ｖ／ｖ）程度添加することが
有効であることを知見した。
【０００８】この方法により、多糖の還元末端に反応性
基であるビニル基を持つ多糖誘導体を得ることできた。
このモノマーを用いることにより、上記した種々の課題
を解決することができるポリマーの合成が期待される。
また、本発明の方法により得られる多糖誘導体モノマー
を用いて担体、例えばシリカゲルと該多糖誘導体モノマ
ーをそのビニル基を利用してハイドロシリレイション法
（Journal of Chromatography, 405(1987)169 〜177 J.
Bradshaw, S.Aggarwal, et al)や重合法を応用し、多
糖の構造をほとんど壊すことなく化学結合させることも
可能である。得られた重合体を前記分離剤などの用途に
利用することが可能となる。
基であるビニル基を持つ多糖誘導体を得ることできた。
このモノマーを用いることにより、上記した種々の課題
を解決することができるポリマーの合成が期待される。
また、本発明の方法により得られる多糖誘導体モノマー
を用いて担体、例えばシリカゲルと該多糖誘導体モノマ
ーをそのビニル基を利用してハイドロシリレイション法
（Journal of Chromatography, 405(1987)169 〜177 J.
Bradshaw, S.Aggarwal, et al)や重合法を応用し、多
糖の構造をほとんど壊すことなく化学結合させることも
可能である。得られた重合体を前記分離剤などの用途に
利用することが可能となる。
【０００９】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たものである。すなわち、本発明は重合度３以上１０以
下のオリゴ糖の還元末端部位のアルデヒド基を酸化して
ラクトンを形成させ、次いで式（１）で表されるビニル
基及びアミノ基を有する化合物
たものである。すなわち、本発明は重合度３以上１０以
下のオリゴ糖の還元末端部位のアルデヒド基を酸化して
ラクトンを形成させ、次いで式（１）で表されるビニル
基及びアミノ基を有する化合物
【００１０】
【化４】
【００１１】を反応させ、オリゴ糖のラクトン部位と該
化合物のアミノ基部との間でアミド結合させた後、ホス
ホリラーゼ、デキストランシュークラーゼ及びレバンシ
ュークラーゼの中から選ばれた酵素を作用させ、結合し
た重合度３以上１０以下の多糖部位を数平均重合度１５
以上５００以下の多糖にまで合成することを特徴とする
式（２）で表される多糖誘導体モノマー
化合物のアミノ基部との間でアミド結合させた後、ホス
ホリラーゼ、デキストランシュークラーゼ及びレバンシ
ュークラーゼの中から選ばれた酵素を作用させ、結合し
た重合度３以上１０以下の多糖部位を数平均重合度１５
以上５００以下の多糖にまで合成することを特徴とする
式（２）で表される多糖誘導体モノマー
【００１２】
【化５】 の製造法を提供するものである。
【００１３】本発明に用いられるオリゴ糖とは、酵素合
成で重合度１５〜５００の多糖に合成するための基質と
なり得るものであり、天然オリゴ糖、合成オリゴ糖のい
ずれを問わない。かかるオリゴ糖の具体例としてα−
１，４−グルカン（マルトオリゴ糖）、β−１，４−グ
ルカン（セロオリゴ糖）、α−１，６−グルカン（イソ
マルトオリゴ糖）、β−１，６−グルカン（ゲンチオオ
リゴ糖）、α−１，３−グルカン（ニゲロオリゴ糖）、
β−１，３−グルカン（ラミナリオリゴ糖）、α−１，
２−グルカン、β−１，２−グルカン（ソホロオリゴ
糖）、β−１，４−キトオリゴ糖、β−１，４−Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖、β−１，４−ガラクタン（ラクト
オリゴ糖）、α−１，６−ガラクタン（メリオリゴ
糖）、β−１，２−フルクタン（イヌロオリゴ糖）、β
−２，６−フルクタン、β−１，３−キシラン、β−
１，４−キシラン、β−１，４−マンナン、α−１，６
−マンナン等を挙げることができる。これらオリゴ糖の
数平均重合度としては３以上であり、上限については特
に制限はないが、ラクトン化，還元アミノ化の反応性等
や取扱いの点から１０程度が好ましい。
成で重合度１５〜５００の多糖に合成するための基質と
なり得るものであり、天然オリゴ糖、合成オリゴ糖のい
ずれを問わない。かかるオリゴ糖の具体例としてα−
１，４−グルカン（マルトオリゴ糖）、β−１，４−グ
ルカン（セロオリゴ糖）、α−１，６−グルカン（イソ
マルトオリゴ糖）、β−１，６−グルカン（ゲンチオオ
リゴ糖）、α−１，３−グルカン（ニゲロオリゴ糖）、
β−１，３−グルカン（ラミナリオリゴ糖）、α−１，
２−グルカン、β−１，２−グルカン（ソホロオリゴ
糖）、β−１，４−キトオリゴ糖、β−１，４−Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖、β−１，４−ガラクタン（ラクト
オリゴ糖）、α−１，６−ガラクタン（メリオリゴ
糖）、β−１，２−フルクタン（イヌロオリゴ糖）、β
−２，６−フルクタン、β−１，３−キシラン、β−
１，４−キシラン、β−１，４−マンナン、α−１，６
−マンナン等を挙げることができる。これらオリゴ糖の
数平均重合度としては３以上であり、上限については特
に制限はないが、ラクトン化，還元アミノ化の反応性等
や取扱いの点から１０程度が好ましい。
【００１４】本発明に用いる酵素としては、上記オリゴ
糖を多糖にまで合成できるものであればよく、精製の程
度は問わず、例えばホスホリラーゼ，デキストランシュ
ークラーゼ，レバンシュークラーゼなどがあり、これら
を含む微生物でもよい。
糖を多糖にまで合成できるものであればよく、精製の程
度は問わず、例えばホスホリラーゼ，デキストランシュ
ークラーゼ，レバンシュークラーゼなどがあり、これら
を含む微生物でもよい。
【００１５】次に、本発明に用いるビニル基及びアミノ
基を有する化合物としては、例えばビニルベンジルアミ
ンが好適なものとして挙げられるが、この他にアクリル
アミド，アクリル酸，アクロレイン，スチレン等のビニ
ル基を持つ化合物をアミノ基を有するよう合成したもの
やアニリン，フェニルエチルアミン等のアミノ化合物を
ビニル基を持つよう誘導した化合物等も用いることがで
きる。さらに、ビニル基の代わりに重合可能あるいはシ
リカゲル等の多孔質担体に化学結合可能な反応性基を有
しているものであってもよい。このような反応性基とし
てアミノ基，アルデヒド基，イソシアネート基，エポキ
シ基，ヒドロキシル基，チオール基，カルボキシル基，
エステル基、シリルエーテル基、シラノール基等が挙げ
られる。
基を有する化合物としては、例えばビニルベンジルアミ
ンが好適なものとして挙げられるが、この他にアクリル
アミド，アクリル酸，アクロレイン，スチレン等のビニ
ル基を持つ化合物をアミノ基を有するよう合成したもの
やアニリン，フェニルエチルアミン等のアミノ化合物を
ビニル基を持つよう誘導した化合物等も用いることがで
きる。さらに、ビニル基の代わりに重合可能あるいはシ
リカゲル等の多孔質担体に化学結合可能な反応性基を有
しているものであってもよい。このような反応性基とし
てアミノ基，アルデヒド基，イソシアネート基，エポキ
シ基，ヒドロキシル基，チオール基，カルボキシル基，
エステル基、シリルエーテル基、シラノール基等が挙げ
られる。
【００１６】ラクトンを形成させるための条件について
述べると、還元末端を持つオリゴ糖、例えばマルトペン
タオースを用い、その還元末端を例えばヨウ素で酸化さ
せることを利用し、分子内エステルであるラクトンを合
成することができる。次に、該ラクトンとビニル基及び
アミノ基を有する化合物を反応させてオリゴ糖のラクト
ン部位と、該化合物のアミノ基部との間でアミド結合さ
せるための条件については、例えばビニル基及びアミノ
基を有する化合物としてビニルベンジルアミンを用い、
これを前記ラクトンとエチレングリコール中で５０〜９
０℃、好ましくは７０〜８０℃で３〜１０時間、好まし
くは５〜７時間反応させればよい。なお、ここで溶媒と
しては、エチレングリコールの他にジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など
のように糖類やビニルベンジルアミンを溶解できるもの
も使用することができる。
述べると、還元末端を持つオリゴ糖、例えばマルトペン
タオースを用い、その還元末端を例えばヨウ素で酸化さ
せることを利用し、分子内エステルであるラクトンを合
成することができる。次に、該ラクトンとビニル基及び
アミノ基を有する化合物を反応させてオリゴ糖のラクト
ン部位と、該化合物のアミノ基部との間でアミド結合さ
せるための条件については、例えばビニル基及びアミノ
基を有する化合物としてビニルベンジルアミンを用い、
これを前記ラクトンとエチレングリコール中で５０〜９
０℃、好ましくは７０〜８０℃で３〜１０時間、好まし
くは５〜７時間反応させればよい。なお、ここで溶媒と
しては、エチレングリコールの他にジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など
のように糖類やビニルベンジルアミンを溶解できるもの
も使用することができる。
【００１７】アミド結合により生成したオリゴ糖誘導体
モノマーは、後記する式（３）で表されるものであり、
これをアセトンやエタノール等により沈澱させる。この
沈澱には、該モノマーの他に未反応の糖も存在するの
で、市販のシリカゲルやオクタデシルシリル基（ＯＤ
Ｓ）が結合した担体などの充填剤を用いるカラムクロマ
ト法により、該モノマーを精製する。このようにして得
られたオリゴ糖誘導体モノマーを酵素合成のプライマー
として用いる。プライマーにＮ−ｐ−ビニルベンジル−
[ Ｏ−α−D −グルコピラノシル−（１→４)]4 −D −
グルコノアミドを使用した場合、基質にグルコース−１
−リン酸塩を、酵素にジャガイモ等から精製したホスホ
リラーゼ〔澱粉科学、第３６巻、第４号、ｐ２５７〜２
６４（１９８９）参照〕を用い、ｐＨ５〜8.５とした緩
衝液または水溶液を調製する。望ましくはｐＨ６である
が、重合度１５〜５０程度の小さいものを合成するに
は、ｐＨを６より高めのアルカリ側にし、反応速度を抑
えて行うとよい。
モノマーは、後記する式（３）で表されるものであり、
これをアセトンやエタノール等により沈澱させる。この
沈澱には、該モノマーの他に未反応の糖も存在するの
で、市販のシリカゲルやオクタデシルシリル基（ＯＤ
Ｓ）が結合した担体などの充填剤を用いるカラムクロマ
ト法により、該モノマーを精製する。このようにして得
られたオリゴ糖誘導体モノマーを酵素合成のプライマー
として用いる。プライマーにＮ−ｐ−ビニルベンジル−
[ Ｏ−α−D −グルコピラノシル−（１→４)]4 −D −
グルコノアミドを使用した場合、基質にグルコース−１
−リン酸塩を、酵素にジャガイモ等から精製したホスホ
リラーゼ〔澱粉科学、第３６巻、第４号、ｐ２５７〜２
６４（１９８９）参照〕を用い、ｐＨ５〜8.５とした緩
衝液または水溶液を調製する。望ましくはｐＨ６である
が、重合度１５〜５０程度の小さいものを合成するに
は、ｐＨを６より高めのアルカリ側にし、反応速度を抑
えて行うとよい。
【００１８】さらに、糖鎖がアミロースの場合は、反応
中あるいは精製中に該アミロースが老化し、沈澱するこ
とがあるので、これを防止する目的でＤＭＳＯを１０〜
３０％（v/v)程度加えて３０〜５５℃で合成を行う。糖
鎖の重合度は、グルコース−１−リン酸から遊離するリ
ン酸を定量するか、あるいはゲル濾過法により決定する
ことができる。目標とする重合度まで合成したならば、
反応液を１０分程度煮沸して酵素を失活させ、次いで冷
却後、浮遊物をガラスフィルター等により濾過し、エタ
ノールを反応液と等量程度（等量以上加えると、グルコ
ース−１−リン酸も沈澱する。）加え、多糖誘導体モノ
マーを沈澱させる。しかる後、遠心分離等の固−液分離
操作によって上澄みを除き、沈澱物をエタノール，エー
テルにて洗浄し、７０℃で２時間真空乾燥することによ
り、還元末端のみにビニル基が導入された多糖誘導体モ
ノマーを効率よく合成することができる。
中あるいは精製中に該アミロースが老化し、沈澱するこ
とがあるので、これを防止する目的でＤＭＳＯを１０〜
３０％（v/v)程度加えて３０〜５５℃で合成を行う。糖
鎖の重合度は、グルコース−１−リン酸から遊離するリ
ン酸を定量するか、あるいはゲル濾過法により決定する
ことができる。目標とする重合度まで合成したならば、
反応液を１０分程度煮沸して酵素を失活させ、次いで冷
却後、浮遊物をガラスフィルター等により濾過し、エタ
ノールを反応液と等量程度（等量以上加えると、グルコ
ース−１−リン酸も沈澱する。）加え、多糖誘導体モノ
マーを沈澱させる。しかる後、遠心分離等の固−液分離
操作によって上澄みを除き、沈澱物をエタノール，エー
テルにて洗浄し、７０℃で２時間真空乾燥することによ
り、還元末端のみにビニル基が導入された多糖誘導体モ
ノマーを効率よく合成することができる。
【００１９】本発明の方法により得られる多糖誘導体モ
ノマーは、上記の式（２）で表されるものであり、数平
均重合度で１５以上５００以下のものである。上限が５
００を超えるものは、ビニル基の反応性の点で問題があ
り、好ましくない。この多糖誘導体モノマーは、重合，
共重合あるいはハイドロシリレイション等によって重合
体とすることにより、前記したような様々な用途に利用
することができる。
ノマーは、上記の式（２）で表されるものであり、数平
均重合度で１５以上５００以下のものである。上限が５
００を超えるものは、ビニル基の反応性の点で問題があ
り、好ましくない。この多糖誘導体モノマーは、重合，
共重合あるいはハイドロシリレイション等によって重合
体とすることにより、前記したような様々な用途に利用
することができる。
【００２０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ 式（３）で表されるＮ−（ｐ−ビニルベンジル）−
｛Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）｝４−Ｄ
−グルコノアミド（以下、ＶＭ５Ａと略記する。）の合
成
る。 実施例１ 式（３）で表されるＮ−（ｐ−ビニルベンジル）−
｛Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）｝４−Ｄ
−グルコノアミド（以下、ＶＭ５Ａと略記する。）の合
成
【００２１】
【化６】
【００２２】ヨウ素9.３ｇをメタノール７０ｍｌに溶解
し、これにマルトペンタオース１５ｇを適量の蒸留水に
溶解して加え、さらに４％ＫＯＨ−メタノール溶液２４
０ｍｌを滴下し、４０℃で１５分間攪拌した。反応液を
氷浴に入れて生成物を沈澱させたのち、濾別し、次いで
２００ｍｌの蒸留水に溶解し、活性炭粉末を加えて過剰
のヨウ素を除いてから濾過し、得られた濾液を凍結乾燥
した。
し、これにマルトペンタオース１５ｇを適量の蒸留水に
溶解して加え、さらに４％ＫＯＨ−メタノール溶液２４
０ｍｌを滴下し、４０℃で１５分間攪拌した。反応液を
氷浴に入れて生成物を沈澱させたのち、濾別し、次いで
２００ｍｌの蒸留水に溶解し、活性炭粉末を加えて過剰
のヨウ素を除いてから濾過し、得られた濾液を凍結乾燥
した。
【００２３】次に、この乾燥物を蒸留水１００ｍｌに溶
解し、アンバーライト１２０−Ｂ（Ｈ型）２００ｍｇ当
量で処理し、濃縮後、凍結乾燥してラクトン１3.３ｇを
得た。このものは、図１の赤外線吸収スペクトルより１
７４０ｃｍ-1にラクトンのＣ＝Ｏ間の伸縮振動が認めら
れ、また13Ｃ−ＮＭＲ分析より９２〜９７ｐｐｍ付近に
存在した還元末端１位の炭素が１７0.８ｐｐｍにシフト
したことから｛Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）｝4 −Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン（以下、ラ
クトン５Ｍと略記する。）と確認した。
解し、アンバーライト１２０−Ｂ（Ｈ型）２００ｍｇ当
量で処理し、濃縮後、凍結乾燥してラクトン１3.３ｇを
得た。このものは、図１の赤外線吸収スペクトルより１
７４０ｃｍ-1にラクトンのＣ＝Ｏ間の伸縮振動が認めら
れ、また13Ｃ−ＮＭＲ分析より９２〜９７ｐｐｍ付近に
存在した還元末端１位の炭素が１７0.８ｐｐｍにシフト
したことから｛Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）｝4 −Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン（以下、ラ
クトン５Ｍと略記する。）と確認した。
【００２４】得られたラクトン５Ｍ １3.３ｇをエチレ
ングリコール７０ｍｌに溶解し、これにｐ−ビニルベン
ジルアミン2.２ｇをエチレングリコール１５ｍｌで希釈
したものを添加して７０℃で６時間反応させた。生成物
をアセトン1.５リットル中に沈澱させ、アセトン８００
ｍｌで洗浄し、未反応のビニルベンジルアミンを除い
た。次いで、６０℃で３時間減圧乾燥を行い１0.１ｇの
ＶＭ５Ａを得た。図２の赤外線吸収スペクトルより１５
４０ｃｍ-1及び１６４０ｃｍ-1に第２級酸アミドのＮ−
Ｈの変角振動とＣ＝Ｏの伸縮振動が認められた。
ングリコール７０ｍｌに溶解し、これにｐ−ビニルベン
ジルアミン2.２ｇをエチレングリコール１５ｍｌで希釈
したものを添加して７０℃で６時間反応させた。生成物
をアセトン1.５リットル中に沈澱させ、アセトン８００
ｍｌで洗浄し、未反応のビニルベンジルアミンを除い
た。次いで、６０℃で３時間減圧乾燥を行い１0.１ｇの
ＶＭ５Ａを得た。図２の赤外線吸収スペクトルより１５
４０ｃｍ-1及び１６４０ｃｍ-1に第２級酸アミドのＮ−
Ｈの変角振動とＣ＝Ｏの伸縮振動が認められた。
【００２５】また、13Ｃ−ＮＭＲ分析よりアミド結合に
供する炭素原子（Ｃ）のケミカルシフトが１７２ｐｐｍ
付近に、また末端の糖が開環したことにより低磁場シフ
トした６位及び４位のＣが６2.７ｐｐｍ、８2.５ｐｐｍ
付近に認められること及びベンゼン環に結合したビニル
基の化学シフトが１１3.７ｐｐｍ、１３6.４ｐｐｍ付近
に認められることからＶＭ５Ａの構造が示唆される。な
お、ここで用いたｐ−ビニルベンジルアミンはPolymer
Journal, vol. 15,NO.9, p667〜671(1983) を参考にし
て合成した。また、ＶＭ５ＡはMacromolecules, vol.2
0,No.4,p906〜908(1987) を参考にして合成した。
供する炭素原子（Ｃ）のケミカルシフトが１７２ｐｐｍ
付近に、また末端の糖が開環したことにより低磁場シフ
トした６位及び４位のＣが６2.７ｐｐｍ、８2.５ｐｐｍ
付近に認められること及びベンゼン環に結合したビニル
基の化学シフトが１１3.７ｐｐｍ、１３6.４ｐｐｍ付近
に認められることからＶＭ５Ａの構造が示唆される。な
お、ここで用いたｐ−ビニルベンジルアミンはPolymer
Journal, vol. 15,NO.9, p667〜671(1983) を参考にし
て合成した。また、ＶＭ５ＡはMacromolecules, vol.2
0,No.4,p906〜908(1987) を参考にして合成した。
【００２６】式（２）で表されるＮ−（ｐ−ビニルベ
ンジル）−〔Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）〕n-1 −Ｄ−グルコノアミド（ｎは平均で１５以上
５００以下の整数を示す。）（以下、ＶＡＡと略記す
る。）の合成 上記で得られたＶＭ５Ａ １０ｇに僅かに含まれる未
反応のオリゴ糖を除くため、高速液体クロマトグラフィ
ーシステム（ウォーターズ社製）を用いて、カラムにＹ
ＭＣ社製ＯＤＳ（Ｓ−５ １２０Ａ ＡＱ）カラム２０
φ×２５０を使用し、示差屈折検出器を用いて移動層を
水：アセトニトリル＝７８：２２とし、流速６ｍｌ／ｍ
ｉｎで２０分あたりに出てくるピークを分取、精製し、
ＶＭ５Ａ4.５ｇを得た。
ンジル）−〔Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）〕n-1 −Ｄ−グルコノアミド（ｎは平均で１５以上
５００以下の整数を示す。）（以下、ＶＡＡと略記す
る。）の合成 上記で得られたＶＭ５Ａ １０ｇに僅かに含まれる未
反応のオリゴ糖を除くため、高速液体クロマトグラフィ
ーシステム（ウォーターズ社製）を用いて、カラムにＹ
ＭＣ社製ＯＤＳ（Ｓ−５ １２０Ａ ＡＱ）カラム２０
φ×２５０を使用し、示差屈折検出器を用いて移動層を
水：アセトニトリル＝７８：２２とし、流速６ｍｌ／ｍ
ｉｎで２０分あたりに出てくるピークを分取、精製し、
ＶＭ５Ａ4.５ｇを得た。
【００２７】このようにして得られたＶＭ５Ａ 1.０８
ｇをプライマーとしてＤＭＳＯ １２０ｍｌを含む0.１
Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ7.５）４８３ｍｌにグルコー
ス−１−リン酸カリウム１４ｇを加えてジャガイモ由来
のホスホリラーゼ８０Ｕを加え、４５℃で１０時間反応
後煮沸し、酵素を失活させた。冷却後、浮遊物を濾過に
より除いたのち濾液にエタノールを加えて多糖誘導体モ
ノマーであるＶＡＡを沈澱させ、遠心分離により上澄み
を除き、さらにエタノール及びエーテルで洗浄し、精製
後、７０℃で真空乾燥により２ｇのＶＡＡを得た。
ｇをプライマーとしてＤＭＳＯ １２０ｍｌを含む0.１
Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ7.５）４８３ｍｌにグルコー
ス−１−リン酸カリウム１４ｇを加えてジャガイモ由来
のホスホリラーゼ８０Ｕを加え、４５℃で１０時間反応
後煮沸し、酵素を失活させた。冷却後、浮遊物を濾過に
より除いたのち濾液にエタノールを加えて多糖誘導体モ
ノマーであるＶＡＡを沈澱させ、遠心分離により上澄み
を除き、さらにエタノール及びエーテルで洗浄し、精製
後、７０℃で真空乾燥により２ｇのＶＡＡを得た。
【００２８】遊離したリン酸をＦｉｓｋ ａｎｄ Ｓｕ
ｂｂａｒｏｗ法により定量することにより算出される上
記モノマーの数平均重合度はｎ＝２０であった。得られ
たＶＡＡの 1Ｈ−ＮＭＲ測定〔溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ6,Ｖ
ＡＡ濃度5%(w/v),基準物質ＴＭＳ，７０℃，２７０ＭＨ
Z 〕を図３に示した。この図より、ＶＡＡは式（２）で
表されるものであることを確認した。また、 1Ｈ−ＮＭ
Ｒ測定から算出した糖部の平均重合度は２８であった。
なお、使用したホスホリラーゼの精製は常法により行っ
た。
ｂｂａｒｏｗ法により定量することにより算出される上
記モノマーの数平均重合度はｎ＝２０であった。得られ
たＶＡＡの 1Ｈ−ＮＭＲ測定〔溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ6,Ｖ
ＡＡ濃度5%(w/v),基準物質ＴＭＳ，７０℃，２７０ＭＨ
Z 〕を図３に示した。この図より、ＶＡＡは式（２）で
表されるものであることを確認した。また、 1Ｈ−ＮＭ
Ｒ測定から算出した糖部の平均重合度は２８であった。
なお、使用したホスホリラーゼの精製は常法により行っ
た。
【００２９】実施例２ 実施例１と同様にして得たＶＭ５Ａ ４１ｍｇをプラ
イマーとしてＤＭＳＯ３５ｍｌを含む0.１Ｍマレイン酸
緩衝液（ｐＨ7.２）１３５ｍｌにグルコース−１−リン
酸カリウム４ｇを加えてジャガイモ由来のホスホリラー
ゼ４５Ｕを加え、４５℃で１８時間反応後煮沸し、酵素
を失活させた。冷却後、浮遊物を濾過により除いたのち
濾液にエタノールを加えて多糖誘導体モノマーであるＶ
ＡＡを沈澱させ、遠心分離により上澄みを除き、さらに
エタノール及びエーテルで洗浄し、精製後、７０℃で真
空乾燥により0.９５ｇのＶＡＡを得た。
イマーとしてＤＭＳＯ３５ｍｌを含む0.１Ｍマレイン酸
緩衝液（ｐＨ7.２）１３５ｍｌにグルコース−１−リン
酸カリウム４ｇを加えてジャガイモ由来のホスホリラー
ゼ４５Ｕを加え、４５℃で１８時間反応後煮沸し、酵素
を失活させた。冷却後、浮遊物を濾過により除いたのち
濾液にエタノールを加えて多糖誘導体モノマーであるＶ
ＡＡを沈澱させ、遠心分離により上澄みを除き、さらに
エタノール及びエーテルで洗浄し、精製後、７０℃で真
空乾燥により0.９５ｇのＶＡＡを得た。
【００３０】遊離したリン酸をＦｉｓｋ ａｎｄ Ｓｕ
ｂｂａｒｏｗ法により定量することにより算出される上
記モノマーの数平均重合度はｎ＝１４３であった。得ら
れたＶＡＡをゲル濾過法（分子量スタンダードは、
（株）中埜酢店製のアミロースを使用）により数平均重
合度を求めたところ、ｎ＝１５５であった。また、ゲル
濾過法において、検出器として示差屈折計検出器（ＲＩ
検出器）と紫外分光光度計（ＵＶ検出器）を直列に接続
したものを用い、分析した。なお、測定条件は以下の通
りである。
ｂｂａｒｏｗ法により定量することにより算出される上
記モノマーの数平均重合度はｎ＝１４３であった。得ら
れたＶＡＡをゲル濾過法（分子量スタンダードは、
（株）中埜酢店製のアミロースを使用）により数平均重
合度を求めたところ、ｎ＝１５５であった。また、ゲル
濾過法において、検出器として示差屈折計検出器（ＲＩ
検出器）と紫外分光光度計（ＵＶ検出器）を直列に接続
したものを用い、分析した。なお、測定条件は以下の通
りである。
【００３１】カラム：TOSOH G6000PWXL + G3000PWXL カラムサイズ:7.8mm ID × 30.0cm 流速:0.7ml/min, 圧力:20.0kg/cm2 注入量:40 μg/20μl, 温度:55 ℃ 溶出液:0.25M KCl水溶液 検出器:SHIMADZU RID-6A, RANGE 8 ×10-5RIU (図4) SHIMADZU SPD-6A, UV280nm, ABSORBANCE 0.04 (図5) 記録計:SIC CHROMATOCORDER 12 (図4) SHIMADZU CR-6A (図5)
【００３２】結果を図４及び図５に示す。紫外分光光度
計において、アミロースでは見られないＵＶ２８０ｎｍ
に吸収ピークが認められたことより、ＶＡＡであること
を確認した。
計において、アミロースでは見られないＵＶ２８０ｎｍ
に吸収ピークが認められたことより、ＶＡＡであること
を確認した。
【００３３】
【発明の効果】本発明により得られる多糖誘導体モノマ
ーは、重合，共重合あるいはハイドロシリレイション等
の方法を用いることにより高分子化し、新規細胞培養基
材，ドラッグデリバリーの原料，分解性プラスチック，
分離膜，電気泳動用ゲルの材料，光学分割用分離剤の材
料等としての利用が期待される。
ーは、重合，共重合あるいはハイドロシリレイション等
の方法を用いることにより高分子化し、新規細胞培養基
材，ドラッグデリバリーの原料，分解性プラスチック，
分離膜，電気泳動用ゲルの材料，光学分割用分離剤の材
料等としての利用が期待される。
【図１】 実施例１におけるラクトンの赤外線吸収スペ
クトルである。
クトルである。
【図２】 実施例１におけるＶＭ５Ａの赤外線吸収スペ
クトルである。
クトルである。
【図３】 実施例１におけるＶＡＡの1 Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルである。
クトルである。
【図４】 実施例２におけるＶＡＡのＲＩ検出結果を示
す。
す。
【図５】 実施例２におけるＶＡＡのＵＶ検出結果を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 赤野 裕文 愛知県半田市有脇町２−46−28 (72)発明者 川村 吉也 愛知県江南市古知野町古渡132 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64
Claims (2)
- 【請求項１】 重合度３以上１０以下のオリゴ糖の還元
末端部位のアルデヒド基を酸化してラクトンを形成さ
せ、次いで式（１）で表されるビニル基及びアミノ基を
有する化合物 【化１】 を反応させ、オリゴ糖のラクトン部位と該化合物のアミ
ノ基部との間でアミド結合させた後、ホスホリラーゼ、
デキストランシュークラーゼ及びレバンシュークラーゼ
の中から選ばれた酵素を作用させ、結合した重合度３以
上１０以下の多糖部位を数平均重合度１５以上５００以
下の多糖にまで合成することを特徴とする式（２）で表
される多糖誘導体モノマーの製造法。 【化２】 - 【請求項２】 酵素としてホスホリラーゼを用いて酵素
合成を行う際に、反応液中にジメチルスルホキシドを１
０〜３０％（ｖ／ｖ）添加することを特徴とする請求項
１記載の多糖誘導体モノマーの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35879792A JP3148029B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 多糖誘導体モノマーの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35879792A JP3148029B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 多糖誘導体モノマーの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06199883A JPH06199883A (ja) | 1994-07-19 |
| JP3148029B2 true JP3148029B2 (ja) | 2001-03-19 |
Family
ID=18461165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35879792A Expired - Fee Related JP3148029B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 多糖誘導体モノマーの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3148029B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5672892B2 (ja) * | 2009-09-18 | 2015-02-18 | 学校法人東京理科大学 | リガンド固定化用共重合体及び該共重合体によるリガンドの固定化方法 |
| TWI652282B (zh) * | 2017-06-20 | 2019-03-01 | 台光電子材料股份有限公司 | 乙烯基改質馬來醯亞胺、組成物及其製品 |
-
1992
- 1992-12-28 JP JP35879792A patent/JP3148029B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06199883A (ja) | 1994-07-19 |
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