JP3139777B2 - 組換えダニアレルゲン - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アレルゲン活性を有す
る組換えダニアレルゲンに関するものである。
る組換えダニアレルゲンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原
因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とさ
れ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入
性アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こされる疾
患においては、その評価は今や確立されたものといえ
る。しかしながら、この減感作療法では感作抗原による
アナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の
投与が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進めら
れている。
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原
因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とさ
れ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入
性アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こされる疾
患においては、その評価は今や確立されたものといえ
る。しかしながら、この減感作療法では感作抗原による
アナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の
投与が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進めら
れている。
【０００３】ダニアレルギー疾患については、ヤケヒョ
ウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種のダ
ニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると報告
されている〔Allerg. Asthma, 10, 329 〜334 (1964);
J. Allergy, 42, 14〜 28 (1968)] 。これらのダニか
ら、主要ダニアレルゲンが分画され、それらはダニ***
物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量24-28k
D の糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、及び／又は分子量14.5-20k
D の蛋白（pI 5〜7.2)であると報告されている〔J. Imm
unol.,125, 587〜592 (1980); J. Allergy Clin. Immun
ol.,76, 753 〜761 (1985); Immunol., 46, 679 〜687
(1982); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214
〜223 (1986); J. Allergy Clin. Immunol.,75, 686 〜
692 (1985)等〕。しかし、減感作治療用抗原として有効
かつ安全なものは、未だ得られていないのが実情であ
る。
ウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種のダ
ニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると報告
されている〔Allerg. Asthma, 10, 329 〜334 (1964);
J. Allergy, 42, 14〜 28 (1968)] 。これらのダニか
ら、主要ダニアレルゲンが分画され、それらはダニ***
物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量24-28k
D の糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、及び／又は分子量14.5-20k
D の蛋白（pI 5〜7.2)であると報告されている〔J. Imm
unol.,125, 587〜592 (1980); J. Allergy Clin. Immun
ol.,76, 753 〜761 (1985); Immunol., 46, 679 〜687
(1982); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214
〜223 (1986); J. Allergy Clin. Immunol.,75, 686 〜
692 (1985)等〕。しかし、減感作治療用抗原として有効
かつ安全なものは、未だ得られていないのが実情であ
る。
【０００４】ダニアレルゲンの遺伝子クローニングとし
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer p
I (分子量：25,371) 及びDer p II (分子量：14,131と
17,460) について、また、コナヒョウヒダニの主要アレ
ルゲンであるDer f II（開始コドン未同定のため分子量
未定）についても、それぞれの遺伝子がクローニングさ
れ塩基配列も決定されており〔Int. Arch. Allergy App
l. Immunol., 85, 127〜129 (1988); J. Exp. Med., 1
67, 175 〜182 (1988); J. Exp. Med., 170, 1457 〜14
62 (1989); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91,
118 〜123 (1990); Int. Arch. Allergy Appl. Immuno
l., 91, 124〜129 (1990);Jpn. J. Allergol., 39, 557
〜561 (1990)〕、遺伝子組換え技術によるダニアレルゲ
ンの研究が試みられている。しかしながら、未だ感作抗
原として使用し得るものは得られていない。
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer p
I (分子量：25,371) 及びDer p II (分子量：14,131と
17,460) について、また、コナヒョウヒダニの主要アレ
ルゲンであるDer f II（開始コドン未同定のため分子量
未定）についても、それぞれの遺伝子がクローニングさ
れ塩基配列も決定されており〔Int. Arch. Allergy App
l. Immunol., 85, 127〜129 (1988); J. Exp. Med., 1
67, 175 〜182 (1988); J. Exp. Med., 170, 1457 〜14
62 (1989); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91,
118 〜123 (1990); Int. Arch. Allergy Appl. Immuno
l., 91, 124〜129 (1990);Jpn. J. Allergol., 39, 557
〜561 (1990)〕、遺伝子組換え技術によるダニアレルゲ
ンの研究が試みられている。しかしながら、未だ感作抗
原として使用し得るものは得られていない。
【０００５】一方、ダニアレルギー疾患の診断方法とし
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験
が殆どであり、まれに、RAST(radio allergosorbent t
est)法による血清中のIgE 抗体価（相対値）の測定、吸
入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であり、ダ
ニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難で
あった。
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験
が殆どであり、まれに、RAST(radio allergosorbent t
est)法による血清中のIgE 抗体価（相対値）の測定、吸
入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であり、ダ
ニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難で
あった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。しかしながら、このような安全で確実に奏効
するに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダ
ニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法
では、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困
難である。
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。しかしながら、このような安全で確実に奏効
するに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダ
ニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法
では、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困
難である。
【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダ
ニアレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第
１の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得ら
れるアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンを提
供することにある。本発明の第２の目的は、該ダニアレ
ルゲンをコードする遺伝子を提供することにある。本発
明の第３の目的は、アレルゲン活性を有する活性断片と
してのダニアレルゲン断片を提供することにある。本発
明の第４の目的は、ダニアレルゲンに含まれるエピトー
プを有するポリペプチド、又は該エピトープと免疫学的
に同一であるとみなされ得るエピトープを有するポリペ
プチドを提供することにある。本発明の第５の目的は、
前記のエピトープを有するポリペプチドをコードする遺
伝子を提供することにある。本発明の第６の目的は、本
発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターを提供するこ
とにある。本発明の第７の目的は、該遺伝子を発現させ
得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供す
ることにある。本発明の第８の目的は、該組換えダニア
レルゲンの製造方法を提供することにある。本発明の第
９の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有効成分
とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供すること
にある。本発明の第10の目的は、本発明の組換えダニア
レルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患診
断薬を提供することにある。本発明の第11の目的は、本
発明のダニアレルゲン断片を有効成分とする新規なダニ
アレルギー疾患治療剤を提供することにある。本発明の
第12の目的は、本発明のダニアレルゲン断片を有効成分
とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供すること
にある。本発明の第13の目的は、本発明のエピトープを
有するポリペプチドを有効成分とする新規なダニアレル
ギー疾患治療剤を提供することにある。本発明の第14の
目的は、本発明のエピトープを有するポリペプチドを有
効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供す
ることにある。
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダ
ニアレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第
１の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得ら
れるアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンを提
供することにある。本発明の第２の目的は、該ダニアレ
ルゲンをコードする遺伝子を提供することにある。本発
明の第３の目的は、アレルゲン活性を有する活性断片と
してのダニアレルゲン断片を提供することにある。本発
明の第４の目的は、ダニアレルゲンに含まれるエピトー
プを有するポリペプチド、又は該エピトープと免疫学的
に同一であるとみなされ得るエピトープを有するポリペ
プチドを提供することにある。本発明の第５の目的は、
前記のエピトープを有するポリペプチドをコードする遺
伝子を提供することにある。本発明の第６の目的は、本
発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターを提供するこ
とにある。本発明の第７の目的は、該遺伝子を発現させ
得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供す
ることにある。本発明の第８の目的は、該組換えダニア
レルゲンの製造方法を提供することにある。本発明の第
９の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有効成分
とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供すること
にある。本発明の第10の目的は、本発明の組換えダニア
レルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患診
断薬を提供することにある。本発明の第11の目的は、本
発明のダニアレルゲン断片を有効成分とする新規なダニ
アレルギー疾患治療剤を提供することにある。本発明の
第12の目的は、本発明のダニアレルゲン断片を有効成分
とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供すること
にある。本発明の第13の目的は、本発明のエピトープを
有するポリペプチドを有効成分とする新規なダニアレル
ギー疾患治療剤を提供することにある。本発明の第14の
目的は、本発明のエピトープを有するポリペプチドを有
効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供す
ることにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ダニ虫体から
強いアレルゲン活性を有するダニアレルゲンをコードす
る遺伝子を見出し、更に研究を重ねて本発明を完成し
た。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ダニ虫体から
強いアレルゲン活性を有するダニアレルゲンをコードす
る遺伝子を見出し、更に研究を重ねて本発明を完成し
た。
【０００９】即ち、本発明の要旨は、 （１）ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、
以下の部分的アミノ酸配列（配列番号：１）、又は該ア
ミノ酸配列において、１個若しくは複数のアミノ酸に、
置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を
含むアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン、 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile （２）ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、
以下のアミノ酸配列（配列番号：２）、又は該アミノ酸
配列において、１個若しくは複数のアミノ酸に、置換、
欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むア
レルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン、 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn （３）前記（１）又は (２) 記載のアミノ酸配列を含む
アレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫
体由来の遺伝子、 (４) 配列番号：２に記載の塩基配列において、少なく
とも塩基番号：１３７〜２３７、塩基番号：２３７〜３
６７または塩基番号：１３７〜３６７にコードされてい
るアミノ酸配列を含有してなるダニアレルゲン断片、 （５) ダニアレルゲンに含まれるエピトープを有するポ
リペプチド、又は該エピトープと免疫学的に同一である
とみなされ得るエピトープを有するポリペプチド、 （６）前記（５）記載のポリペプチドをコードしている
遺伝子、 （７）前記（３）又は（５）記載の遺伝子を発現させ得
る発現ベクター、 （８）前記（７）記載の発現ベクターで形質転換された
細菌、酵母又は哺乳動物細胞、 （９）前記（８）記載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を
該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニア
レルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを
回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造
方法、に関する。
以下の部分的アミノ酸配列（配列番号：１）、又は該ア
ミノ酸配列において、１個若しくは複数のアミノ酸に、
置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を
含むアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン、 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile （２）ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、
以下のアミノ酸配列（配列番号：２）、又は該アミノ酸
配列において、１個若しくは複数のアミノ酸に、置換、
欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むア
レルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン、 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn （３）前記（１）又は (２) 記載のアミノ酸配列を含む
アレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫
体由来の遺伝子、 (４) 配列番号：２に記載の塩基配列において、少なく
とも塩基番号：１３７〜２３７、塩基番号：２３７〜３
６７または塩基番号：１３７〜３６７にコードされてい
るアミノ酸配列を含有してなるダニアレルゲン断片、 （５) ダニアレルゲンに含まれるエピトープを有するポ
リペプチド、又は該エピトープと免疫学的に同一である
とみなされ得るエピトープを有するポリペプチド、 （６）前記（５）記載のポリペプチドをコードしている
遺伝子、 （７）前記（３）又は（５）記載の遺伝子を発現させ得
る発現ベクター、 （８）前記（７）記載の発現ベクターで形質転換された
細菌、酵母又は哺乳動物細胞、 （９）前記（８）記載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を
該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニア
レルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを
回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造
方法、に関する。
【００１０】本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫
体由来の遺伝子の発現によって得られるものであり、こ
こで用いられるダニは特に限定されるものではないが、
屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダ
ニ等が用いられる。
体由来の遺伝子の発現によって得られるものであり、こ
こで用いられるダニは特に限定されるものではないが、
屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダ
ニ等が用いられる。
【００１１】本発明の組換えダニアレルゲンは、部分的
アミノ酸配列として以下の配列（配列番号：１）を含ん
でいる蛋白質であって、アレルゲン活性を有するもので
ある。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile
アミノ酸配列として以下の配列（配列番号：１）を含ん
でいる蛋白質であって、アレルゲン活性を有するもので
ある。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile
【００１２】さらに、前記部分的アミノ酸配列を含む次
のようなアミノ酸配列（配列番号：２）を含む蛋白質で
あって、アレルゲン活性を有するものである。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn
のようなアミノ酸配列（配列番号：２）を含む蛋白質で
あって、アレルゲン活性を有するものである。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn
【００１３】また、本発明の組換えダニアレルゲンは、
前記アミノ酸配列のうち１個又は複数のアミノ酸の置
換、欠失、付加又は転位によって種々変異されたもので
あっても、アレルゲン活性を有するものは本発明の組換
えダニアレルゲンに含まれる。このような変異体は、天
然のアレル変異体又は組換えＤＮＡ技術により、例えば
ＤＮＡの特定の部位に突然変異を誘発することにより得
られる。
前記アミノ酸配列のうち１個又は複数のアミノ酸の置
換、欠失、付加又は転位によって種々変異されたもので
あっても、アレルゲン活性を有するものは本発明の組換
えダニアレルゲンに含まれる。このような変異体は、天
然のアレル変異体又は組換えＤＮＡ技術により、例えば
ＤＮＡの特定の部位に突然変異を誘発することにより得
られる。
【００１４】本発明の組換えダニアレルゲンには、他の
蛋白質との融合蛋白として発現されたものも含まれる。
本明細書では、他の蛋白質と融合して発現した組換えダ
ニアレルゲンを特に融合組換えダニアレルゲンという場
合がある。融合する他の蛋白質としては特に限定されな
いが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ等が挙げられ
る。
蛋白質との融合蛋白として発現されたものも含まれる。
本明細書では、他の蛋白質と融合して発現した組換えダ
ニアレルゲンを特に融合組換えダニアレルゲンという場
合がある。融合する他の蛋白質としては特に限定されな
いが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ等が挙げられ
る。
【００１５】本発明の組換えダニアレルゲンは、アレル
ゲン活性に必須な領域のみの蛋白質断片であってもよ
く、また、アレルゲン活性に必須なドメインからなるも
のであってもよい。例えば、本明細書においては、アレ
ルゲン活性を有する活性断片を、ダニアレルゲン断片と
いうが、具体的には図１０において示される塩基配列に
おいて、少なくとも上流より約170bp 〜約270bp 、約27
0bp 〜約400bp または約170bp 〜約400bp の領域内にコ
ードされているアミノ酸配列を含有してなる断片が挙げ
られる。また、ダニアレルゲン蛋白質のみを発現させて
得られたものの他に、融合蛋白質として発現したものか
ら他の蛋白質を脱離せしめて得られたものでもよい。
ゲン活性に必須な領域のみの蛋白質断片であってもよ
く、また、アレルゲン活性に必須なドメインからなるも
のであってもよい。例えば、本明細書においては、アレ
ルゲン活性を有する活性断片を、ダニアレルゲン断片と
いうが、具体的には図１０において示される塩基配列に
おいて、少なくとも上流より約170bp 〜約270bp 、約27
0bp 〜約400bp または約170bp 〜約400bp の領域内にコ
ードされているアミノ酸配列を含有してなる断片が挙げ
られる。また、ダニアレルゲン蛋白質のみを発現させて
得られたものの他に、融合蛋白質として発現したものか
ら他の蛋白質を脱離せしめて得られたものでもよい。
【００１６】要約すれば、本発明の組換えダニアレルゲ
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる前
記のアミノ酸配列を実質的に含んでいる、アレルゲン活
性を有する蛋白質である。
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる前
記のアミノ酸配列を実質的に含んでいる、アレルゲン活
性を有する蛋白質である。
【００１７】本発明の組換えダニアレルゲンとして、大
腸菌で発現されたβ−ガラクトシダーゼとの融合組換え
ダニアレルゲンが以下のように例示される。即ち、大腸
菌で発現された融合組換えダニアレルゲンは、Ultrogel
AcA 44 （ＬＫＢ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラ
フィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニテ
ィクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィ
ニティクロマトグラフィーで精製され、組換えダニアレ
ルゲンとして下記のような性質を持つ。 色及び性状：白色 水溶性 ：易溶性 分子量 ：約40,000である。 SDS-PAGEで｛（融合蛋白質の分子量）−（β−ガラクト
シダーゼの分子量）｝で見積もる。 部分的アミノ酸配列（配列番号：１）として次のも
のを含む。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile あるいは、前記部分的アミノ酸配列（配列番号：１）を
含む、次のアミノ酸配列（配列番号：２）を含むもので
ある。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn 抗原性を有する。ダニアレルギー患者プール血清中
の特異IgG 、ウサギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗β−ガラ
クトシダーゼとのELISA 反応性及び発現蛋白のSDS-PAGE
後、ニトロセルロース膜にブロットし上記抗血清との反
応性により判断する。 アレルゲン活性を有する。HP
LC(High performance liquid chromatography)を用いた
ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により判
断する。 アナフィラキシー反応を誘導しない。常法
により、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質でモル
モットを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反応に
ついて観察する。
腸菌で発現されたβ−ガラクトシダーゼとの融合組換え
ダニアレルゲンが以下のように例示される。即ち、大腸
菌で発現された融合組換えダニアレルゲンは、Ultrogel
AcA 44 （ＬＫＢ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラ
フィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニテ
ィクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィ
ニティクロマトグラフィーで精製され、組換えダニアレ
ルゲンとして下記のような性質を持つ。 色及び性状：白色 水溶性 ：易溶性 分子量 ：約40,000である。 SDS-PAGEで｛（融合蛋白質の分子量）−（β−ガラクト
シダーゼの分子量）｝で見積もる。 部分的アミノ酸配列（配列番号：１）として次のも
のを含む。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile あるいは、前記部分的アミノ酸配列（配列番号：１）を
含む、次のアミノ酸配列（配列番号：２）を含むもので
ある。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn 抗原性を有する。ダニアレルギー患者プール血清中
の特異IgG 、ウサギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗β−ガラ
クトシダーゼとのELISA 反応性及び発現蛋白のSDS-PAGE
後、ニトロセルロース膜にブロットし上記抗血清との反
応性により判断する。 アレルゲン活性を有する。HP
LC(High performance liquid chromatography)を用いた
ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により判
断する。 アナフィラキシー反応を誘導しない。常法
により、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質でモル
モットを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反応に
ついて観察する。
【００１８】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、生ダニ
虫体からｍＲＮＡを調製し、そのｍＲＮＡを鋳型として
常法によりｃＤＮＡを合成することにより得られるが、
分子中に前記のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているものであり、該部分的アミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡとしては、具体的には
以下のような配列（配列番号：１）が例示される。 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT GCA TCG ATC あるいは、前記塩基配列を含む、次のような塩基配列
（配列番号：２）が例示される。 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT GCA TCG ATC GTA AAC CCA CGA TTG TCA TGG CAT CAA TAC ACG AAA CGC GAT TCT CGT GAA TAC AAG AGT GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCG GAC ATT GCT CTC AAG ATT ACG ATG CCT GAT TAT AAT TCG AAA ATT CAT TAT TCA CGA CAA GGT GAT CAA ATC AAC ATG GAC ATC GAT GGT ACA TTG ATC GAA GGT CAT GCA CAA GGA ACC ATC AGA GAA GGT AAA ATC CAC ATT AAA GGT AGA CAA ACT GAT TTC GAG ATC GAA TCC AAC TAC CGA TAC GAA GAT GGC AAA CTA ATC ATC GAA CCG GTC AAG AGT GAA AAT GGC AAA TTG GAA GGC GTT CTT TCC CGT AAG GTG CCA TCA CAT CTG ACA CTA GAA ACA CCA CGA GTC AAG ATG AAT ATG AAA TAT GAT CGA TAT GCA CCA GTC AAA GTG TTC AAA TTG GAT TAT GAT GGC ATC CAC TTC GAG AAA CAT ACC GAT ATT GAA TAC GAA CCT GGC GTT CGA TAC AAG ATC ATC GGC AAT GGA AAA CTC AAG GAT GAT GGC CGC CAC TAT TCT ATC GAT GTG CAA GGT ATT CCA CGC AAA GCA TTC AAT CTG GAC GCT GAC TTG ATG GAT TTC AAA CTG AAA GTG AGC AAG CCA GAA GAT AGC AAT AAA GCT CAA TTC AGC TAC ACA TTC AAC GAA TAT ACC GAG ACC GAA GAA TAT GAA TTC GAT CCA CAT CGT GCC TAT TAT GTT AAT TGG TTG AGT TCC ATT CGC AAA TAC ATC CAG AAT TTC ATC GTC GAA GAC AAC このＤＮＡ配列は、前記のDer p I 、Der p II及びDer
f III について報告されているものと比較して相同性の
ないものである。
虫体からｍＲＮＡを調製し、そのｍＲＮＡを鋳型として
常法によりｃＤＮＡを合成することにより得られるが、
分子中に前記のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているものであり、該部分的アミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡとしては、具体的には
以下のような配列（配列番号：１）が例示される。 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT GCA TCG ATC あるいは、前記塩基配列を含む、次のような塩基配列
（配列番号：２）が例示される。 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT GCA TCG ATC GTA AAC CCA CGA TTG TCA TGG CAT CAA TAC ACG AAA CGC GAT TCT CGT GAA TAC AAG AGT GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCG GAC ATT GCT CTC AAG ATT ACG ATG CCT GAT TAT AAT TCG AAA ATT CAT TAT TCA CGA CAA GGT GAT CAA ATC AAC ATG GAC ATC GAT GGT ACA TTG ATC GAA GGT CAT GCA CAA GGA ACC ATC AGA GAA GGT AAA ATC CAC ATT AAA GGT AGA CAA ACT GAT TTC GAG ATC GAA TCC AAC TAC CGA TAC GAA GAT GGC AAA CTA ATC ATC GAA CCG GTC AAG AGT GAA AAT GGC AAA TTG GAA GGC GTT CTT TCC CGT AAG GTG CCA TCA CAT CTG ACA CTA GAA ACA CCA CGA GTC AAG ATG AAT ATG AAA TAT GAT CGA TAT GCA CCA GTC AAA GTG TTC AAA TTG GAT TAT GAT GGC ATC CAC TTC GAG AAA CAT ACC GAT ATT GAA TAC GAA CCT GGC GTT CGA TAC AAG ATC ATC GGC AAT GGA AAA CTC AAG GAT GAT GGC CGC CAC TAT TCT ATC GAT GTG CAA GGT ATT CCA CGC AAA GCA TTC AAT CTG GAC GCT GAC TTG ATG GAT TTC AAA CTG AAA GTG AGC AAG CCA GAA GAT AGC AAT AAA GCT CAA TTC AGC TAC ACA TTC AAC GAA TAT ACC GAG ACC GAA GAA TAT GAA TTC GAT CCA CAT CGT GCC TAT TAT GTT AAT TGG TTG AGT TCC ATT CGC AAA TAC ATC CAG AAT TTC ATC GTC GAA GAC AAC このＤＮＡ配列は、前記のDer p I 、Der p II及びDer
f III について報告されているものと比較して相同性の
ないものである。
【００１９】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、ｃＤＮ
Ａの全塩基鎖長が約1.2kbp（アガロース電気泳動法、但
し、リンカーを除くと1143bp (約1.1kbp) であるが、実
際の発現では、その前の停止コドンで終了するので、翻
訳される塩基鎖長は、停止コドンを含めて1026bp (約１
kbp)である）であって、図４に示す制限酵素地図を有す
るものである。
Ａの全塩基鎖長が約1.2kbp（アガロース電気泳動法、但
し、リンカーを除くと1143bp (約1.1kbp) であるが、実
際の発現では、その前の停止コドンで終了するので、翻
訳される塩基鎖長は、停止コドンを含めて1026bp (約１
kbp)である）であって、図４に示す制限酵素地図を有す
るものである。
【００２０】本発明の発現ベクターは、形質転換された
細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、前記の本発明
の遺伝子を発現させ得るように結合している発現ベクタ
ーである。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤ
ＮＡは、特に制限されず、広く普及した入手の容易なも
のが用いられる。例えば、ｐＵＣ18、ｐＴＶ118 Ｎ (宝
酒造社製）、ｐＵＥＸ２（Amersham社製）、ｐＫＫ233-
2(Pharmacia 社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（Clontech社
製）等が挙げられる。本発明の発現ベクターは、例え
ば、λｇｔ11ファージに組み込まれたダニアレルゲンの
ｃＤＮＡを、Kpn I-Sac I 消化し、プラスミドベクター
ｐＵＣ18のKpnI-Sac I 部位に連結して発現ベクターｐ
ＡＫ１を得ることができる。また、ｐＡＫ１のEcoR I消
化断片を同様にｐＵＣ18のEcoR I部位に連結して発現ベ
クターｐＡＫＥ１を得ることができる。さらに、ｐＡＫ
Ｅ１のEcoR I消化断片を予めEcoRI消化で開裂したｐＵ
ＥＸ２（Amersham社製）に連結して発現ベクターｐＡＥ
Ｘ201 を得ることができる。
細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、前記の本発明
の遺伝子を発現させ得るように結合している発現ベクタ
ーである。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤ
ＮＡは、特に制限されず、広く普及した入手の容易なも
のが用いられる。例えば、ｐＵＣ18、ｐＴＶ118 Ｎ (宝
酒造社製）、ｐＵＥＸ２（Amersham社製）、ｐＫＫ233-
2(Pharmacia 社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（Clontech社
製）等が挙げられる。本発明の発現ベクターは、例え
ば、λｇｔ11ファージに組み込まれたダニアレルゲンの
ｃＤＮＡを、Kpn I-Sac I 消化し、プラスミドベクター
ｐＵＣ18のKpnI-Sac I 部位に連結して発現ベクターｐ
ＡＫ１を得ることができる。また、ｐＡＫ１のEcoR I消
化断片を同様にｐＵＣ18のEcoR I部位に連結して発現ベ
クターｐＡＫＥ１を得ることができる。さらに、ｐＡＫ
Ｅ１のEcoR I消化断片を予めEcoRI消化で開裂したｐＵ
ＥＸ２（Amersham社製）に連結して発現ベクターｐＡＥ
Ｘ201 を得ることができる。
【００２１】本発明の発現ベクターで形質転換された細
菌、酵母又は哺乳動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し
得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌と
しては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイ
セス・シェレビィシェー等が、哺乳動物細胞としては、
チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル
ＣＯＳ細胞、マウス・フィブロプラスト等が挙げられ
る。
菌、酵母又は哺乳動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し
得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌と
しては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイ
セス・シェレビィシェー等が、哺乳動物細胞としては、
チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル
ＣＯＳ細胞、マウス・フィブロプラスト等が挙げられ
る。
【００２２】本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発
現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産
生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収すること
による。即ち、例えばダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入
された融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転
換株を用いての組換えダニアレルゲンの製造方法とし
て、次のような方法が例示される。
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発
現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産
生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収すること
による。即ち、例えばダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入
された融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転
換株を用いての組換えダニアレルゲンの製造方法とし
て、次のような方法が例示される。
【００２３】まず、ダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入さ
れたβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白発現プラスミド
を含有する大腸菌形質転換株を常法により振盪培養し対
数増殖させ、この対数増殖期を維持させながら温度ジャ
ンプで、又はβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添
加で融合蛋白質を誘導合成させる。宿主細胞として用い
られる大腸菌としては、例えばE. coli pop2136 （Amer
sham社製）が用いられ、発現ベクターで形質転換された
株をE. coli pop2136 OL-1と命名（微工研菌寄第 11655
号）する。培養終了後、集菌した菌体は、セリン・シス
テイン・アスパラギン酸・金属プロテアーゼインヒビタ
ーを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊される。細
胞デブリスにある膜局在性の蛋白をフェニルメタンスル
フォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチン
Ａ、エチレンジアミン四酢酸等の蛋白分解酵素阻害剤及
びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−10
0 、ノニデットＰ40等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出
する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得られたダ
ニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を、例
えばUltrogelAcA 44 （ＬＫＢ社製）を用いたゲル濾過
クロマトグラフィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定
化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体
固定化アフィニティクロマトグラフィー等で精製する。
なお、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化担体は、抗β
−ガラクトシダーゼ抗体（５Prime →３Prime 社製）
を、活性化されたトレシル担体（例えば、トレシルＧＭ
ゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨパール（東ソー社
製）、トレシルセファロース（Pharmacia 社製）等が用
いられる）に共有結合させたものである。また、抗ダニ
虫体抗体固定化担体は、上述の活性化担体にウサギ抗ダ
ニ虫体抗体を共有結合させたものである。
れたβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白発現プラスミド
を含有する大腸菌形質転換株を常法により振盪培養し対
数増殖させ、この対数増殖期を維持させながら温度ジャ
ンプで、又はβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添
加で融合蛋白質を誘導合成させる。宿主細胞として用い
られる大腸菌としては、例えばE. coli pop2136 （Amer
sham社製）が用いられ、発現ベクターで形質転換された
株をE. coli pop2136 OL-1と命名（微工研菌寄第 11655
号）する。培養終了後、集菌した菌体は、セリン・シス
テイン・アスパラギン酸・金属プロテアーゼインヒビタ
ーを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊される。細
胞デブリスにある膜局在性の蛋白をフェニルメタンスル
フォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチン
Ａ、エチレンジアミン四酢酸等の蛋白分解酵素阻害剤及
びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−10
0 、ノニデットＰ40等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出
する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得られたダ
ニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を、例
えばUltrogelAcA 44 （ＬＫＢ社製）を用いたゲル濾過
クロマトグラフィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定
化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体
固定化アフィニティクロマトグラフィー等で精製する。
なお、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化担体は、抗β
−ガラクトシダーゼ抗体（５Prime →３Prime 社製）
を、活性化されたトレシル担体（例えば、トレシルＧＭ
ゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨパール（東ソー社
製）、トレシルセファロース（Pharmacia 社製）等が用
いられる）に共有結合させたものである。また、抗ダニ
虫体抗体固定化担体は、上述の活性化担体にウサギ抗ダ
ニ虫体抗体を共有結合させたものである。
【００２４】精製された組換えダニアレルゲン融合蛋白
質は、プロテアーゼで消化し、ELISA 及びダニアレルギ
ー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー, 3
7, 725(1988) ）でモニター下に、例えばゲル濾過クロ
マトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、クロマトフォカシング、焦点電気泳動法、
ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせ
て分画し、活性画分から抗β−ガラクトシダーゼ抗体固
定化アフィニティカラムを通してβ−ガラクトシダーゼ
に由来する蛋白成分を吸収除去する。更に、抗ダニ虫体
抗体固定化アフィニティカラムで組換えダニアレルゲン
の断片の精製を行なう。
質は、プロテアーゼで消化し、ELISA 及びダニアレルギ
ー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー, 3
7, 725(1988) ）でモニター下に、例えばゲル濾過クロ
マトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、クロマトフォカシング、焦点電気泳動法、
ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせ
て分画し、活性画分から抗β−ガラクトシダーゼ抗体固
定化アフィニティカラムを通してβ−ガラクトシダーゼ
に由来する蛋白成分を吸収除去する。更に、抗ダニ虫体
抗体固定化アフィニティカラムで組換えダニアレルゲン
の断片の精製を行なう。
【００２５】また、前記方法で精製されたものの蛋白質
分解酵素、例えば、プロナーゼ、スブチリシン、サーモ
リシン、トリプシン等による消化物や臭化シアン、２−
ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン
等の化学処理による分解物からのダニアレルゲンの断片
の精製も前記の方法を単独または組み合わせて行なうこ
とができる。
分解酵素、例えば、プロナーゼ、スブチリシン、サーモ
リシン、トリプシン等による消化物や臭化シアン、２−
ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン
等の化学処理による分解物からのダニアレルゲンの断片
の精製も前記の方法を単独または組み合わせて行なうこ
とができる。
【００２６】また、本発明の組換えダニアレルゲンの製
造方法は、ダニアレルゲン蛋白質の直接発現に加えて、
ダニアレルゲンが他の蛋白質と介在配列を介して融合し
た融合組換えダニアレルゲンとして発現したものを回収
し、次いで融合している他の蛋白質を脱離せしめること
により組換えダニアレルゲンを製造する方法も包含して
いる。融合させる他の蛋白質としては、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ、プロテインＡ等、一般的に融合蛋白とすることが知
られているものが用いられる。
造方法は、ダニアレルゲン蛋白質の直接発現に加えて、
ダニアレルゲンが他の蛋白質と介在配列を介して融合し
た融合組換えダニアレルゲンとして発現したものを回収
し、次いで融合している他の蛋白質を脱離せしめること
により組換えダニアレルゲンを製造する方法も包含して
いる。融合させる他の蛋白質としては、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ、プロテインＡ等、一般的に融合蛋白とすることが知
られているものが用いられる。
【００２７】他の蛋白質を脱離せしめる方法も公知の方
法が用いられるが、例えば他の蛋白質がβ−ガラクトシ
ダーゼで、ダニアレルゲン蛋白質との間にコラーゲンや
フィブリノーゲン蛋白質の一部が介在している場合に
は、コラゲナーゼやトロンビンが用いられ、前記の方法
を単独または組み合わせることによって、ダニアレルゲ
ン蛋白質を精製する。
法が用いられるが、例えば他の蛋白質がβ−ガラクトシ
ダーゼで、ダニアレルゲン蛋白質との間にコラーゲンや
フィブリノーゲン蛋白質の一部が介在している場合に
は、コラゲナーゼやトロンビンが用いられ、前記の方法
を単独または組み合わせることによって、ダニアレルゲ
ン蛋白質を精製する。
【００２８】また、本発明のダニアレルゲン断片は、該
断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡを常法によ
り調製して、発現ベクターを構築し、適当な宿主にて発
現させることにより容易に組換えダニアレルゲンとして
得ることができる。更に、該ダニアレルゲン断片を、常
法の固相合成法により合成して合成ダニアレルゲンとし
て、単独にまたは、適当な担体、例えばヒト血清アルブ
ミン、皮内投与で安全性が確認されているホヤ抗原等に
結合させて用いることも出来る。
断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡを常法によ
り調製して、発現ベクターを構築し、適当な宿主にて発
現させることにより容易に組換えダニアレルゲンとして
得ることができる。更に、該ダニアレルゲン断片を、常
法の固相合成法により合成して合成ダニアレルゲンとし
て、単独にまたは、適当な担体、例えばヒト血清アルブ
ミン、皮内投与で安全性が確認されているホヤ抗原等に
結合させて用いることも出来る。
【００２９】また、本発明のダニ虫体由来のダニアレル
ゲンに含まれるエピトープを有するポリペプチド又は該
エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピ
トープを有するポリペプチドは、以下のアミノ酸配列
（配列番号：３）、 Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr 又は、以下のアミノ酸配列（配列番号：４）を含有する
ポリペプチドが挙げられる。 Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser SerAsp Ile Ala また、これらのポリペプチドをコードしている遺伝子と
しては、以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）を含有する
もの、 ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC 又は、以下のＤＮＡ配列（配列番号：４）を含有するも
のが挙げられる。 GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCGGAC ATT GCT
ゲンに含まれるエピトープを有するポリペプチド又は該
エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピ
トープを有するポリペプチドは、以下のアミノ酸配列
（配列番号：３）、 Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr 又は、以下のアミノ酸配列（配列番号：４）を含有する
ポリペプチドが挙げられる。 Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser SerAsp Ile Ala また、これらのポリペプチドをコードしている遺伝子と
しては、以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）を含有する
もの、 ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC 又は、以下のＤＮＡ配列（配列番号：４）を含有するも
のが挙げられる。 GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCGGAC ATT GCT
【００３０】本発明のダニ虫体由来のダニアレルゲンに
含まれるエピトープを有するポリペプチド又は該エピト
ープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープ
を有するポリペプチドは、前記のようなものが挙げら
れ、ダニアレルギー疾患治療剤あるいはダニアレルギー
疾患診断薬における有効成分として用いる場合、いずれ
も用いることができるが、抗原性は配列番号：４のもの
がより高いので好ましく用いられる。
含まれるエピトープを有するポリペプチド又は該エピト
ープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープ
を有するポリペプチドは、前記のようなものが挙げら
れ、ダニアレルギー疾患治療剤あるいはダニアレルギー
疾患診断薬における有効成分として用いる場合、いずれ
も用いることができるが、抗原性は配列番号：４のもの
がより高いので好ましく用いられる。
【００３１】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記
の精製された組換えダニアレルゲン、ダニアレルゲン断
片あるいはエピトープを有するポリペプチドを有効成分
とするものであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤
として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、ア
トピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性
結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因と
なるあらゆるアレルギー疾患をいう。
の精製された組換えダニアレルゲン、ダニアレルゲン断
片あるいはエピトープを有するポリペプチドを有効成分
とするものであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤
として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、ア
トピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性
結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因と
なるあらゆるアレルギー疾患をいう。
【００３２】本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて
精製されたダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有
するポリペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレ
ルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本
発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤とし
て用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一
般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば
安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛
化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤と
して用いることができる。例えば、粉末状の精製された
組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩
水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて
精製されたダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有
するポリペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレ
ルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本
発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤とし
て用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一
般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば
安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛
化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤と
して用いることができる。例えば、粉末状の精製された
組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩
水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
【００３３】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通
常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内
等の投与方法により行なうことができる。更に、例え
ば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ
剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬とし
ても使用することができる。本発明のダニアレルギー疾
患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状など
に応じて成人１回あたり約20μｇ以下の範囲となるよう
に適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明
のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に
対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。ま
た、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安
全に用いることができる。
常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内
等の投与方法により行なうことができる。更に、例え
ば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ
剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬とし
ても使用することができる。本発明のダニアレルギー疾
患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状など
に応じて成人１回あたり約20μｇ以下の範囲となるよう
に適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明
のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に
対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。ま
た、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安
全に用いることができる。
【００３４】本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダ
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて精製され
たダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するポリ
ペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダ
ニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノール
を含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応
診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられ
る。
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて精製され
たダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するポリ
ペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダ
ニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノール
を含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応
診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられ
る。
【００３５】また、ダニアレルギー診断用滴定試薬とし
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例え
ば、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶
解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用い
る。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。
即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球
（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をHPLCを用
いて測定する〔アレルギー，37, 725(1988) 〕。
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例え
ば、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶
解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用い
る。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。
即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球
（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をHPLCを用
いて測定する〔アレルギー，37, 725(1988) 〕。
【００３６】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の50％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応さ
せた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血
液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球
浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）
より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中
和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためであ
る。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線
からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。ア
レルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギー
の正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離
滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。
の50％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応さ
せた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血
液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球
浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）
より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中
和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためであ
る。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線
からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。ア
レルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギー
の正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離
滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。
【００３７】
【実施例】以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
【００３８】実施例１ ダニ全ＲＮＡの抽出：常法によりコナヒョウヒダニを培
養増殖させて得られる生ダニ虫体６g を200ｍｌの5.5
Ｍイソチアン酸グアニジン (片山化学社製) 液中で石英
砂10ｇとともに乳鉢中ですりつぶし遠心分離し、その上
清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリンジで吸
入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分切断し
た。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフルオロ酢
酸セシウム溶液 (片山化学社製) に対して16ｍｌの割合
で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI SCP55H
swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底にペレ
ットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。これを4.0 Ｍ
イソチアン酸グアニジン溶液に溶解後、エタノール沈澱
して１ｍｌTE (10mM Tris-HCl, pH7.5, １mM EDTA)溶
液とした。
養増殖させて得られる生ダニ虫体６g を200ｍｌの5.5
Ｍイソチアン酸グアニジン (片山化学社製) 液中で石英
砂10ｇとともに乳鉢中ですりつぶし遠心分離し、その上
清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリンジで吸
入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分切断し
た。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフルオロ酢
酸セシウム溶液 (片山化学社製) に対して16ｍｌの割合
で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI SCP55H
swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底にペレ
ットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。これを4.0 Ｍ
イソチアン酸グアニジン溶液に溶解後、エタノール沈澱
して１ｍｌTE (10mM Tris-HCl, pH7.5, １mM EDTA)溶
液とした。
【００３９】実施例２ ダニアレルゲンPoly(A)mＲＮＡの分離：このダニ全ＲＮ
ＡのTE溶液を、65℃にて10分間熱処理して急冷後、等量
の１ＭNaCl を加えて、予めSTE (10 mM Tris-HCl, pH7.
5, 1mM EDTA, 0.5Ｍ NaCl)溶液で平衡化したオリゴ (d
T) セルロースカラム (カラム体積0.5 ｍｌ, Boehringe
r Mannheim 社製) にかけた。素通り液を再度カラムに
リサイクルした後、2.5 倍量のSTE 溶液で、カラムを洗
浄した。洗浄後TE溶液でpoly(A)mＲＮＡを溶出した。こ
こでは、0.2 ｍｌずつのフラクションを取り、臭化エチ
ジウムによるスポットテストでＲＮＡが含まれる画分を
プールした。このカラムによる精製を再度行い、プール
した画分からエタノール沈澱によりＲＮＡを回収して、
poly(A)mＲＮＡ画分とした。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈
系列とともにスポットテストを行なって収量を測定した
ところ、約20μｇであった。
ＡのTE溶液を、65℃にて10分間熱処理して急冷後、等量
の１ＭNaCl を加えて、予めSTE (10 mM Tris-HCl, pH7.
5, 1mM EDTA, 0.5Ｍ NaCl)溶液で平衡化したオリゴ (d
T) セルロースカラム (カラム体積0.5 ｍｌ, Boehringe
r Mannheim 社製) にかけた。素通り液を再度カラムに
リサイクルした後、2.5 倍量のSTE 溶液で、カラムを洗
浄した。洗浄後TE溶液でpoly(A)mＲＮＡを溶出した。こ
こでは、0.2 ｍｌずつのフラクションを取り、臭化エチ
ジウムによるスポットテストでＲＮＡが含まれる画分を
プールした。このカラムによる精製を再度行い、プール
した画分からエタノール沈澱によりＲＮＡを回収して、
poly(A)mＲＮＡ画分とした。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈
系列とともにスポットテストを行なって収量を測定した
ところ、約20μｇであった。
【００４０】実施例３ ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：次に、このpoly(A)mＲ
ＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（Ph
armacia 社製) でそのマニュアルに従って、Eco RI部位
を含んだ13mer のリンカーを両端に持つｃＤＮＡを合成
した。
ＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（Ph
armacia 社製) でそのマニュアルに従って、Eco RI部位
を含んだ13mer のリンカーを両端に持つｃＤＮＡを合成
した。
【００４１】実施例４ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：このｃＤ
ＮＡのうちの1/5 量を、１μｇのEco RI消化λgtll (St
ratagene Cloning System 社製）と混合し、これをエタ
ノールで濃縮した後200unitsのT4 ＤＮＡ ligase を加
えて12℃で15時間反応させることにより、ｃＤＮＡをλ
gtllのEco RI部位に挿入した。この反応液から、in vit
roパッケージングキット (Gigapack PLUS, Stratagene
Cloning System社製) を用いてそのマニュアルにしたが
って、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラ
リー作製操作を２度行い、最終的に２μｇのpoly(A)mＲ
ＮＡから合計41,000 pfu(plaque forming unit)のｃＤ
ＮＡライブラリーを得た。
ＮＡのうちの1/5 量を、１μｇのEco RI消化λgtll (St
ratagene Cloning System 社製）と混合し、これをエタ
ノールで濃縮した後200unitsのT4 ＤＮＡ ligase を加
えて12℃で15時間反応させることにより、ｃＤＮＡをλ
gtllのEco RI部位に挿入した。この反応液から、in vit
roパッケージングキット (Gigapack PLUS, Stratagene
Cloning System社製) を用いてそのマニュアルにしたが
って、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラ
リー作製操作を２度行い、最終的に２μｇのpoly(A)mＲ
ＮＡから合計41,000 pfu(plaque forming unit)のｃＤ
ＮＡライブラリーを得た。
【００４２】実施例５ ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：このｃＤＮＡ
の挿入されたλgtllファージを懸濁したSM (１Ｍ Tris-
HCl, pH7.5, 0.1Ｍ NaCl10mM MgSO4, ２％ gelati
n) 液と一晩培養したE. coli Y1090 （Stratagene Clon
ing System 社製）とを37℃で30分間振盪培養すること
により、宿主にファージを感染させ、これをLB寒天培地
(１％ Bacto tryptone, 0.5％ Bacto yeast extract,
1.5 ％ Bacto agar (Difco社製), 0.5％ NaCl)上に、１
プレート当り約2,000 個のプラークを形成するように撒
いた。42℃で３時間培養後、予め10mMイソプロピル−１
−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG) を浸漬させて乾
燥したニトロセルロースメンブレン (Hibond−C, Amers
ham 社製)で培地表面を覆い、さらに37℃で３時間培養
して誘導合成されるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白を転
写した。このニトロセルロースメンブレンを２％BSA を
含むTBS(10 mM Tris−HCl, pH 8.0, 0.9％ NaCl) 溶
液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ抗ダニ虫体抗原
血清 (100 倍TBS 希釈) 、さらにパーオキシダーゼ結合
ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (Cappel社製, 2000倍TBS 希釈)
とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は0.01％過酸化水
素の存在下、0.4 ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジジン四塩
酸塩を含むTBS 溶液中で行なった。なお、ウサギ抗ダニ
虫体抗原血清は全ダニ飼育物から飽和食塩、ＰＢＳでダ
ニ虫体を浮遊させ、更にＰＢＳで洗浄したダニ虫体を磨
砕して、これを免疫源としてウサギに10週間毎週追加免
疫して得られた抗血清である。茶褐色を呈したシグナル
の位置と合致するプラークをピックアップしてSMに懸濁
し、陽性クローンとして保存した。
の挿入されたλgtllファージを懸濁したSM (１Ｍ Tris-
HCl, pH7.5, 0.1Ｍ NaCl10mM MgSO4, ２％ gelati
n) 液と一晩培養したE. coli Y1090 （Stratagene Clon
ing System 社製）とを37℃で30分間振盪培養すること
により、宿主にファージを感染させ、これをLB寒天培地
(１％ Bacto tryptone, 0.5％ Bacto yeast extract,
1.5 ％ Bacto agar (Difco社製), 0.5％ NaCl)上に、１
プレート当り約2,000 個のプラークを形成するように撒
いた。42℃で３時間培養後、予め10mMイソプロピル−１
−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG) を浸漬させて乾
燥したニトロセルロースメンブレン (Hibond−C, Amers
ham 社製)で培地表面を覆い、さらに37℃で３時間培養
して誘導合成されるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白を転
写した。このニトロセルロースメンブレンを２％BSA を
含むTBS(10 mM Tris−HCl, pH 8.0, 0.9％ NaCl) 溶
液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ抗ダニ虫体抗原
血清 (100 倍TBS 希釈) 、さらにパーオキシダーゼ結合
ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (Cappel社製, 2000倍TBS 希釈)
とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は0.01％過酸化水
素の存在下、0.4 ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジジン四塩
酸塩を含むTBS 溶液中で行なった。なお、ウサギ抗ダニ
虫体抗原血清は全ダニ飼育物から飽和食塩、ＰＢＳでダ
ニ虫体を浮遊させ、更にＰＢＳで洗浄したダニ虫体を磨
砕して、これを免疫源としてウサギに10週間毎週追加免
疫して得られた抗血清である。茶褐色を呈したシグナル
の位置と合致するプラークをピックアップしてSMに懸濁
し、陽性クローンとして保存した。
【００４３】実施例６ λgtllファージベクターを用いた融合蛋白質の発現：実
施例５の免疫スクリーニングで得られた陽性クローン
を、E. coli Y1090 の一晩培養液50μｌとともに100 μ
ｌの100 mM IPTG を含む３ｍｌ LB 液体培地で37℃にて
８時間振盪培養し、その培養上清を蒸留水に対して透
析、凍結乾燥してウエスタンブロット用のサンプルとし
た。SDS −PAGEは、Laemmli らの方法（Nature, 227, 6
80〜685(1970))に従って行い、２ｍｇのサンプルを、ポ
リアクリルアミド濃度５％、定常電流15mAの条件下で泳
動した。その後、SDS −running buffer (192 mM glyci
ne-25 mM Tris, pH8.3, 0.1％ SDS, 20％ methanol)中
で、８−10Ｖ／cm、２時間の泳動により、アクリルアミ
ドゲルからイモビロン（pore size 0.45μm , MILLIPOR
E 社製 )膜へ転写した。このイモビロン膜を、Auro Dye
(JANSSEN Life Sciences Products社製) で蛋白染色及
び、ダニアレルギー患者プール血清、ウサギ抗ダニ虫体
抗原血清、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Prim
e →３Prime社製）を用いて免疫染色し、ダニアレルゲ
ン融合蛋白質を検出した (図１) 。
施例５の免疫スクリーニングで得られた陽性クローン
を、E. coli Y1090 の一晩培養液50μｌとともに100 μ
ｌの100 mM IPTG を含む３ｍｌ LB 液体培地で37℃にて
８時間振盪培養し、その培養上清を蒸留水に対して透
析、凍結乾燥してウエスタンブロット用のサンプルとし
た。SDS −PAGEは、Laemmli らの方法（Nature, 227, 6
80〜685(1970))に従って行い、２ｍｇのサンプルを、ポ
リアクリルアミド濃度５％、定常電流15mAの条件下で泳
動した。その後、SDS −running buffer (192 mM glyci
ne-25 mM Tris, pH8.3, 0.1％ SDS, 20％ methanol)中
で、８−10Ｖ／cm、２時間の泳動により、アクリルアミ
ドゲルからイモビロン（pore size 0.45μm , MILLIPOR
E 社製 )膜へ転写した。このイモビロン膜を、Auro Dye
(JANSSEN Life Sciences Products社製) で蛋白染色及
び、ダニアレルギー患者プール血清、ウサギ抗ダニ虫体
抗原血清、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Prim
e →３Prime社製）を用いて免疫染色し、ダニアレルゲ
ン融合蛋白質を検出した (図１) 。
【００４４】実施例７ 組換えプラスミドの構築：次に、これら抗血清と反応す
るダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白をコ
ードするｃＤＮＡの挿入されたλgtllファージ・クロー
ンから、そのＤＮＡを回収した後Eco RI消化し、この消
化物を、アガロースゲル電気泳動にかけてｃＤＮＡ鎖長
を約1.2kbp (リンカーも含めて) と決定した (図２、図
中の矢印)。次に、このｃＤＮＡの挿入されたλgtllフ
ァージＤＮＡをKpn I-Sac I 消化し、その断片 (約3.3k
bp) をプラスミドベクターpUC18(宝酒造社製) のKpn I-
SacI 部位に連結し、Hanahan の方法（DNA cloning, vo
l. 1, Glover, D.M. ed., pp. 109-136, IRL Press (19
85)) に従ってE. coli JM109 （宝酒造社製）に形質転
換した（図３) 。得られた組換えプラスミドをpAK 1 と
名付け、これを用いて制限酵素地図 (リンカーを除いて
1,144bp)を作成した（図４) 。
るダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白をコ
ードするｃＤＮＡの挿入されたλgtllファージ・クロー
ンから、そのＤＮＡを回収した後Eco RI消化し、この消
化物を、アガロースゲル電気泳動にかけてｃＤＮＡ鎖長
を約1.2kbp (リンカーも含めて) と決定した (図２、図
中の矢印)。次に、このｃＤＮＡの挿入されたλgtllフ
ァージＤＮＡをKpn I-Sac I 消化し、その断片 (約3.3k
bp) をプラスミドベクターpUC18(宝酒造社製) のKpn I-
SacI 部位に連結し、Hanahan の方法（DNA cloning, vo
l. 1, Glover, D.M. ed., pp. 109-136, IRL Press (19
85)) に従ってE. coli JM109 （宝酒造社製）に形質転
換した（図３) 。得られた組換えプラスミドをpAK 1 と
名付け、これを用いて制限酵素地図 (リンカーを除いて
1,144bp)を作成した（図４) 。
【００４５】実施例８ ダニアレルゲンｃＤＮＡの塩基配列の決定：このプラス
ミドpAK 1 のEco RI消化断片を、同じプラスミドベクタ
ーpUC18 のEco RI部位に連結し、同様にE. coli JM109
に形質転換した (図５) 。得られた組換えプラスミドを
pAKE 1と名付け、これを用いて制限酵素地図（リンカー
を除いて940bp)を作成した (図４) 。次に、この組換え
プラスミドpAK 1及びpAKE 1を、Eco RIやBam HIなどで
消化して得られる種々の断片を含有するファージベクタ
ーM13mp18 及びmp19 (宝酒造社製) の形質転換株の培養
上清から常法により一本鎖ＤＮＡを調製し、Sequenase
Version 2.0(東洋紡績社製) を用いたジデオキシターミ
ネーション法により、塩基配列の一部を決定した (配列
番号：１）。さらに、同方法により塩基配列について繰
り返し検討したところ、前記の塩基配列（配列番号：
１）を含む約1.1kbp (リンカーを除く) の塩基配列を決
定した(配列番号：２）。
ミドpAK 1 のEco RI消化断片を、同じプラスミドベクタ
ーpUC18 のEco RI部位に連結し、同様にE. coli JM109
に形質転換した (図５) 。得られた組換えプラスミドを
pAKE 1と名付け、これを用いて制限酵素地図（リンカー
を除いて940bp)を作成した (図４) 。次に、この組換え
プラスミドpAK 1及びpAKE 1を、Eco RIやBam HIなどで
消化して得られる種々の断片を含有するファージベクタ
ーM13mp18 及びmp19 (宝酒造社製) の形質転換株の培養
上清から常法により一本鎖ＤＮＡを調製し、Sequenase
Version 2.0(東洋紡績社製) を用いたジデオキシターミ
ネーション法により、塩基配列の一部を決定した (配列
番号：１）。さらに、同方法により塩基配列について繰
り返し検討したところ、前記の塩基配列（配列番号：
１）を含む約1.1kbp (リンカーを除く) の塩基配列を決
定した(配列番号：２）。
【００４６】実施例９ 高発現ベクターの構築：組換えプラスミドpAKE 1のEcoR
I消化断片 (940bp)をアガロースゲル電気泳動し、Genec
lean IIキット (BIO 101 社製) で抽出し、これを予めE
co RI消化で開裂したベクターpUEX2 (Amersham 社製）
へ翻訳方向とフレームが合うように連結した (図６)。
I消化断片 (940bp)をアガロースゲル電気泳動し、Genec
lean IIキット (BIO 101 社製) で抽出し、これを予めE
co RI消化で開裂したベクターpUEX2 (Amersham 社製）
へ翻訳方向とフレームが合うように連結した (図６)。
【００４７】実施例１０ 融合蛋白質として発現：この得られた組換えプラスミド
を、pAEX201 と名付け、これをE. coli pop2136 （Amer
sham社製）に形質転換した。この形質転換株を500 ｍｌ
SBA液体培地 (2.4 ％Bacto yeast extract, 1.2％Bact
o polypepton,O.5 ％ glycerol, 0.1 M Potassium phos
phate, pH7.5, 50ｍｇ／ｍｌ ampicillin)中で、28℃に
て600nm におけるOD値が0.6 となるまで振盪培養し、56
℃に保温したSBA 培地を等量加えた後、42℃にて90分間
振盪培養した。この42℃への温度シフトによる融合蛋白
の誘導合成の間、OD値を0.6 から1.0 の間に維持するよ
う新鮮なSBA を適時、適量加えた。培養終了後、培養液
を遠心分離して集菌し、滅菌水で洗浄した菌体を10mlの
プロテアーゼ阻害液 (0.1ＭTris-HCl, pH 7.5, １mM E
DTA, 0.1mM phenylmethanesulfonyl fluoride, １mM io
doacetic acid, ５mM 1,2−epoxy −３− (ｐ−nitroph
enoxy) −propane)に懸濁した。この懸濁液を10−20 kH
zの超音波で処理 (１分間を10回) して細胞を破壊し、
遠心分離後ペレットを10ｍｌの0.02％SDS 溶液に懸濁し
た。再度遠心分離してペレットを形成する膜局在蛋白を
10ｍｌの２％SDS 溶液に完全溶解した。この抽出物の凍
結乾燥物をSDS-PAGEで分析した結果を図７に示す。
を、pAEX201 と名付け、これをE. coli pop2136 （Amer
sham社製）に形質転換した。この形質転換株を500 ｍｌ
SBA液体培地 (2.4 ％Bacto yeast extract, 1.2％Bact
o polypepton,O.5 ％ glycerol, 0.1 M Potassium phos
phate, pH7.5, 50ｍｇ／ｍｌ ampicillin)中で、28℃に
て600nm におけるOD値が0.6 となるまで振盪培養し、56
℃に保温したSBA 培地を等量加えた後、42℃にて90分間
振盪培養した。この42℃への温度シフトによる融合蛋白
の誘導合成の間、OD値を0.6 から1.0 の間に維持するよ
う新鮮なSBA を適時、適量加えた。培養終了後、培養液
を遠心分離して集菌し、滅菌水で洗浄した菌体を10mlの
プロテアーゼ阻害液 (0.1ＭTris-HCl, pH 7.5, １mM E
DTA, 0.1mM phenylmethanesulfonyl fluoride, １mM io
doacetic acid, ５mM 1,2−epoxy −３− (ｐ−nitroph
enoxy) −propane)に懸濁した。この懸濁液を10−20 kH
zの超音波で処理 (１分間を10回) して細胞を破壊し、
遠心分離後ペレットを10ｍｌの0.02％SDS 溶液に懸濁し
た。再度遠心分離してペレットを形成する膜局在蛋白を
10ｍｌの２％SDS 溶液に完全溶解した。この抽出物の凍
結乾燥物をSDS-PAGEで分析した結果を図７に示す。
【００４８】実施例１１ 組換えダニアレルゲン融合蛋白質の精製：この抽出物の
凍結乾燥物は、500 ｍｌ培養液から122 ｍｇであった。
その５ｍｇを500 μｌの水に溶解し、その液を、Ultrog
el AcA 44(ＬＫＢ社製，1.4 ×50ｃｍ) ＋AG 11A8 (Bio
Rad社製, 1.4 ×14ｃｍ) の連結カラムにのせ、展開溶
媒として脱イオン水を流速10ｍｌ／hrで展開し、ボイド
ボリュームに溶出される画分を集めた (図８) 。この画
分の凍結乾燥物は、0.6 ｍｇであった。更に、抗β−ガ
ラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティカラムを通し、
次に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラムで精製
を行なった。抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィ
ニティカラムは、抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Prim
e →３Prime社製) をトレシルＧＭゲル（栗田工業社
製）に固定化させたものを用いた。抗ダニ虫体抗体固定
化アフィニティカラムは、実施例５に記載のウサギ抗ダ
ニ虫体抗原血清を硫安分画し、次いでプロテインＡカラ
ムを用いて精製した抗体をトレシルＧＭゲルに固定化さ
せたものを用いた。
凍結乾燥物は、500 ｍｌ培養液から122 ｍｇであった。
その５ｍｇを500 μｌの水に溶解し、その液を、Ultrog
el AcA 44(ＬＫＢ社製，1.4 ×50ｃｍ) ＋AG 11A8 (Bio
Rad社製, 1.4 ×14ｃｍ) の連結カラムにのせ、展開溶
媒として脱イオン水を流速10ｍｌ／hrで展開し、ボイド
ボリュームに溶出される画分を集めた (図８) 。この画
分の凍結乾燥物は、0.6 ｍｇであった。更に、抗β−ガ
ラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティカラムを通し、
次に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラムで精製
を行なった。抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィ
ニティカラムは、抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Prim
e →３Prime社製) をトレシルＧＭゲル（栗田工業社
製）に固定化させたものを用いた。抗ダニ虫体抗体固定
化アフィニティカラムは、実施例５に記載のウサギ抗ダ
ニ虫体抗原血清を硫安分画し、次いでプロテインＡカラ
ムを用いて精製した抗体をトレシルＧＭゲルに固定化さ
せたものを用いた。
【００４９】実施例１２ 精製融合蛋白質を用いたヒスタミン遊離試験：精製した
抗原液（１ｍｇ/ ｍｌ）を適宜希釈し、この溶液200 μ
ｌにハンクス液で洗浄したダニ喘息患者の血球浮遊液20
0 μｌを加え、37℃、30分間反応させた。1,400rpm、10
分間遠心してその上清200 μｌをとり、これに60％過塩
素酸10μｌを加え、激しく攪拌し、10,000rpm 、10分間
遠心して除蛋白した。この上清150 μｌをとり、ＨＰＬ
Ｃでその100 μｌ中に存在するヒスタミン量を測定し
た。なお、ここで全ヒスタミン量の測定は、遠心分離に
より血球を除く操作をせずに以下の操作を同様に行なっ
て求めた。得られた結果について、横軸に抗原の濃度
を、縦軸に（遊離ヒスタミン量／全ヒスタミン量）×10
0 をとって図９に示した。ここでその変曲点の濃度を比
較すると粗虫体抗原よりも、このダニアレルゲン融合蛋
白質は200 倍以上の低濃度で反応していることを示して
いる。
抗原液（１ｍｇ/ ｍｌ）を適宜希釈し、この溶液200 μ
ｌにハンクス液で洗浄したダニ喘息患者の血球浮遊液20
0 μｌを加え、37℃、30分間反応させた。1,400rpm、10
分間遠心してその上清200 μｌをとり、これに60％過塩
素酸10μｌを加え、激しく攪拌し、10,000rpm 、10分間
遠心して除蛋白した。この上清150 μｌをとり、ＨＰＬ
Ｃでその100 μｌ中に存在するヒスタミン量を測定し
た。なお、ここで全ヒスタミン量の測定は、遠心分離に
より血球を除く操作をせずに以下の操作を同様に行なっ
て求めた。得られた結果について、横軸に抗原の濃度
を、縦軸に（遊離ヒスタミン量／全ヒスタミン量）×10
0 をとって図９に示した。ここでその変曲点の濃度を比
較すると粗虫体抗原よりも、このダニアレルゲン融合蛋
白質は200 倍以上の低濃度で反応していることを示して
いる。
【００５０】実施例１３ 組換えダニアレルゲン断片の調製：ｃＤＮＡの970bp の
Eco RIフラグメントを挿入したpUEX２を用いてExonucle
ase III (宝酒造社製Kilo-Sequence 用Deletion kit)
によりｃＤＮＡの下流からのディレーションを行ない、
図１０に示すような10種類のディレーションした塩基鎖
長のｃＤＮＡを得た。これらを大腸菌に導入し、最初28
℃において、ニトロセルロース膜上で生育させ、続いて
42℃、２時間の誘導発現及び100 ℃におけるSDS での溶
菌後、ニトロセルロース膜に吸着した菌体成分につい
て、抗ダニ抗原抗血清を用いた酵素免疫抗体法によって
抗原活性の有無を検定した。その結果を図１０に示す
が、図中の左から６番目のスポットで、約400bp までの
欠損で残存する活性が７番目の約270bp までの欠損によ
って大部分が消失し、さらに８番目の約170bp までの欠
損によって完全に消失していることが判明した。このこ
とから、抗体結合能には少なくとも上流より約170bp 〜
約270bp 、約270bp 〜約400bp または約170bp 〜約400b
p の領域が必要であることが推測され、この領域のアミ
ノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン断片がダニアレル
ギー疾患治療剤、診断薬の有効成分として用いることが
できることが判明した。
Eco RIフラグメントを挿入したpUEX２を用いてExonucle
ase III (宝酒造社製Kilo-Sequence 用Deletion kit)
によりｃＤＮＡの下流からのディレーションを行ない、
図１０に示すような10種類のディレーションした塩基鎖
長のｃＤＮＡを得た。これらを大腸菌に導入し、最初28
℃において、ニトロセルロース膜上で生育させ、続いて
42℃、２時間の誘導発現及び100 ℃におけるSDS での溶
菌後、ニトロセルロース膜に吸着した菌体成分につい
て、抗ダニ抗原抗血清を用いた酵素免疫抗体法によって
抗原活性の有無を検定した。その結果を図１０に示す
が、図中の左から６番目のスポットで、約400bp までの
欠損で残存する活性が７番目の約270bp までの欠損によ
って大部分が消失し、さらに８番目の約170bp までの欠
損によって完全に消失していることが判明した。このこ
とから、抗体結合能には少なくとも上流より約170bp 〜
約270bp 、約270bp 〜約400bp または約170bp 〜約400b
p の領域が必要であることが推測され、この領域のアミ
ノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン断片がダニアレル
ギー疾患治療剤、診断薬の有効成分として用いることが
できることが判明した。
【００５１】実施例１４ エピトープを有するポリペプチドの調製 実施例１３で得られた結果をもとに、実施例１３と同様
の方法によりExonuclease III （宝酒造社製Kilo-Seque
nce 用Deletion kit) の反応時間を調節することによ
り、図１１に示すように170bp 〜400bp 領域中のエピト
ープ領域の特定を行い、181bp 〜246bp と343bp〜378bp
の２つの領域がエピトープ部分として必須であることが
わかった。酵素切断点までの塩基配列の決定は、Toyobo
社製TAQuenceを用いて行った。これらの塩基配列から予
想されるアミノ酸配列（配列番号３、配列番号４）を含
有するポリペプチドは、常法により、例えばApplied Bi
osystems社製ペプチドシンセサイザーで容易に合成して
得られる。
の方法によりExonuclease III （宝酒造社製Kilo-Seque
nce 用Deletion kit) の反応時間を調節することによ
り、図１１に示すように170bp 〜400bp 領域中のエピト
ープ領域の特定を行い、181bp 〜246bp と343bp〜378bp
の２つの領域がエピトープ部分として必須であることが
わかった。酵素切断点までの塩基配列の決定は、Toyobo
社製TAQuenceを用いて行った。これらの塩基配列から予
想されるアミノ酸配列（配列番号３、配列番号４）を含
有するポリペプチドは、常法により、例えばApplied Bi
osystems社製ペプチドシンセサイザーで容易に合成して
得られる。
【００５２】実施例１５ ダニアレルギー疾患治療剤の調製：精製されたアレルゲ
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する減感作治療剤として用いる。0.5 ％フェノ
ールを添加した0.9 ％生理食塩水を溶媒として、アレル
ゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治
療用抗原の原液とする。
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する減感作治療剤として用いる。0.5 ％フェノ
ールを添加した0.9 ％生理食塩水を溶媒として、アレル
ゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治
療用抗原の原液とする。
【００５３】実施例１６ ダニアレルギー疾患診断薬の調製：精製されたアレルゲ
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断
用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には、0.5
％フェノールを添加した0.9 ％生理食塩水を溶媒に、ア
レルゲン活性成分の20万倍希釈液を調製して用いる。ま
た、ダニアレルギー診断用滴定試薬には、アレルゲン活
性成分を1mg/mlの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これ
をヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とし、その希釈液を
用いる。
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断
用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には、0.5
％フェノールを添加した0.9 ％生理食塩水を溶媒に、ア
レルゲン活性成分の20万倍希釈液を調製して用いる。ま
た、ダニアレルギー診断用滴定試薬には、アレルゲン活
性成分を1mg/mlの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これ
をヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とし、その希釈液を
用いる。
【００５４】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA 48 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu １ ５ 10 15 GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT 96 Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu 20 25 30 ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC 144 Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile 35 40 45 GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG 192 Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu 50 55 60 AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT 240 Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 GCA TCG ATC 249 Ala Ser Ile
【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：１０２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA 48 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu １ ５ 10 15 GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT 96 Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu 20 25 30 ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC 144 Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile 35 40 45 GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG 192 Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu 50 55 60 AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT 240 Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 GCA TCG ATC GTA AAC CCA CGA TTG TCA TGG CAT CAA TAC ACG AAA CGC 288 Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg 85 90 95 GAT TCT CGT GAA TAC AAG AGT GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCG 336 Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser 100 105 110 GAC ATT GCT CTC AAG ATT ACG ATG CCT GAT TAT AAT TCG AAA ATT CAT 384 Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His 115 120 125 TAT TCA CGA CAA GGT GAT CAA ATC AAC ATG GAC ATC GAT GGT ACA TTG 432 Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu 130 135 140 ATC GAA GGT CAT GCA CAA GGA ACC ATC AGA GAA GGT AAA ATC CAC ATT 480 Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile 145 150 155 160 AAA GGT AGA CAA ACT GAT TTC GAG ATC GAA TCC AAC TAC CGA TAC GAA 528 Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu 165 170 175 GAT GGC AAA CTA ATC ATC GAA CCG GTC AAG AGT GAA AAT GGC AAA TTG 576 Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu 180 185 190 GAA GGC GTT CTT TCC CGT AAG GTG CCA TCA CAT CTG ACA CTA GAA ACA 624 Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr 195 200 205 CCA CGA GTC AAG ATG AAT ATG AAA TAT GAT CGA TAT GCA CCA GTC AAA 672 Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys 210 215 220 GTG TTC AAA TTG GAT TAT GAT GGC ATC CAC TTC GAG AAA CAT ACC GAT 720 Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp 225 230 235 240 ATT GAA TAC GAA CCT GGC GTT CGA TAC AAG ATC ATC GGC AAT GGA AAA 768 Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys 245 250 255 CTC AAG GAT GAT GGC CGC CAC TAT TCT ATC GAT GTG CAA GGT ATT CCA 816 Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro 260 265 270 CGC AAA GCA TTC AAT CTG GAC GCT GAC TTG ATG GAT TTC AAA CTG AAA 864 Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys 275 280 285 GTG AGC AAG CCA GAA GAT AGC AAT AAA GCT CAA TTC AGC TAC ACA TTC 912 Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe 290 295 300 AAC GAA TAT ACC GAG ACC GAA GAA TAT GAA TTC GAT CCA CAT CGT GCC 960 Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala 305 310 315 320 TAT TAT GTT AAT TGG TTG AGT TCC ATT CGC AAA TAC ATC CAG AAT TTC 1008 Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe 325 330 335 ATC GTC GAA GAC AAC 1023 Ile Val Glu Asp Asn 340
【００５６】 配列番号：３ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA 48 Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys １ ５ 10 15 ATT GAT TCA AAG AAA TAC 66 Ile Asp Ser Lys Lys Tyr 20
【００５７】 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCG GAC ATT GCT 36 Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala １ ５ 10
【図１】E. coli Y1090 を宿主として、ダニアレルゲン
ｃＤＮＡの挿入されたλgtllにより発現されたダニアレ
ルゲン融合蛋白質をSDS −PAGE分析後、ニトロセルロー
ス膜にブロットし、蛋白染色と免疫染色をした結果を示
した図である。図中、レーン１は分子量マーカー（β−
ガラクトシダーゼ：約13万）を、レーン２はE. coliY10
90 細胞全蛋白を、レーン３はウサギ抗ダニ虫体抗原抗
血清を用いた組換えダニアレルゲンの免疫染色（矢印）
を示す。
ｃＤＮＡの挿入されたλgtllにより発現されたダニアレ
ルゲン融合蛋白質をSDS −PAGE分析後、ニトロセルロー
ス膜にブロットし、蛋白染色と免疫染色をした結果を示
した図である。図中、レーン１は分子量マーカー（β−
ガラクトシダーゼ：約13万）を、レーン２はE. coliY10
90 細胞全蛋白を、レーン３はウサギ抗ダニ虫体抗原抗
血清を用いた組換えダニアレルゲンの免疫染色（矢印）
を示す。
【図２】ダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡのアガロ
ース電気泳動の結果を示した図である。
ース電気泳動の結果を示した図である。
【図３】組換えプラスミドpAK 1 の構築を示した図であ
る。
る。
【図４】ダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡの制限酵
素地図を示した図である。
素地図を示した図である。
【図５】組換えプラスミドpAKE 1の構築を示した図であ
る。
る。
【図６】組換えプラスミドpAEX201 の構築を示した図で
ある。
ある。
【図７】E. coli pop2136 を宿主としてpAEX201 により
発現したダニアレルゲン融合蛋白質のSDS −PAGE分析の
結果を示した図である。図中、レーン１は分子量マーカ
ーを、レーン２はプラスミドpUEX2 を含有するE. coli
pop2136 細胞全蛋白を、レーン３はプラスミドpAEX201
を含有するE. coli pop2136 細胞全蛋白を、レーン４は
プラスミドpAEX201を含有するE. coli pop2136 膜局在
蛋白（組換えダニアレルゲンを矢印で示す）を示す。
発現したダニアレルゲン融合蛋白質のSDS −PAGE分析の
結果を示した図である。図中、レーン１は分子量マーカ
ーを、レーン２はプラスミドpUEX2 を含有するE. coli
pop2136 細胞全蛋白を、レーン３はプラスミドpAEX201
を含有するE. coli pop2136 細胞全蛋白を、レーン４は
プラスミドpAEX201を含有するE. coli pop2136 膜局在
蛋白（組換えダニアレルゲンを矢印で示す）を示す。
【図８】ダニアレルゲン融合蛋白質を、連結U1trogel A
cA 44及びAG 11A8 カラムでゲル濾過及びSDS の除去を
した結果を示した図である。
cA 44及びAG 11A8 カラムでゲル濾過及びSDS の除去を
した結果を示した図である。
【図９】ダニアレルゲン融合蛋白質でダニ喘息患者洗浄
血球を滴定した結果を示した図である。
血球を滴定した結果を示した図である。
【図１０】組換えダニアレルゲンのディレーションミュ
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の○印の断片が抗原活性のあることを示す。
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の○印の断片が抗原活性のあることを示す。
【図１１】組換えダニアレルゲンのディレーションミュ
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の−，＋，＋＋＋はディレーションミュータントａ，
ｂ，ｃ，ｄについての抗原活性の程度を示す。
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の−，＋，＋＋＋はディレーションミュータントａ，
ｂ，ｃ，ｄについての抗原活性の程度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 和田 武志 広島県佐伯郡大野町908番地334号 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/435 C12N 15/12 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (21)
- 【請求項１】 ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得
られる、以下の部分的アミノ酸配列（配列番号：１）、
又は該アミノ酸配列において、１個若しくは複数のアミ
ノ酸に、置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ
酸配列を含むアレルゲン活性を有する組換えダニアレル
ゲン。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile - 【請求項２】 ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得
られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：２）、又は該
アミノ酸配列において、１個若しくは複数のアミノ酸
に、置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配
列を含むアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲ
ン。 Phe Val Met Lys Arg Glu Pro Leu Arg Phe Arg Asp Ile Thr Val Glu Gly Asn Glu Asn Ala Tyr Ile Lys Asn Gly Lys Leu His Leu Ser Leu Met Asp Pro Ser Thr Leu Ser Leu Val Thr Lys Ala Asp Gly Lys Ile Asp Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Phe His Glu Gly Glu Leu Ser Ala Ser Ile Val Asn Pro Arg Leu Ser Trp His Gln Tyr Thr Lys Arg Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala Leu Lys Ile Thr Met Pro Asp Tyr Asn Ser Lys Ile His Tyr Ser Arg Gln Gly Asp Gln Ile Asn Met Asp Ile Asp Gly Thr Leu Ile Glu Gly His Ala Gln Gly Thr Ile Arg Glu Gly Lys Ile His Ile Lys Gly Arg Gln Thr Asp Phe Glu Ile Glu Ser Asn Tyr Arg Tyr Glu Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Lys Ser Glu Asn Gly Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Thr Leu Glu Thr Pro Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Tyr Ala Pro Val Lys Val Phe Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Ile His Phe Glu Lys His Thr Asp Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Val Arg Tyr Lys Ile Ile Gly Asn Gly Lys Leu Lys Asp Asp Gly Arg His Tyr Ser Ile Asp Val Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Leu Lys Val Ser Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn Glu Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Leu Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Phe Ile Val Glu Asp Asn - 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子がコナヒョ
ウヒダニ虫体由来の遺伝子である請求項１又は２記載の
組換えダニアレルゲン。 - 【請求項４】 分子量が約40,000(SDS-PAGE)である請求
項１、２又は３記載の組換えダニアレルゲン。 - 【請求項５】 全塩基鎖長が約1.2kbp（アガロース電気
泳動法）であって、図４の制限酵素地図を有する遺伝子
の発現によって得られるものである請求項１〜４のいず
れか記載の組換えダニアレルゲン。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか記載の組換えダ
ニアレルゲンが他の蛋白質と融合していることを特徴と
する融合組換えダニアレルゲン。 - 【請求項７】 請求項６記載の他の蛋白質がβ−ガラク
トシダーゼである請求項６記載の融合組換えダニアレル
ゲン。 - 【請求項８】 分子中に、配列番号：１に記載の部分的
アミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１個若し
くは複数のアミノ酸に、置換、欠失、付加若しくは挿入
を有するアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有する蛋
白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。 - 【請求項９】 分子中に、配列番号：２に記載のアミノ
酸配列、又は該アミノ酸配列において、１個若しくは複
数のアミノ酸に、置換、欠失、付加若しくは挿入を有す
るアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有する蛋白質を
コードしているダニ虫体由来の遺伝子。 - 【請求項１０】 以下のＤＮＡ配列（配列番号：１）、
又は該ＤＮＡ配列において、１個若しくは複数の塩基
に、置換、欠失、付加若しくは挿入を有するＤＮＡ配列
を含むものである請求項８記載ダニ虫体由来の遺伝子。 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT GCA TCG ATC - 【請求項１１】 以下のＤＮＡ配列（配列番号：２）、
又は該ＤＮＡ配列において、１個若しくは複数の塩基
に、置換、欠失、付加若しくは挿入を有するＤＮＡ配列
を含むものである請求項９記載のダニ虫体由来の遺伝
子。 TTT GTC ATG AAA CGA GAA CCA TTG CGA TTC AGA GAC ATC ACT GTC GAA GGA AAC GAA AAT GCC TAT ATC AAA AAT GGC AAA CTT CAT TTG TCG CTT ATG GAT CCG TCA ACA TTG AGT TTA GTC ACG AAA GCC GAT GGA AAA ATC GAC ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC AAC CTT TTC CAT GAA GGT GAA TTG AGT GCA TCG ATC GTA AAC CCA CGA TTG TCA TGG CAT CAA TAC ACG AAA CGC GAT TCT CGT GAA TAC AAG AGT GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCG GAC ATT GCT CTC AAG ATT ACG ATG CCT GAT TAT AAT TCG AAA ATT CAT TAT TCA CGA CAA GGT GAT CAA ATC AAC ATG GAC ATC GAT GGT ACA TTG ATC GAA GGT CAT GCA CAA GGA ACC ATC AGA GAA GGT AAA ATC CAC ATT AAA GGT AGA CAA ACT GAT TTC GAG ATC GAA TCC AAC TAC CGA TAC GAA GAT GGC AAA CTA ATC ATC GAA CCG GTC AAG AGT GAA AAT GGC AAA TTG GAA GGC GTT CTT TCC CGT AAG GTG CCA TCA CAT CTG ACA CTA GAA ACA CCA CGA GTC AAG ATG AAT ATG AAA TAT GAT CGA TAT GCA CCA GTC AAA GTG TTC AAA TTG GAT TAT GAT GGC ATC CAC TTC GAG AAA CAT ACC GAT ATT GAA TAC GAA CCT GGC GTT CGA TAC AAG ATC ATC GGC AAT GGA AAA CTC AAG GAT GAT GGC CGC CAC TAT TCT ATC GAT GTG CAA GGT ATT CCA CGC AAA GCA TTC AAT CTG GAC GCT GAC TTG ATG GAT TTC AAA CTG AAA GTG AGC AAG CCA GAA GAT AGC AAT AAA GCT CAA TTC AGC TAC ACA TTC AAC GAA TAT ACC GAG ACC GAA GAA TAT GAA TTC GAT CCA CAT CGT GCC TAT TAT GTT AAT TGG TTG AGT TCC ATT CGC AAA TAC ATC CAG AAT TTC ATC GTC GAA GAC AAC - 【請求項１２】 配列番号：２に記載の塩基配列におい
て、少なくとも塩基番号：１３７〜２３７、塩基番号：
２３７〜３６７または塩基番号：１３７〜３６７にコー
ドされているアミノ酸配列を含有してなるダニアレルゲ
ン断片。 - 【請求項１３】 ダニ虫体由来のダニアレルゲンに含ま
れるエピトープを有し、以下のアミノ酸配列（配列番
号：３）を含有するポリペプチド。 Met Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Val Thr Lys Arg Ala Ser Leu Lys Ile Asp Ser Lys Lys Tyr - 【請求項１４】 ダニ虫体由来のダニアレルゲンに含ま
れるエピトープを有し、以下のアミノ酸配列（配列番
号：４）を含有するポリペプチド。 Asp Val Glu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Asp Ile Ala - 【請求項１５】 請求項１３又は１４記載のポリペプチ
ドをコードしている遺伝子。 - 【請求項１６】 以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）を
含むものである請求項１５記載の遺伝子。 ATG ACA GTA GAC TTG ATA TCG CCA GTC ACA AAA CGT GCA TCG TTG AAA ATT GAT TCA AAG AAA TAC - 【請求項１７】 以下のＤＮＡ配列（配列番号：４）を
含むものである請求項１５記載の遺伝子。 GAT GTA GAA CTA TCG TTG CGA TCG TCG GAC ATT GCT - 【請求項１８】 形質転換された細菌、酵母又は哺乳動
物細胞中において、請求項８〜１１のいずれか記載の遺
伝子を発現させ得る発現ベクター。 - 【請求項１９】 請求項１８記載の発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞。 - 【請求項２０】 請求項１９記載の細菌、酵母又は哺乳
動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組
換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニア
レルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレル
ゲンの製造方法。 - 【請求項２１】 請求項１９記載の細菌、酵母又は哺乳
動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融
合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニ
アレルゲンを回収し、次いで、融合している他の蛋白質
を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲン
の製造方法。
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