JP3068879B2 - 精製ダニアレルゲン - Google Patents
精製ダニアレルゲンInfo
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアレルゲン活性を有する
精製ダニアレルゲンに関するものである。
精製ダニアレルゲンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療法としては、アレルギーの原
因物質であるアレルゲンを投与して減感作する減感作療
法が、最も重要な根本療法とされ、特に花粉症を始め昆
虫アレルギー等、抗原が特定され易い疾患においては、
その評価は今や確立されたものといえる。しかしなが
ら、この減感作療法ではアレルゲンによるアナフィラキ
シーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要と
される。
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療法としては、アレルギーの原
因物質であるアレルゲンを投与して減感作する減感作療
法が、最も重要な根本療法とされ、特に花粉症を始め昆
虫アレルギー等、抗原が特定され易い疾患においては、
その評価は今や確立されたものといえる。しかしなが
ら、この減感作療法ではアレルゲンによるアナフィラキ
シーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要と
される。
【０００３】ダニアレルギー疾患については、屋内塵中
のダニアレルゲンとして、ヤケヒョウヒダニ（Dermatop
hagoides pteronyssinus）及びコナヒョウヒダニ（Derm
atophagoides farinae）の２種が重要であると報告され
ている[ J. Allergy : 42,14-28,(1968)] 。従来、主要
ダニアレルゲンとしてはダニ***物及び／又はダニ虫体
中に含有されている分子量24〜28kDの糖蛋白（pI 4.6〜
7.2)、及び／又は分子量14.5〜20kDの蛋白（pI 5〜8.3)
が報告されている[J. Immunol. : 125,587-592,(1980）
／ J. Allergy Clin. Immunol. : 76,753-761,(1985)／
Immunology :46,679-687,(1982）／ Int. Arch. Aller
gy Appl. Immunol. : 81,214-223,(1986)／ J. Allergy
Clin. Immunol. : 75,686-692,(1985)等] 。
のダニアレルゲンとして、ヤケヒョウヒダニ（Dermatop
hagoides pteronyssinus）及びコナヒョウヒダニ（Derm
atophagoides farinae）の２種が重要であると報告され
ている[ J. Allergy : 42,14-28,(1968)] 。従来、主要
ダニアレルゲンとしてはダニ***物及び／又はダニ虫体
中に含有されている分子量24〜28kDの糖蛋白（pI 4.6〜
7.2)、及び／又は分子量14.5〜20kDの蛋白（pI 5〜8.3)
が報告されている[J. Immunol. : 125,587-592,(1980）
／ J. Allergy Clin. Immunol. : 76,753-761,(1985)／
Immunology :46,679-687,(1982）／ Int. Arch. Aller
gy Appl. Immunol. : 81,214-223,(1986)／ J. Allergy
Clin. Immunol. : 75,686-692,(1985)等] 。
【０００４】一方、前記の主要ダニアレルゲンよりも高
分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清
IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒス
タミン遊離を誘導する成分が存在することを本発明者ら
は報告している（日本農芸化学会，62:411, 1988）。し
かし、減感作治療用抗原として用いることができる程度
までの精製は、未だなされていなかった。
分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清
IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒス
タミン遊離を誘導する成分が存在することを本発明者ら
は報告している（日本農芸化学会，62:411, 1988）。し
かし、減感作治療用抗原として用いることができる程度
までの精製は、未だなされていなかった。
【０００５】ダニアレルギー疾患の診断方法としては、
従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物
及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験が殆ど
であり、まれにRAST法による血清中のIgE 抗体価の測定
値（相対値）を併用する程度で、ダニアレルギー疾患を
直接的に断定するのはかなり困難であった。
従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物
及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験が殆ど
であり、まれにRAST法による血清中のIgE 抗体価の測定
値（相対値）を併用する程度で、ダニアレルギー疾患を
直接的に断定するのはかなり困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト) 抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、また多種類の不
純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるため
に投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが
現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されている。
また、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断は、ダ
ニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要であり、
診断システムの確立が期待されている。
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト) 抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、また多種類の不
純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるため
に投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが
現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されている。
また、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断は、ダ
ニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要であり、
診断システムの確立が期待されている。
【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬として極めて有用な
新規な精製ダニアレルゲンを提供することにある。即
ち、本発明の第１の目的は、ダニ培養中の虫体抽出液か
ら抽出しうる、アレルゲン活性を有する新規な精製ダニ
アレルゲンを提供することである。本発明の第２の目的
は、当該新規な精製ダニアレルゲンの製造方法を提供す
ることである。本発明の第３の目的は、新規なダニアレ
ルギー疾患治療剤を提供することである。本発明の第４
の目的は、新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供する
ことである。
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬として極めて有用な
新規な精製ダニアレルゲンを提供することにある。即
ち、本発明の第１の目的は、ダニ培養中の虫体抽出液か
ら抽出しうる、アレルゲン活性を有する新規な精製ダニ
アレルゲンを提供することである。本発明の第２の目的
は、当該新規な精製ダニアレルゲンの製造方法を提供す
ることである。本発明の第３の目的は、新規なダニアレ
ルギー疾患治療剤を提供することである。本発明の第４
の目的は、新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供する
ことである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ダニアレ
ルギー疾患の治療剤、診断薬を開発することを目的とし
て、コナヒョウヒダニ虫体抽出物中のアレルゲンについ
て鋭意研究を重ねた。その結果、分子量約94,000の糖蛋
白、分子量約40,000の糖蛋白、分子量約16,000の糖蛋白
および分子量約14,000の糖蛋白に強いアレルゲン活性を
有することを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成
した。
ルギー疾患の治療剤、診断薬を開発することを目的とし
て、コナヒョウヒダニ虫体抽出物中のアレルゲンについ
て鋭意研究を重ねた。その結果、分子量約94,000の糖蛋
白、分子量約40,000の糖蛋白、分子量約16,000の糖蛋白
および分子量約14,000の糖蛋白に強いアレルゲン活性を
有することを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成
した。
【０００９】即ち、本発明は下記の理化学的性質および
生物学的性質を有する精製ダニアレルゲンである。 （１）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約６０％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約94,000 アレルゲン活性を有する。 （２）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約１５％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約40,000 アレルゲン活性を有する。 （３）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約２０％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約16,000 アレルゲン活性を有する。 （４）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約１３％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約14,000 アレルゲン活性を有する。
生物学的性質を有する精製ダニアレルゲンである。 （１）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約６０％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約94,000 アレルゲン活性を有する。 （２）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約１５％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約40,000 アレルゲン活性を有する。 （３）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約２０％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約16,000 アレルゲン活性を有する。 （４）精製ダニアレルゲン 虫体抽出液に含まれる。 約１３％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約14,000 アレルゲン活性を有する。
【００１０】また、本発明はダニ虫体を磨砕した後、飽
和食塩水及び／又は中程度イオン強度の緩衝液により抽
出処理し、得られた抽出液をゲル濾過等の手法を用いて
分画することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれ
か記載の精製ダニアレルゲンの製造方法である。
和食塩水及び／又は中程度イオン強度の緩衝液により抽
出処理し、得られた抽出液をゲル濾過等の手法を用いて
分画することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれ
か記載の精製ダニアレルゲンの製造方法である。
【００１１】さらに、本発明は前記（１）〜（４）のい
ずれか記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニ
アレルギー疾患治療剤、ダニアレルギー疾患診断薬であ
る。
ずれか記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニ
アレルギー疾患治療剤、ダニアレルギー疾患診断薬であ
る。
【００１２】この明細書においては、アミノ酸等につい
て、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および当該分野に
おける慣用略号で表示する場合があり、それらを例示す
ると次の通りである。
て、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および当該分野に
おける慣用略号で表示する場合があり、それらを例示す
ると次の通りである。
【００１３】アミノ酸残基に対する略号は、以下の通り
である。 Asx アスパラギン酸及び／又はアスパラギン； Thr スレオニン； Ser セリン； Glx グルタミン酸及び／又はグルタミン； Gly グリシン； Ala アラニン； Val バリン； Ile イソロイシン； Leu ロイシン； Tyr チロシン； Phe フェニルアラニン； His ヒスチジン； Lys リジン； Arg アルギニン； Pro プロリン； Cys システイン Met メチオニン
である。 Asx アスパラギン酸及び／又はアスパラギン； Thr スレオニン； Ser セリン； Glx グルタミン酸及び／又はグルタミン； Gly グリシン； Ala アラニン； Val バリン； Ile イソロイシン； Leu ロイシン； Tyr チロシン； Phe フェニルアラニン； His ヒスチジン； Lys リジン； Arg アルギニン； Pro プロリン； Cys システイン Met メチオニン
【００１４】糖に対する略号は、以下の通りである。 Fuc フコース； Ara アラビノース； Xyl キシロース； Gal ガラクトース； Man マンノース； Glc グルコース； HexNAc アミノ糖
【００１５】本発明において、精製ダニアレルゲンは前
記の各〜の要件を満足する限り、単一の精製ダニア
レルゲンよりなるもの、また複数のダニアレルゲンより
なるもの（すなわち、精製ダニアレルゲンの混合物の態
様）のいずれでもよい。
記の各〜の要件を満足する限り、単一の精製ダニア
レルゲンよりなるもの、また複数のダニアレルゲンより
なるもの（すなわち、精製ダニアレルゲンの混合物の態
様）のいずれでもよい。
【００１６】以下、本発明の精製ダニアレルゲンの代表
例についてより詳細に説明する。 ａ）精製ダニアレルゲン（Dfb-94) （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：SDS-PAGEにより約94,000である。 （４）組成成分：組成成分からの解析では、糖含量が約
60％を占める。
例についてより詳細に説明する。 ａ）精製ダニアレルゲン（Dfb-94) （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：SDS-PAGEにより約94,000である。 （４）組成成分：組成成分からの解析では、糖含量が約
60％を占める。
【００１７】〔アミノ酸組成〕0.2%サンプル溶液２００
μl を１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ2 置換をした
密封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解した。乾
固させた後、少量の水を加え再び乾固させるという操作
を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミ
ノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解し、アミ
ノ酸アナライザー（ベックマン社）により定量した。
μl を１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ2 置換をした
密封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解した。乾
固させた後、少量の水を加え再び乾固させるという操作
を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミ
ノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解し、アミ
ノ酸アナライザー（ベックマン社）により定量した。
【００１８】〔糖の組成〕全中性糖は、Glucose を標準
としてフェノール硫酸法で定量した。個々の中性糖とア
ミノ糖は、試料を４Ｎトリフルオロ酢酸（TFA)中で、１
００℃、４時間加水分解し、NaBH4 で還元後、無水酢酸
を用いて１００℃、４時間加熱してアセチル化した後、
ＧＬＣ法で定量した。 アミノ酸（計３２６０．１ nmol/mg) Asp 413.2 ； Thr 461.0 ； Ser 298.0 ； Glu 521.4 ； Gly 127.8 ； Ala 150.4 ； Cys 21.5 ； Val 212.5 ； Met 19.4 ； Ile 77.0 ； Leu 370.4 ； Tyr 3.3 ； Phe 55.7 ； His 30.3 ； Lys 322.2 ； Arg 68.3 ； Pro 107.7 中性糖（計３１５４．９ nmol/mg) Fuc 216.5 ； Ara 426.7 ； Xyl 490.0 ； Gal 350.0 ； Man 1671.7 ； Glc − アミノ糖（計２６５．２ nmol/mg) HexNAc 265.2
としてフェノール硫酸法で定量した。個々の中性糖とア
ミノ糖は、試料を４Ｎトリフルオロ酢酸（TFA)中で、１
００℃、４時間加水分解し、NaBH4 で還元後、無水酢酸
を用いて１００℃、４時間加熱してアセチル化した後、
ＧＬＣ法で定量した。 アミノ酸（計３２６０．１ nmol/mg) Asp 413.2 ； Thr 461.0 ； Ser 298.0 ； Glu 521.4 ； Gly 127.8 ； Ala 150.4 ； Cys 21.5 ； Val 212.5 ； Met 19.4 ； Ile 77.0 ； Leu 370.4 ； Tyr 3.3 ； Phe 55.7 ； His 30.3 ； Lys 322.2 ； Arg 68.3 ； Pro 107.7 中性糖（計３１５４．９ nmol/mg) Fuc 216.5 ； Ara 426.7 ； Xyl 490.0 ； Gal 350.0 ； Man 1671.7 ； Glc − アミノ糖（計２６５．２ nmol/mg) HexNAc 265.2
【００１９】（５）アレルゲン活性を有する。ダニアレ
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
【００２０】ｂ）精製ダニアレルゲン（Dfb-40) （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：SDS-PAGEにより約40,000である。 （４）組成成分：前記の方法による組成成分の解析で
は、糖含量は約15％を占める。 アミノ酸（計６７９２．９ nmol/mg) Asp 613.1 ； Thr 361.0 ； Ser 483.3 ； Glu 846.4 ； Gly 676.4 ； Ala 875.4 ； Cys 81.7 ； Val 511.1 ； Met 10.7 ； Ile 273.6 ； Leu 540.4 ； Tyr 93.3 ； Phe 212.5 ； His 147.6 ； Lys 433.7 ； Arg 334.7 ； Pro 298.0 中性糖（計７９７．４ nmol/mg) Fuc 12.2 ； Ara 28.7 ； Xyl 153.3 ； Gal 79.4 ； Man 469.4 ； Glc 54.4 アミノ糖（計６７．４ nmol/mg) HexNAc 67.4
は、糖含量は約15％を占める。 アミノ酸（計６７９２．９ nmol/mg) Asp 613.1 ； Thr 361.0 ； Ser 483.3 ； Glu 846.4 ； Gly 676.4 ； Ala 875.4 ； Cys 81.7 ； Val 511.1 ； Met 10.7 ； Ile 273.6 ； Leu 540.4 ； Tyr 93.3 ； Phe 212.5 ； His 147.6 ； Lys 433.7 ； Arg 334.7 ； Pro 298.0 中性糖（計７９７．４ nmol/mg) Fuc 12.2 ； Ara 28.7 ； Xyl 153.3 ； Gal 79.4 ； Man 469.4 ； Glc 54.4 アミノ糖（計６７．４ nmol/mg) HexNAc 67.4
【００２１】（５）アレルゲン活性を有する。ダニアレ
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
【００２２】ｃ）精製ダニアレルゲン（Dfb-16) （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：SDS-PAGEにより約16,000である。 （４）組成成分：前記の方法による組成成分の解析で
は、糖含量は約20％を占める。 アミノ酸（計６３７８．４ nmol/mg) Asp 753.6 ； Thr 569.3 ； Ser 530.0 ； Glu 728.1 ； Gly 523.3 ； Ala 456.8 ； Cys 64.4 ； Val 428.3 ； Met 12.7 ； Ile 310.2 ； Leu 424.5 ； Tyr 164.5 ； Phe 191.7 ； His 122.4 ； Lys 407.0 ； Arg 350.2 ； Pro 341.4 中性糖（計７７８．４ nmol/mg) Fuc 47.6 ； Ara 48.0 ； Xyl 320.7 ； Gal 182.7 ； Man − ； Glc 179.4 アミノ糖（計２９０．５ nmol/mg) HexNAc 290.5
は、糖含量は約20％を占める。 アミノ酸（計６３７８．４ nmol/mg) Asp 753.6 ； Thr 569.3 ； Ser 530.0 ； Glu 728.1 ； Gly 523.3 ； Ala 456.8 ； Cys 64.4 ； Val 428.3 ； Met 12.7 ； Ile 310.2 ； Leu 424.5 ； Tyr 164.5 ； Phe 191.7 ； His 122.4 ； Lys 407.0 ； Arg 350.2 ； Pro 341.4 中性糖（計７７８．４ nmol/mg) Fuc 47.6 ； Ara 48.0 ； Xyl 320.7 ； Gal 182.7 ； Man − ； Glc 179.4 アミノ糖（計２９０．５ nmol/mg) HexNAc 290.5
【００２３】（５）アレルゲン活性を有する。ダニアレ
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
【００２４】ｄ）精製ダニアレルゲン（Dfb-14) （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：SDS-PAGEにより約14,000である。 （４）組成成分：前記の方法による組成成分の解析で
は、糖含量は約13％を占める。 アミノ酸（計６６０１．５ nmol/mg) Asp 722.8 ； Thr 715.4 ； Ser 577.5 ； Glu 870.2 ； Gly 471.4 ； Ala 576.9 ； Cys 59.4 ； Val 355.8 ； Met 76.4 ； Ile 281.3 ； Leu 554.1 ； Tyr 15.5 ； Phe 72.8 ； His 130.2 ； Lys 500.7 ； Arg 237.1 ； Pro 384.0 中性糖（計５６４．３ nmol/mg) Fuc 37.8 ； Ara 20.0 ； Xyl 219.3 ； Gal 66.1 ； Man 32.8 ； Glc 188.3 アミノ糖（計１８４．２ nmol/mg) HexNAc 184.2
は、糖含量は約13％を占める。 アミノ酸（計６６０１．５ nmol/mg) Asp 722.8 ； Thr 715.4 ； Ser 577.5 ； Glu 870.2 ； Gly 471.4 ； Ala 576.9 ； Cys 59.4 ； Val 355.8 ； Met 76.4 ； Ile 281.3 ； Leu 554.1 ； Tyr 15.5 ； Phe 72.8 ； His 130.2 ； Lys 500.7 ； Arg 237.1 ； Pro 384.0 中性糖（計５６４．３ nmol/mg) Fuc 37.8 ； Ara 20.0 ； Xyl 219.3 ； Gal 66.1 ； Man 32.8 ； Glc 188.3 アミノ糖（計１８４．２ nmol/mg) HexNAc 184.2
【００２５】（５）アレルゲン活性を有する。ダニアレ
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。
【００２６】〔製造方法〕本発明の精製ダニアレルゲン
の製造方法としては、たとえば次のような方法が例示さ
れる。
の製造方法としては、たとえば次のような方法が例示さ
れる。
【００２７】ａ）粗ダニ虫体抗原の調製 ダニ抗原の製造原料として、コナヒョウヒダニまたはヤ
ケヒョウヒダニのいずれを用いてもよい。これらのダニ
をダニ培養培地で培養し、ダニ虫体から粗抗原を抽出処
理する。抽出処理は飽和食塩水及び／又はリン酸緩衝液
を加えて攪拌し、室温で30分間静置した後に、遠心分離
(3000 rpm 、30分) を行い上清をプールする。プールし
た上清に浮遊するダニ虫体をろ過して集める。このダニ
虫体を抽出し、溶媒と共に磨砕後、遠心分離し、その上
清を透析、凍結乾燥してダニ虫体粗抗原（出発原料）と
する。この際、抽出溶媒としては他に、中程度イオン強
度の緩衝液であればいずれをを用いてもよい。例えば、
乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
ケヒョウヒダニのいずれを用いてもよい。これらのダニ
をダニ培養培地で培養し、ダニ虫体から粗抗原を抽出処
理する。抽出処理は飽和食塩水及び／又はリン酸緩衝液
を加えて攪拌し、室温で30分間静置した後に、遠心分離
(3000 rpm 、30分) を行い上清をプールする。プールし
た上清に浮遊するダニ虫体をろ過して集める。このダニ
虫体を抽出し、溶媒と共に磨砕後、遠心分離し、その上
清を透析、凍結乾燥してダニ虫体粗抗原（出発原料）と
する。この際、抽出溶媒としては他に、中程度イオン強
度の緩衝液であればいずれをを用いてもよい。例えば、
乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００２８】ｂ）粗ダニ虫体抗原の精製 粗ダニ***物抗原の精製は、(i) ダニ喘息患者血清特
異IgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗ダニ虫
体抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) により測定
することによる、各フラクションの抗原活性の測定(Imm
unochemistry, 8, 871 (1971))、(ii) ウサギ抗ダニ虫
体血清を用いたラジオイムノアッセイによる、各フラク
ションの抗原活性の測定、(iii) 皮内反応活性によ
る、各フラクションのアレルゲン活性の測定、(iv) ダ
ニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活性による、各
フラクションのアレルゲン活性の測定、等のモニターの
下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィ
ー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、
焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を単独または組み合
わせて精製することができる。例えば、次のような方法
が例示される。
異IgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗ダニ虫
体抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) により測定
することによる、各フラクションの抗原活性の測定(Imm
unochemistry, 8, 871 (1971))、(ii) ウサギ抗ダニ虫
体血清を用いたラジオイムノアッセイによる、各フラク
ションの抗原活性の測定、(iii) 皮内反応活性によ
る、各フラクションのアレルゲン活性の測定、(iv) ダ
ニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活性による、各
フラクションのアレルゲン活性の測定、等のモニターの
下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィ
ー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、
焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を単独または組み合
わせて精製することができる。例えば、次のような方法
が例示される。
【００２９】（i) 粗ダニ虫体抗原の精製 粗ダニ虫体抗原をウルトロゲル AcA 54 (LKB社) でゲル
濾過する。その時の溶出パターンをダニ喘息患者血清特
異IgG 及び特異IgE 、及びウサギ抗ダニ虫体抗体に対す
る反応性(ELISA) 、患者白血球ヒスタミン遊離能でモニ
ターし、蛋白含量及び280nm の吸収をガイドに画分に分
ける。
濾過する。その時の溶出パターンをダニ喘息患者血清特
異IgG 及び特異IgE 、及びウサギ抗ダニ虫体抗体に対す
る反応性(ELISA) 、患者白血球ヒスタミン遊離能でモニ
ターし、蛋白含量及び280nm の吸収をガイドに画分に分
ける。
【００３０】患者血清特異IgG 及び特異IgE 、及びウサ
ギ抗ダニ虫体抗体を用いるELISA での反応性が強く、白
血球ヒスタミン遊離能及び皮内反応活性が強い画分につ
いて、更に調製用ディスクSDS-PAGEを用いて、抗原成分
の分離を行う。例えばゲルからの目的の抗原成分の抽出
は、0.1 ％SDS 溶液を用いて振盪拡散法と電気溶出法で
行い、更に抽出に用いた SDSをイオン交換樹脂 AG11A8
(Bio Rad社) に通して吸着除去し、抗原活性成分を精製
することができる。
ギ抗ダニ虫体抗体を用いるELISA での反応性が強く、白
血球ヒスタミン遊離能及び皮内反応活性が強い画分につ
いて、更に調製用ディスクSDS-PAGEを用いて、抗原成分
の分離を行う。例えばゲルからの目的の抗原成分の抽出
は、0.1 ％SDS 溶液を用いて振盪拡散法と電気溶出法で
行い、更に抽出に用いた SDSをイオン交換樹脂 AG11A8
(Bio Rad社) に通して吸着除去し、抗原活性成分を精製
することができる。
【００３１】〔ダニアレルギー疾患治療剤としての適
用〕本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患
に対する減感作治療剤として有用である。ここでダニア
レルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー
性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダ
ニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をい
う。
用〕本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患
に対する減感作治療剤として有用である。ここでダニア
レルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー
性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダ
ニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をい
う。
【００３２】前記の方法により精製された精製ダニアレ
ルゲンは、濃縮して溶液状又はシロップ状として採取す
るか、更に乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー疾
患に対する減感作治療剤として用いられる。本減感作治
療剤はそのままで、又は必要に応じて一般的に用いられ
るアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形
剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存
剤、着色剤等を添加した配合剤として用いることができ
る。
ルゲンは、濃縮して溶液状又はシロップ状として採取す
るか、更に乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー疾
患に対する減感作治療剤として用いられる。本減感作治
療剤はそのままで、又は必要に応じて一般的に用いられ
るアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形
剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存
剤、着色剤等を添加した配合剤として用いることができ
る。
【００３３】本減感作治療剤は、通常の投与経路、例え
ば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法に
より行うことができる。更に、例えばトローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することが
できる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与
経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
ば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法に
より行うことができる。更に、例えばトローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することが
できる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与
経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
【００３４】また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾
患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用であ
る。本減感作治療剤は、アナフィラキシー誘発作用もな
く、人体に対して安全に用いることができる。
患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用であ
る。本減感作治療剤は、アナフィラキシー誘発作用もな
く、人体に対して安全に用いることができる。
【００３５】〔ダニアレルギー疾患診断薬としての適
用〕本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患
の診断薬として有用である。即ち、患者の血液、及びこ
の血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に
懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ精製ダニアレ
ルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激
により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミ
ン量を測定する[ アレルギー：33,692,(1984) ／アレル
ギー：33,733,(1984)]。
用〕本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患
の診断薬として有用である。即ち、患者の血液、及びこ
の血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に
懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ精製ダニアレ
ルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激
により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミ
ン量を測定する[ アレルギー：33,692,(1984) ／アレル
ギー：33,733,(1984)]。
【００３６】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の50％量( 滴定曲線の変曲点) から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（i) 血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る、（ii）血液の滴定値は、通常、血球浮遊液の値より
高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能
を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。
の50％量( 滴定曲線の変曲点) から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（i) 血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る、（ii）血液の滴定値は、通常、血球浮遊液の値より
高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能
を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。
【００３７】従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液
滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得ら
れる。感受性とこの遮断抗体価から表１のように、ダニ
アレルギーの正確な診断が可能となる。また、減感作治
療効果のモニターとしても有用である。
滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得ら
れる。感受性とこの遮断抗体価から表１のように、ダニ
アレルギーの正確な診断が可能となる。また、減感作治
療効果のモニターとしても有用である。
【表１】
【００３８】〔アレルゲン活性及びアナフィラキシー誘
発試験〕本発明の精製ダニアレルゲンは、下記の実験に
よりアレルゲン活性を有し、アナフィラキシー誘発性は
無いことが判明した。 実験例１ Balb/Cマウス（４週令）２匹の腹腔内に、Dfb-94、Dfb-
40、Dfb-16及び Dfb-14 それぞれ 100μg をFreund com
plete adjuvant（Difco)と混合して注入することによ
り、０週目に初回免疫をした。追加免疫は２週目と４週
目に行った。マウスの血清中の抗 Dfb-94 、抗 Dfb-40
、抗 Dfb-16 及び抗 Dfb-14 抗体価が上昇し、充分な
免疫原性が認められた。従って、遮断抗体誘導能があ
り、治療用抗原として用いることができると判断され
た。一例としてDfb-94の免疫原性試験の結果を図１に示
す。
発試験〕本発明の精製ダニアレルゲンは、下記の実験に
よりアレルゲン活性を有し、アナフィラキシー誘発性は
無いことが判明した。 実験例１ Balb/Cマウス（４週令）２匹の腹腔内に、Dfb-94、Dfb-
40、Dfb-16及び Dfb-14 それぞれ 100μg をFreund com
plete adjuvant（Difco)と混合して注入することによ
り、０週目に初回免疫をした。追加免疫は２週目と４週
目に行った。マウスの血清中の抗 Dfb-94 、抗 Dfb-40
、抗 Dfb-16 及び抗 Dfb-14 抗体価が上昇し、充分な
免疫原性が認められた。従って、遮断抗体誘導能があ
り、治療用抗原として用いることができると判断され
た。一例としてDfb-94の免疫原性試験の結果を図１に示
す。
【００３９】実験例２ モルモット２匹の腹腔内に、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16及
び Dfb-14 それぞれ１mgを Alum に加えて注入すること
により、０週目に初回免疫をし、追加免疫は３週目に行
った。対照は、モルモット１匹の腹腔内に Alum を加え
た生理食塩水を同様に注入した。モルモットにおいても
血清中の抗 Dfb-94 、抗 Dfb-40 、抗 Dfb-16 及び抗 D
fb-14 抗体価は上昇し、充分な免疫原性が認められた。
しかし、３週目の追加免疫の直後の観察では、アナフィ
ラキシー症状は全く認められなかった。このことから、
Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16及び Dfb-14 にはアナフィラキ
シー誘発性は無いと判断された。一例として、Dfb-94の
免疫原性およびアナフィラキシー誘発性試験の結果を図
２に示す。
び Dfb-14 それぞれ１mgを Alum に加えて注入すること
により、０週目に初回免疫をし、追加免疫は３週目に行
った。対照は、モルモット１匹の腹腔内に Alum を加え
た生理食塩水を同様に注入した。モルモットにおいても
血清中の抗 Dfb-94 、抗 Dfb-40 、抗 Dfb-16 及び抗 D
fb-14 抗体価は上昇し、充分な免疫原性が認められた。
しかし、３週目の追加免疫の直後の観察では、アナフィ
ラキシー症状は全く認められなかった。このことから、
Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16及び Dfb-14 にはアナフィラキ
シー誘発性は無いと判断された。一例として、Dfb-94の
免疫原性およびアナフィラキシー誘発性試験の結果を図
２に示す。
【００４０】〔実施例〕以下に、実施例を挙げて本発明
を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
【００４１】実施例１ ダニ虫体粗抗原の調製：ラット、マウス、ハムスター用
飼料Ｍ（オリエンタル酵母社）中で、温度２６±２℃、
湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培
地程度になるようにコナヒョウヒダニを飼育したものを
ダニ培養物とした。これを凍結殺ダニし、その１２．２
ｋｇに質量換算で、１０倍量の飽和食塩水を加え、穏や
かによく攪拌した。４℃、１時間静置後、４℃、３００
０ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、ダニ虫体を上清表
面に浮遊させ、吸引ろ過により回収した。次に、得られ
たダニ虫体１．７ｋｇに重量にして半量のＰＢＳを加
え、乳鉢でよくすりつぶし、この磨砕物に更にｆｉｎａ
ｌで２倍量になるようにＰＢＳを加え、時々攪拌しなが
ら１時間抽出した。この懸濁液を４℃、８０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離し、その上清をイオン交換水に対し
て透析した後、不溶物を除くため、更に４℃、８０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を凍結乾燥すること
によりダニ虫体粗抗原（Ｄｆｂ）１９．６ｇを得た。
飼料Ｍ（オリエンタル酵母社）中で、温度２６±２℃、
湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培
地程度になるようにコナヒョウヒダニを飼育したものを
ダニ培養物とした。これを凍結殺ダニし、その１２．２
ｋｇに質量換算で、１０倍量の飽和食塩水を加え、穏や
かによく攪拌した。４℃、１時間静置後、４℃、３００
０ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、ダニ虫体を上清表
面に浮遊させ、吸引ろ過により回収した。次に、得られ
たダニ虫体１．７ｋｇに重量にして半量のＰＢＳを加
え、乳鉢でよくすりつぶし、この磨砕物に更にｆｉｎａ
ｌで２倍量になるようにＰＢＳを加え、時々攪拌しなが
ら１時間抽出した。この懸濁液を４℃、８０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離し、その上清をイオン交換水に対し
て透析した後、不溶物を除くため、更に４℃、８０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を凍結乾燥すること
によりダニ虫体粗抗原（Ｄｆｂ）１９．６ｇを得た。
【００４２】実施例２ 虫体粗抗原のウルトロゲルＡｃＡ５４（ＬＫＢ社）によ
る分画 ０．９％ＮａＣｌ溶液で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ
54（ＬＫＢ社：カラム体積 4.4×75.0ｃｍ）に２％（w/
v)ダニ虫体粗抗原３０ｍｌを２０００ｒｐｍ、１０分間
遠心分離し、不溶解物を除去したものをかけ、ＵＶ２８
０nmのモニター下に、流速２ｍｌ／分でフラクションボ
リューム３２ｍｌで分画した。各フラクションの抗原活
性は、患者血清及びウサギ抗虫体粗抗原血清のＥＬＩＳ
Ａにより測定した。タンパク、中性糖分布はそれぞれ、
ホリンローリー法、フェノール硫酸法で決定した。予め
行った Analytical scale でのアレルゲン分布とＵＶ２
８０nm吸収パターンにより、４画分（Ｄｆｂ１〜４）に
分画した（図３）。各画分の収量はＤｆｂ１ｇからＤｆ
ｂ１が５０６mg、Ｄｆｂ２が１４８mg、Ｄｆｂ３が３３
mgおよびＤｆｂ４が３mgであった。
る分画 ０．９％ＮａＣｌ溶液で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ
54（ＬＫＢ社：カラム体積 4.4×75.0ｃｍ）に２％（w/
v)ダニ虫体粗抗原３０ｍｌを２０００ｒｐｍ、１０分間
遠心分離し、不溶解物を除去したものをかけ、ＵＶ２８
０nmのモニター下に、流速２ｍｌ／分でフラクションボ
リューム３２ｍｌで分画した。各フラクションの抗原活
性は、患者血清及びウサギ抗虫体粗抗原血清のＥＬＩＳ
Ａにより測定した。タンパク、中性糖分布はそれぞれ、
ホリンローリー法、フェノール硫酸法で決定した。予め
行った Analytical scale でのアレルゲン分布とＵＶ２
８０nm吸収パターンにより、４画分（Ｄｆｂ１〜４）に
分画した（図３）。各画分の収量はＤｆｂ１ｇからＤｆ
ｂ１が５０６mg、Ｄｆｂ２が１４８mg、Ｄｆｂ３が３３
mgおよびＤｆｂ４が３mgであった。
【００４３】このようにして、ウルトロゲルＡｃＡ５４
（ＬＫＢ社）で分画して得られた４画分について、喘息
患者の皮内反応試験を行った。その結果、４画分（Ｄｆ
ｂ１〜４）のうち、Ｄｆｂ２画分に最も強い皮内反応活
性が見られ、またヒスタミン遊離試験においても、この
画分が最も強いアレルゲン活性を示した（表２）。この
結果から、このＤｆｂ２画分が虫体粗抗原中の主要アレ
ルゲンを多量に含有していると考えられた。
（ＬＫＢ社）で分画して得られた４画分について、喘息
患者の皮内反応試験を行った。その結果、４画分（Ｄｆ
ｂ１〜４）のうち、Ｄｆｂ２画分に最も強い皮内反応活
性が見られ、またヒスタミン遊離試験においても、この
画分が最も強いアレルゲン活性を示した（表２）。この
結果から、このＤｆｂ２画分が虫体粗抗原中の主要アレ
ルゲンを多量に含有していると考えられた。
【表２】
【００４４】実施例３ Ｄｆｂ２画分の SDS-PAGE, Wstern blot, Immuno stain
によるアレルゲン成分の検出 アレルゲン活性最強のＤｆｂ２画分を SDS-PAGE にかけ
た。試料の還元、非還元による影響は、分子量約１００
ｋのバンドが、還元する際に消出する以外は変化がなか
った。Ｄｆｂ２画分の SDS-PAGE による分子量分布は、
１４ｋから９４ｋまで幅広く分布していた。これを Wes
tern blot し、Auro Dye（Janssen Pharmaceutica 社)
と免疫染色を行ったところ、患者により、Ｄｆｂ２画分
中の様々な成分に反応しているが、９４ｋ、６０ｋ、４
０ｋ、１６ｋ、１４ｋの成分は、非常に高い頻度で反応
していた。このことから、これらがアレルゲン活性最強
画分Ｄｆｂ２の主要アレルゲン成分であると推測され
た。
によるアレルゲン成分の検出 アレルゲン活性最強のＤｆｂ２画分を SDS-PAGE にかけ
た。試料の還元、非還元による影響は、分子量約１００
ｋのバンドが、還元する際に消出する以外は変化がなか
った。Ｄｆｂ２画分の SDS-PAGE による分子量分布は、
１４ｋから９４ｋまで幅広く分布していた。これを Wes
tern blot し、Auro Dye（Janssen Pharmaceutica 社)
と免疫染色を行ったところ、患者により、Ｄｆｂ２画分
中の様々な成分に反応しているが、９４ｋ、６０ｋ、４
０ｋ、１６ｋ、１４ｋの成分は、非常に高い頻度で反応
していた。このことから、これらがアレルゲン活性最強
画分Ｄｆｂ２の主要アレルゲン成分であると推測され
た。
【００４５】実施例４ 大型ディスク SDS-PAGE によるアレルゲンの分離・抽出
・精製 Ｄｆｂ２画分中のアレルゲンと思われる９４ｋ、６０
ｋ、４０ｋ、１６ｋおよび１４ｋを大型ディスク SDS-P
AGE で精製した。２０ｍｇのＤｆｂ２と標準物質を大型
ディスク SDS-PAGE に入れ、泳動したときの分離の様子
を図４に示す。図４中、矢印で示した９４ｋ、６０ｋ、
４０ｋ、１６ｋおよび１４ｋのアレルゲンに相当すると
考えられるゲル部をそれぞれ切出し、振盪拡散法あるい
は電気溶出法でゲルからのアレルゲン抽出を行った。精
製が不充分な場合には、必要に応じて適宜、１０％Ｔゲ
ルあるいは12.5％Ｔゲルを用いて精製を繰り返し行う。
分離精製した各成分はＤｆｂ２（１４８ｍｇ）から Dfb
-94 が 1.2ｍｇ、 Dfb-60 が 1.8ｍｇ、 Dfb-40 が 2.1
ｍｇ、 Dfb-16 が 6.5ｍｇおよび Dfb-14 が 7.7ｍｇ得
られた。
・精製 Ｄｆｂ２画分中のアレルゲンと思われる９４ｋ、６０
ｋ、４０ｋ、１６ｋおよび１４ｋを大型ディスク SDS-P
AGE で精製した。２０ｍｇのＤｆｂ２と標準物質を大型
ディスク SDS-PAGE に入れ、泳動したときの分離の様子
を図４に示す。図４中、矢印で示した９４ｋ、６０ｋ、
４０ｋ、１６ｋおよび１４ｋのアレルゲンに相当すると
考えられるゲル部をそれぞれ切出し、振盪拡散法あるい
は電気溶出法でゲルからのアレルゲン抽出を行った。精
製が不充分な場合には、必要に応じて適宜、１０％Ｔゲ
ルあるいは12.5％Ｔゲルを用いて精製を繰り返し行う。
分離精製した各成分はＤｆｂ２（１４８ｍｇ）から Dfb
-94 が 1.2ｍｇ、 Dfb-60 が 1.8ｍｇ、 Dfb-40 が 2.1
ｍｇ、 Dfb-16 が 6.5ｍｇおよび Dfb-14 が 7.7ｍｇ得
られた。
【００４６】実施例５ 分離・精製成分のアレルゲン性の確認 分離精製により得られた成分 Dfb-94 、Dfb-60、Dfb-4
0、Dfb-16および Dfb-14 を用いてニトロセルロースシ
ートへのスポット−免疫染色テストを１５人の喘息患者
血清を用いて行った。その結果を図５に示すが、これら
の成分は１５人の喘息患者ＩｇＧ血清に極めて高頻度に
反応した。しかし、 Dfb-60 は、患者ＩｇＧ血清と反応
はするものの、低頻度であった。患者ＩｇＥ血清におい
ても同様に、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16および Dfb-14 は
すべて１０人以上の高頻度で、患者ＩｇＥ血清と反応し
た。従って、これらDfb-94、Dfb-40、Dfb-16および Dfb
-14はダニ虫体抗原由来の主要アレルゲンであることが
確認された。 Dfb-60 は喘息患者ＩｇＥ血清と全く反応
せず、アレルゲンとしての可能性は薄いと判断された。
このように、ダニ虫体粗抗原から、ゲルクロマトグラフ
ィー及び大型ディスクSDS-PAGE を用いて従来報告され
ていない新規の、しかも主要アレルゲンを検出、分離・
精製し、取得した。
0、Dfb-16および Dfb-14 を用いてニトロセルロースシ
ートへのスポット−免疫染色テストを１５人の喘息患者
血清を用いて行った。その結果を図５に示すが、これら
の成分は１５人の喘息患者ＩｇＧ血清に極めて高頻度に
反応した。しかし、 Dfb-60 は、患者ＩｇＧ血清と反応
はするものの、低頻度であった。患者ＩｇＥ血清におい
ても同様に、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16および Dfb-14 は
すべて１０人以上の高頻度で、患者ＩｇＥ血清と反応し
た。従って、これらDfb-94、Dfb-40、Dfb-16および Dfb
-14はダニ虫体抗原由来の主要アレルゲンであることが
確認された。 Dfb-60 は喘息患者ＩｇＥ血清と全く反応
せず、アレルゲンとしての可能性は薄いと判断された。
このように、ダニ虫体粗抗原から、ゲルクロマトグラフ
ィー及び大型ディスクSDS-PAGE を用いて従来報告され
ていない新規の、しかも主要アレルゲンを検出、分離・
精製し、取得した。
【００４７】実施例６ 交差免疫電気泳動(CIE) による免疫学的特性の検定 実施例４で得られた精製ダニアレルゲンの免疫学的純度
を検定するために、免疫２次元電気泳動を行った。その
結果、 Dfb-94 はウサギ抗虫体血清との沈降帯をシャー
プに１本のみ形成した。このことから、この Dfb-94
は、抗原レベルで極めて均一なものであることを確認し
た。 Dfb-40 についても１本のシャープな沈降帯を形成
し、ウサギ抗血清との抗原レベルで、均一なものであっ
た。 Dfb-16 についてもかなり均一に精製されているこ
とが観察された。 Dfb-14 についても同様に沈降帯は、
１本しか得られなかった。ＣＩＥの結果により、大型デ
ィスク SDS-PAGE によって極めて均一に精製が行われて
いることが確認された。
を検定するために、免疫２次元電気泳動を行った。その
結果、 Dfb-94 はウサギ抗虫体血清との沈降帯をシャー
プに１本のみ形成した。このことから、この Dfb-94
は、抗原レベルで極めて均一なものであることを確認し
た。 Dfb-40 についても１本のシャープな沈降帯を形成
し、ウサギ抗血清との抗原レベルで、均一なものであっ
た。 Dfb-16 についてもかなり均一に精製されているこ
とが観察された。 Dfb-14 についても同様に沈降帯は、
１本しか得られなかった。ＣＩＥの結果により、大型デ
ィスク SDS-PAGE によって極めて均一に精製が行われて
いることが確認された。
【００４８】実施例７ 組成分析 Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16および Dfb-14 の組成分析を行
った。アミノ酸組成は以下の方法により定量した。0.2%
サンプル溶液２００μｌを１２Ｎ塩酸２００μｌと混合
し、Ｎ2 置換をした密封試験管内で、１１０℃で２４時
間加水分解した。乾固させた後、少量の水を加え再び乾
固させるという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸
を行い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液
１mlに溶解し、アミノ酸アナライザー（ベックマン社）
により定量した。全中性糖は、Glucose を標準としてフ
ェノール硫酸法で定量した。また、個々の中性糖とアミ
ノ糖は、試料を４Ｎトリフルオロ酢酸（TFA)中で、１０
０℃、４時間加水分解し、NaBH4 で還元後、無水酢酸を
用いて１００℃、４時間加熱してアセチル化した後、Ｇ
ＬＣ法で定量した。その結果、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16
および Dfb-14 の組成は以下の通りであった。
った。アミノ酸組成は以下の方法により定量した。0.2%
サンプル溶液２００μｌを１２Ｎ塩酸２００μｌと混合
し、Ｎ2 置換をした密封試験管内で、１１０℃で２４時
間加水分解した。乾固させた後、少量の水を加え再び乾
固させるという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸
を行い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液
１mlに溶解し、アミノ酸アナライザー（ベックマン社）
により定量した。全中性糖は、Glucose を標準としてフ
ェノール硫酸法で定量した。また、個々の中性糖とアミ
ノ糖は、試料を４Ｎトリフルオロ酢酸（TFA)中で、１０
０℃、４時間加水分解し、NaBH4 で還元後、無水酢酸を
用いて１００℃、４時間加熱してアセチル化した後、Ｇ
ＬＣ法で定量した。その結果、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16
および Dfb-14 の組成は以下の通りであった。
【００４９】 〔 Dfb-94 の組成〕 アミノ酸（計３２６０．１ nmol/mg) Asp 413.2 ； Thr 461.0 ； Ser 298.0 ； Glu 521.4 ； Gly 127.8 ； Ala 150.4 ； Cys 21.5 ； Val 212.5 ； Met 19.4 ； Ile 77.0 ； Leu 370.4 ； Tyr 3.3 ； Phe 55.7 ； His 30.3 ； Lys 322.2 ； Arg 68.3 ； Pro 107.7 中性糖（計３１５４．９ nmol/mg) Fuc 216.5 ； Ara 426.7 ； Xyl 490.0 ； Gal 350.0 ； Man 1671.7 ； Glc − アミノ糖（計２６５．２ nmol/mg) HexNAc 265.2
【００５０】 〔 Dfb-40 の組成〕 アミノ酸（計６７９２．９ nmol/mg) Asp 613.1 ； Thr 361.0 ； Ser 483.3 ； Glu 846.4 ； Gly 676.4 ； Ala 875.4 ； Cys 81.7 ； Val 511.1 ； Met 10.7 ； Ile 273.6 ； Leu 540.4 ； Tyr 93.3 ； Phe 212.5 ； His 147.6 ； Lys 433.7 ； Arg 334.7 ； Pro 298.0 中性糖（計７９７．４ nmol/mg) Fuc 12.2 ； Ara 28.7 ； Xyl 153.3 ； Gal 79.4 ； Man 469.4 ； Glc 54.4 アミノ糖（計６７．４ nmol/mg) HexNAc 67.4
【００５１】 〔 Dfb-16 の組成〕 アミノ酸（計６３７８．４ nmol/mg) Asp 753.6 ； Thr 569.3 ； Ser 530.0 ； Glu 728.1 ； Gly 523.3 ； Ala 456.8 ； Cys 64.4 ； Val 428.3 ； Met 12.7 ； Ile 310.2 ； Leu 424.5 ； Tyr 164.5 ； Phe 191.7 ； His 122.4 ； Lys 407.0 ； Arg 350.2 ； Pro 341.4 中性糖（計７７８．４ nmol/mg) Fuc 47.6 ； Ara 48.0 ； Xyl 320.7 ； Gal 182.7 ； Man − ； Glc 179.4 アミノ糖（計２９０．５ nmol/mg) HexNAc 290.5
【００５２】 〔 Dfb-14 の組成〕 アミノ酸（計６６０１．５ nmol/mg) Asp 722.8 ； Thr 715.4 ； Ser 577.5 ； Glu 870.2 ； Gly 471.4 ； Ala 576.9 ； Cys 59.4 ； Val 355.8 ； Met 76.4 ； Ile 281.3 ； Leu 554.1 ； Tyr 15.5 ； Phe 72.8 ； His 130.2 ； Lys 500.7 ； Arg 237.1 ； Pro 384.0 中性糖（計５６４．３ nmol/mg) Fuc 37.8 ； Ara 20.0 ； Xyl 219.3 ； Gal 66.1 ； Man 32.8 ； Glc 188.3 アミノ糖（計１８４．２ nmol/mg) HexNAc 184.2
【００５３】このことから、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16お
よび Dfb-14 はそれぞれ、約６０％、約１５％、約２０
％、約１３％の糖を含んでいた。Dfb-16および Dfb-14
は、従来報告されいてるダニ虫体由来主要アレルゲン D
er f II と同じような分子量をとるが、 Der f II がタ
ンパク性アレルゲンであるのに対し、Dfb-16および Dfb
-14 は糖タンパク性アレルゲンであり、異なるアレルゲ
ンである。
よび Dfb-14 はそれぞれ、約６０％、約１５％、約２０
％、約１３％の糖を含んでいた。Dfb-16および Dfb-14
は、従来報告されいてるダニ虫体由来主要アレルゲン D
er f II と同じような分子量をとるが、 Der f II がタ
ンパク性アレルゲンであるのに対し、Dfb-16および Dfb
-14 は糖タンパク性アレルゲンであり、異なるアレルゲ
ンである。
【００５４】実施例８ 減感作治療用抗原製剤の調製 0.5 ％フェノールを添加した 0.9％食塩水を溶媒とし、
Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16または Dfb-14 を１ｍｇ／ｍｌ
の濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液とする。
Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16または Dfb-14 を１ｍｇ／ｍｌ
の濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液とする。
【００５５】実施例９ ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製 ハンクス緩衝液を溶媒とし、Dfb-94、Dfb-40、Dfb-16ま
たは Dfb-14 を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、ヒスタミ
ン遊離滴定用試薬の原液とする。
たは Dfb-14 を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、ヒスタミ
ン遊離滴定用試薬の原液とする。
【図１】Dfb-94の免疫原性試験の結果を示す図である。
【図２】Dfb-94の免疫原性およびアナフィラキシー誘発
性試験の結果を示す図である。
性試験の結果を示す図である。
【図３】虫体粗抗原のウルトロゲルＡｃＡ５４（ＬＫＢ
社）による分画を示す図である。
社）による分画を示す図である。
【図４】Ｄｆｂ２と標準物質を大型ディスク SDS-PAGE
に入れ、泳動したときの分離の様子を示す図である。
に入れ、泳動したときの分離の様子を示す図である。
【図５】Dfb-94、Dfb-60、Dfb-40、Dfb-16および Dfb-1
4 を用いたスポット−免疫染色テストの結果を示す図で
ある。
4 を用いたスポット−免疫染色テストの結果を示す図で
ある。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ (72)発明者 和田 武志 広島県佐伯郡大野町908番地334号 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/00 - 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質および生物学的性質
を有する精製ダニアレルゲン。 虫体抽出液に含まれる。 約６０％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約94,000 アレルゲン活性を有する。 - 【請求項２】 下記の理化学的性質および生物学的性質
を有する精製ダニアレルゲン。 虫体抽出液に含まれる。 約１５％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約40,000 アレルゲン活性を有する。 - 【請求項３】 下記の理化学的性質および生物学的性質
を有する精製ダニアレルゲン。 虫体抽出液に含まれる。 約２０％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約16,000 アレルゲン活性を有する。 - 【請求項４】 下記の理化学的性質および生物学的性質
を有する精製ダニアレルゲン。 虫体抽出液に含まれる。 約１３％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（SDS-PAGE）: 約14,000 アレルゲン活性を有する。 - 【請求項５】 ダニ虫体を磨砕した後、飽和食塩水及び
／又は中程度イオン強度の緩衝液により抽出処理し、得
られた抽出液をゲル濾過等の手法を用いて分画すること
を特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の精製ダニア
レルゲンの製造方法。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか記載の精製ダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療
剤。 - 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか記載の精製ダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP3104950A JP3068879B2 (ja) | 1991-03-09 | 1991-03-09 | 精製ダニアレルゲン |
| CA002062105A CA2062105C (en) | 1991-03-09 | 1992-02-28 | Purified mite allergen |
| AU11339/92A AU651174B2 (en) | 1991-03-09 | 1992-03-02 | Purified mite allergen |
| EP92103894A EP0503505B1 (en) | 1991-03-09 | 1992-03-06 | Purified mite allergen |
| DE69204500T DE69204500T2 (de) | 1991-03-09 | 1992-03-06 | Gereinigtes Milben-Allergen. |
| KR1019920003891A KR0141678B1 (ko) | 1991-03-09 | 1992-03-09 | 정제 진드기 알레르겐 |
| US08/293,605 US5747047A (en) | 1991-03-09 | 1994-08-22 | Purified mite allergen |
| US09/009,835 US6054125A (en) | 1991-03-09 | 1998-01-20 | Purified mite allergen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3104950A JP3068879B2 (ja) | 1991-03-09 | 1991-03-09 | 精製ダニアレルゲン |
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|---|---|
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| JP3068879B2 true JP3068879B2 (ja) | 2000-07-24 |
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ID=14394380
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| KR (1) | KR0141678B1 (ja) |
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| GB9609252D0 (en) * | 1996-05-02 | 1996-07-03 | Mini Agriculture & Fisheries | Vaccines |
| CA2270898A1 (en) | 1996-11-06 | 1998-05-14 | The Regents Of The University Of California | Isolated tumor necrosis factor receptor releasing enzyme, compositions comprising the enzyme and methods of the use thereof |
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|---|---|---|---|---|
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| JP3139777B2 (ja) * | 1990-08-27 | 2001-03-05 | フマキラー株式会社 | 組換えダニアレルゲン |
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- 1991-03-09 JP JP3104950A patent/JP3068879B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1992-03-06 EP EP92103894A patent/EP0503505B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 DE DE69204500T patent/DE69204500T2/de not_active Expired - Lifetime
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-
1998
- 1998-01-20 US US09/009,835 patent/US6054125A/en not_active Expired - Lifetime
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| DE69204500D1 (de) | 1995-10-12 |
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