CN1274756A - L－古洛糖酸－γ－内酯脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用微生物由L－古洛糖酸－γ－内酯制造L－抗坏血酸的新方法、制备对L－古洛糖酸－γ－内酯的微生物学氧化作用负责之酶的方法,所说的酶是纯化形式的L－古洛糖酸－γ－内酯脱氢酶。

Description

L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶
本发明涉及以微生物学手段由L-古洛糖酸-γ-内酯制造L-抗坏血酸的新方法，制备对L-古洛糖酸-γ-内酯之微生物学氧化作用负责的酶的方法，所说的酶是纯化形式的L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶。
如上面所指出的，本发明提供的新的L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶(以下简称为GLDH)可催化L-古洛糖酸-γ-内酯氧化成L-抗坏血酸。
催化L-古洛糖酸-γ-内酯(I)氧化成L-抗坏血酸(II)的酶是已知的。Nishikimi等人从大鼠肝脏(Arch，Biochem.Biophy，175，427-435，1976)、羊肝脏(Arch，Biochem.Biophy.，175，427-435，1976)和鸡肾脏(Biochemistry，21，5076-5082，1982)中分离了L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶。在I氧化成II的过程中，这些酶是以分子氧作为直接电子受体，但本发明所提供的GLDH则不是。此外，它们都由一个亚基构成，而本发明的GLDH则由三个类型的亚基构成。Nishikimi等人由面包酵母中分离了L-半乳糖酸-γ-内酯氧化酶(Arch，Biochem.Biophy.，191，479-486，1978)。该酶催化L-半乳糖酸-γ-内酯和L-古洛糖酸-γ-内酯氧化成L-抗坏血酸。另外，Bleeg等人从啤酒酵母中分离了L-半乳糖酸-γ-内酯氧化酶(Eur.J.Biochem.，127，391-396，1982)。据报导，该酶对L-半乳糖酸-γ-内酯有活性，但对L-古洛糖酸-γ-内酯没有活性。本发明的GLDH则不能使用L-半乳糖酸-γ-内酯作为其底物。
因此，本发明所提供的GLDH在底物特异性上明显不同于酵母的L-半乳糖酸-γ-内酯氧化酶。另一方面，Shigeoka等人报导了裸藻(Euglena gracilis Z)的粗制L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的特性，(Agric.Biol.Chem.，43，2187-2188，1979)，即该酶可催化L-古洛糖酸-γ-内酯和L-半乳糖酸-γ-内酯氧化，而且不能使用氧作为电子受体。此外，如众所周知，由于藻类微生物生长上遇到的问题(如包括脆性、细胞***及生长期长等)，而很难于处理。
本发明提供的新的GLDH在其底物特异性上与之明显不同。另外，迄今尚未报导分离裸藻(Euglena gracilis Z)之L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的方法。
迄今还没有报导利用细菌由L-古洛糖酸-γ-内酯转化成L-抗坏血酸。然而，根据本发明，已发现细菌能够由L-古洛糖酸-γ-内酯产生L-抗坏血酸。这就是使用细菌由L-古洛糖酸-γ-内酯产生L-抗坏血酸的第一个可能性。
如上所述，尚没有公开一种具有脱氢酶活性的纯化的酶，如细菌来源的酶能够将L-古洛糖酸-γ-内酯氧化成L-抗坏血酸。已经发现，由特异微生物细菌细胞的可溶性部分分离出的纯化酶，可催化L-古洛糖酸-γ-内酯氧化成L-抗坏血酸。已在这一发现的基础上完成了本发明。
如已提出的，本发明的一个目的是提供可作用于L-古洛糖酸-γ-内酯以产生L-抗坏血酸的新的GLDH。本发明的另一个目的是提供一种微生物，如能够在细胞内产生新的GLDH的，属于葡糖杆菌属或其突变体的微生物生产该新的GLDH的方法，经破碎细胞，由已破碎之细胞的无细胞提取物中，更好是由微生物的可溶性部分中分离并纯化所说的GLDH。本发明的再一个目的是提供一种利用所说的酶生产L-抗坏血酸的方法。再一个目的是提供一种借助细菌发酵生产L-抗坏血酸的方法。此外，还有一个目的是提供具有所说的酶活性的微生物。从下面的描述中将会进一步了解本发明的上述及其他目的。
对纯化的新的GLDH的物理-化学性质，可举例说明如下：
1)酶活性：
本发明的新的GLDH可在电子受体存在下，按下列反应将L-古洛糖酸-γ-内酯氧化成L-抗坏血酸：
L-古洛糖酸-γ-内酯+电子受体→
L-抗坏血酸+还原的电子受体
该酶并不是利用氧作电子受体。这一点可根据在使用氧作所说的电子受体时，该酶将失去将L-古洛糖酸-γ-内酯转化成L-抗坏血酸的催化活性得以证实。此外，用氧探测器检测时，反应混合物中测不出氧的消耗。然而可利用能用作电子受体的任何常规化合物，连同本发明的酶。作为这种电子受体，可使用辅酶，或表现有辅酶功能的化合物，如2，6-二氯靛酚(以下称为DCIP)、甲基硫酸吩嗪、沃斯特氏兰、氰铁酸盐、辅酶Q或细胞色素C等。
于25℃以分光光度法检测DCIP在600nm处之吸光率的降低值，以进行酶检测。1单位酶活性定义为每分钟催化1微摩尔DCIP还原所需的酶量。DCIP在pH7.0条件下的消光系数为14.5mM-1。1cm光程的比色杯内含有0.16mMDCIP、1.6mM甲基硫酸吩嗪、200mM磷酸钾缓冲液、400mML-古洛糖酸-γ-内酯、酶溶液和水，终体积为0.5ml。对照比色杯含有除L-古洛糖酸-γ-内酯以外的所有成分。反应在加入L-古洛糖酸-γ-内酯开始。酶活性是作为DCIP的初始还原速率测得的。
2)底物特异性
使用上述的同一酶检测方法检测酶的底物特异性，不同的是使用各种不同的底物溶液(400mM)代替L-古洛糖酸-γ-内酯。检测结果示于表1中。GLDH对L-古洛糖酸-γ-内酯和D-木糖有高度活性，并对D-葡糖醛酸-γ-内酯、D-葡萄糖和D-甘露糖有微弱活性。
3)最适pH：
使用上面1)中所述的同一酶检测方法检测GLDH的反应速率与pH间的相互关系，不同是使用各种pH的缓冲液。结果示于表2中。该酶在pH7.0至8.0范围内有最高酶活性。
4)pH稳定性：
4℃下使纯化的酶在不同pH的缓冲液中保存192小时。使用上述的同一酶检测方法检测残留的酶活性。检测结果示于表3中。纯化的酶在pH6.5-9.2之间相当稳定。
5)热稳定性：
纯化的酶在200mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中于不同温度下处理5分钟，然后立即在冰水中冷却。使用上面1)中所述的同样酶检测方法检测残留的活性。结果示于表4中。纯化的酶在高达30℃时是稳定的，且在55℃和60℃保温后，其活性分别丢失大约50％和80％。
6)最适温度：
按上面1)中所述的同一酶检测法检测GLDH在25℃至55℃之温度下的酶活性。结果示于表5中。该酶在所试验的温度范围内并没有独特的最适温度。
7)分子量：
使用预先用含300mM氯化钠之100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的大小排阻凝胶柱(TSK gel G3000 SW×L柱，7.8mm×30cm)，以高效液相层析法检测GLDH的分子量。使用氰钴胺(MW：1350)、肌球蛋白(MW：17,000)、卵白蛋白(MW：44,000)、γ-球蛋白(MW：158,000)和甲状腺球蛋白(MW：670,000)作为分子量标准品。测得GLDH的分子量为110,000±2,000。
然后检测纯化之GLDH的亚基成分。在β-巯基乙醇存在下，用十二烷基硫酸钠(以下称为SDS)处理纯化的GLDH，并加到用含有0.1％SDS之100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡过的如上述的同样层析柱上。使用溶菌酶(MW：14,000)、大豆胰蛋白酶抑制剂(MW：21,500)、碳酸酐酶(MW：31,000)、卵白蛋白(MW：45,000)、牛血清白蛋白(MW：66,200)和磷酸化酶B(MW：92,500)作为分子量标准品。该酶由三个分子量分别为61,000、32,500和16,500的亚基组成。这些亚基分子量的总和是110,000，即天然GLDH的总分子量。
最大成分(MW：61,000)可能是黄素蛋白，因为在SDS中进行凝胶电泳后，当未染色的凝胶与紫外光接触时，其可显示出很强的荧光。可经血红素染色而着染的第二种成分(MW：32,500)是细胞色素。
第三个成分(MW：16,500±500)是一种简单蛋白质，即不携带辅基的蛋白质。总括起来，各自的分子量是：
61,000±1,000
32,500±1,000
16,500±500，已根据常规方法，如SDS电泳法确定了标准误差。
按照P.E.Thomas等人(Analytical Biochemistry75，168-176(1976)所述的方法对上述电泳凝胶进行血红素染色，现概括如下：
在甲醇中新鲜制备6.3mM3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ)溶液。使用前，直接将3份TMBZ溶液与7份0.25M乙酸钠(pH5.0)混合。将凝胶浸入该混合物中，置于暗处室温下断续搅拌2小时。加入H2O2至终体积为30mM，以着染包括细胞色素的第二种蛋白质成份。
8)吸收光谱：
加连二亚硫酸钠降低纯化之GLDH的吸收光谱，显示出在可见光区域的416、521和552nm处有最大值，表明存在细胞色素C成份(见图1)。
9)Km值的测定：
使用上述的同一酶检测方法，检测随着L-古洛糖酸-γ-内酯浓度从0.18mM变到90mM所引起的氧化反应速度的改变，以确定L-古洛糖酸-γ-内酯的Km值。发现在底物浓度为大约71.8mM时出现最大反应速度。用DCIP作电子受体时，算得表观米氏常数(Km)为34.8mM。
10)金属离子的影响：
使用如上述的同一酶检测方法，检测各种金属离子对酶活性的影响。结果示于表6中。显示Cu2+和Mn2+对酶有很强的抑制作用。
11)抑制剂的影响：
使用上述的同一酶检测方法，检测各种抑制剂对酶活性的影响。结果示于表7中。被试的化合物均没有显示对GLDH有抑制作用。
12)纯化方法：
可联合使用已知纯化方法，如离子交换层析、液相层析、吸附层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳、盐析及透析等方法纯化L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶。
所用的微生物包括葡糖杆菌属的所有菌株，当在巨大芽孢杆菌存在下共培养时，它们显示出良好的生长状态。所说微生物的突变体和变异体也可用于本发明。优选的菌株是氧化葡糖杆菌。
已参照伯格氏细菌鉴定手册(Bergey′s Manual ofDeterminative Bacterioloyy，1974年第8版)，特别是根据它们所表现的下列特征，将这些菌株定名并分类为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)：
a)由L-山梨糖产生2-酮-古洛糖酸，
b)将乙醇氧化成乙酸，
c)将D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸，
d)聚醇的生酮作用
e)在pH4和5的甘露醇培养液中(24小时培养)有菌膜和环生长，
在pH4.5的D-葡萄糖培养液中有菌膜生长。
此外，它们还表现有下列特性：
f)基本上不能由甘油产生二羟丙酮，
g)可由D-山梨醇和D-葡糖二酸，但不能由D-葡萄糖、D-果糖、D-葡糖酸、D-甘露醇或2-酮-D-葡糖酸产生2-酮-D-葡糖二酸，
h)有多形性，未观察到鞭毛，
i)由D-果糖产生一种褐色色素，
j)当在巨大芽孢杆菌或其细胞提取物存在下共培养时生长良好，
k)对链霉素敏感。
一个特定的和优选的氧化葡糖杆菌已于1987年3月17日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(Goettingen)，保藏登记号为DSM4025。
氧化葡糖杆菌菌株的细胞呈棒状，两端为圆形。细胞直径平均大约0.3-0.6μm其长度约0.9-1.6μm，大多为1-1.5μm。
为了制备GLDH，可于有氧条件下在添加适当营养素的液体培养基中培养该微生物。培养可在pH大约4.0至9.0之间，较好在pH6.0至8.0之间进行。虽然培养时间可根据pH、温度及所用的营养培养基而异，但通常2至5天即可得到良好结果。培养的优选温度范围为13至36℃，更好是18至33℃。
通常要求培养基中含有可同化的碳源、可消化的氮源和无机物、维生素、微量元素等营养素以及其他生长促进因子。作为可同化的碳源，可使用L-山梨糖、甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-***糖醇等。也可以使用各种有机或无机物质作为氮源，如酵母提取物、肉汁、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。作为无机物质，可使用硫酸镁、磷酸钾、氯化铁和氯化亚铁、碳酸钙等。
下面简要描述在培养后由微生物中分离并纯化GLDH的实施方案。
(1)用离心或过滤法，从发酵培养液中收集细胞。
(2)将细胞悬浮于缓冲溶液中，并借助匀浆器、超声波发生器或用溶菌酶等处理来破碎细胞，得到被破坏之细胞的溶液。
(3)由被破坏之细胞的无细胞提取物中，更好从微生物的可溶性部分中分离并纯化GLDH。
在这些步骤中，最好是能使用柱层析法，如
1)DEAE纤维素柱层析，
2)Q-Sepharose柱层析，
3)羟基磷灰石柱层析，
4)Sephacryl S-300柱层析，
5)聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
本发明提供的GLDH可用作由L-古洛糖酸-γ-内酯生产L-抗坏血酸的催化剂。该反应应在电子受体如DCIP、PMS、Wurster氏兰、氰铁酸盐、辅酶Q、细胞色素C等的存在下，在McIlvaine缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCI缓冲液等溶剂中，于大约6.0至9.0的pH值条件下进行。
优选的反应温度为大约25至55℃。当反应的pH和温度分别定在大约7.0-8.0和30-50℃时，反应通常可获得最好的结果。作为溶剂中的底物，L-古洛糖酸-γ-内酯的浓度可依据其他反应条件而异，但一般可在大约10-150g/l，更好是大约10-100g/l。
为完成这一反应，也可以使用带有适当载体的呈固相化状态的酶。可使用本领域中已知的任何一种固定酶的方法。例如，可将酶直接结合到膜、颗粒或有功能性基团的树脂上，或者通过有双功能基团的桥接化合物，如戊二醛结合到树脂上。
就发酵方法而论，可按照下列程序分别选用下列参数并适当地完成该方法：可在化合物I的存在下，在营养素水溶液中培养有产生II之能力的微生物；或者在微生物生长后，使之在缓冲液中与I接触，然后继续保温。
所用微生物可以是细菌，如醋酸杆菌属细菌，如弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)(DSM 5935)
氧化醋酸杆菌(Acetobacter Oxydans)(DSM5936)
黑色醋酸杆菌(Acetobacter melanogenus)(NDIMB8086)葡糖杆菌属，如
氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(ATCC621)
氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(DSM4025)。其他适用的细菌是放线菌属，链霉菌属等，如
抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)(ATCC8633)
优洛钉菌链霉菌(Streptomyces eurocidicus)(ATCC19551)
淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)(DSM5926)
橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)(ATCC3335)
纺缍链霉菌(Streptomycesnetropsis)(NRRL2268)〔NRRL＝Northern Utilization Research and DevelopmentDivision of U.S.D.A.，Peoria，Illinois.USA；
ATCC＝American Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA；
NCIMB＝National Collection of Industrial+MarineBacteria，Torry Research Station，Aberdeen AB98DG，Scotland〕
该反应选用的是醋酸杆菌属和葡糖杆菌属的特定菌种，特别是弱氧化醋酸杆菌和氧化葡糖杆菌菌株。已为保护该方法的目的保藏了这些菌株。
应明确的是，用于本发明的每种微生物最好都生长于营养培养基中，然后用于本发明的发酵过程。菌株有可能在液体培养基中生长。
可将有微生物生长的营养培养基直接用于发酵反应。
本发明反应培养基的组成可以很简单，例如可以是合并有在缓冲液中单独生长的微生物，而没有任何其他成分的析出物I的溶液。
培养基的pH可在2至9之间，较好是大约4至7。必要时可用缓冲***调节pH值。
为得到最佳产率，最好使用浓度约为1-10％(重量)的析出物。
发酵时间较好在2至100小时，特别是在4至72小时之间，添加析出物I可延长发酵时间。
应指出的是，氧化作用代表了一个需氧过程。在空气或另外通气下进行强烈振荡或搅拌反应介质即可满足这些条件。
下列实施例将进一步阐述本发明。
实施例1
L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的制备
(1)氧化葡糖杆菌DSM4025的培养
氧化葡糖杆菌DSM4025在含有5.0％甘露醇、0.25％MgSO47H2O、1.75％玉米浆、5.0％面包酵母、0.5％尿素、0.5％CaCO3和2.0％琼脂的琼脂斜面培养基上27℃生长4天。取1菌环氧化葡糖杆菌DSM4025的琼脂斜面培养物，接种于加在500ml培养瓶中的50ml含有8.0％山梨糖、0.05％甘油、0.5％尿素、0.25％MgSO47H2O、1.75％玉米浆、5.0％面包酵母和1.5％CaCO3的种子菌培养基中，在旋转振荡器(180rpm)上30℃培养1天。取5ml该培养物移入加在500ml培养瓶中的50ml同一培养基中，并按上述的同样方法培养。用如此制得的2升种子培养物接种含有20升培养基的30升小型发酵罐，所说的培养基含有8.0％L-山梨糖、0.05％甘油、1.2％尿素、0.25％MgSO47H2O、1.75％玉米浆、5.0％面包酵母和1.5％CaCO3。该小型发酵罐在30℃、400rpm搅拌及0.5vvm(空气体积/培养基体积/分钟)通气条件下进行工作。发酵40小时后，发酵液以1,500rpm离心10分钟，除去碳酸钙；然后以8,000rpm(10,000×g)离心，沉淀出细胞团块。细胞团块用0.85％NaCl溶液洗一次。从20升发酵液中约得到100g(净重)细胞。
(2)可溶性部分的制备
由上述步骤(1)得到的氧化葡糖杆菌DSM4025(净重95g)细胞用0.85％NaCl溶液洗两次。将洗过的细胞悬浮于380ml 10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，并用French挤压匀浆器以1,500kg/cm2的压力将细胞悬浮液制成匀浆。以1,800×g离心10分钟除去细胞碎片，然后将上清液(以下称为无细胞提取物)以100,000×g离心60分钟。作为氧化葡糖杆菌DSM4025细胞的可溶性部分，收集所得上清液(450ml)。
(3)二乙氨乙基(以下称为DEAE)纤维素柱层析
将上述步骤中得到的可溶性部分(450ml)对10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析。将透析液(500ml)加到用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡过的DEAE纤维素柱(2.5×120cm)上。用同样缓冲液，然后再用含有0.25M NaCl的同样缓冲液洗柱。用含有0.5MNaCl的同样缓冲液洗脱GLDH。
(4)Q-Sepharose柱层析
将得自前述步骤的合并的活性部分(200ml)对两批各2升的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，并将透析液加到用同样缓冲液平衡过的Q-Sepharose柱(2.5×50cm)上。用同样缓冲液洗柱后，用0.3至0.5M的NaCl线性梯度洗脱GLDH。
(5)羟基磷灰石(Bio-gel HTP)柱层析
将前述步骤中得到的合并的活性部分210ml)对两批各2升的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，并将透析液加到预先用同样缓冲液平衡过的羟基磷灰石柱(2.5×25cm)上。用同样缓冲液洗柱，并用10mM至40mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性梯度洗脱GLDH。合并有酶活性的各管并用超滤器(pM10，Amicon)将其超滤浓缩至大约20ml。
(6)Sephacryl S-300柱层析
将上述步骤得到的含酶部分(2ml)加于预先用含有50mMNaCl之50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡过的Sephacryl S-300柱(1.0×100cm)，并用同样缓冲液展开。合并含有电泳纯GLDH的各管并于-80℃下储存。
使用上述纯化步骤，可使GLDH纯化约900倍。表8中总结了GLDH的各纯化步骤。
(7)分离的酶的纯度
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(分离胶：10％聚丙烯酰胺；电泳条件4℃，20mA，6小时)，估测分离的GLDH的纯度。经考马斯亮蓝R-250染色后，酶显示出一条单一的带。当未染色的凝胶在含有50mML-古洛糖酸-γ-内酯、20μg/ml氮蓝四唑和40μg/ml甲基硫酸吩嗪的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中浸渍20分钟时，该蛋白带显示出GLDH活性。
(8)反应产物的鉴定
将含有0.5ml纯化的GLDH(7.5μg，469单位/mg蛋白质)、1.0ml 0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.1gL-古洛糖酸-γ-内酯、0.1ml 10mM甲基硫酸吩嗪并加水至终体积为2.0ml的反应混合物于30℃下保温2小时。用薄层层析法和高效液相层析法分析反应产物。薄层层析按下述方法进行：样品(1ul)点在硅胶板(Merck，USA)上，用正丙烷-水-1％磷酸-甲酸(400∶100∶10∶1)的溶剂***在室温下展层2小时。然后干燥层析板并在紫外灯下观察。发现产物即是Rf值为大约0.7处的UV吸收点，其相当于L-抗坏血酸的实际样品。按下述方法进行高效液相层析：将样品加于预先用乙腈∶水∶乙酸(87∶11∶2)溶剂***平衡过的LichrosorbNH2柱(Merck，USA，0.4×25cm)上，流速定为3.0ml/分钟，并经测254nm吸光率来检测产物。结果可见，在同一滞留时间洗脱的产物即相当于L-抗坏血酸的真实样品。
最后该产物被鉴定为L-抗坏血酸。
L-抗坏血酸的产率为0.71g/L/小时。
实施例2
经发酵(生长细胞)由L-古洛糖酸-γ-内酯生产L-抗坏血酸
在3升小型发酵罐内，用200ml按实施例1-(1)中所述方法制备的氧化葡糖杆菌DSM4025的种子菌培养物接种2升含有L-古洛糖酸-γ-内酯(8％)、甘油(0.05％)、面包酵母(5.0％)、MgSO47H2O(0.25％)、玉米浆(1.75％)、尿素(0.5％)和CaCO3(1.5％)(初始pH定在7.0)的培养基中。在30℃、700rpm搅拌及0.5vvm，通气量条件下进行发酵。如表9所示，发酵66小时产生了8.6g/lL-抗坏血酸。
实施例3
使用静止细胞***由L-古洛糖酸-γ-内酯生产L-抗坏血酸
将0.1g至0.67g按实施例1-(1)所述方法制备的氧化葡糖杆菌DSM4025的细胞加到总体积为3ml，含有47.6mg/ml或89.3mg/lL-古洛糖酸-γ-内酯的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。反应混合物于30℃振荡(280rpm)保温6小时。结果示于表10中。L-抗坏血酸的最高产率为20mg/小时/克细胞，最高收率为13.92g/l。
实施例4
使用氧化葡糖杆菌DSM4025的无细胞提取物由L-古洛糖酸-γ-内酯生产L-抗坏血酸
将含有1.0ml实施例1-(1)和(2)所述方法制备的氧化葡糖杆菌DSM4025的无细胞提取物(蛋白质含量：10.3mg/ml)、1ml 0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.0)和0.5ml 17.8％L-古洛糖酸-γ-内酯的反应混合物于30℃保温17.5小时。结果产生2.19g/lL-抗坏血酸。
实施例5
(生长细胞***)
弱氧化醋酸杆菌(DSM5935)生长于培养基1(组成：50％酵母水、50％甘露醇，加自来水调到pH6.5)中的琼脂斜面上。30℃保温2天后，用1菌环细胞接种5ml液体培养基1(组成同上，但没有琼脂)。试管于30℃下振荡(220rpm)保温3天。取1ml预培养物接种100ml加有1g析出物I的培养基1。于30℃下振荡(220rpm)培养。72小时后终止培养。分析检测结果表明，3％的析出物I转化成了产物II。
实施例6
(静止细胞***)
按上述方法培养弱氧化醋酸杆菌(DSM5935)。离心(10,000rpm，10分钟)收集100ml培养物并加在塑料瓶内用液氮冷冻。在含有培养基1的100ml培养瓶内接种0.5ml取自各小瓶的培养物，30℃振荡(220rpm)保温并在同一时间加入1g析出物I。根据分析检测结果，表明在72小时内有10％的析出物I被转化成了产物II。
实施例7
(静止细胞***)
按实施例6中所述培养弱氧化醋酸杆菌(DSM5935)。以接种了-0.5ml取自小瓶之预培养物的100ml培养物作为同一培养基中的另一生长培养物。这些含100ml培养基1的培养瓶各接种5ml预培养物并于30℃下振荡(220rpm)培养24小时。离心(10,000rpm，10分钟)收集生长的细胞，将3g湿细胞(相当于一个培养瓶的细胞)悬浮于总体积为120ml、加有0.1g析出物I(作为粉末加入)的缓冲溶液(pH6.0，0.05M磷酸盐缓冲液)中。结果48小时内有30％的析出物I转化成了产物II。
实施例8
(静止细胞***)
在实施例1中所述的琼脂斜面上培养弱氧化醋酸杆菌(DSM5935)。将生长的细胞层悬浮于10ml生理盐水(0.9％)中。用该悬液接种10个摇瓶(100ml培养基1)(各接种1ml)。培养瓶于30℃下振荡(220rpm)保温4天。用这10份培养物接种10升叶片搅拌的生物反应器(含9,000ml培养基1)。生长条件是：温度30℃，通气量0.4vvm，搅拌速度500rpm。生长44小时后离心(以12,000rpm连续离心)收获细胞。收率为每升21g湿细胞。将细胞分成几部分深冻。在本实施例中，将1g冷冻的细胞迅速融化并连同0.4g析出物I一起加到0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。该分析混合物的总体积为5ml。分析检测结果表明有19％的析出物I被转化成了产物II。
    表    1L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的底物特异性底物                                    相对活性(％)L-古洛糖酸-γ-内酯                      100L-半乳糖酸-γ-内酯                      0D-葡糖醛酸-γ-内酯                      6.38D-葡糖酸-δ-内酯                        0D-葡糖醛酸                              0D-葡糖酸                                0D-葡萄糖                                23.4D-甘露糖                                7.23D-半乳糖                                0L-古洛糖                                0D-木糖                                  110.6
      表    2L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的最适pH
                                 相对活性(％)pH值
                                  缓冲液
           MCIlvain               磷酸钾            Tris-HCl4.0            0                      -                 -4.5            0                      -                 -5.0            8.2                    -                 -5.5            18.2                   -                 -6.0            58.5                   -                 -6.5            77.8                   56.4              -7.0            100                    83.6              45.97.5            105.8                  102.3             58.28.0            109.3                  -                 61.78.5            -                      -                 60.0
           (-：未测)
      表    3L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的PH稳定性
                                                    相对活性(％)pH值
                                              缓冲液
             McIlvaine             磷酸钾         Tris-HCl           NH4OH-NH4Cl4.0              0                     -              -                  -4.5              0                     -              -                  -5.0              0                     -              -                  -5.5              9.38                  -              -                  -6.0              48.4                  62.5           -                  -6.5              75.0                  50.3           -                  -7.0              79.7                  71.9           84.4               -7.5              100                   95.3           75.0               -8.0              84.4                  -              62.5               -8.3              -                     -              53.2               57.88.85             -                     -              -                  115.69.2              -                     -              -                  1009.7              -                     -              -                  68.8
      表    4L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的温度稳定性温度(℃)                                   相对活性(％)0                                          10025                                         10030                                         10035                                         89.640                                         87.545                                         72.950                                         70.855                                         53.160                                         18.865                                         070                                         075                                         0
      表    5L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的最适温度温度(℃)                                   相对活性(％)25                                         10030                                         103.235                                         101.840                                         106.645                                         101.450                                         115.155                                         102.7
      表    6各种金属对L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶活性的影响金属                    浓度          相对活性     金属                 浓度          相对活性
                    (mM)          (％)                              (mM)          (％)Ca(NO3)2·4H2O      0.19          100          MgSO4·7H2O       0.19          92
                    0.38          100                               0.38          96
                    0.89          96                                0.89          92CaCl2                  0.19          96           MgCl2·6H2O       0.19          96
                    0.38          104                               0.38          96
                    0.89          96                                0.89          96CoCl2·6H2O          0.19          102          MnCl2·4H2O        0.19          100
                    0.38          110                               0.38          0
                    0.89          100                               0.89          0CoSO4·7H2O          0.19          96           MnSO4·4-6H2O      0.19          100
                    0.38          108                               0.38          0
                    0.89          88                                0.89          0CuSO4                 0.19          92           Na2MoO4·2H2O     0.19          104
                    0.38          24                                0.38          96
                    0.89          12                                0.89          88CuSO4·5H2O          0.19          80           TiCl                 0.19          88
                    0.38          20                                0.38          92
                    0.89          0                                 0.89          80Cu(NO3)2·3H2O      0.19          88           ZnCl2               0.19          88
                    0.38          24                                0.38          88
                    0.89          0                                 0.89          80CuCl2·2H2O          0.19          84           ZnSO4·7H2O        0.19          88
                    0.38          8                                 0.38          88
                    0.89          0                                 0.89          76Fe(SO4)3·xH2O      0.19          104          NiSO4·7H2O       0.19          96
                    0.38          92                                0.38          96
                    0.89          76                                0.89          88K4Fe(CN)6·3H2O     0.10          0            无                                 100
          表    7各种抑制剂对L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶活性的影响抑制剂                   浓度                   相对活性
                     (mM)                     (％)EDTA                     0.96                     95.2-                        1.89                     100N-乙基-                  4.46                     90.5顺丁烯二酰亚胺           0.96                     95.2
                     1.89                     100
                     4.46                     100叠氮化钠                 0.96                     100
                     1.89                     97.6
                     4.46                     97.6一碘乙酸                 0.96                     104.8
                     1.89                     100
                     4.46                     92.9PCMB(对位氯-             0.96                     90.5苯甲酸汞)                1.89                     102.4
                     4.46                     100No2HAsO4·7H2O       0.96                     95.2
                     1.89                     104.8
                     4.46                     97.6氟化钠                   0.96                     107.1
                     1.89                     114.3
                     4.46                     97.6KCN                      0.96                     96.0
                     1.89                     96.0
                     4.46                     96.0盐酸胲                   1.0                      100
                     2.0                      100一水合肼                 1.0                      100无                                                100
      表    8L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶的纯化步骤步骤               总活性               总蛋白质               比活性               回收率
               (单位)               (mg)                   (单位/mg)            (％)可溶性部分         1179.9               2289.5                 0.52                 100DEAE纤维素         766.9                66.44                  11.54                65.0Q Sepharose        761.8                8.65                   88.10                64.6羟基磷灰石         473.1                3.24                   146.0                40.1Sephacryl S-300    37.8                 0.0806                 469.0                -
        表    9由L-古洛糖酸-γ-内酯发酵生产L-抗坏血酸培养时间(小时)                           产生的L-抗坏血酸
                                     (g/l)0                                        0.071518.5                                     3.5427                                       5.1242                                       6.9651                                       7.8866                                       8.5775                                       8.4690                                       7.72
              表    10使用静止细胞***由L-古洛糖酸-γ-内酯生产L-抗坏血酸初始L-古洛糖酸             细胞浓度               所产生的L-抗坏血酸-γ内酯浓度                (克细胞湿重/ml)        (mg/ml)(mg/ml)                                             3小时        6小时0                            0.1                    0            047.6                         0.1                    5.98         7.22
                         0.17                   6.46         7.82
                         0.33                   7.83         9.65
                         0.67                   9.51         11.2889.3                         0.1                    5.88         7.62
                         0.17                   6.88         9.50
                         0.33                   8.37         13.92
                         0.67                   8.67         13.51

Claims (1)

1.生产L-抗坏血酸的方法，包括在L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶和电子受体存在下氧化L-古洛糖酸-γ-内酯，所说的L-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶具有下列物理化学性质：
a)底物特异性：对L-古洛糖酸-γ-内酯和D-木糖有高度活性；
b)最适pH：7-8；
c)分子量：110,000±2,000(由三个亚基组成，包括分子量分别为61,000±1,000、32,500±1,000和16,5000±500的黄素蛋白、细胞色素C及一种简单蛋白质)；
d)辅基：黄素；
e)金属离子的影响：Cu2+和Mn2+对该酶有强抑制作用；
f)电子受体：不同于氧。
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