JP2665673B2 - グルコースを含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの測定法 - Google Patents
グルコースを含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は糖尿病の診断マーカーとして有用な1,5−ア
ンヒドログルシトール（以下AGと言う）の測定法に関す
る。
ンヒドログルシトール（以下AGと言う）の測定法に関す
る。
（従来の技術） AGはヒト体液中含まれ、糖尿病の診断マーカーとして
有用であるが、その存在量はAGと構造的に類似している
グルコースと比して少なく、AGの物理化学的あるいは生
化学的測定に際しグルコースの存在は測定誤差を大きく
するので好ましくなく、試料をイオン交換樹脂等で処理
してグルコースを除去していた。
有用であるが、その存在量はAGと構造的に類似している
グルコースと比して少なく、AGの物理化学的あるいは生
化学的測定に際しグルコースの存在は測定誤差を大きく
するので好ましくなく、試料をイオン交換樹脂等で処理
してグルコースを除去していた。
（発明が解決すべき課題） しかし、従来の技術では樹脂処理に時間がかかり多量
の試料を分析するため、より簡便にグルコースを除去で
き、かつAGを分析できる測定法が要望されていた。
の試料を分析するため、より簡便にグルコースを除去で
き、かつAGを分析できる測定法が要望されていた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは研究の結果、試料中のグルコースをグル
コースオキシダーゼで処理し、生ずる過酸化水素をパー
オキシダーゼと水素供与体とで水に分解した後、試料中
のAGを酵素を用いて測定出来ること、又試料中のグルコ
ースをグルコース６位リン酸化酵素とアデノシン３リン
酸（以下ATPと言う）でグルコース−６−リン酸とし、
これを更にグルコース−６−リン酸水素酵素とニコチナ
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下NADP）で酸化
し、生ずるNADPH（NADPの還元体）を電子伝達体および
溶存酸素で酸化し、生ずる過酸化水素をパーオキシダー
ゼと水素供与体とで水に分解した後、試料中のAGを酵素
を用いて測定できることを見出だした。
コースオキシダーゼで処理し、生ずる過酸化水素をパー
オキシダーゼと水素供与体とで水に分解した後、試料中
のAGを酵素を用いて測定出来ること、又試料中のグルコ
ースをグルコース６位リン酸化酵素とアデノシン３リン
酸（以下ATPと言う）でグルコース−６−リン酸とし、
これを更にグルコース−６−リン酸水素酵素とニコチナ
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下NADP）で酸化
し、生ずるNADPH（NADPの還元体）を電子伝達体および
溶存酸素で酸化し、生ずる過酸化水素をパーオキシダー
ゼと水素供与体とで水に分解した後、試料中のAGを酵素
を用いて測定できることを見出だした。
即ち、本発明は（１）グルコースおよび1,5−アンヒ
ドログルシトールを含有する試料へグルコース６位リン
酸化酵素、アデノシン３リン酸、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、電子伝達体、パーオキシダーゼおよび水素供与体
を添加、反応し、グルコースを消去した後、該試料中の
1,5−アンヒドログルシトールを酵素を用いて定量する
ことを特徴とするグルコースおよび1,5−アンヒドログ
ルシトールを含有する試料中の1,5−アンヒドログルシ
トールの測定法 （２）グルコースおよび1,5−アンヒドログルシトール
を含有する試料へグルコースオキシダーゼ、パーオキシ
ダーゼおよび水素供与体を添加、反応しグルコースを消
去した後、該試料中の1,5−アンヒドログルシトールを
酵素を用いて定量することを特徴とするグルコースと1,
5−アンヒドログルシトールを含有する試料中の1,5−ア
ンヒドログルシトールの測定法に関する。
ドログルシトールを含有する試料へグルコース６位リン
酸化酵素、アデノシン３リン酸、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、電子伝達体、パーオキシダーゼおよび水素供与体
を添加、反応し、グルコースを消去した後、該試料中の
1,5−アンヒドログルシトールを酵素を用いて定量する
ことを特徴とするグルコースおよび1,5−アンヒドログ
ルシトールを含有する試料中の1,5−アンヒドログルシ
トールの測定法 （２）グルコースおよび1,5−アンヒドログルシトール
を含有する試料へグルコースオキシダーゼ、パーオキシ
ダーゼおよび水素供与体を添加、反応しグルコースを消
去した後、該試料中の1,5−アンヒドログルシトールを
酵素を用いて定量することを特徴とするグルコースと1,
5−アンヒドログルシトールを含有する試料中の1,5−ア
ンヒドログルシトールの測定法に関する。
本発明で用いられる試料としては、AGおよびグルコー
スを含むことが予測され、かつAG含量を測定したいもの
なら特に制限は無く、例えば血液、尿、髄液などの体液
や植物、動物などの抽出物およびその蛋白除去物などが
あげられる。
スを含むことが予測され、かつAG含量を測定したいもの
なら特に制限は無く、例えば血液、尿、髄液などの体液
や植物、動物などの抽出物およびその蛋白除去物などが
あげられる。
第一の発明で用いられるグルコース６位リン酸化酵素
としては例えばグルコキナーゼやヘキソキナーゼがあげ
られるがグルコキナーゼが好ましい。グルコキナーゼ、
ヘキソキナーゼはIUPAC−IUBの命名法委員会でそれぞれ
EC2.7.1.2およびEC2.7.1.1と分類しうるものであれば特
に制限なく、市販のものを使用しうる。グルコース−６
−リン酸脱水酵素およびホースラディシュパーオキシダ
ーゼなどのパーオキシダーゼはIUPAC−IUBの命名法委員
会で、それぞれEC1.1.1.49およびEC1.11.1.7と分類しう
るものであれば特に制限は無く市販のものを使用しう
る。
としては例えばグルコキナーゼやヘキソキナーゼがあげ
られるがグルコキナーゼが好ましい。グルコキナーゼ、
ヘキソキナーゼはIUPAC−IUBの命名法委員会でそれぞれ
EC2.7.1.2およびEC2.7.1.1と分類しうるものであれば特
に制限なく、市販のものを使用しうる。グルコース−６
−リン酸脱水酵素およびホースラディシュパーオキシダ
ーゼなどのパーオキシダーゼはIUPAC−IUBの命名法委員
会で、それぞれEC1.1.1.49およびEC1.11.1.7と分類しう
るものであれば特に制限は無く市販のものを使用しう
る。
これらの酵素の使用量は試料中のグルコース量により
異なるが、グルコース６位リン酸化酵素の場合、試料1m
l当り通常0.1〜10単位である。グルコース−６−リン酸
脱水酵素の場合試料1ml当り通常0.1〜10単位であり、パ
ーオキシダーゼの場合試料1ml当り0.1〜５単位である。
異なるが、グルコース６位リン酸化酵素の場合、試料1m
l当り通常0.1〜10単位である。グルコース−６−リン酸
脱水酵素の場合試料1ml当り通常0.1〜10単位であり、パ
ーオキシダーゼの場合試料1ml当り0.1〜５単位である。
グルコースをリン酸するにはATPが必要であり、その
使用量は試料中のグルコース量により異なるが１〜10mM
程度で良い。
使用量は試料中のグルコース量により異なるが１〜10mM
程度で良い。
本発明で用いられる電子伝達体としては酵素の存在下
にNADPHを酸化し、過酸化水素を生成しうるもので例え
ばフェナジンメトサルフェートあるいは１−メトキシフ
ェナジンメトサルフェート（以下１−MPMSと言う）など
のフェナジンメトサルフェート類、メチレンブルー、2,
6−ジクロロフェノールインドフェノール、ナフトキノ
ン、インジゴスルホン酸類好ましくはフェナジンメトサ
ルフェート類、メチレンブルーなどがあり、通常１〜10
0μＭの濃度でもちいられる。
にNADPHを酸化し、過酸化水素を生成しうるもので例え
ばフェナジンメトサルフェートあるいは１−メトキシフ
ェナジンメトサルフェート（以下１−MPMSと言う）など
のフェナジンメトサルフェート類、メチレンブルー、2,
6−ジクロロフェノールインドフェノール、ナフトキノ
ン、インジゴスルホン酸類好ましくはフェナジンメトサ
ルフェート類、メチレンブルーなどがあり、通常１〜10
0μＭの濃度でもちいられる。
電子伝達体とともに反応に関与するものは溶存酸素で
あるが、大気より反応系中に供給される酸素量で十分な
ので、大気中で試料を処理すれば、酸素を別に添加する
必要性はない。
あるが、大気より反応系中に供給される酸素量で十分な
ので、大気中で試料を処理すれば、酸素を別に添加する
必要性はない。
水素供与体としてはパーオキシダーゼの存在下に過酸
化水素を分解しうるもので、特に発色をしないものが好
ましく、例えばフェノール、アニリン、あるいはジアル
キルアニリンなどのそれらの誘導体が用いられ、その濃
度は通常0.1〜10mMである。
化水素を分解しうるもので、特に発色をしないものが好
ましく、例えばフェノール、アニリン、あるいはジアル
キルアニリンなどのそれらの誘導体が用いられ、その濃
度は通常0.1〜10mMである。
グルコース−６−リン酸脱水素酸素反応に必要なNADP
の量は試料中のグルコース量より異なるが１〜10mM程度
で良い。
の量は試料中のグルコース量より異なるが１〜10mM程度
で良い。
反応は通常１〜200mM、pH6〜10バッファー中で20〜60
℃、望ましくは30℃〜37℃で５〜60分程度行われる。使
用できるバッファーとしては、リン酸バッファー、トリ
スー塩酸バッファーなどがある。
℃、望ましくは30℃〜37℃で５〜60分程度行われる。使
用できるバッファーとしては、リン酸バッファー、トリ
スー塩酸バッファーなどがある。
上記のグルコースを消去させる反応の際、塩類に共存
させた方が好ましい。反応液に添加する必要のある塩類
としては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどのマ
グネシウム塩および塩化カリウム、硫酸カリウムなどの
カリウム塩がありそれぞれ共に１〜100mMの濃度で用い
られる。
させた方が好ましい。反応液に添加する必要のある塩類
としては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどのマ
グネシウム塩および塩化カリウム、硫酸カリウムなどの
カリウム塩がありそれぞれ共に１〜100mMの濃度で用い
られる。
第２の発明で用いられるグルコースオキシダーゼとし
てはIUPAC−IUBの命名法委員会でEC1.1.3.4と分類しう
るものであれば特に制限は無く市販のものが使用出来
る。その使用量は試料中のグルコース量により異なる
が、試料1ml当り１〜100単位である。パーオキシダー
ゼ、および水素供与体は前述のものが同様に用いること
が出来る。反応は通常１〜100mM、pH5〜８のバッファー
中で20〜60℃、望ましくは30〜37℃で10分〜２時間程度
行われる。使用出来るバッファーとしては例えばリン酸
バッファー、トリス塩酸バッファーなどがある。
てはIUPAC−IUBの命名法委員会でEC1.1.3.4と分類しう
るものであれば特に制限は無く市販のものが使用出来
る。その使用量は試料中のグルコース量により異なる
が、試料1ml当り１〜100単位である。パーオキシダー
ゼ、および水素供与体は前述のものが同様に用いること
が出来る。反応は通常１〜100mM、pH5〜８のバッファー
中で20〜60℃、望ましくは30〜37℃で10分〜２時間程度
行われる。使用出来るバッファーとしては例えばリン酸
バッファー、トリス塩酸バッファーなどがある。
上記のグルコース消去反応の際、各酵素、試薬とも反
応の順に別々に添加してもよいが、同時に試料に添加
し、反応させた方が好ましい。
応の順に別々に添加してもよいが、同時に試料に添加
し、反応させた方が好ましい。
試料中のAGを酵素を用いて測定するには、AG酸化酵素
を用いる公知の方法、例えば特開昭62−79780号もしく
はEP公開261591号記載の方法で行うことができる。AG酸
化酵素としては1,5−AGの２−位の水酸基を酸化する能
力を有するものが好ましく、そのような酵素としては、
ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダー
ゼ、シュードモナスSP、NK−85001（Ferm p−8100）の
産生する酵素などがあげられる。
を用いる公知の方法、例えば特開昭62−79780号もしく
はEP公開261591号記載の方法で行うことができる。AG酸
化酵素としては1,5−AGの２−位の水酸基を酸化する能
力を有するものが好ましく、そのような酵素としては、
ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダー
ゼ、シュードモナスSP、NK−85001（Ferm p−8100）の
産生する酵素などがあげられる。
本発明で用いられるピラノースオキシダーゼとＬ−ソ
ルボースオキシダーゼはIUPAC−IUBの命名法委員会でそ
れぞれEC1,1,3,10およびEC1,1,3,11と分類し得るもので
あれば特に制限はなく、ピラノースオキシダーゼとして
は、例えばポリポラスオブッサス（Polyporus obtusu
s）ATCC26733の産生するものがあげられ、又、Ｌ−ソル
ボースオキシダーゼとしては、例えばトラメテスサング
イネア（Trametes sanguinea）IFO4923の産生するもの
などがあげられる。
ルボースオキシダーゼはIUPAC−IUBの命名法委員会でそ
れぞれEC1,1,3,10およびEC1,1,3,11と分類し得るもので
あれば特に制限はなく、ピラノースオキシダーゼとして
は、例えばポリポラスオブッサス（Polyporus obtusu
s）ATCC26733の産生するものがあげられ、又、Ｌ−ソル
ボースオキシダーゼとしては、例えばトラメテスサング
イネア（Trametes sanguinea）IFO4923の産生するもの
などがあげられる。
これらの酸素は通常緩衝液に溶解した溶液で使用され
るが、マイクロカプセル、樹脂や多糖類に共有結合もし
くは吸着させたものなど、通常の方法で固定化した酵素
も使用しうる。又、その使用量は、試料の量などによっ
て異なるが、酵素による反応時間を好適な短時間とする
ためには１単位以上であればよく、好ましくは1.5〜５
単位程度である。また用いる酵素の比活性は高いものほ
ど反応にとって良好であることは言うまでもないことで
あるが必ずしも最高純度のものを要求するものではな
い。
るが、マイクロカプセル、樹脂や多糖類に共有結合もし
くは吸着させたものなど、通常の方法で固定化した酵素
も使用しうる。又、その使用量は、試料の量などによっ
て異なるが、酵素による反応時間を好適な短時間とする
ためには１単位以上であればよく、好ましくは1.5〜５
単位程度である。また用いる酵素の比活性は高いものほ
ど反応にとって良好であることは言うまでもないことで
あるが必ずしも最高純度のものを要求するものではな
い。
なお、本発明で使用する酵素を採取する方法は、例え
ば前者についてはBiochim.Biophys.Acta167、493−500
（1968）に，又後者についてはThe Journal of Biochem
istry62（２）223−229（1967）に開示されている。
ば前者についてはBiochim.Biophys.Acta167、493−500
（1968）に，又後者についてはThe Journal of Biochem
istry62（２）223−229（1967）に開示されている。
グルコースを消去した後の試料中のAGを定量するには
例えば上記公報記載の方法のようにすればよい。
例えば上記公報記載の方法のようにすればよい。
（１）酸素消費に基づく方法 密閉型反応容器に0.05Mトリス−塩酸緩衝液（pH7）1m
l、30mMフェナジンメトサルフェート20μ、1,5−AG酸
化酵素又は膜画分サスペンジョンあるいは1,5−AG酸化
酵素抽出液0.3mlを加え酸素電極を挿入し反応容器内を3
4℃で撹拌しながらこれに試料溶液50μを加えて反応
を開始し経時的に酸素の消費量をオキシゲンモニターで
測定する。既知濃度の1,5−AG溶液で検量線を作成して
おき試料の酸素消費量から1,5−AGの濃度を算出する。
l、30mMフェナジンメトサルフェート20μ、1,5−AG酸
化酵素又は膜画分サスペンジョンあるいは1,5−AG酸化
酵素抽出液0.3mlを加え酸素電極を挿入し反応容器内を3
4℃で撹拌しながらこれに試料溶液50μを加えて反応
を開始し経時的に酸素の消費量をオキシゲンモニターで
測定する。既知濃度の1,5−AG溶液で検量線を作成して
おき試料の酸素消費量から1,5−AGの濃度を算出する。
（２）電子受容体の着色度変化を利用する方法 トリス−塩酸緩衝液（0.05M pH7） 0.7ml、0.1Mフェリシアン化カリウム溶液0.1ml、シュ
ードモナス属に属する微生物より得られる1,5−AG酸化
酵素又はその抽出液0.1mlおよび試料溶液0.1mlを容器に
入れ34℃で10分間反応させた後、硫酸第二鉄−デュバノ
ール試薬（硫酸第二鉄5g、ラウリル硫酸ナトリウム3g、
85％リン酸95ml、蒸留水900ml）0.5ml、蒸留水3.5mlを
加え10分間放置して660nmにおける吸光度を測定する。
既知濃度の1,5−AG溶液で検量線を作成しておき試料の
吸光度より1,5−AGの濃度を算出する。
ードモナス属に属する微生物より得られる1,5−AG酸化
酵素又はその抽出液0.1mlおよび試料溶液0.1mlを容器に
入れ34℃で10分間反応させた後、硫酸第二鉄−デュバノ
ール試薬（硫酸第二鉄5g、ラウリル硫酸ナトリウム3g、
85％リン酸95ml、蒸留水900ml）0.5ml、蒸留水3.5mlを
加え10分間放置して660nmにおける吸光度を測定する。
既知濃度の1,5−AG溶液で検量線を作成しておき試料の
吸光度より1,5−AGの濃度を算出する。
電子受容体としては上記のフェリシアン化カリウムや
フェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化アンモニウ
ムなどのフェリシアニドの他ジクロルフェノールインド
フェノールなどが利用出来る。
フェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化アンモニウ
ムなどのフェリシアニドの他ジクロルフェノールインド
フェノールなどが利用出来る。
（３）H2O2を検出する方法 リン酸ナトリウム緩衝液（1/15M,pH5.6）0.3ml、4m
M、2,2′−アジノジ〔３−エチルベンツチアゾリンスル
ホネイト（６）〕。（ABTS）と12U/mlのホースラディッ
シュペルオキシダーゼを含む発色液0.5ml、1,5−AG酸化
酵素又はその抽出液0.1mlおよび試料溶液0.1mlを容器に
入れ、37℃で30分間反応させた後、氷冷下に反応を止
め、405nmにおける吸光度を測定する。既知濃度の1,5−
AG溶液で検量線を作成しておき、試料の収光度より1,5
−AGの濃度を算出する。
M、2,2′−アジノジ〔３−エチルベンツチアゾリンスル
ホネイト（６）〕。（ABTS）と12U/mlのホースラディッ
シュペルオキシダーゼを含む発色液0.5ml、1,5−AG酸化
酵素又はその抽出液0.1mlおよび試料溶液0.1mlを容器に
入れ、37℃で30分間反応させた後、氷冷下に反応を止
め、405nmにおける吸光度を測定する。既知濃度の1,5−
AG溶液で検量線を作成しておき、試料の収光度より1,5
−AGの濃度を算出する。
ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質として
は、ABTSの外、５−アミノサルチル酸、４−アミノアン
チビリンとフェノール、フエノール誘導体又はアニリン
誘導体、０−トルイジン等の発色基質や、ｐ−ヒドロキ
シ酢酸、ｐ−ヒドロキシプロピオン酸等のケイ光基質が
利用できる。
は、ABTSの外、５−アミノサルチル酸、４−アミノアン
チビリンとフェノール、フエノール誘導体又はアニリン
誘導体、０−トルイジン等の発色基質や、ｐ−ヒドロキ
シ酢酸、ｐ−ヒドロキシプロピオン酸等のケイ光基質が
利用できる。
また、1,5−AGの酸化反応により生成したH2O2の検出
法としては、この他に、H2O2電極を用いて直接測定する
方法や、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ
酸エステル類のH2O2酸化による化学発光を利用する方法
なども利用し得る。
法としては、この他に、H2O2電極を用いて直接測定する
方法や、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ
酸エステル類のH2O2酸化による化学発光を利用する方法
なども利用し得る。
（４）AGの酸化物質を分析する方法 試料溶液にシュードモナス菌由来の膜画分サスペンジ
ョンを加え30℃、16時間反応する。反応終了後超遠心に
より膜画分を除き、上澄液で凍結直空乾燥して白色粉末
を得る。この粉末をカルボニル基のラベル化剤又は水酸
基の保護剤で処理することにより、分析することができ
る。たとえばカルボニル基のラベル化剤として2,4−ジ
ニトロフエニルヒドラジンを用いる場合には、凍結乾燥
した粉末を少量のエタノールに溶解し、不溶物を除去し
た濾液へ2,4−ジニトロフエニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加した熱湯中で加熱反応さ
せる。この生成物を逆相系のHPLC（液体クロマトグラフ
ィー）により分析することにより、AGの酸化物質を検出
することができる。
ョンを加え30℃、16時間反応する。反応終了後超遠心に
より膜画分を除き、上澄液で凍結直空乾燥して白色粉末
を得る。この粉末をカルボニル基のラベル化剤又は水酸
基の保護剤で処理することにより、分析することができ
る。たとえばカルボニル基のラベル化剤として2,4−ジ
ニトロフエニルヒドラジンを用いる場合には、凍結乾燥
した粉末を少量のエタノールに溶解し、不溶物を除去し
た濾液へ2,4−ジニトロフエニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加した熱湯中で加熱反応さ
せる。この生成物を逆相系のHPLC（液体クロマトグラフ
ィー）により分析することにより、AGの酸化物質を検出
することができる。
（効果） 実施例１ AGを蒸溜水又は200mg/dlのグルコース水溶液で溶解し
て各種濃度のAG標準液を調整し、これら試料を本発明の
方法で処理後、ピラノースオキシダーゼでAGを酸化し、
生じた過酸化水素をパーオキシダーゼ〜４−アミノアン
チピリン〜Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS）系
により発色として検量線を作製した。
て各種濃度のAG標準液を調整し、これら試料を本発明の
方法で処理後、ピラノースオキシダーゼでAGを酸化し、
生じた過酸化水素をパーオキシダーゼ〜４−アミノアン
チピリン〜Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS）系
により発色として検量線を作製した。
参考例としてグルコース水溶液で調整した標準液を本
発明の方法によらず、直接ピラノースオキシダーゼで酸
化し上述の系で発色して吸光度をみた。
発明の方法によらず、直接ピラノースオキシダーゼで酸
化し上述の系で発色して吸光度をみた。
下記の組成の試薬Ａ、試薬Ｂおよび酵素液を調整し、
2.5mlの試薬ＡへAG標準液0.1mlと酵素液0.1mlを加え、3
7℃、30分反応後、試薬Ｂ 0.3mlを加え更に60分反応し
て分光光度計で593nmでの吸光度を測定した。
2.5mlの試薬ＡへAG標準液0.1mlと酵素液0.1mlを加え、3
7℃、30分反応後、試薬Ｂ 0.3mlを加え更に60分反応し
て分光光度計で593nmでの吸光度を測定した。
試薬A:トリス−塩酸バッファー（5nM、pH9）、ATP（1m
M）、NADP（ImM）、塩化マグネシューム（20mM）塩化カ
リューム（20mM）、パーオキシダーゼ（2u/ml）、DAOS
（1mM）、１−MPMS−（10μＭ） 試薬B:リン酸パッファー（200mM、pH5.6）、ピリノース
オキシダーゼ（25u/ml）、４−アミノアンチピリン（0.
5mg/ml） 酵素液：トリス塩酸バッファー（5mM、pH7）、グルコキ
ナーゼ（50u/ml）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
（35u/ml） 上表から明らかなように本発明方法によると、グルコ
ースが共存しても共存しない場合と極めて高い相関関係
を示した。又AG濃度と吸光度の間には良い直線関係がみ
られた。一方、表１の参考例に示した様に直接ピラノー
スオキシダーゼで酸化して発色した場合は過大な値が得
られAGの測定には利用出来ないことは明らかである。ま
たグルコキナーゼに替えヘキソキナーゼを用いて同様の
実験を行ったがグルコキナーゼを用いた場合と同様AGを
測定できた。
M）、NADP（ImM）、塩化マグネシューム（20mM）塩化カ
リューム（20mM）、パーオキシダーゼ（2u/ml）、DAOS
（1mM）、１−MPMS−（10μＭ） 試薬B:リン酸パッファー（200mM、pH5.6）、ピリノース
オキシダーゼ（25u/ml）、４−アミノアンチピリン（0.
5mg/ml） 酵素液：トリス塩酸バッファー（5mM、pH7）、グルコキ
ナーゼ（50u/ml）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
（35u/ml） 上表から明らかなように本発明方法によると、グルコ
ースが共存しても共存しない場合と極めて高い相関関係
を示した。又AG濃度と吸光度の間には良い直線関係がみ
られた。一方、表１の参考例に示した様に直接ピラノー
スオキシダーゼで酸化して発色した場合は過大な値が得
られAGの測定には利用出来ないことは明らかである。ま
たグルコキナーゼに替えヘキソキナーゼを用いて同様の
実験を行ったがグルコキナーゼを用いた場合と同様AGを
測定できた。
実験例２ 蒸溜水および2mMグルコース水溶液でAGを溶解して作
製した標準液１および２を用いて下の様に反応、発色し
て505nmにおける吸光度を測定した。参考例として標準
板２へ試薬ＡおよびＢを同時に加えて反応させ、同様に
吸光度を測定した。
製した標準液１および２を用いて下の様に反応、発色し
て505nmにおける吸光度を測定した。参考例として標準
板２へ試薬ＡおよびＢを同時に加えて反応させ、同様に
吸光度を測定した。
試薬A:トリス−塩酸バッファー（10nm、pH7）、パーオ
キシダーゼ（10u/ml）、フェノール（2mg/ml）、グルコ
ースオキシダーゼ（50μ/ml） 試薬B:リン酸バッファー（100mM、pH5.6）、４−アミノ
アンチピリン（1mg/ml）、ピラノースオキシダーゼ（5u
/ml） 方法：各種標準液0.1mlへ試薬A1,5mlを加え、37℃、２
時間反応した後試薬Ｂを1.5ml加え、37℃60分反応後505
nmにおける吸光度を測定した。
キシダーゼ（10u/ml）、フェノール（2mg/ml）、グルコ
ースオキシダーゼ（50μ/ml） 試薬B:リン酸バッファー（100mM、pH5.6）、４−アミノ
アンチピリン（1mg/ml）、ピラノースオキシダーゼ（5u
/ml） 方法：各種標準液0.1mlへ試薬A1,5mlを加え、37℃、２
時間反応した後試薬Ｂを1.5ml加え、37℃60分反応後505
nmにおける吸光度を測定した。
上の表の様にグルコース水溶液中のAGはグルコースオ
キシダーゼ、パーオキシダーゼおよび水素供与体である
フェノールによりグルコースと過酸化水素を消去した
後、ピラノースオキシダーゼで酸化、発色することによ
り、その含量と吸光度の間に良い比例関係がみられた。
一方、グルコース消去方法をしないで直接発色した場
合、発色度が過大となり、かつ比例関係が良くなった。
キシダーゼ、パーオキシダーゼおよび水素供与体である
フェノールによりグルコースと過酸化水素を消去した
後、ピラノースオキシダーゼで酸化、発色することによ
り、その含量と吸光度の間に良い比例関係がみられた。
一方、グルコース消去方法をしないで直接発色した場
合、発色度が過大となり、かつ比例関係が良くなった。
実施例１ ヒト血清中のAGを測定するため、５種類の血清をアミ
コン社製MPS−セントリフリーで除蛋白した試料および
蒸溜水で溶解したAG標準液を実験例１の方法に準じて反
応、発色し、AG標準液による検量線を用いて血清中のAG
を測定した。同時に同試料を従来の方法であるガスクロ
マトグラフィー法でAGおよびグルコース含量を測定し
た。
コン社製MPS−セントリフリーで除蛋白した試料および
蒸溜水で溶解したAG標準液を実験例１の方法に準じて反
応、発色し、AG標準液による検量線を用いて血清中のAG
を測定した。同時に同試料を従来の方法であるガスクロ
マトグラフィー法でAGおよびグルコース含量を測定し
た。
上の表の様に本発明の方法による結果は、従来の方法
であるガスクロ法による結果と良い相関を示し（相関係
数＝0.996）、グルコースが大量に含まれる血清中のAG
でも測定できることがわかった。
であるガスクロ法による結果と良い相関を示し（相関係
数＝0.996）、グルコースが大量に含まれる血清中のAG
でも測定できることがわかった。
Claims (2)
- 【請求項１】グルコースおよび1,5−アンヒドログルシ
トールを含有する試料へグルコース６位リン酸化酵素、
アデノシン３リン酸、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸、電子
伝達体、パーオキシダーゼおよび水素供与体を添加、反
応し、グルコースを消去した後、該試料中の1,5−アン
ヒドログルシトールを酵素を用いて定量することを特徴
とするグルコースおよび1,5−アンヒドログルシトール
を含有する試料中の1,5−アンヒドログルシトールの測
定法 - 【請求項２】グルコースおよび1,5−アンヒドログルシ
トールを含有する試料へグルコースオキシダーゼ、パー
オキシダーゼおよび水素供与体を添加、反応しグルコー
スを消去した後、該試料中の1,5−アンヒドログルシト
ールを酵素を用いて定量することを特徴とするグルコー
スと1,5−アンヒドログルシトールを含有する試料中の
1,5−アンヒドログルシトールの測定法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15460488A JP2665673B2 (ja) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | グルコースを含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15460488A JP2665673B2 (ja) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | グルコースを含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01320998A JPH01320998A (ja) | 1989-12-27 |
| JP2665673B2 true JP2665673B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=15587813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15460488A Expired - Fee Related JP2665673B2 (ja) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | グルコースを含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2665673B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5871949A (en) * | 1996-12-04 | 1999-02-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
| CA2291912A1 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-11 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol |
| CN101522895A (zh) | 2006-06-22 | 2009-09-02 | 池田食研株式会社 | 1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法及1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物 |
-
1988
- 1988-06-24 JP JP15460488A patent/JP2665673B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01320998A (ja) | 1989-12-27 |
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