JP3036883B2 - Method for measuring platelet activating factor acetylhydrolase activity - Google Patents
Method for measuring platelet activating factor acetylhydrolase activityInfo
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Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、血小板活性化因子アセ
チルヒドロラーゼ活性を測定する方法に関する。The present invention relates to a method for measuring platelet activating factor acetylhydrolase activity.
【0002】[0002]
【従来の技術】血小板活性化因子(PAF)[1−アル
キル−2−アセチル−sn−グリセロ−3−ホスフォコ
リン]は、炎症やアレルギー反応等広範囲の各種病態発
症に関与するメディエーターである。血小板活性化因子
アセチルヒドロラーゼ(PAFアセチルヒドロラーゼ)
は、PAFの持つ強力な生物活性を消去する役割を担っ
ていることからPAFの活性発現を調節し生体の恒常性
維持に関与している。川崎病、全身性エリトマトーデス
等の疾患時に、健康時に認められない血清中のPAFア
セチルヒドロラーゼ活性の変動が観察されており、血清
または血漿中のPAFアセチルヒドロラーゼ活性は各種
炎症性患者の発症、病態変化を反映し、これら疾患の診
断に有用な情報をもたらす新規な臨床検査法として重要
なものである。また血清PAFアセチルヒドロラーゼ欠
損者が存在し、この酵素欠損が重篤な小児喘息のリスク
ファクターと見なされていることから、それらの診断は
予防医学の面からも有用性が示されている。2. Description of the Related Art Platelet activating factor (PAF) [1-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine] is a mediator involved in the development of a wide variety of disease states such as inflammation and allergic reactions. Platelet activating factor acetyl hydrolase (PAF acetyl hydrolase)
Plays a role in eliminating the powerful biological activity of PAF, and thus regulates the expression of PAF activity and is involved in maintaining homeostasis in living organisms. Fluctuations in serum PAF acetylhydrolase activity, which are not observed at the time of health, have been observed during diseases such as Kawasaki disease and systemic lupus erythematosus. It is important as a new clinical test method that provides useful information for diagnosing these diseases. In addition, since some patients have serum PAF acetylhydrolase deficiency, and this enzyme deficiency is regarded as a risk factor for severe pediatric asthma, their diagnosis has been shown to be useful also in terms of preventive medicine.
【0003】従来PAFアセチルヒドロラーゼ活性は、
放射性同位元素である[ 3H]あるいは[14C]でアセ
チル基あるいはアルキル基を標識したPAFを用いた
り、あるいは残存する未反応基質PAFをバイオアッセ
イで定量し、測定していた。しかしながら、放射性同位
元素標識PAFを用いる従来のPAFアセチルヒドロラ
ーゼ活性測定法では、使用者および使用施設が限定さ
れ、また安全性あるいは放射性試薬の廃棄等の問題があ
り、さらに非標識PAFを基質として反応生成物のリゾ
PAFあるいは未分解のPAFを測定するには有機溶媒
による抽出や、混在する脂質を除去するためのクロマト
グラフィーによる精製操作等煩雑な操作が必要であり、
さらに未反応のPAFをバイオアッセイあるいはRIA
で測定するには、それぞれ血小板の使用時調製あるいは
高価な試薬が必要となるなど、一般の検査法として利用
するには困難な問題が存在した。Conventionally, PAF acetylhydrolase activity has been
PAF labeled with an acetyl group or an alkyl group with a radioactive isotope [3 H] or [14 C] was used, or the remaining unreacted substrate PAF was quantified and measured by a bioassay. However, the conventional method for measuring PAF acetylhydrolase activity using radioisotope-labeled PAF is limited in the number of users and facilities used, and has problems such as safety or disposal of radioactive reagents. Measuring lyso-PAF or undegraded PAF of the product requires complicated operations such as extraction with an organic solvent and purification by chromatography to remove mixed lipids.
In addition, unreacted PAF is analyzed by bioassay or RIA.
However, there is a problem that it is difficult to use as a general test method, for example, that the platelet requires preparation at the time of use or an expensive reagent is required.
【0004】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上記のような現状に鑑
みて本発明者らは、PAFアセチルヒドロラーゼ活性の
測定法として、非放射性基質を用いる安全でかつ操作が
簡便な直接測定法の開発を課題とし、鋭意研究を行い本
発明を完成するに至った。In view of the above situation, the present inventors have developed a safe and easy-to-use direct measurement method using a non-radioactive substrate as a method for measuring PAF acetylhydrolase activity. As an object, the present inventors have conducted intensive studies and completed the present invention.
【0005】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明は、血小板活性化
因子アセチルヒドロラーゼ活性の測定において、基質と
して一般式〔I〕SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for measuring platelet activating factor acetylhydrolase activity, wherein a substrate represented by the general formula [I]:
【0006】[0006]
【化2】 Embedded image
【0007】(式中、R1 はアシル基を示し、R2 はモ
ノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基また
はトリメチルアミノエチル基を示し、R3 はアルキル基
を示す)で表されるチオPAFおよびチオPAF類縁体
化合物を用いることを特徴とする血小板活性化因子アセ
チルヒドロラーゼ活性の測定法にある。本発明における
一般式〔I〕のR1 はアシル基を示し、特に炭素数が2
から5の飽和または不飽和のアシル基が好ましく、例え
ば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基およびバ
レリル基等が挙げられる。R2 はモノメチルアミノエチ
ル基、ジメチルアミノエチル基またはトリメチルアミノ
エチル基を示す。R3 はアルキル基を示し、特に炭素数
が12から18の飽和または不飽和のアルキル基が好ま
しく、例えば、ヘキサデシル基、オクタデシル基および
オレオイル基等が挙げられる。Wherein R 1 represents an acyl group, R 2 represents a monomethylaminoethyl group, a dimethylaminoethyl group or a trimethylaminoethyl group, and R 3 represents an alkyl group. A method for measuring platelet activating factor acetylhydrolase activity, which comprises using a thioPAF analog compound. In the present invention, R 1 in the general formula [I] represents an acyl group, and particularly has 2 carbon atoms.
To 5 saturated or unsaturated acyl groups are preferable, and examples include an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, and a valeryl group. R 2 represents a monomethylaminoethyl group, a dimethylaminoethyl group or a trimethylaminoethyl group. R 3 represents an alkyl group, particularly preferably a saturated or unsaturated alkyl group having 12 to 18 carbon atoms, and examples thereof include a hexadecyl group, an octadecyl group, and an oleoyl group.
【0008】そして、一般式〔I〕で表されるチオPA
Fの例としては、1−O−ヘキサデシル−2−チオアセ
チル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリン、1−O−
オクタデシル−2−チオアセチル−sn−グリセロ−3
−ホスフォコリン等が挙げられ、チオPAF類縁体化合
物の例としては、1−O−ヘキサデシル−2−チオプロ
ピオニル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリン、1−
O−ヘキサデシル−2−チオブチリル−sn−グリセロ
−3−ホスフォコリン、1−O−オクタデシル−2−チ
オプロピオニル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリ
ン、1−O−オクタデシル−2−チオバレリル−sn−
グリセロ−3−ホスフォコリン等が挙げられる。The thioPA represented by the general formula [I]
Examples of F include 1-O-hexadecyl-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1-O-
Octadecyl-2-thioacetyl-sn-glycero-3
-Phosphocholine and the like, and examples of the thioPAF analog compound include 1-O-hexadecyl-2-thiopropionyl-sn-glycero-3-phosphocholine,
O-hexadecyl-2-thiobutyryl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1-O-octadecyl-2-thiopropionyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1-O-octadecyl-2-thiovaleryl-sn-
Glycero-3-phosphocholine and the like.
【0009】本発明における一般式〔I〕で表されるチ
オPAFおよびチオPAF類縁体化合物は、PAFアセ
チルヒドロラーゼにより脱アシル化され、リゾチオPA
FあるいはリゾチオPAF類縁体化合物を生成する。こ
のリゾチオPAFあるいはリゾチオPAF類縁体化合物
は遊離SH基を有することから、SH基検出試薬を作用
させることによってその呈色の変化を測定し、リゾチオ
PAFあるいはリゾチオPAF類縁体化合物の生成量が
定量できる。すなわち、本発明によるチオPAFおよび
チオPAF類縁体化合物を基質とし、SH基検出試薬を
呈色試薬として用いることにより、PAFアセチルヒド
ロラーゼ活性が安全かつ簡便に測定することができる。The thioPAF and the thioPAF analog compound represented by the general formula [I] in the present invention are deacylated by PAF acetylhydrolase to give lysothioPA
Produces F or lysothio PAF analog compounds. Since this lysothio PAF or lysothio PAF analog compound has a free SH group, a change in coloration is measured by the action of an SH group detection reagent, and the amount of lysothio PAF or lysothio PAF analog compound produced can be quantified. . That is, PAF acetylhydrolase activity can be measured safely and simply by using the thio-PAF and the thio-PAF analog compound according to the present invention as a substrate and an SH group detection reagent as a color reagent.
【0010】SH基検出試薬は、SH基と反応して定量
的に呈色の変化(可視部または紫外部)を生ずるもので
あればいずれでも良く、例えば、DTNB(5,5’−
ジチオビス(2−ニトロ安息香酸))、4,4’−ビス
(ジメチルアミノ)ベンズヒドロール、2,2’−ジチ
オビス(5−ニトロピリジン)、2,2’−ジチオジピ
リジン、4,4’−ジチオジピリジン等が使用できる。The reagent for detecting the SH group may be any reagent that reacts with the SH group to quantitatively change the color (visible or ultraviolet). For example, DTNB (5,5'-
Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)), 4,4′-bis (dimethylamino) benzhydrol, 2,2′-dithiobis (5-nitropyridine), 2,2′-dithiodipyridine, 4,4 ′ -Dithiodipyridine and the like can be used.
【0011】PAFアセチルヒドロラーゼ活性測定時に
は、キレート試薬を共存させることが好ましい。キレー
ト試薬を共存させることにより、Ca2 +依存性である
ホスホリパーゼA2活性によるチオPAFおよびチオP
AF類縁体化合物の分解反応を抑制することができ、P
AFアセチルヒドロラーゼ活性を特異的に測定すること
ができるようになる。このキレート試薬としては、ED
TAあるいはEGTA等公知のものを使用することがで
きる。At the time of PAF acetylhydrolase activity measurement, it is preferable to coexist a chelating reagent. The co-presence of a chelating agent allows the thioPAF and thioP to be activated by phospholipase A2 activity which is dependent on Ca2 +.
The decomposition reaction of the AF analog compound can be suppressed, and P
AF acetylhydrolase activity can be specifically measured. As this chelating reagent, ED
Known materials such as TA or EGTA can be used.
【0012】病態時の血清中のPAFアセチルヒドロラ
ーゼ活性は、血清型PAFアセチルヒドロラーゼと組織
由来の細胞型PAFアセチルヒドロラーゼに基づくの
で、測定時に細胞型PAFアセチルヒドロラーゼ阻害物
質を作用させることにより、血清型PAFアセチルヒド
ロラーゼと細胞型PAFアセチルヒドロラーゼを分別定
量することが可能となる。なお、細胞型PAFアセチル
ヒドロラーゼ阻害物質としては、トリプシン等のプロテ
アーゼやフッ化ナトリウム、ジイソプロピルフルオロリ
ン酸等が挙げられる。[0012] The serum PAF acetylhydrolase activity in the disease state is based on serotype PAF acetylhydrolase and tissue-derived cell-type PAF acetylhydrolase. PAF acetylhydrolase and cell-type PAF acetylhydrolase can be separately quantified. Examples of the cell-type PAF acetylhydrolase inhibitor include proteases such as trypsin, sodium fluoride, and diisopropylfluorophosphate.
【0013】PAFアセチルヒドロラーゼにより生成し
た遊離のSH基を有するリゾチオPAFあるいはリゾチ
オPAF類縁体化合物とSH基検出試薬の反応による呈
色の変化の測定は、その呈色の変化を測定するのに最適
な波長で吸光度を測定することにより行う。本発明によ
るPAFアセチルヒドロラーゼの活性測定は、エンド法
でもレート法でも行えるが、エンド法の場合には、本発
明による基質のみを除いた測定試薬と試料とを反応させ
て、試料中に存在する蛋白質等に含まれる遊離SH基が
SH基検出試薬と反応して呈色した吸光度を差し引いて
PAFアセチルヒドロラーゼ活性を求める必要がある。
レート法の場合には、呈色の変化が定量的に行われてい
る時間内に吸光度の測定を行えば良い。また、PAFア
セチルヒドロラーゼ活性の算出は、SH基検出試薬の呈
色の分子吸光係数より算出するか、遊離のSH基を有す
る物質を標準物質としてその一定量の標準物質の呈色の
吸光度を測定することにより算出して行う。なお、本発
明によるPAFアセチルヒドロラーゼの活性測定は、用
手法でも自動分析装置を用いても行うことができる。The measurement of the change in color due to the reaction of a lysothio PAF or a lysothio PAF analog compound having a free SH group generated by PAF acetylhydrolase with an SH group detection reagent is most suitable for measuring the change in color. The measurement is performed by measuring the absorbance at a suitable wavelength. The activity of PAF acetylhydrolase according to the present invention can be measured by either the endo method or the rate method. In the case of the endo method, the PAF acetylhydrolase is present in the sample by reacting the sample with the measuring reagent from which only the substrate according to the present invention has been removed. It is necessary to determine the PAF acetylhydrolase activity by subtracting the absorbance at which the free SH group contained in the protein or the like contained in the protein reacts with the SH group detection reagent and develops a color.
In the case of the rate method, the absorbance may be measured within a time period in which the color change is quantitatively performed. In addition, the PAF acetylhydrolase activity is calculated from the molecular extinction coefficient of the color of the SH group detection reagent or by measuring the color absorbance of a certain amount of the standard substance using a substance having a free SH group as a standard substance. The calculation is performed by performing the above. In addition, the PAF acetylhydrolase activity measurement according to the present invention can be performed using a manual method or an automatic analyzer.
【0014】PAFアセチルヒドロラーゼ活性を測定す
る試料としては、ヒトあるいは動物の血液、血清、血
漿、尿、羊水等の体液、そして、ヒトあるいは動物の細
胞、臓器、細胞および臓器の抽出液等が対象となる。本
発明によるPAFアセチルヒドロラーゼの活性測定法に
おいては、一般式〔I〕で表されるチオPAFおよびチ
オPAF類縁体化合物の基質、および先に記したSH基
検出試薬、キレート試薬、細胞型PAFアセチルヒドロ
ラーゼ阻害物質だけでなく、緩衝剤、安定化剤、活性化
剤、賦形剤等の酵素の活性測定に一般に用いられている
ものを使用しても良い。そして、本発明によるPAFア
セチルヒドロラーゼの活性測定法においては、活性測定
時、一般式〔I〕で表されるチオPAFおよびチオPA
F類縁体化合物の基質は0.01〜1.0mM、SH基
検出試薬においては0.1〜5.0mM、キレート試薬
は0.5〜20mMの範囲で使用するのが好ましい。ま
た、緩衝剤はpH6.5からpH9.5の間に緩衝能を
持つものなら使用することができる。 〔参考例〕 チオPAFおよびチオPAF類縁体化合物
の製造法。Samples for measuring PAF acetylhydrolase activity include body fluids such as human or animal blood, serum, plasma, urine, and amniotic fluid, and human or animal cells, organs, and extracts of cells and organs. Becomes In the method for measuring the activity of PAF acetylhydrolase according to the present invention, the substrate of thioPAF and the thioPAF analog compound represented by the general formula [I], the SH group detection reagent, the chelating reagent and the cell-type PAF acetyl described above are used. Not only hydrolase inhibitors but also those generally used for measuring the activity of enzymes such as buffers, stabilizers, activators and excipients may be used. In the method for measuring the activity of PAF acetylhydrolase according to the present invention, when the activity is measured, thioPAF and thioPA
It is preferable to use the substrate of the F analog compound in the range of 0.01 to 1.0 mM, the SH group detection reagent in the range of 0.1 to 5.0 mM, and the chelating reagent in the range of 0.5 to 20 mM. Further, any buffering agent having a buffering ability between pH 6.5 and pH 9.5 can be used. [Reference Example] A method for producing thioPAF and thioPAF analog compounds.
【0015】本発明における一般式〔I〕で表されるチ
オPAFおよびチオPAF類縁体化合物は以下のように
して合成することができる。なお、図3にこの合成法の
反応過程を示した。図3において、1は(S)−1−O
−アセチル−2−O−ベンジルグリセロール、2は
(R)−1−O−アセチル−2−O−ベンジル−3−O
−トシルグリセロール、3は(R)−2−O−ベンジル
−1−O−トシルグリセロール、4は(R)−2−O−
ベンジル−3−O−テトラヒドロピラニル−1−O−ト
シルグリセロール、5は(S)−2−O−ベンジル−3
−O−ヘキサデシル−1−O−テトラヒドロピラニルグ
リセロール、6は(S)−3−O−ヘキサデシル−1−
O−テトラヒドロピラニルグリセロール、7は(S)−
3−O−ヘキサデシル−2−O−(4−ニトロベンゼン
スルホニル)−1−O−テトラヒドロピラニルグリセロ
ール、8aは(R)−1−O−ヘキサデシル−3−O−
テトラヒドロピラニル−2−チオアセチルグリセロー
ル、8bは(R)−1−O−ヘキサデシル−3−O−テ
トラヒドロピラニル−2−チオプロピオニルグリセロー
ル、8cは(R)−1−O−ヘキサデシル−3−O−テ
トラヒドロピラニル−2−チオブチリルグリセロール、
9aは1−O−ヘキサデシル−2−チオアセチル−sn
−グリセロ−3−ホスフォコリン、9bは1−O−ヘキ
サデシル−2−チオプロピオニル−sn−グリセロ−3
−ホスフォコリン、9cは1−O−ヘキサデシル−2−
チオブチリル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリンを
それぞれ示す。The thioPAF and thioPAF analog compound represented by the general formula [I] in the present invention can be synthesized as follows. FIG. 3 shows a reaction process of this synthesis method. In FIG. 3, 1 is (S) -1-O
-Acetyl-2-O-benzylglycerol, 2 is (R) -1-O-acetyl-2-O-benzyl-3-O
-Tosylglycerol, 3 is (R) -2-O-benzyl-1-O-tosylglycerol, 4 is (R) -2-O-
Benzyl-3-O-tetrahydropyranyl-1-O-tosylglycerol, 5 is (S) -2-O-benzyl-3
-O-hexadecyl-1-O-tetrahydropyranylglycerol, 6 represents (S) -3-O-hexadecyl-1-
O-tetrahydropyranylglycerol, 7 is (S)-
3-O-hexadecyl-2-O- (4-nitrobenzenesulfonyl) -1-O-tetrahydropyranylglycerol, 8a is (R) -1-O-hexadecyl-3-O-
Tetrahydropyranyl-2-thioacetylglycerol, 8b is (R) -1-O-hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-thiopropionylglycerol, 8c is (R) -1-O-hexadecyl-3- O-tetrahydropyranyl-2-thiobutyrylglycerol,
9a is 1-O-hexadecyl-2-thioacetyl-sn
-Glycero-3-phosphocholine, 9b is 1-O-hexadecyl-2-thiopropionyl-sn-glycero-3
-Phosphocholine, 9c is 1-O-hexadecyl-2-
Shows thiobutyryl-sn-glycero-3-phosphocholine, respectively.
【0016】まず、公知の方法(Tetrahedron Lett.,29
巻,5173頁(1988))で容易に得られる(S)−1−O−
アセチル−2−O−ベンジルグリセロール(図3中の化
合物1)に氷冷下p−トルエンスルホニルクロライドを
加え反応させて(R)−1−O−アセチル−2−O−ベ
ンジル−3−O−トシルグリセロール(図3中の化合物
2)を得る。これに25%アンモニア水とメタノールの
混合溶媒を加え減圧濃縮した後、ジクロロメタンを加え
飽和食塩水で洗浄し、(R)−2−O−ベンジル−1−
O−トシルグリセロール(図3中の化合物3)を得る。
これに3,4−ジヒドロ−2H−ピランを加え、さらに
氷冷下p−トルエンスルホン酸を加え反応させて(R)
−2−O−ベンジル−3−O−テトラヒドロピラニル−
1−O−トシルグリセロール(図3中の化合物4)を得
る。これに水素化ナトリウムの無水ジメチルホルムアミ
ド懸濁液にヘキサデカノールを添加したものを加え反応
させて(S)−2−O−ベンジル−3−O−ヘキサデシ
ル−1−O−テトラヒドロピラニルグリセロール(図3
中の化合物5)を得る。これに5%Pd−Cを加え水素
気流中で攪拌した後濾過して(S)−3−O−ヘキサデ
シル−1−O−テトラヒドロピラニルグリセロール(図
3中の化合物6)を得る。これに4−ジメチルアミノピ
リジンを加え、さらに氷冷下で4−ニトロベンゼンスル
ホニルクロライドを加えて反応させ、(S)−3−O−
ヘキサデシル−2−O−(4−ニトロベンゼンスルホニ
ル)−1−O−テトラヒドロピラニルグリセロール(図
3中の化合物7)を得る。これをアセトニトリルに溶解
し、チオ酢酸カリウムを加えて還流して(R)−1−O
−ヘキサデシル−3−O−テトラヒドロピラニル−2−
チオアセチルグリセロール(図3中の化合物8a)を得
る。First, a known method (Tetrahedron Lett., 29)
Vol., P. 5173 (1988)).
Acetyl-2-O-benzylglycerol (compound 1 in FIG. 3) was added with p-toluenesulfonyl chloride under ice cooling and reacted to give (R) -1-O-acetyl-2-O-benzyl-3-O-. Tosylglycerol (compound 2 in FIG. 3) is obtained. A mixed solvent of 25% aqueous ammonia and methanol was added thereto, and the mixture was concentrated under reduced pressure. Dichloromethane was added, and the mixture was washed with saturated saline, and then (R) -2-O-benzyl-1- was added.
O-tosylglycerol (compound 3 in FIG. 3) is obtained.
To this, 3,4-dihydro-2H-pyran was added, and further, p-toluenesulfonic acid was added thereto under ice cooling to react (R)
-2-O-benzyl-3-O-tetrahydropyranyl-
1-O-tosylglycerol (compound 4 in FIG. 3) is obtained. To this was added a suspension of sodium hydride in anhydrous dimethylformamide to which hexadecanol had been added, and the mixture was reacted to give (S) -2-O-benzyl-3-O-hexadecyl-1-O-tetrahydropyranylglycerol ( FIG.
To give compound 5). 5% Pd-C was added thereto, and the mixture was stirred in a hydrogen stream and filtered to obtain (S) -3-O-hexadecyl-1-O-tetrahydropyranylglycerol (compound 6 in FIG. 3). To this, 4-dimethylaminopyridine was added, and further, 4-nitrobenzenesulfonyl chloride was added thereto under ice cooling to cause a reaction, and (S) -3-O-
Hexadecyl-2-O- (4-nitrobenzenesulfonyl) -1-O-tetrahydropyranylglycerol (compound 7 in FIG. 3) is obtained. This was dissolved in acetonitrile, potassium thioacetate was added thereto, and the mixture was refluxed to give (R) -1-O
-Hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-
Thioacetylglycerol (compound 8a in FIG. 3) is obtained.
【0017】この(R)−1−O−ヘキサデシル−3−
O−テトラヒドロピラニル−2−チオアセチルグリセロ
ール(図3中の化合物8a)のテトラヒドロピラニル基
を脱保護後、2−ブロモエチルホスフォロクロリデート
を反応させ、ついでトリエチルアミンと反応させること
によりチオPAF[1−O−ヘキサデシル−2−チオア
セチル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリン](図3
中の化合物9a)を合成する。The (R) -1-O-hexadecyl-3-
After deprotection of the tetrahydropyranyl group of O-tetrahydropyranyl-2-thioacetylglycerol (compound 8a in FIG. 3), thioPAF was reacted with 2-bromoethylphosphorochloridate and then with triethylamine. [1-O-hexadecyl-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine] (FIG. 3
Compound 9a) in is synthesized.
【0018】また、チオPAF類縁体化合物の合成は、
対応する酸クロライドまたは対応する酸とジエチルホス
フォロシアニデート等のエステル縮合剤を利用して
(R)−1−O−ヘキサデシル−3−O−テトラヒドロ
ピラニル−2−チオアセチルグリセロール(図3中の化
合物8a)より合成することができる。(R)−1−O
−ヘキサデシル−3−O−テトラヒドロピラニル−2−
チオアセチルグリセロール(図3中の化合物8a)をリ
チウムアルミニウムハイドライドで還元後、プロピオニ
ルクロライドや酪酸とジエチルホスフォロシアニデート
等のエステル化剤で、チオアシル体化合物である(R)
−1−O−ヘキサデシル−3−O−テトラヒドロピラニ
ル−2−チオプロピオニルグリセロール(図3中の化合
物8b)や(R)−1−O−ヘキサデシル−3−O−テ
トラヒドロピラニル−2−チオブチリルグリセロール
(図3中の化合物8c)を合成した後、前記の(R)−
1−O−ヘキサデシル−3−O−テトラヒドロピラニル
−2−チオアセチルグリセロール(図3中の化合物8
a)からチオPAF[1−O−ヘキサデシル−2−チオ
アセチル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリン](図
3中の化合物9a)を合成した方法と同じようにして、
チオアシル体化合物(図3中の化合物8b,8c)より
チオPAF類縁体化合物である1−O−ヘキサデシル−
2−チオプロピオニル−sn−グリセロ−3−ホスフォ
コリン(図3中の化合物9b)および1−O−ヘキサデ
シル−2−チオブチリル−sn−グリセロ−3−ホスフ
ォコリン(図3中の化合物9c)を合成する。In addition, the synthesis of thioPAF analog compounds is as follows:
(R) -1-O-hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-thioacetylglycerol (FIG. 3) using a corresponding acid chloride or a corresponding acid and an ester condensing agent such as diethylphosphorocyanidate. From the compound 8a). (R) -1-O
-Hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-
After reducing thioacetylglycerol (compound 8a in FIG. 3) with lithium aluminum hydride, it is a propionyl chloride or an esterifying agent such as butyric acid and diethylphosphoranidate, which is a thioacyl compound (R).
-1-O-hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-thiopropionylglycerol (compound 8b in FIG. 3) and (R) -1-O-hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-thio After synthesizing butyrylglycerol (compound 8c in FIG. 3), the aforementioned (R)-
1-O-hexadecyl-3-O-tetrahydropyranyl-2-thioacetylglycerol (compound 8 in FIG. 3)
In the same manner as in the method for synthesizing thio PAF [1-O-hexadecyl-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine] (compound 9a in FIG. 3) from a),
From the thioacyl compound (compounds 8b and 8c in FIG. 3), 1-O-hexadecyl-
2-thiopropionyl-sn-glycero-3-phosphocholine (compound 9b in FIG. 3) and 1-O-hexadecyl-2-thiobutyryl-sn-glycero-3-phosphocholine (compound 9c in FIG. 3) are synthesized.
【0019】[0019]
0.556mM チオPAF[1−O−ヘキサデシル−
2−チオアセチル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリ
ン]、1.11mM DTNB、4.44mMEDTA
を含む0.1M トリス塩酸緩衝液(pH7.5) 〔試料〕 3種類の血清試料S1、S2およびS3 〔操作〕 予め37゜Cに加温した上記の測定試薬1.8mlに血
清試料200μlを添加し、攪拌した後、37゜C恒温
装置を備えた分光光度計を用いて、15分間1分毎に4
12nmにおける吸光度を測定した。なお、血清試料の
かわりに精製水を添加したものを対照とした。0.556 mM thioPAF [1-O-hexadecyl-
2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine], 1.11 mM DTNB, 4.44 mM EDTA
0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.5) [Sample] Three kinds of serum samples S1, S2 and S3 [Operation] 200 μl of serum sample was added to 1.8 ml of the above-mentioned measuring reagent which had been heated to 37 ° C. in advance. After addition and stirring, use a spectrophotometer equipped with a 37 ° C thermostat for 4 minutes every minute for 15 minutes.
The absorbance at 12 nm was measured. In addition, what added purified water instead of the serum sample was set as the control.
【0020】この測定操作は、3種類の血清試料それぞ
れについて3回ずつおこない、3回の吸光度測定値の平
均を測定値とした。反応が定量的に進行していた5分め
から10分めにかけての単位時間(1分間)当りの吸光
度の変化量(ΔE)とDTNBの分子吸光係数ε=15
500から各血清試料のPAFアセチルヒドロラーゼ活
性値を算出した。This measurement operation was performed three times for each of the three types of serum samples, and the average of the three measured absorbance values was used as the measured value. The amount of change in absorbance (ΔE) per unit time (1 minute) from the 5th to the 10th minute when the reaction progressed quantitatively, and the molecular extinction coefficient ε of DTNB = 15
From 500, the PAF acetylhydrolase activity value of each serum sample was calculated.
【0021】その結果は、S1=1.57(nmol/
min/試料50μl)、S2=1.96(nmol/
min/試料50μl)、S3=2.81(nmol/
min/試料50μl)であった。血清試料のPAFア
セチルヒドロラーゼ活性を測定した時のタイムコースを
図1に示した。横軸は測定試薬に試料を加えた後のイン
キュベート時間、縦軸はリゾチオPAFの生成量を示
す。インキュベート初期には、血清試料中の遊離SH基
に基づく見かけのリゾチオPAF生成量の変化が見られ
るが、インキュベート3分後からはPAFアセチルヒド
ロラーゼ活性に基づき生成されるリゾチオPAF量がイ
ンキュベート時間に比例して定量的に増加していること
が示されている。As a result, S1 = 1.57 (nmol /
min / sample 50 μl), S2 = 1.96 (nmol /
min / sample 50 μl), S3 = 2.81 (nmol /
min / sample 50 μl). FIG. 1 shows a time course when the PAF acetylhydrolase activity of the serum sample was measured. The horizontal axis incubation time after adding the sample to the measurement reagent and a vertical axis shows the production amount of lyso-thio PAF. The incubation early, but the change in lyso-thio PAF production of apparent based on the free SH group in a serum sample is observed, the Rizochio PAF amount generated based on the PAF acetylhydrolase activity from 3 minutes after the incubation is incubation time It is shown that it is increasing quantitatively in proportion.
【0022】本測定法と従来の放射性標識PAFを用い
るPAFアセチルヒドロラーゼ活性測定法との相関を図
2に示した。[ 3H]アセチル−PAFを用いる測定法
(Y)と本測定法(X)との相関は、回帰式:Y=0.
85X−0.02、相関係数:r=0.997と良い相
関を示し、本測定法は充分実用性があることが実証され
た。FIG. 2 shows the correlation between this measurement method and a conventional method for measuring PAF acetylhydrolase activity using radiolabeled PAF. The correlation between the measurement method (Y) using [3 H] acetyl-PAF and the present measurement method (X) is represented by a regression equation: Y = 0.
85X-0.02, correlation coefficient: r = 0.997, showing a good correlation, demonstrating that this measurement method is sufficiently practical.
【0023】[0023]
【発明の効果】本発明によるPAFアセチルヒドロラー
ゼ活性測定法は、試料中のPAFアセチルヒドロラーゼ
活性を放射性標識基質を用いることなく直接測定するこ
とが可能となるので、日常の検査に安全、迅速、簡便か
つ高精度の測定法として充分利用できる。また、従来の
方法より測定時間が短縮されたことにより疾患の検定、
予後の経過を短時間で診断できるため極めて有用性が高
い。According to the method for measuring PAF acetylhydrolase activity of the present invention, it is possible to directly measure PAF acetylhydrolase activity in a sample without using a radioactively labeled substrate. And it can be used as a highly accurate measurement method. In addition, due to the reduced measurement time compared to conventional methods,
This is extremely useful because the prognosis can be diagnosed in a short time.
【図1】本発明の測定法により血清試料のPAFアセチ
ルヒドロラーゼ活性を測定した時のタイムコースを示し
た図である。FIG. 1 is a diagram showing a time course when a PAF acetylhydrolase activity of a serum sample was measured by the measurement method of the present invention.
【図2】本発明の測定法と放射性標識PAFを用いる測
定法との相関を示した図である。FIG. 2 is a diagram showing a correlation between the measurement method of the present invention and a measurement method using radiolabeled PAF.
【図3】本発明で使用するチオPAFおよびチオPAF
類縁体化合物の合成法を示した図である。FIG. 3. ThioPAF and thioPAF used in the present invention
FIG. 3 is a view showing a method for synthesizing an analog compound.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12Q 1/25 - 1/66 BIOSIS(DIALOG) CA(STN) REGISTRY(STN) WPI(DIALOG)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (58) Investigated field (Int. Cl. 7 , DB name) C12Q 1/25-1/66 BIOSIS (DIALOG) CA (STN) REGISTRY (STN) WPI (DIALOG)
Claims (1)
活性の測定において、基質として一般式〔I〕 【化1】 (式中、R1 はアシル基を示し、R2 はモノメチルアミ
ノエチル基、ジメチルアミノエチル基またはトリメチル
アミノエチル基を示し、R3 はアルキル基を示す)で表
されるチオPAFおよびチオPAF類縁体化合物を用い
ることを特徴とする血小板活性化因子アセチルヒドロラ
ーゼ活性の測定法。In the measurement of platelet activating factor acetylhydrolase activity, a substrate represented by the general formula [I]: (Wherein, R 1 represents an acyl group, R 2 represents a monomethylaminoethyl group, a dimethylaminoethyl group or a trimethylaminoethyl group, and R 3 represents an alkyl group). A method for measuring platelet activating factor acetylhydrolase activity, which comprises using a somatic compound.
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- 1991-05-24 JP JP3120286A patent/JP3036883B2/en not_active Expired - Fee Related
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