JP3026367B2

JP3026367B2 - ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドにより形質転換された微生物による３−ヒドロキシニトリル化合物の製造法

Info

Publication number: JP3026367B2
Application number: JP3062597A
Authority: JP
Inventors: 秀明山田; 透長沢; 哲二中村; 渉水無; 不二夫湯
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1991-03-04
Filing date: 1991-03-04
Publication date: 2000-03-27
Anticipated expiration: 2015-03-27
Also published as: JPH05317066A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、１，３−ジハロ−２−
プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性および
その逆反応を触媒する活性を有する酵素（以下ハロヒド
リンエポキシダーゼと略す）遺伝子ＤＮＡをベクタープ
ラスミドに連結した組換え体プラスミドを宿主微生物に
導入した形質転換微生物による、３−ヒドロキシニトリ
ル化合物の製造法に関する。３−ヒドロキシニトリル化
合物は、種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として
有用な物質として知られている。

【０００２】

【発明の背景】脱ハロゲン化酵素の作用によりエピハロ
ヒドリンから４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
を製造する方法は、先に、本発明者らの一部により見出
されている（特願平１−１８５９９２号明細書参照）。
しかし、これら脱ハロゲン化酵素を有する微生物の触媒
能力は高くなく、工業的に用いる場合には満足できるも
のではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子組換えの方法で
クローン化された脱ハロゲン化酵素遺伝子によるエピハ
ロヒドリンから４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリ
ルへの変換反応では、菌体内に多数の遺伝子を存在させ
ることができるため微生物の触媒能力を従来の方法に比
して飛躍的に増大させることが期待できる。このような
状況下、本発明者らの一部は、エピハロヒドリンを４−
ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに変換する酵素が
ハロヒドリンエポキシダーゼであることを見い出し、さ
らに微生物由来のハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺伝
子ＤＮＡをベクタープラスミドに挿入して組換え体プラ
スミドを得、この組換え体プラスミドを導入した形質転
換体によりハロヒドリンエポキシダーゼを発現させるこ
とに成功した。

【０００４】

【問題を解決するための手段】本発明は、この形質転換
体によるハロヒドリンエポキシダーゼ酵素反応が、エピ
ハロヒドリン以外の１，２−エポキシ化合物にも適用で
き、３−ヒドロキシニトリル化合物の製造に有用できる
ことを見い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発
明は、微生物由来のハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺
伝子ＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組換え体プ
ラスミドにより形質転換された形質転換微生物の培養
液、菌体または菌体処理物を、シアン化アルカリの存在
下で、下記一般式〔Ｉ〕で示される１，２−エポキシ化
合物に作用させ、これを下記一般式（ＩＩ〕で示される
３−ヒドロキシニトリル化合物に変換せしめることを特
徴とする３−ヒドロキシニトリル化合物の製造法、であ
る。

【０００５】

【化２】〔Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す〕

【０００６】本発明における形質転換微生物は、ハロヒ
ドリンエポキシダーゼ遺伝子ＤＮＡをベクタープラスミ
ドに連結した組換え体プラスミドにより形質転換された
微生物であり、この組換え体プラスミドとして、（１）配列番号：１で示されるアミノ酸配列またはその
一部の配列を有しハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、（２）配列番号：２で示されるアミノ酸配列またはその
一部の配列を有しハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、（３）上記（１）項のハロヒドリンエポキシダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列
番号：３で示されるＤＮＡ配列またはその一部の配列か
らなるもの、（４）上記（２）項のハロヒドリンエポキシダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列
番号：４で示されるＤＮＡ配列またはその一部の配列か
らなるもの、の少なくとも一つを含むものが挙げられる。

【０００７】以下に本発明を具体的に説明する。本発明
で使用し得る形質転換微生物におけるＤＮＡ供与体微生
物としては、コリネバクテリウムｓｐ．Ｎ−１０７４
（微工研条寄第２６４３号）、ミクロバクテリウムｓ
ｐ．Ｎ−４７０１（微工研条寄第２６４４号）等が挙げ
られ、その菌学的性質はそれぞれ特開平２−２９１２８
０号公報に記載されている。ベクターとしては、プラス
ミドベクター（例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＵＣ１１９等）、ファージベクター（例え
ばλｇｔ１１等）のいずれでもよい。また、形質転換に
用いられる宿主微生物としては、エシェリシアコリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５株あるいは同ＪＭ１０９株
が挙げられるが、特に、これらに限定されるものではな
く、他の宿主生物を用いることもできる。一例として、
コリネバクテリウムｓｐ．Ｎ−１０７４（微工研条寄第
２６４３号）のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株へのクローニングを、以
下に示す。

【０００８】（１）コリネバクテリウムｓｐ．Ｎ−１０
７４染色体ＤＮＡの調製とＤＮＡライブラリーの作成：コリネバクテリウムｓｐ．Ｎ−１０７４からＳａｉｔｏ
ａｎｄＭｉｕｒａの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７２，６１９（１９６３）参照〕
により染色体ＤＮＡを分離し、これを制限酵素（Ｂａｍ
ＨＩあるいはＢｇｌＩＩ）で切断後、ベクタープラスミ
ドｐＵＣ１８に挿し組換え体ＤＮＡのライブラリーを作
成した。

【０００９】（２）形質転換体の作成および組換え体Ｄ
ＮＡの選別：工程（１）で調製した組換え体ライブラリーによる形質
転換体を宿主生物としてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株を
用いて塩化カルシウム法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５
３，１５４（１９７０）〕により作成し、その中からハ
ロヒドリンエポキシダーゼ活性を示すようになったもの
を選別した。選別は以下のようにして行った。アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）とＩＰＴＧ（１ｍｌ）を含む
ＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクト
イーストエキス、０．５％ＮａＣ１、１．５％寒天）に
作成した形質転換体のコロニーを形成させた。１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０２％ブロモ
クレゾールパープル、１％１，３−ジクロロ−２−プロ
パノールを染み込ませたロ紙にコロニーを移し、室温に
て数時間放置した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を
持つコロニーは塩酸を遊離しコロニー付近のｐＨは低下
し、ｐＨ指示薬であるブロモクレゾールパープルは青紫
色から黄色に変化するため、肉眼観察によりハロヒドリ
ンエポキシダーゼ遺伝子を持つ株を選別することができ
る。

【００１０】これらの形質転換株が実際にハロヒドリン
エポキシダーゼ活性を有しているかどうかは次のように
して調べることができる。これらの株をアンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）とＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含むＬＢ培
地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエ
キス、０．５％ＮａＣｌ）にて３７℃で一夜培養する。
菌体を５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８）で２回洗
浄後、１％１，３−ジクロロプロパノールを含む１Ｍト
リス−硫酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、２０℃にてイン
キューベートした。一定時間後、生成するエピクロルヒ
ドリンをガスクロマトグラフィーにて定量した。こうし
て得られた形質転換株から再びプラスミドＤＮＡを取り
出し、選別された２種の目的のプラスミドを得た。これ
らのプラスミドをｐＳＴ００１およびｐＳＴ００５、な
らびにこれらのプラスミドが導入された形質転換体をＪ
Ｍ１０９／ｐＳＴ００１およびＪＭ１０９／ｐＳＴ００
５と称する。

【００１１】（３）制限酵素地図の作成とハロヒドリン
エポキシダーゼ遺伝子の位置の決定：工程（２）で得られたプラスミドについて制限酵素地図
を作成した。その後、より小さなＤＮＡ断片を持つプラ
スミドを作成した。これらのプラスミドによって工程
（２）と同様にして形質転換された株のハロヒドリンエ
ポキシダーゼ活性の有無によって目的遺伝子の含まれて
いる箇所を決定した。この過程で、ｐＳＴ００１のＢａ
ｍＨＩ−Ｂｇｌ１．３Ｋｂ断片を含むｐＳＴ０１５（ｐ
ＵＣ１１８ベクター）およびｐＳＴ００５のＢａｍＨＩ
−ＰｓｔＩ１．１Ｋｂ断片を含むｐＳＴ１１１（ｐＵＣ
１１８ベクター）プラスミドを作成した（図１）。こ
れらのプラスミドが導入された形質転換体をＪＭ１０９
／ｐＳＴ０１５およびＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１と称す
る。

【００１２】（４）塩基配列の決定：工程（３）で得られたプラスミドｐＳＴ０１５およびｐ
ＳＴ１１１のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子に関す
る部分のＤＮＡの塩基配列を決定した（配列番号：５お
よび配列番号：６）。なお、ここで得られた形質転換体
ＪＭ１０９／ｐＳＴ００１、ＪＭ１０９／ｐＳＴ００
５、ＪＭ１０９／ｐＳＴ０１５およびＪＭ１０９／ｐＳ
Ｔ１１１は、工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に、それぞれ微工研菌寄第１１９６１号、微工研菌
寄第１１９６２号、微工研菌寄第１２０６４号および微
工研菌寄第１２０６５号として寄託されている。

【００１３】本発明の形質転換微生物の培養は、通常は
液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことが
できる。培地としては、例えばＬＢ培地が用いられる。
培養は１０〜５０℃の温度で、ｐＨ２〜１１の範囲で行
われる。微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行
ってもよい。

【００１４】培養により得られた形質転換微生物は、培
養液あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基
質を添加する方法、菌体処理物（例えば菌体破砕物、粗
酵素・精製酵素等の菌体抽出物等）あるいは常法により
固定化した菌体または菌体処理物等の懸濁液に基質を添
加する方法、微生物の培養時に基質を培養液に添加して
培養と同時に反応を行う方法等により、シアン化アルカ
リの存在下に、前記一般式〔Ｉ〕で示される１，２−エ
ポキシ化合物に作用させて、これを前記一般式〔ＩＩ〕
で示される３−ヒドロキシニトリル化合物に変換するこ
とができる。

【００１５】一般式〔Ｉ〕で示される１，２−エポキシ
化合物は、例えば、１，２−エポキシプロパン、１，２
−エポキシブタン、１，２−エポキシヘキサン等であ
る。また、シアン化アルカリは、シアン化カリウム、シ
アン化ナトリウム等である。反応液中の基質濃度は特に
限定するものではないが、０．１〜１０（Ｗ／Ｖ）％が
好ましく、また、シアン化アルカリの使用量は、通常基
質の１〜３倍量（モル）である。基質は反応液に一括し
て加えるかあるいは分割添加することができる。反応温
度は５〜５０℃、反応ｐＨは４〜１０の範囲で行うこと
が好ましい。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるい
はその他の反応条件等によって変わるが、通常１〜１２
０時間で終了するように条件を設定するのが好ましい。

【００１６】かくして、反応液中に生成、蓄積した３−
ヒドロキシニトリル化合物は公知の方法を用いて採取お
よび精製することができる。例えば、反応液から遠心分
離などの方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなど
の溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することによ
り３−ヒドロキシニトリル化合物のシロップを得ること
ができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留する
ことによりさらに精製することもできる。

【００１７】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子組換えの方法で
クローン化されたハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が
菌体内に多数存在する形質転換微生物の使用により、シ
アン化アルカリの存在下、１，２−エポキシ化合物から
３−ヒドロキシニトリル化合物を効率よく製造すること
が可能である。

【００１８】

【実施例】実施例１アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）と１ｍＭＩＰＴＧを
含むＬＢ培地１８ｌにＪＭ１０９／ｐＳＴ００１を接種
し３７℃にて１６時間振盪培養を行った。得られた培養
液から遠心分離により菌体を回収し、１００ｍＭトリ
ス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌで洗浄後、同緩
衝液に懸濁し菌体懸濁液を調製した。菌体を超音波破砕
した後、遠心分離して沈澱物を除去し、上清を菌体抽出
液とした。常法にて硫安分画を行い、ＤＥＡＥ−セファ
セル、Ｐｈｅｎｙｌ−セファロースおよびＯｃｔｙｌ−
セファロース（ファルマシア製）を用いたカラムクロマ
トグラフィーによって酵素を精製した。４００ｍＭのト
リス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）にシアン化カリウムを
２００ｍＭになるように溶かした後、１Ｎの硫酸でｐＨ
を８．０に調整し、この溶液２５ｍｌに精製酵素溶液
（タンパク濃度：３０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌと４００
ｍＭの１，２−エポキシブタン溶液２５ｍｌを加え、２
０℃で２時間反応した。反応液をガスクロマトグラフィ
ーで分析したところ、１００ｍＭの３−ヒドロキシバレ
ロニトリルが生成していた。なお、本反応生成物は、反
応液から酢酸エチルで抽出することによって単離した
後、ＮＭＲ、赤外吸光スペクトルおよびマススペクトル
による分析から、３−ヒドロキシバレロニトリルである
ことを確認した。

【００１９】実施例２１，２−エポキシブタンの代わりに１，２−エポキシプ
ロパンを使用して実施例１と同様の反応を行ったとこ
ろ、７１ｍＭの３−ヒドロキシブチロニトリルが生成し
た。本反応生成物は実施例１と同様にして同定した。

【００２０】実施例３実施例１と同様にして調製した培地（１００ｍｌ）に、
それぞれＪＭ１０９／ｐＳＴ０１５およびＪＭ１０９／
ｐＳＴ１１１を接種し、３７℃にて１６時間培養を行っ
た。これらの培養液をそれぞれ遠心分離して菌体を集
め、１００ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０
ｍｌで洗浄後、同緩衝液２５ｍｌに懸濁し菌体懸濁液を
調製した。４００ｍＭのトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．
０）にシアン化カリウムを２００ｍＭとなるように溶か
した後、１Ｎの硫酸でｐＨを８．０に調整した溶液５０
ｍｌを作成し、この溶液に上記菌体懸濁液と２００ｍＭ
の１，２−エポキシブタン溶液をそれぞれ２５ｍｌ加
え、２０℃で３０分（ＪＭ１０９／ｐＳＴ０１５）およ
び２０℃で１５分（ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１）反応さ
せた。反応液をガスクロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、それぞれ１１．１ｍＭ（ＪＭ１０９／ｐＳＴ０１
５）および７．２ｍＭ（ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１）の
３−ヒドロキシバレロニトリルが生成していた。

【００２１】実施例４１，２−エポキシブタンの代わりに１，２−エポキシプ
ロパン使用して実施例３と同様の反応を行ったところ、
それぞれ３．６ｍＭ（ＪＭ１０９／ｐＳＴ０１５）およ
び６．２ｍＭ（ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１）の３−ヒド
ロキシブチロニトリルが生成していた。

【００２２】

【配列表】

【００２３】

【００２４】

【００２５】

【００２６】

【００２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】組換え体プラスミドｐＳＴ００１、ｐＳＴ００
５、ｐＳＴ０１５およびｐＳＴ１１１の制限酵素地図を
示す。

【配列表】

【００２３】配列番号：１配列の長さ：244 配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： Met Lys Ile Ala Leu Val Thr His Ala Arg His Phe Ala Gly Pro Ala 1 5 10 15 Ala Val Glu Ala Leu Thr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Val Cys His Asp 20 25 30 Ala Thr Phe Ala Asp Ala Ala Glu Arg Gln Arg Phe Glu Ser Glu Asn 35 40 45 Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala Glu Gln Lys Pro Glu Arg Leu Val Asp 50 55 60 Ala Thr Leu Gln His Gly Glu Ala Ile Asp Thr Ile Val Ser Asn Asp 65 70 75 80 Tyr Ile Pro Arg Pro Met Asn Arg Leu Pro Ile Glu Gly Thr Ser Glu 85 90 95 Ala Asp Ile Arg Gln Val Phe Glu Ala Leu Ser Ile Phe Pro Ile Leu 100 105 110 Leu Leu Gln Ser Ala Ile Ala Pro Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ala Ser 115 120 125 Val Ile Phe Ile Thr Ser Ser Val Gly Lys Lys Pro Leu Ala Tyr Asn 130 135 140 Pro Leu Tyr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Val Ala Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Ala Ala Lys Thr Leu Ser Arg Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Ile Gly 165 170 175 Pro Asn Phe Phe Asn Asn Pro Thr Tyr Phe Pro Thr Ser Asp Trp Glu 180 185 190 Asn Asn Pro Glu Leu Arg Glu Arg Val Glu Arg Asp Val Pro Leu Gly 195 200 205 Arg Leu Gly Arg Pro Asp Glu Met Gly Ala Leu Ile Thr Phe Leu Ala 210 215 220 Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ile Val Gly Gln Phe Phe Ala Phe Thr Gly 225 230 235 240 Gly Tyr Leu Pro

【００２４】配列番号：２配列の長さ：235 配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235

【００２５】配列番号：３配列の長さ：732 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： ATG AAG ATC GCC CTC GTG ACT CAT GCA CGG CAT TTT GCA GGC CCC GCC 48 GCC GTC GAG GCG CTT ACG CGG GAT GGC TAT ACC GTG GTT TGC CAC GAC 96 GCG ACG TTC GCT GAT GCA GCT GAA CGA CAG CGT TTC GAG TCG GAG AAC 144 CCG GGC ACC GTC GCG CTC GCC GAG CAG AAG CCC GAG CGT CTG GTC GAC 192 GCC ACG CTG CAG CAC GGG GAA GCG ATC GAC ACG ATC GTC TCG AAC GAT 240 TAC ATT CCG CGC CCG ATG AAT CGG CTC CCG ATC GAG GGA ACG AGC GAG 288 GCC GAC ATC CGA CAG GTG TTC GAG GCG CTC AGC ATC TTC CCG ATC CTG 336 CTC CTG CAG TCG GCC ATC GCG CCG CTA CGG GCT GCA GGC GGC GCC TCC 384 GTT ATC TTC ATC ACG TCC TCA GTT GGC AAG AAG CCG CTC GCC TAC AAC 432 CCT CTC TAT GGG CCC GCG CGC GCC GCT ACC GTC GCG CTT GTC GAA TCG 480 GCA GCG AAG ACG CTG TCC CGT GAC GGA ATC TTG CTC TAC GCG ATC GGT 528 CCG AAC TTC TTC AAC AAC CCG ACG TAC TTC CCG ACG TCG GAT TGG GAG 576 AAC AAC CCC GAG CTC CGG GAG CGT GTC GAG CGG GAC GTG CCG CTC GGT 624 CGC CTC GGC CGT CCG GAC GAG ATG GGT GCG CTG ATC ACC TTC CTC GCT 672 TCG CGT CGT GCA GCG CCC ATC GTG GGG CAG TTC TTC GCT TTC ACC GGT 720 GGC TAT CTG CCC 732

【００２６】配列番号：４配列の長さ：705 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： ATG GCT AAC GGA AGG AAA AGG GAA ATG GCT AAC GGA AGA CTG GCA GGC 48 AAG CGG GTC CTA CTC ACG AAC GCC GAT GCC TAC ATG GGT GAG GCC ACG 96 GTC CAG GTG TTC GAG GAG GAG GGC GCA GAG GTC ATC GCT GAC CAC ACC 144 GAC TTG ACG AAG GTC GGC GCG GCG GAG GAG GTC GTC GAG AGG GCT GGG 192 CAC ATC GAT GTC CTG GTG GCC AAC TTC GCG GTC GAC GCC CAC TTC GGG 240 GTG ACC GTG CTG GAG ACC GAC GAG GAG CTG TGG CAG ACG GCC TAC GAG 288 ACC ATC GTG CAC CCG CTG CAT CGG ATC TGC CGT GCG GTG CTC CCG CAG 336 TTC TAC GAG CGG AAC AAG GGC AAG ATC GTT GTC TAC GGA AGT GCC GCA 384 GCG ATG CGG TAC CAG GAA GGT GCG CTG GCC TAC AGC ACG GCG CGT TTC 432 GCT CAG CGC GGG TAC GTC ACC GCC CTC GGT CCC GAG GCA GCG AGG CAC 480 AAC GTC AAC GTG AAC TTC ATC GCC CAG CAC TGG ACC CAA AAC AAG GAG 528 TAC TTC TGG CCC GAG CGC ATC GCC ACC GAC GAG TTC AAG GAG GAT ATG 576 GCG CGC CGA GTT CCC CTG GGT CGG CTC GCG ACT GCC CGA GAG GAC GCG 624 CTG CTC GCG TTG TTC CTG GCC TCG GAC GAG AGT GAC TTC ATC GTC GGC 672 AAG TCG ATC GAG TTC GAC GGC GGC TGG GCC ACC 705

【００２７】配列番号：５配列の長さ：829 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： GAATTCCAGA ACCAATTGAG AGGAAATGAA CA ATG AAG ATC GCC CTC GTG ACT 53 Met Lys Ile Ala Leu Val Thr 1 5 CAT GCA CGG CAT TTT GCA GGC CCC GCC GCC GTC GAG GCG CTT ACG CGG 101 His Ala Arg His Phe Ala Gly Pro Ala Ala Val Glu Ala Leu Thr Arg 10 15 20 GAT GGC TAT ACC GTG GTT TGC CAC GAC GCG ACG TTC GCT GAT GCA GCT 149 Asp Gly Tyr Thr Val Val Cys His Asp Ala Thr Phe Ala Asp Ala Ala 25 30 35 GAA CGA CAG CGT TTC GAG TCG GAG AAC CCG GGC ACC GTC GCG CTC GCC 197 Glu Arg Gln Arg Phe Glu Ser Glu Asn Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala 40 45 50 55 GAG CAG AAG CCC GAG CGT CTG GTC GAC GCC ACG CTG CAG CAC GGG GAA 245 Glu Gln Lys Pro Glu Arg Leu Val Asp Ala Thr Leu Gln His Gly Glu 60 65 70 GCG ATC GAC ACG ATC GTC TCG AAC GAT TAC ATT CCG CGC CCG ATG AAT 293 Ala Ile Asp Thr Ile Val Ser Asn Asp Tyr Ile Pro Arg Pro Met Asn 75 80 85 CGG CTC CCG ATC GAG GGA ACG AGC GAG GCC GAC ATC CGA CAG GTG TTC 341 Arg Leu Pro Ile Glu Gly Thr Ser Glu Ala Asp Ile Arg Gln Val Phe 90 95 100 GAG GCG CTC AGC ATC TTC CCG ATC CTG CTC CTG CAG TCG GCC ATC GCG 389 Glu Ala Leu Ser Ile Phe Pro Ile Leu Leu Leu Gln Ser Ala Ile Ala 105 110 115 CCG CTA CGG GCT GCA GGC GGC GCC TCC GTT ATC TTC ATC ACG TCC TCA 437 Pro Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Ile Phe Ile Thr Ser Ser 120 125 130 135 GTT GGC AAG AAG CCG CTC GCC TAC AAC CCT CTC TAT GGG CCC GCG CGC 485 Val Gly Lys Lys Pro Leu Ala Tyr Asn Pro Leu Tyr Gly Pro Ala Arg 140 145 150 GCC GCT ACC GTC GCG CTT GTC GAA TCG GCA GCG AAG ACG CTG TCC CGT 533 Ala Ala Thr Val Ala Leu Val Glu Ser Ala Ala Lys Thr Leu Ser Arg 155 160 165 GAC GGA ATC TTG CTC TAC GCG ATC GGT CCG AAC TTC TTC AAC AAC CCG 581 Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Ile Gly Pro Asn Phe Phe Asn Asn Pro 170 175 180 ACG TAC TTC CCG ACG TCG GAT TGG GAG AAC AAC CCC GAG CTC CGG GAG 629 Thr Tyr Phe Pro Thr Ser Asp Trp Glu Asn Asn Pro Glu Leu Arg Glu 185 190 195 CGT GTC GAG CGG GAC GTG CCG CTC GGT CGC CTC GGC CGT CCG GAC GAG 677 Arg Val Glu Arg Asp Val Pro Leu Gly Arg Leu Gly Arg Pro Asp Glu 200 205 210 215 ATG GGT GCG CTG ATC ACC TTC CTC GCT TCG CGT CGT GCA GCG CCC ATC 725 Met Gly Ala Leu Ile Thr Phe Leu Ala Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ile 220 225 230 GTG GGG CAG TTC TTC GCT TTC ACC GGT GGC TAT CTG CCC TAACCCGCGC 774 Val Gly Gln Phe Phe Ala Phe Thr Gly Gly Tyr Leu Pro 235 240 CGGTACGGCA ACAGGAAGGA CTGTCTGACA CGGTTCGTCC TCCCAACGCG CCGGC 829

【００２８】配列番号：６配列の長さ：843 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： GTCGACTAGA GAAGGTATTC CGACTGCTGC GGTGCCTGGC ACCGCAGCAA AAGATTCAAG 60 GATTCTCGAA GAAAGGAAAA GGGAA ATG GCT AAC GGA AGG AAA AGG GAA ATG 112 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met 1 5 GCT AAC GGA AGA CTG GCA GGC AAG CGG GTC CTA CTC ACG AAC GCC GAT 160 Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp 10 15 20 25 GCC TAC ATG GGT GAG GCC ACG GTC CAG GTG TTC GAG GAG GAG GGC GCA 208 Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala 30 35 40 GAG GTC ATC GCT GAC CAC ACC GAC TTG ACG AAG GTC GGC GCG GCG GAG 256 Glu Val Ile Ala Asp His Thr Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu 45 50 55 GAG GTC GTC GAG AGG GCT GGG CAC ATC GAT GTC CTG GTG GCC AAC TTC 304 Glu Val Val Glu Arg Ala Gly His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe 60 65 70 GCG GTC GAC GCC CAC TTC GGG GTG ACC GTG CTG GAG ACC GAC GAG GAG 352 Ala Val Asp Ala His Phe Gly Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu 75 80 85 CTG TGG CAG ACG GCC TAC GAG ACC ATC GTG CAC CCG CTG CAT CGG ATC 400 Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile 90 95 100 105 TGC CGT GCG GTG CTC CCG CAG TTC TAC GAG CGG AAC AAG GGC AAG ATC 448 Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile 110 115 120 GTT GTC TAC GGA AGT GCC GCA GCG ATG CGG TAC CAG GAA GGT GCG CTG 496 Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu 125 130 135 GCC TAC AGC ACG GCG CGT TTC GCT CAG CGC GGG TAC GTC ACC GCC CTC 544 Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu 140 145 150 GGT CCC GAG GCA GCG AGG CAC AAC GTC AAC GTG AAC TTC ATC GCC CAG 592 Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln 155 160 165 CAC TGG ACC CAA AAC AAG GAG TAC TTC TGG CCC GAG CGC ATC GCC ACC 640 His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr 170 175 180 185 GAC GAG TTC AAG GAG GAT ATG GCG CGC CGA GTT CCC CTG GGT CGG CTC 688 Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu 190 195 200 GCG ACT GCC CGA GAG GAC GCG CTG CTC GCG TTG TTC CTG GCC TCG GAC 736 Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp 205 210 215 GAG AGT GAC TTC ATC GTC GGC AAG TCG ATC GAG TTC GAC GGC GGC TGG 784 Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp 220 225 230 GCC ACC TGAGAGACGT CACAGCCCCC TCGGGCAGGC GCTCGTCGTC GTTGTAGCTG CAG 843 Ala Thr 235

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者水無渉神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号日東化学工業株式会社中央研究所内 (72)発明者湯不二夫神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号日東化学工業株式会社中央研究所内審査官新見浩一 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/00 C12N 9/00 C12N 15/09 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物由来のハロヒドリンエポキシダー
ゼ酵素遺伝子ＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組
換え体プラスミドにより形質転換された形質転換微生物
の培養液、菌体または菌体処理物を、シアン化アルカリ
の存在下で、下記一般式〔Ｉ〕で示される１，２−エポ
キシ化合物に作用させ、これを下記一般式〔II〕で示さ
れる３−ヒドロキシニトリル化合物に変換せしめること
を特徴とする３−ヒドロキシニトリル化合物の製造法。【化１】〔R は炭素数１〜４のアルキル基を表す〕
【請求項２】ハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺伝子
ＤＮＡが、配列番号：１で示されるアミノ酸配列または
その一部の配列を有しハロヒドリンエポキシダーゼ活性
を有するポリペプチドをコ−ドするＤＮＡ配列からなる
請求項１記載の３−ヒドロキシニトリル化合物の製造
法。
【請求項３】ハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺伝子
ＤＮＡが、配列番号：２で示されるアミノ酸配列または
その一部の配列を有しハロヒドリンエポキシダーゼ活性
を有するポリペプチドをコ−ドするＤＮＡ配列からなる
請求項１記載の３−ヒドロキシニトリル化合物の製造
法。
【請求項４】ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号：
３で示されるＤＮＡ配列またはその一部の配列からなる
請求項２記載の３−ヒドロキシニトリル化合物の製造
法。
【請求項５】ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号：
４で示されるＤＮＡ配列またはその一部の配列からなる
請求項３記載の３−ヒドロキシニトリル化合物の製造
法。