JPH03251184A - ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はシュードモナス　クロロラフイス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）　Ｂ２３株
由来であり、ニトリル類を対応するアミド類に変換する
能力を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子ＤＮＡ、このＤＮＡを含む組
換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡにより形質転換された
形質転換体及びこの形質転換体によるニトリルヒドラー
ゼの製法並びにこの形質転換体を用いたアミド類の製法
に関する。 〔従来の技術１ ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成させる酵
素はニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼとして知
られており、該酵素を産生ずる微生物として、例えばバ
チルス属、バクテリジューム属、マイクロコカス属及び
ブレビバクテリウム属（特公昭６２−２１５１９号公報
参照）、コリネバクテリウム属及びノカルジア属（特公
昭５６−１７９１８号公報参照）、シュードモナス属（
特公昭５９−３７９５１号公報参照）及びロドコッカス
属、アルスロバクタ−属及びミクロバクテリウム属等の
微生物を挙げることができる（特開昭６１−１６２１９
３号公報参照）。 〔発明が解決しようとする課題〕 遺伝子組換えの方法でクローン化されたニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子によるニトリル類の水和では、菌体内に同
遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生物
の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させるこ
とが期待できる。 この遺伝子組換え方法に関し、ロドコッカスｓｐ、　Ｎ
−７７４株（微工研条寄第１９３６号）由来でありニト
リル類を対応するアミド類に変換する能力、すなわちニ
トリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子ＤＮＡに係る発明が先に本発明者の一人らに
よって提案されている（特願昭６３−２０２７７９号）
。 本発明は、ニトリル類の水和に対して極めて高いニトリ
ルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス　クロロラ
フイス　Ｂ２３株からニトリルヒドラターゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡを取り出し、これを
ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡとし、さらに微生
物に形質転換しニトリルヒドラターゼ活性を有する形質
転換体を得て、本発明を完成するに至った。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、 （１）次のサブユニッサブユニットβのアミノ酸配列を
有するニトリルヒドラーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子ＤＮＡ、並プ庄玉ユ上工 並１１ニヒムｌ［ ＧＡＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＧＴＴＴＣＡＡＧ
ＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣ
ＡＣＧＣＧＴＴＧＧＣ （２）サブユニットαをコードするＤＮＡ配列及びサブ
ユニットβをコードするＤＮＡ配列がそれぞれ次に示さ
れるものである上記（１）の遺伝子ＤＮＡ。 土プ王三ヱ上生 皇１１ジヒムＵ ＡＴＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＧ
ＣＧＡＣＡＣＣＴＴ（：ＧＡＣＡＣＣＵ［；６ｔ；ＧＡ
ＡＣＧＣＣＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣ
ＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＧＡＡ（３）上記（１
）又は（２）の遺伝子ＤＮＡをベクターに組み込んだ組
換え体ＤＮＡ、（４）上記（３）の岨換え体ＤＮＡで形
質転換された形質転換体。 （４）上記（３）記載の組換え体ＤＮＡで形質転換され
た形質転換体。 （５）上記（４）記載の形質転換体を培地に培養し、培
養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴と
するニトリルヒドラターゼの製造法。 （６）上記（４）記載の形質転換体を培地に培養し、得
られるニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル類を
対応するアミド類に転換するアミド類の製造法。 （７）上記（４）記載の形質転換体を培養し、得られる
形質転換体の培養液、分離菌体、菌体処理物又はこれら
の固定化物をニトリル類に作用させ対応するアミド類を
製造することを特徴とするアミド類の製造法 に関する。 以下に本発明の詳細な説明する。 本発明は、下記（１）〜（９）の工程により実施される
ものである。 （１）ニトリルヒドラターゼの抽出精製とアミノ酸配列
の部分的決定： 培養集菌したシュードモナス　クロロラフイス８２３株
（微工研条寄第１８７号）からその中に含有されるニト
リルヒドラターゼを抽出精製し、これを高速液体クロマ
トグラフィーを用いて２つのサブユニット（α、β）に
分離する。そして、これらのサブユニットのアミノ酸配
列の一部を決定する（第１図）。 （２）ニトリルヒドラターゼのＤＮＡプローブの作成二
本発明においては、前記特願昭６３−２０２７７９号明
細書記載のロドコッカスｓｐ、　Ｎ−７７４株のニトリ
ルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列が上記
各βサブユニットと高い相同性を示したことより、同明
細書記載の形質転換体ＪＭ１０５／ｐＹＵＫ１２１（微
工研条寄第１９３７号）を用いて、ＤＮＡプローブの作
製を行った。すなわち、培養集菌したｐＹＵＫ１２１を
含有する形質転換体からｐＹｔｌＫ１２１を抽出し、そ
の中に含まれるロドコッカスｓｐ、Ｎ−７７４株由来の
ニトリルヒドラターゼ遺伝子（第２図）を含むＤＮＡ断
片を制限酵素ｓｐｈ　Ｉ及び５ａｌＩで切断後、抽出精
製し、これを放射性同位元素でラベルし、プローブを作
製する。 （３）ニトリルヒドラターゼ染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ
断片の調製： シュードモナス　クロロラフイス　８２３株から染色体
ＤＮＡを分離し、これを制限酵素で切断後、サザンハイ
プリダイゼーション法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ。 Ｍ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　■、　５０３　
（１９７５）、以下同様］により目的遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片を上記（２）のプローブを用いて検出する。 この工程で、１０−ブとハイブリダイズする鎖長の異な
る２種類のＤＮＡ断片が選別される。 （４）染色体ＤＮＡ断片のへフタ−への挿入：工程（３
）で調製した染色体ＤＮＡ断片をベクターに挿入し、組
換え体ＤＮＡのライブラリーを作製する。 （５）形質転換体の作製及び組換え体ＤＮＡの選別：工
程（４）で調製したｍ換え体ＤＮＡライブラリーによる
形質転換体を作製し、その中から工程（２）で作製した
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼイション法（
Ｒ，Ｂｒｕｃｅ　Ｗａｌｌａｃｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　
　Ｎｕｃ。 Ａｃｉ、　Ｒｅｓ、　９　、８７９（１９８１）　、以
下同様〕により目的の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体
を選別する。 更にサザンハイプリダイゼーションにより、目的組換え
体ＤＮＡの再確認を行う。 選別された目的のプラスミドを各々ｐＰｃＮ１及びｐＰ
ＣＮ３と称する。 （６）組換え体ＤＮＡの精製と制限酵素地図の作成：工
程（５）で得られたｐＰｃＮｌ及びｐＰＣＮ３を精製し
た後、これらを用いて制限酵素地図（第３図）を作製し
、目的遺伝子の含まれている箇所を決める。 （７）塩基配列の決定： 工程（５）で得られたｐＰｃＮｌ及びｐＰＣＮ３の親株
由来の染色体ＤＮＡ断片から不要部分を制限酵素を用い
て除去し、得られたＤＮＡ断片の全塩基配列（第４図）
を決定し、工程（１）で決定したアミノ酸配列から予想
される塩基配列を含むことを再確認する。 （８）発現プラスミドの調製と形質転換体の作製：工程
（６）で精製、作製した目的遺伝子を含む組換え体プラ
スミドｐＰｃＮ１及びｐＰＣＮ３とから、制限酵素によ
り親株由来のＤＮＡを切断し、これらを連結した後、更
にｐＵｃ１９に連結して発現プラスミドを作製する。こ
のプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株（Ａｓ＋ｅ
ｒｓｈａｍ社製）に形質転換させる。 （９）形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼの生産
とニトリル類のアミド類への変換： 工程（８）で作製した形質転換体を培養し、得られたニ
トリルヒドラターゼ酵素を含む菌体をニトリル類を含む
基質溶液と混合し、アミド類を生成させる。 なお、シュードモナス　クロロラフイス　８２３株は微
工研に微工研条寄第１８７　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８７
）として、及び工程（８）で作製したｐＰＣＮ４を含有
する形質転換体ＪＭＩ０５／ｐＰＣＮ４は微工研に微工
研条寄第２７７９号（ＦＥＲ？Ｉ　ＢＰ−２７７９）と
して寄託されている。 上記工程で用いるベクターとしてはプラスミドベクター
（例えばｐＡＴ１５３．　ｐＭＰ９．　ｐＨＣ６２４，
ｐＫＣ７等）、ファージベクター（例えばλｇｔｌｌ　
（東洋紡績社製）、　Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ　（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）等）のいずれもが用いられる。また、上
記工程で用いられる制限酵素としては５ｐｈｌ、　Ｓａ
ｌ　Ｉ、５ａｃｌ、　ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ等が用いられ、これらはいずれも市販品（宝酒造社製
）が用いられる。また、形質転換に用いる宿主生物とし
てはＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株あるいはＥ、ｃｏｌｉ
　ＴＧＩ株等が挙げられるが、特にこれらに限定される
ものではなく、他の宿主生物を用いることができる。形
質転換体の培養に用いる培地は通常の培地が用いられる
。 ニトリル類のアミドへの変換には、上記形質転換体の培
養により得られるニトリルヒドラターゼの他に形質転換
体の培養液、分離菌体、菌体処理物、粗酵素液が用いら
れる。 また、本発明で対象とするニトリルとしては、例えば、
炭素数２〜４のニトリルが挙げられる。 具体的には、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチ
ロニトリル、イソブチロニトリルであり、アクリロニト
リルが代表的である。 以下に、実施例により本発明の詳細な説明する。 但し、本発明はこれらの実施例により限定されるもので
ない。 なお、実施例において下記の略語を用いた。 ＴＥ　　：　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１０ｏ＋Ｍ、ｐＨ７
，８）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ、ｐＨ８，０）ＴＮＥ：　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（５０ｍＭ、ｐＨ８，０）、ＥＤＴＡ（
１ｓＭ、ｐＨ８，０）ＮａＣ１（５０ｍＭ） ＳＴＥ：　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（５０ｍＭ、ｐＨ８，０）
、ＥＤＴＡ（５＋ｗＭ、ｐＨ８，０）Ｓｕｃｒｏｓｅ（
３５ｍＭ） ２ｘＹＴ培地：１．６χトリプトン、１．０χ酵母エキ
ス０．５χＮａＣ１ 実施例 （１）ニトリルヒドラターゼの抽出精製とアミノ酸配列
の部分的決定： シュードモナス　クロロラフイス　８２３株を培地（シ
ュークロース　１０ｇ／　１２、メタクリルアミド４ｇ
／　ｌ　、、ＫＨｚＰｏ、　０．５ｇ／　ｌ、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４０，５ｇ／　ｌ、Ｍｇ５Ｏｎ４ＨｚＯ０，５ｇ／　
ｌ　、　Ｆｅ５Ｏｎ　Ｈ７８ｚＯ０，０１ｇ／　Ｉｌ、
ｐＨ７，０）で２５°Ｃ１２８時間培養した後、集菌し
、この細胞１００ｇを破砕し、硫安分画し、透析後遠心
して上清みをとり、ＤＥＡＥ・セファセル・クロマトグ
ラフィー、オクチル・セファロースＣＬ−４Ｂ・クロマ
トグラフィー、フェニル・セファロースＣＬ−４Ｂ・ク
ロマトグラフィー、セファデックスＧ−１５０・クロマ
トグラフィーにかけ、活性画分を得て、これを透析して
酵素液を得た。そして、この酵素液をそれぞれ高速液体
クロマトグラフィーで逆相カラム（Ｓｅｎｓｈｕ　Ｐａ
ｋ　ＶＰ−３０４−１２５１）　（■センシュウ科学製
］を用いて二つのサブユニット　（αβ）に分離した。 これらのサブユニ・７トのＮ末端からのアミノ酸配列（
α１．β、）をアミノ酸シーケンサ−〔アプライドバイ
オシステム社製４７０Ａ　）を用いて決定した。 このアミノ酸配列の結果は第１図に示す通りである。 （２）ニトリルヒドラターゼのＤＮＡプローブの作製：
ｐＹＵＫ１２１を含有するε、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株
（微工研条寄第１９３７号）を２ｘＹＴ　（５０ＩＩ　
ｇ／　Ｍｌアンピシリン含有）培地１００１ｄで３０゛
Ｃで一夜（１２時間）培養後、集菌し、ＴＨＥを加え再
度集菌し、ＳＴＥを８Ｍ１、リゾチームを１０■加え、
０°Ｃでで５分間反応させ、０．２５ＭＥＤＴＡ　４　
ｍ加えて、更に室温で１０％ＳＤＳ　２ｔｄ、５ＨＮａ
ＣＩ　５ｊＥｌ！を加え、０〜４℃で３時間放置し′た
。それを超遠心し、その上澄みに３０％のＰＥＧ６００
０を１／２当量加え、０〜４°Ｃで一夜（１２時間）放
置し、再度遠心した後ＴＮＨに溶解して７．５　ｄとし
、ＣｓＣ１を加えて遠心して除蛋白後、臭化エチジウム
溶液を３００〜５００ｍｇ／ｄ加えシールチューブに移
し、熱シールし超遠心した。そして、ペリスタポンプで
ｃｃｃ　ＤＮＡを取り出し水飽和イソプロピルアルコー
ルを等量以上加えて臭化エチジウムを除き、ＴＥで透析
し、精製したプラスミドｐＹＵＫ１２１約３ｍを得た。 このｐＹＵＫ１２１を制限酵素５ｐｈＩ　と５ａｉｌで
切断し作製したロドコッカスｓｐ、Ｎ−７７４株由来の
ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む２．０７ＫｂのＤＮ
Ａ断片を抽出精製した。そして、このＤＮＡ断片を３２
ｐで放射能ラベルし、プローブを作製した。なお、この
プローブの塩基配列は第２図に示した通りである。 （３）ニトリルヒドラターゼ染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ
断片の調製： シュードモナス　クロロラフイス−８２３株を前記（１
）における培地１００ｔｌ！に植菌して培養後集菌し、
この菌体をＴＮＥで洗浄後ＴＥ　１０ｄに懸濁し、０．
２５Ｍ　ＥＤＴＡ　４　ｄ、リゾチーム１０〜２０■、
アクロモプロテアーゼ１０〜２０■及び１０％ＳＯ５１
０ｄを加え、３７°Ｃで３時間放置した。次にフェノー
ル（６０°Ｃ）を１５１ｄ加え、６０℃で１５分間放置
し、遠心し、その上層１５ｄを採った。そしてこれに２
．５Ｍ酢酸ナトリウム溶ｌ　０．７ｍ、ジエチルエーテ
ルを加え遠心し、その上層を捨て、下層に２容量のエタ
ノールを加え、棒でＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを
ＴＥ：エタノール（容積比）の２＝８．１：９、及び０
：１０の各溶液に５分間づつひたし、２〜４ｄのＴＥ　
（３７℃）に溶かし、３７℃でＲＮａｓｅ　ＡとＴ、の
混合物を１０μｌ加えた。次にフェノールを等量加え、
遠心後その上層２〜４ｄを採り、エーテルを等量以上加
え、また遠心し上層を捨て、下層をクロロホルムを少量
添加した２ＩｌのＴＥで一晩透析した。 更に２回目の透析を３〜４時間かけて行い、粗染色体Ｄ
ＮＡ標品約４７を得た０次に、粗染色体ＤＮＡ標品１５
μｌにそれぞれ制限酵素５ａｃＩ２μ！及びＢａｍＨＩ
とＳａｌ　Ｉ各２ｕｌ、該酵素用緩液（１０倍濃度）３
μ２及びＴＥ　１０　μｌを加え３７°Ｃで１時間反応
させた後、アガロースゲル電気泳動（６０Ｖ、　３時間
）に供し、工程（２）で合成したＤＮＡプローブを用い
てサザンハイプリダイゼーションを行イた結果、それぞ
れ約４．６Ｋｂ及び４．７Ｋｂの位置に上記プローブが
強くハイブリダイズするＤＮＡ断片があることが見出さ
れた。 そこで、粗染色体ＤＮＡ標品１５μｌを前述と同様の方
法で制限酵素Ｓａｃ　Ｉ及びＢａｍＨＩと５ａｌＩで切
断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、４．６Ｋｂ
と４．７ＫｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出した。 これを、それぞれ３倍容量の８　Ｍ　ＮａＣｌＯ４溶液
を加えて可溶化した後、６ｍｍ径のＧＦ／Ｃ濾紙（Ｗｈ
ａ　ｔｌＩ＋ａｎ製）の上にＤＮＡを吸着させ、次いで
６　Ｍ　ＮａＣｌＯ４含有ＴＥ　１００μｌを１０回、
更に９５％エタノール１００μｌを１０回滴下し、３分
間風乾させた。そして、これを０．５ｄエツペンドルフ
のチューブに移しＴＥ４０μｌを添加し、３７℃、　３
０分間放置した後、遠心してその上澄み約４０μｌを分
取した。この溶液の中に目的のニトリルヒドラターゼ染
色体ＤＮＡを含む４．６ＫｂＤＮＡ断片と４．７ＫｂＤ
ＮＡ断片がそれぞれ回収されたことになる。 （４）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入：（ａ）　
４．６Ｋｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片 プラスミドｐＵｃ１８　１０μ！に対し、制限酵素Ｓａ
ｃ　１２　ｕ　Ｉ！、該酵素用緩衝液（１０倍濃度＞３
ｕｌ及びＴＥ　１０μｌを加え３７°Ｃで１時間反応さ
せ、次に０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　２μｌを添加して反応
を止め、更にＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ　Ｈ９）
を７　ｕ　ｌ、　ＢＡＰ（細菌性アルカリホスファター
ゼ）３μｌ加えて６５°Ｃで１時間反応させた。これに
ＴＥを加えて全体を１００μｌとし、等量のフェノール
で３回抽出し、これにエーテルを等量刑えて、下層を採
り、これに３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１０μｌとエタノー
ル２５０μ！を加え、−８０°Ｃで３０分放置後遠心し
、乾燥してＴＥに溶解した。 この様にＳａｃ　Ｉで切断し、ＲＡＰ処理したｐＵｃ１
８５μｌと工程（３）で回収した３、６ＫｂＤＮＡ断片
溶液４０μｌを混合し、連結緩衝液６μｌ、６ｎ＋ｇ／
ＩＩＩＡＴＰ、溶液６μ！及びＴ４−ＤＮＡリガーゼ３
μｌとを加え、４°Ｃで一夜（１２時間）反応させるこ
とによって目的遺伝子を含有する３、６ＫｂＤＮＡ断片
をｐＵｃｌＢに挿入した組換え体プラスミド約６０ｕ７
！を作製してＤＮＡライブラリーとした。 （ｂ）　４．７Ｋｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片 （ａ）において、制限酵素Ｓａｃ　Ｉの代わりにＢａ■
）■と５ａｌＩを加えた以外は同様の操作を行い４．７
ＫｂＤＮＡ断片をｐＵｃｌＢに挿入した組換え体プラス
ミド約６０μｌを作製してＤＮＡライブラリーとした。 （５）形質転換体の作製及び組換え体ＤＮＡの選別二Ｅ
、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株（Ａｗ＋ｅｒｓｈａｍ社製）
を２ｘＹＴ墳地１０Ｈ１に３７°Ｃで植菌して１２時間
培養後、それを新規な２ｘＹＴ培地に１％植菌し、３７
°Ｃで２時間培養した。 そして遠心集菌後、冷５０ｍＭ　ＣａＣ１ｇ溶液を５ｄ
加え、０゛Ｃで４０分放置後、再度遠心して、冷５０ｍ
Ｍ　ＣａＣ１ｚ溶液０．２５１ｄ及び工程（４）で調製
した組換え体プラスミドそれぞれについて該プラスミド
を含有する溶液６０μ！を加え、０℃で４０分放置後、
４２°Ｃで２分間ヒートショックを与え０°Ｃで５分放
置して、２ｘＹＴ培地１０ｄを加え、３７°Ｃで９０分
間振とう培養した後、遠心集菌した。これに２ｘＹＴ培
地１Ｉ１１添加し菌体を充分懸濁させた後、その懸濁液
をｌ０ｐｌずつアンピシリン５０ａｇ／ｄ含有２にＹＴ
培地寒天２プレートに分注し、３７°Ｃで培養した。そ
して、プレート上に生育した形質転換体コロニーをコロ
ニーハイブリダイゼーション法にてニトリルヒドラター
ゼ遺伝子を持つ形質転換体を選抜した。すなわちプレー
ト中に培養した形質転換体をニトロセルロースフィルタ
ー上に移し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これ
を工程（２）作製のプローブで処理し、オートラジオグ
ラフ法で目的の組換え体ＤＮＡを含むコロニーを選択し
た。更に、この選択したコロニーから組換え体プラスミ
ドを抽出し、サザンハイプリダイゼーションによって上
述のプローブとハイブリダイズさせ、選抜したコロニー
が目的遺伝子を含む形質転換体であることを再ｉＩ認し
た。 （６）組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作成
： 工程（５）で選択した形質転換体を２ｘＹＴ　（５０ｕ
　ｇ／　ｄアンピシリン含有）培地１００１ｄに植菌し
、３７°Ｃで一夜（１２時間）培養後、集菌し、ＴＮＥ
を加え再度集菌し、ＳＴＥを８ｄ、リゾチームを１０ｇ
加え、Ｏ″Ｃで５分間反応させ、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ
　４　ｍ加えて、更に室温で１０％ＳＯ５２１ｄ、５Ｍ
　ＮａＣ１５ｍを加え、０〜４℃で３時間放置した。そ
れを超遠心し、その上澄みに３０％のＰＥＧ６０００を
１／２当量加え、０〜４°Ｃで一夜（１２時間）放置し
、再度遠心した後ＴＮＥに溶解して７．５　ｄとし、Ｃ
ｓＣ１を加えて遠心して除蛋白後、臭化エチジウム溶液
を３００〜５００ｍｇ／　ｄ加えシールチューブに移し
、熱シールし超遠心した。 そして、ペリスタポンプでｃｃｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを取り出
し水飽和イソプロピルアルコールを等量販上加えて臭化
エチジウムを除き、ＴＥで透析し、精製した組換え体プ
ラスミド約３Ｍｌ１を得た。これをｐＰｃＮｌ（４，７
ＫｂＤＮＡ断片の場合はｐＰＣＮ３）と命名した。 これらの岨換え体プラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲ■、
ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、　５ａｃｌ及びＳａｌ　Ｉ等を
用いて切断し、第３図に示される挿入断片の制限酵素地
図を作成した。 （７）塩基配列の決定： ｐＰｃＮｌ及びｐＰＣＮ３の親株由来のＤＮＡ断片のど
の部分に目的遺伝子が位置しているかを工程（６）で作
成した制限酵素地図とサザンハイブリダイゼーションに
よって決め、それを基にｐＰＣＮ３の挿入断片の目的遺
伝子を含む部分（制限酵素Ｂａｗｌ　ＩからＨｉｎｃＩ
ＩまでのＤＮＡ断片２．４５６Ｋｂ）の全塩基配列をＭ
１３ファージベクターを用いたサンガー法（Ｓａｎｇｅ
ｒ、Ｆ、５ｃｉｅｎｃｅ２１４１２０５−１２１０　（
１９８１））　により決定した。その結果、この親株由
来の２．４５６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列は第４図に
示す通りであった。 なお、この塩基配列の中には、工程（１）で決定したア
ミノ酸配列から予想される塩基配列の全てが含まれるこ
とが確認され、このＤＮＡ断片にα。 βサブユニツト遺伝子の両方が存在することが明らかと
なった。 （８）発現プラスミドの調製と形質転換体の作製：工程
（６）で作製したプラスミドからｐＰｃＮ１由来の２．
２ＫｂのＳｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片とｐＰＣＮ３の
由来の４．７ＷｂのＢａｔａｌｌ　１−３ａｌ　１断片
を切断し、連結した（第３図）そして、そのＤＮＡ断片
を制限酵素ｓｐｈ　Ｉと５ａｌｌで切断したプラスミド
ｐＵｃ１９と連結してｐＰＣＮ４と称する発現プラスミ
ド約３Ｉ１１を作成した。 このプラスミドｐＰＣＮ４を用いて工程（５）と同様な
方法でＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株を宿主とする形質転
換体ＪＭ１０５／ｐＰＣＮ４　（微工研条寄第２７７９
号〕を作製した。 （９）形質転換体を用いたニトリルヒドラーゼ生産とニ
トリル類のアミド類への変換ニ プラスミドｐＰＣＮ４を含有するＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１
０５株（形質転換体ＪＭ１０５／ｐＰＣＮ４　）を２ｘ
ＹＴ（５０ｕ　ｇ／ｍｌアンピシリン含有）培地１０ｄ
に接種し２６．５°Ｃで一夜（１２時間）培養し、この
培養物を２ｘＹＴ　（５０μｇ／メアンピシリンー５０
ｍｇ／　１２　ＦｅＦｅ５０４４ＨｚＯ１１０／　ｌ　
Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２０、ｌｌ１ｇ／　ｌピロロキノリン
キノン含有）培地１０Ｗ１に１％宛接種し、２６．５°
Ｃで５時間培養し、これに終濃度が１＋Ｍとなるように
ＩＰＴＧを添加し、更に２６．５°Ｃで１０時間培養し
た。集菌後、この菌体を１／２０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，７）　５　ｄに懸濁し、その菌体懸濁液０．ｌｌ１
１に基質溶液（アクリロニトリルＩＭ）１０μ！と混合
し、２０°Ｃで２０分間反応させた。 なお、対照試験として、上記Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５
株（形質転換体ＪＭ１０５／ｐＰＣＮ４）に代えて、Ｅ
、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株のみを用いて同様に行った。 反応終了後、反応液中の生成アクリルアミドと未反応ア
クリロニトリルを高速液体クロマトグラフィーを用いて
検出した。その結果、宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株
の菌体懸濁液ではアクリルアミドが検出できなかったが
、Ｅ。 ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株（形質転換体ＪＭ１０５／ｐＰ
ＣＮ４）ではアクリルアミドが検出され原料アクリロニ
トリルは検出されなかった。 〔発明の効果〕 本発明により、シュードモナスクロロラフイス８２３株
の持つサブユニッサブユニットβのアミノ酸配列を有し
、ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列が明らかにされた。そして、このＤ
ＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体が作
出された０以上により、このニトリルヒドラターゼ遺伝
子を菌体内に多コピー存在させ、菌体内酵素量を従来に
比して飛躍的に増大させることができる。 る。 ３、

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス　クロロラフイス　Ｂ２３株の
ニトリルヒドラターゼの各サブユニットのＮ−末端アミ
ノ酸配列、第２図はＤＮＡプローブに用いたロドコッカ
スｓｐ、　Ｎ−７７４株のニトリルヒドラターゼ遺伝子
のＤＮＡ配列、第３図は組換え体プラスミドｐＰｃＮ１
、ｐＰＣＮ３及び　ｐＰＣＮ４の制限酵素地図及び第４
図はｐＰＣＮ３に含まれるシュードモナス　クロロラフ
イス　８２３株由来のＤＮＡ［１片の塩基配列ならびに
それから予想されるアミノ酸配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のサブユニットα及びサブユニットβのアミノ酸
   配列を有し、ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子ＤＮＡ。 ￥サブユニットα￥ 【遺伝子配列があります】 ￥サブユニットβ￥ 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ２、サブユニットαをコードするＤＮＡ配列及びサブユ
   ニットβをコードするＤＮＡ配列がそれぞれ次に示され
   るものである請求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。 ￥サブユニットα￥ 【遺伝子配列があります】 ￥サブユニット￥ 【遺伝子配列があります】 ３、請求項１又は２記載の遺伝子ＤＮＡをベクターに組
   み込んだ組換え体ＤＮＡ。 ４、請求項３記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された形
   質転換体。 ５、請求項４記載の形質転換体を培地に培養し、培養物
   からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする
   ニトリルヒドラターゼの製造法。 ６、請求項４記載の形質転換体を培地に培養し、得られ
   るニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル類を対応
   するアミド類に転換するアミド類の製造法。 ７、請求項４記載の形質転換体を培養し、得られる形質
   転換体の培養液、分離菌体、菌体処理物又はこれらの固
   定化物をニトリル類に作用させ対応するアミド類を製造
   することを特徴とするアミド類の製造法。