JP3024864B2 - Ellagic acid glycoside and method for producing the same - Google Patents
Ellagic acid glycoside and method for producing the sameInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、新規なエラグ酸配糖
体、特にエラグ酸の優れた生理活性を有し、しかも水に
対する溶解度が非常に高い新規なエラグ酸配糖体に関す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel ellagic acid glycoside, particularly to a novel ellagic acid glycoside having excellent physiological activity of ellagic acid and having extremely high solubility in water.
【０００２】[0002]
【従来の技術】エラグ酸は、食用油脂類に対する抗酸
化作用、微生物に対する抗突然変異作用及びマウ
ス、ラット等の小動物に対する抗腫瘍作用等、優れた生
理活性を有し、食品及び医薬産業上有用な化合物であ
る。2. Description of the Related Art Ellagic acid has excellent physiological activities, such as an antioxidant effect on edible oils and fats, an antimutagenic effect on microorganisms, and an antitumor effect on small animals such as mice and rats, and is useful in the food and pharmaceutical industries. Compound.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】このようにエラグ酸
は、上記食品や医薬産業において、その利用が期待され
ているにも拘らず、水に対する溶解度が非常に低いため
利用しにくいという問題点を有している。As described above, although ellagic acid is expected to be used in the above-mentioned food and pharmaceutical industries, its solubility in water is extremely low, so that it is difficult to use ellagic acid. Have.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】そこで本発明者等はこの
ような問題点を解決するため、種々検討を重ねた結果、
エラグ酸に糖供与体の存在下、サイクロデキストリン合
成酵素を作用させるときは、エラグ酸の優れた生理活性
を殆ど損うことなく、水に対する溶解度が非常に高いエ
ラグ酸配糖体が得られることを知り、この知見に基いて
本発明を完成した。The inventors of the present invention have conducted various studies to solve such problems, and as a result,
When cyclodextrin synthase is allowed to act on ellagic acid in the presence of a sugar donor, an ellagic acid glycoside having extremely high solubility in water can be obtained without substantially impairing the excellent physiological activity of ellagic acid. And completed the present invention based on this finding.
【０００５】即ち本発明は、式That is, the present invention provides
【化２】 （式中ｎは、１〜６の整数を表す）で表わされるエラグ
酸配糖体であり、また本発明はエラグ酸に糖供与体の存
在下、サイクロデキストリン合成酵素を作用させること
を特徴とするエラグ酸配糖体の製造法である。Embedded image (Where n represents an integer of 1 to 6), and the present invention is characterized in that cyclodextrin synthase is allowed to act on ellagic acid in the presence of a sugar donor. This is a method for producing ellagic acid glycosides.
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
用いられるエラグ酸としては、エラグ酸またはその含有
物が挙げられる。これらは、公知の方法例えば、ガロタ
ンニンより製造する方法（特開平２−２５５６８６参
照）、没食子酸、メチルガレートまたはエチルガレート
を酸化重合して製造する方法（リービッヒス・アンナー
レン・ケミーエ ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ． Ｃｈｅｍ．
９２９頁（１９８４）参照）、エラジタンニンを酸に
より加水分解して製造する方法（ジャード・ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８巻、３４４５頁、（１９５
６）参照）等により得ることができる。Hereinafter, the present invention will be described in detail. Examples of the ellagic acid used in the present invention include ellagic acid and its contents. These are known methods, for example, a method of producing from gallotannin (see JP-A-2-255686) and a method of producing by oxidative polymerization of gallic acid, methyl gallate or ethyl gallate (Liebigs Annanaren Chemie Liebigs Ann. Chem.
929 (1984)), a method of producing ellagitannin by hydrolysis with an acid (Jard Journal of American Chemical Society, J.A.).
m. Chem. Soc. 78, 3445, (195
6)).
【０００７】このエラグ酸は、水に対する溶解度が非常
に低い（０．１〜１．０ｍｇ／ｌ）ので、アルギニン、
トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等の存在下で水に溶解（１〜６ｍｇ／ｍｌ）し、できる
だけエラグ酸の濃度を高くして使用することが効率良く
エラグ酸配糖体を取得する上で好ましい。This ellagic acid has a very low solubility in water (0.1 to 1.0 mg / l), so that arginine,
Dissolving in water (1 to 6 mg / ml) in the presence of triethylamine, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc., and using as high a concentration of ellagic acid as possible to obtain ellagic acid glycosides efficiently Is preferred.
【０００８】糖供与体としては、グルコシル残基の少な
くとも１分子がエラグ酸分子に転移され得るもの、例え
ばサイクロデキストリン、澱粉、澱粉液化物、澱粉糖化
物、アミロース、アミロペクチン等が挙げられる。これ
らは、必要により併用してもよい。Examples of the sugar donor include those capable of transferring at least one molecule of a glucosyl residue to an ellagic acid molecule, such as cyclodextrin, starch, liquefied starch, saccharified starch, amylose, and amylopectin. These may be used together if necessary.
【０００９】次に、本発明で用いられるサイクロデキス
トリン合成酵素は、エラグ酸に糖供与体の存在下で反応
させた場合エラグ酸配糖体を生成する、またはこの逆反
応を触媒する酵素で、公知の酵素である。Next, the cyclodextrin synthase used in the present invention is an enzyme which produces ellagic acid glycoside when ellagic acid is reacted in the presence of a sugar donor, or catalyzes the reverse reaction thereof. It is a known enzyme.
【００１０】サイクロデキストリン合成酵素の起源とし
ては、例えばバチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍａｃｅｒａｎｃｅ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・
ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミキ
サ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス
・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｒａ
ｎｃｅ）、好アルカリ性バチルス属に属する微生物（Ａ
ｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．）、クレブシーラ・ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａ ｐｎｅｕｎｏｎｉａｅ）等のものが知られて
いる〔澱粉科学 ３３巻 ２号（１９８６年）１４２
頁、ほか参照〕。これらの微生物を栄養培地に接種培養
して、該酵素を生産蓄積せしめ、次いで常法により該酵
素を分離することにより得られるもので、粗酵素、この
精製酵素、市販酵素（例えば天野製薬社製、コンチザイ
ム（商品名））等、いずれを用いてもよい。As a source of cyclodextrin synthase, for example, Bacillus macerans (Bacillus)
macerance), Bacillus megaterium (B
acillus megaterium), Bacillus
Stearothermophilus (Bacillus stea)
rothermophilus), Bacillus polymyxa, Bacillus circula
nce), a microorganism belonging to the alkalophilic bacillus genus (A
Ikalophilic Bacillus s
p. ), Klebsi
(Starch Science, Vol. 33, No. 2, (1986) 142).
Page, etc.]. These microorganisms are obtained by inoculating and culturing these microorganisms in a nutrient medium to produce and accumulate the enzyme, and then separating the enzyme by a conventional method. , Contizyme (trade name)) and the like.
【００１１】本発明を実施するには、先ずエラグ酸と糖
供与体とを水に溶解して、混合液を調製する。水に対す
る上記２つの成分の添加量は、全体として重量％濃度で
０．１〜１０％、好ましくは０．３〜５．０％である。In order to carry out the present invention, first, ellagic acid and a sugar donor are dissolved in water to prepare a mixed solution. The addition amount of the above two components to water is 0.1 to 10%, preferably 0.3 to 5.0% by weight as a whole.
【００１２】そして、上記混合液に対するサイクロデキ
ストリン合成酵素の添加量は、エラグ酸と糖供与体の合
計重量１グラム当たり１単位以上、望ましくは５０〜１
００単位である。なお、１単位とはティルデン−ハドソ
ン（Ｔｉｌｄｅｎ−Ｈａｄｓｏｎ）らの方法に従って求
めたものである。The amount of cyclodextrin synthase to be added to the mixture is 1 unit or more, preferably 50 to 1 unit, per gram of the total weight of ellagic acid and sugar donor.
00 units. One unit is determined according to the method of Tilden-Hadson et al.
【００１３】また、酵素反応のｐＨは６．５〜９．０、
好ましくは７．５〜８．５であり、また温度は３０〜７
０℃、好ましくは４０〜６０℃であり、また時間は１〜
２４時間、好ましくは８〜１５時間である。Further, the pH of the enzyme reaction is 6.5 to 9.0,
Preferably it is 7.5-8.5 and the temperature is 30-7.
0 ° C., preferably 40 to 60 ° C., and the time is 1 to
24 hours, preferably 8 to 15 hours.
【００１４】このようにして、グルコース重合度が１〜
６のエラグ酸配糖体の集合体を得ることができる。な
お、この反応終了液にグルコアミラーゼを添加し、この
温度でさらに１〜２４時間、好ましくは８〜１５時間反
応させると、グルコース重合度が１であるエラグ酸配糖
体が得られるので、これを得たい場合には、後述の操作
に入る前に予めこの操作をすることが好ましい。Thus, the degree of polymerization of glucose is 1 to
An aggregate of ellagic acid glycoside of No. 6 can be obtained. When glucoamylase is added to the reaction-terminated liquid and the mixture is further reacted at this temperature for 1 to 24 hours, preferably 8 to 15 hours, an ellagic acid glycoside having a glucose polymerization degree of 1 is obtained. If it is desired to obtain, it is preferable to perform this operation before starting the operation described later.
【００１５】このようにして得られた反応終了液から目
的とするエラグ酸配糖体の分離は、以下に述べる通常の
エラグ酸化合物の単離方法を採用すればよい。即ち、セ
ファデックスＬＨ−２０等のデキストラン誘導体を担体
とするクロマトグラフィー法［Ｒ．Ｓ．Ｔｏｍｐｓｏｎ
等著、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ，Ｎ
ｏ．１１，１３８７（１９７２）参照］、シリカゲルを
用いる液体クロマトグラフィー法［Ｃ．Ｗｉｌｌｉａｍ
Ｇｌｅｎｎｉｅ 等著、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ
Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２９．９６５〜９６８（１９８
１）参照］、ポリスチレン系樹脂、例えばダイヤイオン
ＨＰ２０、ＨＰ２１、ＳＰ２０６、ＳＰ２０７、ＣＨＰ
３Ｃ、ＣＨＰ５Ｃ、ＣＨＰ２０Ｐ（以上何れも三菱化成
工業社製）、アンバーライトＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、
ＸＡＤ−４（以上何れもオルガノ社製）を用いたクロマ
トグラフィー法（特開昭６３−１６２６８５参照）、あ
るいは限外濾過膜や逆浸透膜を用いて分画する方法（特
開昭６３−２６７７７４参照）等の単離方法を採用する
ことが好ましい。これらは単独、または併用してもよ
い。For separation of the target ellagic acid glycoside from the reaction-terminated liquid obtained in this manner, a usual method for isolating an ellagic acid compound described below may be employed. That is, a chromatography method using a dextran derivative such as Sephadex LH-20 as a carrier [R. S. Tompson
J. et al. Chem. Soc. Perkin I, N
o. 11, 1387 (1972)], a liquid chromatography method using silica gel [C. William
Glennie et al. Agric. Food
Chem. , Vol. 29.965-968 (198
1)], a polystyrene resin, for example, Diaion HP20, HP21, SP206, SP207, CHP
3C, CHP5C, CHP20P (all manufactured by Mitsubishi Kasei Industries), Amberlite XAD-1, XAD-2,
Chromatography using XAD-4 (all of these are manufactured by Organo) (see JP-A-63-162885), or fractionation using an ultrafiltration membrane or a reverse osmosis membrane (JP-A-63-267774). It is preferable to employ an isolation method such as that described above. These may be used alone or in combination.
【００１６】上記単離方法をより具体的に示すと以下の
通りである。例えば、反応終了液をロータリーエバポレ
ーターにより濃縮し、濾過樹脂（例えばファルマシア社
製、セファデックスＬＨ−２０）を充填したカラムに通
液し、ついで０．０５Ｎ水酸化カリウム水を通液して未
反応の糖供与体、サイクロデキストリン合成酵素（蛋白
質）等を溶出し、次いで未反応のエラグ酸を溶出し、最
後に目的とするエラグ酸配糖体を溶出する。このように
して得られたエラグ酸配糖体を含む溶出液に、塩酸また
は硫酸等の酸を加えて、ｐＨを３．０以下に調整し、エ
ラグ酸配糖体を析出沈殿させ、以下常法により遠心分離
などの手段により分離し、少量の水で洗浄して、真空乾
燥等によりグルコース重合度の異なるエラグ酸配糖体の
集合体を得ることができる。そして上記エラグ酸配糖体
の溶出液に、未反応のエラグ酸が夾雑物として含まれる
場合や、上記エラグ酸配糖体の集合体からそれぞれグル
コース重合度の異なる配糖体を分離したい場合は、これ
に酸を加えて、エラグ酸配糖体を析出沈殿させ、この沈
殿物をメタノール、エタノール等の溶媒に溶解した後、
逆相系の分配吸着クロマトグラム（例えば、ＴＯＳＯＨ
社製、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ）にかけ、メ
タノールの濃度勾配によって目的とするエラグ酸配糖体
画分を分離、溶出し、エバポレータ等により濃縮し、蒸
発乾固して目的とするエラグ酸配糖体を得る。The following is a more specific description of the above isolation method. For example, the reaction-completed solution is concentrated by a rotary evaporator, passed through a column filled with a filtration resin (for example, Sephadex LH-20, manufactured by Pharmacia), and then passed through a 0.05 N potassium hydroxide aqueous solution to allow unreacted solution. Elute the sugar donor, cyclodextrin synthase (protein), etc., then elute unreacted ellagic acid, and finally elute the target ellagic acid glycoside. An acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid is added to the eluate containing the ellagic acid glycoside thus obtained to adjust the pH to 3.0 or less to precipitate and precipitate the ellagic acid glycoside. It is separated by a method such as centrifugation by a method, washed with a small amount of water, and dried by vacuum drying or the like to obtain an aggregate of ellagic acid glycosides having different degrees of glucose polymerization. And when the unreacted ellagic acid is contained as an impurity in the eluate of the ellagic acid glycoside, or when it is desired to separate glycosides having different degrees of glucose polymerization from the aggregate of the ellagic acid glycoside, Then, an acid was added thereto to precipitate and precipitate ellagic acid glycoside, and the precipitate was dissolved in a solvent such as methanol or ethanol.
Partitioned adsorption chromatograms of reversed-phase systems (eg, TOSOH
Separation and elution of the target ellagic acid glycoside fraction with a methanol concentration gradient, concentration by an evaporator or the like, evaporation to dryness and evaporation of the target ellagic acid distribution. Get the saccharide.
【００１７】[0017]
【本発明の効果】本発明によればエラグ酸に糖供与体の
存在下、サイクロデキストリン合成酵素を作用させると
いう極めて簡単な操作によって、反応液中にエラグ酸４
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドを始めとするエラグ酸
配糖体を得ることができる。このエラグ酸配糖体は、エ
ラグ酸の優れた生理活性を有し、しかも水に対する溶解
度が非常に高い特徴を有している。According to the present invention, ellagic acid 4 is added to the reaction solution by a very simple operation of allowing cyclodextrin synthase to act on ellagic acid in the presence of a sugar donor.
An ellagic acid glycoside including -O-α-D-glucopyranoside can be obtained. This ellagic acid glycoside has the excellent physiological activity of ellagic acid, and has a very high solubility in water.
【００１８】以下、実施例を示して本発明をより具体的
に説明する。Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
【実施例１】エラグ酸４ｇを２ｌの水に懸濁し、このエ
ラグ酸の溶解を促進するためアルギニン５ｇ添加して該
エラグ酸を溶解し、これを希塩酸にてｐＨを７．５に調
整した。これに糖供与体としてα−サイクロデキストリ
ンを８ｇ、サイクロデキストリン合成酵素として、コン
チザイム（商品名、天野製薬社製）を６０，０００単位
添加し、５０℃で１５時間反応させ、糖化合物生成反応
を行い、次いで、８０℃、５分間加熱処理して酵素反応
を停止し酵素反応終了液を得た。この反応終了液のＨＰ
ＬＣ分析の結果を図１に示す。図１の結果から、反応終
了液には、エラグ酸と共にグルコース重合度が１〜数個
であるエラグ酸配糖体が含まれていることが確認でき
る。EXAMPLE 1 4 g of ellagic acid was suspended in 2 liters of water, and 5 g of arginine was added to promote the dissolution of the ellagic acid to dissolve the ellagic acid, and the pH was adjusted to 7.5 with dilute hydrochloric acid. . To this, 8 g of α-cyclodextrin as a sugar donor and 60,000 units of contizyme (trade name, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) as a cyclodextrin synthase are added, and the mixture is reacted at 50 ° C. for 15 hours. Then, the enzyme reaction was stopped by heating at 80 ° C. for 5 minutes to obtain an enzyme reaction completed solution. HP of this reaction end solution
FIG. 1 shows the results of the LC analysis. From the results in FIG. 1, it can be confirmed that the reaction completed solution contains ellagic acid glycoside having a glucose polymerization degree of 1 to several together with ellagic acid.
【００１９】[0019]
【実施例２】上記酵素反応終了液に、グルコアミラー
ゼ、グルクザイムＡＦ−６（商品名、天野製薬社製）１
２，０００単位を添加し、５０℃において１５時間反応
させてグルコース重合度が複数のエラグ酸配糖体のグル
コース鎖を加水分解した。この加水分解反応液を以下に
示す高速液体クロマトグラムによりＨＰＬＣ分析を行っ
た。その結果を図２に示す。図２の結果から、加水分解
反応液には未反応のエラグ酸以外に単一なエラグ酸配糖
体が著量含まれていることが確認できる。 ［高速液体クロマトグラムによるＨＰＬＣ分析の条件］ カラム；Ｃｉｃａ−ＭＥＲＣＫ，ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ
ＲＰ−１８（５μｍ）内径、４．０ｍｍ、長さ、２５
０ｍｍ、 流速；１ｍｌ／分 移動相；メタノール：５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ２．
５）＝４５：５５ 検出波長；２５５ｎｍExample 2 Glucoamylase and Gluczyme AF-6 (trade name, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.)
2,000 units were added and reacted at 50 ° C. for 15 hours to hydrolyze the glucose chains of ellagic acid glycosides having a plurality of degrees of polymerization of glucose. This hydrolysis reaction solution was subjected to HPLC analysis using a high performance liquid chromatogram shown below. The result is shown in FIG. From the results in FIG. 2, it can be confirmed that the hydrolysis reaction solution contains a significant amount of a single ellagic acid glycoside other than unreacted ellagic acid. [Conditions for HPLC analysis by high performance liquid chromatogram] Column; Cica-MERCK, LiChrosorb
RP-18 (5 μm) inner diameter, 4.0 mm, length, 25
0 mm, flow rate; 1 ml / min mobile phase; methanol: 5 mM KH 2 PO 4 (pH 2.
5) = 45: 55 detection wavelength; 255 nm
【００２０】[0020]
【実施例３】次に、上記実施例２で得られた加水分解反
応液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜（旭化成社
製）に透過処理して不溶物及びサイクロデキストリン合
成酵素等を除去し、得られた透過液をロータリーエバポ
レーターにて１／４０容量となるまで濃縮した。つい
で、この濃縮液をセファデックスＬＨ−２０カラム（内
径５センチ、長さ１００センチ）に通液し、次いで０．
０５Ｎ水酸化カリウム水を通液して、最初未反応の糖供
与体，蛋白質（酵素）及び未反応のエラグ酸を溶出し、
そして最後に目的とするエラグ酸配糖体を溶出した。こ
のようにして得られたエラグ酸配糖体を含む溶液に、直
ちに濃塩酸を加えて、ｐＨを１．５に調整し、エラグ酸
配糖体を析出沈殿させ、３，０００ｒｐｍ、５分間遠心
分離し、少量の水で洗浄して、再度遠心分離し、次いで
常法により真空乾燥して、目的とするエラグ酸配糖体と
思われる粉末約２０ｍｇを得た。上記粉末を以下の条件
で、高速液体クロマトグラフィーによりエラグ酸配糖体
の純度を測定したところ９８％であった。 ［高速液体クロマトグラフィーの条件］ カラム；Ｃｉｃａ−ＭＥＲＣＫ，ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ
ＲＰ−１８（５μｍ）内径、４．０ｍｍ、長さ、２５
０ｍｍ 流速；１ｍｌ／分 移動相；メタノール：５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ２．
５）＝４５：５５ 検出波長；２５５ｎｍExample 3 Next, the hydrolysis reaction solution obtained in Example 2 was permeated through an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10,000 (manufactured by Asahi Kasei Corporation) to obtain insoluble substances and cyclodextrin synthase. Was removed, and the obtained permeate was concentrated to 1/40 volume with a rotary evaporator. Then, the concentrated solution was passed through a Sephadex LH-20 column (inner diameter: 5 cm, length: 100 cm).
First, unreacted sugar donor, protein (enzyme) and unreacted ellagic acid are eluted by passing a 05N potassium hydroxide aqueous solution through,
Finally, the target ellagic acid glycoside was eluted. Concentrated hydrochloric acid was immediately added to the solution containing the ellagic acid glycoside thus obtained to adjust the pH to 1.5, and the ellagic acid glycoside was precipitated and precipitated, and then centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes. It was separated, washed with a small amount of water, centrifuged again, and then vacuum-dried by a conventional method to obtain about 20 mg of a powder which was considered to be the target ellagic acid glycoside. The purity of the ellagic acid glycoside of the above powder was measured by high performance liquid chromatography under the following conditions and found to be 98%. [Conditions of high performance liquid chromatography] Column; Cica-MERCK, LiChrosorb
RP-18 (5 μm) inner diameter, 4.0 mm, length, 25
0 mm flow rate; 1 ml / min mobile phase; methanol: 5 mM KH 2 PO 4 (pH 2.
5) = 45: 55 detection wavelength; 255 nm
【００２１】次に、上記粉末のエラグ酸配糖体の構造を
以下の核磁気共鳴スペクトル及びマススペクトルにより
分析したところ、得られた化合物はエラグ酸 ４−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシドであることが確認された。即
ち、上記粉末を常法に従って、重ＤＭＳＯに溶解し、1
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル及び13Ｃ−核磁気共鳴スペク
トルにより測定し、構造の解析をしたところそれぞれ図
３（1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨZ））及び図４（13Ｃ−Ｎ
ＭＲ（５０ＭＨZ））が得られ、これらの図より構成成
分はグルコース１分子とエラグ酸１分子であり、グルコ
ースの１位とエラグ酸の４位がα結合していることが判
明した。Next, the structure of the ellagic acid glycoside of the above powder was analyzed by the following nuclear magnetic resonance spectrum and mass spectrum, and the obtained compound was found to be ellagic acid 4-O-
It was confirmed to be α-D-glucopyranoside. That is, the above powder was dissolved in heavy DMSO according to a conventional method, and 1
H- was measured by a nuclear magnetic resonance spectrum and 13 C- nuclear magnetic resonance spectra, respectively Figure 3 was the analysis of the structure (1 H-NMR (200MH Z )) and FIG. 4 (13 C-N
MR (50MH Z)) is obtained, the components from these figures is one molecule of glucose and ellagic acid molecule, it was found that the 4-position of the 1-position and ellagic acid glucose is bound alpha.
【００２２】次に、本実施例で得られたエラグ酸配糖体
を常法に従って、マススペクトルにより分析を行ったと
ころ図５が得られ、この結果から本発明の方法で得られ
た化合物の分子量は４６４であることを確認した。Next, the ellagic acid glycoside obtained in this example was analyzed by mass spectrometry according to a conventional method, and FIG. 5 was obtained. From the results, the compound of the compound obtained by the method of the present invention was obtained. It was confirmed that the molecular weight was 464.
【００２３】次に、本発明の方法で得られたエラグ酸配
糖体を常法に従ってＵＶ及び、ＩＲスペクトルを調べた
結果、それぞれ図６、図７が得られた。ＵＶスペクトル
は検体をメタノールに溶解して測定し、そして、ＩＲス
ペクトルはＫＢｒ法により測定した。この結果から、得
られた糖化合物はエラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピ
ラノシドであることが確認された。Next, the ellagic acid glycoside obtained by the method of the present invention was examined for UV and IR spectra according to a conventional method. As a result, FIGS. 6 and 7 were obtained. The UV spectrum was measured by dissolving the sample in methanol, and the IR spectrum was measured by the KBr method. From this result, it was confirmed that the obtained sugar compound was ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside.
【００２４】[0024]
【応用例１】 「エラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの水溶
解性試験」エラグ酸、及びエラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシドをそれぞれ表１の各濃度となるように
純水に懸濁し、次いで濾過膜、ミリポア製マイレックス
ＧＳ（孔径０．２２μｍ）を２回通過させて液中の不溶
性懸濁物を完全に除去し、濾液中に完全に溶解している
エラグ酸またはエラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシドの量を高速液体クロマトグラムにより測定し、そ
の溶解度を求めた。その結果を表１に示す。[Application example 1] "Water solubility test of ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside" ellagic acid and ellagic acid 4-O-α-D-
Glucopyranosides were suspended in pure water so as to have the respective concentrations shown in Table 1, and then passed twice through a filtration membrane and a Millipore Myrex GS (pore size: 0.22 μm) to completely remove the insoluble suspension in the liquid. Then, the amount of ellagic acid or ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside completely dissolved in the filtrate was measured by a high performance liquid chromatogram, and its solubility was determined. Table 1 shows the results.
【００２５】 [0025]
【００２６】表１の結果から、エラグ酸 ４−Ｏ−α−
Ｄ−グルコピラノシドは、エラグ酸に比べて溶解度が重
量比で約１５０倍、モル比で約１００倍増大し、実用に
際して著しく便利であることが判る。From the results shown in Table 1, ellagic acid 4-O-α-
D-glucopyranoside has about 150 times the solubility by weight and about 100 times the molar ratio as compared with ellagic acid, indicating that it is extremely convenient for practical use.
【００２７】[0027]
【応用例２】 「エラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの抗酸
化性試験」アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５２巻、１１号、２
７１７〜２７２２頁、（１９８８年）に記載の方法に従
い、抗酸化性試験を行なった。但し、０．１２５モル・
トリスバッファの代りに純水を使用した。反応液８ｍｌ
を、１０ｍｌプラスチック製スピッツ管に入れ、１５ワ
ット昼白色蛍光燈直下２０ｃｍ（２９００ ルック
ス）、３２℃に置いた。経時的に４６０ｎｍの吸光度を
測定して、β−カロチンの残存率によって、抗酸化能の
比較を行なった。その結果を図８に示す。尚、図８にお
いて、記号×はエラグ酸を最終濃度１０μＭ添加した場
合を示し、○はエラグ酸４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シドを最終濃度１０μＭ添加した場合を示し、●はエラ
グ酸４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドを最終濃度２４
μｇ／ｍｌ添加した場合を示し、□はブランクを示し、
▲はカテキンを最終濃度１０μＭ添加した場合を示し、
そして△はα−トコフェロールを最終濃度１０μＭ添加
した場合を示している。[Application Example 2] “Antioxidant test of ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside” Agricultural Biology (Agricultural Biology)
cal Chemistry), Vol. 52, No. 11, 2
The antioxidant test was performed according to the method described on pages 717 to 2722 (1988). However, 0.125 mol
Pure water was used instead of Tris buffer. 8 ml of reaction solution
Was placed in a 10 ml plastic Spitz tube and placed at 32 ° C., 20 cm (2900 lux) directly under a 15-watt daylight fluorescent lamp. The absorbance at 460 nm was measured over time, and the antioxidant ability was compared based on the residual ratio of β-carotene. FIG. 8 shows the result. In FIG. 8, the symbol x indicates the case where ellagic acid was added at a final concentration of 10 μM, the symbol ○ indicates the case where ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside was added at a final concentration of 10 μM, and the symbol ● indicates the case where ellagic acid 4-M was added. O-α-D-glucopyranoside was added to a final concentration of 24.
μg / ml is shown, □ shows a blank,
▲ indicates the case where catechin was added at a final concentration of 10 μM,
△ indicates the case where α-tocopherol was added at a final concentration of 10 μM.
【００２８】図８の結果からエラグ酸は、水溶解性が著
しく低いため高濃度で添加してもβ−カロチンの分解を
殆ど防止することができず、ブランクの場合と殆ど差が
ない。 これに対して、エラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシドは、１０μＭという少量の添加で、β−
カロチンの分解を強力に防止し、６時間３０分経過後も
４０％以上β−カロチンが残存しており、また水に対す
る飽和濃度（２４μｇ／ｍｌ）添加すれば６時間３０分
経過後も５０％以上β−カロチンが残存していることが
判る。また、その抗酸化力は従来公知のカテキン及びα
−トコフェロールと比べ勝るとも劣らない値を示し、優
れた抗酸化剤として利用できることが判る。この様なこ
とから、エラグ酸を配糖体化し水溶解性を高めることに
よって、抗酸化能を有効に発揮させることができること
が判る。From the results shown in FIG. 8, ellagic acid has a remarkably low solubility in water, so that even at a high concentration, ellagic acid can hardly prevent the decomposition of β-carotene, and there is almost no difference from the blank. In contrast, ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside can be added to β-
Carotene degradation is strongly prevented, β-carotene remains at least 40% after 6 hours and 30 minutes, and 50% after 6 hours and 30 minutes when a saturated concentration in water (24 μg / ml) is added. Thus, it can be seen that β-carotene remains. In addition, its antioxidant power is known from catechin and α
-Shows a value not inferior to that of tocopherol, indicating that it can be used as an excellent antioxidant. From these facts, it is understood that the antioxidant ability can be effectively exerted by converting ellagic acid into a glycoside and increasing the water solubility.
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】実施例１で得られた、グルコース重合度の異な
る複数のエラグ酸配糖体を含む酵素反応終了液のＨＰＬ
Ｃ分析の結果を示す。FIG. 1 shows the HPL of an enzyme reaction-completed solution containing a plurality of ellagic acid glycosides having different degrees of glucose polymerization obtained in Example 1.
C shows the results of the analysis.
【図２】実施例１で得られた、グルコース重合度の異な
る複数のエラグ酸配糖体を含む酵素反応終了液に、グル
コアミラーゼを反応させて得られた、単一なエラグ酸配
糖体が増大して存在するＨＰＬＣ分析の結果を示す。FIG. 2 shows a single ellagic acid glycoside obtained by reacting a glucoamylase with an enzyme reaction completed solution containing a plurality of ellagic acid glycosides having different degrees of glucose polymerization obtained in Example 1. Shows the results of the HPLC analysis in which is increased.
【図３】エラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
の1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨZ）（重ＤＭ
ＳＯ）を示す。FIG. 3. 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (200 MH Z ) of ellagic acid 4-O-α-D-glucopyranoside (deuterated DM
SO).
【図４】同化合物の13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（５０
ＭＨZ）（重ＤＭＳＯ）を示す。FIG. 4 shows a 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (50
MH Z ) (Heavy DMSO).
【図５】同化合物のマススペクトルを示す。FIG. 5 shows a mass spectrum of the compound.
【図６】同化合物をメタノールに溶解したときのＵＶス
ペクトルを示す。FIG. 6 shows a UV spectrum when the same compound was dissolved in methanol.
【図７】同化合物のＫＢｒ法によるＩＲスペクトルを示
す。FIG. 7 shows an IR spectrum of the compound by a KBr method.
【図８】同化合物の抗酸化力を示す。FIG. 8 shows the antioxidant activity of the compound.
【化３】 Embedded image
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 17/04 C12P 1/00 - 19/24 A61P 35/00 A61P 43/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C07H 17/04 C12P 1/00-19/24 A61P 35/00 A61P 43/00 BIOSIS (DIALOG) CA (STN ) WPI (DIALOG)
Claims (2)
配糖体。(1) Formula (1) (Wherein, n represents an integer of 1 to 6).
キストリン合成酵素を作用させることを特徴とするエラ
グ酸配糖体の製造法。2. A process for producing ellagic acid glycosides, which comprises reacting cyclodextrin synthase with ellagic acid in the presence of a sugar donor.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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| JPH05331183A JPH05331183A (en) | 1993-12-14 |
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ID=15744233
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-
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