KR100511419B1 - beta-fructosyl-L-ascorbic acid and the preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산화안정성이 개선된 신규 구조의 아스코르브산 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 미생물 유래의 레반 프럭토트랜스퍼라제(levan fructotransferase) 또는 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 (Inulin fructotransferase)를 이용하여 아스코르브산에 프럭토실기를 결합시킴으로써 산화 안정성을 가지며 동시에 항산화, 미백 등의 생리활성을 나타내는 신규물질인 β-프럭토실-L-아스코르브산 및 이의 제조방법에 관한 것이다The present invention relates to a novel ascorbic acid derivative having improved oxidation stability and a method for preparing the same. More specifically, microorganism-derived levan fructotransferase or inulin fructotransferase is used to bind fructosyl groups to ascorbic acid to provide oxidative stability and at the same time physiological activities such as antioxidant and whitening. Β-fructosyl-L-ascorbic acid, which is a novel substance which represents
Description
본 발명은 산화안정성이 개선된 아스코르브산 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 미생물 유래의 레반 프럭토트랜스퍼라제(levan fructotransferase) 또는 이눌린 프럭토트랜스퍼라제(Inulin fructotransferase) 효소를 이용하여 아스코르브산에 프럭토실기를 결합시켜 제조되고 산화 안정성을 가지며 동시에 항산화, 미백 등의 생리활성을 나타내는 신규물질인 β-프럭토실-L-아스코르브산 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an ascorbic acid derivative having improved oxidation stability and a preparation method thereof. More specifically, microorganism-derived levan fructotransferase or inulin fructotransferase enzymes are prepared by binding fructosyl groups to ascorbic acid, and have an oxidative stability and simultaneously antioxidant, whitening, etc. The present invention relates to β-fructosyl-L-ascorbic acid and a method for producing the same.
기능성 물질로 다양한 생리활성을 지닌 아스코르브산은 구조적으로 불안정하여 쉽게 산화된다. 아스코르브산의 화학적 성질은 분자 속에서 하나의 이중결합에 2개의 수산기가 붙은 구조(엔디올基)를 가지고 있으므로 환원성이 매우 강하다. 생체 내에서는 아스코르브산 산화효소의 작용으로 산화되어 탈수소아스코르브산이 된다. 이 반응은 가역반응으로 생체 내의 산화환원 상태를 일정하게 유지하는 역할을 한다. 또한, 티로신, 페닐알라닌 등의 대사작용에도 중요한 역할을 하고 있고, 티로신으로부터 생성되는 흑갈색 색소인 멜라닌 색소의 형성도 아스코르브산에 의해 억제된다. 이러한 아스코르브산은 γ-락톤(lactone)과 유사한 구조를 갖고 있어 불안정하고 빛, 공기, 물, 열 등의 영향을 받아 쉽게 산화되어 탈수소아스코르브산이 된다. 아스코르브산의 산화 반응은 일반적으로 연속적인 두개의 전자 전이 과정인 수소이온의 해리로 인해 아스코르브산의 산화 중간체인 디히드로아스코르브산 라디칼(dehydroascorbate radical)이 만들어지며, 이는 반응성이 풍부하고 그 자체가 2 분자로 반응해서 1분자의 아스코르브산과 탈수소아스코르브산을 생성한다(Williams, N.H.& Yandell, J.K.; Aust. J. Chem., 35(6), pp1133-44, 1982). 항산화제는 이 때 생성된 디히드로아스코르브산 라디칼과 반응하여 유리기를 환원시키므로 산화 반응을 억제한다. 아스코르브산의 산화 반응은 가역적이며 산화형인 탈수소아스코르브산 역시 비타민으로서의 생리 활성을 지니고 있다. 하지만 탈수소아스코르브산은 쉽게 가수분해되어 2,3-데케토-L-굴론산(2,3-deketo-L-gulonic acid)이 만들어지는데 이는 카르복실기의 이웃에 2개의 C=O 기를 갖기 때문에 일반 카르본산보다 해리되기 쉬우며 C=O 기의 결합각(120') 때문에 원자간 위치의 자유도가 작은 락톤환을 생성하기 어려워진다. 따라서 비가역적으로 분해되어 L-리속신산(lyxosic acid)과 L-자일로신산(xylosic acid)이 생성되는데 이들은 아스코르브산으로서의 생리 활성이 소실된 상태이다(Staudinger, H., Krisch, K.; Ann. N.Y. Acad. Sci., 92, pp195, 1961).Ascorbic acid, which has various physiological activities as a functional substance, is structurally unstable and easily oxidized. Ascorbic acid has very strong reducing properties because it has a structure in which two hydroxyl groups are attached to one double bond in the molecule. In vivo, it is oxidized by the action of ascorbic oxidase to become dehydrogen ascorbic acid. This reaction is a reversible reaction and serves to maintain a constant redox state in vivo. In addition, it plays an important role in metabolism of tyrosine, phenylalanine and the like, and formation of melanin pigment, which is a dark brown pigment produced from tyrosine, is also inhibited by ascorbic acid. Such ascorbic acid has a structure similar to γ-lactone, which is unstable and easily oxidized under the influence of light, air, water, heat, and the like to become dehydrogenated ascorbic acid. Oxidation of ascorbic acid typically results in dehydroascorbate radicals, which are the oxidative intermediates of ascorbic acid, due to dissociation of hydrogen ions, two successive electron transfer processes. The molecule reacts to produce one molecule of ascorbic acid and dehydrogen ascorbic acid (Williams, NH & Yandell, JK; Aust. J. Chem. , 35 (6) , pp1133-44, 1982). Antioxidants inhibit the oxidation reaction by reacting with the dihydroascorbic acid radicals produced at this time to reduce the free groups. The oxidation of ascorbic acid is reversible and the oxidative dehydrogen ascorbic acid also has a physiological activity as a vitamin. However, dehydroascorbic acid is easily hydrolyzed to form 2,3-deketo-L-gulonic acid, which is a common carboxylic acid because it has two C═O groups in the neighborhood of the carboxyl group. It is easier to dissociate and it is difficult to produce a lactone ring having a low degree of freedom between atoms due to the bonding angle 120 'of the C = O group. Thus, irreversible degradation results in the formation of L-lyxosic acid and L-xyloxic acid, which have lost their physiological activity as ascorbic acid (Staudinger, H., Krisch, K .; Ann NY Acad. Sci. , 92 , pp 195, 1961).
아스코르브산은 비수용액에서는 극소량이 용해되는 반면, 수용액에서는 다량이 용해되는 특성을 갖고 있으나 산화작용으로 쉽게 안정화되지 못해 의약품, 식품, 화장품 등의 용도로는 사용하기가 어렵다. Ascorbic acid has a very small amount in the non-aqueous solution, while a large amount in the aqueous solution, but because it is not easily stabilized by oxidation, it is difficult to use for pharmaceuticals, food, cosmetics, and the like.
종래에는 아스코르브산의 화학적 안정성을 높이기 위해서 아스코르브산 황산염, 아스코르브산 인산염, α-글리코실-L-아스코르브산 등과 같은 유도체들을 화학적 또는 효소법으로 합성하는 기술이 보고된 바 있다. 이시오(Ishio) 등(일본특허공보 5,920/83호)과 마사모토(Masamoto) 등(일본특허공보 198,498/83호)은 화학적합성법으로 α-글리코실-L-아스코르브산을 생산하는 기술을 개발하였으나, 그 반응이 복잡하고 수율이 낮을 뿐만 아니라 생성된 유도체에 대한 무독성과 안전성 확립이 어려운 등의 단점이 있어 최근에는 효소를 이용한 배당체의 생산방법이 주로 연구되고 있다. 지금까지 α-글리코실-L-아스코르브산를 생산하는 것으로 알려진 효소로는 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제와 α-글루코시다제가 있다. 이 중 α-글루코시다제는 덱스트린의 말단의 비 환원성 α-1, 4-결합의 α-글루코스 단위를 가수분해하는 효소로 반응조건에 따라 α-글리코실-L-아스코르브산의 합성과 가수분해 활성을 모두 갖고 있다. 이러한 효소에 의한 배당화 반응으로 개발된 아스코르브산의 포도당 유도체인 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 1990년 노리스(Noris) 등이 쥐 소장의 α-글루코시다제를 사용하여 처음으로 합성하였다(Noris M., et al., Agricultural and biological chemistry, 54, pp1697-1733, 1990). 이후 일본의 하야시바라사가 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제와 α-글루코시다제를 사용한 효소합성법에 의한 α-글리코실-L-아스코르브산의 제조기술을 개발하였다(일본특허 2926412호/2832848호, 한국특허등록 158102호/제162495호).Conventionally, techniques for synthesizing derivatives such as ascorbic acid sulfate, ascorbic acid phosphate, α-glycosyl-L-ascorbic acid, etc. in order to increase the chemical stability of ascorbic acid have been reported. Ishio et al. (Japanese Patent Publication No. 5,920 / 83) and Masamoto et al. (Japanese Patent Publication No. 198,498 / 83) developed a technique for producing α-glycosyl-L-ascorbic acid by chemical synthesis. In addition, the reaction is complicated, the yield is low, and there are disadvantages such as non-toxicity and difficulty in establishing safety of the resulting derivatives. Recently, a method of producing glycosides using enzymes has been mainly studied. Enzymes so far known to produce α-glycosyl-L-ascorbic acid include cyclodextrin glucanotransferase and α-glucosidase. Among these, α-glucosidase is an enzyme that hydrolyzes non-reducing α-1, 4-linked α-glucose units at the end of dextrin. Synthesis and hydrolysis of α-glycosyl-L-ascorbic acid depending on reaction conditions It has all the activity. 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid, a glucose derivative of ascorbic acid, developed by the enzyme glycation reaction, was used in 1990 by Noris et al. For the first time (Noris M., et al., Agricultural and biological chemistry , 54 , pp 1697-1733, 1990). Since then, Hayashibara Corporation has developed a technology for producing α-glycosyl-L-ascorbic acid by enzymatic synthesis using cyclodextrin glucanotransferase and α-glucosidase (Japanese Patent No. 2926412/2832848, Korean Patent Registration). 158102/162495).
본 발명자들은 그동안 프럭토트랜스퍼라제의 일종인 레반슈크라제를 이용한 알킬 프럭토시드의 생산기술을 개발하여 국내특허로서 등록한 바 있고 (한국특허 0257118, 2000. 2. 28), 미생물 유래 신규 프럭토트랜스퍼라제 유전자를 분리하고 이 효소의 트랜스프럭토실레이션 활성을 이용한 디-D-프럭토퓨라노스 2,6':6,2' 디언하이드리드 생산기술을 개발하여 국내외 특허로서 출원[한국특허출원 99-45302 (1999. 10. 19); 미국특허출원 제 09/868,328 (2001. 6. 18), 유럽특허출원 제 00 976 414.3호 (2001. 6. 20)] 하는 등의 연구실적을 보고한 바 있으며, 프럭토실 배당체 생산기술을 개발하는 과정에서 프럭토트랜스퍼라제가 이눌린과 레반과 같은 프락탄으로부터 과당 전이반응에 의해 프럭토시드를 생성한다는 사실을 확인하고, 프럭토실기 수용체로서 아스코르브산을 사용하여 화학적으로 안정한 신규물질인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 생산하는 새로운 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have developed a technology for producing alkyl fructoside using levanschkrase, a kind of fructotransferase, and registered it as a domestic patent (Korean Patent 0257118, Feb. 28, 2000), and a novel fructo derived from microorganisms. Isolate the transferase gene and develop di-D-fructofuranose 2,6 ': 6,2' deion hydride production technology using the transfructosylation activity of this enzyme and filed it as a domestic and international patent [Korea Patent Application 99- 45302 (October 19, 1999); US Patent Application No. 09 / 868,328 (June 18, 2001), European Patent Application No. 00 976 414.3 (June 20, 2001), and others. In the process, it was confirmed that fructotransferase produced fructoside by fructose transfer reaction from fructans such as inulin and levane, and β-Fruc, a chemically stable novel substance using ascorbic acid as a fructosyl group receptor The present invention has been completed by developing a new technique for producing tosyl-L-ascorbic acid.
본 발명은 종래에 화학적으로나 생물학적 방법으로 생산된 바가 없는 안정하고 새로운 아스코르브산 유도체인 β-프럭토실-L-아스코르브산 및 이를 생산하는 신규한 제조방법을 제공하는 것이다. The present invention provides a stable new novel ascorbic acid derivative β-fructosyl-L-ascorbic acid, which has not been produced by chemical or biological methods, and a novel method for producing the same.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프럭토실기의 수용체로서 하기 화학식 1의 아스코르브산을 이용한 과당전이반응으로 생성된, 안정하고 신규한 하기 일반식 Ⅰ의 β-프럭토실-L-아스코르브산을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a stable and novel β-fructosyl-L-ascorbic acid produced by fructose transfer reaction using ascorbic acid of formula (1) as a receptor for fructosyl group to provide.
상기 식에서, n은 0부터 10 사이의 정수이다.Wherein n is an integer from 0 to 10.
상기 일반식 (I) 화합물 정의에서 바람직하기로는 n이 0 내지 5의 정수인 화합물이다.In the above general formula (I) compound definitions, preferably n is an integer from 0 to 5.
또한 본 발명은 1) 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 미생물을 β-프럭토실 당화합물을 주성분으로 함유하는 배지에 접종하여 배양하고, 배양물을 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 유안침전법(Ammonium sulfate precipitation method)으로 프럭토트랜스퍼라제 조효소 용액을 제조하고 부가적으로 정제하는 제 1단계;In addition, the present invention is 1) inoculating microorganisms producing fructotransferase in a medium containing β-fructosyl sugar compound as a main component, followed by culture, centrifugation of the culture to remove the cells, and then yuan sedimentation (Ammonium sulfate a first step of preparing and additionally purifying the fructotransferase coenzyme solution by precipitation method;
2) β-프럭토실 당화합물을 함유한 완충액에 아스코르브산을 용해시킨 후, pH를 4.5 내지 7.0으로 조정하고, 빛이 차단된 조건하에서 상기 제 1 단계에서 수득된 프럭토트랜스퍼라제를 가하고 반응시켜 β-프럭토실-L-아스코르브산을 수득하는 제 2단계;2) After dissolving ascorbic acid in a buffer containing β-fructosyl sugar compound, the pH was adjusted to 4.5 to 7.0, and the fructotransferase obtained in the first step was added and reacted under the condition of blocking light. a second step of obtaining β-fructosyl-L-ascorbic acid;
3) 상기 제 2단계에서 수득된 β-프럭토실-L-아스코르브산에 부가적인 정제과정을 수행하여 정제된 β-프럭토실-L-아스코르브산을 제조하는 제 3단계;로 이루어진 공정을 포함하는 신규한 β-프럭토실-L-아스코르브산의 제조방법을 제공한다.3) a third step of preparing purified β-fructosyl-L-ascorbic acid by performing an additional purification process on the β-fructosyl-L-ascorbic acid obtained in the second step; A novel method for preparing β-fructosyl-L-ascorbic acid is provided.
상기 프럭토트랜스퍼라제는 레반 프럭토트랜스퍼라제, 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 또는 이들의 혼합물을 의미한다.The fructotransferase refers to levan fructotransferase, inulin fructotransferase or mixtures thereof.
또한 레반 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 균주로서 바람직하게는 아스로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience), 아스로박터 니코티노보란스(A. nicotinovorans) 균주들을 포함하며, 더욱 바람직하게는 장 등의 문헌(K.H. Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp2632-2636, 2003)에 기재된 아스로박터 옥시단스, 송 등의 문헌에 기재된 아스로박터 유레아파시엔스 K2032(K. B. Song et. al., Enzyme and Microbial Technology, 27, pp212-218, 2000) 또는 아스로박터 니코티노보란스 ATCC 49919 균주를 사용할 수 있다.In addition, the levan fructo preferably Aspergillus bakteo oxy thiooxidans (Arthrobacter oxydans), Aspergillus bakteo urea Pacific Enschede (A. ureafacience), bakteo nicotinoyl borane's (A. nicotinovorans) strain to Ars as in a strain producing the transferase More preferably, asrobacter oxydans, song, etc., as described in Jan Jan, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry , 51 , pp2632-2636, 2003. Bacter ureapaciens K2032 (KB Song et. Al., Enzyme and Microbial Technology , 27 , pp212-218, 2000) or Asrobacter nicotinobolance ATCC 49919 strain can be used.
이 외에도 아스로박터 유레아파시엔스에서 분리한 레반 프럭토트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 재조합 대장균, 바람직하게는 레반 프럭토트랜스퍼라제 pUDFA84로 형질전환된 재조합 대장균(KCTC 8961P)을 포함한다. In addition, the recombinant E. coli transformed with Levan fructotransferase gene isolated from Asrobacter urea faciens, preferably recombinant E. coli (KCTC 8961P) transformed with levan fructotransferase pUDFA84.
또한, 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 균주는 바람직하게는 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience), 아스로박터 그로비포미스(A. globiformis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)를 포함하고, 더욱 바람직하게는 장 등의 문헌(K.H. Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp2632-2636, 2003)에 기재된 아스로박터 옥시단스, 기탁번호 KCTC 9101인 아스로박터 그로비포미스 또는 기탁번호 KCTC 1645인 슈도모나스 플루오레센스 균주를 사용할 수 있다.In addition, strains that produce inulin fructotransferases preferably include Asrobacter ureafacience , A. globiformis , Pseudomonas fluorescence , More preferably Asrobacter Grobypo, Asrobacter oxydans, Accession No. KCTC 9101, described in Chang et al., KH Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry , 51 , pp2632-2636, 2003. Pseudomonas fluorescens strains with miss or accession number KCTC 1645 can be used.
또한 상기 β-프럭토실 당화합물은 레반, 이눌린 또는 이들의 혼합물로부터 선택되어 사용될 수 있다.In addition, the β-fructosyl sugar compound may be selected from levan, inulin or mixtures thereof.
상기 1단계에서 균주 접종시 레반 또는 이눌린의 농도는 0.01 내지 5%를 사용할 수 있으며, 0.5%의 농도로 사용하는 것이 바람직하고, 사용시 50 내지 70℃의 온수에 용해하여 0.45㎛ 필터를 통과시킨 후 타 배지성분과 혼합한다. 배양시 배양온도는 4 내지 80℃, 배양시간은 3시간 내지 5일간이 바람직하며 가장 적절한 배양 pH, 온도와 배양시간은 pH 7.0에서, 30℃에서 24시간 배양하는 것이다.When inoculating the strain in step 1, the concentration of levan or inulin may be 0.01 to 5%, preferably used at a concentration of 0.5%, and dissolved in hot water at 50 to 70 ° C. and passed through a 0.45 μm filter. Mix with other media components. When incubating the culture temperature is 4 to 80 ℃, the incubation time is preferably 3 hours to 5 days, the most appropriate culture pH, temperature and incubation time is incubated at pH 7.0, 30 ℃ 24 hours.
특히, 레반 프럭토트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 재조합 대장균의 경우, 재조합 대장균을 항생제가 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 8시간 내지 12시간동안 배양한 후 유가식 발효(semi-batch process)에 종균으로 사용하여 당업계의 통상적인 방법으로 단백질발현을 유도시킨 후, 분리 정제하여 본 발명의 프럭토트랜스퍼라제를 생산할 수 있다. 상기 수득된 조효소 용액에 부가적으로 투석, 이온교환크로마토그래피, 겔여과크로마토그래피를 수행하여 정제된 형태의 프럭토트랜스퍼라제를 제조할 수 있다.In particular, in the case of recombinant Escherichia coli transformed with the Levan fructotransferase gene, the recombinant Escherichia coli was inoculated in LB medium containing antibiotics and cultured at 37 ° C. for 100 to 200 rpm for 8 to 12 hours, followed by fed-batch It can be used as a seed in a fermentation (semi-batch process) to induce protein expression by a conventional method in the art, and then separated and purified to produce the fructotransferase of the present invention. Purified fructotransferase can be prepared by performing dialysis, ion exchange chromatography, and gel filtration chromatography on the obtained coenzyme solution.
상기 제 2단계에서, 레반 또는 이눌린은 완충액, 바람직하게는 50mM 인산완충액에 1 내지 20중량%으로 함유하며, 이에 아스코르브산을 0.5 내지 15 중량%로 용해시킨 후, pH를 4.5 내지 7.0, 바람직하게는 5.0 내지 6.0으로 조정한다. 효소와 반응시 빛이 차단된 조건하에서 수행하며, 상기 제 1 단계에서 수득된 프럭토트랜스퍼라제를 레반 또는 이눌린 1g 당 5 내지 100 단위(unit)씩 가하고, 배양온도는 25 내지 50℃이고, 37℃이 바람직하며, 반응시간은 3시간 내지 5일이내가 바람직하다.In the second step, levan or inulin is contained in a buffer, preferably 50mM phosphate buffer in an amount of 1 to 20% by weight, solubilizing ascorbic acid to 0.5 to 15% by weight, and then the pH is 4.5 to 7.0, preferably Is adjusted to 5.0 to 6.0. When the reaction with the enzyme is carried out under light-blocking conditions, the fructotransferase obtained in the first step is added 5 to 100 units per 1 g of levan or inulin, and the incubation temperature is 25 to 50 ° C., 37 ℃ is preferred, the reaction time is preferably within 3 hours to 5 days.
상기 제 3단계에서, 정제된 β-프럭토실-L-아스코르브산 제품을 필요로 하는 경우 그의 분리정제는 분자량과 전자 친화성의 차이로 분리 정제할 수 있는데, 이러한 성질을 이용하여 용매 추출법, 멤브레인 분리법, 겔 여과 크로마토그래피법, 칼럼 크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법 및 이온교환 수지법 중 한 가지 또는 그 이상의 방법을 통하여 분리 정제가 가능하며, 이를 이용하여 β-프럭토실-L-아스코르브산을 아스코르브산과 프럭토스 및 반응 부산물 등의 미반응물과의 분리가 가능하다. 그 예로써는 반응혼합물에 일정량의 유기용매를 가하여 불용성 물질을 막 분리법으로 여과하여 분리하며, 또는 활성탄을 처리하여 단백성물질과 착색물질을 제거할 수 있다. 또한 양이온 교환수지로 탈염하고 음이온 교환수지로 착염시켜 분리 정제하는 방법이 있다. 이러한 방법으로 분리 정제된 물질을 실리카겔 충진제나, 리크로프렙(LiChroprep) RP-18 충진제를 이용하여 좀 더 순도높은 물질로 분리 정제가 가능하다. In the third step, when the purified β-fructosyl-L-ascorbic acid product is required, its separation and purification can be separated and purified by the difference in molecular weight and electron affinity, using this property solvent extraction method, membrane separation method , Gel filtration chromatography, column chromatography, high-speed liquid chromatography, and ion exchange resin method can be separated and purified by using one or more of the method, by using the β-fructosyl-L- ascorbic acid Separation of ascorbic acid from unreacted products such as fructose and reaction byproducts is possible. For example, a predetermined amount of an organic solvent may be added to the reaction mixture to separate the insoluble material by membrane separation, or activated carbon may be removed to remove the protein and the coloring material. In addition, there is a method of separating and purifying by desalting with a cation exchange resin and complexing with an anion exchange resin. The purified material can be separated and purified using silica gel filler or LiChroprep RP-18 filler in a higher purity material.
이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by reference examples, examples and experimental examples.
단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.However, the following Reference Examples, Examples, and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Reference Examples, Examples, and Experimental Examples.
본 발명의 대표적인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 다음의 실험에서 구체적으로 설명한다.Representative β-fructosyl-L-ascorbic acid of the present invention is described in detail in the following experiment.
참고예 1. 레반 프럭토트랜스퍼라제의 활성측정Reference Example 1 Activity Measurement of Levan Fructotransferase
레반 프럭토트랜스퍼라제의 활성은 다음과 같이 측정하였다. The activity of Levan fructotransferase was measured as follows.
50mM 인산완충용액(pH 6.5)을 사용하여 제조한 1% 레반 용액 180㎕에 효소액 20㎕를 혼합하고, 이를 45℃에서 30분간 반응시킨 후 생성된 프럭토오스의 양을 넬슨-소모기(Nelson-Somogyi) 법(Somogyi, M. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., 195, pp19-23, 1952)으로 정량하였다.20 µl of enzyme solution was mixed with 180 µl of a 1% levane solution prepared using a 50 mM phosphate buffer solution (pH 6.5) and reacted at 45 ° C. for 30 minutes, and then the amount of fructose produced was Nelson-consumer (Nelson). (Somogyi, M. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. , 195 , pp19-23, 1952).
효소 활성 1 단위는 1분 동안에 1μ㏖의 프럭토오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produced 1 μmol of fructose in one minute.
참고예 2. 이눌린 프럭토트랜스퍼라제의 활성측정Reference Example 2 Activity Measurement of Inulin Fructotransferase
이눌린 프럭토트랜스퍼라제의 활성은 다음과 같이 측정하였다. Inulin fructotransferase activity was measured as follows.
50mM 인산완충용액(pH 5.5)을 사용하여 제조한 1% 이눌린 용액 180㎕에 효소액 20㎕를 혼합하고, 이를 45℃에서 30분간 반응시킨 후 생성된 프럭토오스의 양을 넬슨-소모기(Nelson-Somogyi) 법으로 정량하였다. 20 μl of the enzyme solution was mixed with 180 μl of a 1% inulin solution prepared using a 50 mM phosphate buffer solution (pH 5.5), and the resultant was reacted at 45 ° C. for 30 minutes. Quantified by Somogyi method.
효소 활성 1 단위는 1분 동안에 1μ㏖의 프럭토오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produced 1 μmol of fructose in one minute.
실시예 1: 프럭토트랜스퍼라제의 제조Example 1 Preparation of Fructotransferase
1-1. 레반 프럭토트랜스퍼라제의 제조1-1. Preparation of Levan Fructotransferase
레반 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 것으로 알려진 아스로박터 (Arthrobacter) 속 미생물 중에서 본 발명자가 분리한 아스로박터 옥시단스(A. oxydans) (K.H. Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp2632-2636, 2003)와 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience K2032, K. B. Song et. al., Enzyme and Microbial Technology, 27, pp212-218, 2000) 및 아스로박터 니코티노보란스(A. nicotinovorans, ATCC 49919)를 각각 0.5% 레반(w/v), 0.3% NaNO3, 0.05% MgSO4, 0.02% MnCl2, 0.1% K2HPO4, 효모 추출물 0.3%로 조성된 배지에 접종하여 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 이 때 레반은 고압살균하는 다른 영양성분과는 별도로 물에 용해하여 0.45 ㎛ 필터를 통과시킨 후 다른 성분과 혼합되었다. 배양 후 원심분리하여 균체를 제거하고 유안 침전법으로 배양 상등액에 존재하는 단백질을 침전시켜 레반 프럭토트랜스퍼라제 조효소액을 조제하였다. A. oxydans (KH Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry , 51 ) isolated from the inventors of the genus Arthrobacter known to produce Levan fructotransferase , pp2632-2636, 2003) and Asrobacter ureapaciens ( A. ureafacience K2032, KB Song et. al., Enzyme and Microbial Technology , 27 , pp212-218, 2000) and Asrobacter nicotinoborance ( A nicotinovorans, ATCC 49919) 0.5% Levan (w / v), 0.3% NaNO 3 , 0.05% MgSO 4 , 0.02% MnCl 2 , 0.1% K 2 HPO 4 , incubated in a medium composed of 0.3% yeast extract was incubated for 24 hours at 30 ℃. . At this time, Levan was dissolved in water and passed through a 0.45 ㎛ filter, and mixed with other ingredients, apart from other nutrients sterilized under autoclaving. After incubation, the cells were removed by centrifugation, and the protein present in the culture supernatant was precipitated by yuan precipitation to prepare a levan fructotransferase coenzyme solution.
이 레반 프럭토트랜스퍼라제 조효소액을 20 mM 인산완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.5)에 투석한 후 동일 완충용액(pH 6.5)으로 안정화된 Q-세파로스(Sepharose) FF 음이온 교환 크로마토그라피 컬럼(2.5×500 mm, Pharmacia사, Piscataway, NJ)에 흡착시키고, 동일 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.45㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 레반 프럭토트랜스퍼라제 용액은 센트리플러스 (Centriplus, Amicon사, Beverly, USA)로 농축한 후 위와 동일한 인산완충용액을 사용하여 투석하였다. 이어서 투석으로 염이 제거된 효소액을 인산완충용액으로 안정화된 모노-Q HR 5/5 (Pharmacia사) 크로마토그라피에 흡착시키고, 인산 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.5㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 효소 용액은 센트리플러스로 농축한 후 인산완충용액에 대하여 투석하여 정제 레반 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다.This Levan fructotransferase coenzyme solution was dialyzed in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) and stabilized with the same buffer (pH 6.5). Q-Sepharose FF anion exchange chromatography column (2.5 Enzyme was eluted by adsorbing to 500 mm, Pharmacia, Piscataway, NJ), and using a 0.5 M NaCl solution prepared using the same buffer to increase the salt concentration at a constant rate of 0.45 mL per minute. The eluted Levan fructotransferase solution was concentrated with Centriplus (Centriplus, Amicon, Beverly, USA) and dialyzed using the same phosphate buffer solution as above. Subsequently, the enzyme solution from which the salt was removed by dialysis was adsorbed to mono-Q HR 5/5 (Pharmacia) chromatography stabilized with phosphate buffer solution, and the salt concentration was constant using a 0.5 M NaCl solution prepared using phosphate buffer. The enzyme was eluted at a rate of 0.5 ml per minute, increasing slowly. The eluted enzyme solution was concentrated to CentriPlus and then dialyzed against phosphate buffer solution to obtain purified Levan fructotransferase.
이러한 정제방법에 의하여 약 70배의 정제도와 20 - 30 %의 수율로 레반 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다. By this purification method, Levan's fructotransferase was obtained with a purity of about 70 times and a yield of 20-30%.
1-2. 재조합 레반 프럭토트랜스퍼라제의 제조1-2. Preparation of Recombinant Levan Fructotransferase
아스로박터 유레아파시엔스에서 분리한 레반 프럭토트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 개발하여(한국특허등록 제 380970호) 레반 프럭토트랜스퍼라제의 대량생산에 이용하였다. 재조합 대장균을 리터당 100 mg의 엠피실린이 첨가된 LB 배지 100 ㎖에 접종하여 37℃에서 115 rpm의 조건으로 10시간동안 배양한 후 유가식 발효에 종균으로 사용하였다. 유가식 발효는 높은 세포농도를 얻기 위하여 세포 성장 단계와 효소 단백질 생산 단계로 나누어 실시하였다. 초기 회분식 배양배지는 13.3g/L KH2PO4, 4.0g/L 효모추출물, 6.0g/L 글루코스, 1.7g/L 시트르산, 1.2g/L MgSO4·7H2O, 0.1g/L 티아민(Thiamine)-HCl, 0.14g/L 암피실린을 함유한 것을 사용하였고, 성장단계에서는 부피증가를 최소화하면서 세포농도를 높이고자 상기 조성에서 포도당의 농도를 700g/L로 증가시킨 배지를 사용하였고, pH의 유지와 동시에 질소원으로는 NH4OH를 사용하였다. 효소 발현단계에서는 600nm에서 배양액의 흡광도가 약 100에 도달하였을 때 IPTG를 0.02 mmol/L/g cell의 농도로 투입하였다. 이렇게 유가식 배양에서 IPTG 유도에 의하여 발현된 레반 프럭토 트랜스퍼라제의 생산량은 약 3 g/L 였다.A recombinant Escherichia coli transformed with a Levan fructotransferase gene isolated from Asrobacter urea faciens was developed (Korean Patent No. 380970) and used for mass production of Levan fructotransferase. Recombinant Escherichia coli was inoculated into 100 ml of LB medium to which 100 mg of empicillin was added and incubated at 37 rpm for 10 hours at 37 ° C., which was used as a seed for fed-batch fermentation. The fed-batch fermentation was performed by dividing the cell growth stage and the enzyme protein production stage to obtain high cell concentration. The initial batch culture medium was 13.3g / L KH 2 PO 4, 4.0g / L yeast extract, 6.0g / L glucose, 1.7g / L citric acid, 1.2g / L MgSO 4 · 7H 2 O, 0.1g / L thiamine ( Thiamine) -HCl, containing 0.14 g / L ampicillin was used, and in the growth stage, a medium in which the concentration of glucose was increased to 700 g / L was used to increase the cell concentration while minimizing the volume increase. At the same time, NH 4 OH was used as the nitrogen source. In the enzyme expression step, IPTG was added at a concentration of 0.02 mmol / L / g cells at 600 nm when the absorbance of the culture reached about 100 nm. The yield of levan fructo transferase expressed by IPTG induction in fed-batch culture was about 3 g / L.
1-3. 이눌린 프럭토트랜스퍼라제의 제조1-3. Preparation of Inulin Fructotransferases
이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 것으로 알려진 미생물 중에서 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience, KCTC 8961P)와 아스로박터 그로비포미스(A. globiformis, KCTC 9101), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence, KCTC 1645) 를 각각 0.5% 이눌린(w/v), 0.3% NaNO3, 0.05% MgSO4, 0.02% MnCl2, 0.1% K2HPO4, 효모 추출물 0.3%로 조성된 배지에 접종하여 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 이 때 이눌린은 고압살균하는 다른 영양성분과는 별도로 60℃ 온수에 용해하여 0.45 ㎛ 필터를 통과시킨 후 다른 성분과 혼합되었다. 배양 후 원심분리하여 균체를 제거하고 유안 침전법으로 배양 상등액에 존재하는 단백질을 침전시켜 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 조효소액을 조제하였다. 이 조효소액을 20 mM 인산완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.5)에 투석한 후 동일 완충용액(pH 6.5)으로 안정화된 Q-세파로스 FF 음이온 교환 크로마토그라피 컬럼(2.5×500 mm, Pharmacia사, Piscataway, NJ)에 흡착시키고, 동일 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.45㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 용액은 센트리플러스 (Centriplus, Amicon사, Beverly, USA)로 농축한 후 위와 동일한 인산완충용액을 사용하여 투석하였다. 이어서 투석으로 염이 제거된 효소액을 인산완충용액으로 안정화된 모노-Q HR 5/5 (Mono-Q HR 5/5, Pharmacia사) 크로마토그라피에 흡착시키고, 인산 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.5㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 효소 용액은 센트리플러스로 농축한 후 인산완충용액에 대하여 투석하여 정제 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다.Among the microorganisms known to produce inulin fructotransferase, A. ureafacience ( KCTC 8961P), A. globiformis ( KCTC 9101), Pseudomonas fluorescence ( Pseudomonas fluorescence) KCTC 1645) Inoculated in a medium composed of 0.5% inulin (w / v), 0.3% NaNO 3 , 0.05% MgSO 4 , 0.02% MnCl 2 , 0.1% K 2 HPO 4 , yeast extract 0.3% and incubated at 30 ° C. for 24 hours. . Inulin was dissolved in hot water at 60 ° C, passed through a 0.45 μm filter, and mixed with other ingredients. After incubation, the cells were removed by centrifugation, and the protein present in the culture supernatant was precipitated by fluoroprecipitation to prepare an inulin fructotransferase coenzyme solution. This coenzyme solution was dialyzed in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) and stabilized with the same buffer (pH 6.5). Q-Sepharose FF anion exchange chromatography column (2.5 x 500 mm, Pharmacia, Piscataway , NJ), and salt concentration was increased using a 0.5 M NaCl solution prepared using the same buffer at a rate of 0.45 ml / min to elute the enzyme. The eluted inulin fructotransferase solution was concentrated to Centriplus (Centriplus, Amicon, Beverly, USA) and dialyzed using the same phosphate buffer solution as above. Subsequently, the enzyme solution from which the salt was removed by dialysis was adsorbed onto mono-Q HR 5/5 (Mono-Q HR 5/5, Pharmacia) chromatography stabilized with phosphate buffer solution, and 0.5M NaCl prepared using phosphate buffer. The solution was used to elute the enzyme by increasing the salt concentration at a constant rate of 0.5 ml per minute. The eluted enzyme solution was concentrated to CentriPlus and then dialyzed against phosphate buffer solution to obtain purified inulin fructotransferase.
이러한 정제방법에 의하여 약 80배의 정제도와 20 - 30%의 수율로 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다. By this purification method, inulin fructotransferase was obtained at about 80-fold purity and 20-30% yield.
1-4. 유안 침전법 1-4. Yuan precipitation method
상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3에 명시된 프럭토트랜스퍼라제 생산 미생물을 대량 배양한 후 4℃에서 원심분리(6000rpm, 30분)하여 균체를 제거한 상등액에 (NH4)2SO4를 4℃에서 서서히 첨가하여 80%까지 포화시킨 후 하룻밤 방치하였다. 생성된 침전물을 원심분리(6000rpm, 20분)하여 회수한 후 적정량의 20mM 인산완충액(pH 6.5)에 녹인 후, 동일 완충액에서 충분히 투석하였다. 투석 후 생성된 침전물, 즉 불활성화된 단백질은 원심분리하여 제거한 후, 그 상등액을 이온교환 크로마토그라피 시료로 사용하였다.After mass culture of the fructotransferase producing microorganisms specified in Examples 1-1, 1-2 and 1-3, the supernatant was removed from the supernatant by centrifugation (6000 rpm, 30 minutes) at 4 ° C (NH 4 ) 2 SO. 4 was added slowly at 4 ° C., saturated to 80%, and left overnight. The resulting precipitate was recovered by centrifugation (6000 rpm, 20 minutes), dissolved in an appropriate amount of 20 mM phosphate buffer (pH 6.5), and sufficiently dialyzed in the same buffer. The precipitate produced after dialysis, that is, the inactivated protein was removed by centrifugation, and the supernatant was used as an ion exchange chromatography sample.
1-5. 이온교환 크로마토그라피1-5. Ion exchange chromatography
활성화시킨 Q-세파로스(Q-Sepharose) 칼럼(50×2.5cm)을 먼저 20 mM 인산완충액(pH 6.5)으로 평형화시킨 후, 유안 침전법으로 얻은 효소액을 흡착시킨 후, 동일한 완충액으로 비흡착 단백질 및 다른 불순물을 충분히 용출시켜 제거하는 세척과정을 수행하였다. 단백질 용출은 0.5 M NaCl을 함유한 동일한 완충용액을 이용하여 NaCl용액(0 내지 0.5 M)으로 직선농도구배를 형성시켜 0.45 ㎖/분의 유속으로 용출하면서 시험관 당 6.5 ㎖씩 분획하여 각 분획의 단백질 양 및 효소 활성을 측정하였다. 이온교환 크로마토그라피로 얻은 효소분획을 모아 20 mM 인산완충액(pH 6.5)에 투석하고 센트리플러스(Centriplus, Amicon사, USA)로 농축하여 정제된 효소를 얻었다.The activated Q-Sepharose column (50 × 2.5 cm) was first equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.5), followed by adsorption of the enzyme solution obtained by the yuan precipitation method, followed by non-adsorbed protein with the same buffer. And a washing process to sufficiently elute and remove other impurities. Protein elution was carried out using the same buffer solution containing 0.5 M NaCl to form a linear concentration tool with NaCl solution (0 to 0.5 M), eluting at a flow rate of 0.45 ml / min, and fractionating 6.5 ml per test tube to obtain the protein of each fraction. The amount and enzyme activity were measured. Enzyme fractions obtained by ion exchange chromatography were collected, dialyzed in 20 mM phosphate buffer (pH 6.5) and concentrated with Centriplus (Centriplus, Amicon, USA) to obtain purified enzymes.
실시예 2: 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 1Example 2: β-fructosyl-L-ascorbic acid preparation 1 by levan fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 4%와 아스코르브산 1%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 아스로박터 옥시단스 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제 50 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과, 약 30%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 90%의 수율로 얻었다. After dissolving 4% levane and 1% ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), the pH was adjusted to 6.0 using 4N sodium hydroxide. 100 ml of this solution was taken into a brown reagent bottle, and 50 units of Levan fructotransferase derived from Asrobacter oxydane per 1 g of levan was added and sealed, followed by enzymatic reaction by shaking at 37 ° C. for 72 hours. Analysis of the reaction product by HPLC showed that about 30% of ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The reaction mixture was heated to inactivate unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated carbon, purified and concentrated to obtain a yield of about 90% based on dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 3: 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 2Example 3: Preparation of β-fructosyl-L-ascorbic acid by levan fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 6%와 아스코르브산 2%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 50 단위에 해당하는 양의 아스로박터 니코티노보란스 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 결과 약 27%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환되었다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 85%의 수율로 얻었다.After dissolving 6% of Levan and 2% of ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), the pH was adjusted to 6.0 using 4N sodium hydroxide. Take 100 ml of this solution into a brown reagent bottle, add 50 parts per 1g of Levan, add Asrobacter nicotinoboranth-derived Levan's fructotransferase, seal and shake for 72 hours at 37 ℃. Was performed. As a result, about 27% of ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The reaction mixture was heated to inactivate unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated carbon, purified, and concentrated to give a yield of about 85% based on the dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 4: 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 3Example 4: β-Fructosyl-L-ascorbic acid Preparation Example 3 by Levan fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 4%와 아스코르브산 2%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 아스로박터 유레아파시엔스 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제 100 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간 동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 분석한 결과, 약 33%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 72%의 수율로 얻었다.After dissolving 4% levane and 2% ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), the pH was adjusted to 6.0 using 4N sodium hydroxide. 100 ml of this solution was taken into a brown reagent bottle, and 100 units of Levan fructotransferase derived from Asrobacter urea faciens per 1 g of levan was added and sealed, followed by enzymatic reaction by shaking at 37 ° C. for 72 hours. Analysis of the reaction product showed that about 33% of ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The reaction mixture was heated to inactivate unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated carbon, purified and concentrated to obtain a yield of about 72% based on the dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 5: 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 1Example 5 β-Fructosyl-L-Ascorbic Acid Preparation Example 1 by Inulin Fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 5.5)에 이눌린 10%와 아스코르브산 2%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 이눌린 1g당 아스로박터 유레아파시엔스 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 50 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 과당전이 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과, 약 27%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 91%의 수율로 얻었다.After dissolving inulin 10% and ascorbic acid 2% in 50 mM phosphate buffer (pH 5.5), the pH was adjusted to 5.5 using 4N sodium hydroxide. 100 ml of the solution was taken into a brown reagent bottle, and 50 g of inulin fructotransferase derived from Asrobacter ureapaciens per 1 g of inulin was added and sealed, followed by shaking for 72 hours at 37 ° C. to carry out fructose transfer enzyme reaction. Analysis of the reaction product by HPLC showed that about 27% of ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The reaction mixture was heated to inactivate unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated carbon, purified, and concentrated to give a yield of about 91% based on the dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 6: 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 2Example 6: Preparation of β-fructosyl-L-ascorbic acid by inulin fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 5.5)에 이눌린 15%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 이눌린 1g당 슈도모나스 플루오레센스 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 50 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과, 약 25%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 83%의 수율로 얻었다.After dissolving 15% of inulin and 3% ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 5.5), the pH was adjusted to 5.5 using 4N sodium hydroxide. 100 ml of this solution was taken into a brown reagent bottle, and 50 g of inulin fructotransferase derived from Pseudomonas fluorescein was added per 1 g of inulin, and then sealed, followed by enzymatic reaction by shaking at 37 ° C for 72 hours. Analysis of the reaction product by HPLC showed that about 25% of ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The reaction mixture was heated to inactivate the unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated carbon, purified, and concentrated to give a yield of about 83% based on the dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 7: 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 3Example 7: Preparation of β-fructosyl-L-ascorbic acid by inulin fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 5.5)에 이눌린 10%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 이눌린 1g당 아스로박터 그로비포미스 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 100 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과, 약 30%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 94%의 수율로 얻었다.After dissolving inulin 10% and ascorbic acid 3% in 50 mM phosphate buffer (pH 5.5), the pH was adjusted to 5.5 using 4N sodium hydroxide. 100 ml of this solution was taken into a brown reagent bottle, and 100 g of inulin fructotransferase derived from Asrobacter Groviformis was added per 1 g of inulin, and then sealed, followed by enzymatic reaction by shaking at 37 ° C for 72 hours. Analysis of the reaction product by HPLC showed that about 30% of ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The reaction mixture was heated to inactivate unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated charcoal, purified, and concentrated to give a yield of about 94% based on the dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 8: 재조합 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조예 4Example 8 Preparation of β-Fructosyl-L-ascorbic Acid by Recombinant Levan Fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 6%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 3리터를 취하여 온도 및 pH 제어장치와 혼합장치가 부착된 5리터 효소반응기에 넣고 빛이 차단되도록 알루미늄 호일을 사용하여 반응조를 둘러쌌다. 이 용액에 레반 1g당 아스로박터 유레아파시엔스 유래 재조합 레반 프럭토트랜스퍼라제 200 단위를 가하여 밀봉한 후 온도 37℃, pH 6.5를 유지하고, 100 rpm으로 혼합해 주면서 72시간동안 과당전이 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 분석한 결과, 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 수율은 약 35% 였다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 88%의 수율로 얻었다.After dissolving 6% of Levan and 3% of ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), the pH was adjusted to 6.0 using 4N sodium hydroxide. 3 liters of this solution was taken and placed in a 5 liter enzyme reactor equipped with a temperature and pH control device and a mixing device and surrounded by a reaction tank using aluminum foil to block light. 200 g of Asrobacter ureapaciens-derived recombinant Levan fructotransferase per 1 g of Levan was added to the solution, sealed, and maintained at 37 ° C. and pH 6.5. Was performed. Analysis of the reaction product showed that the yield of ascorbic acid converted to ascorbic acid fructoside was about 35%. The reaction mixture was heated to inactivate unreacted enzyme, filtered, and the filtrate was decolorized with activated carbon, purified and concentrated to give a yield of about 88% based on the dry solids based on the weight of the starting material.
실시예 9: 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 정제Example 9: Purification of 2-O-β-Fructosyl-L-ascorbic acid
실시예 2 내지 8에서 제조된 반응혼합물 중 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 분리 정제하기 위하여, 반응혼합물 100㎖를 알콜에 침전시켜 침전물을 제거한 후 여액을 감압 건조하였다. 건조된 고체를 증류수에 용해시킨 후 묽은 염산으로 용액의 pH를 3으로 조절한 다음, 리크로프렙 RP-18(LiChroprep RP-18, 제조회사) 충진제로 충진된 칼럼을 통과시켰다(용리액; 증류수). 용리액을 증발시켜 순수하게 분리된 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 얻었다. 수율은 반응혼합물 중의 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산에 대해 약 80% 이었다. D2O에서 측정된 수소 및 탄소핵자기공명 스펙트럼을 도 1과 도 2에 각각 나타내었다.In order to isolate and purify 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid in the reaction mixtures prepared in Examples 2 to 8, 100 ml of the reaction mixture was precipitated in alcohol to remove the precipitate, and the filtrate was dried under reduced pressure. The dried solid was dissolved in distilled water and the pH of the solution was adjusted to 3 with dilute hydrochloric acid, and then passed through a column filled with LiChroprep RP-18 (LiChroprep RP-18, manufacturer) filler (eluent; distilled water). . Eluent was evaporated to afford purely separated 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid. The yield was about 80% relative to 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid in the reaction mixture. Hydrogen and carbon nuclear magnetic resonance spectra measured at D 2 O are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
1H-NMR in D2O(ppm) ; 3.50-4.20(m, 5H), 3.73(dd, 2H, J=14Hz, 4Hz), 3.93(dd, 1H, 12Hz, 2Hz), 4.81(m, 3H) 1 H-NMR in D 2 O (ppm); 3.50-4.20 (m, 5H), 3.73 (dd, 2H, J = 14 Hz, 4 Hz), 3.93 (dd, 1H, 12 Hz, 2 Hz), 4.81 (m, 3H)
13C-NMR in D2O(ppm) ; 51.2, 57.7, 60.2, 60.4, 61.6, 67.3, 70.7, 74.6, 75.7, 116.2, 153.7, 171.8 13 C-NMR in D 2 O (ppm); 51.2, 57.7, 60.2, 60.4, 61.6, 67.3, 70.7, 74.6, 75.7, 116.2, 153.7, 171.8
또한 정제된 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 하기의 HPLC 조건에서 머무름 시간을 L-아스코르브산과 비교하여 측정하였으며 크로마토그람을 도 3에 나타내었다In addition, the retention time of the purified 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid under the following HPLC conditions was measured in comparison with L-ascorbic acid, and the chromatogram is shown in FIG. 3.
분리칼럼; Capcell Pak C18 4.6 x 250mm(Sheido사)Separation column; Capcell Pak C 18 4.6 x 250mm (Sheido)
이 동 상; 0.05M KH2PO4(인산으로 pH 2.2 로 조절)Moving phase; 0.05M KH 2 PO 4 (PH 2.2 adjusted to pH 2.2)
유 속; 1.0㎖/분Flow rate; 1.0 ml / min
검 출 기; UV 254nm(Photodiode detector;996, Waters)Detector; UV 254 nm (Photodiode detector; 996, Waters)
주사부피; 20㎕ Injection volume; 20 μl
머무름시간; 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산 ; 5.37분 Retention time; 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid; 5.37 minutes
L-아스코르브산 ; 4.64분 L-ascorbic acid; 4.64 minutes
실험예 1 : 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 과당전이 효소반응Experimental Example 1 Fructose Transfer Enzyme Reaction by Levan Fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 4%와 아스코르브산 1%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖ 씩을 취하여 빛이 차단되도록 제조된 갈색 용기 3개에 넣고 각각에 실시예 1의 방법으로 제조한 미생물 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제를 레반 1g당 10 단위(unit)씩 가하여 밀봉한 후 37℃에서 48시간동안 반응시켰다. 반응 후 반응 생성물은 -20℃에 보관되었으며 HPLC로 분석한 결과, 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 확인되었으며 전환수율은 각각 아스로박터 옥시단스 효소의 경우 28%, 아스로박터 니코티노보란스 효소의 경우 25%, 아스로박터 유레아파시엔스 효소의 경우 35% 이었다. After dissolving 4% levane and 1% ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), the pH was adjusted to 6.0 using 4N sodium hydroxide. 100 ml of this solution was taken and placed in three brown containers prepared to block light, and each of the microorganism-derived levan fructotransferases prepared by the method of Example 1 was added and sealed in units of 10 units per 1 g of levan, and then sealed. The reaction was carried out for 48 hours at ℃. After the reaction, the reaction product was stored at -20 ° C and analyzed by HPLC. Ascorbic acid was converted to ascorbic acid fructoside. The conversion yield was 28% for Asrobacter oxydans enzyme and Asrobacter nicotino. 25% for borance enzyme and 35% for Asrobacter ureapaciens enzyme.
실험예 2 : 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 과당전이 효소반응Experimental Example 2 Fructose Transfer Enzyme Reaction by Inulin Fructotransferase
50 mM 인산완충액(pH 5.5) 에 이눌린 4%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖ 씩을 취하여 빛이 차단되도록 제조된 갈색 용기 3개에 넣고 각각에 실시예 1의 방법으로 제조한 3종의 미생물 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 이눌린 1g당 10 단위(unit)씩 가하여 밀봉한 후 37℃에서 48시간동안 반응시켰다. 반응 후 반응 생성물은 -20℃에 보관되었으며 HPLC로 분석한 결과, 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 확인되었다. 전환수율은 아스로박터 유레아파시엔스 효소의 경우 23%, 아스로박터 그로비포미스 효소의 경우 26%, 슈도모나스 플루오레센스 효소의 경우 20% 이었다. After dissolving 4% inulin and 3% ascorbic acid in 50 mM phosphate buffer (pH 5.5), the pH was adjusted to 5.5 using 4N sodium hydroxide. Take 100 ml of this solution and place it in three brown containers prepared to block light, and add three microorganism-derived inulin fructotransferases prepared by the method of Example 1 to each unit for 10 g of inulin. After reacting at 37 ° C. for 48 hours. After the reaction, the reaction product was stored at −20 ° C. and analyzed by HPLC. Ascorbic acid was found to be converted to ascorbic acid fructoside. The conversion yields were 23% for Asrobacter ureapaciens enzyme, 26% for Asrobacter Grobiformis enzyme and 20% for Pseudomonas fluorescens enzyme.
상기와 같이 본 발명은 L-아스코르브산에 레반 또는 이눌린을 이용하여 프럭토트랜스퍼라제의 과당전이반응을 시킴으로써 안정화된 β-프럭토실-L-아스코르브산을 제공하며, 이는 아스코르브산을 함유하는 화장품, 식품 및 의약품 등에 안정된 상태로 사용될 수 있다.As described above, the present invention provides β-fructosyl-L-ascorbic acid stabilized by the fructose transfer reaction of fructotransferase using levan or inulin to L-ascorbic acid, which is a cosmetic containing ascorbic acid, It can be used in a stable state such as food and medicine.
도 1은 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 수소핵자기공명스펙트럼이고,1 is a hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum of 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid,
도 2는 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 탄소핵자기공명스펙트럼이고,2 is a carbon nuclear magnetic resonance spectrum of 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid,
도 3은 L-아스코르브산과 머무름시간을 비교한 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 HPLC 스펙트럼이다.3 is an HPLC spectrum of 2-O-β-fructosyl-L-ascorbic acid comparing retention time with L-ascorbic acid.
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