JP2613067B2 - モノクローナル抗体及びその使用方法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びその使用方法Info
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- JP2613067B2 JP2613067B2 JP62318564A JP31856487A JP2613067B2 JP 2613067 B2 JP2613067 B2 JP 2613067B2 JP 62318564 A JP62318564 A JP 62318564A JP 31856487 A JP31856487 A JP 31856487A JP 2613067 B2 JP2613067 B2 JP 2613067B2
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- Japan
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- osteocalcin
- monoclonal antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はオステオカルシン（以下OCと略称する）に対
して特異性を有するモノクローナル抗体及びその使用方
法に関する。
して特異性を有するモノクローナル抗体及びその使用方
法に関する。
OCは骨で生産されるビタミンＫ依存性カルシウム結合
蛋白である。OCの生理作用は造骨過程において重要な役
割を担つている。OCの生合成は骨組織、特に骨芽細胞で
行われ、骨代謝の良好な指標として骨の石灰化、異所石
炭化、骨転移、ベージエツト病、原発性副甲状腺機能亢
進症、オステオペニアの臨床診断上重要な測定意義を有
する。
蛋白である。OCの生理作用は造骨過程において重要な役
割を担つている。OCの生合成は骨組織、特に骨芽細胞で
行われ、骨代謝の良好な指標として骨の石灰化、異所石
炭化、骨転移、ベージエツト病、原発性副甲状腺機能亢
進症、オステオペニアの臨床診断上重要な測定意義を有
する。
この目的のため、P.A.プライスら〔P.A.Priceらプロ
シーデイング オブ ナシヨナルアカデミー オブ サ
イエンス オブ ザ USA（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）第
77巻、第2234頁（1980）〕によつてポリクローナル抗体
を用いたラジオイムノアツセイ法が開発され、ヒト血中
のOC濃度を測定することが可能となつた。また、ポリク
ローナル抗体を用いるエンザイムイムノアツセイ法も報
告されている〔H.タナカ（H.Tanaka）ら、ジャーナル
オブ イムノロジカル メソツズ（J.Immunol.Method
s）第94巻、第19頁（1986）〕。
シーデイング オブ ナシヨナルアカデミー オブ サ
イエンス オブ ザ USA（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）第
77巻、第2234頁（1980）〕によつてポリクローナル抗体
を用いたラジオイムノアツセイ法が開発され、ヒト血中
のOC濃度を測定することが可能となつた。また、ポリク
ローナル抗体を用いるエンザイムイムノアツセイ法も報
告されている〔H.タナカ（H.Tanaka）ら、ジャーナル
オブ イムノロジカル メソツズ（J.Immunol.Method
s）第94巻、第19頁（1986）〕。
しかしながらこれらの方法はポリクローナル抗体を用
いているため、感度、精度の面で満足なものでなく改良
が望まれている。
いているため、感度、精度の面で満足なものでなく改良
が望まれている。
本発明の目的は、ポリクローナル抗体の問題点のない
抗OCモノクローナル抗体及びその使用方法を提供するこ
とにある。
抗OCモノクローナル抗体及びその使用方法を提供するこ
とにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はIgGクラ
スに属し、 （ａ） OCのＣ末端アミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
OCのアミノ酸配列 （式中のGlaはγ−カルボキシグルタミン酸を示す）を
認識しない、 （ｂ） OCのアミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
OCのＣ末端アミノ酸配列 を認識しない、 のいずれかの性質を有するものであることを特徴とする
抗OCモノクローナル抗体に関し、また第２発明はOCの測
定方法に関する発明であつて、生体試料中のOCの免疫学
的測定に際して、上記第１の発明のIgGクラスに属する
抗OCモノクローナル抗体を使用することを特徴とする。
スに属し、 （ａ） OCのＣ末端アミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
OCのアミノ酸配列 （式中のGlaはγ−カルボキシグルタミン酸を示す）を
認識しない、 （ｂ） OCのアミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
OCのＣ末端アミノ酸配列 を認識しない、 のいずれかの性質を有するものであることを特徴とする
抗OCモノクローナル抗体に関し、また第２発明はOCの測
定方法に関する発明であつて、生体試料中のOCの免疫学
的測定に際して、上記第１の発明のIgGクラスに属する
抗OCモノクローナル抗体を使用することを特徴とする。
本発明者らは、前述した問題点を克服するため鋭意研
究を重ねた結果、細胞融合によりOCに対して特異性を有
するIgGクラスに属するモノクローナル抗体を取得する
ことに成功し、このモノクローナル抗体を用いれば、OC
を高感度で精度よく測定可能あることを見出し、本発明
を完成するに至つた。
究を重ねた結果、細胞融合によりOCに対して特異性を有
するIgGクラスに属するモノクローナル抗体を取得する
ことに成功し、このモノクローナル抗体を用いれば、OC
を高感度で精度よく測定可能あることを見出し、本発明
を完成するに至つた。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法
によつて製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイ
ブリドーマをクローン化し、OCに対し特異性を示す抗体
を産生するクローンを選択することによつて製造され
る。抗体産生細胞は例えばOCによつて免疫された動物か
らの脾細胞、リンパ節細胞リンパ球が使用できる。免疫
させる動物としては、マウス、ラツト、馬、ヤギ、ウサ
ギなどが例示される。抗原としては動物の骨由来のOCが
利用可能であり、例えば次のようにして製造され、免疫
に使用される。ウシ骨粉末をEDTA溶液で抽出し、ODSカ
ラムを用いたHPLCによりウシOCを精製する。かくして得
られたウシOCは例えばKLH（Keyhole limpet Hemocyani
n）に代表されるキヤリア蛋白と結合後、又はPVP（ポリ
ビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジユバン
ドと混合し、動物の免疫用として使用する。又はウシOC
を直接フロイントのアジユバントと混合し、動物の免疫
用として使用する。
によつて製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイ
ブリドーマをクローン化し、OCに対し特異性を示す抗体
を産生するクローンを選択することによつて製造され
る。抗体産生細胞は例えばOCによつて免疫された動物か
らの脾細胞、リンパ節細胞リンパ球が使用できる。免疫
させる動物としては、マウス、ラツト、馬、ヤギ、ウサ
ギなどが例示される。抗原としては動物の骨由来のOCが
利用可能であり、例えば次のようにして製造され、免疫
に使用される。ウシ骨粉末をEDTA溶液で抽出し、ODSカ
ラムを用いたHPLCによりウシOCを精製する。かくして得
られたウシOCは例えばKLH（Keyhole limpet Hemocyani
n）に代表されるキヤリア蛋白と結合後、又はPVP（ポリ
ビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジユバン
ドと混合し、動物の免疫用として使用する。又はウシOC
を直接フロイントのアジユバントと混合し、動物の免疫
用として使用する。
免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に20
〜200μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与するこ
とによつて行われる。最終免疫よりも約３〜５日後、免
疫動物から抗体産生細胞を分取する。
〜200μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与するこ
とによつて行われる。最終免疫よりも約３〜５日後、免
疫動物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由来のも
のが使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.Khle
rh）ネーチャー（Nature）第256巻、第495頁（1975）に
記載の方法又はこれに準ずる方法によつて行われる。こ
の際30〜50％ポリエチレングリコール（分子量1000〜40
00）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度反応さ
せることによつて行われる。
のが使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.Khle
rh）ネーチャー（Nature）第256巻、第495頁（1975）に
記載の方法又はこれに準ずる方法によつて行われる。こ
の際30〜50％ポリエチレングリコール（分子量1000〜40
00）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度反応さ
せることによつて行われる。
細胞融合によつて得られたハイブリドーマはスクリー
ニングに付される。すなわち、スクリーニングは酵素抗
体法等によつて行われる。得られた抗体産生ハイブリド
ーマはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブ
リドーマを例えば限界希釈法によつてクローニングを行
つてクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的
とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリ
ーニングに付され、例えば酵素抗体法等によつて行われ
る。選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を投与したB
ALB/Cマウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水か
らのモノクローナル抗体の回収はIgの精製法として従来
既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を
応用することで容易に達成される。
ニングに付される。すなわち、スクリーニングは酵素抗
体法等によつて行われる。得られた抗体産生ハイブリド
ーマはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブ
リドーマを例えば限界希釈法によつてクローニングを行
つてクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的
とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリ
ーニングに付され、例えば酵素抗体法等によつて行われ
る。選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を投与したB
ALB/Cマウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水か
らのモノクローナル抗体の回収はIgの精製法として従来
既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を
応用することで容易に達成される。
かくして得られた抗OCモノクローナル抗体は、生体由
来の試料、例れば血清、血しよう又は尿中のOCを特異的
に高感度で精度良く測定するために極めて好適である。
この測定のために、モノクローナル抗体そのもの又はそ
れからの相大する免疫学的特性を有するフラグメント、
例えばFabフラグメントを使用することができる。
来の試料、例れば血清、血しよう又は尿中のOCを特異的
に高感度で精度良く測定するために極めて好適である。
この測定のために、モノクローナル抗体そのもの又はそ
れからの相大する免疫学的特性を有するフラグメント、
例えばFabフラグメントを使用することができる。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ モノクローナル抗体の作製 （１） 抗原の精製 ウシ大腿骨を細砕し、0.5M EDTA（pH8）で骨蛋白を抽
出した。抽出懸濁液を遠心分離し、上清を凍結乾燥後OD
Sカラムを用いたHPLCでウシOCを精製した。
出した。抽出懸濁液を遠心分離し、上清を凍結乾燥後OD
Sカラムを用いたHPLCでウシOCを精製した。
（２） マウスの免疫 ウシOC2mgとKLH2mgを１−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−３−エチルカルボジイミド20mgを溶解させた50
mMリン酸緩衝液（pH7.4）3mlに加え、室温で１晩かくは
ん後、0.15M NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.4）に
対して透析した。透析内液をフロイントの完全アジユバ
ントと1:1（V/V）を割合でよく混合し、マウス１匹当り
ウシOCが80μｇとなるようにに腹腔内に免疫した。初回
免疫から14日後に40μｇのウシOCを含む上記混合物を腹
空内投与し、更にその18日後、ウシOC−KLHコンジユゲ
ートをアジユバントと混合せず腹腔内に最終免疫した。
ピル）−３−エチルカルボジイミド20mgを溶解させた50
mMリン酸緩衝液（pH7.4）3mlに加え、室温で１晩かくは
ん後、0.15M NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.4）に
対して透析した。透析内液をフロイントの完全アジユバ
ントと1:1（V/V）を割合でよく混合し、マウス１匹当り
ウシOCが80μｇとなるようにに腹腔内に免疫した。初回
免疫から14日後に40μｇのウシOCを含む上記混合物を腹
空内投与し、更にその18日後、ウシOC−KLHコンジユゲ
ートをアジユバントと混合せず腹腔内に最終免疫した。
（３） 細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスの脾臓を取出し、その脾細
胞とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し前記
ネーチヤー記載のケラーらの方法を用いて細胞融合を行
つた。次に、96ウエルマイクロプレートに植え込み、HA
T（ヒポキサンチン１×10-4M、アミノプテリン４×10-7
M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％FCS培地
（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサンチン
１×10-4M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％F
CS培地（HT培地）に移行し、更にフラスコ（25ml）に培
養できるようになつてからDMEM−10％FCS培地で培養し
た。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法により測定し、適切なウエルから限界希釈法によ
り、求めるハイブリドーマのクローニングを行つた。す
なわち、マクイロプレートにウエル当り約2.5×104個の
マウス胸腺細胞を植え込み、次にDMEM培地で５、１、0.
5個/0.1mlになるようにハイブリドーマを希釈し、これ
を上記マイクロプレートに0.1m/ウエルずつ植え込み培
養した。培養開始後10〜14日で肉眼で認められるコロニ
ーが形成され、クローン株を得た。
胞とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し前記
ネーチヤー記載のケラーらの方法を用いて細胞融合を行
つた。次に、96ウエルマイクロプレートに植え込み、HA
T（ヒポキサンチン１×10-4M、アミノプテリン４×10-7
M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％FCS培地
（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサンチン
１×10-4M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％F
CS培地（HT培地）に移行し、更にフラスコ（25ml）に培
養できるようになつてからDMEM−10％FCS培地で培養し
た。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法により測定し、適切なウエルから限界希釈法によ
り、求めるハイブリドーマのクローニングを行つた。す
なわち、マクイロプレートにウエル当り約2.5×104個の
マウス胸腺細胞を植え込み、次にDMEM培地で５、１、0.
5個/0.1mlになるようにハイブリドーマを希釈し、これ
を上記マイクロプレートに0.1m/ウエルずつ植え込み培
養した。培養開始後10〜14日で肉眼で認められるコロニ
ーが形成され、クローン株を得た。
（４） スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウエルの培養
上清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アツセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（E
LISA）法によりウシOCに対する抗体産生ハイブリドーマ
及びクローンを調べた。マイクロタイタープレートにウ
シOCを0.5μg/50μ／ウエルとなるように分注し、４
℃で18時間静置してウシOCを固相に吸着させた。10mMリ
ン酸緩衝食塩水（PBS）（pH7.4）200μで３回洗浄し
た後、１％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS100μ
／ウエルを加え、37℃で１時間静置し、各ウエルの未
吸着部分をブロツクした。次いで、検体である培養液を
50μ／ウエル加え37℃で１時間反応させた。0.05％ツ
イーン（Tween）−20を含むPBSで３回洗浄した後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスIgG（ICN社製）を50μ／ウ
エル添加し、37℃で１時間反応させた。ツイーン−20含
有PBSで洗浄し、0.001％過酸化水素、0.55mg/ml ABTS
〔2,2′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリン−
スルホネート）〕ベーリンガーマンハイム社製〕を含む
0.1Mクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH4.0）を加
え、波長410nmでの吸光度を測定した。検体中、ウシOC
に対する抗体が存在したウエルのみ発色がみられた。
上清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アツセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（E
LISA）法によりウシOCに対する抗体産生ハイブリドーマ
及びクローンを調べた。マイクロタイタープレートにウ
シOCを0.5μg/50μ／ウエルとなるように分注し、４
℃で18時間静置してウシOCを固相に吸着させた。10mMリ
ン酸緩衝食塩水（PBS）（pH7.4）200μで３回洗浄し
た後、１％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS100μ
／ウエルを加え、37℃で１時間静置し、各ウエルの未
吸着部分をブロツクした。次いで、検体である培養液を
50μ／ウエル加え37℃で１時間反応させた。0.05％ツ
イーン（Tween）−20を含むPBSで３回洗浄した後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスIgG（ICN社製）を50μ／ウ
エル添加し、37℃で１時間反応させた。ツイーン−20含
有PBSで洗浄し、0.001％過酸化水素、0.55mg/ml ABTS
〔2,2′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリン−
スルホネート）〕ベーリンガーマンハイム社製〕を含む
0.1Mクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH4.0）を加
え、波長410nmでの吸光度を測定した。検体中、ウシOC
に対する抗体が存在したウエルのみ発色がみられた。
この結果、抗体産生能の高いクローン株OC−G1、OC−
G2及びOC−３が得られた。
G2及びOC−３が得られた。
前記クローン株は、各々Hybridoma OC−G1と表示し微
工研菌寄第9696号（FERM P−9696）、Hybridoma OC−G2
と表示し微工研条寄第2077号（FERM BP−2077）、Hybri
doma OC−G3と表示し微工研条寄第2078号（FERM BP−20
78）として、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
工研菌寄第9696号（FERM P−9696）、Hybridoma OC−G2
と表示し微工研条寄第2077号（FERM BP−2077）、Hybri
doma OC−G3と表示し微工研条寄第2078号（FERM BP−20
78）として、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
（５） モノクローナル抗体の作製 ７週令以上のBALB/C系マウスにプリスタン（アルドリ
ツチ社製）0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過し
た後、培養、増殖させたクローン株１〜９×108個／マ
ウスを腹腔内接種した。10〜14日後にマウスを殺し、腹
水を採取した。これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜
15ml/匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。
ツチ社製）0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過し
た後、培養、増殖させたクローン株１〜９×108個／マ
ウスを腹腔内接種した。10〜14日後にマウスを殺し、腹
水を採取した。これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜
15ml/匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。
（６） モノクローナル抗体の精製 上記（５）によつて得られた腹水を脱脂綿で過して
脂肪を除き、50mMリン酸緩衝液（pH7.3）で２倍希釈し
た後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、沈澱画分を
分取した。この画分をなるべく少量の上記リン酸緩衝液
に溶解させ、同じ緩衝液に対して透析した。このサンプ
ルをDEAE−セルロースカラムにかけ、クローン株OC−G
1、OC−G2及びOC−G3から各々抗ウシOCモノクローナル
抗体OC−G1、OC−G2及びOC−G3を得た。
脂肪を除き、50mMリン酸緩衝液（pH7.3）で２倍希釈し
た後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、沈澱画分を
分取した。この画分をなるべく少量の上記リン酸緩衝液
に溶解させ、同じ緩衝液に対して透析した。このサンプ
ルをDEAE−セルロースカラムにかけ、クローン株OC−G
1、OC−G2及びOC−G3から各々抗ウシOCモノクローナル
抗体OC−G1、OC−G2及びOC−G3を得た。
（７） モノクローナル抗体の物理化学的性質 Igサブクラス OC−G1:IgG1 OC−G2:IgG2 OC−G3:IgG3 1/15Mリン酸緩衝食塩水（pH7.2）にアガロースを１％
加え、煮沸後スライドグラスに5mlのせ、固化した。直
径2.5mmの穴を5mm間隔で開け、各穴に腹水より精製した
モノクローナル抗体又はウサギで作成した各種マウスIg
サブクラスに対する抗血清を５μ入れた。スライドグ
ラスを湿潤箱に入れ、室温で18時間静置し、モノクロー
ナル抗体と抗マウスIgサブクラス血清を入れた２穴間に
生じた抗原抗体反応による沈降線の形成を観察した。
加え、煮沸後スライドグラスに5mlのせ、固化した。直
径2.5mmの穴を5mm間隔で開け、各穴に腹水より精製した
モノクローナル抗体又はウサギで作成した各種マウスIg
サブクラスに対する抗血清を５μ入れた。スライドグ
ラスを湿潤箱に入れ、室温で18時間静置し、モノクロー
ナル抗体と抗マウスIgサブクラス血清を入れた２穴間に
生じた抗原抗体反応による沈降線の形成を観察した。
分子量 OC−G1:145,000 OC−G2:145,000 OC−G.:146,000 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（12.5％）で
モノクローナル抗体の分子量を推定した。両抗体はIgG
であることから、Ｈ鎖とＬ鎖の分子量の合計の２倍をモ
ノクローナル抗体の分子量とした。分子量マーカーはバ
イオ−ラド（Bio−Rad）社のSDS−PAGE分子量スタンダ
ードーLow（リゾチーム14.4k、ダイズトリプシンインヒ
ビター21.5k、カルボニツクアンハイドラーゼ31k、オボ
アルブミン45k、ウシ血清アルブミン66.2k、ホスホリラ
ーゼB92.5k）を用いた。
モノクローナル抗体の分子量を推定した。両抗体はIgG
であることから、Ｈ鎖とＬ鎖の分子量の合計の２倍をモ
ノクローナル抗体の分子量とした。分子量マーカーはバ
イオ−ラド（Bio−Rad）社のSDS−PAGE分子量スタンダ
ードーLow（リゾチーム14.4k、ダイズトリプシンインヒ
ビター21.5k、カルボニツクアンハイドラーゼ31k、オボ
アルブミン45k、ウシ血清アルブミン66.2k、ホスホリラ
ーゼB92.5k）を用いた。
等電点 OC−G1:7.7〜7.3 OC−G2:7.2〜6.8 OC−G3:8.9〜8.7 精製モノクローナル抗体の等電点電気泳動を行つたと
ころ、上記のpIに相当するバンドが認められた。
ころ、上記のpIに相当するバンドが認められた。
抗原との結合部位 ウシOCをトリプシン（シグマ社製）とスタフイロコツ
カス アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテ
アーゼ（シグマ社製）で消化し、フラグメントに断片化
した。
カス アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテ
アーゼ（シグマ社製）で消化し、フラグメントに断片化
した。
各消化物はC18逆相HPLCにより分画し、6N HCl中130℃
で３時間酸加水分解を行つた後、アミノ酸組成分析を実
施し、フラグメントの固定を行つた。その結果を表１に
示す。トリブシン消化物からは、T1（１−19）、T2（21
−43）、T3（45−49）、スタフイロコツカス アウレウ
ス V8プロテアーゼ消化物からはV1（８−31）、V2（32
−40）、V3（41−45）、V4（46−49）が得られた。各分
画は、次に示す方法によつて、モノクローナル抗体の抗
原への結合部位の検索に使用した。
で３時間酸加水分解を行つた後、アミノ酸組成分析を実
施し、フラグメントの固定を行つた。その結果を表１に
示す。トリブシン消化物からは、T1（１−19）、T2（21
−43）、T3（45−49）、スタフイロコツカス アウレウ
ス V8プロテアーゼ消化物からはV1（８−31）、V2（32
−40）、V3（41−45）、V4（46−49）が得られた。各分
画は、次に示す方法によつて、モノクローナル抗体の抗
原への結合部位の検索に使用した。
まず、96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエル
にウシOCを５μg/50μ／ウエルとなるように分注し、
４℃で18時間静置して、固相に吸着させた。次にリン酸
緩衝食塩水（PBS）250μで３回洗浄した後、１％ウシ
血清アルブミン（BSA）を含むPBS100μ／ウエルを加
え、４℃で18時間静置し、各ウエルの未吸着部分をブロ
ツクした。PBS250μで３回洗浄した後、サンプル50μ
を添加した。サンプルは、西洋ワサビペルオキシター
ゼ（HRP）標識モノクトーナル抗体と、T1〜T3、V1〜V4
をそれぞれ４℃で20時間反応させたものを用いた。37℃
で２時間反応させた後、PBS250μで４回洗浄し、0.00
1％過酸化水素、0.55mg/ml ABTSを含む0.1Mクエン酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（pH4.0）を加え、波長410nmで
の吸光度を測定した。その結果、表２に示すように、HR
P標識モノクローナル抗体とフラグメントが結合してい
るために発色の低くなるフラグメントが存在することが
示された。すなわちOC−G1はT3（45−49）、V4（46−4
9）と結合し、OC−G2はT3（45−49）と結合し、OC−G3
はT2（21−43）、V1（８−31）と結合することより、OC
−G1の結合部位は46−49、OC−G2の結合部位は45−49、
OC−G3の結合部位は21−31であると決定した。
にウシOCを５μg/50μ／ウエルとなるように分注し、
４℃で18時間静置して、固相に吸着させた。次にリン酸
緩衝食塩水（PBS）250μで３回洗浄した後、１％ウシ
血清アルブミン（BSA）を含むPBS100μ／ウエルを加
え、４℃で18時間静置し、各ウエルの未吸着部分をブロ
ツクした。PBS250μで３回洗浄した後、サンプル50μ
を添加した。サンプルは、西洋ワサビペルオキシター
ゼ（HRP）標識モノクトーナル抗体と、T1〜T3、V1〜V4
をそれぞれ４℃で20時間反応させたものを用いた。37℃
で２時間反応させた後、PBS250μで４回洗浄し、0.00
1％過酸化水素、0.55mg/ml ABTSを含む0.1Mクエン酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（pH4.0）を加え、波長410nmで
の吸光度を測定した。その結果、表２に示すように、HR
P標識モノクローナル抗体とフラグメントが結合してい
るために発色の低くなるフラグメントが存在することが
示された。すなわちOC−G1はT3（45−49）、V4（46−4
9）と結合し、OC−G2はT3（45−49）と結合し、OC−G3
はT2（21−43）、V1（８−31）と結合することより、OC
−G1の結合部位は46−49、OC−G2の結合部位は45−49、
OC−G3の結合部位は21−31であると決定した。
実施例２モノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法EI
AによるOCの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体OC−G2、OC−G3を
用いてOC測定試薬を調製した。
AによるOCの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体OC−G2、OC−G3を
用いてOC測定試薬を調製した。
（１） 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識モノ
クローナル抗体の作製 ニユーヨーク市、アラン Ｒ リス インコーポレー
テツド（Alan R Liss Inc.）1979年発行、P.K.ナカネ
（P.K.Nakane）著「イムノアツセイス イン ザ クリ
ニカル ラボラトリー」（Immunoassays in the Clinic
al Laboratory）第81頁に記載の方法に準じて行つた。H
RP（ベーリンガーマンハイム社製）4mgを1mgの蒸留水に
溶かし、0.1M過ヨウ素酸ソーダ0.2mlを加えて室温で20
分間反応させた後、1mM酢酸ソーダ緩衝液（pH4）に対し
て１晩透析する。0.2M炭酸ソーダ緩衝液（pH8.5）0.02m
lを加えてpH9〜9.5にすると同時にモノクローナル抗体O
C−G3 8mg/ml〔0.01M炭酸ソーダ緩衝液（pH9.5）に対し
て透析したもの〕を加える。室温で２時間反応させた
後、水素化ホウ素ソーダ4gm/mlを0.1ml加えて４℃で２
時間反応させる。これをセフアデツクス（Sephadex）Ｇ
−100カラムでゲル過し、0.1M NaClを含む0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液pH7.5で溶出させ、HRP標識OC−G3モノ
クローナル抗体を分取した。
クローナル抗体の作製 ニユーヨーク市、アラン Ｒ リス インコーポレー
テツド（Alan R Liss Inc.）1979年発行、P.K.ナカネ
（P.K.Nakane）著「イムノアツセイス イン ザ クリ
ニカル ラボラトリー」（Immunoassays in the Clinic
al Laboratory）第81頁に記載の方法に準じて行つた。H
RP（ベーリンガーマンハイム社製）4mgを1mgの蒸留水に
溶かし、0.1M過ヨウ素酸ソーダ0.2mlを加えて室温で20
分間反応させた後、1mM酢酸ソーダ緩衝液（pH4）に対し
て１晩透析する。0.2M炭酸ソーダ緩衝液（pH8.5）0.02m
lを加えてpH9〜9.5にすると同時にモノクローナル抗体O
C−G3 8mg/ml〔0.01M炭酸ソーダ緩衝液（pH9.5）に対し
て透析したもの〕を加える。室温で２時間反応させた
後、水素化ホウ素ソーダ4gm/mlを0.1ml加えて４℃で２
時間反応させる。これをセフアデツクス（Sephadex）Ｇ
−100カラムでゲル過し、0.1M NaClを含む0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液pH7.5で溶出させ、HRP標識OC−G3モノ
クローナル抗体を分取した。
（２） サンドイツチ法EIA測定系 96ウエル マイクロタイタープレートの各ウエルにPB
Sに溶解したモノクローナル抗体OC−G2（50μg/ml）を5
0μずつ添加し、４℃で１晩インキユベートし、溶液
を捨てた後、１％BSAを含むPBS溶液を100μずつ各ウ
エルに添加し、37℃で１時間ブロツキングを行つた。PB
Sでよく洗浄したのち、サンプル50μを添加し37℃で
１時間反応させ、PBSで３回洗浄し、１％BSAを含むPBS
で希釈したHRP標識OC−G3モノクローナル抗体液50μ
を添加して37℃で１時間反応させた。PBSで３回洗浄し
たのち、0.001％過酸化水素、0.55mg/ml ABTSを含む0.1
Mクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH4.0）を加え、
波長410nmでの吸光度を測定した。
Sに溶解したモノクローナル抗体OC−G2（50μg/ml）を5
0μずつ添加し、４℃で１晩インキユベートし、溶液
を捨てた後、１％BSAを含むPBS溶液を100μずつ各ウ
エルに添加し、37℃で１時間ブロツキングを行つた。PB
Sでよく洗浄したのち、サンプル50μを添加し37℃で
１時間反応させ、PBSで３回洗浄し、１％BSAを含むPBS
で希釈したHRP標識OC−G3モノクローナル抗体液50μ
を添加して37℃で１時間反応させた。PBSで３回洗浄し
たのち、0.001％過酸化水素、0.55mg/ml ABTSを含む0.1
Mクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH4.0）を加え、
波長410nmでの吸光度を測定した。
（３） 測定系の感度 各種濃度のウシOC（0.05〜10ng/ml）を用いて作製し
た検量線を第１図に示す。すなわち第１図は、本発明の
モノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法EIAによるO
C測定の感度と精度を、ウシOC濃度（ng/ml、横軸）と41
0nmにおける吸光度（縦軸）との関係で示す図である。
た検量線を第１図に示す。すなわち第１図は、本発明の
モノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法EIAによるO
C測定の感度と精度を、ウシOC濃度（ng/ml、横軸）と41
0nmにおける吸光度（縦軸）との関係で示す図である。
第１図に示す結果から、本発明の測定方法を用いれ
ば、0.1ng/mlまで精度良く測定可能であることが明らか
である。
ば、0.1ng/mlまで精度良く測定可能であることが明らか
である。
以上詳細に説明した通り、本発明によりOCに対するモ
ノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用することにより、精度及び感度の高いOCの
微量定量が可能となり、OCの生理作用の研究、骨代謝に
おけるOCの役割の解明などに非常に有用である。
ノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用することにより、精度及び感度の高いOCの
微量定量が可能となり、OCの生理作用の研究、骨代謝に
おけるOCの役割の解明などに非常に有用である。
第１図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ツチ法EIAによるOC測定の感度と精度を示す図である。
ツチ法EIAによるOC測定の感度と精度を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日野 文嗣 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−263999（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−146154（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】IgGクラスに属し、 （ａ） オステオカルシンのＣ末端アミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
オステオカルシンのアミノ酸配列 （式中のGlaはγ−カルボキシグルタミン酸を示す）を
認識しない、 （ｂ） オステオカルシンのアミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
オステオカルシンのＣ末端アミノ酸配列 を認識しない、 のいずれかの性質を有するものであることを特徴とする
抗オステオカルシンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】生体試料中のオステオカルシンの免疫学的
測定に際して、IgGクラスに属し、 （ａ） オステオカルシンのＣ末端アミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
オステオカルシンのアミノ酸配列 （式中のGlaはγ−カルボキシグタミン酸を示す）を認
識しない、 （ｂ） オステオカルシンのアミノ酸配列 の少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識し、
オステオカルシンのＣ末端アミノ酸配列 を認識しない、 のいずれかの性質を有する抗オステオカルシンモノクロ
ーナル抗体を使用することを特徴とするオステオカルシ
ンの測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62318564A JP2613067B2 (ja) | 1987-12-18 | 1987-12-18 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
| DE19883842498 DE3842498A1 (de) | 1987-12-18 | 1988-12-16 | Verfahren zur erkennung von krankheiten und hierfuer verwendbare monoklonale antikoerper |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62318564A JP2613067B2 (ja) | 1987-12-18 | 1987-12-18 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01160493A JPH01160493A (ja) | 1989-06-23 |
| JP2613067B2 true JP2613067B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=18100541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62318564A Expired - Fee Related JP2613067B2 (ja) | 1987-12-18 | 1987-12-18 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2613067B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2558956B2 (ja) * | 1989-02-10 | 1996-11-27 | 帝人株式会社 | ヒト・オステオカルシンの免疫学的測定方法、そのための試薬及びキツト、ヒト・オステオカルシンに対する抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを産生する方法 |
| US5506111A (en) * | 1989-02-10 | 1996-04-09 | Teijin Limited | Method of immunological assaying of human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody to human osteocalcin, hybridoma producing said antibody, and method of producing it |
| EP0646794A1 (en) * | 1989-02-10 | 1995-04-05 | Teijin Limited | Method of immunological assaying of human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody to human osteocalcin, hybridoma producing said antibody, and method of producing it |
| JP2559907B2 (ja) * | 1990-12-27 | 1996-12-04 | 帝人株式会社 | ヒト・オステオカルシンフラグメントに対する抗体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60146154A (ja) * | 1984-01-11 | 1985-08-01 | Eisai Co Ltd | オステオカルシン関連誘導体 |
| JPH0633317B2 (ja) * | 1985-05-20 | 1994-05-02 | 旭化成工業株式会社 | 新規ペプチド |
-
1987
- 1987-12-18 JP JP62318564A patent/JP2613067B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01160493A (ja) | 1989-06-23 |
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