JP2971667B2 - 光学活性α−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸エステル類またはヒドロキシアセタール類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、吸水性ポリマーに固定
化した酵素を用いる光学活性α−もしくはβ−ヒドロキ
シカルボン酸エステル類またはヒドロキシアセタール類
の製造法に関する。

【０００２】光学活性α−もしくはβ−ヒドロキシカル
ボン酸エステル類またはヒドロキシアセタール類は、医
農薬品、香料をはじめとする種々の有機化学製品の中間
体もしくは、製造原料として重要な化合物である。

【０００３】このように医薬品および香料の原料・中間
体となる例としては、アンジオテンシン変換酵素を阻害
する血圧降下剤であるサラザブリル（ロッシュ社（スイ
ス）製）、エナラプリル（メルク社（米国）製）、ベン
ザプリル（チバガイギー社（スイス）製）およびデラプ
リル（武田薬品（株））の製造原料となる（Ｒ）−４−
フェニル−２−ヒドロキシブタン酸およびそのエステル
（特開平2-16987 、WO890717）、ペネム系抗生物質の合
成中間体である4-アセトキシアゼチジノンの製造原料と
なる（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸およびそのエステ
ル（テトラヘドロン レターズ(Tetrahedron Lett.) ，
26，4647(1985)）、代謝性医薬品である塩化レボカルニ
チンの製造原料となる（Ｒ）−３−クロロ乳酸およびそ
のエステル（有機合成化学協会誌，45，331(1987) ）、
抗菌活性を示す天然物である、グラハミマイシンＡ_１(g
rahamiycin A₁ ）の合成中間体となる（Ｓ）−１−
（１，３−ジチアン−２−イル）−２−ヒドロキシプロ
パンおよび（Ｓ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒドジ
メチルアセタール（テトラヘドロン レターズ，24，28
7(1983))、ビタミンＥおよび香料であるムスコンの原料
となる（Ｓ）−（＋）−３−ヒドロキシ−２−メチルプ
ロパン酸およびそのエステル（ヘルペティカ キミカ
アクタ(Helv. Chim. Acta)，60，925(1977) およびジャ
ーナル オブ オーガニック ケミストリー(J. Org. C
hem)，41，3505(1976)）などがあげられる。

【０００４】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従
来、光学活性なα−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸
エステル類またはヒドロキシアセタール類を製造する方
法としては、脱水素酵素を用いた方法があり、 １）ゲオトリカム・キャンディウム由来のグリセロール
脱水素酵素と補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下、ＮＡＤ^＋と略す）による方法（テト
ラヘドロン レターズ，29，2453(1988)）および ２）ウマ肝臓由来のアルコール脱水素酵素とＮＡＤ^＋に
よる方法（ジャーナルオブ アメリカン ケミカル ソ
サイエティー(J. Am. Chem. Soc.) ，104 ，4458(198
2)）などが報告されている。しかしながら、これらの方
法は、水溶液中で行なうため基質が溶解しにくく、前記
の一般式(I) や(II)の化合物がエステル基の加水分解お
よび重合を伴う欠点があり、改良法として ３）基質の溶解性を考慮した、有機溶媒と水溶液を混合
して用いる４−クロロ−３−オキソブタン酸エステルの
還元反応（アプライド エンバイロンメンタルマイクロ
バイオロジー(Appl. Environ. Microbiol.) ，56，2374
(1990)が報告されている。

【０００５】しかしながらこの方法では、有機溶媒の使
用により脱水素酵素が失活するため、反応後、水溶液中
の脱水素酵素は活性が低下し、工業的に再利用すること
は困難である。脱水素酵素や補酵素は高価であり固定化
などの処理による再利用が望まれるが、固定化の一般的
手法としては、 ４）アクリルアミドとＮ−アクリロキシコハク酸イミド
との重合物によるウマ肝臓由来のアルコール脱水素酵素
の固定化法（ジャーナル オブ アメリカン ケミカル
ソサイエティー，102 ，6234(1980)）、 ５）ＮＡＤ^＋のアデニン環の６位の窒素にアミノエチル
基を導入し、これをスペーサーとし、カルボキシル基を
有するポリエチレングリコールに脱水アミド化により結
合させる方法（ジャーナル オブ アプライド バイオ
ケミストリー(J.Appl. Biochem.) ，３，301(1981)
）、 ６）ＮＡＤ^＋のアデニン環の６位の窒素にモノマー側鎖
を導入し、アクリルアミド類と共重合させる方法（バイ
オケミストリー(Biochem.)，62，629(1980) ）などが報
告されており、４）の方法でえられる固定化酵素は前記
の一般式(III) で表わされるα−ケトアセタールである
ピルビンアルデヒドジメチルアセタールの不斉還元に用
いられている（ジャーナル オブ アメリカン ケミカ
ル ソサイエティー，107 ，4028（1985））。

【０００６】しかしながら４）〜６）の方法において
は、酵素や補酵素の失活および煩雑な操作を伴うため、
脱水素酵素および補酵素の簡便な固定化法が望まれてい
た。

【０００７】本発明はかかる実情に鑑み、医農薬品およ
び香料をはじめとする種々の有機化学製品の中間体もし
くは製造原料として重要な化合物である、光学活性なα
−またはβ−ヒドロキシカルボン酸エステル類およびア
セタール類の、簡便でかつ経済性にすぐれた製造法を提
供することを目的とする。

【０００８】本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意
検討を重ねた結果、α−もしくはβ−ケトエステル類ま
たはケトアセタール類を原料とし、脱水素酵素および補
酵素を水または緩衝液に溶解させ吸水性ポリマーに固定
化した固定化触媒に接触させ、有機溶媒中で立体選択的
にαまたはβ位のカルボニル基の還元反応を行なうこと
で、光学活性α−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸エ
ステル類またはヒドロキシアセタール類をえることがで
き、かつ、固定化した酵素や補酵素の再利用、該固定化
酵素によるカラム方式の連続反応も可能であることを見
出し、本発明を完成するにいたった。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は一般式(I) ：

【００１０】

【化４】

【００１１】（式中、Ｒ、Ｒ′およびＲ″は同一または
相異なり、直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアル
キル基、直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアルケ
ニル基、芳香族基、ハロゲン原子または水素原子を表わ
すが、Ｒ″はハロゲン原子ではなく、ａは０、１または
２を、ｂは０または１を表わす）、一般式(II)：

【００１２】

【化５】

【００１３】（式中、Ｒは前記と同じであるが、ハロゲ
ン原子ではなく、ｎは３または４を表わす）または一般
式(III) ：

【００１４】

【化６】

【００１５】（式中、Ｒ、Ｒ′、ａおよびｂは前記と同
じ、Ｒ¹ およびＲ² は同一または相異なり、直鎖もしく
は分岐鎖状の炭素数１〜18のアルキル基、またはいっし
ょになって−（ＣＨ₂ ）_k −（式中ｋは２または３）で
示される環を形成し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表
わす）で示されるα−もしくはβ−ケトエステル類また
はケトアセタール類を、有機溶媒中で一級または二級ア
ルコールを還元剤とし、水または緩衝液に溶解させた脱
水素酵素および補酵素を吸水性ポリマーに固定化してな
る固定化酵素に接触せしめることにより、立体選択的に
αまたはβ位のカルボニル基を還元することを特徴とす
る、光学活性α−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸エ
ステル類またはヒドロキシアセタール類の製造法に関す
る。

【００１６】

【実施例】本発明においては、一般式(I) ：

【００１７】

【化７】

【００１８】（式中、Ｒ、Ｒ′およびＲ″は同一または
相異なり、直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアル
キル基、直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアルケ
ニル基、芳香族基、ハロゲン原子または水素原子を表わ
すが、Ｒ″はハロゲン原子ではなく、ａは０、１または
２を、ｂは０または１を表わす）、一般式(II)：

【００１９】

【化８】

【００２０】（式中、Ｒは前記と同じであるが、ハロゲ
ン原子ではなく、ｎは３または４を表わす）または一般
式(III) ：

【００２１】

【化９】

【００２２】（式中、Ｒ、Ｒ′、ａおよびｂは前記と同
じ、Ｒ¹ およびＲ² は同一または相異なり、直鎖もしく
は分岐鎖状の炭素数１〜18のアルキル基、またはいっし
ょになって−（ＣＨ₂ ）_k −（式中ｋは２または３）で
示される環を形成し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表
わす）で示されるα−もしくはβ−ケトエステル類また
はケトアセタール類を、吸水性ポリマーに固定化した酵
素および補酵素と反応させることにより、αまたはβ位
のカルボニル基を立体選択的にヒドロキシル基に変換
し、光学活性α−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸エ
ステル類またはヒドロキシアセタール類（以下、ヒドロ
キシチオアセタール類も含む）がえられる。

【００２３】本発明において、Ｒ、Ｒ′、Ｒ″で表わさ
れる置換基の例としては、水素原子のほか、メチル基、
エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イ
ソブチル基、ステアリル基などのアルキル基、ビニル
基、アリル基、イソプロペニル基などのアルケニル基、
フェニル基、４−メトキシフェニル基、４−クロロフェ
ニル基などの芳香族、塩素原子、臭素原子などのハロゲ
ン原子などをあげることができる。また、Ｒ¹ およびＲ
² で表わされる置換基の例としては、メチル基、エチル
基、プロピル基などのアルキル基、そして環状構造を形
成するエチレン基、プロピレン基などをあげることがで
きる。

【００２４】本発明で用いることのできる脱水素酵素と
しては、スポロボロミセテス(Sporobolomycetes)属、エ
ンテロバクター(Enterobacter)属、クリプトコッカス(C
ryptococcus)属、スポロトリカム(Sporotrichum)属、テ
ルモアネーロビウム(Thermoanaerobium)属、ラクトバチ
ルス(Lactobacillus) 属、アピオトリカム(Apiotrichu
m) 属、キャンディダ(Candida) 属、トルロプシス(Toru
lopsis)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、サッカ
ロマイシス(Saccharomyces) 属、ロドスポリディウム(R
hodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、クレブシエラ(K
lebsiella)属、ロドコッカス(Rhodococcus) 属、ロドト
ルラ(Rhodotorula) 属、パラコッカス(Paracoccus)属、
ノルカディオアイデス(Nocardioides)属、ゲオトリカム
(Geotrichum)属、クロエケラ(Kloeckera) 属、ノカルデ
ィア(Nocardia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcu
s)属、サーマス(Thermus) 属、エアロバクター(Aerobac
ter)属、バチルス(Bacillus)属、セルロモナス(Cellulo
monas)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、ロイコ
ノストック(Leuconostoc) 属、プロテウス(Proteus)属
に属する微生物の生産する脱水素酵素、ブタ心臓、ブタ
筋肉、ウサギ筋肉、ウマ肝臓、ウシ心臓もしくはトリ心
臓由来の脱水素酵素またはパン酵母の生産する脱水素酵
素などがあげられ、α−もしくはβ−ケトエステル類ま
たはケトアセタール類のα位またはβ位のカルボニル基
を立体選択的に還元しうるものであればどのようなもの
でもよいが、すぐれた脱水素酵素という点で、好適な例
としては、ゲオトリカム・キャンディウム由来のグリセ
ロール脱水素酵素（天野製薬（株）製）、ノカルディア
属由来のコレステロール脱水素酵素（たとえば、ＣＨＤ
Ｈ「アマノ」天野製薬（株）製、商品名）、スタフィロ
コッカス属由来のラクテート脱水素酵素（たとえば、Ｌ
ＤＨ「アマノ」天野製薬（株）製、商品名）、サーマス
属由来のマレート脱水素酵素（たとえば、ＭＤＨ「アマ
ノ」天野製薬（株）製、商品名）、バチルス属由来のグ
ルコース脱水素酵素（たとえば、ＧＬＵＣＤＨ「アマ
ノ」天野製薬（株）製、商品名）、ラクトバチルス ラ
イヒマンニ由来のＤ−酪酸脱水素酵素（シグマ製）、ウ
マ肝臓由来のアルコール脱水素酵素（シグマ製）などが
あげられる。

【００２５】これらの酵素は、それぞれ単独でも、ある
いは必要に応じてゲオトリカム・キャンディウム由来の
グリセロール脱水素酵素、ノルカディア属由来のコレス
テロール脱水素酵素、スタフィロコッカス属由来のラク
テート脱水素酵素、サーマス属由来のマレート脱水素酵
素などの補酵素再生用酵素と、ウマ肝臓由来のアルコー
ル脱水素酵素、ウサギ筋肉由来のＬ−乳酸脱水素酵素、
ラクトバチルス属由来のＤ−乳酸水素酵素などの基質還
元用酵素とを混合して用いることもできる。これらの酵
素は、それらを生産する微生物を培養することによって
えられるが、吸水性ポリマーに固定化するさいに菌体培
養液をそのまま用いても、粗酵素、精製酵素として用い
てもよい。

【００２６】また、本発明で用いることのできる補酵素
としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などがあげ
られる。

【００２７】また、固定化に用いる吸水性ポリマーは、
保水性があり、酵素および補酵素の活性が保持されれ
ば、どのようなものでもよいが、たとえば、アニオン性
およびカチオン性高分子吸水性樹脂があげられる。アニ
オン性吸水性樹脂としては、アクリル酸重合体、メタク
リル酸重合体、多糖類−アクリル酸またはメタアクリル
酸グラフト共重合物、アクリル酸またはメタアクリル−
アクリルアミド−スルホン化アクリルアミド３元共重合
体または、これらのアルカリ金属塩もしくはアルカリ土
類金属塩、たとえばアクリル酸またはアクリル酸塩重合
体、アクリル酸またはアクリル酸塩−メタクリル酸また
はメタクリル酸塩共重合体、でんぷん−アクリル酸また
はアクリル酸塩グラフト共重合体、多糖類−アクリル酸
またはメタアクリル酸アルキルエステルグラフト共重合
体のケン化物、多糖類−アクリロニトリルグラフト共重
合体のケン化物、多糖類−アクリルアミド共重合体のケ
ン化物、アクリル酸アルキルエステルまたはメタアクリ
ル酸アルキルエステル−酢酸ビニル共重合体のケン化
物、でんぷん−アクリロニトリル−アクリルアミド−２
−メチルプロパンスルホン酸グラフト共重合体のケン化
物、でんぷん−アクリロニトリル−ビニルスルホン酸グ
ラフト共重合体のケン化物、ナトリウムカルボキシメチ
ルセルロースなどがあげられるが、アクリル酸、メタア
クリル酸、これらのアルカリ金属塩もしくはアルカリ土
類金属塩、またはこれらのエステルの代わりに、一般式
(IV)：

【００２８】

【化１０】

【００２９】（式中、−ＳＯ₃ Ｒ³ 基の置換位置は２
−，３−あるいは４−位で、Ｒ³ は直鎖もしくは分岐鎖
状の炭素数１〜18のアルキル基、水素原子、または、ア
ルカリ金属もしくはアルカリ土類金属を表わし、ａは０
または１を表わす）で示されるスルホン酸類またはその
誘導体を用いてもよい。また、これらは、単独でも２種
以上混合して用いてもよく、架橋物として用いることも
できる。

【００３０】また、カチオン性吸水性樹脂としては、一
般式(V) ：

【００３１】

【化１１】

【００３２】（式中、Ｒ⁴ は水素またはメチル基、Ｒ⁵
は直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアルキル基ま
たは水素原子を表わし、ｊは１、２、３、４または５
を、Ｙは酸素原子もしくは窒素原子を表わし、Ｚはスル
ホン酸イオンまたはハロゲンイオンを表わす）で示され
るアンモニウム塩の重合体または、Ｎ−アルキル−アク
リルアミドもしくはＮ−アルキル−メタクリルアミドと
の共重合体などがあげられる。市販品としては、アクア
リック（日本触媒（株）製、商品名）、ポイズおよびワ
ンダーゲル（花王（株）製、商品名）、アクアキープ
（住友精化（株）製、商品名）、アラソープ（荒川化学
（株）製、商品名）、ダイヤウェット（三菱油化（株）
製、商品名）、スミカゲル（住友化学（株）製、商品
名）、サンウェット（三洋化成（株）製、商品名）、Ｐ
Ｑポリマー（大阪有機化学工業（株）製、商品名）など
があるが、好適なものとしては、ＰＱポリマー（グレー
ド：ＢＬ−100 ）（大阪有機化学工業（株）製）（特開
昭63-56512）、アクアキープおよびワンダーゲルなどが
あげられる。

【００３３】また、還元剤であるアルコールは、脱水素
酵素によって酸化され、補酵素による基質のカルボニル
基の還元を阻害しないならば、どのようなものでもよい
が、たとえば、一般式(VI)：

【００３４】

【化１２】

【００３５】（式中、Ｒ⁶ は直鎖もしくは分岐鎖状の炭
素数１〜18のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状の炭素
数１〜18のアルケニル基、芳香族基または水素原子を表
わし、Ｒ⁷ はＲ⁶ もしくは−ＣＯＯＲ⁶ を表わし、ａは
０または１を表わす）または、一般式(VII) ：

【００３６】

【化１３】

【００３７】（式中、ａは前記と同じ、ｊは１、２、
３、４または５を表わす）で示される一級もしくは二級
アルコールであり、好適なものとしては、エタノール、
プロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、シク
ロペンタノール、シクロヘキサノール、乳酸エステルな
どがあげられる。

【００３８】また、固定化の際に水または緩衝液が用い
られるが、緩衝液としては、通常用いられるリン酸ナト
リウム、リン酸カリウムのごとき無機酸塩の緩衝液、酢
酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムのごとき有機酸塩の
緩衝液などがあり、ｐＨは、使用する酵素の最適ｐＨに
合わせることが好ましい。

【００３９】固定化酵素は、脱水素酵素および補酵素を
溶解させた水または緩衝液を吸水性ポリマーに浸透させ
ることによりえられる。水または緩衝液中の脱水素酵素
および補酵素の濃度、そして吸水性ポリマーの使用量
は、一般式(I) 、(II)または(III) で表わされる基質の
還元および補酵素の再生が円滑に進行するならばとくに
限定されない。脱水素酵素の濃度は、一般には１×10^-4
〜0.1 ユニット／ｌ、好ましくは１×10^-3〜0.1 ユニッ
ト／ｌ、補酵素の濃度は、一般には１×10^-3〜10モル／
ｌ、好ましくは0.05〜５モル／ｌ、そして吸水性ポリマ
ーの使用量は、水または緩衝液に対し、0.1 〜100wt
％、好ましくは１〜10wt％である。

【００４０】本発明の方法において用いられる有機溶媒
は、一般式(I) 、(II)または(III)で示される基質とな
るエステル、アセタールまたはチオアセタール類を溶解
し、脱水素酵素や補酵素の活性を阻害しないという要件
を満たす限りとくに限定されない。このような有機溶媒
は、炭化水素、ハロゲン系炭化水素、芳香族炭化水素、
ハロゲン系芳香族炭化水素、アルキルもしくは芳香族エ
ーテル類、アルキルもしくは芳香族ニトリル類、または
アルキルもしくは芳香族エステル類などであり、単独で
も混合して用いてもよく、これらの例としては、ｎ−ペ
ンタン、シクロペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサ
ン、四塩化炭素、ジクロロメタン、トルエン、ベンゼ
ン、クロロベンゼン、イソプロピルエーテル、プロピオ
ニトリルおよび酢酸ブチルなどがあげられるが、好適な
ものとしては、ｎ−ペンタン、シクロペンタン、ｎ−ヘ
キサン、シクロヘキサン、ベンゼンおよびトルエンがあ
げられる。

【００４１】一般式(I) 、(II)または(III) で表わされ
る基質に対する、還元剤であるアルコールの使用比率、
固定化触媒の使用量、および有機溶媒の使用量は、上記
基質の還元および補酵素の再生が円滑に進行するならば
とくに限定されない。還元剤であるアルコールの使用比
率は1.0 〜1.5 モル当量、固定化触媒の使用量は一般に
は１〜1000g ／モル、好ましくは100 〜500g／モルであ
る。また有機溶媒は、上記基質の濃度が一般には0.1 〜
50wt％、好ましくは１〜15wt％となるように用いること
が望ましい。

【００４２】反応温度は、酵素の活性が維持される範囲
内であれば、どのような温度でもよいが、耐熱性菌より
えられた酵素のばあいには０〜90℃であり、一般酵素の
ばあいには０〜60℃である。反応時間は、数日間要して
もよく、とくに限定されることはないが、一般的には１
〜30時間である。

【００４３】反応の経時および終点は、高速液体クロマ
トグラフィーあるいはガスクロマトグラフィーにより確
認することができる。

【００４４】吸水性ポリマーにより固定化した酵素およ
び補酵素は反応後も活性を有し、バッチ方式では回収し
た固定化酵素の再使用が可能であり、またカラム方式で
も固定化酵素を充填剤として連続して反応を行なうこと
ができる。

【００４５】バッチ方式のばあい、反応終了後、反応液
と固定化酵素を分離し、濃縮を行ない、蒸留あるいはカ
ラムクロマトグラフィーなどの常法を適用することによ
り、光学活性α−もしくはβ−ヒドロキシエステルまた
はヒドロキシアセタールを精製、取得することができ
る。

【００４６】カラム方式のばあい、一般式(I) 、(II)ま
たは(III) で表わされる原料を溶解させた上記有機溶媒
と一般式(VI)または(VII) で表わされるアルコールと
を、固定化酵素を単独あるいは他の充填剤とともに充填
したカラムに加圧下で注入し、カラムより流出する反応
が完結した反応液を濃縮し、蒸留あるいはカラムクロマ
トグラフィーなどの常法を適用することにより、光学活
性α−もしくはβ−ヒドロキシエステルまたはヒドロキ
シアセタールを精製、取得することができる。反応が効
率良く進行しかつ反応液が流出するためには、固定化酵
素は他の充填剤とともに混合して用いることが望まし
く、用いられるその他の充填剤は脱水素酵素および補酵
素の活性を阻害しないという要件を満たす限りとくに限
定されない。このような充填剤としては、カラム分取用
のシリカゲル、酸性、塩基性および中性アルミナ、陽イ
オンおよび陰イオン交換樹脂、セライト、石英砂および
海砂などであり、これらは単独でも混合して用いてもよ
く、好適な例としてはシリカゲル（200 〜300 メッシ
ュ）（和光純薬工業（株）製）、セライト(521) （アル
ドリッチ社（米国）製）などがあげられる。

【００４７】以下、本発明を実施例に基づいて説明する
が、本発明はもとよりこれらの実施例にのみ限定される
ものではない。

【００４８】実施例１ （固定化酵素の調製）脱水素酵素（1040ユニット）とニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）（所
定量）を含むトリス緩衝液（ｐＨ8.0 ）（100ml ）に、
吸水性ポリマー（6.00g ）を加え、固定化酵素をえた。

【００４９】（反応）ピルビン酸ブチル(2.88g、0.02モ
ル）とシクロペンタノール(1.89g、0.022 モル）を溶解
させた有機溶媒（400ml)中に、前記の調製した固定化酵
素を加え、35℃で振とうした。ガスクロマトグラフィー
で反応終了を確認したのち、ろ過により固定化酵素を除
き、有機溶媒を留去し、えられた油状物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ）−乳酸ブチル
をえた。

【００５０】（Ｒ）−乳酸ブチルの光学純度は、光学活
性２−メトキシ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸
クロリドで、ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロ
マトグラフィー分析により求めた。えられた化合物の収
率、光学純度（％e.e.）は表１に示すとおりであった。

【００５１】また、えられた化合物の沸点、旋光度、^１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。

【００５２】沸点：71−72℃（10Torr）

【００５３】

【数１】

【００５４】^１Ｈ−ＮＭＲ（200 ＭＨｚ、ＣＤＣｌ
₃ 中、δ値(ppm) ）：0.93（ｔ，３Ｈ）、1.20〜2.14
（ｍ，７Ｈ）、3.02〜3.28（ｂｓ，１Ｈ）、4.03〜4.53
（ｍ，３Ｈ）

【００５５】

【表１】

【００５６】実施例２ ピルビン酸エチル（2.32g 、0.02モル）と２−プロパノ
ール（1.32g 、0.022モル）を溶解させた有機溶媒（400
ml)中に、実施例１と同様の方法で調製した固定化酵素
を加え、35℃で振とうした。ガスクロマトグラフィーで
反応終了を確認したのち、ろ過により固定化酵素を除
き、有機溶媒を留去し、えられた油状物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ）−乳酸エチル
をえた。

【００５７】（Ｒ）−乳酸エチルの光学純度は、光学活
性２−メトキシ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸
クロリドで、ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロ
マトグラフィー分析により求めた。えられた化合物の収
率、光学純度（％e.e.）は、表２に示すとおりであっ
た。

【００５８】また、えられた化合物の旋光度、^１Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルデータを以下に示す。

【００５９】沸点：69−70℃（36Torr）

【００６０】

【数２】

【００６１】^１Ｈ−ＮＭＲ（200 ＭＨｚ、ＣＤＣｌ
₃ 中、δ値(ppm) ）：1.30（ｔ，３Ｈ）、1.39（ｄ，３
Ｈ）、3.00〜3.26（ｂｓ，１Ｈ）、4.06〜4.55（ｍ，３
Ｈ）

【００６２】

【表２】

【００６３】実施例３ （固定化酵素の調製）Ｄ−酪酸脱水素酵素（シグマ製）
（1040ユニット）、ゲオトリカム・キャンディウム由来
のグリセロール脱水素酵素（天野製薬（株）製）（1040
ユニット）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ^＋）（所定量）を含むトリス緩衝液（ｐＨ8.
0 ）(100ml) に、吸水性ポリマー(6.00g）を加え固定化
酵素をえた。

【００６４】（反応）２−オキソ−４−フェニルブタン
酸エチル（4.12g 、0.02モル）とシクロペンタノール
（1.89g 、0.022 モル）を溶解させたベンゼン（400ml
）中に、前記の調製した固定化酵素を加え、35℃で振
とうした。ガスクロマトグラフィーで反応終了を確認し
たのち、ろ過により固定化酵素を除き、有機溶媒を留去
し、えられた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーで精製し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸エチルをえた。

【００６５】（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪
酸エチルの光学純度は、光学活性２−メトキシ−２−ト
リフルオロメチルフェニル酢酸クロリドで、ヒドロキシ
ル基をエステル化し、ガスクロマトグラフィー分析によ
り求めた。えられた化合物の収率、光学純度（％e.e.）
は表３に示すとおりであった。

【００６６】

【表３】

【００６７】実施例４ ４−クロロ−３−オキシブタン酸エチル（3.29g は、0.
02モル）と２−プロパノール（1.32g 、0.022 モル）を
溶解させたベンゼン（400ml ）中に、実施例１と同様の
方法で調製した固定化酵素を加え、35℃で振とうした。
ガスクロマトグラフィーで反応終了を確認したのち、ろ
過により固定化酵素を除き、有機溶媒を留去し、えられ
た油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製
し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチ
ルをえた。

【００６８】（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタ
ン酸エチルの光学純度は、光学活性２−メトキシ−２−
トリフルオロメチルフェニル酢酸クロリドで、ヒドロキ
シル基をエステル化し、ガスクロマトグラフィー分析に
より求めた。えられた化合物の収率、光学純度（％e.
e.）は表４に示すとおりであった。

【００６９】

【表４】

【００７０】実施例５ （固定化酵素の精製）ウマ肝臓由来のアルコール脱水素
酵素（1040ユニット）（シグマ製）、ゲオトリカム・キ
ャンディウム由来のアルコール脱水素酵素（1040ユニッ
ト）（天野製薬（株）製）、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）（所定量）およびＮａＣｌ
（3.51g ）を含むトリス緩衝液（ｐＨ8.0 ）（100ml)
に、吸水性ポリマー（6.00g ）を加え固定化酵素をえ
た。

【００７１】（反応）４−クロロ−３−オキシブタン酸
エチル（3.29g 、0.02モル）と２−プロパノール（1.32
g 、0.022 モル）を溶解させたベンゼン(400ml) 中に、
前記の調製した固定化酵素を加え、35℃で振とうした。
ガスクロマトグラフィーで反応終了を確認したのち、ろ
過により固定化酵素を除き、有機溶媒を留去し、えられ
た油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製
し、（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチ
ルをえた。

【００７２】（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタ
ン酸エチルの光学純度は、光学活性２−メトキシ−２−
トリフルオロメチルフェニル酢酸クロリドで、ヒドロキ
シル基をエステル化し、ガスクロマトグラフィー分析に
より求めた。えられた化合物の収率、光学純度（％e.
e.）は表５に示すとおりであった。

【００７３】

【表５】

【００７４】実施例６ ピルビンアルデヒドジメチルアセタール（2.36g 、0.02
モル）と２−プロパノール（1.32g 、0.022 モル）を溶
解させたベンゼン(400ml) 中に、実施例５と同じ方法で
調製した固定化酵素を加え、35℃で振とうした。ガスク
ロマトグラフィーで反応終了を確認したのち、ろ過によ
り固定化酵素を除き、有機溶媒を留去し、えられた油状
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、
（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピオンアルデヒドジメチル
アセタールをえた。

【００７５】（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピオンアルデ
ヒドジメチルアセタールの光学純度は、光学活性２−メ
トキシ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸クロリド
で、ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロマトグラ
フィー分析により求めた。えられた化合物の収率、光学
純度（％e.e.) は表６に示すとおりであった。

【００７６】

【表６】

【００７７】実施例７ ピルビンアルデヒドジメチルアセタール（2.64g 、0.02
モル）と２−プロパノール(1.32g、0.022 モル）の溶解
したベンゼン(400ml) 中に、実施例５と同じ方法で調製
した固定化酵素を加え、35℃で振とうした。ガスクロマ
トグラフィーで反応終了を確認したのち、ろ過により固
定化酵素を除き、有機溶媒を留去し、えられた油状物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（Ｓ）−
３−ヒドロキシブチルアルデヒドジメチルアセタールを
えた。

【００７８】（Ｓ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒド
ジメチルアセタールの光学純度は、光学活性２−メトキ
シ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸クロリドで、
ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロマトグラフィ
ー分析により求めた。えられた化合物の収率、光学純度
（％e.e.）は表７に示すとおりであった。

【００７９】

【表７】

【００８０】実施例８ ２−エトキシカルボニルシクロペンタノン(3.12g、0.02
モル）と２−プロパノール(1.32g、0.022 モル）を溶解
させたｎ−ヘキサン(400ml) 中に、実施例１と同じ方法
で調製した固定化酵素を加え、35℃で振とうした。ガス
クロマトグラフィーで反応終了を確認したのち、ろ過に
より固定化酵素を除き、有機溶媒を留去し、えられた油
状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、
（１Ｓ，２Ｒ）−２−エトキシカルボニルシクロペンタ
ノールをえた。

【００８１】（１Ｓ，２Ｒ）−２−エトキシカルボニル
シクロペンタノールの光学純度は、光学活性２−メトキ
シ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸クロリドで、
ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロマトグラフィ
ー分析により求めた。えられた化合物の収率、光学純度
（％e.e.）は表８に示すとおりであった。

【００８２】

【表８】

【００８３】実施例９（固定化酵素をバッチ方式で再利
用するばあい） （固定化酵素の調製）ゲオトリカム・キャンディウム由
来のグリセロール脱水素酵素（天野製薬（株）製）（10
40ユニット）とＮＡＤ^＋（8.0 ×10^-3モル）を含むトリ
ス緩衝液（ｐＨ8.0 ）（100ml)に、吸水性ポリマーであ
るＢＬ−100 （大阪有機化学工業（株）製）(6.00g）を
加え、固定化酵素をえた。

【００８４】（反応）ピルビン酸ブチル(2.88g、0.02モ
ル）とシクロペンタノール(1.89g、0.022 モル）を溶解
させたｎ−ヘキサン(400ml）中に、前記の調製した固定
化酵素を加え、35℃で振とうした。ガスクロマトグラフ
ィーで反応終了を確認したのち、固定化酵素と反応液を
ろ過し、反応液を濃縮してえられた油状物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ）−乳酸ブチ
ルをえた。回収した固定化酵素をそのまま用いて上記の
方法でさらに２回還元反応を行なった。

【００８５】（Ｒ）−乳酸ブチルの光学純度は、光学活
性２−メトキシ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸
クロリドで、ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロ
マトグラフィー分析により求めた。３回の還元反応でえ
られた化合物の収率、光学純度（％e.e.）は表９に示す
とおりであった。

【００８６】

【表９】

【００８７】実施例10（固定化酵素をカラム方式で連続
反応に用いるばあい） （固定化酵素のカラム充填）ゲオトリカム・キャンディ
ウム由来のグリセロール脱水素酵素（天野製薬（株）
製）（2080ユニット）とＮＡＤ^＋(1.6×10^-3モル）を含
むトリス緩衝液（ｐＨ8.0 ）(200ml) に、吸水性ポリマ
ーであるＢＬ−100 （大阪有機化学工業（株）製）(12.
0g）を加えてえた固定化酵素と、カラム分取用シリカゲ
ル（200 〜300メッシュ）(24.0g）（和光純薬工業
（株）製）を混合し、ガラスカラム（直径1.6cm 、長さ
50cm）に充填した。

【００８８】（反応）ピルビン酸ブチル(57.6g、0.40モ
ル）とシクロペンタノール（37.8g 、0.44モル）を溶解
させたｎ−ヘキサン(8L)を、ポンプを用いて加圧下で上
記カラムに室温で注入し、流速を15ml／hrに保った。流
出する反応液についてガスクロマトグラフィー分析を行
ない反応終了を確認した。注入終了後、ガラスカラム内
をｎ−ヘキサン(100ml) で洗浄し、流出した反応液と洗
浄液を合わせて濃縮し、えられた油状物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ）−乳酸ブチル
をえた。

【００８９】（Ｒ）−乳酸ブチルの光学純度は、光学活
性２−メトキシ−２−トリフルオロメチルフェニル酢酸
クロリドで、ヒドロキシル基をエステル化し、ガスクロ
マトグラフィー分析により求めた。えられた（Ｒ）−乳
酸ブチルの収率は99％、光学純度は99％e.e.以上、およ
びＮＡＤ^＋のターンオーバーは25000 であった。

【００９０】

【発明の効果】本発明によれば、高価な脱水素酵素およ
び補酵素を、触媒量用いて吸水性ポリマーに失活するこ
となく固定化し、バッチ方式で再利用するかまたはカラ
ム方式で連続反応に使用することにより、医農薬品、香
料をはじめとする種々の有機化学製品の中間体もしくは
製造原料として重要な化合物である、光学活性α−もし
くはβ−ヒドロキシカルボン酸エステル類またはヒドロ
キシアセタール類を簡便にかつ経済的に製造することが
できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺田 久美 京都市左京区上高野北田町12−７ (56)参考文献 特開 平３−285689（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 7/62 C12P 7/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式(I) ： 【化１】 （式中、Ｒ、Ｒ′およびＲ″は同一または相異なり、直
   鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアルキル基、直鎖
   もしくは分岐鎖状の炭素数１〜18のアルケニル基、芳香
   族基、ハロゲン原子または水素原子を表わすが、Ｒ″は
   ハロゲン原子ではなく、ａは０、１または２を、ｂは０
   または１を表わす）、一般式(II)： 【化２】 （式中、Ｒは前記と同じであるが、ハロゲン原子ではな
   く、ｎは３または４を表わす）または一般式(III) ： 【化３】 （式中、Ｒ、Ｒ′、ａおよびｂは前記と同じ、Ｒ¹ およ
   びＲ² は同一または相異なり、直鎖もしくは分岐鎖状の
   炭素数１〜18のアルキル基、またはいっしょになって−
   （ＣＨ₂ ）_k −（式中ｋは２または３）で示される環を
   形成し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表わす）で示さ
   れるα−もしくはβ−ケトエステル類またはケトアセタ
   ール類を、有機溶媒中で一級または二級アルコールを還
   元剤とし、水または緩衝液に溶解させた脱水素酵素およ
   び補酵素を吸水性ポリマーに固定化してなる固定化酵素
   に接触せしめることにより、立体選択的にαまたはβ位
   のカルボニル基を還元することを特徴とする、光学活性
   α−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸エステル類また
   はヒドロキシアセタール類の製造法。
2. 【請求項２】 反応後、分離操作により固定化酵素を回
   収し再利用する請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 水または緩衝液に溶解させた脱水素酵素
   および補酵素を吸水性ポリマーに固定化してなる固定化
   酵素を、充填剤としてカラム方式で連続して反応に用い
   る請求項１記載の製造法。