JP2958286B2 - Bkウイルスエンハンサーを含有する真核生物性発現ベクターを用いる方法 - Google Patents
Bkウイルスエンハンサーを含有する真核生物性発現ベクターを用いる方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、大きいDNAウイ
ルスの即時型遺伝子産物の存在下にBKエンハンサーを
用いて、真核宿主細胞における組換え遺伝子の転写を増
加させる方法、ならびに本方法に用いるのに適したDN
A化合物、組換えDNAベクターおよび該ベクターで形
質転換した宿主細胞に関する[ここでいうBKエンハン
サーとは、3個の繰り返し配列からなる、本明細書に定
義したDNAセグメントである(後記実施例17中に記
載)]。 【0002】本明細書中に例示したBKエンハンサー配
列は、BKウイルス、すなわち免疫抑制患者の尿から初
めて単離されたヒト・パポバウイルスから得られる。B
Kウイルスは、外見からはわからない幼年期感染を引き
起こすものと推測され、全人類中に存在している。BK
ウイルスはヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウイ
ルスは非霊長動物細胞においては不稔サイクル下に入
り、インビトロで齧歯類動物細胞を形質転換し、そして
ハムスターにおいては腫瘍を引き起こす。BKウイルス
はSV40に極めて似ているが、この2種類のパポバウ
イルス(すなわち、SV40およびBK)のエンハンサー
配列は実質的にヌクレオチド配列が異なっている。BK
ウイルスの完全なヌクレオチド配列(〜5.2kb)は、セ
イフ等[Seif et al.,Cell,18:963(1979)]、
ならびにヤングおよびウー[Yangand Wu,Science,2
06:456(1979)]が開示しており、このウイルス
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(A
TCC)(American TypeCulture Collection,123
01 Parklawn Dr.,Rockville,MD20852−1
776)から、取得番号ATCC VR−837のもとで
入手することができる。このBKウイルスの制限部位お
よび機能地図を添付の図1に示す。 【0003】エンハンサー成分はcis−作用であり、こ
のエンハンサー成分の位置および配向に比較的依存せず
に、近接する遺伝子の、そのプロモーターからの転写レ
ベルを増加させる。事実、コーリーおよびグルス[Khou
ry and Gruss,cell,33:313(1983)]は、「真核
生物遺伝子の上流、内部または下流で機能するエンハン
サー配列の注目すべき能力は、これらを古典的なプロモ
ーター成分と区別するものである・・・」と述べ、ある
種の実験結果が「エンハンサーはかなりの距離(おそらく
10kb以上)を越えて作用することができる」ことを示し
ている、と示唆している。 【0004】本発明は、真核生物性プロモーター(有用
な物質をコードしているDNA配列を転写させるため
に、BKエンハンサーと直列して用いる)の「CAAT」
領域のすぐ上流(該領域の5'側)にBKエンハンサーを
配置することによって、予想外の転写の増加が得られる
ことを教示するものである。このCAAT領域または
「すぐ上流の領域」または「−80相同配列」は、転写活性
のための配列が詳細に調べられているプロモーター中に
見い出されるヌクレオチドの保存領域である。このCA
AT配列は転写の効率に関係し、ごくわずかな例外を除
いて、これを削除するとプロモーターの強さが減少す
る。 【0005】エンハンサー成分は、多数のウイルス[B
Kおよびサルウイルス40(SV40)などのパポバウイ
ルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎
ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウ
イルス、ポリオーマウイルスを含む]および非ウイルス
性遺伝子(たとえば、マウスの免疫グロブリン遺伝子イ
ントロン中など)において確認されている。エンハンサ
ー成分は多種多様のその他の生物中にも存在している可
能性がある。宿主細胞は、エンハンサー成分が異なる
と、異なった反応を示すことが多い。この細胞特異性
は、宿主遺伝子産物が遺伝子の発現中にエンハンサー成
分と相互作用していることを示すものである。 【0006】また、エンハンサー成分は、宿主細胞中に
存在しているウイルス性遺伝子産物と相互作用すること
もある。ベルシッチおよびジッフ[Velcich and Ziff,
Cell,40:705(1983)]、ボレリ等[Borrelli e
t al.,Nature,312:608(1984)]およびヘン
等[Hen et al.,Science,230:1391(198
5)]は、SV40、ポリオーマウイルス、マウス免疫グ
ロブリン遺伝子およびアデノウイルス−2 E1Aのエ
ンハンサーが誘起する転写の活性化を、アデノウイルス
−2初期領域1A(E1A)遺伝子産物が抑制すると記載
している。従って、E1Aを含有する宿主細胞において
は、組換え遺伝子の転写を増加させるためにエンハンサ
ーを用いた真核生物性発現ベクターが、エンハンサーを
有さないベクターより有効に作動すると期待することは
できない。エンハンサー類を用いる先行技術の方法とは
著しく異なり、本発明のBKウイルスエンハンサー成分
を用いる方法は、E1A遺伝子産物または大きいDNA
ウイルスの同様の即時型遺伝子産物を用いて遺伝子発現
を最大にすることに関するものである。すなわち本発明
は、いずれかのアデノウイルスのE1A遺伝子産物の存
在下に、BKエンハンサーのDNA転写促進能力を向上
させることを教示するものである。 【0007】E1A遺伝子産物(正確に言うと、E1A
遺伝子は2種類の産物を産生するが、本明細書中ではこ
れらをひとまとめにして「E1A遺伝子産物」と称する)
は、アデノウイルス(大きいDNAウイルス)の即時型遺
伝子産物である。本発明は、E1A遺伝子産物と同様に
機能してBKエンハンサーの活性を増加させる、大きい
DNAウイルスのあらゆる即時型遺伝子産物の使用を包
含する。単純性疱疹ウイルスICP4タンパク質[デル
カ等(De Luca et al.,Mol.Cell.Biol.,5:199
7−2008(1985))が開示]、シュードラビエスウ
イルスIEタンパク質[フェルドマン等(Feldman et a
l.,P.N.A.S.,79:4952−4956(1982))
が開示]およびアデノウイルスのE1Bタンパク質は、
すべてE1Aタンパク質と同様の機能を有する、大きい
DNAウイルスの即時型遺伝子産物である。従って本発
明方法は、E1Aタンパク質の存在または非存在下にI
CP4、IE、またはE1Bタンパク質を用いて、BK
エンハンサーの活性を増加させることをも包含する。 【0008】アデノウイルスのE1A遺伝子産物のよう
な、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の存在下
にBKウイルスエンハンサーを用いると、真核宿主細胞
において組換え遺伝子の転写および発現が増加する。本
発明の別の重要な態様は、真核生物性プロモーター(た
とえば、アデノウイルス後期プロモーター)に直列して
BKエンハンサー配列を用い、真核宿主細胞において有
用な産物を発現させる種々の発現ベクターに関する。こ
れらの発現ベクターの多くは、BKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターカセットを含有し、このカ
セットは、本発明方法に用いる他のベクターに容易に移
し換えることができる。この発現ベクターの多様性は、
これらのベクターが誘導する種々のタンパク質(たとえ
ば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、タンパク質C、組織プラスミノーゲン活性化因子、
および修飾化組織プラスミノーゲン活性化因子など)の
高レベル発現によって示される。 【0009】本発明のさらに別の重要な態様は、近接す
る真核生物性プロモーターと関連しているBKエンハン
サーの活性を増加させる方法に関し、これをBKエンハ
ンサー−アデノウイルス−2後期プロモーターカセット
を用いて説明する。これらの誘導体を、アデノウイルス
−2後期プロモーターのCAAT領域の極めて近くにB
Kエンハンサーを配置する酵素的な処理によって構築し
た。これらの修飾化BKエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーター配列を発現ベクターに導入し、次いで
これらを用いて真核宿主細胞中で有用な遺伝子産物を発
現させたとき、このような位置決めを欠く構築物と比較
すると、劇的な発現レベルの増加が認められた。すなわ
ち本発明は、近接する真核生物性プロモーターと関連し
ているBKエンハンサーの活性を増加させるための方法
であって、真核生物性プロモーターのCAAT領域の
5'末端のすぐ上流、0−約300ヌクレオチド以内に
該エンハンサーを配置することからなる方法を提供する
ものである。 【0010】本明細書中で用いる語句を以下のように定
義する。 抗生物質:微生物が産生する物質であって、天然のまま
で、またはわずかに化学修飾することにより、他の微生
物または真核生物細胞を殺すか、またはその増殖を抑制
する物質。 抗生物質耐性付与遺伝子:抗生物質に対する耐性を付与
する活性をコードしているDNAセグメント。 ApR:アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与する
遺伝子。 クローニング:組換えDNAクローニングベクターにD
NAセグメントを導入する過程。 CmR:クロラムフェニコール耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。 ep:T−抗原遺伝子のSV40初期プロモーター、T−
抗原結合部位、およびSV40の複製起源を含有するD
NAセグメント。 真核生物性プロモーター:真核生物細胞中でプロモータ
ーとして機能するすべてのDNAセグメント。 HmR:ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。 IVS:介在配列とも呼ばれる、イントロンをコードし
ているDNA。 【0011】大きいDNAウイルス:真核生物細胞に感
染し、〜10kb以上の大きさのゲノムを有するウイル
ス、すなわちポックスウイルス類、アデノウイルス類、
およびヘルペスウイルス類のいずれか。 NeoR:ネオマイシン耐性付与遺伝子であり、これを用
いて真核宿主細胞にG418耐性を付与することもでき
る。 ori:プラスミドの複製起源。 pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA配
列。 プロモーター:DNAのRNAへの転写を誘導するDN
A配列。 組換えDNAクローニングベクター:自律的に複製する
かまたは組み込まれる媒介物であって、1またはそれ以
上の付加的なDNAセグメントを付加することができる
かまたは付加したDNA分子からなる媒介物。 組換えDNA発現ベクター:プロモーターおよびこれに
関連する挿入部位を含有する組換えDNAクローニング
ベクターであって、該部位に有用な産物をコードしてい
るDNA分子を挿入し、そして発現させることができる
ベクター。 【0012】組換えDNAベクター:組換えDNAクロ
ーニングまたは組換えDNA発現ベクター。 レプリコン:組換えDNAベクターの複製を制御してい
るDNA配列。 制限フラグメント:1またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成した直線状のDNA。 rRNA:リボソーム性リボ核酸。 感受性宿主細胞:ある抗生物質またはその他の毒性化合
物に対する耐性を付与するDNAセグメントなしでは、
それらが存在するところで増殖することができない宿主
細胞。 構造遺伝子:開始および停止コドンをコードしているD
NAを含む、ポリペプチドをコードしているDNA配
列。 TcR:テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。 形質転換体:形質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換:受容宿主細胞へのDNAの導入。 tRNA:転移リボ核酸。 【0013】図面の説明 図1は、BKウイルス(5.2kb)の制限部位および機能
地図であり、図2は、プラスミドpBKE1(7.9kb)の
制限部位および機能地図であり、図3は、プラスミドp
BKneo1(11.5kb)の制限部位および機能地図であ
り、図4は、プラスミドpSV2cat(5.015kb)の制
限部位および機能地図であり、図5は、プラスミドpL
Pcat(4.83kb)の制限部位および機能地図であり、図
6は、プラスミドpBLcat(6.09kb)の制限部位およ
び機能地図であり、図7は、プラスミドpBKcat(5.7
9kb)の制限部位および機能地図であり、図8は、プラ
スミドpSBLcat(5.88kb)の制限部位および機能地
図であり、 【0014】図9は、プラスミドpL133の構築なら
びにその制限部位および機能地図を表し、図10は、プ
ラスミドpLPC(6.5kb)の制限部位および機能地図で
あり、図11は、プラスミドpLPC4(11.7kb)の制
限部位および機能地図であり、図12は、プラスミドp
SV2hyg(5.24kb)の制限部位および機能地図であ
り、図13は、プラスミドpLPChyg1(8.3kb)の制
限部位および機能地図であり、図14、図15、図16
および図17は、プラスミドpBW32の構築ならびに
その制限部位および機能地図を表し、図18は、プラス
ミドpLPChd1(10.23kb)の制限部位および機能地
図であり、図19は、プラスミドphd(8.55kb)の制限
部位および機能地図であり、 【0015】図20は、プラスミドpLPCE1A(7.
6kb)の制限部位および機能地図であり、図21は、プ
ラスミドpBLT(6.44kb)の制限部位および機能地図
であり、図22は、プラスミドpBLThyg1(8.95k
b)の制限部位および機能地図であり、図23は、プラス
ミドpBLTdhfr1(8.34kb)の制限部位および機能地
図であり、図24は、プラスミドpTPA602(4.9k
b)の制限部位および機能地図であり、図25は、プラス
ミドpTPA603(6.3kb)k制限部位および機能地図
であり、図26は、プラスミドphdTPA(10.67kb)
の制限部位および機能地図であり、図27は、プラスミ
ドphdMTPA(10.67kb)の制限部位および機能地図
である。 【0016】本発明は、真核宿主細胞において機能的な
ポリペプチドを産生させるための方法であって、大きい
DNAウイルスまたはそのDNAで形質転換され、そし
て少なくとも a)真核生物性プロモーター、 b)該プロモーターを刺激するように配置したBKウイル
スエンハンサー、 c)該プロモーターから発現するように配置した、機能的
なポリペプチドをコードしているDNA配列、を含有す
る組換えDNAベクターで形質転換された真核生物細
胞、または上記a)、b)、c)および d)大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物をコードし
ているDNA配列、を含有する組換えDNAベクターで
形質転換された真核生物細胞を、c)およびd)の発現に適
した条件下で培養することからなる方法を提供するもの
である。 【0017】また、本発明は真核生物性プロモーターと
関連しているBKエンハンサーの活性を増加させるため
の方法であって、プロモーターがSV40初期プロモー
ターではないという限定のもと、真核生物性プロモータ
ーのCAAT領域の5'末端の上流側0−300ヌクレ
オチド以内に該エンハンサーを配置することからなる方
法を提供するものである。 【0018】さらに本発明は、本発明方法において使用
するに適した組換えDNAベクター、ならびに該組換え
DNAベクターで形質転換したヒト胎児腎細胞およびサ
ル腎細胞等の真核生物細胞を提供するものである。加え
て本発明は、BKエンハンサー−アデノウイルス後期プ
ロモーターを含有するDNA化合物をも提供するもので
ある。 【0019】当業者なら、本発明方法の両態様におけ
る、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の重要な
役割について理解することであろう。さらに、多数の確
立された細胞セルラインが大きいDNAウイルスの即時
型遺伝子産物を発現すること、およびそのようなセルラ
インが本発明方法において特に有用であることについて
も理解することであろう。本方法の1態様では、真核生
物性プロモーター、該プロモーターを刺激するように配
置したBKエンハンサー、および所望の機能的なポリペ
プチドをコードしているDNA配列(該プロモーターか
ら発現するようにこの配列を配置する)を含有する組換
えDNAベクターで、大きいDNAウイルスの即時型遺
伝子産物を発現する細胞を形質転換し、そして発現に適
した条件下で該ベクターを含有する細胞を培養する。ま
た、本発明方法の他の態様は、大きいDNAウイルスの
即時型遺伝子産物は発現しないが、即時型遺伝子産物を
コードしているDNA配列、ならびに上記のプロモータ
ー、エンハンサーおよび機能的なポリペプチドをコード
しているDNA配列を含有する組換えDNA発現ベクタ
ーで形質転換した細胞を培養することからなる。 【0020】本発明において重要なものは、BKエンハ
ンサー配列をアデノウイルス−2後期プロモーターと直
列して含有する1群の新規発現ベクターである。該ベク
ター中、発現のための正しい位置に、有用な産物をコー
ドしているDNA分子を容易に挿入するか、または挿入
できるように、本発明の発現ベクターを構築した。さら
に、比較的小さい制限フラグメントとして発現ベクター
から単離しうる「カセット」を形成するように、BKエン
ハンサー配列および真核生物性プロモーターを組み立て
た。このカセットは、種々の発現ベクター間を容易に往
復することができる。本明細書中に特定して例示した発
現ベクターは、本発明方法において転写を誘導するBK
エンハンサー−真核生物性プロモーターカセットに、ア
デノウイルス−2またはBK後期プロモーターを用いて
いる。 【0021】BKウイルス(ATCC VR−837)は
購入可能であるか、または実施例1の記載のようにして
容易かつ大量に単離することができるが、このウイルス
は、BKウイルス性DNAをプラスミドクローニングベ
クターにクローンし、この組換えベクターをBKウイル
ス性DNA配列の供給源として使用するのにも都合がよ
い。従って、BKウイルスDNAを制限酵素EcoRIで
消化して直線状のBKDNA(BKゲノム上にはEcoR
I部位が1つしか存在しないので)を得、同様にプラス
ミドpUC8[ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(B
RL)(BethesdaResearch Laboratories,P.O.Box
6009,Gaithersburg,MD 20877)から入手可
能]を制限酵素EcoRIで消化して直線化し、そしてこ
のEcoRI切断したプラスミドpUC8 DNAをEcoR
I切断したBKウイルスDNAにライゲートして、BK
ウイルスDNAの配向だけが異なるプラスミドpBKE
1およびpBKE2を得た。プラスミドpBKE1の制限
部位および機能地図を添付の図2に示す。プラスミドp
BKE1およびpBKE2の構築については、実施例2
に記載する。 【0022】また、BKウイルスゲノムをプラスミドpd
BPV−MMTneoの一部と結合させてプラスミドpBK
neo1およびpBKneo2を構築した。プラスミドpdBP
V−MMTneo(約15kbの大きさであり、ATCCから
取得番号ATCC 37224のもとで入手可能である)
は、プラスミドpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺
伝子およびレプリコン、ネオマイシン耐性付与酵素をコ
ードしている構造遺伝子を発現させるように配置したマ
ウス・メタロチオネイン・プロモーター、および約8kb
のウシ乳頭腫ウイルス(BPV)DNAを含有している。
プラスミドpdBPV−MMTneoを制限酵素BamHIで
消化して2種類のフラグメント、すなわちBPV DN
Aを含有する〜8kbフラグメントおよびそれ以外の上記
配列を含有する〜7kbフラグメントを得ることができ
る。BKウイルスはBamHI制限部位を1つだけ有して
おり、プラスミドpdBPV−MMTneoの〜7kb BamH
I制限フラグメントをBamHIで直線化したBKウイル
スDNAにライゲートすることによってプラスミドpB
Kneo1およびpBKneo2を構築した。BKウイルスD
NAの配向だけが異なっているこのプラスミドpBKneo
1およびpBKneo2の構築を実施例3に記載し、プラス
ミドpBKneo1の制限部位および機能地図を添付の図3
に示す。 【0023】プラスミドpBKE1、pBKE2、pBKn
eo1およびpBKneo2それぞれは、エンハンサー配列を
含むBKウイルスの完全なゲノムを含有しており、従っ
て本発明の発現ベクター用の有用な出発原料となる。説
明のためにそのような発現ベクターを1つ挙げると、プ
ラスミドpBLcatは、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ酵素(CAT)を発現させるように配置
した、ヒトアデノウイルス−タイプ−2・後期プロモー
ターと直列してBKエンハンサー配列を含有している。
プラスミドpSV2catはCAT遺伝子の都合のよい供給
源として有用であり、取得番号ATCC 37155の
もとでATCCから入手できる。プラスミドpSV2cat
の制限部位および機能地図を添付の図4に示す。ヒトア
デノウイルス−タイプ−2 DNAは市販品から入手す
ることができ、またATCCから取得番号ATCC V
R−2のもとで入手することもできる。 【0024】説明のために挙げたこのプラスミドpBLc
atは、ヒトアデノウイルス−タイプ−2・DNAの〜
0.32kb後期プロモーター含有AccI−PvuII制限
フラグメントを、AccI−PvuII制限フラグメントの
PvuII末端だけに結合する平滑末端化BclIリンカ
ーにライゲートすることによって構築した。次いで得ら
れたフラグメントをプラスミドpSV2catの〜4.51k
b AccI−StuI制限フラグメントにライゲートして中
間体プラスミドpLPcatを得た(このプラスミドの制限
部位および機能地図を添付の図5に示す)。所望のプラ
スミドpBLcatは、複製起源およびエンハンサーを含有
する、BKウイルスDNAの〜1.28kbAccI−Pvu
II制限フラグメントを、プラスミドpLPcatの〜4.
81kb AccI−StuI制限フラグメントにライゲート
することによって、プラスミドpLPcatから構築した。
得られたプラスミドpBLcatの制限部位および機能地図
を添付の図6に示す。プラスミドpBLcatの構築につい
ては実施例4にさらに詳しく記載する。 【0025】プラスミドpBKcatは本発明をさらに例示
する発現ベクターであり、BKエンハンサーおよびBK
後期プロモーターを用いてクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼを発現させるものである。プラス
ミドpBKcatを、プラスミドpLPcatについて記載した
と類似の方法で構築した。すなわち、プラスミドpSV
2catの〜4.51kb AccI−StuI制限フラグメント
をBKウイルスの〜1.28kb AccI−PvuII制限フ
ラグメントにライゲートして、BK後期プロモーターが
正しい配向となるようにし、CAT遺伝子を発現させる
ようにした。プラスミドpBKcatの制限部位および機能
地図を添付の図7に示す。 【0026】プラスミドpBLcatは、本発明のBKエン
ハンサー−アデノウイルス後期プロモーター「カセット」
の都合のよい供給源である。このカセットは〜870bp
のHindIII制限フラグメントであり、都合よく真核
生物性発現ベクターに挿入して該ベクターがコードして
いる産物の発現を増加させることができる。これは、プ
ラスミドpSV2catを制限酵素HindIIIで消化し、
BKエンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカ
セットを挿入することによって行なわれる。得られたプ
ラスミド(プラスミドpSBLcatと命名した)は、SV4
0複製起源、SV40初期プロモーターおよびSV40
エンハンサーを含有し、従ってこれらの配列が削除され
ているプラスミドpBLcatとは異なる。 【0027】プラスミドpSBLcatは、E1A遺伝子産
物が存在しなければ、プラスミドpBLcatより高レベル
でCATを発現させる。E1A遺伝子産物が存在しない
場合におけるこの発現の増加は、2種類のエンハンサー
(一方はSV40由来、他方はBK由来)が、隣接するプ
ロモーターからの転写において付加的な促進効果を有し
ていることを示すものである。しかし、E1A遺伝子産
物の存在下では、プラスミドpSBLcatよりプラスミド
pBLcatの方が高レベルでCATを発現させる(これは
おそらくSV40エンハンサーがE1A遺伝子産物によ
って抑制されるためであろう)。プラスミドpSBLcat
の制限部位および機能地図を添付の図8に示し、プラス
ミドpSBLcatの構築を実施例5に記載する。 【0028】また、BKエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーターカセットを用いて、ヒトタンパク質C
の発現を改良した。これは、カセットをプラスミドpL
133中にライゲートすることによって行った。プラス
ミドpL133の制限部位および機能地図を添付の図9
に示し、その構築を実施例6に記載する。プラスミドp
L133を制限酵素HindIIIで消化し、次いでプラ
スミドpBLcatの〜0.87kb HindIII制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドpLPCを得た。プ
ラスミドpLPCの制限部位および機能地図を添付の図
10に示し、プラスミドpLPCの構築を実施例7に記
載する。 【0029】プラスミドpL133と同様、プラスミドp
LPCはSV40の複製起源、T−抗原結合部位、初期
および後期プロモーター、およびエンハンサーを含有す
る。これらの成分はともにSV40 DNA上に近接し
て位置しており、これを正確に表すことは困難である。
T−抗原のT−抗原結合部位への結合(SV40の複製
に必要である)が、SV40後期プロモーターからの転
写を促進することが知られているが、驚くべきことにB
K後期プロモーターに対しても同様の効果を有してい
る。SV40複製起源を含有するプラスミドの高レベル
T−抗原誘導複製は通常宿主細胞にとって致死的である
ので、SV40 T−抗原の存在下ではプラスミドpLP
CおよびプラスミドpL133のどちらもエピソーム(染
色体外)成分として安定に保持されず、むしろこの2種
類のプラスミドを宿主細胞の染色体DNA中に組み込ん
で安定に保持されるようにしなければならない。 【0030】BKエンハンサー領域の全体の構造はSV
40のそれと極めて類似しており、BKエンハンサー、
複製起源、初期および後期プロモーター、およびT−抗
原結合部位のBK同等物はすべて近接して位置してお
り、BKウイルスDNA上において、正確に表すことは
困難である。しかし、BK T−抗原の存在下で増殖さ
せたとき、BK複製起源およびT−抗原結合部位を含有
するプラスミドは致死となるまでは複製せず、エピソー
ム成分として宿主細胞中に安定に保持される。多分、B
KおよびSV40 T−抗原とそれらの抗原のそれぞれ
の結合部位との間の、類似した構造−機能の関係によ
り、BKの複製はSV40 T−抗原によっても刺激さ
れる。形質転換した真核生物細胞中で、安定に保持され
る成分として存在しうるプラスミドpLPCの誘導体を
構築するため、完全なBKゲノム(EcoRIで直線化し
た制限フラグメントとして)を、プラスミドpLPCの唯
一のEcoRI制限部位に挿入した。この挿入により2種
類のプラスミドが得られた。これらは、BK EcoRI
フラグメントの配向においてのみ異なっており、それぞ
れpLPC4およびpLPC5と命名した。プラスミドp
LPC4の制限部位および機能地図を添付の図11に示
し、プラスミドpLPC4およびpLPC5の構築を実施
例8に記載する。 【0031】組換えDNA発現ベクターのエピソーム保
持は、宿主細胞染色体への組み込みの際に、常に好まし
いというわけではない。しかし、真核生物細胞中で機能
する選択マーカーが存在しないため、プラスミドpLP
Cを別の選択マーカー含有プラスミドと共形質転換しな
ければ、プラスミドpLPCの安定な真核生物性形質転
換体を同定するのは困難である。従って、プラスミドp
LPCを修飾して、真核宿主細胞中で選択しうるプラス
ミド誘導体を作成した。 【0032】プラスミドpSV2hyg、すなわちハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドの一部に
プラスミドpLPCをライゲートすることによってこれ
を行った。プラスミドpSV2hyg[このプラスミドは、
ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー(N
RRL)(Northern Regional Research Laboratory,
Peoria,IL 61640)から取得番号NRRL B−
18039のもとで入手することができる]の制限部位
および機能地図を添付の図12に示す。プラスミドpS
V2hygを制限酵素BamHIで消化し、完全なハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子を含有する〜2.5kb BamHI
制限フラグメントを単離し、クレノウ酵素[E.コリ(E.
coli)DNAポリメラーゼIのスブチリシン切断によっ
て得られる大きいフラグメント]で処理し、次いでクレ
ノウ処理した、プラスミドpLPCの〜5.82kb Nde
I−StuI制限フラグメントにライゲートしてプラスミ
ドpLPChyg1およびpLPChyg2を得た。プラスミド
pLPChyg1およびpLPChyg2はハイグロマイシン耐
性付与フラグメントの配向だけが異なっている。プラス
ミドpLPChyg1の制限部位および機能地図を添付の図
13に示し、プラスミドpLPChyg1およびpLPChyg
2構築のプロトコールを実施例9に記載する。 【0033】ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含有
する、クレノウ処理した、プラスミドpBW32の〜1.
9kb BamHI制限フラグメントを、プラスミドpLPC
の〜5.82kb NdeI−StuI制限フラグメントに挿入
することによって、dhfr遺伝子を含有する上記と同様の
ヒトタンパク質C発現プラスミドを構築した。得られた
プラスミド、すなわちpLPCdhfr1およびpLPCdhfr
2はdhfr遺伝子の配向だけが異なっており、これらのプ
ラスミドの構築を実施例11Bに記載する。 【0034】プラスミドpLPChyg1をさらに修飾して
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を導入した。dhfr遺
伝子はdhfr−陰性の細胞における選択マーカーであり、
これを用い、宿主細胞をメトトレキセイトにさらす(濃
度を順次増加する)ことによって、DNAセグメントの
コピー数を増加させることができる。このdhfr遺伝子は
プラスミドpBW32から得ることができる。プラスミ
ドpBW32の制限部位および機能地図を添付の図1
4、図15、図16および図17に示し、プラスミドp
BW32構築のプロトコールを実施例10に記載する。 【0035】dhfr遺伝子を含有する、プラスミドpBW
32の〜1.9kb BamHI制限フラグメントを単離し、
クレノウ酵素で処理し、部分的にEcoRI消化したプラ
スミドpLPChyg1に挿入してプラスミドpLPChd1
およびpLPChd2を得た。プラスミドpLPChyg1は
2つのEcoRI制限酵素認識部位を含有し、1つはハイ
グロマイシン耐性付与遺伝子中に、もう1つはプラスミ
ドpBR322由来の配列中に存在している。dhfr遺伝
子を含有するフラグメントを、プラスミドpLPChyg1
のpBR322由来配列中に位置するEcoRI部位に挿
入してプラスミドpLPChd1およびpLPChd2を得
た。プラスミドpLPChd1の制限部位および機能地図
を添付の図18に示し、dhfr遺伝子を含有するDNAセ
グメントの配向だけが異なっているプラスミドpLPCh
d1およびpLPChd2の構築を実施例11に記載する。 【0036】プラスミドpLPChd1を修飾してプラス
ミドphd、すなわち本発明に係るBKエンハンサー−ア
デノウイルス後期プロモーターカセットならびにハイグ
ロマイシン耐性付与およびdhfr遺伝子の両者を含有する
プラスミドを得た。プラスミドphdを構築するため、プ
ラスミドpLPChd1をdamE.コリ宿主細胞から調製
し、制限酵素BclIで消化し、そして再び環化してヒト
タンパク質CをコードしているDNAを削除した。プラ
スミドphdはBclI制限酵素認識部位を1つだけ含有し
ており、この部位は、本発明のBKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターから発現させようとするす
べての配列を挿入するのに都合よく配置されている。プ
ラスミドphdの制限部位および機能地図を添付の図19
に示し、プラスミドphd構築のプロトコールを実施例1
2に記載する。 【0037】本発明をさらに例示する別の発現ベクター
であって、ヒトタンパク質Cを発現させるベクターはプ
ラスミドpLPCE1Aである。プラスミドpLPCE1
Aはヒトアデノウイルス タイプ2のE1A遺伝子を含
有し、この遺伝子の産物は、上述のように、BKエンハ
ンサーの活性を増加させる。すなわち、BKエンハンサ
ーに直列するプロモーターからの転写は、E1A遺伝子
産物の存在下に増加する。E1A遺伝子を含有する、ヒ
トアデノウイルス−タイプ−2 DNAの〜1.8kb Ba
lI制限フラグメントを、プラスミドpLPCの〜5.8
2kb NdeI−StuI制限フラグメントとライゲートす
ることにより、プラスミドpLPCE1Aを構築した。
プラスミドpLPCE1Aの制限部位および機能地図を
添付の図20に示し、プラスミドpLPCE1A構築の
プロトコールを実施例13に記載する。 【0038】本発明の発現ベクターのうちの多数は、組
織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)または修飾化T
PA(MTPA)を発現させるために、BKエンハンサー
−アデノウイルス後期プロモーターカセットを利用して
いる。このようなベクターを構築するため、プラスミド
pBW32(図14、図15、図16および図17)を制
限酵素BamHIで消化し、得られた〜5.6kbフラグメ
ントを再環化してプラスミドpBW32delを得た。修飾
化TPAをコードし、HindIII制限部位を1つだけ
含有するこのプラスミドpBW32delをHindIIIで
消化し、次いでプラスミドpBal8catの〜0.65kb H
indIII制限フラグメントとライゲートしてプラスミ
ドpBLTを得た。プラスミドpBal8catについては実
施例17に記載するが、このプラスミドは改良型BKエ
ンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセット
を含有している。プラスミドpBLTの制限部位および
機能地図を添付の図21に示し、プラスミドpBLT構
築のプロトコールを実施例14に記載する。 【0039】BamHI消化したプラスミドpBLTに選
択マーカーを導入した。ある構築においては、ハイグロ
マイシン耐性遺伝子を含有する、プラスミドpSV2hyg
の〜2.5kb BamHI制限フラグメントを挿入してプラ
スミドpBLThyg1およびpBLThyg2を得、別の構築
においては、dhfr遺伝子を含有する、プラスミドpBW
32の〜1.9kb BamHI制限フラグメントを挿入し
てプラスミドpBLTdhfr1およびpBLTdhfr2を得
た。これら4種のプラスミド、pBLThyg1、pBLTh
yg2、pBLTdhfr1、およびpBLTdhfr2は、選択マ
ーカーの種類および/または配向だけが異なっている。
プラスミドpBLThyg1およびpBLTdhfr1それぞれ
の制限部位および機能地図を添付の図22および図23
に示し、プラスミドpBLThyg1、pBLThyg2、pB
LTdhfr1、およびpBLTdhfr2構築のプロトコール
を実施例15に記載する。 【0040】TPAまたは修飾化TPAを発現させる本
発明の他の発現ベクターは、プラスミドpBW32の構
築に用いる中間体であるプラスミドpTPA103から
得られる。プラスミドpTPA103構築のプロトコー
ルを実施例10に記載し、プラスミドpTPA103の
制限部位および機能地図を添付の図14、図15、図1
6および図17に示す。これらの誘導体を構築するた
め、プラスミドpTPA103のTPAコード化領域の
5'末端の直前にBamHI制限部位を導入した。プラス
ミドpTPA103を制限酵素HgaIで消化して、TP
Aコード化領域の5'末端を含有する〜0.52kb Hga
I制限フラグメントを単離した。クレノウ処理した後、
このHgaIフラグメントをBamHIリンカーにライゲー
トし、制限酵素BamHIで消化し、そしてBamHI消化
したプラスミドpBR322に挿入してプラスミドpTP
A601およびpTPA602を得た。プラスミドpTP
A602(このプラスミドは、挿入したBamHI制限フ
ラグメントの配向だけがプラスミドpTPA601と異
なる)の制限部位および機能地図を添付の図24に示
す。 【0041】次いで、プラスミドpTPA602を制限
酵素BglIIおよびSalIで消化し、得られた〜4.2k
b BglII−SalI制限フラグメントをプラスミドpT
PA103の〜2.05kb SalI−BglII制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドpTPA603を得
た。従って、プラスミドpTPA603は、両末端がBa
mHI制限部位で区切られているTPAの完全なコード
化配列を含有している。プラスミドpTPA603の制
限部位および機能地図を添付の図25に示す。プラスミ
ドpTPA603に類似しているが、しかし改良型TP
Aをコードしているプラスミドを構築するため、プラス
ミドpTPA603を制限酵素BglIIおよびSstIで
消化し、得られた〜5.02kb BglII−SstIフラグ
メントをプラスミドpBLTの〜0.69kb BglII−
SstI制限フラグメントにライゲートした。次いで、得
られたプラスミド(pMTPA603と命名した)を制限
酵素BamHIで消化し、得られた〜1.35kbフラグメ
ントを単離した。このフラグメントおよびプラスミドp
TPA603の〜1.90kb BamHI制限フラグメント
を、別々にBclI消化したプラスミドphd(図19)にラ
イゲートして、それぞれプラスミドphdMTPAおよびp
hdTPAを得た。プラスミドphdTPAおよびphdMTP
Aの制限部位および機能地図をそれぞれ添付の図26お
よび図27に示す。プラスミドphdTPAおよびphdMT
PAの構築(プラスミドpTPA602構築のプロトコー
ルから始める)を実施例16に記載する。 【0042】本発明は、真核生物性プロモーターと直列
してBKエンハンサーを用いて、大きいDNAウイルス
の即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞において、DN
A配列を転写および発現させるための方法を包含する。
本方法において、実質的にすべての真核生物性プロモー
ターをBKエンハンサーと直列して用いることができる
ということについては当業者の理解するところであろ
う。たとえば、SV40初期および後期プロモーター、
BK初期および後期プロモーター、すべてのポリオーマ
ウイルス群またはパポバウイルス群の初期および後期プ
ロモーター、単純性疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロ
モーター、インターフェロンα1プロモーター、マウス
メタロチオネインプロモーター、レトロウイルス群のプ
ロモーター、β−グロビンプロモーター、アデノウイル
ス群のプロモーター、ウニH2Aプロモーター、コンア
ルブミンプロモーター、卵アルブミンプロモーター、マ
ウスβ−グロビンプロモーター、ヒトβグロビンプロモ
ーター、およびラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返し
(LTR)プロモーターは、本発明方法において、すべて
真核生物性プロモーターとして役立ちうる。さらに、上
流の「CAAT」配列を有するか、または有しない「TA
TA」様の配列からなる転写開始部位を含有するすべて
の配列が、本発明におけるプロモーターとして役立ちう
る。このようなプロモーターをBKエンハンサー含有の
発現ベクター中に都合よく挿入することによって、該プ
ロモーターを本方法に用いることができる(本方法に用
いるに好ましい真核生物性プロモーターであるアデノウ
イルス−2後期プロモーターを用いて本明細書中に例示
したようにして)。 【0043】本発明を例示するものである本明細書中の
ベクターに用いられるBKエンハンサーは、BKウイル
スの原型菌株から単離されたものである。しかし、多数
のBKウイルス変異株が単離され、開示されている。ガ
ードナー等[Gardner et al.,The Lancet,1:125
3(1971);Gardner,Brit.Med.J.,1:77−78
(1973)をも参照]は最初のBKウイルスの単離につ
いて記載しており、従ってこのガードナー株は原型また
は野生型BKウイルスと称されている。BKウイルスの
ガードナー株(図1)は、ATCCから取得番号ATCC
VR−837のもとで入手可能である。大きいDNA
ウイルスの即時型遺伝子産物の存在下に、BKエンハン
サーを真核生物性プロモーターと直列して用いて有用な
物質(たとえば、核酸およびタンパク質)を発現させる方
法、およびそれ以外のすべての本発明方法は、原型株の
エンハンサーが好ましいものではあるが、いずれもガー
ドナー株または特定のBK変異株に限定されるものでは
ない。本発明方法に用いることができる多数の代表的な
BK変異株を以下の第1表に挙げる。 【0044】 【表1】【表2】 【0045】宿主細胞が大きいDNAウイルスの即時型
遺伝子産物を発現するものである限り、本方法において
種々の真核宿主細胞を用いることができるということに
ついては当業者の理解するところであろう。多数の方法
(たとえば、プラスミドまたは他のベクターを用いる形
質転換)によって即時型遺伝子産物を宿主細胞に導入す
ることができるので、実質的にすべての真核細胞を本方
法に用いることができる。ヒト細胞はBKウイルスの天
然の宿主であり、かつBKエンハンサーの刺激に役立つ
細胞因子を含有していると考えられるので、本発明方法
における好ましい宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞
としてはヒト腎細胞が特に好ましいが、E1A遺伝子産
物を発現するアデノウイルス 5−形質転換したヒト胎
児腎細胞セルライン293が最も好ましく、このセルラ
インはATCCから取得番号ATCC CRL 1575
3のもとで入手可能である。 【0046】293細胞がE1A遺伝子産物を発現する
という理由だけではなく、293細胞がタンパク質Cの
ような複雑な遺伝子産物をγ−カルボキシル化すること
ができ、かつそれ以外に該産物を正確にプロセッシング
することができるという理由から293セルラインが好
ましい。腎細胞は通常ある種のタンパク質をγ−カルボ
キシル化し、かつそれ以外にそれをプロセッシングする
が、293細胞をアデノウイルスで形質転換すると、通
常特殊な機能が失われてしまう。従って本発明は、天然
にγカルボキシル化され、正しく折りたたまれ、そして
プロセッシングされたタンパク質を産生させるための方
法(該タンパク質を組換えDNAベクター中にコード化
して、該ベクターを含有する真核宿主細胞を適当な発現
条件下で培養したときに該タンパク質が発現されるよう
にする方法)の改良法であって、改良点が、(a)アデノウ
イルスで形質転換したヒト胎児腎細胞に該ベクターを挿
入すること、および(b)カルボキシル化のための十分量
のビタミンKを含有する培地中、増殖条件下で工程(a)
の宿主細胞を培養すること、からなる方法をも包含する
ものである。 【0047】真核生物性プロモーターと関連しているB
Kエンハンサーの活性を改良するための方法を用いて、
実施例17に記載した新規BKエンハンサー−真核生物
性プロモーター構築物を構築した。この方法は、BKエ
ンハンサーと直列して用いる真核生物性プロモーターの
CAAT流域の5'末端の上流側0−300ヌクレオチ
ド以内にBKエンハンサーを配置することからなる。こ
の方法によって調製した改良型カセットは本発明の重要
な態様を構成する。改良型カセットの好ましい使用法
は、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物による改
良型カセットの刺激を包含するものであるが、E1Aま
たは類似の遺伝子産物を発現する宿主細胞に限定はされ
ない。 【0048】アデノウイルスのVA遺伝子産物などの他
のウイルス性遺伝子産物を用いて、本方法(BKエンハ
ンサーを用いて真核宿主細胞における組換え遺伝子の転
写および発現を促進させる)の全体の効率を増加させる
ことができる。このVA遺伝子産物は、アデノウイルス
の3分節リーダーを含有するmRNA分子の翻訳効率を
増加させる[カウフマン(Kaufman,PNAS,82:68
9−693(1985));スベンソンおよびアクジャルル
(Svensson and Akusjarul.EMBO.4:957−96
4(1985))]。本発明のベクターを修飾してアデノウ
イルスの完全な3分節リーダーをコードさせることもで
きるが、実施例18に示すように、本発明はVA遺伝子
産物を用いて、アデノウイルスの3分節リーダーの最初
の部分だけを含有するmRNAの翻訳を増加させること
を含むものである。 【0049】アデノウイルスの3分節リーダーは以下の
配列で示される: 【化11】 [配列中、Aはリボアデニル、Gはリボグアニル、Cは
リボシチジル、およびUはウリジルである]。 本明細書中において、アデノウイルスの3分節リーダー
の「最初の部分」とは、少なくとも以下の配列を含有する
ものである: 【化12】 【0050】すなわち本発明は、有用な物質をコードし
ているDNA配列および真核生物性プロモーターの両者
を含有している組換えDNAベクターで形質転換した真
核宿主細胞において、該有用な物質を産生させるための
方法(該プロモーターから発現するように該配列を配置
し、該有用な物質の発現に適した条件下で該ベクターを
含有する該細胞を培養する)の改良法であって、mRNA
がアデノウイルスの完全な3分節リーダーを含有しない
という限定のもと、改良点が、(a)アデノウイルスの3
分節リーダーの最初の部分をコードしているDNAを該
ベクター中に導入して、転写に際して、生成したmRN
Aが該有用な産物をコードし、そしてその5'末端にお
いて該3分節リーダーの最初の部分を含有しているよう
にすること、(b)工程a)のベクターを含有している該細
胞に、該アデノウイルスのVA遺伝子産物の発現をコー
ドしているDNA配列を付与すること、および(c)該V
A遺伝子産物の発現および該mRNAの翻訳の刺激に適
した条件下で工程b)の細胞を培養すること、からなる方
法を含有するものである。 【0051】VAをコードしているプラスミドは、アデ
ノウイルスDNAから構築した。アデノウイルス−2
DNAから、ヌクレオチド9833のSalI部位および
ヌクレオチド11556のHindIII部位を境界とす
る〜1723bpの制限フラグメントを単離し、HindI
II−SalI消化したプラスミドpBR322中にクロ
ーンし、こうしてpBR322の〜622bp SalI−H
indIIIフラグメントを置換してプラスミドpVAを構
築した。プラスミドpVAから〜1826bp NruIフラ
グメントを単離し、このフラグメントをクレノウ処理し
たBamHI消化プラスミドpSVNeo(BRLから入手可
能)中に挿入することによって、ネオマイシン耐性およ
びVAをコードしているプラスミドを構築した。得られ
たプラスミド(pVA−Neoと命名した)を用い、形質転
換後のネオマイシン(G418)耐性選択によって、すべ
てのセルラインにVA遺伝子を挿入することができる。 【0052】SV40、BKウイルス、またはその他の
すべてのポリオーマウイルスのT−抗原を本発明のベク
ターとともに用いて、複製を刺激することによりプラス
ミドのコピー数を増加させ、そして/またはプロモータ
ー活性を増加させることができる。SV40 T−抗原
はアデノウイルスおよびBK後期プロモーターの両者か
らの転写を刺激する。本発明の発現ベクターにT−抗原
コード化配列を含有させること、またはこのベクターを
T−抗原コード化配列を有するプラスミドと同時トラン
スフェクションすることにより、実施例19に概説した
ように選択圧の応用に先だって、コピー数の増幅を得る
ことができる。これは、発現ベクターの高コピー数組み
込みを可能にする。 【0053】従って、本発明の好ましい態様において
は、組換えDNA発現ベクターは、アデノウイルス後期
プロモーター(それ自身は、少なくとも3分節リーダー
の最初の部分および有用な物質をコードしている遺伝子
を発現させるように配置されている)の上流側300ヌ
クレオチド以内に配置した原型菌株のBKエンハンサー
を含有する。この好ましいベクターを用い、修飾を加え
て(発現ベクターで形質転換する前または後に)アデノウ
イルスのVA遺伝子産物を発現させるようにしたヒト胎
児腎293細胞を形質転換する。 【0054】以下に実施例を挙げて、本発明の方法、化
合物および組換え微生物をさらに詳しく説明するが、実
施例中に記載した特定の試薬、装置および方法は単に説
明のために挙げたものであって、本発明を限定するもの
ではない。 【0055】実施例1 BKウイルスDNAの調製 BKウイルスを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(ATCC)から取得番号ATCC VR−8
37のもとで入手する。このウイルスは凍結乾燥品とし
て得られ、これをハンク(Hank)のバランス塩[ギブコ
(Gibco,3175Staley Road,Grand Island,NY
14072)]に再懸濁して約105プラーク生成単位(pf
u)/mlの力価にする。BKウイルスDNA調製用に選択
した宿主は1次(プライマリー)ヒト胎児腎(PHEK)細
胞であり、この細胞はフロウ・ラボラトリーズ社(Flow
Laboratories,Inc.,7655 Old Springhouse R
oad,McLean,VA 22101)からカタログ番号0−
100のもとで、またはM.A.バイオプロダクツ(M.
A.Bioproducts)からカタログ番号70−151のもと
で入手することができる。 【0056】全面単層の約106PHEK細胞を含有す
る75mm2ポリスチレンフラスコ約5個を用いてウイル
スを調製する。力価105pfu/mlのBKウイルス約1ml
を各フラスコに加え、これを37℃で1時間インキュベ
ートし、次いで新鮮な培養培地[10%ウシ胎児血清を
追加したデルベッコの改良イーグル培地(Delbecco's
Modified Eagle's Medium,Gibco)]を加え、感染細
胞を37℃で10−14日間またはウイルスの完全な細
胞病原性効果が認められるまでインキュベートする。こ
の細胞病原性効果はセルラインの種類およびウイルスの
種類によって変わるが、通常、丸くなり、凝集し、そし
て培養盤から剥がれる細胞からなる。 【0057】凍結−解凍を3回繰り返すことによってこ
の細胞からウイルスを放出させ、5000Xgで遠心し
て細胞破片を除去する。PEG−6000(100g)を
加え、この溶液を4℃で24時間インキュベートし、そ
して5000Xgで20分間遠心することによって、上
清液1l中のウイルスを沈澱させ、集める。このペレッ
トを、最初の容積の1/100となるように0.1X S
SC緩衝液[1X SSC=0.15M NaClおよび0.
015Mクエン酸Na(pH=7)]に溶解する。このウイ
ルス懸濁液を、試験管中の飽和KBr溶液15mlに層状
に加え、これを75,000Xgで3時間遠心する。遠心
後、このKBr溶液中に2つのバンドが現れる。完全な
ビリオンを含有する低い方のバンドを集め、TE[10m
Mトリス−HCl(pH=7.8)および1mM EDTA]を
溶離緩衝液として用いてセファデックス(Sephadex)G
−50カラムで脱塩する。 【0058】このカラムから得た精製ビリオン溶液に、
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1%濃度となるよう
に加え、プロナーゼを100μg/ml濃度となるように
加え、そしてこの溶液を37℃で2時間インキュベート
する。次いで、この溶液に塩化セシウムを1.56g/ml
濃度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度10
0μg/mlとなるように加える。この溶液を、ソーバル
(Sorval)865ローターまたは同様の垂直ローター
中、260,000Xgで24時間遠心する。遠心後、ウ
イルスDNAのバンドを単離し、100mMトリス−H
Cl(pH=7.8)で飽和したイソアミルアルコールで5
回抽出する。次いでこのBKウイルスDNAの溶液を、
DNAの260nm/280nm吸収比が1.75と1.90
の間に入るまで、TE緩衝液に対して透析する。NaCl
濃度を0.15Mに調整し、2倍量のエタノールを加
え、この溶液を−70℃で少なくとも2時間インキュベ
ートし、そして12,000Xgで10分間遠心すること
によってDNAを沈澱させる。得られたBKウイルスD
NAのペレットを、1mg/mlの濃度でTE緩衝液に懸濁
させる。 【0059】実施例2 プラスミドpBKE1およびpB
KE2の構築 TE緩衝液1μl中のBKウイルスDNA(実施例1で調
製した)約1μgを、10×EcoRI緩衝液[1.0Mトリ
ス−HCl(pH=7.5)、0.5M NaCl、50mM M
gCl2および1mg/ml BSA]2μlおよび水15μlに
溶解した。このDNA溶液に、制限酵素EcoRI約2μ
l[〜10単位:酵素の実際の供給源は異なることもある
が、本明細書中で用いるすべての酵素単位は、他に記載
がなければ、ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ne
w England Biolabs,32 Tozer Road,Beverly,M
A 01915−9990)定義の単位を意味する]を加
え、得られた反応溶液を37℃で2時間インキュベート
した。 【0060】実質的に、EcoRI消化したBKウイルス
DNAを調製するための方法に従って、TE緩衝液1μ
l中のプラスミドpUC8[ファーマシア P−L バイオ
ケミカルズ(Pharmacia P−L Biochemicals,800
Centennial Ave.,Piscataway,N.J.08854)か
ら入手可能]約1μgをEcoRIで消化した。このEcoR
I消化したプラスミドpUC8 DNAをTE緩衝液で1
00μlに希釈し、この溶液にウシ腸アルカリホスファ
ターゼ〜0.06単位を加え、得られた反応溶液を37
℃で30分間インキュベートした。1×SET[5mMト
リス−HCl(pH=7.8)、5mM EDTAおよび15
0mM NaCl]、0.3M NaOAc、および0.5%SD
Sを含有するようにこの溶液を調整し、次いで65℃で
45分間インキュベートした。このホスファターゼ処理
はpUC8 DNAが自己ライゲートするのを防止する。 【0061】このEcoRI消化したBKウイルスおよび
プラスミドpUC8 DNAを、始め緩衝フェノールで、
次いでクロロホルムで抽出した。各DNA溶液のNaCl
濃度を0.25Mに調整し、2倍量のエタノールを加
え、得られた混合物をドライアイス−エタノール浴で5
分間インキュベートし、そして遠心してDNAをペレッ
ト化することによってDNAを集めた。上清を除去し、
DNAペレットを70%エタノールですすぎ、乾燥し、
そしてBKおよびプラスミドpUC8試料用のTE緩衝
液それぞれ10μlおよび30μlに再懸濁した。 【0062】水約3μlおよび10×リガーゼ緩衝液
[0.5Mトリス−HCl(pH=7.8)、100mM MgC
l2、200mM DTT、10mM ATP、および0.5m
g/mlBSA]1μlを、EcoRI消化したBKウイルス
2μlおよびEcoRI消化したプラスミドpUC8 DN
A1μlの混合物に加えた。このDNA溶液にT4 DN
Aリガーゼ1μl(〜1000単位)を加え、得られた反
応液を16℃で一晩インキュベートした。このライゲー
ト化DNAは所望のプラスミドpBKE1およびpBKE
2からなり、これらは挿入したBKウイルスDNAの配
向だけが異なっている。プラスミドpBKE1の制限部
位および機能地図を添付の図2に示す。 【0063】L−ブロス中のE.コリ(E.coli)K12
JM103(ファーマシア P−L バイオケミカルズか
ら入手可能)培養物50mlを、650ナノメーターにお
ける光学密度(O.D.650)が約0.4吸収単位になるまで
増殖させた。この培養物を氷上で10分間冷却し、遠心
して細胞を集めた。この細胞ペレットを100mMの冷
MgCl225mlに再懸濁し、氷上で25分間インキュベ
ートした。この細胞を遠心してもう一度ペレット化し、
ペレットを100mMの冷CaCl22.5mlに再懸濁し、
氷上で30分間インキュベートした。インキュベート
後、この細胞は形質転換するDNAの取り込みに対して
コンピテントである。 【0064】この細胞懸濁液200μlを、上記のよう
にして調製したライゲート化DNAと混合し、氷上で3
0分間インキュベートした。この時間が経過した後、細
胞を42℃の水浴に2分間入れ、次いで氷上に戻してさ
らに10分間インキュベートした。遠心して細胞を集
め、L−ブロス1mlに再懸濁し、37℃で1時間インキ
ュベートした。 【0065】この細胞混合物の一部を、100μgアン
ピシリン/ml、40μg X−gal/mlおよび40μgIP
TG/ml含有のL−寒天(1lあたり寒天15g含有する
L−ブロス)プレート上にプレートした。このプレート
を37℃で一晩インキュベートした。挿入体を含まない
プラスミドを含有するコロニー(E.コリK12 JM1
03/pUC8など)はプレート上で青色を呈し、挿入体
を含むプラスミドを含有するコロニー(E.コリK12
JM103/pBKE1)は白色を呈する。白色コロニー
数個を選び、それらのプラスミドDNAの制限酵素分析
によって、BKウイルスの〜5.2kb EcoRI制限フラ
グメントの存在についてスクリーニングした。実質的
に、後記実施例記載のプラスミドDNAの単離方法に従
って(制限酵素分析のためだけにプラスミドDNAを単
離するときには、CsCl勾配の工程を省略し、比較的小
さいスケールで行う)、E.コリK12 JM103/pB
KE1およびE.コリK12 JM103/pBKE2細
胞からプラスミドDNAを得た。 【0066】実施例3 プラスミドpBKneo1およびp
BKneo2の構築 E.コリK12 HB101/pdBPV−MMTneo細胞
を、ATCCから取得番号ATCC 37224のも
と、凍結乾燥品として入手する。この凍結乾燥細胞を、
100μg/mlのアンピシリンを含有するL−寒天プレ
ート上にプレートし、37℃でインキュベートして単一
のコロニー単離体を得る。 【0067】50μg/mlのアンピシリンを含有するL
−ブロス(1lあたりトリプトン10g、NaCl 10g、
および酵母抽出物5g)1lにE.コリK12 HB101
/pdBPV−MMTneoのコロニーを接種し、空気振盪
器中、37℃で、O.D.590が〜1吸収単位になるまで
インキュベートし、この時点でクロラムフェニコール1
50mgを培養物に加えた。インキュベートを約16時間
継続した。クロラムフェニコールの添加によりタンパク
質の合成が阻害され、従って細胞***が阻害されるが、
プラスミドの複製は継続して起こり得る。 【0068】この培養物を、ソーバル(Sorvall)GSA
ローター(DuPont Co.,Instrument Products,Biom
edical Division,Newtown,CN 06470)中、60
00rpm、4℃で5分間遠心した。得られた上清を除去
し、細胞ペレットをTES緩衝液[10mMトリス−HC
l(pH=7.5)、10mM NaCl、および1mM EDT
A]40mlで洗浄し、次いで再ペレット化した。上清を
除去し、細胞ペレットをドライアイス−エタノール浴で
凍結させ、次いで解凍した。解凍した細胞ペレットを、
25%ショ糖および50mM EDTAの溶液10mlに再
懸濁した。この溶液に5mg/mlリソチーム溶液約1ml、
0.25MのEDTA(pH=8.0)3ml、および10mg
/mlのRNアーゼA 100μlを加え、次いで氷上で1
5分間インキュベートした。このリソチーム処理した細
胞に、溶解溶液[10%トリトン−X100(3ml)、0.
25M EDTA(pH=8.0)75ml、1Mトリス−H
Cl(pH=8.0)15ml、および水7mlを混合して調製
する]3mlを加え、混合し、得られた溶液を氷上でさら
に15分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴で凍結させ、ついで解凍した。 【0069】SW27ローター(Beckman,7360N.
Lincoln Ave.,Lincolnwood,IL60646)中、2
5,000rpmで40分間遠心し、緩衝フェノールで抽出
することによって、溶液から細胞の残骸を除去した。こ
の細胞抽出物に、CsCl約30.44gおよび5mg/ml臭
化エチジウム溶液〜1mlを加え、次いでこの溶液の容量
をTES緩衝液で40mlに調整した。この溶液をVTi
50超遠心管(Beckman)中にデカンテーションし、次い
で封をし、VTi50ローター中、42,000rpmで〜
16時間遠心した。紫外線で目に見えるようにしたプラ
スミドのバンドを単離し、Ti75遠心管およびロータ
ー(Beckman)に入れ、50,000rpmで16時間遠心し
た。必要な容量調整はすべて0.761g/mlのCsClを
含有するTESを用いて行った。このプラスミドバンド
をもう一度単離し、塩で飽和させたイソプロパノールで
抽出して臭化エチジウムを除去し、そしてTES緩衝液
で1:3に希釈した。次いでこの溶液に2倍量のエタノ
ールを加え、−20℃で一晩インキュベートした。この
溶液を、SS34ローター(Sorvall)中、10,000r
pmで15分間遠心することによって、プラスミドDNA
をペレット化した。 【0070】この方法によって得たプラスミドpdBPV
−MMTneoDNA〜1mgをTE緩衝液1mlに懸濁さ
せ、−20℃で保存した。通常、前記のプラスミド単離
法は、大量の極めて純粋なプラスミドDNAが必要なと
きに用いられる。この方法を若干変え、培養細胞を約5
mlだけ用い、適宜減少させた溶解緩衝液中で細胞を溶解
し、そして遠心工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に置き換えることによって、比較的少量の、やや純度
の劣るDNA(あるプラスミドの存在について形質転換
体をスクリーニングする場合に必要となるようなDN
A)を早く得ることができる。 【0071】10×BamHI緩衝液[1.5M NaCl、
60mMトリス−HCl(pH=7.9)、60mM MgC
l2、および1mg/mlBSA]2μl、制限酵素BamHI
1μlおよび水7μlを含有する溶液中、37℃で2時
間、上記で調製したプラスミドpdBPV−MMTneoD
NA約5μg(5μl)および実施例1で調製したBKウイ
ルスDNA5μg(5μl)それぞれを消化した。等容量の
フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで2回抽出す
ることによって反応を呈しさせた。BamHI消化したD
NAそれぞれを沈澱させ、遠心して集め、水5μlに再
懸濁した。 【0072】BamHI消化したプラスミドpdBPV−M
MTneo(1μl)およびBamHI消化したBKウイルスD
NA(1μl)の混合物に、10×リガーゼ緩衝液約1μl
を加えた。このDNA混合物に、T−4 DNAリガー
ゼ1μl(〜1000単位)および水6μlを加え、得られ
た反応溶液を16℃で一晩インキュベートした。このラ
イゲート化DNAは所望のプラスミドpBKneo1および
pBKneo2からなり、これらはBKウイルスDNAの配
向だけが異なっている。プラスミドpBKneo1の制限部
位および機能地図を添付の図3に示す。 【0073】E.コリK12 HB101細胞は、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー(NRRL)
から取得番号NRRL B−15626のもと、凍結乾
燥品として入手可能である。実質的に、実施例2の方法
に従って、E.コリK12 HB101細胞を培養し、形
質転換用にコンピテントにし、上記で調製したライゲー
ト化DNAで形質転換した。この形質転換細胞を、10
0μg/mlアンピシリンを含有するL−寒天プレート上
にプレートした。E.コリK12 HB101/pBKneo
1およびE.コリK12/pBKneo2形質転換体を、そ
のアンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドDN
Aの制限酵素分析によって同定した。 【0074】実施例4 プラスミドpBLcatの構築 A.中間体プラスミドpLPcatの構築 アデノウイルス2(Ad2)のビリオンDNAは、約35.
94kbの大きさの、2本鎖の直線状分子である。このA
d2の後期プロモーターは、Ad2ゲノムの〜0.316k
b AccI−PvuII制限フラグメントとして単離するこ
とができ、この〜0.32kb制限フラグメントは、Ad2
ゲノムのヌクレオチド位置5755と6071の間の配
列に対応している。所望の〜0.32kb AccI−PvuI
I制限フラグメントを単離するため、始めにAd2 DN
Aを制限酵素BalIで消化し、〜0.32kb AccI−P
vuII制限フラグメントの完全な配列を含有する〜2.
4kb BalI制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜2.4kb BalI制限フラグメントをAccIおよびP
vuIIで消化して所望のフラグメントを得る。 【0075】Ad2 DNA(BRLから入手可能)約50
μgを、水80μlおよび10×BalI緩衝液[100mM
トリス−HCl(pH=7.6)、120mM MgCl2、10
0mM DTT、および1mg/mlBSA]10μlに溶解す
る。このAd2 DNAの溶液に、制限酵素BalI約10
μl(〜20単位)を加え、得られた反応液を37℃で4
時間インキュベートする。 【0076】制限フラグメントが十分に分離するまで、
BalI消化したDNAをアガロースゲル電気泳動にかけ
る。電気泳動したDNAの可視化は、臭化エチジウムの
希釈溶液(0.5μg/ml)中でゲルを染色し、染色したゲ
ルに長波長紫外光(UV)をあてることによって行う。ア
ガロースからDNAを単離する方法の1つは以下のよう
である。所望のフラグメントの前方のゲルに小さい切れ
目を入れ、各切れ目にNA−45 DEAEメンブラン
[シュライヒャー・アンド・シュエル(Schleicher and
Schuell,Keene,NH 03431)]の小片を差し込
む。さらに電気泳動を続けると、DNAがDEAEメン
ブランに非共有結合的に結合する。所望のフラグメント
がDEAEメンブランに結合した後、メンブランを取り
上げ、低塩の緩衝液[100mM KCl、0.1mM ED
TA、および20mMトリス−HCl(pH=8)]ですす
ぐ。次いで、メンブランを小さい試験管に入れ、高塩の
緩衝液[1M NaCl、0.1mM EDTA、および20m
M トリス−HCl(pH=8)]中に浸漬し、そして65℃
で1時間インキュベートしてDEAE紙からDNAを取
り出す。65℃のインキュベーションの後、インキュベ
ート緩衝液を集め、メンブランを高塩緩衝液ですすぐ。
この高塩緩衝液ですすいだ溶液を、高塩インキュベート
緩衝液といっしょにプールする。 【0077】NaCl濃度が0.25Mとなるように、高
塩−DNA溶液の容積を調整し、次いでこの溶液に3倍
量の無水の冷エタノールを加える。得られた溶液を混合
し、10−20分間、−70℃に保つ。次いでこの溶液
を15,000rpmで15分間遠心する。残留する塩を除
去するため、もう一度この沈澱操作を行った後、DNA
ペレットをエタノールですすぎ、乾燥し、TE緩衝液2
0μl中に再懸濁する。このペレットはAd2の所望の制
限フラグメント約3μgからなる。得られた精製フラグ
メントをTE緩衝液10μlに溶解する。 【0078】水約6μlおよび10×AccI緩衝液[60
mM NaCl、60mMトリス−HCl(pH=7.5)、60
mM MgCl2、60mM DTT、および1mg/ml BS
A]2μlを、Ad2の〜2.4kb BalI制限フラグメン
トの溶液に加える。このDNA溶液に制限酵素AccI約
2μl(〜10単位)を加えた後、反応液を37℃で2時
間インキュベートする。このAccI消化の後、DNAを
エタノール沈澱で集め、水16μlおよび10×PvuI
I緩衝液[600mM NaCl、60mMトリス−HCl(p
H=7.5)、60mM MgCl2、60mM DTT、およ
び1mg/ml BSA]2μl中に再懸濁する。このDNA
溶液に制限酵素PvuII約2μl(約10単位)を加えた
後、反応液を37℃で2時間インキュベートする。 【0079】Ad2の後期プロモーターを含有する〜0.
32kb AccI−PvuII制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、AccI−PvuII消化した、A
d2の〜2.4kb BalI制限フラグメントを〜6%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかける。このゲルを臭化
エチジウムで染色し、UV光を用いて観察し、〜0.3
2kb AccI−PvuII制限フラグメントを含有するゲ
ルセグメントをゲルから切り出し、つぶし、抽出緩衝液
[500mM NH4OAc、10mM MgOAc、1mM E
DTA、および0.1%SDS]〜250μl中に、室温
で一晩浸漬する。翌朝、この混合物を遠心し、ペレット
を除去する。上清中のDNAをエタノールで沈澱させ、
tRNA約2μgを加えて所望のフラグメントの沈澱を完
全なものにする。〜0.32kb AccI−PvuII制限フ
ラグメント約0.2μgが得られ、これを水7μlに懸濁
させる。 【0080】実質的に、後記実施例10Aに記載した方
法に従って、キナーゼ処理しておいたBclIリンカー
[5'−CTGATCAG−3';ニュー・イングランド・
バイオラブズ(New England Biolabs)から入手可能]
約0.25μg(0.5μl中)を、〜0.32kb AccI−P
vuII制限フラグメントの溶液に加え、次いでこのDN
A溶液にT4 DNAリガーゼ1μl(〜1000単位)お
よび10×リガーゼ緩衝液1μlを加え、得られた反応
液を16℃で一晩インキュベートした。このBclIリン
カーは、AccI−PvuII制限フラグメントのPvuII
末端にだけライゲートすることもある。後に行ったDN
A配列決定により、AccI−PvuII制限フラグメント
のPvuII末端には4個のBclIリンカーが結合してい
ることがわかった。これら余分のBclIリンカーをBcl
I消化および再ライゲートによって除去することができ
るが、これらのリンカーは余分のリンカーを含有するベ
クターの正しい機能を妨害しないので、これら余分のB
clIリンカーを除去しなかった。 【0081】E.コリK12 HB101/pSV2cat細
胞をATCCから取得番号ATCC37155のもと、
凍結乾燥品として入手し、実質的に実施例3の方法に従
ってこの細胞からプラスミドpSV2cat DNAを単離
した。プラスミドpSV2catの制限部位および機能地図
を添付の図4に示す。プラスミドpSV2cat DNA約
1mgが得られ、これをTE緩衝液1mlに溶解する。プラ
スミドpSV2cat DNA約3μg(3μl)を10×Acc
I緩衝液2μlおよび水16μlに加え、次いで制限酵素
AccI3μl(約9単位)をこのpSV2cat DNA溶液に
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。次いで、10×StuI緩衝液[1.0M NaCl、
100mMトリス−HCl(pH=8.0)、100mM Mg
Cl2、60mM DTT、および1mg/ml BSA]3μ
l、水5μl、および制限酵素StuI約2μl(約10単
位)を加えることにより、このAccI消化したプラスミ
ドpSV2cat DNAを制限酵素StuIで消化した。得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。こ
の反応混合物をフェノールで1回、次いでクロロホルム
で2回抽出することによって反応を停止させた。所望の
フラグメント約0.5μgが得られ、これをTE緩衝液2
0μlに溶解した。 【0082】AccI−StuI消化したプラスミドpSV
2cat DNA約4μlを、Ad2の〜0.32kb AccI−
PvuII(BclIリンカーが結合している)制限フラグメ
ント約7μlと混合し、10×リガーゼ緩衝液3μl、水
15μl、およびT4 DNAリガーゼ2μl(約1000
単位)を加えた後、このライゲーション混合物を16℃
で一晩インキュベートした。このライゲートしたDNA
は所望のプラスミドpLPcat、すなわち、Ad2後期プ
ロモーター(クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を転写し、これを発現させるように配置
されている)を含有するプラスミドからなっていた。プ
ラスミドpLPcatの制限部位および機能地図を添付の図
5に示す。 【0083】実質的に実施例3の方法に従い、このライ
ゲート化DNAを用いてE.コリK12 HB101細胞
を形質転換した。形質転換細胞を、50μg/mlアンピ
シリンを含有するL−寒天で平板培養した。プラスミド
DNAの制限酵素分析を用いてE.コリK12 HB10
1/pLPcat形質転換体を同定した。実施例3に記載し
たプラスミド単離法に実質的に従って、後の構築に用い
るためにプラスミドpLPcat DNAを形質転換体から
単離した。 【0084】B.プラスミドpBLcatの最終的な構築 10×AccI緩衝液7.5μl、水30μl、および制限
酵素AccI15μl(約75単位)に、TE緩衝液50μl
中のプラスミドpBKneo1DNA約88μgを加え、得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。A
ccI消化したBKウイルスDNAをアガロースゲルにか
け、BKエンハンサーを含有する〜1.4kbフラグメン
トを他の消化産物から分離した。次いで、実施例4A記
載の方法に実質的に従って、〜1.4kb AccI制限フラ
グメントを単離した。このフラグメント約5μgを、1
0×PvuII緩衝液5μl、水45μl、および制限酵素
PvuII 5μl(約25単位)中に再懸濁し、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。次いで、実
質的に実施例4Aの方法に従って、PvuII消化したD
NAをライゲーション用に単離し、調製した。所望の〜
1.28kb AccI−PvuIIフラグメントが約2μg得
られ、これをTE緩衝液5μlに溶解した。 【0085】プラスミドpLPcat DNA約1μgを、1
0×AccI緩衝液5μlおよび水40μlに溶解した。制
限酵素AccI約5μl(〜25単位)をプラスミドpLPc
atDNAの溶液に加え、得られた反応液を37℃でイ
ンキュベートした。AccI消化したプラスミドpLPc
at DNAをエタノールで沈澱させ、10×StuI緩衝
液5μl、水40μl、および制限酵素StuI 5μl(約
25単位)中に再懸濁し、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。AccI−StuI消化したプラ
スミドpLPcat DNAをエタノールで数回沈澱させ
て、他の消化産物(大きさが16bpの制限フラグメント)
を含まない、E.コリの複製期限およびAd2後期プロモ
ーターを含有する〜4.81kb AccI−StuI制限フラ
グメントを精製した。所望の〜4.81kb制限フラグメ
ントが約1μg得られ、これをTE緩衝液20μlに溶解
した。 【0086】プラスミドpLPcatの〜4.81kb AccI
−StuI制限フラグメント5μlを、BKウイルスの
1.28kb AccI−PvuII制限フラグメント5μlに
加えた。このDNA混合物に、10×リガーゼ緩衝液3
μl、水15μl、およびT4DNAリガーゼ2μl(約1
000単位)を加えた後、このライゲーション反応液を
16℃で一晩インキュベートした。このライゲート化D
NAは所望のプラスミドpBLcatからなっていた。プラ
スミドpBLcatの制限部位および機能地図を添付の図6
に示す。 【0087】実施例3記載の方法に実質的に従い、この
ライゲート化DNAを用いてE.コリK12 HB101
細胞を形質転換した。プラスミドDNAの制限酵素分析
によって、E.コリK12 HB101/pBLcat形質転
換体を同定した。実質的に実施例3の方法に従って、後
の構築に用いるためにプラスミドpBLcat DNAを調
製した。 【0088】実施例5 プラスミドpSBLcatの構築 プラスミドpBLcat DNA約100μgを、10×Hin
dIII緩衝液[0.5M NaCl、0.1Mトリス−HCl
(pH=8.0)、0.1M MgCl2、および1mg/ml BS
A]10μlおよび水80μlに溶解した。このプラスミ
ドpBLcatDNAの溶液に、制限酵素HindIII約1
0μl(約100単位)を加え、得られた反応液を37℃
で2時間インキュベートした。BKエンハンサーおよび
Ad2後期プロモーターを含有する〜0.87kb HindI
II制限フラグメントが他の消化産物から十分に分離す
るまで、HindIII消化したプラスミドpBLcat DN
Aをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、この〜0.87kbフラグ
メントをライゲーション用に単離し、調製した。目的の
フラグメントが約10μg得られ、これをTE緩衝液5
0μlに溶解した。 【0089】TE緩衝液1μl中のプラスミドpSV2ca
t DNA約1μgを、10×HindIII緩衝液2μlお
よび水16μlに溶解した。このDNA溶液に制限酵素
HindIII約1μl(約10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。この反応混合
物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで2回抽
出することによって、反応を停止させた。HindIII
消化したプラスミドpSV2cat DNAをエタノールで
沈澱させ、TE緩衝液100μlに再懸濁した。このHi
ndIII消化したプラスミドpSV2cat DNAを、実
質的に実施例2の方法に従って、ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼで処理し、次いでTE緩衝液10μlに再懸濁
した。 【0090】プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind
III制限フラグメント約5μlを、HindIII消化し
たプラスミドpSV2cat 10μlに加え、次いでこのD
NA溶液に、10×リガーゼ緩衝液3μl、T4 DNA
リガーゼ2μl(約1000単位)、および水13μlを加
え、この反応液を16℃で2時間インキュベートした。
このライゲート化DNAは目的のプラスミドpSBLcat
からなっていた。このライゲート化DNAを用い、実質
的に実施例3の方法に従って、E.コリK12HB10
1を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有の
L−寒天で平板培養し、制限酵素分析によってアンピシ
リン耐性形質転換体のプラスミドDNAを試験して、
E.コリK12 HB101/pSBLcat形質転換体を同
定した。BKエンハンサーおよびAd2後期プロモータ
ーをコードしている〜0.87kb HindIII制限フラ
グメントは、HindIII消化したプラスミドpSBLca
t中に、2つの配向のうちのいずれかで挿入される(その
うちの1つだけがプラスミドpSBLcatを与える)。プラス
ミドpSBLcatの制限部位および機能地図を添付の図8
に示す。 【0091】実施例6 プラスミドpL133の構築 A.中間体プラスミドpSV2−HPC8の構築 プラスミドpHC7はヒトタンパク質Cをコードしてい
るDNA配列を含有している。15μg/mlのテトラサ
イクリンを含有するL−ブロス1lにE.コリK12 R
R1/pHC7(NRRL B−15926)の培養物を接
種し、実質的に実施例3の方法に従ってプラスミドpH
C7 DNAを単離し、精製した。この操作により約1m
gのプラスミドpHC7 DNAが得られ、これをTE緩
衝液1mlに懸濁し、−20℃で保存した。プラスミドp
HC7の制限部位および機能地図を添付の図9に示す。 【0092】プラスミドpHC7 DNA50μlを、制
限酵素BanI 5μl(〜50単位)、10×BanI反応緩
衝液[1.5M NaCl、60mMトリス−HCl(pH=7.
9)、60mM MgCl2、および1mg/ml BSA]10μ
lおよび水35μlと混合し、消化が完結するまでインキ
ュベートした。次いで、〜1.25kb BanI制限フラグ
メントが他の消化産物から分離するまで、このBanI消
化したプラスミドpHC7 DNAを3.5%ポリアクリ
ルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=2
9:1)電気泳動にかけた。 【0093】この〜1.25kb BanI制限フラグメント
を含有するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入
れ、細かくつぶした。このフラグメントを含有する試験
管に抽出緩衝液(500mM NH4OAc、10mM MgO
Ac、1mM EDTA、1%SDS、および10mg/ml
tRNA)1mlを加え、一晩試験管を37℃に保った。遠
心して残骸をペレット化し、上清を新しい試験管に移し
た。残骸を抽出緩衝液200μlで1回洗浄し、洗浄液
の上清を、最初の、一晩抽出物からの上清といっしょに
した。この上清を、ガラスウールを詰めたところに通し
た後、2倍量のエタノールを加え、混合した。得られた
溶液を〜10分間ドライアイス−エタノール浴に入れ、
次いで遠心してDNAをペレット化した。 【0094】この操作により約8μgの〜1.25kb Ba
nI制限フラグメントが得られた。この精製フラグメン
トをTE緩衝液10μlに懸濁し、−20℃で保存し
た。プラスミドpSV2−HPC8を構築するために
は、リンカーを付加することによってBanI制限フラグ
メントを修飾しなければならない。このリンカーの構築
に用いるDNAフラグメントを、システック 1450
A DNA合成機(Systec1450A DNA Synthesi
zer;Systec Inc.,3816 Chandler Drive,Minne
apolis,MN)またはABS 380A DNA合成機(Ap
plied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Centre D
rive,Foster City,CA 94404)のどちらかを用
いることによって合成した。当分野においては多数のD
NA合成装置が知られており、これらを用いてフラグメ
ントを調製することができる。さらに、実質的にイタク
ラ等[Itakura et al.,Science,198:1056(19
77)]およびクレア等[Crea et al.,Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA,75:5765(1978)]の方法に従っ
て、常法によりフラグメントを調製することもできる。 【0095】T4ポリヌクレオチドキナーゼ15単位
(〜0.5μl)、10×リガーゼ緩衝液2μl、500μ
M ATP10μl、および水7.5μlを含有する反応緩
衝液20μl中で、1本鎖リンカーそれぞれ500ピコ
モルをキナーゼ処理した。このキナーゼ反応液を37℃
で30分間インキュベートし、次いで100℃で10分
間インキュベートすることによって反応を止めた。キナ
ーゼ化を完全にするため、反応液を氷で冷却し、反応混
合物に0.2Mジチオトレイトール2μl、5mMATP
2.5μl、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ15単
位を加えて混合し、この反応混合物を37℃でさらに3
0分間インキュベートした。100℃でさらに10分間
インキュベートすることによって反応を止め、次いで氷
で冷却した。 【0096】キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ
反応後、2種類の1本鎖DNAリンカーをいっしょにし
て混合した。これらの鎖をアニールするため、キナーゼ
反応混合物を、〜150mlの水を入れた水浴中、100
℃で10分間インキュベートした。インキュベート後、
水浴の栓を止め、室温まで冷却した。この過程に約3時
間かかった。次いで、キナーゼ処理したDNAの試験管
がまだ入っている水浴を4℃で一晩インキュベートし
た。この操作により1本鎖がアニールされた。作成した
リンカーは以下の構造を有していた: 【化13】 このリンカーを使用時まで−20℃で保存した。〜1.
25kb BanIフラグメント〜8μgを、リンカー〜50
μl(〜500ピコモル)、T4 DNAリガーゼ1μl(約
500単位)、10×リガーゼ緩衝液10μl、および水
29μlに加えて混合し、このライゲーション反応液を
4℃で一晩インキュベートした。65℃で10分間イン
キュベートすることによってライゲーション反応を止め
た。最終濃度0.3MとなるようにNaOAcを加え、2
倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴
で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによってDN
Aをペレット化した。 【0097】このDNAペレットを、10×ApaI反応
緩衝液[60mM NaCl、60mMトリス−HCl(pH=
7.4)、60mM MgCl2、および60mM 2−メルカ
プトエタノール]10μl、制限酵素ApaI 5μl(〜5
0単位)および水85μlに溶解し、反応液を2時間37
℃に保った。次いで上記のようにして反応を止め、DN
Aをペレット化した。このDNAペレットを、10×H
indIII反応緩衝液10μl、制限酵素HindIII 5
μl(〜50単位)および水85μlに溶解し、反応液を2
時間37℃に保った。HindIII消化の後、実質的に
実施例4A記載の方法に従って、反応混合物を3.5%
ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜1.23kb H
indIII−ApaI制限フラグメントを単離した。目的
のフラグメントが約5μg得られ、これをTE緩衝液1
0μlに懸濁し、−20℃で保存した。 【0098】プラスミドpHC7 DNA50μlを、制
限酵素PstI 5μl(〜50単位)、10×PstI反応緩
衝液[1.0M NaCl、100mMトリス−HCl(pH=
7.5)、100mM MgCl2、および1mg/ml BSA]
10μlおよび水35μlと混合し、37℃で2時間イン
キュベートした。次いで、実質的に上記記載の方法に従
って、PstI消化したプラスミドpHC7 DNAを、
3.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目的
の〜0.88kbフラグメントを精製した。目的のフラグ
メント約5μgが得られ、これをTE緩衝液10μlに懸
濁し、−20℃で保存した。 【0099】この〜0.88kb PstIフラグメント〜5
μgを、自動DNA合成機で作成した以下のリンカー〜
50μlに加えて混合した: 【化14】 このDNA混合物に、T4 DNAリガーゼ約1μl(〜
10単位)、10×リガーゼ緩衝液10μl、および水2
9μlを加え、得られたライゲーション反応液を4℃で
一晩インキュベートした。 【0100】このライゲーション反応を、65℃で10
分間インキュベートすることによって止めた。ライゲー
ト化DNAを沈澱させた後、DNAペレットを10×A
paI反応緩衝液10μl、制限酵素ApaI 5μl(〜50
単位)および水85μlに溶解し、反応液を2時間37℃
に保った。次いでもう一度反応を止め、DNAをペレッ
ト化した。このDNAペレットを、10×BglII反応
緩衝液[1M NaCl、100mMトリス−HCl(pH=
7.4)、100mM MgCl2、100mM 2−メルカプ
トエタノール、および1mg/ml BSA]10μl、制限
酵素BglII 5μl(〜50単位)および水85μlに溶
解し、反応液を2時間37℃に保った。BglII消化
の後、実質的に上記記載の方法に従って、反応混合物を
3.5%ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜0.
19kb ApaI−BglII制限フラグメントを単離し
た。目的のフラグメントが約1μg得られ、これをTE
緩衝液10μlに懸濁し、−20℃で保存した。 【0101】プラスミドpSV2gpt DNA(ATCC
37145)約10μgを、10×HindIII反応緩衝
液10μl、制限酵素HindIII 5μl(〜50単位)お
よび水85μlに溶解し、反応液を2時間37℃に保っ
た。次いでこの反応混合物を、NaOAcが0.25Mと
なるようにし、2倍量のエタノールを加えてドライアイ
ス−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してD
NAをペレット化した。このDNAペレットを、10×
BglII緩衝液10μl、制限酵素BglII 5μl(〜5
0単位)および水85μlと混合し、反応液を2時間37
℃に保った。BglII消化の後、反応混合物を1%アガ
ロースゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離し
た。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見
えるようにし、目的の〜5.1kb HindIII−BglI
Iフラグメントを含有するバンドをゲルから切り出し、
これを透析管に入れ、DNAがアガロースから溶出して
しまうまで電気泳動を続けた。透析管からのDNA含有
緩衝液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次い
でDNAを沈澱させた。このペレットは目的のプラスミ
ドpSV2gptの〜5.1kb HindIII−BglII制限
フラグメント〜5μgからなり、これをTE緩衝液10
μlに再懸濁した。 【0102】〜1.23kb HindIII−ApaI制限フ
ラグメント2μl、〜0.19kb ApaI−BglIIフラ
グメント3μl、および〜5.1kb HindIII−BglI
Iフラグメント2μlをいっしょにして混合し、次い
で、10×リガーゼ緩衝液10μl、T4 DNAリガー
ゼ1μl(〜500単位)、および水82μlとともに16
℃で一晩インキュベートした。このライゲートしたDN
Aは目的のプラスミドpSV2−HPC8からなってい
た。このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の
図9に示す。 【0103】E.コリK12 RR1(NRRL B−15
210)を、実質的に実施例2記載の方法に従って、形
質転換用にコンピテントにした。上記で調製したライゲ
ート化DNAを用いてこの細胞を形質転換した。形質転
換混合物の一部を、100μg/mlアンピシリン含有の
L−寒天プレートにプレートし、このプレートを37℃
でインキュベートした。プラスミドDNAの制限酵素分
析によってE.コリK12 RR1/pSV2−HPC8
形質転換体を確認した。 【0104】B.プラスミドpL133の最終的な構築 50μgのプラスミドpSV2−HPC8を、10×Hin
dIII反応緩衝液10μl、制限酵素HindIII 5μ
l(〜50単位)および水85μlに溶解し、反応液を37
℃で2時間インキュベートした。HindIII消化の
後、DNAを沈澱させ、そのDNAペレットを10×S
alI反応緩衝液[1.5M NaCl、60mMトリス−HC
l(pH=7.9)、60mM MgCl2、60mM 2−メルカ
プトエタノール、および1mg/ml BSA]10μl、制
限酵素SalI 5μl(〜50単位)および水85μlに溶
解した。得られたSalI反応混合物を37℃で2時間イ
ンキュベートした。次いで、目的の〜0.29kb Hind
III−SalI制限フラグメントが他の反応生成物から
分離するまで、このHindIII−SalI消化したプラ
スミドpSV2−HPC8を3.5%ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけた。目的のフラグメントをゲルから
単離して約2μgのフラグメントを得、これをTE緩衝
液10μlに懸濁させた。 【0105】50μgのプラスミドpSV2−HPC8
を、10×BglII反応緩衝液10μl、制限酵素Bgl
II 5μl(〜50単位)および水85μlに溶解し、反
応液を37℃で2時間インキュベートした。BglII消
化の後、DNAを沈澱させ、そのDNAペレットを10
×SalI反応緩衝液10μl、制限酵素SalI 5μl(〜
50単位)および水85μlに溶解した。得られたSalI
反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。次い
で、目的の〜1.15kb SalI−BglII制限フラグメ
ントが他の反応生成物から分離するまで、このSalI−
BglII消化したプラスミドpSV2−HPC8を3.5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この〜
1.15kb SalI−BglII制限フラグメントをゲルか
ら単離して約8μgのフラグメントを得、これをTE緩
衝液10μlに懸濁させた。 【0106】約10μgのプラスミドpSV2−β−グロ
ビンDNA(NRRL B−15928)を、10×Hind
III反応緩衝液10μl、制限酵素HindIII 5μl
(〜50単位)および水85μlに溶解し、反応液を2時
間37℃に保った。次いでこの反応混合物を、NaOAc
が0.25Mとなるようにし、2倍量のエタノールを加
えてドライアイス−エタノール浴でインキュベートした
後、遠心してDNAをペレット化した。このHindII
I消化したプラスミドpSV2−β−グロビンを、10
×BglII緩衝液10μl、制限酵素BglII 5μl(〜
50単位)および水85μlと混合し、反応液を2時間3
7℃に保った。BglII消化の後、反応混合物を1%ア
ガロースゲル電気泳動にかけてフラグメントを分離し
た。目的の〜4.2kb HindIII−BglII制限フラ
グメントをゲルから単離して約5μgのフラグメントを
得、これをTE緩衝液10μlに懸濁させた。 【0107】プラスミドpSV2−HPC8の〜0.29
kb HindIII−SalIフラグメント2μl、プラスミ
ドpSV2−HPC8の〜1.15kb SalI−BglII
フラグメント2μl、およびプラスミドpSV2−β−グ
ロビンの〜4.2kb HindIII−BglIIフラグメン
ト2μlをいっしょにして混合し、実質的に実施例6A
の方法に従ってライゲートした。このライゲートしたD
NAは目的のプラスミドpL133からなっていた。こ
のプラスミドpL133の制限部位および機能地図を添
付の図9に示す。形質転換するDNAとして、プラスミ
ドpSV2−HPC8のかわりにプラスミドpL133を
用いること以外は、実質的に実施例6Aの教示に従っ
て、目的のE.コリK12 RR1/pL133形質転換
体を作成した。 【0108】実施例7 プラスミドpLPCの構築 プラスミドpBLcatDNA約20μgを、10×HindI
II緩衝液10μlおよび水80μlに溶解した。得られ
たプラスミドpBLcatDNAの溶液に制限酵素HindI
II約10μl(〜100単位)を加え、この反応液を3
7℃で2時間インキュベートした。次いで、BKエンハ
ンサーおよびAd2後期プロモーターを含有する〜0.8
7kb HindIII制限フラグメントが他の消化生成物か
ら分離するまで、このHindIII消化したプラスミドp
BLcatDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。次
いで、実質的に実施例4Aの方法に従って、〜0.87k
bフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約2μg得られ、これをTE
緩衝液5μlに溶解した。 【0109】プラスミドpL133 DNA約1.5μg
を、10×HindIII緩衝液2μlおよび水16μlに
溶解した。このDNA溶液に制限酵素HindIII約1
μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。次いで、このDNAをTE緩
衝液で100μlまで希釈し、実質的に実施例2の方法
に従って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。
このHindIII消化したプラスミドpL133 DNA
をフェノールで2回、クロロホルムで1回抽出し、エタ
ノールで沈澱させ、そしてTE緩衝液10μlに再懸濁
した。 【0110】プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind
III制限フラグメント約5μlを、HindIII消化し
たプラスミドpL133 1.5μlに加え、次いでこの
DNA溶液に、10×リガーゼ緩衝液1μl、T4 DN
Aリガーゼ1μl(〜1000単位)、および水1.5μl
を加え、得られた反応液を16℃で一晩インキュベート
した。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpL
PCからなっていた。プラスミドpLPCの制限部位お
よび機能地図を添付の図10に示す。 【0111】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例3の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、制限酵素分析によってアンピシリン
耐性形質転換体のプラスミドDNAを試験して、E.コ
リK12 HB101/pLPC形質転換体を同定した。
BKエンハンサーおよびAd2後期プロモーターをコー
ドしている〜0.87kb HindIII制限フラグメント
は、HindIII消化したプラスミドpSBLcat中に、
2つの配向のうちのどちらかで挿入されている(そのう
ちの1つだけがプラスミドpLPCを生じる)。 【0112】実施例8 プラスミドpLPC4およびpL
PC5の構築 実施例1で調製したBKウイルスDNA約1μg(1μl)
およびプラスミドpLPC1μg(1μl)を、10×Eco
RI緩衝液2μlおよび水14μlに溶解した。このDN
A溶液に制限酵素EcoRI約2μl(〜10単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このEcoRI消化したBKウイルスおよびプラスミ
ドpLPC DNAの混合物を緩衝フェノールで1回、ク
ロロホルムで1回抽出した。次いで、NaCl濃度を0.
25Mに調整し、2倍量のエタノールを加え、この溶液
をドライアイス−エタノール浴で2分間インキュベート
し、そして溶液を遠心してDNAをペレット化すること
によってDNAを集めた。上清を除去し、DNAペレッ
トを70%エタノールですすぎ、乾燥し、TE緩衝液1
2μlに再懸濁した。 【0113】EcoRI消化したBKウイルスおよびプラ
スミドpLPC DNAの混合物に、水約13μlおよび
10×リガーゼ緩衝液3μlを加えた。このDNA溶液
にT4DNAリガーゼ2μl(〜1000単位)を加え、
得られた反応液を16℃で2時間インキュベートした。
このライゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPC
4およびpLPC5からなり、両者は挿入したBKウイ
ルスDNAの配向だけが異なっていた。プラスミドpL
PC4の制限部位および機能地図を添付の図11に示
す。 【0114】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例3の方法に従って、E.コリK12 HB101コ
ンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を100
μg/mlアンピシリン含有のL−寒天で平板培養した。
アンピシリン耐性の表現型およびプラスミドDNAの制
限酵素分析によって、E.コリK12 HB101/pL
PC4およびE.コリK12 HB101/pLPC5形
質転換体を同定した。 【0115】実施例9 プラスミドpLPChyg1および
pLPChyg2の構築 E.コリK12 RR1/pSV2hyg細胞を、NRRLか
ら取得番号NRRLB−18039のもとで入手する。
実質的に実施例3の方法に従って、この細胞からプラス
ミドpSV2hyg DNAを得る。プラスミドpSV2hyg
の制限部位および機能地図を添付の図12に示す。 【0116】プラスミドpSV2hyg約10μg(TE緩衝
液10μl中)を、10×BamHI緩衝液2μlおよび水
6μlに加えた。このDNA溶液に、制限酵素BamHI
約2μl(約20単位)を加え、得られた反応液を37℃
で2時間インキュベートした。この反応液を始めフェノ
ールで抽出し、次いでクロロホルムで2回抽出した。実
質的に実施例4A記載の方法に従って、このBamHI消
化したプラスミドpSV2hyg DNAをアガロースゲル
にかけ、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する〜2.
5kbの制限フラグメントを単離した。 【0117】10×クレノウ緩衝液[4種類のdNTPそ
れぞれが0.2mM、0.5Mトリス−HCl(pH=7.
8)、50mM MgCl2、0.1M 2−メルカプトエタ
ノール、および100μg/ml BSA]約5μlおよび水
35μlを、BamHI消化したプラスミドpSV2hyg D
NAの溶液に加え、次いでこのDNA混合物にクレノウ
酵素(BRLから市販されている)約25単位(約5μl)
を加え、得られた反応液を16℃で30分間インキュベ
ートした。このクレノウ処理し、BamHI消化したプラ
スミドpSV2hyg DNAをフェノールで1回、クロロ
ホルムで1回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。
目的のフラグメントが約2μg得られ、これをTE緩衝
液5μlに懸濁させた。 【0118】プラスミドpLPC DNA約10μg(10
μl)を、10×StuI緩衝液2μlおよび水6μlに加え
た。このDNA溶液に、制限酵素StuI約2μl(〜10
単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。このStuI消化したプラスミドpLPC
DNAをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、10×
NdeI緩衝液[1.5M NaCl、0.1Mトリス−HCl
(pH=7.8)、70mM MgCl2、60mM 2−メルカ
プトエタノール、および1mg/ml BSA]2μlおよび
水16μlに再懸濁した。このStuI消化したDNAの
溶液に、制限酵素NdeI約2μl(〜10単位)を加え、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。 【0119】NdeI−StuI消化したプラスミドpLP
C DNAをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、1
0×クレノウ緩衝液5μlおよび水40μlに再懸濁し
た。このDNA溶液に、クレノウ酵素約5μl(〜25単
位)を加え、得られた反応液を16℃で30分間インキ
ュベートした。クレノウ反応の後、反応混合物をアガロ
ースゲルにかけ、〜5.82kb NdeI−StuI制限フラ
グメントをゲルから単離した。目的のフラグメントが約
5μg得られ、これをTE緩衝液5μlに懸濁させた。 【0120】プラスミドpSV2hygの〜2.5kbのクレ
ノウ処理したBamHI制限フラグメント約2μlを、プ
ラスミドpLPCの〜5.82kbのクレノウ処理したNde
I−StuI制限フラグメント約1μlと混合し、このD
NA溶液に、10×リガーゼ緩衝液約3μl、T4 DN
Aリガーゼ2μl(〜1000単位)、T4 RNAリガー
ゼ1μl(〜1単位)、および水14μlを加えた。得られ
た反応液を16℃で一晩インキュベートした。このライ
ゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPChyg1およ
びpLPChyg2からなり、それらはプラスミドpSV2h
ygの〜2.5kbのクレノウ処理したBamHI制限フラグ
メントの配向だけが異なっていた。プラスミドpLPCh
yg1の制限部位および機能地図を添付の図13に示す。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3の方
法に従って、E.コリK12 HB101を形質転換し
た。目的のE.コリK12 HB101/pLPChyg1お
よびE.コリK12 HB101/pLPChyg2形質転換
体を、アンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プラ
スミドDNAの制限酵素分析によって同定した。 【0121】実施例10 プラスミドpBW32の構築 A.中間体プラスミドpTPA103の構築 プラスミドpTPA102はヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子(TPA)のコード化配列を含有している。プ
ラスミドpTPA102はE.コリK12 MM294/p
TPA102(この菌株はNRRLから取得番号NRR
L B−15834のもとで入手可能である)から単離す
ることができる。プラスミドpTPA102の制限部位
および機能地図を添付の図14、図15、図16および
図17に示す。プラスミドpTPA102 DNAを、実
質的に実施例2の方法に従って、E.コリK12 MM2
94/pTPA102から単離する。 【0122】プラスミドpTPA102約50μg(TE
緩衝液約50μl中)を、10×Tth111I緩衝液[0.5
M NaCl、80mMトリス−HCl(pH=7.4)、80m
M MgCl2、80mM 2−メルカプトエタノール、およ
び1mg/ml BSA]10μlおよび水80μlに加えた。
このDNA溶液に制限酵素Tth111I約10μl(〜50
単位)を加え、得られた反応液を65℃で2時間インキ
ュベートした。この反応混合物をアガロースゲルにか
け、TPAコード化配列を含有する〜4.4kb Tth111
I制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化
産物、すなわち3.1kbおよび0.5kb制限フラグメント
は廃棄した。目的の〜4.4kb Tth111I制限フラグメ
ントが約10μg得られ、これをTE緩衝液10μlに懸
濁させた。 【0123】10×クレノウ緩衝液約5μlおよび水3
0μlに〜4.4kb Tth111I制限フラグメントを含有す
る溶液を加え、さらにクレノウ酵素約5μl(〜5単位)
を加えた後、この反応混合物を16℃で30分間インキ
ュベートした。クレノウ反応の後、DNAをエタノール
で沈澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水14
μlに再懸濁させた。 【0124】配列: 【化15】 で示されるBamHIリンカー(ニュー・イングランド
・バイオラブズ)を以下の方法によってキナーゼ処理
し、ライゲーション用に調製した。リンカー4μl(〜2
μg)を水20.15μlおよび10×キナーゼ緩衝液[5
00mM トリス−HCl(pH=7.6)および100mM
MgCl2]5μlに溶解し、90℃で2分間インキュベー
トし、次いで室温まで冷却した。この混合物に、γ−32
P−ATP 5μl(〜20μCi)、1M DTT 2.5μ
lおよびポリヌクレオチドキナーゼ5μl(〜10単位)を
加え、得られた反応液を37℃で30分間インキュベー
トした。次いで、0.01M ATP3.35μlおよびキ
ナーゼ5μlを加え、反応液をさらに30分間37℃に
保った。この放射活性ATPは、リンカーが標的DNA
にライゲートしたかどうかを決定するのに役立つ。 【0125】キナーゼ処理したBamHIリンカー約10
μlを〜4.4kb Tth111I制限フラグメントの溶液に加
え、さらにT4 DNAリガーゼ2μl(〜1000単位)
およびT4 RNAリガーゼ1μl(〜2単位)を加えた
後、このライゲーション反応液を4℃で一晩インキュベ
ートした。このライゲートしたDNAをエタノールで沈
澱させ、10×HindIII緩衝液5μlおよび水40μ
lに再懸濁させた。このDNA溶液に制限酵素HindII
I約5μl(〜50単位)を加え、得られた反応液を37
℃で2時間インキュベートした。 【0126】このHindIII消化したDNAをエタノ
ールで沈澱させ、10×BamHI緩衝液10μlおよび
水90μlに再懸濁させた。このDNA溶液に制限酵素
BamHI約10μl(〜100単位)を加え、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。BamHI消
化の後、反応混合物をアガロースゲルにかけ、〜2.0k
b BamHI−HindIII制限フラグメントをゲルから
単離した。目的のフラグメントが約4μg得られ、これ
をTE緩衝液約5μlに懸濁させた。 【0127】プラスミドpTPA103を構築するた
め、プラスミドpTPA102由来の〜2.0kb BamH
I−HindIII制限フラグメントを、BamHI−Hind
III消化したプラスミドpRCに挿入した。プラスミ
ドpRCは、E.コリtrpオペロンのプロモーターおよび
オペレーター(trpPO)配列を含有する〜288bp Eco
RI−ClaI制限フラグメントを、EcoRI−ClaI消
化したプラスミドpKC7に挿入することによって構築
した。プラスミドpKC7は、E.コリ K12 N100
/pKC7として、ATCCから取得番号ATCC37
084のもとで入手することができる。trpPOを含有
する〜288bp EcoRI−ClaI制限フラグメントは
プラスミドpTPA102[このプラスミドはE.コリ K
12 MM294/pTPA102(NRRL B−158
34)から単離することができる]から単離することがで
きる。プラスミドpKC7およびプラスミドpTPA10
2DNAは、実質的に実施例3の方法に従って、上記セ
ルラインから得ることができる。このプラスミドpTP
A102の〜0.29kb EcoRI−ClaI制限フラグメ
ントは、E.コリ trp遺伝子の翻訳活性化配列の大部分
および転写活性化配列を含有し、以下の配列を有してい
る: 【0128】 【化16】 【化17】【0129】すなわち、プラスミドpRCを構築するた
めに、TE緩衝液10μl中のプラスミドpKC7約2μ
gを、10×ClaI緩衝液[0.5M NaCl、60mMト
リス−HCl(pH=7.9)、60mM MgCl2、および
1mg/ml BSA]2μlおよび水6μlに加えた。このプ
ラスミドpKC7 DNAの溶液に制限酵素ClaI約2μ
l(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時
間インキュベートした。このClaI消化したプラスミド
pKC7 DNAをエタノールで沈澱させ、10×EcoR
I緩衝液2μlおよび水16μlに再懸濁させた。このC
laI消化したプラスミドpKC7 DNAの溶液に制限酵
素EcoRI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。 【0130】このEcoRI−ClaI消化したプラスミド
pKC7 DNAを、フェノールで1回、次いでクロロホ
ルムで2回抽出した。次いで、DNAをエタノールで沈
澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水20μlに
再懸濁した。プラスミドpKC7の制限部位および機能
地図は、マニアティス等[Maniatis et al.]のMolecul
ar Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,8頁
(1982)から入手することができる。 【0131】TE緩衝液約20μl中のプラスミドpTP
A102約20μgを、10×ClaI緩衝液10μlおよ
び水60μlに加えた。このプラスミドpTPA102
DNAの溶液に、制限酵素ClaI約10μl(〜50単
位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュ
ベートした。このClaI消化したプラスミドpTPA1
02 DNAをエタノールで沈澱させ、10×EcoRI
緩衝液10μlおよび水80μlに再懸濁した。このCla
I消化したプラスミドpTPA102 DNAの溶液に制
限酵素EcoRI約10μl(〜50単位)を加え、得られ
た反応液を37℃で2時間インキュベートした。 【0132】このEcoRI−ClaI消化したプラスミド
pTPA102 DNAをフェノールで1回抽出し、trp
POを含有する〜288bp EcoRI−ClaI制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで、7%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いでこの〜288
bp EcoRI−ClaI制限フラグメントをゲルから単離
した。目的のフラグメントが約1μg得られ、これをT
E緩衝液5μlに懸濁し、上記のようにして調製したEc
oRI−ClaI消化のプラスミドpKC7 DNAの溶液
に加えた。次いでこのDNA混合物に、T4 DNAリ
ガーゼ約2μl(〜1000単位)を加え、得られたライ
ゲーション反応液を16℃で2時間インキュベートし
た。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpRC
DNAからなっていた。 【0133】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101コ
ンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を100
μg/mlアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プ
ラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐
性形質転換体をスクリーニングして目的のE.コリK1
2 HB101/pRCコロニーを同定した。実質的に実
施例3の方法に従って、E.コリK12 HB101/p
RC形質転換体からプラスミドpRC DNAを得た。 【0134】TE緩衝液約2μl中のプラスミドpRC
DNA約2μgを、10×HindIII緩衝液2μlおよ
び水16μlに加えた。このプラスミドpRC DNAの
溶液に、制限酵素HindIII約2μl(〜10単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このHindIII消化したプラスミドpRC DNA
をエタノールで沈澱させ、10×BamHI緩衝液2μl
および水16μlに再懸濁した。このHindIII消化し
たプラスミドpRC DNAの溶液に制限酵素BamHI約
2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で
2時間インキュベートした。 【0135】このBamHI−HindIII消化したプラ
スミドpRC DNAをフェノールで1回、次いでクロロ
ホルムで2回抽出した。このDNAをエタノールで沈澱
させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水20μlに再
懸濁した。このBamHI−HindIII消化したプラス
ミドpRC DNAの溶液に、プラスミドpTPA102
の〜2.0kb HindIII−BamHI制限フラグメント
〜4μg(TE緩衝液〜5μl中)を加えた。このDNA混
合物に、T4 DNAリガーゼ約2μl(〜1000単位)
を加え、得られた反応液を16℃で2時間インキュベー
トした。このライゲート化DNAは目的のプラスミドp
TPA103 DNAからなっていた。 【0136】目的ではない形質転換体を減少させるた
め、このライゲート化DNAを制限酵素NcoI(この酵
素はプラスミドpRCを切断するがプラスミドpTPA1
03を切断しない)で消化した。すなわち、直線化した
DNAは閉環した環状DNAに比べてE.コリを形質転
換することが少ないので、NcoIによってライゲート化
DNAを消化すると目的ではない形質転換体が減少す
る。ライゲート化DNAを消化するため、始めにDNA
をエタノールで沈澱させ、次いで10×NcoI緩衝液
[1.5M NaCl、60mMトリス−HCl(pH=7.
8)、60mM MgCl2、および1mg/ml BSA]2μl
および水16μlに再懸濁した。このDNA溶液に制限
酵素NcoI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。 【0137】ライゲートし、次いでNcoI消化したこの
DNAを用いてE.コリK12 RV308(NRRL B
−15624)を形質転換した。実質的に実施例3の方
法に従って、E.コリK12 RV308細胞をコンピテ
ントにし、そして形質転換した。形質転換混合物を10
0μg/mlアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し
た。アンピシリン耐性形質転換体をカナマイシン感受性
について試験した(プラスミドpRCはカナマイシン耐性
を与えるがプラスミドpTPA103は与えない)。次い
でアンピシリン耐性かつカナマイシン感受性の形質転換
体からプラスミドDNAを調製し、このプラスミドDN
Aを制限酵素分析することによってE.コリK12 RV
308/pTPA103形質転換体を同定した。プラス
ミドpTPA103の制限部位および機能地図を添付の
図14、図15、図16および図17に示す。実質的に
実施例3の方法に従って、E.コリK12 RV308
/pTPA103細胞からプラスミドpTPA103 D
NAを単離した。 【0138】B.中間体プラスミドpBW25の構築 TE緩衝液1μl中のプラスミドpTPA103 DNA
約1μgを、10×BglII緩衝液2μlおよび水16μ
lに加えた。このプラスミドpTPA103 DNAの溶
液に、制限酵素BglII約1μl(〜5単位)を加え、得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。こ
のBglII消化したプラスミドpTPA103 DNAを
エタノールで沈澱させ、10×クレノウ緩衝液5μlお
よび水44μlに再懸濁した。このBglII消化したプ
ラスミドpTPA103 DNAの溶液に、クレノウ酵素
約1μl(〜1単位)を加え、得られた反応液を16℃で
2時間インキュベートした。このクレノウ処理し、Bgl
II消化したプラスミドpTPA103 DNAをエタノ
ールで沈澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水
22μlに再懸濁した。 【0139】このクレノウ処理し、BglII消化したプ
ラスミドpTPA103 DNAの溶液に、配列: 【化18】 で示されるキナーゼ処理していないNdeIリンカー(ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ)約2μl(0.2μg)
を、T4 DNAリガーゼ2μl(〜1000単位)および
T4 RNAリガーゼ1μl(〜2単位)とともに加え、得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。こ
のライゲート化DNAはプラスミドpTPA103derN
deIからなっていた(このプラスミドは、プラスミドpT
PA103が有するBglII認識配列のところにNdeI
認識配列を有していること以外は、実質的にプラスミド
pTPA103と同じである)。 【0140】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2記載の方法に従って、E.コリK12 RV30
8コンピテント細胞を形質転換した。この形質転換細胞
をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プラスミ
ドDNAの制限酵素分析によって、E.コリK12 RV
308/pTPA103derNdeI形質転換体を同定し
た。後の構築にもちいるため、プラスミドpTPA10
3derNdeI DNAを、実質的に実施例3の方法に従っ
て、形質転換体から単離した。 【0141】TE緩衝液10μl中のプラスミドpTPA
103derNdeI DNA約10μgを、10AvaII緩
衝液[0.6M NaCl、60mMトリス−HCl(pH=8.
0)、0.1M MgCl2、60mM 2−メルカプトエタノ
ール、および1mg/ml BSA]2μlおよび水6μlに加
えた。このDNA溶液に、制限酵素AvaII約2μl(〜
10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間イ
ンキュベートした。〜1.4kb制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このAvaII消化したDN
Aをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いでこのプラ
スミドpTPA103derNdeIの〜1.4kb AvaII制
限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント
約2μgを得、これをTE緩衝液5μlに懸濁した。 【0142】この〜1.4kb AvaII制限フラグメント
の溶液に、10×クレノウ緩衝液約5μl、水35μl、
およびクレノウ酵素5μl(〜5単位)を加え、得られた
反応液を16℃で30分間インキュベートした。このク
レノウ処理したDNAをエタノールで沈澱させ、10×
リガーゼ緩衝液3μlおよび水14μlに再懸濁した。 【0143】実質的に実施例10Aの方法に従って、配
列: 【化19】 で示されるHpaIリンカー約2μgをキナーゼ処理し
た。クレノウ処理した、プラスミドpTPA103derN
deIの〜1.4kb AvaII制限フラグメントの溶液に、
このキナーゼ処理したリンカー約10μlを、T4 DN
Aリガーゼ2μl(〜1000単位)およびT4 RNAリ
ガーゼ1μl(〜1単位)とともに加え、得られた反応液
を16℃で一晩インキュベートした。 【0144】このライゲート化DNAをフェノールで1
回、クロロホルムで2回抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、10×EcoRI緩衝液2μlおよび水16μlに再懸
濁した。このDNA溶液に、制限酵素EcoRI約2μl
(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。このEcoRI消化したDNAをフ
ェノールで1回、クロロホルムで2回抽出し、エタノー
ルで沈澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水2
0μlに再懸濁した。このようにして調製した、約77
0bpの大きさの、trpPOおよびTPAのアミノ末端を
コードしているフラグメントは、EcoRI適合末端を1
つおよび平滑末端を1つ有しており、これをEcoRI−
SmaI消化したプラスミドpUC19にライゲートして
プラスミドpUC19TPAFEを得た。 【0145】プラスミドpUC19[ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ(BRL)から入手可能]約2μlを、1
0×SmaI緩衝液[0.2M KCl、60mMトリス−H
Cl(pH=8.0)、60mM MgCl2、60mM 2−メル
カプトエタノール、および1mg/ml BSA]2μlおよ
び水16μlに溶解した。このDNA溶液に、制限酵素
SmaI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を
25℃で2時間インキュベートした。このSmaI消化し
たプラスミドpUC19 DNAをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、10×EcoRI緩衝液2μlおよび
水16μlに再懸濁した。このSmaI消化したプラスミ
ドpUC19 DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約2μ
l(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時
間インキュベートした。このEcoRI−SmaI消化した
プラスミドpUC19 DNAをフェノールで1回、クロ
ロホルムで2回抽出し、TE緩衝液5μlに再懸濁し
た。 【0146】EcoRI−SmaI消化したプラスミドpU
C19 DNAを、プラスミドpTPA103derNdeI
由来の〜770bp EcoRI−平滑末端制限フラグメン
トを含有する容器に加えた。このDNA混合物に、T4
DNAリガーゼ約2μl(〜1000単位)を加え、得ら
れた反応液を16℃で一晩インキュベートした。このラ
イゲート化DNAは目的のプラスミドpUC19TPA
FEからなっていた。プラスミドpUC19TPAFE
の制限部位および機能地図を添付の図14、図15、図
16および図17に示す。 【0147】プラスミドpUC19TPAFEの構築に
用いるEcoRIおよびSmaI認識配列を含有する、プラ
スミドpUC19の多重クローニング部位は、lacZ α
フラグメントのコード化配列内に位置している。lacZ
ΔM15突然変異(βガラクトシダーゼをコードしてい
るlacZ遺伝子における突然変異)を含有する細胞におい
てこのlacZ αフラグメントを発現させると、これらの
細胞は機能的なβガラクトシダーゼ分子を発現し、従っ
てこれらの細胞はX−ガル(5−ブロモ−4−クロロ−
3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;無色の
化合物)をそのインジゴ色の加水分解産物に加水分解す
る。プラスミドpUC19の多重クローニング部位にD
NAを挿入すると、lacZ αフラグメントのコード化配
列が乱され、lacZ ΔM15突然変異を有する(そのよ
うなプラスミドを有する)細胞はX−ガルを加水分解す
ることができない(プラスミドpUC8にクローニングす
るときに同じ原理を用いる;実施例2参照)。プラスミド
pUC19TPAFEからなるこのライゲート化DNA
を用い、実質的に実施例2の方法に従って、形質転換用
にコンピテントにしたE.コリK12 RR1ΔM15
(NRRL B−15440)細胞を形質転換した。 【0148】形質転換細胞を、100μg/mlアンピシ
リン、40μg/ml X−ガル、および1mM IPTGを
含有するL−寒天で平板培養した。インジゴ色を呈しな
いコロニーを継代培養し、これを用いてプラスミドDN
Aを調製し、プラスミドDNAの制限酵素分析によって
E.コリK12 RR1ΔM15/pUC19TPAFE
形質転換体を同定した。後の構築にもちいるため、プラ
スミドpUC19TPAFE DNAを、実質的に実施例
3の方法に従って、E.コリK12 RR1ΔM15/p
UC19TPAFE細胞から単離した。 【0149】TE鑑賞液20μl中のプラスミドpUC1
9TPAFE約7μgを、10×HpaI緩衝液[0.2M
KCl、0.1Mトリス−HCl(pH=7.4)、および
0.1M MgCl2]10μlおよび水70μlに加えた。こ
のプラスミドpUC19TPAFE DNAの溶液に、制
限酵素HpaI約3μl(〜6単位)を加え、得られた反応
液を37℃で20分間インキュベートした(この短い反
応時間は部分的にHpaI消化するために設定した)。こ
の反応液を、1×BamHI緩衝液[150mM NaCl、
10mMトリス−HCl(pH=8.0)、および10mM M
gCl2;塩濃度を高くするとHpaIを不活性化する]15
0μlに調整した。この部分的にHpaI消化したDNA
の溶液に、制限酵素BamHI約1μl(〜16単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。 【0150】このBamHI−HpaI部分消化プラスミド
pUC19TPAFE DNAをエタノール沈澱で濃縮
し、1.5%アガロースゲルにかけた。次いで、目的の
フラグメントを含有するゲルセグメントを切り出し、セ
グメントを凍結させ、次いでセグメントから液体を圧搾
することによって、プラスミドpUCATPAFEのレ
プリコン、βラクタマーゼ遺伝子、およびTPAコード
化DNAのすべてを含有する〜3.42kb HpaI−Bam
HI制限フラグメントをゲルから単離した。エタノール
沈澱によって液体からDNAを沈澱させた。目的のフラ
グメントが約1μg得られ、これをTE緩衝液20μlに
懸濁した。 【0151】TE緩衝液10μl中のプラスミドpTPA
103約10μgを、10×ScaI緩衝液[1.0M Na
Cl、60mMトリス−HCl(pH=7.4)、60mM Mg
Cl2、10mM DTT、および1mg/ml BSA]10μ
lおよび水80μlに加えた。このプラスミドpTPA1
03 DNAの溶液に、制限酵素ScaI約3μl(〜18
単位)を加え、得られた反応液を37℃で90分間イン
キュベートした。この反応液の容積を、1×BamHI緩
衝液で150μlに調整し、この混合物に制限酵素Bam
HI約1μl(〜16単位)を加え、得られた反応液を3
7℃で90分間インキュベートした。このDNAをエタ
ノールで沈澱させ、遠心して集め、電気泳動用の調製物
に再懸濁した。このScaI−BamHI消化したプラスミ
ドpTPA103 DNAを、〜1.015kb ScaI−B
amHI制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。プラス
ミドpTPA103のTPAカルボキシ末端コード化D
NAを含有する〜1.015kb ScaI−BamHI制限フ
ラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント約
0.5μgを得、これをガラス蒸留した水20μlに溶解
した。 【0152】プラスミドpTPA103の〜1.015kb
ScaI−BamHI制限フラグメント2μlに、プラスミ
ドpUC19TPAFEの〜3.42kb BamHI−Hpa
I制限フラグメント約2μlを、10×リガーゼ緩衝液
2μlおよびT4 DNAリガーゼ1μl[〜1バイス(We
iss)単位;このリガーゼはプロメガ・バイオテック(Pro
mege Biotec,2800 S.Fish Hatchery Road,Ma
dison,WI 53711)から入手した]とともに加え、
得られた反応液を16℃で一晩インキュベートした。こ
のライゲート化DNAは目的のプラスミドpBW25か
らなっていた。このプラスミドpBW25の制限部位お
よび機能地図を添付の図14、図15、図16および図
17に示す。 【0153】50mM CaCl2を用いること以外は実質
的に実施例2の方法に従い、このライゲート化DNAを
用いて形質転換用にコンピテントにしておいたE.コリ
K12 JM105(BRLから入手できる)を形質転換
した。形質転換細胞を1000μg/mlアンピシリン含
有のBHI[ディフコ・ラボラトリーズ(Difco Labora
tories,Detroit,MI)]で平板培養し、プラスミドDN
Aの制限酵素分析によってE.コリK12 JM105/
pBW25形質転換体を同定した。プラスミドpBW25
を制限酵素EcoRIで消化すると、〜3.38kbおよび
〜1.08kb制限フラグメントが得られる。後の構築に
もちいるため、実質的に実施例3の方法に従って、プラ
スミドpBW25を調製した。 【0154】C.TPAコード化領域の部位特異的な突
然変異誘発およびプラスミドpBW28の構築 ガラス蒸留した水10μl中のプラスミドpBW25約5
μgを、10×HindIII反応緩衝液約10μlおよび
水80μlに加えた。このプラスミドpBW25DNAの
溶液に、制限酵素HindIII約1μl(〜20単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。このHindIII消化したプラスミドpBW25
DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約3μl(〜24単
位)および1M トリス−HCl(pH=7.6)10μlを加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。このEcoRI−HindIII消化したプラスミドp
BW25 DNAをエタノール沈澱で濃縮し、〜810b
p EcoRI−HindIII制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、1.5%アガロースゲル電気泳
動にかけた。〜810bp EcoRI−HindIII制限フ
ラグメント約0.5μgをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製し、これをガラス蒸留した水20μlに再懸
濁した。 【0155】ガラス蒸留した水35μl中の複製型(R
F)のM13mp8 DNA(ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手できる)約4.5μgを、10×HindI
II緩衝液10μlおよび水55μlに加えた。このM1
3mp8 DNAの溶液に、制限酵素HindIII約1μl
(〜20単位)を加え、得られた反応液を37℃で1時間
インキュベートした。このHindIII消化したM13m
p8 DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約3μl(〜24
単位)および1M トリス−HCl(pH=7.6)約10μl
を加え、得られた反応液を37℃で1時間インキュベー
トした。このHindIII−EcoRI消化したM13mp
8 DNAをエタノール沈澱で集め、アガロースゲル電
気泳動用の調製物に再懸濁し、ゲル電気泳動によって大
きい制限フラグメントをゲルから単離した。M13mp8
の大きいEcoRI−HindIII制限フラグメント約1
μgが得られ、これをガラス蒸留した水20μlに懸濁し
た。M13mp8の大きいEcoRI−HindIII制限フ
ラグメント約2μl、10×リガーゼ緩衝液2μl、水1
2μl、およびT4 DNAリガーゼ〜1μl(〜1バイス
単位)を、プラスミドpBW25の〜810bp EcoRI
−HindIII制限フラグメント3μlに加え、得られた
ライゲーション反応液を16℃で一晩インキュベートし
た。 【0156】トランスフェクションに用いるDNAの量
を変えること以外は、実質的にBRL M13 クローニ
ング/'ジデオキシ'シークエンシング・インストラクシ
ョン・マニュアル(BRL M13 Cloning/'Dideox
y'Sequencing InstructionManual)記載の方法に従っ
て、E.コリJM103細胞(BRLから入手可能)をコ
ンピテントにし、ライゲーション混合物でトランスフェ
クションした。挿入によるβガラクトシダーゼ αフラ
グメントをコードしている遺伝子の不活性化(これによ
り、X−ガルをそのインジゴ色の切断産物に切断する能
力が失われる)によって組換え体プラークを同定した。
スクリーニングするため、白いプラーク6個をLブロス
2.5mlに入れ、これに、最小培地ストックで培養してp
roABを有するFエピソームの保持を確実なものにし
た、E.コリK12 JM103(0.4ml)を、対数増殖
期において加えた。このプラークを含有する溶液を、エ
アー振盪器中、37℃で8時間インキュベートした。こ
の溶液1.5mlから得た細胞をペレット化し、実質的に
バーンボイムおよびドーリィ[Birnboim and Doly,Nu
c.Acids Res.,7:1513(1979)]のアルカリ・
ミニスクリーン法に従って、RF DNAを単離した。
各培養物の残りは4℃で保存した。目的のファージ(pM
8BW26と命名した)は、M13mp8の〜7.2kb Ec
oRI−HindIII制限フラグメントにライゲートした
プラスミドpBW25の〜810bp EcoRI−HindI
II制限フラグメントを含有していた。 【0157】対数期のE.コリ JM103約50mlをp
M8BW26で感染させ、エアー振盪器中、37℃で1
8時間インキュベートした。低速遠心することによって
感染細胞をペレット化し、上記インストラクション・マ
ニュアルの方法をスケールアップすることによって培養
物上清から1本鎖pM8BW26 DNAを調製した。ク
レノウ反応を、室温で30分間、次いで37℃で60分
間、次いで10℃で18時間行うこと以外は、実質的に
アデルマン等[Adelman et al.,DNA 2(3):183
−193(1983)]の教示に従って、1本鎖pM8BW
26を突然変異誘発にかけた。さらに、S1処理を20
℃で行ない、緩衝液の塩濃度を製造元推奨の半分にし、
そしてM13配列決定(シークエンシング)プライマー
(BRL)を用いた。天然TPAのアミノ酸残基87から
261に対応するコード化配列を削除するために用いた
合成オリゴデオキシリボヌクレオチド・プライマーは以
下の配列で示される: 5'−GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA−3' 【0158】得られた突然変異誘発混合物を用い、実質
的に上記の感染方法に従って、E.コリK12 JM10
3をトランスフェクションした。RF DNAの制限酵
素分析、およびマクサムおよびギルバート(Maxam and
Gilbert)のDNA配列決定によって目的の突然変異体
を同定した。天然TPAのアミノ酸残基87から261
に対応するコード化配列が削除された目的の突然変異体
をpM8BW27と命名した。 【0159】プラスミドpBW28を構築するために
は、多種のDNAフラグメントが必要である。それらフ
ラグメントの最初のものを以下のようにして得た。ガラ
ス蒸留した水20μl中のRF pM8BW27 DNA〜
20μgを、10×NdeI緩衝液10μlおよび水60μ
lに加えた。このプラスミドpM8BW27 DNAの混
合物に、制限酵素NdeI約10μl(〜50単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このNdeI消化したプラスミドpM8BW27DN
Aをエタノールで沈澱させ、遠心した集め、10×Eco
RI緩衝液10μlおよび水90μlに再懸濁した。この
NdeI消化したプラスミドpM8BW27DNAの溶液
に、制限酵素EcoRI約10μl(〜50単位)を加え、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
欠失部位を含むTPAコード化配列の一部を含有する〜
560bp NdeI−EcoRI制限フラグメントが他の消
化産物から分離するまで、このEcoRI−NdeI消化し
たプラスミドpM8BW27DNAをアガロースゲル電
気泳動にかけた。この〜560bp NdeI−EcoRI制
限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント
約0.5μgを得、これをガラス蒸留した水20μlに再
懸濁した。 【0160】プラスミドpBW28の構築に必要な第2
のフラグメントは、鎖1本ずつ自動DNA合成機で合成
する。実質的に実施例6Aの方法に従って、2本の相補
的な鎖(これらは、ハイブリダイズしてXbaIおよびNd
eIの重なり部分を有する2本鎖DNAセグメントを形
成する)をキナーゼ処理し、アニーリングする。このリ
ンカーは以下の構造を有している: 【化20】 【0161】プラスミドpBW28の構築に必要な第3
のフラグメントは以下のようにして調製した。TE緩衝
液20μl中のプラスミドpTPA103(〜20μg)
を、10×BamHI緩衝液10μlおよび水60μlに加
えた。このプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、
制限酵素BamHI約10μl(〜50単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpTPA103 DNAをエ
タノールで沈澱させ、遠心して集め、10×EcoRI緩
衝液10μlおよび水80μlに再懸濁した。このBamH
I消化したプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、
制限酵素EcoRI約10μl(〜50単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。TP
Aのカルボキシ末端のコード化配列を含有する〜689
bp EcoRI−BamHI制限フラグメントが他の消化産
物から分離するまで、このBamHI−EcoRI消化した
プラスミドpTPA103 DNAをアガロースゲル電気
泳動にかけた。この〜689bpフラグメント約0.5μg
をゲルから単離し、次いでガラス蒸留した水10μlに
再懸濁した。 【0162】プラスミドpBW28の構築に必要な最後
のフラグメントはプラスミドpL110から単離した。
プラスミドpL110の制限部位および機能地図を添付
の図14、図15、図16および図17に示し、プラス
ミドpL110の構築を実施例10D(本実施例の次節)
に記載する。 【0163】TE緩衝液25μl中のプラスミドpL11
0約25μgを、10×XbaI緩衝液[0.5M NaCl、
60mM トリス−HCl(pH=7.9)、60mM MgC
l2、および1mg/ml BSA]10μlおよび水55μlに
加えた。このプラスミドpL110 DNAの溶液に、制
限酵素XbaI約10μl(〜50単位)を加え、得られた
反応液を37℃で2時間インキュベートした。このXba
I消化したプラスミドpL110 DNAをエタノールで
沈澱させ、遠心して集め、10×BamHI緩衝液10μ
lおよび水89μlに再懸濁した。このXbaI消化したプ
ラスミドpL110 DNAの溶液に、制限酵素BamHI
約1μl(〜5単位)を加え、得られた反応液を37℃で
30分間インキュベートして、BamHI部分消化物を得
た。〜6.0kb XbaI−BamHIフラグメントが他の消
化産物から明確に分離するまで、このXbaI消化−Bam
HI部分消化したプラスミドpL110 DNAをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。この〜6.0kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、約0.5μgの〜6.0kb Xba
I−BamHI制限フラグメントを得、これをガラス蒸留
した水約40μlに懸濁した。この〜6.0kb XbaI−
BamHI制限フラグメントは、EK−BGHをコードし
ているDNAを除き、プラスミドpL110のすべてを
含有している。 【0164】プラスミドpBW28を構築するため、次
のフラグメント、すなわち、プラスミドpL110の〜
6.0kb BamHI−XbaI制限フラグメント約0.1μg
(〜8μl)、プラスミドpM8BW27の〜560bp Nd
eI−EcoRI制限フラグメント約0.05μg(〜2μ
l)、プラスミドpTPA103の〜689bp EcoRI−
BamHI制限フラグメント約0.1μg(〜2μl)、およ
び〜45bp XbaI−NdeI合成リンカー約0.02μg
(〜1μl)をいっしょにして混合した。このDNA混合
物に、10×リガーゼ緩衝液約2μlおよびT4 DNA
リガーゼ1μl(〜1バイス単位)を加え、得られたライ
ゲーション反応液を4℃で一晩2時間インキュベートし
た。ライゲート化DNAは目的のプラスミドpBW28
からなっていた。このプラスミドpBW28の制限部位
および機能地図を添付の図14、図15、図16および
図17に示す。 【0165】このライゲート化DNAを用い、50mM
CaCl2を用いること以外は実質的に実施例2の方法に
従って、コンピテントにしておいたE.コリK12 MM
294(NRRL B−15625)を形質転換した。プ
ラスミドpBW28上にラムダpLプロモーターおよび感
温性ラムダpLリプレッサーをコードしている遺伝子が
存在しているため、形質転換方法および形質転換体の培
養方法を若干変えた。形質転換および次いで行う培養に
おいて、細胞を32℃以上の温度にしなかった。本実施
例の次節は、ラムダpLプロモーターおよびその感温性
リプレッサーをコードしているプロモーターの取り扱い
方法をより詳細に説明している。目的のE.コリK12
MM294/pBW28形質転換体を、そのテトラサイ
クリン耐性かつアンピシリン感受性の表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。 【0166】D.プラスミドpL110の構築 プラスミドpKC283を出発原料として用いてプラス
ミドpL110を構築した。E.コリK12 BE120
1/pKC283の凍結乾燥品を、NRRLから取得番
号NRRL B−15830のもとで入手する。この凍
結乾燥品をLブロス10ml含有の試験管に移し、32℃
で2時間インキュベートし、この時点で培養物を50μ
g/mlアンピシリンの濃度にし、次いで32℃で一晩イ
ンキュベートする。プラスミドpKC283がpLプロモ
ーターを含有し、E.コリK12 BE1201細胞が細
胞DNA内に組み込まれた感温性cIリプレッサー遺伝
子を含有するので、このE.コリK12 BE1201/
pKC283細胞を32℃で培養した。野性型ラムダpL
リプレッサー遺伝子を含有する細胞、またはラムダpL
プロモーターを含有しない細胞を、このプラスミド単離
方法に用いるときには、本明細書中の後の実施例に記載
したように、インキュベーション温度は37℃である。 【0167】一晩培養物の少量を、E.コリK12 BE
1201/pKC283の単一コロニー単離体が得られ
るような方法で、50μg/mlアンピシリン含有のL寒
天プレートで平板培養する。得られた単一コロニーを、
50μg/mlアンピシリン含有のLブロス10mlに接種
し、激しく振盪しながら32℃で一晩インキュベートし
た。この一晩培養物10mlをLブロス500mlに接種
し、培養物が定常期に到達するまで、激しく振盪しなが
ら32℃でインキュベートした。次いで、実質的に実施
例3の方法に従って、細胞からプラスミドpKC283
DNAを調製した。プラスミドpKC283が約1mg得
られ、これをTE緩衝液中、約1μg/μlの濃度で、4
℃で保存した。プラスミドpKC283の制限部位およ
び機能地図を添付の図14、図15、図16および図1
7に示す。 【0168】プラスミドpKC283 DNA約10μl
(〜10μg)を、10×中濃度塩制限緩衝液[500mM
NaCl、100mM トリス−HCl(pH=7.5)、10
0mMMgCl2、および10mM DTT]20μl、1mg/
ml BSA20μl、制限酵素PvuII 5μl(〜25単
位)、および水145μlと混合し、得られた反応液を3
7℃で2時間インキュベートした。ここに記載する制限
酵素反応は、常法により、フェノール抽出、次いでクロ
ロホルム抽出によって停止させ、DNAを沈澱させ、エ
タノールで洗浄し、そしてDNAをTE緩衝液に再懸濁
した。上記のようにしてPvuII消化を停止させた後、
PvuII消化したプラスミドpKC283 DNAを沈澱
させ、これをTE緩衝液5μlに再懸濁した。 【0169】XhoIリンカー(5'−CCTCGAGG−
3')約600ピコモル(pM)を、5×キナーゼ緩衝液[3
00mM トリス−HCl(pH=7.8)、50mM MgC
l2、および25mM DTT]10μl、5mM ATP5μ
l、水24μl、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ0.5μ
l[P−L バイオケミカルズ(P−L Biochemicals)定
義の約2.5単位]、1mg/mlBSA5μl、および10m
Mスペルミジン5μlを含有する混合物中、混合物を3
7℃で30分間インキュベートすることによってキナー
ゼ処理した。このキナーゼ処理したXbaIリンカー約1
2.5μlを、PvuII消化したプラスミドpKC283
DNA 5μlに加え、次いでこのDNA溶液に、10×
リガーゼ緩衝液2.5μl、T4 DNAリガーゼ2.5μ
l(P−Lバイオケミカルズ定義の約2.5単位)、10m
Mスペルミジン2.5μl、および水12.5μlを加え、
得られたライゲーション反応液を4℃で一晩インキュベ
ートした。ライゲーション反応の後、反応混合物を高塩
緩衝液[0.1M NaCl、0.05M トリス−HCl(pH
=7.5)、10.0mM MgCl2、および1mM DTT]
の組成に調整した。この混合物に制限酵素XhoI約10
μl(100単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。 【0170】反応を止め、XhoI消化したDNAを沈澱
させ、再懸濁し、ライゲーション混合物にXhoIリンカ
ーを加えないこと以外は上記と同様にして、ライゲート
した。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpK
C283PXからなっていた。このプラスミドpKC2
83PXの制限部位および機能地図を添付の図14、図
15、図16および図17に示す。 【0171】E.コリK12 MO(λ+)[NRRLから取
得番号NRRL B−15993のもとで入手可能]は野
性型ラムダpL cIリプレッサー遺伝子を含有している
ので、E.コリK12 MO(λ+)細胞においてはラムダp
Lプロモーターからの転写は起こらない。E.コリK1
2 MO(λ+)の単一コロニーを単離し、細胞の一晩培養
物10mlを調製する(増殖培地にアンピシリンを用いな
い)。この一晩培養物50μlを、10mM MgSO4およ
び10mM MgCl2含有のLブロス5mlに接種した。こ
の培養物を、激しく振盪しながら37℃で一晩インキュ
ベートした。翌朝、この培養物を10mM MgSO4およ
び10mM MgCl2含有のLブロスで200mlに希釈し
た。この希釈培養物を、O.D.590が約0.5(これは、
約1×108細胞/mlの細胞密度を示す)になるまで、激
しく振盪しながら37℃でインキュベートした。氷水浴
で培養物を10分間冷却し、次いで4℃、4000Xg
で10分間遠心して細胞を集めた。この細胞ペレットを
冷10mM NaCl 100mlに再懸濁し、そして直ちに
遠心して再ペレット化した。この細胞ペレットを30m
M CaCl2 100mlに再懸濁し、氷上で20分間イン
キュベートした。 【0172】もう一度遠心して細胞を集め、これを30
mM CaCl2 10mlに再懸濁した。この細胞のうち0.
5mlを上記のようにして調製したライゲート化DNA
(このDNAは30mM CaCl2にしておいた)に加え
た。この細胞−DNA混合物を氷上で1時間インキュベ
ートし、42℃で90秒間熱ショックを加え、次いで氷
上で約2分間冷却した。この細胞−DNA混合物を、1
25mlフラスコ中、LB培地で10mlに希釈し、37℃
で1時間インキュベートした。この100μlをアンピ
シリン含有のL寒天プレートにプレートし、コロニーが
現れるまで37℃でインキュベートした。 【0173】このコロニーを別々に培養し、個々のコロ
ニーのプラスミドDNAを制限酵素分析およびゲル電気
泳動で試験した。プラスミドDNAの単離は、実施例3
の方法に従って、比較的小さいスケールで行なったが、
目的のE.コリK12 MO(λ+)/pKC283PX形質
転換体が同定されるまでCsCl勾配工程は割愛した。プ
ラスミドpKC283PXの制限部位および機能地図を
添付の図14、図15、図16および図17に示す。 【0174】プラスミドpKC283PX DNA10μ
gを、10×高塩緩衝液20μl、1mg/ml BSA20
μl、制限酵素BglII 5μl(〜50単位)、制限酵素
XhoI5μl(〜50単位)、および水150μlに溶解
し、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。反応を止め、BglII−XhoI消化したDNAを沈
澱させ、このDNAをTE緩衝液5μlに再懸濁した。 【0175】BglIIおよびXhoI制限酵素切断の特徴
を示す1本鎖DNA末端を有するDNAリンカーを、自
動DNA合成機を用いて合成し、実施例6Aの記載と同
様にしてキナーゼ処理した。このDNAリンカーは次の
構造を有していた: 【化21】このリンカーおよびBglII−XhoI消化したプラス
ミドpKC283PXを、実質的に上記ライゲーション
法に従ってライゲートした。このライゲート化DNAは
目的のプラスミドpKC283−Lからなっていた。こ
のプラスミドpKC283−Lの制限部位および機能地
図を添付の図14、図15、図16および図17に示
す。このプラスミドpKC283−L DNAを用いて
E.コリK12 MO(λ+)を形質転換し、得られたE.コ
リK12 MO(λ+)/pKC283−L形質転換体を、
そのアンピシリン耐性の表現型およびプラスミドDNA
の制限酵素分析によって同定した。 【0176】プラスミドpKC283−L DNA約10
μgを、10×高塩緩衝液20μl、1mg/ml BSA2
0μl、制限酵素XhoI 5μl(〜50単位)、および水
155μlに溶解し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。次いで、XhoI消化したプラスミ
ドpKC283−L DNAを沈澱させ、これを10×ニ
ックトランスレーション緩衝液[0.5M トリス−HCl
(pH=7.2)、0.1MMgSO4、および1mM DTT]
2μl、デオキシヌクレオチド三リン酸それぞれが2mM
である溶液1μl、水15μl、クレノウ1μl(P−L
バイオケミカルズ定義の〜6単位)、および1mg/mlB
SA1μlに再懸濁した。得られた反応液を25℃で3
0分間インキュベートし、この溶液を70℃で5分間イ
ンキュベートすることによって反応を止めた。 【0177】実質的に、上記のリンカーライゲーション
法に従って、BamHIリンカー(5'−CGGGATCC
CG−3')をキナーゼ処理し、これを、XhoI消化し、
クレノウ処理したプラスミドpKC283−L DNAに
ライゲートした。ライゲーション反応の後、このDNA
を高塩緩衝液中、37℃で約2時間、BamHI約100
単位で消化した。BamHI消化の後、実質的に上記の方
法に従って、DNAをライゲーション用に調製し、〜
5.9kb BamHI制限フラグメントをライゲートして環
化し、E.コリK12 MO(λ+)に導入して形質転換し
た。実質的に実施例3の方法に従って、E.コリK12
MO(λ+)/pKC283−LB形質転換体を同定し、
次いでプラスミドpKC283−LB DNAを形質転換
体から調製した。このプラスミドpKC283−LBの
制限部位および機能地図を添付の図14、図15、図1
6および図17に示す。 【0178】実質的に上記方法に従って、プラスミドp
KC283PX約10μgを、高塩緩衝液中、制限酵素
SalIで消化し、クレノウで処理し、EcoRIリンカー
(5'−GAGGAATTCCTC−3')にライゲートし
た。制限酵素EcoRIによる消化(これにより〜2.1kb
DNAが削除される)の後、〜4.0kb EcoRI制限フ
ラグメントをライゲーションにより環化してプラスミド
pKC283PRSを得た。実質的に実施例3の方法に
従って、このライゲート化DNAを用いてE.コリK1
2 MO(λ+)を形質転換し、E.コリK12 MO(λ+)
/pKC283PRS形質転換体を同定した後、形質転
換体からプラスミドpKC283PRS DNAを調製し
た。このプラスミドpKC283PRSの制限部位およ
び機能地図を添付の図14、図15、図16および図1
7に示す。 【0179】プラスミドpKC283PRS約10μg
を、高塩緩衝液200μl中、制限酵素PstIおよびSp
hIそれぞれ約50単位で消化した。この反応液を37
℃で約2時間インキュベートした後、反応混合物を、ト
リス−アセテート緩衝液中、0.6%低ゲル化温度アガ
ロース[FMC社(FMC Corporation,Marine Collo
ids Division,Rockland,Maine 04841)ゲルで、
2〜3時間、〜130Vおよび〜75mAで電気泳動し
た。 【0180】ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液で染色
し、〜0.85kb PstI−SphI制限フラグメントを含
有するDNAバンド(長波長UV光で目に見えるように
した)をゲルから小さいセグメントとして切り出した。
セグメントの重量および密度からセグメントの体積を測
定し、等容量の10mM トリス−HCl(pH=7.6)を
セグメントを含む試験管に加えた。次いで72℃でイン
キュベートしてセグメントを溶融した。約100μl容
量中に、プラスミドpKC283PRSの〜0.85kb
PstI−SphI制限フラグメントが約1μg得られた。
同様の方法により、プラスミドpKC283−LBを制
限酵素PstIおよびSphIで消化し、得られた〜3.0k
b 制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって
単離し、ライゲーション用に調製した。 【0181】プラスミドpKC283PRSの〜0.85
kb PstI−SphI制限フラグメントをプラスミドpKC
283−LBの〜3.0kb PstI−SphI制限フラグメ
ントにライゲートした。このライゲート化DNAは目的
のプラスミドpL32からなっていた。プラスミドpL3
2の制限部位および機能地図を添付の図14、図15、
図16および図17に示す。プラスミドpL32をE.コ
リK12 MO(λ+)細胞に導入して形質転換し、実質的
に実施例3の方法に従って、E.コリK12 MO(λ+)
/pL32形質転換体からプラスミドpL32 DNAを
調製した。プラスミドpL32 DNAの分析により、プ
ラスミドpKC283PXのクレノウ処理したSalI末
端に1以上のEcoRIリンカーが結合していることがわ
かった。1以上のEcoRIリンカーの存在は、プラスミ
ドpL32またはプラスミドpL32誘導体の有用性に影
響せず、これをXhoI制限部位(この部位は2個のEco
RIリンカーがライゲートしたときに生成する)の存在
によって検出することができる。 【0182】プラスミドpCC101はショーナー等[S
choner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,
5403−5407(1984)]が開示している。ショ
ーナー等はプラスミドpCC101をプラスミドpCZ1
01と称している。プラスミドpCC101の制限部位
および機能地図を添付の図14、図15、図16および
図17に示す。EK−BGHをコードしているDNAを
単離するため、プラスミドpCC101約10μgを、制
限酵素XbaIおよびBamHIそれぞれを約50単位含有
する高塩緩衝液200μl中で消化した。この消化産物
をアガロースゲル電気泳動によって分離し、EK−BG
Hをコードしている〜0.6kb XbaI−BamHI制限フ
ラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製
した。 【0183】また、プラスミドpL32も制限酵素Xba
IおよびBamHIで消化し、〜3.9kb制限フラグメン
トを単離し、ライゲーション用に調製した。このプラス
ミドpL32の〜3.9kb XbaI−BamHI制限フラグ
メントを、プラスミドpCC101の〜0.6kb XbaI
−BamHI制限フラグメントにライゲートしてプラスミ
ドpL47を得た。プラスミドpL47の制限部位および
機能地図を添付の図14、図15、図16および図17
に示す。プラスミドpL47をE.コリK12 MO(λ+)
に導入して形質転換し、E.コリK12 MO(λ+)/pL
47形質転換体を同定した。実質的に実施例3の方法に
従って、形質転換体からプラスミドpL47 DNAを調
製した。 【0184】プラスミドpPR12は、感温性pLリプレ
ッサー遺伝子cI857およびプラスミドpBR322の
テトラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。プラ
スミドpPR12は、1984年3月13日発行の米国
特許No.4,436,815に記載され、特許請求されて
いる。プラスミドpPR12の制限部位および機能地図
を添付の図14、図15、図16および図17に示す。 【0185】プラスミドpPR12約10μgを、高塩緩
衝液200μl中、37℃で2時間、制限酵素EcoRI
約50単位で消化した。実質的に上記方法に従って、こ
のEcoRI消化したプラスミドpPR12DNAを沈澱
させ、次いでクレノウで処理した。クレノウ反応の後、
このEcoRI消化し、クレノウ処理したプラスミドpP
R12 DNAをライゲートして再環化し、目的のプラ
スミドpPR12ΔR1からなるこのライゲート化DN
Aを用いてE.コリK12 RV308(NRRLB−1
5624)を形質転換した。形質転換体はテトラサイク
リン(10μg/ml)耐性に基いて選択した。実質的に実
施例3の方法に従って、E.コリK12RV308/pP
R12ΔR1形質転換体を同定した後、プラスミドpP
R12ΔR1DNAを形質転換体から調製した。 【0186】プラスミドpPR12ΔR1約10μgを、
中塩緩衝液200μl中、37℃で2時間、制限酵素Av
aI約50単位で消化した。このAvaI消化したプラス
ミドpPR12ΔR1 DNAを沈澱させ、次いでクレノ
ウで処理した。クレノウ反応の後、このAvaI消化し、
クレノウ処理したプラスミドpPR12ΔR1 DNAを
EcoRIリンカー(5'−GAGGAATTCCTC−
3')にライゲートし、沈澱させ、制限酵素EcoRIを約
50単位含有する高塩緩衝液約200μlに再懸濁し、
37℃で約2時間インキュベートした。このEcoRI消
化の後、反応混合物を低溶融アガロースゲルにかけ、〜
5.1kb EcoRI制限フラグメントをゲルから精製し、
ライゲーションによって再環化して目的のプラスミドp
PR12AR1を得た。このプラスミドpPR12AR
1 DNAをE.コリK12 RV308に導入して形質
転換した。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐性に
基いて行った。実質的に実施例3の方法に従って、プラ
スミドpPR12AR1 DNAを形質転換体から調製し
た。プラスミドpPR12AR1の制限部位および機能
地図を添付の図14、図15、図16および図17に示
す。 【0187】プラスミドpPR12AR1 DNA約10
μgを、制限酵素PstIおよびEcoRIそれぞれを約5
0単位含有する高塩緩衝液約200mlに懸濁し、この消
化反応液を37℃で約2時間インキュベートした。次い
で、反応混合物をアガロースゲルにかけ、プラスミドp
PR12AR1の〜2.9kb PstI−EcoRI制限フラ
グメントを単離し、ライゲーション用に調製した。 【0188】プラスミドpL47約10μgを、高塩緩衝
液200μl中、37℃で2時間、制限酵素PstIおよ
びBamHIで消化した。このPstI−BamHI消化した
DNAをアガロースゲルにかけ、複製起源およびアンピ
シリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜2.7kb Pst
I−BamHI制限フラグメントを単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。別の反応液において、プラスミドpL
47 DNA約10μgを、高塩緩衝液200μl中、
37℃で2時間、制限酵素EcoRIおよびBamHIで消
化し、ラムダpL転写活性化配列、E.コリ lpp翻訳活性
化配列、およびEK−BGHをコードしているDNAを
含有する〜1.03kb EcoRI−BamHI制限フラグメ
ントを単離し、ライゲーション用に調製した。 【0189】プラスミドpL47の〜2.7kb PstI−
BamHIおよび〜1.03kb EcoRI−BamHI制限フ
ラグメントを、プラスミドpPR12AR1の〜2.9kb
PstI−EcoRI制限フラグメントにライゲートして
プラスミドpL110を構築し、このライゲート化DN
Aを用いてE.コリK12RV308を形質転換した。
テトラサイクリン耐性に基いて形質転換体を選択した。 【0190】2つのPstI制限酵素認識部位が、EK−
BGHコード化領域に存在する(添付図の制限部位およ
び機能地図には記載されていない)。プラスミドpL11
0の制限部位および機能地図を添付の図14、図15、
図16および図17に示す。 【0191】E.最終的なプラスミドpBW32の構築 プラスミドpSV2−β−グロビンDNA(NRRL B
−15928)約10μgを10×HindIII反応緩衝
液10μl、制限酵素HindIII 5μl(〜50単位)、
および水85μlに溶解し、この反応液を2時間37℃
に保った。次いでこの反応混合物を0.15M LiClと
し、2.5倍量のエタノール加え、ドライアイス−エタ
ノール浴でインキュベートした後、遠心してDNAをペ
レット化した。 【0192】このDNAペレットを、10×BglII緩
衝液10μl、制限酵素BglII5μl(〜50単位)、お
よび水85μlに溶解し、この反応液を2時間37℃に
保った。このBglII消化の後、反応混合物を0.85
%アガロースゲル電気泳動にかけ、フラグメントを分離
した。前記と同様にして、臭化エチジウムおよび紫外光
を用いてゲルを可視化し、目的の〜4.2kb HindII
I−BglIIフラグメントを含有するバンドをゲルから
切り出した。ペレットを水10μlに再懸濁した。この
ペレットは目的のプラスミドpSV2−β−グロビンの
〜4.2kb HindIII−BglII制限フラグメント〜
5μgからなっていた。実質的に上記教示に従って、T
PAをコードしているプラスミドpTPA103の〜2.
0kb HindIII−BamHI制限フラグメントをプラス
ミドpTPA103から単離した。プラスミドpTPA1
03の〜2.0kb HindIII−BamHI制限フラグメ
ント約5μgが得られ、水10μlに懸濁し、−20℃で
保存した。 【0193】プラスミドpSV2−β−グロビンの〜4.
2kb BglII−HindIII制限フラグメント2μlお
よびプラスミドpTPA103の〜2.0kb HindIII
−BamHIフラグメント4μlをいっしょにして混合
し、次いで10×リガーゼ緩衝液2μl、水11μl、お
よびT4 DNAリガーゼ1μl(〜500単位)とともに
4℃で一晩インキュベートした。このライゲート化DN
Aは目的のプラスミドpTPA301からなっていた。
このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の図1
4、図15、図16および図17に示す。実質的に実施
例3の教示に従い、このライゲート化DNAを用いて、
形質転換用にコンピテントにしたE.コリK12 RR1
細胞(NRRL B−15210)を形質転換した。実質
的に実施例3の方法に従って、E.コリK12 RR1/
pTPA301形質転換体からプラスミドDNAを得
た。 【0194】プラスミドpSV2−dhfrは、ジヒドロ葉
酸還元酵素(dhfr)遺伝子に共有結合したDNAの増幅お
よび形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるdhfr
遺伝子を含有している。プラスミドpSV−dhfr[E.コ
リK12 HB101/pSV2−dhfr(ATCC 371
46)から単離した]10μgを、10×PvuII緩衝液
10μl、PvuII制限酵素2μl(〜20単位)、および
水88μlと混合し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。フェノールおよびクロロホルム抽
出によって反応を止め、次いでこのPvuII消化したプ
ラスミドpSV2−dhfr DNAを沈澱させ、遠心して集
めた。 【0195】以下の方法により、BamHIリンカー(5'
−CGGATCCCG−3')をキナーゼ処理しライゲー
ション用に調製した。水5μl中のリンカー1μgに、5
×キナーゼ塩[300mM トリス−HCl(pH=7.8)、
50mM MgCl2、および25mM DTT]10μl、5m
M ATP 5μl、1mg/ml BSA 5μl、10mMス
ペルミジン5μl、水19μl、および10単位/μlポ
リヌクレオチドキナーゼ1μlを加えた。次いでこの反
応液を37℃で60分間インキュベートし、−20℃で
保存した。PvuII消化したプラスミドpSV2−dhfr
5μl(〜5μg)およびキナーゼ処理したBamHIリンカ
ー12μl(〜.25μl)を混合し、水11μl、10×リ
ガーゼ緩衝液2μlおよびT4 DNAリガーゼ1μl(〜
1000単位)とともに16℃で一晩インキュベートし
た。 【0196】このライゲーション反応混合物に、10×
BamHI反応緩衝液10μl、BamHI制限酵素10μl
(〜50単位)、および水48μlを加え、次いでこの溶
液を37℃で3時間インキュベートした。この反応液を
1%アガロースゲルにかけ、dhfr遺伝子を含有する目的
の〜1.9kbフラグメントをゲルから単離した。これら
の実施例で行なったリンカー付加のすべては、常法によ
りアガロースゲルで精製して最終ベクターにおける多重
リンカー配列の可能性を減少させた。得られたフラグメ
ント〜3μgをTE緩衝液10μlに懸濁した。 【0197】次に、プラスミドpTPA301約15μl
(〜1μg)を、上記のようにしてBamHI制限酵素で消
化した。プラスミドpTPA301にはBamHI部位が
1つしか存在しないので、このBamHI消化により直線
状のプラスミドpTPA301DNAが生成する。この
BamHI消化したプラスミドpTPA301をエタノー
ルで沈澱させ、水94μlに再懸濁し、ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ[コラボレーティブ・リサーチ社(Colla
borative Research,Inc.,128 Spring Street,L
exington,MA 02173)]1μlおよび1Mトリス−
HCl(pH=9.0)5μlを用いて65℃で45分間ホス
ファターゼ処理した。このDNAをフェノール:クロロ
ホルムで抽出し、次いでクロロホルム:イソアミルアル
コールで抽出し、エタノール沈澱し、水20μlに再懸
濁した。ホスファターゼ処理したプラスミドpTPA3
01(10μl:〜0.25μg)を、BamHI 5μl、dhfr
遺伝子を含有する制限フラグメント(〜1.5μg)、10
×リガーゼ緩衝液3μl、T4DNAリガーゼ3μl(〜
1500単位)、および水9μlに加えた。このライゲー
ション反応液を15℃で一晩インキュベートした。この
ライゲート化DNAは目的のプラスミドpTPA303
DNAからなっていた。 【0198】プラスミドpTPA303を用いてE.コリ
K12 RR1(NRRL B−15210)を形質転換
し、得られたE.コリK12 RR1/pTPA303形
質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。実
質的に実施例3の方法に従って、プラスミドpTPA3
03を形質転換体から単離した。 【0199】pBR322レプリコンおよびプラスミドp
TPA301由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードし
ている〜2.7kb EcoRI−BglII制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpTPA301約10μg
を、全反応液容量400μl中、37℃で、1×BglI
I緩衝液中のBglII制限酵素20単位で完全に消化し
た。このBglII消化の後、トリス−HCl濃度を11
0mMに調整し、BglII消化したDNAにEcoRI制
限酵素20単位を加えた。〜2.7kb EcoRI−BglI
I制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、
このEcoRI−BglII消化したDNAをアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、次いで〜2.7kbフラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。 【0200】dhfr遺伝子を含有する制限フラグメントを
単離するため、プラスミドpTPA303をHindIII
およびEcoRI制限酵素で2重に消化し、dhfr遺伝子を
含有する〜2340bp EcoRI−HindIII制限フラ
グメントを単離し、回収した。 【0201】TPAのカルボキシ末端コード化領域およ
びSV40プロモーターを含有するプラスミドpTPA
303の〜2kb HindIII−SstI制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpTPA303を、1×Hi
ndIII緩衝液中、HindIIIおよびSstI制限酵素
で2重に消化した。〜1.7kbフラグメントをゲルから
単離し、ライゲーション用に調製した。 【0202】改良型TPAのアミノ末端コード化領域を
含有するプラスミドpBW28の〜680bp XhoII
(ライゲーションに対してはBglII重なり部分と適合
しうる)−SstI制限フラグメントを単離するため、プ
ラスミドpBW28約10μgを、1×XhoII緩衝液
[0.1M トリス−HCl(pH=8.0)、0.1M MgCl
2、0.1%トリトンX−100、および1mg/ml BS
A]中、XhoII酵素で完全に消化した。このXhoII
消化したDNAをエタノール沈澱で回収し、次いでSst
I酵素で完全に消化した。このXhoII−SstI消化し
たDNAをアクリルアミドゲルにかけ、目的のフラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。 【0203】上記のフラグメント、すなわちプラスミド
pTPA301の〜2.7kb EcoRI−BglII制限フ
ラグメント、プラスミドpTPA303の〜2.34kb
EcoRI−HindIII制限フラグメント、プラスミドp
TPA303の〜1.7kb SstI−HindIII制限フ
ラグメント、およびプラスミドpBW28の〜0.68kb
SstI−XhoII制限フラグメントそれぞれ約0.1μ
gをいっしょにしてライゲートし、プラスミドpBW32
を得た。このライゲーション混合物を用い、50mM C
aCl2を用いること以外は実施例2の教示のようにし
て、E.コリK12MM294を形質転換した。形質転
換体をそのアンピシリン耐性の表現型およびそのプラス
ミドDNAの制限分析によって同定した。実質的に実施
例3の方法に従って、E.コリK12 MM294/pB
W32形質転換体からプラスミドpBW32 DNAを得
た。このプラスミドpBW32の制限部位および機能地
図を添付の図14、図15、図16および図17に示
す。 【0204】実施例11 プラスミドpLPChd1、pL
PChd2、pLPCdhfr1およびpLPCdhfr2の構築 A.プラスミドpLPChd1およびpLPChd2の構築 TE緩衝液20μl中のプラスミドpBW32約20μg
を、10×BamHI緩衝液10μlおよび水60μlに加
えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、制限
酵素BamHI約10μl(〜50単位)を加え、得られた
反応液を37℃で2時間インキュベートした。このBam
HI消化したプラスミドpBW32 DNAをエタノール
で沈澱させ、遠心して集め、10×クレノウ緩衝液5μ
l、水45μlおよびクレノウ酵素2μl(〜100単位)
に再懸濁した。この反応液を16℃で30分間インキュ
ベートし、次いで消化産物が明確に分離するまでこの反
応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に
実施例4Aの方法に従って、dhfr遺伝子を含有する、プ
ラスミドpBW32の〜1.9kb クレノウ処理化BamH
I制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。目的のフラグメントが約4μg得られ、
これをTE緩衝液5μlに懸濁した。 【0205】TE緩衝液100μl中のプラスミドpLP
Chyg1約200μgを、10×EcoRI緩衝液15μl
および水30μlに加えた。このプラスミドpLPChyg
1 DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約5μl(〜50
単位)を加え、得られた反応液を37℃で10分間イン
キュベートした。この短い反応時間は、部分的なEcoR
I消化物が得られるように算出したものである。プラス
ミドpLPChyg1はEcoRI制限部位を2箇所有してお
り、そのうちの1箇所は、ハイグロマイシン耐性付与
(HmR)遺伝子のコード化配列内に存在している。この
HmR遺伝子内ではないプラスミドpLPChyg1のEco
RI部位に、dhfr遺伝子を含有している制限フラグメン
トを挿入することが望ましい。1箇所だけ切断したプラ
スミドpLPChyg1 DNAが未切断プラスミドDNA
およびその他の消化産物から分離するまで、この部分に
EcoRI消化したプラスミドpLPChyg1 DNAをア
ガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例4Aの
方法に従って、この1箇所だけ切断したDNAをゲルか
ら単離し、ライゲーション用に調製した。1箇所だけE
coRI切断したプラスミドpLPChyg1が約2μg得ら
れ、これをTE緩衝液25μlに懸濁した。この試料
に、クレノウ酵素約5μl(〜25単位)、10×クレノ
ウ緩衝液5μl、および水40μlを加え、得られた反応
液を16℃で60分間インキュベートした。このクレノ
ウ処理し、部分的にEcoRI消化したDNAを、フェノ
ールで2回、次いでクロロホルムで1回抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、TE緩衝液25μlに再懸濁した。 【0206】プラスミドpBW32の〜1.9kbのクレノ
ウ処理したBamHI制限フラグメント約5μl、および
1箇所だけEcoRI切断したプラスミドpLPChyg1
DNA約5μlをいっしょにして混合し、このDNA混
合物に、10×リガーゼ緩衝液1μl、水5μl、T4
DNAリガーゼ1μl(〜500単位)、およびT4 RN
Aリガーゼ1μl(〜2単位)を加え、得られた反応液を
16℃で一晩インキュベートした。このライゲート化D
NAは目的のプラスミドpLPChd1およびpLPChd2
(これらは、dhfr遺伝子を含有している〜1.9kbフラグ
メントの配向だけが異なっている)からなっていた。 【0207】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、形質転換用にコンピテントに
しておいたE.コリK12 HB101細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を100μg/mlアンピシリン含有の
L−寒天で平板培養し、アンピシリン耐性の形質転換体
をプラスミドDNAの制限酵素分析によって分析して、
E.コリK12 HB101/pLPChd1およびE.コリ
K12 HB101/pLPChd2形質転換体を同定し
た。プラスミドpLPChd1の制限部位および機能地図
を添付の図18に示す。プラスミドpLPChd1および
プラスミドpLPChd2 DNAを、実質的に実施例3の
方法に従って、適切な形質転換体から単離した。 【0208】プラスミドpLPChd3およびpLPChd4
は、その構造がプラスミドpLPChd1およびpLPChd
2に類似している。プラスミドpLPChyg1のかわりに
プラスミドpLPChyg2を出発原料として用いること以
外は、実質的にプラスミドpLPChd1およびpLPChd
2の構築に用いた方法に従って、プラスミドpLPChd
3およびpLPChd4を構築する。 【0209】B.プラスミドpLPCdhfr1およびpLP
Cdhfr2の構築 TE緩衝液100μl中のプラスミドpBW32約100
μgを、10×BamHI緩衝液15μlおよび水25μl
に加えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、
制限酵素BamHI約10μl(〜25単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpBW32DNAを、実質
的に実施例11Aの方法に従って、クレノウで処理し
た。この平滑末端にしたフラグメントをエタノールで沈
澱させ、TE緩衝液10μlに再懸濁し、次いでジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜1.9kb BamHI制
限フラグメントがその他の消化産物から分離するまで、
アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実
施例4Aの方法に従って、この〜1.9kb制限フラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
目的のフラグメントが約10μg得られ、これをTE緩
衝液50μlに懸濁した。 【0210】NdeI−StuI消化したプラスミドpLP
C DNA(実施例9で調製した)約5μlを、クレノウ処
理した、プラスミドpBW32の〜1.9kb BamHI制
限フラグメント5μl、10×リガーゼ緩衝液1.5μ
l、T4 DNAリガーゼ1μl(〜1000単位)、T4
RNAリガーゼ1μl(〜2単位)、および水1.5μlに
加えた。得られたライゲーション反応液を16℃で一晩
インキュベートした。このライゲート化DNAは目的の
プラスミドpLPCdhfr1およびpLPCdhfr2(これら
は、dhfr遺伝子を含有している〜1.9kbフラグメント
の配向だけが異なっている)からなっていた。このライ
ゲート化DNAを用い、実質的に実施例2の方法に従っ
て、E.コリK12 HB101を形質転換した。形質転
換細胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プ
ラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐
性のE.コリK12 HB101/pLPCdhfr1および
E.コリK12 HB101/pLPCdhfr2形質転換体
を同定した。 【0211】実施例12 プラスミドphdの構築 プラスミドphdを構築するためには、アデニンメチラー
ゼ(たとえばこれをdam遺伝子がコードしており、その遺
伝子産物は配列:5'−GATC−3'中のアデニン残基
をメチル化する)を欠くE.コリ宿主細胞から、プラスミ
ドpLPChd1DNA(これをプラスミドphd構築の出発原料
として用いる)を調製することが必要であった。E.コリ
K12 GM48(NRRL B−15725)は機能的な
damメチラーゼを欠いており、従って、プラスミドphd構
築の出発原料として用いるプラスミドpLPChd1 DN
Aを調製する目的で使用するのに適した宿主である。 【0212】実質的に実施例2の方法に従って、E.コ
リK12 GM48細胞を培養し、形質転換用にコンピ
テントにし、プラスミドpLPChyg1を用いてこのE.
コリK12 GM48細胞を形質転換した。実質的に実
施例3の方法に従って、この形質転換細胞をアンピシリ
ン含有のL寒天にプレートし、アンピシリン耐性のE.
コリK12 GM48/pLPChd1形質転換体がコロニ
ーを形成したら、そのコロニーの1つを用いてプラスミ
ドpLPChd1 DNAを調製した。約1mgのプラスミド
pLPChd1 DNAが得られ、これをTE緩衝液約1ml
に懸濁した。 【0213】TE緩衝液2μl中のプラスミドpLPChd
1 DNA約2μgを、10×BclI緩衝液[750mM
KCl、60mM トリス−HCl(pH=7.4)、100m
M MgCl2、10mM DTT、および1mg/ml BSA]
2μlおよび水14μlに加えた。このプラスミドpLP
Chd1 DNAの溶液に、制限酵素BclI約2μl(〜1
0単位)を加え、得られた反応液を50℃で2時間イン
キュベートした。この混合物をフェノールで1回、クロ
ロホルムで2回抽出することによって反応を止めた。 【0214】BclI消化したプラスミドpLPChd1 D
NA約1μlを、10×リガーゼ緩衝液1μl、水8μ
l、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜500単位)に
加えた。このライゲーション反応液を16℃で一晩イン
キュベートした。このライゲート化DNAは目的のプラ
スミドphdからなっていた。プラスミドphdは、プラスミ
ドpLPChd1から全大きさが約1.45kbの2個の近接
BclI制限フラグメントおよびプラスミドpLPcat構築
の際に結合した余分のBclIリンカー削除することによ
って得られる。プラスミドphdの制限部位および機能地
図を添付の図19に示す。発現させようとするDNA
を、プラスミドphdの唯一のBclI部位に、発現のため
の正しい位置で、容易に挿入することができるので、プ
ラスミドphdは、本発明のBKウイルスエンハンサー−
アデノウイルス後期プロモーターからのすべてのDNA
配列の発現を容易にする。 【0215】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 GM48を形
質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−寒
天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析によ
ってアンピシリン耐性のE.コリK12 GM48/phd
形質転換体を同定した。 【0216】プラスミドpLPChd1の代わりにプラス
ミドpLPChd2、pLPChd3またはpLPChd4のい
ずれかを出発原料として用い、実質的に上記のプラスミ
ドphd構築法に従って、プラスミドphdに類似するプラス
ミドを構築することができる。これらの類似プラスミド
は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子および/またはdh
fr遺伝子の配向だけがプラスミドphdと異なっている。 【0217】実施例13 プラスミドpLPCE1Aの
構築 アデノウイルス2 DNAのE1A遺伝子を単離するた
め、アデノウイルス2DNA(BRLから入手)約20μ
gを、10×BalI緩衝液[100mM トリス−HCl(p
H=7.6)、120mM MgCl2、100mM 2−メル
カプトエタノール、および1mg/ml BSA]10μlお
よび水80μlに溶解した。このアデノウイルス2 DN
Aの溶液に、制限酵素BalI約10μl(約20単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。E1A遺伝子を含有する〜1.8kb制限フラグメ
ントがその他の消化産物から分離するまで、このBalI
消化したDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。実
質的に実施例4Aの方法に従って、この〜1.8kbフラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約3μg得られ、これをTE
緩衝液20μlに懸濁した。 【0218】TE緩衝液5μl中のプラスミドpLPC約
5μgを、10×StuI緩衝液2μlおよび水11μlに
加えた。このプラスミドpLPCの溶液に、制限酵素St
uI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を37
℃で2時間インキュベートした。このStuI消化したプ
ラスミドpLPC DNAをエタノールで沈澱させ、10
×NdeI緩衝液2μlおよび水16μlに再懸濁した。こ
のStuI消化したプラスミドpLPC DNAの溶液に制
限酵素NdeI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。 【0219】このNdeI−StuI消化したプラスミドp
LPC DNAをエタノールで沈澱させ、10×クレノ
ウ緩衝液5μlおよび水42μlに再懸濁した。このDN
A溶液にクレノウ酵素約3μl(〜6単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で30分間インキュベートした。〜
5.82kbの、クレノウ処理したNdeI−StuI制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から明確に分離するま
で、この反応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ
た。実質的に実施例4Aの方法に従って、このフラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドpLPCの〜5.82kbの、クレノウ処理した
NdeI−StuI制限フラグメントが約2μg得られ、T
E緩衝液25μlに懸濁した。 【0220】E1A遺伝子をコードしているアデノウイ
ルス2の〜1.8kb BamHI制限フラグメント約9μ
l、およびプラスミドpLPCの〜5.82kb クレノウ処
理化NdeI−StuI制限フラグメント3μlを、10×
リガーゼ緩衝液2μlおよび水4μlに加えた。このDN
A溶液に、T4 DNAリガーゼ約1μl(〜500単位)
およびT4 RNAリガーゼ1μl(〜2単位)を加え、得
られた反応液を16℃で一晩インキュベートした。 【0221】このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドpLPCE1AおよびpLPCE1A1からなっていた
(これらは、E1A遺伝子の配向が異なり、またおそら
くは、BKエンハンサーがプラスミド上のE1A遺伝子
に対して有している発現促進効果が異なる)。プラスミ
ドpLPCE1A1よりプラスミドpLPCE1Aのほう
が、BKエンハンサーにより近接してE1Aプロモータ
ーが位置しているので、プラスミドpLPCE1A1を
用いるよりプラスミドpLPCE1Aを用いるときのほ
うがE1A発現が高くなるであろう。プラスミドpLP
CE1Aの制限部位および機能地図を添付の図20に示
す。 【0222】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性形質転換体をスクリーニングし
て、E.コリK12 HB101/pLPCE1Aおよび
E.コリK12 HB101/pLPCE1A1形質転換
体を同定した。後の実験にもちいるため、実質的に実施
例3の方法に従って、形質転換体からプラスミドDNA
を得た。 【0223】実施例14 プラスミドpBLTの構築 TE緩衝液1μl中のプラスミドpBW32 DNA(図1
4、図15、図16および図17、実施例10)約1μg
を、10×BamHI緩衝液2μlおよび水15μlに加え
た。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、制限酵
素BamHI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。この反応混合
物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで2回抽
出することによって反応を止めた。このBamHI消化し
たプラスミドpBW32 DNA約1μlを、10×リガ
ーゼ緩衝液1μlおよび水8μlに加え、このDNA溶液
にT4 DNAリガーゼ約1μl(〜500単位)を加えた
後、得られた反応液を16℃で一晩インキュベートし
た。 【0224】このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドpBW32delからなっていた(このプラスミドは大き
さが約5.6kbであり、HindIII制限部位を1つだけ
含有している)。このライゲート化DNAを用い、実質
的に実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB10
1を形質転換した。目的のE.コリK12 HB101/
pBW32del形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表
現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て同定した。後の構築にもちいるため、実質的に実施例
3の方法に従って、形質転換体からプラスミドpBW3
2del DNAを得た。 【0225】TE緩衝液1μl中のプラスミドpBW32
del約1μgを、10×HindIII緩衝液2μlおよび水
15μlに加えた。このプラスミドpBW32del DNA
の溶液に、制限酵素HindIII約2μl(〜10単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。実質的に実施例2記載の方法に従って、この試料
をTE緩衝液で100μlに希釈し、ウシ腸アルカリホ
スファターゼで処理した。この反応液をフェノールで2
回、次いでクロロホルムで1回抽出した。次いで、この
HindIII消化したプラスミドpBW32del DNAを
エタノールで沈澱させ、水10μlに再懸濁した。 【0226】実質的に実施例5の方法に従って、プラス
ミドpBal8cat(実施例17)を制限酵素HindIIIで
消化し、改良型BKエンハンサー−アデノウイルス2後
期プロモーターカセットを含有する〜0.65kb Hind
III制限フラグメントを単離し、これをライゲーショ
ン用に調製した。TE緩衝液5μl中のプラスミドpBal
8catの〜0.65kb HindIII制限フラグメント約
0.1μgを、HindIII消化したプラスミドpBW32
delの溶液3μlに加えた。このDNA混合物に、T4
DNAリガーゼ約1μl(〜500単位)および10×リ
ガーゼ緩衝液1μlを加え、得られた反応液を16℃で
一晩インキュベートした。 【0227】このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドpBLTからなっていた。プラスミドpBLTの制限部
位および機能地図を添付の図21に示す。このライゲー
ト化DNAを用い、実質的に実施例2の方法に従って、
E.コリK12 HB101を形質転換した。形質転換細
胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プラス
ミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐性の
E.コリK12 HB101/pBLT形質転換体を同定
した。〜0.65kb HindIII制限フラグメントは、
2つの配向(そのうちの1つだけがプラスミドpBLTを
与える)のうちのどちらででもHindIII消化したプラ
スミドpBW32delに挿入することができるので、この
〜0.65kb HindIII制限フラグメントの配向を決
定してE.コリK12 HB101/pBLT形質転換体
を同定した。後の構築にもちいるため、実質的に実施例
3の方法に従って、形質転換体からプラスミドpBLT
DNAを調製した。 【0228】実施例15 プラスミドpBLThyg1、p
BLThyg2、pBLTdhfr1、およびpBLTdhfr2の
構築 A.プラスミドpBLThyg1およびpBLThyg2の構築 TE緩衝液4μl中のプラスミドpBLT DNA約4μg
を、10×BamHI緩衝液2μlおよび水12μlに加え
た。このプラスミドpBLT DNAの溶液に、制限酵素
BamHI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液
を37℃で2時間インキュベートした。この反応混合物
を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで抽出する
ことによって反応を止めた。次いで、このBamHI消化
したプラスミドpBLT DNAをエタノールで沈澱さ
せ、TE緩衝液2μlに再懸濁した。 【0229】TE緩衝液10μl中のプラスミドpSV2
hyg約10μgを、10×BamHI緩衝液10μlおよび
水75μlに加えた。このプラスミドpSV2hyg DNA
の溶液に、制限酵素BamHI約5μl(〜25単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このBamHI消化したプラスミドpSV2hyg DN
Aをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液10μlに再懸
濁し、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有する〜
2.5kb BamHI制限フラグメントがその他の消化産物
から分離するまで、アガロースゲル電気泳動にかけた。
次いで、実質的に実施例4Aの方法に従って、この〜
2.5kb制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメント約2μgが得
られ、これをTE緩衝液10μlに懸濁した。 【0230】BamHI消化したプラスミドpBLT DN
A約2μlおよびプラスミドpSV2hygの〜2.5kb Ba
mHI制限フラグメント1μlを、10×リガーゼ緩衝液
1μl、水5μl、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜
500単位)に加え、得られた反応液を16℃で一晩イ
ンキュベートした。このライゲート化DNAは目的のプ
ラスミドpBLTThyg1およびpBLThyg2からなって
いた。プラスミドpBLThyg1の制限部位および機能地
図を添付の図22に示す。プラスミドpBLThyg1とp
BLThyg2は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコ
ードしている〜2.5kb BamHI制限フラグメントの配
向だけが異なっている。 【0231】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB101/
pBLThyg1およびE.コリK12 HB101/pBL
Thyg2形質転換体を同定した。 【0232】B.プラスミドpBLTdhfr1およびpBL
Tdhfr2の構築 TE緩衝液100μl中のプラスミドpBW32約100
μgを、10×BamHI緩衝液15μlおよび水25μl
に加えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、
制限酵素BamHI約10μl(〜50単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpBW32DNAをエタノ
ールで沈澱させ、TE緩衝液10μlに再懸濁し、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜1.9kb BamHI
制限フラグメントがその他の消化産物から分離するま
で、アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、この〜1.9kb制限フラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメント約10μgが得られ、これをT
E緩衝液50μlに懸濁した。 【0233】実施例15Aで調製したBamHI消化のプ
ラスミドpBLT DNA約2μlおよびプラスミドpBW
32の〜1.9kb BamHI制限フラグメント1μlを、
10×リガーゼ緩衝液1μl、水5μl、およびT4 D
NAリガーゼ1μl(〜500単位)に加え、得られた反
応液を16℃で一晩インキュベートした。このライゲー
ト化DNAは目的のプラスミドpBLTdhfr1およびpB
LTdhfr2からなっていた。プラスミドpBLTdhfr1
の制限部位および機能地図を添付の図23に示す。プラ
スミドpBLTdhfr1とpBLTdhfr2は、dhfr遺伝子を
コードしている〜1.9kb BamHI制限フラグメントの
配向だけが異なっている。 【0234】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB101/
pBLTdhfr1およびE.コリK12 HB101/pBL
Tdhfr2形質転換体を同定した。 【0235】実施例16 プラスミドphdTPAおよびp
hdMTPAの構築 A.中間体プラスミドpTPA602の構築 ガラス蒸留水45μl中のプラスミドpTPA103(実
施例10、図14、図15、図16および図17)約5
0μgを、10×EcoRI緩衝液30μlおよび水225
μlに加えた。このプラスミドpTPA103 DNAの
溶液に、制限酵素EcoRI約10μl(〜80単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。このEcoRI消化したプラスミドpTPA103
DNAをエタノールで沈澱させ、1×ローディング緩衝
液(10%グリセリンおよび0.02%ブロモフェノール
ブルー)50μlに再懸濁し、〜1.1kb EcoRI制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から分離するまで、ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。フラグメントを透析袋
に電気泳動させることによって、TPAのアミノ末端を
コードしているDNAを含有する〜1.1kb EcoRI制
限フラグメントをゲルから単離した。次いで、このフラ
グメントをエタノールで沈澱させ、水160μlに再懸
濁した。 【0236】10×HgaI緩衝液[0.5M NaCl、6
0mM トリス−HCl(pH=7.4)、および0.1M
MgCl2]約40μl、ガラス蒸留水200μl、および制
限酵素HgaI 20μl(約10単位)を、〜1.1kb Eco
RI制限フラグメントの溶液に加え、得られた反応液を
37℃で4時間インキュベートした。このHgaI消化し
たDNAをエタノールで沈澱させ、次いで5%アクリル
アミドゲルで電気泳動し、TPAのアミノ末端をコード
している〜520bp制限フラグメントをDE81紙に単
離し、回収した。〜520bp HgaIフラグメント約5
μgが得られ、これを水50μlに懸濁した。 【0237】10×クレノウ緩衝液[0.5M トリス−
HCl(pH=7.4)、および0.1MMgCl2]約12.5
μl、4種類のデオキシヌクレオチド三リン酸それぞれ
が6.25mMである溶液2μl、0.2M DTT 2μ
l、7μg/ml BSA 1μl、ガラス蒸留水57.5μ
l、およびクレノウ酵素[ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ(Boehringer−Mannheim Biochemical
s,7941 CastlewayDr.,P.O.Box 50816,I
ndianapolis,IN 46250)]2μl(〜10単位)を、
〜520bp HgaI制限フラグメントの溶液に加え、得
られた反応液を20℃で30分間インキュベートした。
このクレノウ処理したDNAを70℃で15分間インキ
ュベートし、エタノールで沈澱させた。 【0238】BamHIリンカー(5'−CGGGATCC
CG−3';2本鎖であり、ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手した)約500ピコモルを、合計反応
容量25μl中、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホ
スホリル化した。この反応は、実質的に実施例6A記載
の方法に従って行った。クレノウ処理した〜520bpH
gaI制限フラグメントの溶液に、このキナーゼ処理した
BamHIリンカーを、10×リガーゼ緩衝液15μl、
T4 DNAリガーゼ7μl(〜7バイス単位)、および反
応液容量を150μlとするに十分なガラス蒸留水とと
もに加えた。得られた反応液を16℃で一晩インキュベ
ートした。 【0239】このライゲーション反応液を加熱して不活
性化し、DNAをエタノールで沈澱させ、10×BamH
I緩衝液5μlおよび水45μlに再懸濁した。このDN
A溶液に制限酵素BamHI約1μl(〜16単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。次いで、この反応混合物にBamHI酵素16単位
をさらに加え、反応液を37℃でさらに90分間インキ
ュベートした。次いで、実質的に実施例6Aの方法に従
って、反応混合物を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、BamHI末端を有する〜530bp HgaI制
限フラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメン
トが約2μg得られ、これを水20μlに懸濁した。 【0240】BamHI消化し、脱ホスホリル化したプラ
スミドpBR322 DNAは、ニュー・イングランド・
バイオラブズから入手することができる。水2μl中
の、BamHI消化し、脱ホスホリル化したプラスミドp
BR322約0.1μgを、プラスミドpTPA103
の、BamHI末端を有する〜530bp HgaI制限フラ
グメント1μl、水14μl、およびT4 DNAリガー
ゼ1μl(〜1バイス単位)に加え、得られた反応液を1
6℃で一晩インキュベートした。このライゲート化DN
Aは、目的のプラスミドpTPA602およびプラスミ
ドpTPA601と命名したその等価物(このプラスミド
は、挿入した〜530bp制限フラグメントの配向だけが
プラスミドpTPA602と異なる)からなっていた。こ
のプラスミドpTPA602の制限部位および機能地図
を添付の図24に示す。 【0241】このライゲート化DNAを用い、50mM
CaCl2を用いること以外は実質的に実施例2の方法に
従って、E.コリK12 MM294を形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養
し、プラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシ
リン耐性のE.コリK12 MM294/pTPA602
およびE.コリK12 MM294/pTPA601細胞
を同定した。〜530bpBamHI制限フラグメントの存
在は、プラスミドがpTPA602またはpTPA601
のどちらかであることを示す。 【0242】B.中間体プラスミドpTPA603の構築 プラスミドpTPA602約5μgを、10×BglII緩
衝液20μlおよび水180μlに加えた。このプラスミ
ドpTPA602 DNAの溶液に、制限酵素BglII約
3μl(〜24単位)を加え、得られた反応液を37℃で
90分間インキュベートした。次いで、この反応混合物
に10×BamHI緩衝液〜13μlを加えて、反応混合
物の塩濃度をSalI消化に推奨される濃度にし、この反
応液に制限酵素SalI 2μl(〜20単位)を加えた。こ
の反応液を37℃でさらに2時間インキュベートし、次
いでDNAをエタノールで沈澱させ、ローディング緩衝
液75μlに再懸濁し、〜4.2kb BglII−SalI制
限フラグメントがその他の消化産物から分離するまで、
アガロースゲル電気泳動にかけた。この〜4.2kb Bgl
II−SalI制限フラグメントを含有するゲル領域をゲ
ルから切り出し、凍結させ、この凍結セグメントをプラ
スチックで包み、そして圧搾して〜4.2kbフラグメン
トを取り出した。このDNAを沈澱させ、水20μlに
再懸濁した(目的のフラグメントが約200ナノグラム
得られた)。 【0243】プラスミドpTPA103約12μgを、1
0×BglII緩衝液15μlおよび水135μlに加え
た。このプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、制
限酵素BglII約2μl(〜16単位)を加え、得られた
反応液を37℃で90分間インキュベートした。このB
glII消化したプラスミドpTPA103 DNAの溶液
に10×BamHI緩衝液約10μlを加えて、反応混合
物の塩濃度をSalI消化に必要とされる濃度にした。次
いで、このBglII消化したプラスミドpTPA103
DNAの溶液に制限酵素SalI約2μl(〜20単位)を
加え、この反応液を37℃でさらに90分間インキュベ
ートした。このBglII−SalI消化したプラスミドp
TPA103 DNAをエタノール沈澱によって濃縮
し、次いでアガロースゲルにかけ、TPAのアミノ末端
以外のすべてをコードしている〜2.05kb BglII−
SalI制限フラグメントをゲルから単離し、エタノール
で沈澱させ、水20μlに再懸濁した。目的のフラグメ
ントが約2μg得られた。 【0244】プラスミドpTPA602の〜4.2kb Bg
lII−SalI制限フラグメント約5μlおよびプラスミ
ドpTPA103の〜2.05kb BglII−SalI制限
フラグメント2μlを、10×リガーゼ緩衝液2μl、水
10μl、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜1バイス
単位)に加え、得られたライゲーション反応液を16℃
で一晩インキュベートした。このライゲート化DNAは
目的のプラスミドpTPA603からなっていた。プラ
スミドpTPA603の制限部位および機能地図を添付
の図25に示す。 【0245】このライゲート化DNAを用い、50mM
CaCl2を用いること以外は実質的に実施例2の方法に
従って、E.コリK12 MM294を形質転換した。こ
の形質転換細胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培
養し、プラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピ
シリン耐性のE.コリK12 MM294/pTPA60
3形質転換体を同定した。 【0246】C.プラスミドpMTPA603の構築 TE緩衝液100μl中のプラスミドpBLT(実施例1
4、図21)約100μgを、10×SstI(SstIは制
限酵素SacIと等価である)緩衝液[60mM トリス−H
Cl(pH=7.4)、60mM MgCl2、60mM 2−メル
カプトエタノール、および1mg/ml BSA]10μlお
よび水25μlに加えた。このプラスミドpBLT DN
Aの溶液に、制限酵素SstI約10μl(〜50単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。このSstI消化したプラスミドpBLT DNAを
エタノールで沈澱させ、10×BglII緩衝液10μl
および水85μlに再懸濁した。このSstI消化したプ
ラスミドpBLT DNAの溶液に、制限酵素BglII約
5μl(〜50単位)を加え、得られた反応液を37℃で
2時間インキュベートした。 【0247】実質的に実施例4Aの方法に従って、この
BglII−SstI消化したプラスミドpBLT DNAを
エタノールで沈澱させ、水10μlに再懸濁し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、改良型TPAのコード化配列
部分(改良型TPAをコードしている配列が得られるよ
うな欠失が生じている)を含有するプラスミドpBLTの
〜690bp BglII−SstI制限フラグメントをゲル
から単離した。目的の、プラスミドpBLTの〜690b
p BglII−SstI制限フラグメントが約5μg得ら
れ、これを水100μlに懸濁した。 【0248】TE緩衝液5μl中のプラスミドpTPA6
03(実施例16B、図25)約5μgを、10×SstI
緩衝液10μlおよび水95μlに加えた。このプラスミ
ドpTPA603 DNAの溶液に、制限酵素SstI約5
μl(〜50単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。このSstI消化したプラスミ
ドpTPA603 DNAをエタノールで沈澱させ、10
×BglII緩衝液10μlおよび水85μlに再懸濁し
た。このSstI消化したプラスミドpTPA603DN
Aの溶液に、制限酵素BglII約5μl(〜50単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。実質的に実施例2の方法に従って、このBglII
−SstI消化したプラスミドpTPA603 DNAをT
E緩衝液100μlに希釈し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼで処理した。次いで、このDNAをエタノールで
沈澱させ、水10μlに再懸濁した。 【0249】BglII−SstI消化したプラスミドpT
PA603約5μlおよびプラスミドpBLTの〜690
bp BglII−SstI制限フラグメント2μlを、10×
リガーゼ緩衝液2μl、水10μl、およびT4 DNA
リガーゼ1μl(〜1000単位)に加え、得られたライ
ゲーション反応液を16℃で一晩インキュベートした。
このライゲート化DNAは目的のプラスミドpMTPA
603からなっていた。従って、プラスミドpMTPA
603が改良型TPAをコードし、プラスミドpTPA
603がTPAをコードしていること以外は、プラスミ
ドpMTPA603はその構造がプラスミドpTPA60
3(図25)と類似している。 【0250】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。この形質転換細胞をアンピシリン含有の
L−寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分
析によってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB10
1/pMTPA603形質転換体を同定した。 【0251】D.プラスミドphdTPAの構築 TE緩衝液10μl中のプラスミドpTPA603(実施
例16B、図25)約10μgを、10×BamHI緩衝液
10μlおよび水85μlに加えた。このプラスミドpT
PA603 DNAの溶液に、制限酵素BamHI約5μl
(〜50単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。このBamHI消化したプラスミド
pTPA603 DNAをエタノールで沈澱させ、水10
μlに再懸濁し、TPAをコードしている〜1.90kb
BamHI制限フラグメントがその他の消化産物から分離
するまでアガロースゲル電気泳動にかけた。この〜1.
90kb BamHI制限フラグメントをゲルから単離し、
TE緩衝液50μlに再懸濁した。目的のフラグメント
が約4μg得られた。 【0252】TE緩衝液2μl中のプラスミドphd(実施
例12、図19)約2μgを、10×BclI緩衝液2μl
および水14μlに加えた。このプラスミドphd DNA
の溶液に、制限酵素BclI約2μl(〜10単位)を加
え、得られた反応液を50℃で2時間インキュベートし
た。この反応混合物を始めにフェノールで、次いでクロ
ロホルムで2回抽出することによって、反応を停止させ
た。次いで、このBclI消化したプラスミドphd DNA
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液20μlに再懸濁
した。 【0253】BclI消化したプラスミドphd約1μlおよ
びプラスミドpTPA603の〜1.90kb BamHI制
限フラグメント2μlを、10×リガーゼ緩衝液1μl、
水5μl、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜500単
位)に加え、得られたライゲーション反応液を16℃で
一晩インキュベートした。このライゲート化DNAは目
的のプラスミドphdTPAからなっていた。このプラス
ミドphdTPAの制限部位および機能地図を添付の図2
6に示す。 【0254】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101
(NRRL B−15626)を形質転換した。この形質
転換混合物をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養
し、制限酵素分析によってアンピシリン耐性のE.コリ
K12 HB101/phdTPA細胞を同定した。〜1.
90kb BamHI制限フラグメントは、BclI消化した
プラスミドphdに2種類の配向のうちどちらかで挿入す
ることができるが、そのうちの1つだけが、BKエンハ
ンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセットの制
御下に発現させるのに適した位置に、TPAコード化配
列を配置している。すなわち、これが目的のプラスミド
phdTPAである。 【0255】E.プラスミドphdMTPAの構築 TE緩衝液10μl中のプラスミドpMTPA603(実
施例16C)約10μgを、10×BamHI緩衝液10μ
lおよび水85μlに加えた。このプラスミドpMTPA
603 DNAの溶液に、制限酵素BamHI約5μl(〜
50単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間イ
ンキュベートした。このBamHI消化したプラスミドp
MTPA603 DNAをエタノールで沈澱させ、水1
0μlに再懸濁し、改良型TPAをコードしている〜1.
35kb BamHI制限フラグメントがその他の消化産物
から分離するまでアガロースゲル電気泳動にかけた。こ
の〜1.35kb BamHI制限フラグメントをゲルから単
離し、TE緩衝液20μlに再懸濁した。目的のフラグ
メントが約4μg得られた。 【0256】実施例16Dで調製したBclI消化のプラ
スミドphd約1μlおよびプラスミドpMTPA603の
〜1.35kb BamHI制限フラグメント2μlを、10
×リガーゼ緩衝液1μl、水5μl、およびT4 DNA
リガーゼ1μl(〜500単位)に加え、得られたライゲ
ーション反応液を16℃で一晩インキュベートした。こ
のライゲート化DNAは目的のプラスミドphdMTPA
からなっていた。プラスミドphdMTPAの制限部位お
よび機能地図を添付の図27に示す。 【0257】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。この形質転換混合物をアンピシリン含有
のL−寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素
分析によってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB1
01/phdMTPA細胞を同定した。〜1.35kbBamH
I制限フラグメントは、BclI消化したプラスミドphd
に2種類の配向のうちのどちらかで挿入することができ
るが、そのうちの1つだけが、BKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターの制御下に発現させるのに
適した位置に、TPAコード化配列を配置している。す
なわち、これが目的のプラスミドphdMTPAである。 【0258】実施例17 改良型BKエンハンサー−ア
デノウイルス後期プロモーターカセットの構築 近接する真核生物性プロモーターのCAAT領域の5'
末端の上流側0〜300ヌクレオチドにBKエンハンサ
ーを配置することによって、該エンハンサーの転写促進
効果を著しく増加させることができる。修飾を加えてよ
り大きい促進活性を達成する前の、本発明のBKエンハ
ンサー−アデノウイルス2後期プロモーターカセットの
配列および機能成分を以下に示す: 【0259】 【化22】 【化23】【化24】 【化25】[配列中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニ
ル、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルであ
る]。 【0260】BKエンハンサーは、上記配列中に示した
3つの繰り返し配列で定義され、近接する配列に対し
て、どちらの配向であっても同様に機能する。このエン
ハンサー、すなわちBKエンハンサーの3番目の繰り返
しの3'末端(これは配向に依存する)を、アデノウイル
ス−2 後期プロモーターのCAAT領域の5'末端のよ
り近くに持ってくるため、TE緩衝液170μl中のSs
tI消化したプラスミドpBLcat DNA約82μgを、
5×Bal31ヌクレアーゼ緩衝液[0.1M トリス−H
Cl(pH=8.1)、0.5M NaCl、0.06M CaC
l2、および5mM Na2EDTA]20μlおよびBal31
ヌクレアーゼ[これは、「早い」Bal31酵素6μl(〜6
単位)および「遅い」Bal31酵素3μl(〜3単位)からな
り、これらはインターナショナル・バイオテクノロジー
ズ社(International Biotechnologies,Inc.,P.O.
Box 1565,New Haven,CT 06506)から市販
されている]9μlに加えた。この反応液を30℃で約3
分間インキュベートし、次いで0.1M EGTA約10
μlを加えて反応を止めた後、このBal31消化したD
NAをエタノール沈澱および遠心することによって集め
た。実質的に上記記載の方法に従って、このDNAペレ
ットを1×クレノウ緩衝液に再懸濁し、クレノウ酵素で
処理した。 【0261】このクレノウ処理したDNAをTE緩衝液
10μlに再懸濁し、次いで前記のようにして、このD
NA約1μlを、1×リガーゼ緩衝液10μl中、T4
DNAおよびRNAリガーゼを用いて自己ライゲートさ
せた。このライゲート化DNAを用いてE.コリK12
HB101を形質転換し、次いでこの形質転換体をアン
ピシリン含有のL寒天にプレートした。制限酵素分析を
用いて、どの形質転換体が適当な大きさのBKエンハン
サー−アデノウイルス2後期プロモーターカセット含有
のプラスミドを含んでいるかを測定し、DNA配列決定
を用いてこのカセットのヌクレオチド配列を確認した。
上記の方法は、アデノウイルス後期プロモーターのCA
AT領域の上流側0〜300ヌクレオチド以内にBKエ
ンハンサーが配置された多数のプラスミドを生じる。上
記方法から得られたプラスミドの1つをプラスミドpBa
l8catと命名した。このプラスミドpBal8catのBKエ
ンハンサー−アデノウイルス2後期プロモーターの配列
を以下に示す: 【0262】 【化26】 【化27】【化28】 [配列中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニ
ル、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルであ
る]。 【0263】プラスミドpBal8catについて説明した
が、上記方法によって多数の別種プラスミドが得られる
ことは当業者の理解するところであろう。一群のこれら
プラスミドは、Ad2後期プロモーターのCAAT領域
から300ヌクレオチド以内の様々な距離のところにB
Kエンハンサーを配置したものであり、従って本発明の
重要な態様である。上述の方法または当分野で既知のそ
の他の方法を用いておこなうことができるこのBKエン
ハンサー活性を改良する方法は、すべてのBKエンハン
サーおよびすべての真核生物性プロモーターを用いて行
うことができる。 【0264】実施例18 本発明の発現ベクターの真核
宿主細胞形質転換体の作成およびこれら形質転換体にお
ける組換え遺伝子発現レベルの測定 本発明の態様のうち重要なものは、BKエンハンサーを
用いて、E1A遺伝子産物の存在下に遺伝子の発現を刺
激することに関する。293細胞は構成的にE1A遺伝
子産物を発現するので、293細胞が本発明の真核生物
性発現ベクターの宿主として好ましい。293細胞はア
デノウイルスタイプ5(本発明方法においては、アデノ
ウイルスの特定タイプのいずれかを用いてE1A遺伝子
産物を供給することができることに注意)で形質転換し
たヒト胎児腎細胞であり、ATCCから取得番号CRL
1573のもとで入手できる。しかし本発明の発現ベ
クターは、たとえE1A遺伝子産物が存在しない場合で
あっても、多種多様の宿主細胞において機能する。さら
に、E1A遺伝子を含有する本発明のベクター(たとえ
ば、プラスミドpLPCE1AおよびpLPCE1A1)
あるいは完全なアデノウイルスDNAで形質転換する
か、またはアデノウイルスに感染させることによって、
E1A−非産生セルラインにE1A遺伝子産物を導入す
ることができる。 【0265】以下に記載する形質転換法は、宿主細胞セ
ルラインとして293細胞を挙げて言及するが、この方
法は、ほとんどの真核生物セルラインに一般的に応用す
ることができる。本発明のベクターで多数のセルライン
を形質転換し、実際に作成した形質転換体のいくつか、
およびその関連情報を本実施例中、後記の表に示す。本
発明の発現ベクターは極めて多数にのぼるので、形質転
換法は一般的に記載し、実際に作成した形質転換体を表
中に示す。 【0266】293細胞を、ATCCから取得番号CR
L1573のもと、10%の加熱不活性化したウマ血清
を含有するイーグル(Eagle)の最小必須培地中の、約
5.5×106の全面単層細胞を含有する25mm2フラス
コとして入手する。このフラスコを37℃でインキュベ
ートし、培地を週2回交換する。培地を除去し、ハンク
(Hank)のバランス塩溶液(Gibco)ですすぎ、0.25%
トリプシンを1〜2分間加え、新鮮な培地ですすぎ、そ
して1:5または1:10の継代培養比で新しいフラスコ
に吸引、分取することによって細胞を継代培養する。 【0267】形質転換の1日前に0.7×106細胞/皿
で細胞を植え付ける。形質転換の4時間前に培地を交換
する。滅菌し、エタノール沈澱させたプラスミドDNA
(TE緩衝液に溶解した)を用いて、40μg/ml DNA
および250mM CaCl2を含有する2×DNA−CaC
l2溶液を調製する。280mM NaCl、50mMヘペス
および1.5mMリン酸ナトリウムを含有し、pHを7.0
5〜7.15に調整した2×HBSを調製する。2×D
NA−CaCl2溶液を等容量の滅菌2×HBSに滴下す
る。綿栓をつけた1mlの滅菌プラスチックピペットを、
2×HBSを含有する混合管に挿入し、DNAを添加す
る間、吹き込むことによって気泡を導入する。室温で3
0〜45分間、撹拌することなくカルシウム−リン酸塩
−DNA沈澱物を析出させる。 【0268】次いで、プラスチックピペットで穏やかに
ピペット操作を行って沈澱物を混合し、受容細胞を覆う
増殖培地10mlに沈澱物1ml(プレートあたり)を直接加
える。37℃で4時間インキュベートした後、培地を1
0%ウシ胎児血清含有のDMEMに置き換え、選択圧を
与える前にこの細胞をさらに72時間インキュベートす
る。組換えヒトタンパク質Cを発現する形質転換体に対
しては、このタンパク質のγカルボキシル化に必要な補
助因子であるビタミンK(1〜10μg/ml)を増殖培地
に含有させた。真核生物細胞中で機能する選択マーカー
を含有していないプラスミドに対しては、プラスミド混
合物、すなわち選択マーカーを欠く本発明の発現ベクタ
ー、および真核生物細胞中で機能する選択マーカーを含
有している発現ベクターを用いて形質転換を行った。こ
の共形質転換法は、形質転換させるプラスミドの両者を
含有している細胞の同定を可能にする。 【0269】ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有す
るプラスミドでトランスフェクションした細胞に対して
は、増殖培地に最終濃度約200〜400μg/mlにな
るまでハイグロマイシンを加える。次いで、培地を3〜
4日間隔で交換しながら37℃で2〜4週間細胞をイン
キュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコロ
ニーを、その特徴を調べるために別々の培養フラスコに
移す。ネオマイシン(ネオマイシンの代わりにG418
を用いることもできる)耐性コロニーの選択は、ハイグ
ロマイシンの代わりにネオマイシンを最終濃度400μ
g/mlになるまで加えること以外は、実質的にハイグロ
マイシン耐性細胞の選択方法に従って行う。293細胞
はdhfr陽性であるので、dhfr遺伝子を有するプラスミド
含有の293形質転換体はdhfr陽性の表現型(ヒポキサ
ンチンおよびチミンを欠く培地で増殖する能力)に基づ
いてのみでは選択されない。機能的なdhfr遺伝子を欠
き、そしてdhfrを含有するプラスミドで形質転換された
セルラインは、dhfr+表現型に基づいて選択することが
できる。 【0270】dhfr欠失セルラインに遺伝子またはプラス
ミドを導入するための選択マーカーとしてジヒドロ葉酸
還元酵素(dhfr)遺伝子を用いること、および後にメトト
レキセイトを用いてプラスミドのコピー数を増幅するこ
とは文献上よく認められている。dhfr産生細胞において
選択および増幅マーカーとしてdhfrを用いることについ
ては十分に研究が為されていないが、文献に挙げられて
いる証拠は、遺伝子増幅のためおよびdhfr産生細胞にお
ける選択マーカーとしてdhfrを用いることができること
を示唆している。本発明は用いる選択マーカーによって
は限定されない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、ア
デノシンデアミナーゼ遺伝子、またはP−糖タンパク質
で例示される多重遺伝子耐性族の一員などの増幅しうる
マーカーを用いることができる。 【0271】 【表3】【表4】 【0272】 【表5】* それぞれのセルラインにおいて産生したCATの相
対レベル値は、プラスミドpSV2catからのCATレベ
ルを基礎とした(それぞれのセルラインにおいて1であ
るとして)。結果は別個に測定した2〜6測定値の平均
である。ND=検出されず。NT=試験せず。プラスミ
ドpSLcatはプラスミドpBLcatに類似しているが、B
Kエンハンサーの代わりにSV40エンハンサーを有し
ている。293セルラインだけがE1Aを産生する。C
OSおよびk816−4セルラインはT抗原を産生す
る。 ** k816−4細胞は、複製起源に欠失を有するS
V40ゲノムを含有している。pMK16,8−16と命
名されたプラスミド[グルズマン(Y.Gluzman,Cold S
pring Harbor)から入手]で1次ヒト腎細胞を形質転換
することによって調製した。このセルラインはSV40
のT抗原を構成的に産生する。このk816−4セルラ
インは本質的にセルラインSV1[SV40で形質転換
したヒト腎細胞セルラインであり、メジャー(E.O.Ma
jor,Polyomaviruses and HumanNeurological Disea
se,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.1983,eds D.Ma
dden,and J.Sever)が開示している]と同じである。 【0273】 【表6】 * それぞれのセルラインにおいて産生したCATの相
対レベル値は、細胞溶解物中のCATレベルを、ハイブ
リダイゼーション分析で測定した同細胞溶解物中のプラ
スミドDNA量で割ることによって補正した。293細
胞におけるプラスミドpSV2catの補正値を1とした。
ルスの即時型遺伝子産物の存在下にBKエンハンサーを
用いて、真核宿主細胞における組換え遺伝子の転写を増
加させる方法、ならびに本方法に用いるのに適したDN
A化合物、組換えDNAベクターおよび該ベクターで形
質転換した宿主細胞に関する[ここでいうBKエンハン
サーとは、3個の繰り返し配列からなる、本明細書に定
義したDNAセグメントである(後記実施例17中に記
載)]。 【0002】本明細書中に例示したBKエンハンサー配
列は、BKウイルス、すなわち免疫抑制患者の尿から初
めて単離されたヒト・パポバウイルスから得られる。B
Kウイルスは、外見からはわからない幼年期感染を引き
起こすものと推測され、全人類中に存在している。BK
ウイルスはヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウイ
ルスは非霊長動物細胞においては不稔サイクル下に入
り、インビトロで齧歯類動物細胞を形質転換し、そして
ハムスターにおいては腫瘍を引き起こす。BKウイルス
はSV40に極めて似ているが、この2種類のパポバウ
イルス(すなわち、SV40およびBK)のエンハンサー
配列は実質的にヌクレオチド配列が異なっている。BK
ウイルスの完全なヌクレオチド配列(〜5.2kb)は、セ
イフ等[Seif et al.,Cell,18:963(1979)]、
ならびにヤングおよびウー[Yangand Wu,Science,2
06:456(1979)]が開示しており、このウイルス
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(A
TCC)(American TypeCulture Collection,123
01 Parklawn Dr.,Rockville,MD20852−1
776)から、取得番号ATCC VR−837のもとで
入手することができる。このBKウイルスの制限部位お
よび機能地図を添付の図1に示す。 【0003】エンハンサー成分はcis−作用であり、こ
のエンハンサー成分の位置および配向に比較的依存せず
に、近接する遺伝子の、そのプロモーターからの転写レ
ベルを増加させる。事実、コーリーおよびグルス[Khou
ry and Gruss,cell,33:313(1983)]は、「真核
生物遺伝子の上流、内部または下流で機能するエンハン
サー配列の注目すべき能力は、これらを古典的なプロモ
ーター成分と区別するものである・・・」と述べ、ある
種の実験結果が「エンハンサーはかなりの距離(おそらく
10kb以上)を越えて作用することができる」ことを示し
ている、と示唆している。 【0004】本発明は、真核生物性プロモーター(有用
な物質をコードしているDNA配列を転写させるため
に、BKエンハンサーと直列して用いる)の「CAAT」
領域のすぐ上流(該領域の5'側)にBKエンハンサーを
配置することによって、予想外の転写の増加が得られる
ことを教示するものである。このCAAT領域または
「すぐ上流の領域」または「−80相同配列」は、転写活性
のための配列が詳細に調べられているプロモーター中に
見い出されるヌクレオチドの保存領域である。このCA
AT配列は転写の効率に関係し、ごくわずかな例外を除
いて、これを削除するとプロモーターの強さが減少す
る。 【0005】エンハンサー成分は、多数のウイルス[B
Kおよびサルウイルス40(SV40)などのパポバウイ
ルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎
ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウ
イルス、ポリオーマウイルスを含む]および非ウイルス
性遺伝子(たとえば、マウスの免疫グロブリン遺伝子イ
ントロン中など)において確認されている。エンハンサ
ー成分は多種多様のその他の生物中にも存在している可
能性がある。宿主細胞は、エンハンサー成分が異なる
と、異なった反応を示すことが多い。この細胞特異性
は、宿主遺伝子産物が遺伝子の発現中にエンハンサー成
分と相互作用していることを示すものである。 【0006】また、エンハンサー成分は、宿主細胞中に
存在しているウイルス性遺伝子産物と相互作用すること
もある。ベルシッチおよびジッフ[Velcich and Ziff,
Cell,40:705(1983)]、ボレリ等[Borrelli e
t al.,Nature,312:608(1984)]およびヘン
等[Hen et al.,Science,230:1391(198
5)]は、SV40、ポリオーマウイルス、マウス免疫グ
ロブリン遺伝子およびアデノウイルス−2 E1Aのエ
ンハンサーが誘起する転写の活性化を、アデノウイルス
−2初期領域1A(E1A)遺伝子産物が抑制すると記載
している。従って、E1Aを含有する宿主細胞において
は、組換え遺伝子の転写を増加させるためにエンハンサ
ーを用いた真核生物性発現ベクターが、エンハンサーを
有さないベクターより有効に作動すると期待することは
できない。エンハンサー類を用いる先行技術の方法とは
著しく異なり、本発明のBKウイルスエンハンサー成分
を用いる方法は、E1A遺伝子産物または大きいDNA
ウイルスの同様の即時型遺伝子産物を用いて遺伝子発現
を最大にすることに関するものである。すなわち本発明
は、いずれかのアデノウイルスのE1A遺伝子産物の存
在下に、BKエンハンサーのDNA転写促進能力を向上
させることを教示するものである。 【0007】E1A遺伝子産物(正確に言うと、E1A
遺伝子は2種類の産物を産生するが、本明細書中ではこ
れらをひとまとめにして「E1A遺伝子産物」と称する)
は、アデノウイルス(大きいDNAウイルス)の即時型遺
伝子産物である。本発明は、E1A遺伝子産物と同様に
機能してBKエンハンサーの活性を増加させる、大きい
DNAウイルスのあらゆる即時型遺伝子産物の使用を包
含する。単純性疱疹ウイルスICP4タンパク質[デル
カ等(De Luca et al.,Mol.Cell.Biol.,5:199
7−2008(1985))が開示]、シュードラビエスウ
イルスIEタンパク質[フェルドマン等(Feldman et a
l.,P.N.A.S.,79:4952−4956(1982))
が開示]およびアデノウイルスのE1Bタンパク質は、
すべてE1Aタンパク質と同様の機能を有する、大きい
DNAウイルスの即時型遺伝子産物である。従って本発
明方法は、E1Aタンパク質の存在または非存在下にI
CP4、IE、またはE1Bタンパク質を用いて、BK
エンハンサーの活性を増加させることをも包含する。 【0008】アデノウイルスのE1A遺伝子産物のよう
な、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の存在下
にBKウイルスエンハンサーを用いると、真核宿主細胞
において組換え遺伝子の転写および発現が増加する。本
発明の別の重要な態様は、真核生物性プロモーター(た
とえば、アデノウイルス後期プロモーター)に直列して
BKエンハンサー配列を用い、真核宿主細胞において有
用な産物を発現させる種々の発現ベクターに関する。こ
れらの発現ベクターの多くは、BKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターカセットを含有し、このカ
セットは、本発明方法に用いる他のベクターに容易に移
し換えることができる。この発現ベクターの多様性は、
これらのベクターが誘導する種々のタンパク質(たとえ
ば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、タンパク質C、組織プラスミノーゲン活性化因子、
および修飾化組織プラスミノーゲン活性化因子など)の
高レベル発現によって示される。 【0009】本発明のさらに別の重要な態様は、近接す
る真核生物性プロモーターと関連しているBKエンハン
サーの活性を増加させる方法に関し、これをBKエンハ
ンサー−アデノウイルス−2後期プロモーターカセット
を用いて説明する。これらの誘導体を、アデノウイルス
−2後期プロモーターのCAAT領域の極めて近くにB
Kエンハンサーを配置する酵素的な処理によって構築し
た。これらの修飾化BKエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーター配列を発現ベクターに導入し、次いで
これらを用いて真核宿主細胞中で有用な遺伝子産物を発
現させたとき、このような位置決めを欠く構築物と比較
すると、劇的な発現レベルの増加が認められた。すなわ
ち本発明は、近接する真核生物性プロモーターと関連し
ているBKエンハンサーの活性を増加させるための方法
であって、真核生物性プロモーターのCAAT領域の
5'末端のすぐ上流、0−約300ヌクレオチド以内に
該エンハンサーを配置することからなる方法を提供する
ものである。 【0010】本明細書中で用いる語句を以下のように定
義する。 抗生物質:微生物が産生する物質であって、天然のまま
で、またはわずかに化学修飾することにより、他の微生
物または真核生物細胞を殺すか、またはその増殖を抑制
する物質。 抗生物質耐性付与遺伝子:抗生物質に対する耐性を付与
する活性をコードしているDNAセグメント。 ApR:アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与する
遺伝子。 クローニング:組換えDNAクローニングベクターにD
NAセグメントを導入する過程。 CmR:クロラムフェニコール耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。 ep:T−抗原遺伝子のSV40初期プロモーター、T−
抗原結合部位、およびSV40の複製起源を含有するD
NAセグメント。 真核生物性プロモーター:真核生物細胞中でプロモータ
ーとして機能するすべてのDNAセグメント。 HmR:ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。 IVS:介在配列とも呼ばれる、イントロンをコードし
ているDNA。 【0011】大きいDNAウイルス:真核生物細胞に感
染し、〜10kb以上の大きさのゲノムを有するウイル
ス、すなわちポックスウイルス類、アデノウイルス類、
およびヘルペスウイルス類のいずれか。 NeoR:ネオマイシン耐性付与遺伝子であり、これを用
いて真核宿主細胞にG418耐性を付与することもでき
る。 ori:プラスミドの複製起源。 pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA配
列。 プロモーター:DNAのRNAへの転写を誘導するDN
A配列。 組換えDNAクローニングベクター:自律的に複製する
かまたは組み込まれる媒介物であって、1またはそれ以
上の付加的なDNAセグメントを付加することができる
かまたは付加したDNA分子からなる媒介物。 組換えDNA発現ベクター:プロモーターおよびこれに
関連する挿入部位を含有する組換えDNAクローニング
ベクターであって、該部位に有用な産物をコードしてい
るDNA分子を挿入し、そして発現させることができる
ベクター。 【0012】組換えDNAベクター:組換えDNAクロ
ーニングまたは組換えDNA発現ベクター。 レプリコン:組換えDNAベクターの複製を制御してい
るDNA配列。 制限フラグメント:1またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成した直線状のDNA。 rRNA:リボソーム性リボ核酸。 感受性宿主細胞:ある抗生物質またはその他の毒性化合
物に対する耐性を付与するDNAセグメントなしでは、
それらが存在するところで増殖することができない宿主
細胞。 構造遺伝子:開始および停止コドンをコードしているD
NAを含む、ポリペプチドをコードしているDNA配
列。 TcR:テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。 形質転換体:形質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換:受容宿主細胞へのDNAの導入。 tRNA:転移リボ核酸。 【0013】図面の説明 図1は、BKウイルス(5.2kb)の制限部位および機能
地図であり、図2は、プラスミドpBKE1(7.9kb)の
制限部位および機能地図であり、図3は、プラスミドp
BKneo1(11.5kb)の制限部位および機能地図であ
り、図4は、プラスミドpSV2cat(5.015kb)の制
限部位および機能地図であり、図5は、プラスミドpL
Pcat(4.83kb)の制限部位および機能地図であり、図
6は、プラスミドpBLcat(6.09kb)の制限部位およ
び機能地図であり、図7は、プラスミドpBKcat(5.7
9kb)の制限部位および機能地図であり、図8は、プラ
スミドpSBLcat(5.88kb)の制限部位および機能地
図であり、 【0014】図9は、プラスミドpL133の構築なら
びにその制限部位および機能地図を表し、図10は、プ
ラスミドpLPC(6.5kb)の制限部位および機能地図で
あり、図11は、プラスミドpLPC4(11.7kb)の制
限部位および機能地図であり、図12は、プラスミドp
SV2hyg(5.24kb)の制限部位および機能地図であ
り、図13は、プラスミドpLPChyg1(8.3kb)の制
限部位および機能地図であり、図14、図15、図16
および図17は、プラスミドpBW32の構築ならびに
その制限部位および機能地図を表し、図18は、プラス
ミドpLPChd1(10.23kb)の制限部位および機能地
図であり、図19は、プラスミドphd(8.55kb)の制限
部位および機能地図であり、 【0015】図20は、プラスミドpLPCE1A(7.
6kb)の制限部位および機能地図であり、図21は、プ
ラスミドpBLT(6.44kb)の制限部位および機能地図
であり、図22は、プラスミドpBLThyg1(8.95k
b)の制限部位および機能地図であり、図23は、プラス
ミドpBLTdhfr1(8.34kb)の制限部位および機能地
図であり、図24は、プラスミドpTPA602(4.9k
b)の制限部位および機能地図であり、図25は、プラス
ミドpTPA603(6.3kb)k制限部位および機能地図
であり、図26は、プラスミドphdTPA(10.67kb)
の制限部位および機能地図であり、図27は、プラスミ
ドphdMTPA(10.67kb)の制限部位および機能地図
である。 【0016】本発明は、真核宿主細胞において機能的な
ポリペプチドを産生させるための方法であって、大きい
DNAウイルスまたはそのDNAで形質転換され、そし
て少なくとも a)真核生物性プロモーター、 b)該プロモーターを刺激するように配置したBKウイル
スエンハンサー、 c)該プロモーターから発現するように配置した、機能的
なポリペプチドをコードしているDNA配列、を含有す
る組換えDNAベクターで形質転換された真核生物細
胞、または上記a)、b)、c)および d)大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物をコードし
ているDNA配列、を含有する組換えDNAベクターで
形質転換された真核生物細胞を、c)およびd)の発現に適
した条件下で培養することからなる方法を提供するもの
である。 【0017】また、本発明は真核生物性プロモーターと
関連しているBKエンハンサーの活性を増加させるため
の方法であって、プロモーターがSV40初期プロモー
ターではないという限定のもと、真核生物性プロモータ
ーのCAAT領域の5'末端の上流側0−300ヌクレ
オチド以内に該エンハンサーを配置することからなる方
法を提供するものである。 【0018】さらに本発明は、本発明方法において使用
するに適した組換えDNAベクター、ならびに該組換え
DNAベクターで形質転換したヒト胎児腎細胞およびサ
ル腎細胞等の真核生物細胞を提供するものである。加え
て本発明は、BKエンハンサー−アデノウイルス後期プ
ロモーターを含有するDNA化合物をも提供するもので
ある。 【0019】当業者なら、本発明方法の両態様におけ
る、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の重要な
役割について理解することであろう。さらに、多数の確
立された細胞セルラインが大きいDNAウイルスの即時
型遺伝子産物を発現すること、およびそのようなセルラ
インが本発明方法において特に有用であることについて
も理解することであろう。本方法の1態様では、真核生
物性プロモーター、該プロモーターを刺激するように配
置したBKエンハンサー、および所望の機能的なポリペ
プチドをコードしているDNA配列(該プロモーターか
ら発現するようにこの配列を配置する)を含有する組換
えDNAベクターで、大きいDNAウイルスの即時型遺
伝子産物を発現する細胞を形質転換し、そして発現に適
した条件下で該ベクターを含有する細胞を培養する。ま
た、本発明方法の他の態様は、大きいDNAウイルスの
即時型遺伝子産物は発現しないが、即時型遺伝子産物を
コードしているDNA配列、ならびに上記のプロモータ
ー、エンハンサーおよび機能的なポリペプチドをコード
しているDNA配列を含有する組換えDNA発現ベクタ
ーで形質転換した細胞を培養することからなる。 【0020】本発明において重要なものは、BKエンハ
ンサー配列をアデノウイルス−2後期プロモーターと直
列して含有する1群の新規発現ベクターである。該ベク
ター中、発現のための正しい位置に、有用な産物をコー
ドしているDNA分子を容易に挿入するか、または挿入
できるように、本発明の発現ベクターを構築した。さら
に、比較的小さい制限フラグメントとして発現ベクター
から単離しうる「カセット」を形成するように、BKエン
ハンサー配列および真核生物性プロモーターを組み立て
た。このカセットは、種々の発現ベクター間を容易に往
復することができる。本明細書中に特定して例示した発
現ベクターは、本発明方法において転写を誘導するBK
エンハンサー−真核生物性プロモーターカセットに、ア
デノウイルス−2またはBK後期プロモーターを用いて
いる。 【0021】BKウイルス(ATCC VR−837)は
購入可能であるか、または実施例1の記載のようにして
容易かつ大量に単離することができるが、このウイルス
は、BKウイルス性DNAをプラスミドクローニングベ
クターにクローンし、この組換えベクターをBKウイル
ス性DNA配列の供給源として使用するのにも都合がよ
い。従って、BKウイルスDNAを制限酵素EcoRIで
消化して直線状のBKDNA(BKゲノム上にはEcoR
I部位が1つしか存在しないので)を得、同様にプラス
ミドpUC8[ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(B
RL)(BethesdaResearch Laboratories,P.O.Box
6009,Gaithersburg,MD 20877)から入手可
能]を制限酵素EcoRIで消化して直線化し、そしてこ
のEcoRI切断したプラスミドpUC8 DNAをEcoR
I切断したBKウイルスDNAにライゲートして、BK
ウイルスDNAの配向だけが異なるプラスミドpBKE
1およびpBKE2を得た。プラスミドpBKE1の制限
部位および機能地図を添付の図2に示す。プラスミドp
BKE1およびpBKE2の構築については、実施例2
に記載する。 【0022】また、BKウイルスゲノムをプラスミドpd
BPV−MMTneoの一部と結合させてプラスミドpBK
neo1およびpBKneo2を構築した。プラスミドpdBP
V−MMTneo(約15kbの大きさであり、ATCCから
取得番号ATCC 37224のもとで入手可能である)
は、プラスミドpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺
伝子およびレプリコン、ネオマイシン耐性付与酵素をコ
ードしている構造遺伝子を発現させるように配置したマ
ウス・メタロチオネイン・プロモーター、および約8kb
のウシ乳頭腫ウイルス(BPV)DNAを含有している。
プラスミドpdBPV−MMTneoを制限酵素BamHIで
消化して2種類のフラグメント、すなわちBPV DN
Aを含有する〜8kbフラグメントおよびそれ以外の上記
配列を含有する〜7kbフラグメントを得ることができ
る。BKウイルスはBamHI制限部位を1つだけ有して
おり、プラスミドpdBPV−MMTneoの〜7kb BamH
I制限フラグメントをBamHIで直線化したBKウイル
スDNAにライゲートすることによってプラスミドpB
Kneo1およびpBKneo2を構築した。BKウイルスD
NAの配向だけが異なっているこのプラスミドpBKneo
1およびpBKneo2の構築を実施例3に記載し、プラス
ミドpBKneo1の制限部位および機能地図を添付の図3
に示す。 【0023】プラスミドpBKE1、pBKE2、pBKn
eo1およびpBKneo2それぞれは、エンハンサー配列を
含むBKウイルスの完全なゲノムを含有しており、従っ
て本発明の発現ベクター用の有用な出発原料となる。説
明のためにそのような発現ベクターを1つ挙げると、プ
ラスミドpBLcatは、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ酵素(CAT)を発現させるように配置
した、ヒトアデノウイルス−タイプ−2・後期プロモー
ターと直列してBKエンハンサー配列を含有している。
プラスミドpSV2catはCAT遺伝子の都合のよい供給
源として有用であり、取得番号ATCC 37155の
もとでATCCから入手できる。プラスミドpSV2cat
の制限部位および機能地図を添付の図4に示す。ヒトア
デノウイルス−タイプ−2 DNAは市販品から入手す
ることができ、またATCCから取得番号ATCC V
R−2のもとで入手することもできる。 【0024】説明のために挙げたこのプラスミドpBLc
atは、ヒトアデノウイルス−タイプ−2・DNAの〜
0.32kb後期プロモーター含有AccI−PvuII制限
フラグメントを、AccI−PvuII制限フラグメントの
PvuII末端だけに結合する平滑末端化BclIリンカ
ーにライゲートすることによって構築した。次いで得ら
れたフラグメントをプラスミドpSV2catの〜4.51k
b AccI−StuI制限フラグメントにライゲートして中
間体プラスミドpLPcatを得た(このプラスミドの制限
部位および機能地図を添付の図5に示す)。所望のプラ
スミドpBLcatは、複製起源およびエンハンサーを含有
する、BKウイルスDNAの〜1.28kbAccI−Pvu
II制限フラグメントを、プラスミドpLPcatの〜4.
81kb AccI−StuI制限フラグメントにライゲート
することによって、プラスミドpLPcatから構築した。
得られたプラスミドpBLcatの制限部位および機能地図
を添付の図6に示す。プラスミドpBLcatの構築につい
ては実施例4にさらに詳しく記載する。 【0025】プラスミドpBKcatは本発明をさらに例示
する発現ベクターであり、BKエンハンサーおよびBK
後期プロモーターを用いてクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼを発現させるものである。プラス
ミドpBKcatを、プラスミドpLPcatについて記載した
と類似の方法で構築した。すなわち、プラスミドpSV
2catの〜4.51kb AccI−StuI制限フラグメント
をBKウイルスの〜1.28kb AccI−PvuII制限フ
ラグメントにライゲートして、BK後期プロモーターが
正しい配向となるようにし、CAT遺伝子を発現させる
ようにした。プラスミドpBKcatの制限部位および機能
地図を添付の図7に示す。 【0026】プラスミドpBLcatは、本発明のBKエン
ハンサー−アデノウイルス後期プロモーター「カセット」
の都合のよい供給源である。このカセットは〜870bp
のHindIII制限フラグメントであり、都合よく真核
生物性発現ベクターに挿入して該ベクターがコードして
いる産物の発現を増加させることができる。これは、プ
ラスミドpSV2catを制限酵素HindIIIで消化し、
BKエンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカ
セットを挿入することによって行なわれる。得られたプ
ラスミド(プラスミドpSBLcatと命名した)は、SV4
0複製起源、SV40初期プロモーターおよびSV40
エンハンサーを含有し、従ってこれらの配列が削除され
ているプラスミドpBLcatとは異なる。 【0027】プラスミドpSBLcatは、E1A遺伝子産
物が存在しなければ、プラスミドpBLcatより高レベル
でCATを発現させる。E1A遺伝子産物が存在しない
場合におけるこの発現の増加は、2種類のエンハンサー
(一方はSV40由来、他方はBK由来)が、隣接するプ
ロモーターからの転写において付加的な促進効果を有し
ていることを示すものである。しかし、E1A遺伝子産
物の存在下では、プラスミドpSBLcatよりプラスミド
pBLcatの方が高レベルでCATを発現させる(これは
おそらくSV40エンハンサーがE1A遺伝子産物によ
って抑制されるためであろう)。プラスミドpSBLcat
の制限部位および機能地図を添付の図8に示し、プラス
ミドpSBLcatの構築を実施例5に記載する。 【0028】また、BKエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーターカセットを用いて、ヒトタンパク質C
の発現を改良した。これは、カセットをプラスミドpL
133中にライゲートすることによって行った。プラス
ミドpL133の制限部位および機能地図を添付の図9
に示し、その構築を実施例6に記載する。プラスミドp
L133を制限酵素HindIIIで消化し、次いでプラ
スミドpBLcatの〜0.87kb HindIII制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドpLPCを得た。プ
ラスミドpLPCの制限部位および機能地図を添付の図
10に示し、プラスミドpLPCの構築を実施例7に記
載する。 【0029】プラスミドpL133と同様、プラスミドp
LPCはSV40の複製起源、T−抗原結合部位、初期
および後期プロモーター、およびエンハンサーを含有す
る。これらの成分はともにSV40 DNA上に近接し
て位置しており、これを正確に表すことは困難である。
T−抗原のT−抗原結合部位への結合(SV40の複製
に必要である)が、SV40後期プロモーターからの転
写を促進することが知られているが、驚くべきことにB
K後期プロモーターに対しても同様の効果を有してい
る。SV40複製起源を含有するプラスミドの高レベル
T−抗原誘導複製は通常宿主細胞にとって致死的である
ので、SV40 T−抗原の存在下ではプラスミドpLP
CおよびプラスミドpL133のどちらもエピソーム(染
色体外)成分として安定に保持されず、むしろこの2種
類のプラスミドを宿主細胞の染色体DNA中に組み込ん
で安定に保持されるようにしなければならない。 【0030】BKエンハンサー領域の全体の構造はSV
40のそれと極めて類似しており、BKエンハンサー、
複製起源、初期および後期プロモーター、およびT−抗
原結合部位のBK同等物はすべて近接して位置してお
り、BKウイルスDNA上において、正確に表すことは
困難である。しかし、BK T−抗原の存在下で増殖さ
せたとき、BK複製起源およびT−抗原結合部位を含有
するプラスミドは致死となるまでは複製せず、エピソー
ム成分として宿主細胞中に安定に保持される。多分、B
KおよびSV40 T−抗原とそれらの抗原のそれぞれ
の結合部位との間の、類似した構造−機能の関係によ
り、BKの複製はSV40 T−抗原によっても刺激さ
れる。形質転換した真核生物細胞中で、安定に保持され
る成分として存在しうるプラスミドpLPCの誘導体を
構築するため、完全なBKゲノム(EcoRIで直線化し
た制限フラグメントとして)を、プラスミドpLPCの唯
一のEcoRI制限部位に挿入した。この挿入により2種
類のプラスミドが得られた。これらは、BK EcoRI
フラグメントの配向においてのみ異なっており、それぞ
れpLPC4およびpLPC5と命名した。プラスミドp
LPC4の制限部位および機能地図を添付の図11に示
し、プラスミドpLPC4およびpLPC5の構築を実施
例8に記載する。 【0031】組換えDNA発現ベクターのエピソーム保
持は、宿主細胞染色体への組み込みの際に、常に好まし
いというわけではない。しかし、真核生物細胞中で機能
する選択マーカーが存在しないため、プラスミドpLP
Cを別の選択マーカー含有プラスミドと共形質転換しな
ければ、プラスミドpLPCの安定な真核生物性形質転
換体を同定するのは困難である。従って、プラスミドp
LPCを修飾して、真核宿主細胞中で選択しうるプラス
ミド誘導体を作成した。 【0032】プラスミドpSV2hyg、すなわちハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドの一部に
プラスミドpLPCをライゲートすることによってこれ
を行った。プラスミドpSV2hyg[このプラスミドは、
ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー(N
RRL)(Northern Regional Research Laboratory,
Peoria,IL 61640)から取得番号NRRL B−
18039のもとで入手することができる]の制限部位
および機能地図を添付の図12に示す。プラスミドpS
V2hygを制限酵素BamHIで消化し、完全なハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子を含有する〜2.5kb BamHI
制限フラグメントを単離し、クレノウ酵素[E.コリ(E.
coli)DNAポリメラーゼIのスブチリシン切断によっ
て得られる大きいフラグメント]で処理し、次いでクレ
ノウ処理した、プラスミドpLPCの〜5.82kb Nde
I−StuI制限フラグメントにライゲートしてプラスミ
ドpLPChyg1およびpLPChyg2を得た。プラスミド
pLPChyg1およびpLPChyg2はハイグロマイシン耐
性付与フラグメントの配向だけが異なっている。プラス
ミドpLPChyg1の制限部位および機能地図を添付の図
13に示し、プラスミドpLPChyg1およびpLPChyg
2構築のプロトコールを実施例9に記載する。 【0033】ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含有
する、クレノウ処理した、プラスミドpBW32の〜1.
9kb BamHI制限フラグメントを、プラスミドpLPC
の〜5.82kb NdeI−StuI制限フラグメントに挿入
することによって、dhfr遺伝子を含有する上記と同様の
ヒトタンパク質C発現プラスミドを構築した。得られた
プラスミド、すなわちpLPCdhfr1およびpLPCdhfr
2はdhfr遺伝子の配向だけが異なっており、これらのプ
ラスミドの構築を実施例11Bに記載する。 【0034】プラスミドpLPChyg1をさらに修飾して
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を導入した。dhfr遺
伝子はdhfr−陰性の細胞における選択マーカーであり、
これを用い、宿主細胞をメトトレキセイトにさらす(濃
度を順次増加する)ことによって、DNAセグメントの
コピー数を増加させることができる。このdhfr遺伝子は
プラスミドpBW32から得ることができる。プラスミ
ドpBW32の制限部位および機能地図を添付の図1
4、図15、図16および図17に示し、プラスミドp
BW32構築のプロトコールを実施例10に記載する。 【0035】dhfr遺伝子を含有する、プラスミドpBW
32の〜1.9kb BamHI制限フラグメントを単離し、
クレノウ酵素で処理し、部分的にEcoRI消化したプラ
スミドpLPChyg1に挿入してプラスミドpLPChd1
およびpLPChd2を得た。プラスミドpLPChyg1は
2つのEcoRI制限酵素認識部位を含有し、1つはハイ
グロマイシン耐性付与遺伝子中に、もう1つはプラスミ
ドpBR322由来の配列中に存在している。dhfr遺伝
子を含有するフラグメントを、プラスミドpLPChyg1
のpBR322由来配列中に位置するEcoRI部位に挿
入してプラスミドpLPChd1およびpLPChd2を得
た。プラスミドpLPChd1の制限部位および機能地図
を添付の図18に示し、dhfr遺伝子を含有するDNAセ
グメントの配向だけが異なっているプラスミドpLPCh
d1およびpLPChd2の構築を実施例11に記載する。 【0036】プラスミドpLPChd1を修飾してプラス
ミドphd、すなわち本発明に係るBKエンハンサー−ア
デノウイルス後期プロモーターカセットならびにハイグ
ロマイシン耐性付与およびdhfr遺伝子の両者を含有する
プラスミドを得た。プラスミドphdを構築するため、プ
ラスミドpLPChd1をdamE.コリ宿主細胞から調製
し、制限酵素BclIで消化し、そして再び環化してヒト
タンパク質CをコードしているDNAを削除した。プラ
スミドphdはBclI制限酵素認識部位を1つだけ含有し
ており、この部位は、本発明のBKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターから発現させようとするす
べての配列を挿入するのに都合よく配置されている。プ
ラスミドphdの制限部位および機能地図を添付の図19
に示し、プラスミドphd構築のプロトコールを実施例1
2に記載する。 【0037】本発明をさらに例示する別の発現ベクター
であって、ヒトタンパク質Cを発現させるベクターはプ
ラスミドpLPCE1Aである。プラスミドpLPCE1
Aはヒトアデノウイルス タイプ2のE1A遺伝子を含
有し、この遺伝子の産物は、上述のように、BKエンハ
ンサーの活性を増加させる。すなわち、BKエンハンサ
ーに直列するプロモーターからの転写は、E1A遺伝子
産物の存在下に増加する。E1A遺伝子を含有する、ヒ
トアデノウイルス−タイプ−2 DNAの〜1.8kb Ba
lI制限フラグメントを、プラスミドpLPCの〜5.8
2kb NdeI−StuI制限フラグメントとライゲートす
ることにより、プラスミドpLPCE1Aを構築した。
プラスミドpLPCE1Aの制限部位および機能地図を
添付の図20に示し、プラスミドpLPCE1A構築の
プロトコールを実施例13に記載する。 【0038】本発明の発現ベクターのうちの多数は、組
織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)または修飾化T
PA(MTPA)を発現させるために、BKエンハンサー
−アデノウイルス後期プロモーターカセットを利用して
いる。このようなベクターを構築するため、プラスミド
pBW32(図14、図15、図16および図17)を制
限酵素BamHIで消化し、得られた〜5.6kbフラグメ
ントを再環化してプラスミドpBW32delを得た。修飾
化TPAをコードし、HindIII制限部位を1つだけ
含有するこのプラスミドpBW32delをHindIIIで
消化し、次いでプラスミドpBal8catの〜0.65kb H
indIII制限フラグメントとライゲートしてプラスミ
ドpBLTを得た。プラスミドpBal8catについては実
施例17に記載するが、このプラスミドは改良型BKエ
ンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセット
を含有している。プラスミドpBLTの制限部位および
機能地図を添付の図21に示し、プラスミドpBLT構
築のプロトコールを実施例14に記載する。 【0039】BamHI消化したプラスミドpBLTに選
択マーカーを導入した。ある構築においては、ハイグロ
マイシン耐性遺伝子を含有する、プラスミドpSV2hyg
の〜2.5kb BamHI制限フラグメントを挿入してプラ
スミドpBLThyg1およびpBLThyg2を得、別の構築
においては、dhfr遺伝子を含有する、プラスミドpBW
32の〜1.9kb BamHI制限フラグメントを挿入し
てプラスミドpBLTdhfr1およびpBLTdhfr2を得
た。これら4種のプラスミド、pBLThyg1、pBLTh
yg2、pBLTdhfr1、およびpBLTdhfr2は、選択マ
ーカーの種類および/または配向だけが異なっている。
プラスミドpBLThyg1およびpBLTdhfr1それぞれ
の制限部位および機能地図を添付の図22および図23
に示し、プラスミドpBLThyg1、pBLThyg2、pB
LTdhfr1、およびpBLTdhfr2構築のプロトコール
を実施例15に記載する。 【0040】TPAまたは修飾化TPAを発現させる本
発明の他の発現ベクターは、プラスミドpBW32の構
築に用いる中間体であるプラスミドpTPA103から
得られる。プラスミドpTPA103構築のプロトコー
ルを実施例10に記載し、プラスミドpTPA103の
制限部位および機能地図を添付の図14、図15、図1
6および図17に示す。これらの誘導体を構築するた
め、プラスミドpTPA103のTPAコード化領域の
5'末端の直前にBamHI制限部位を導入した。プラス
ミドpTPA103を制限酵素HgaIで消化して、TP
Aコード化領域の5'末端を含有する〜0.52kb Hga
I制限フラグメントを単離した。クレノウ処理した後、
このHgaIフラグメントをBamHIリンカーにライゲー
トし、制限酵素BamHIで消化し、そしてBamHI消化
したプラスミドpBR322に挿入してプラスミドpTP
A601およびpTPA602を得た。プラスミドpTP
A602(このプラスミドは、挿入したBamHI制限フ
ラグメントの配向だけがプラスミドpTPA601と異
なる)の制限部位および機能地図を添付の図24に示
す。 【0041】次いで、プラスミドpTPA602を制限
酵素BglIIおよびSalIで消化し、得られた〜4.2k
b BglII−SalI制限フラグメントをプラスミドpT
PA103の〜2.05kb SalI−BglII制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドpTPA603を得
た。従って、プラスミドpTPA603は、両末端がBa
mHI制限部位で区切られているTPAの完全なコード
化配列を含有している。プラスミドpTPA603の制
限部位および機能地図を添付の図25に示す。プラスミ
ドpTPA603に類似しているが、しかし改良型TP
Aをコードしているプラスミドを構築するため、プラス
ミドpTPA603を制限酵素BglIIおよびSstIで
消化し、得られた〜5.02kb BglII−SstIフラグ
メントをプラスミドpBLTの〜0.69kb BglII−
SstI制限フラグメントにライゲートした。次いで、得
られたプラスミド(pMTPA603と命名した)を制限
酵素BamHIで消化し、得られた〜1.35kbフラグメ
ントを単離した。このフラグメントおよびプラスミドp
TPA603の〜1.90kb BamHI制限フラグメント
を、別々にBclI消化したプラスミドphd(図19)にラ
イゲートして、それぞれプラスミドphdMTPAおよびp
hdTPAを得た。プラスミドphdTPAおよびphdMTP
Aの制限部位および機能地図をそれぞれ添付の図26お
よび図27に示す。プラスミドphdTPAおよびphdMT
PAの構築(プラスミドpTPA602構築のプロトコー
ルから始める)を実施例16に記載する。 【0042】本発明は、真核生物性プロモーターと直列
してBKエンハンサーを用いて、大きいDNAウイルス
の即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞において、DN
A配列を転写および発現させるための方法を包含する。
本方法において、実質的にすべての真核生物性プロモー
ターをBKエンハンサーと直列して用いることができる
ということについては当業者の理解するところであろ
う。たとえば、SV40初期および後期プロモーター、
BK初期および後期プロモーター、すべてのポリオーマ
ウイルス群またはパポバウイルス群の初期および後期プ
ロモーター、単純性疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロ
モーター、インターフェロンα1プロモーター、マウス
メタロチオネインプロモーター、レトロウイルス群のプ
ロモーター、β−グロビンプロモーター、アデノウイル
ス群のプロモーター、ウニH2Aプロモーター、コンア
ルブミンプロモーター、卵アルブミンプロモーター、マ
ウスβ−グロビンプロモーター、ヒトβグロビンプロモ
ーター、およびラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返し
(LTR)プロモーターは、本発明方法において、すべて
真核生物性プロモーターとして役立ちうる。さらに、上
流の「CAAT」配列を有するか、または有しない「TA
TA」様の配列からなる転写開始部位を含有するすべて
の配列が、本発明におけるプロモーターとして役立ちう
る。このようなプロモーターをBKエンハンサー含有の
発現ベクター中に都合よく挿入することによって、該プ
ロモーターを本方法に用いることができる(本方法に用
いるに好ましい真核生物性プロモーターであるアデノウ
イルス−2後期プロモーターを用いて本明細書中に例示
したようにして)。 【0043】本発明を例示するものである本明細書中の
ベクターに用いられるBKエンハンサーは、BKウイル
スの原型菌株から単離されたものである。しかし、多数
のBKウイルス変異株が単離され、開示されている。ガ
ードナー等[Gardner et al.,The Lancet,1:125
3(1971);Gardner,Brit.Med.J.,1:77−78
(1973)をも参照]は最初のBKウイルスの単離につ
いて記載しており、従ってこのガードナー株は原型また
は野生型BKウイルスと称されている。BKウイルスの
ガードナー株(図1)は、ATCCから取得番号ATCC
VR−837のもとで入手可能である。大きいDNA
ウイルスの即時型遺伝子産物の存在下に、BKエンハン
サーを真核生物性プロモーターと直列して用いて有用な
物質(たとえば、核酸およびタンパク質)を発現させる方
法、およびそれ以外のすべての本発明方法は、原型株の
エンハンサーが好ましいものではあるが、いずれもガー
ドナー株または特定のBK変異株に限定されるものでは
ない。本発明方法に用いることができる多数の代表的な
BK変異株を以下の第1表に挙げる。 【0044】 【表1】【表2】 【0045】宿主細胞が大きいDNAウイルスの即時型
遺伝子産物を発現するものである限り、本方法において
種々の真核宿主細胞を用いることができるということに
ついては当業者の理解するところであろう。多数の方法
(たとえば、プラスミドまたは他のベクターを用いる形
質転換)によって即時型遺伝子産物を宿主細胞に導入す
ることができるので、実質的にすべての真核細胞を本方
法に用いることができる。ヒト細胞はBKウイルスの天
然の宿主であり、かつBKエンハンサーの刺激に役立つ
細胞因子を含有していると考えられるので、本発明方法
における好ましい宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞
としてはヒト腎細胞が特に好ましいが、E1A遺伝子産
物を発現するアデノウイルス 5−形質転換したヒト胎
児腎細胞セルライン293が最も好ましく、このセルラ
インはATCCから取得番号ATCC CRL 1575
3のもとで入手可能である。 【0046】293細胞がE1A遺伝子産物を発現する
という理由だけではなく、293細胞がタンパク質Cの
ような複雑な遺伝子産物をγ−カルボキシル化すること
ができ、かつそれ以外に該産物を正確にプロセッシング
することができるという理由から293セルラインが好
ましい。腎細胞は通常ある種のタンパク質をγ−カルボ
キシル化し、かつそれ以外にそれをプロセッシングする
が、293細胞をアデノウイルスで形質転換すると、通
常特殊な機能が失われてしまう。従って本発明は、天然
にγカルボキシル化され、正しく折りたたまれ、そして
プロセッシングされたタンパク質を産生させるための方
法(該タンパク質を組換えDNAベクター中にコード化
して、該ベクターを含有する真核宿主細胞を適当な発現
条件下で培養したときに該タンパク質が発現されるよう
にする方法)の改良法であって、改良点が、(a)アデノウ
イルスで形質転換したヒト胎児腎細胞に該ベクターを挿
入すること、および(b)カルボキシル化のための十分量
のビタミンKを含有する培地中、増殖条件下で工程(a)
の宿主細胞を培養すること、からなる方法をも包含する
ものである。 【0047】真核生物性プロモーターと関連しているB
Kエンハンサーの活性を改良するための方法を用いて、
実施例17に記載した新規BKエンハンサー−真核生物
性プロモーター構築物を構築した。この方法は、BKエ
ンハンサーと直列して用いる真核生物性プロモーターの
CAAT流域の5'末端の上流側0−300ヌクレオチ
ド以内にBKエンハンサーを配置することからなる。こ
の方法によって調製した改良型カセットは本発明の重要
な態様を構成する。改良型カセットの好ましい使用法
は、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物による改
良型カセットの刺激を包含するものであるが、E1Aま
たは類似の遺伝子産物を発現する宿主細胞に限定はされ
ない。 【0048】アデノウイルスのVA遺伝子産物などの他
のウイルス性遺伝子産物を用いて、本方法(BKエンハ
ンサーを用いて真核宿主細胞における組換え遺伝子の転
写および発現を促進させる)の全体の効率を増加させる
ことができる。このVA遺伝子産物は、アデノウイルス
の3分節リーダーを含有するmRNA分子の翻訳効率を
増加させる[カウフマン(Kaufman,PNAS,82:68
9−693(1985));スベンソンおよびアクジャルル
(Svensson and Akusjarul.EMBO.4:957−96
4(1985))]。本発明のベクターを修飾してアデノウ
イルスの完全な3分節リーダーをコードさせることもで
きるが、実施例18に示すように、本発明はVA遺伝子
産物を用いて、アデノウイルスの3分節リーダーの最初
の部分だけを含有するmRNAの翻訳を増加させること
を含むものである。 【0049】アデノウイルスの3分節リーダーは以下の
配列で示される: 【化11】 [配列中、Aはリボアデニル、Gはリボグアニル、Cは
リボシチジル、およびUはウリジルである]。 本明細書中において、アデノウイルスの3分節リーダー
の「最初の部分」とは、少なくとも以下の配列を含有する
ものである: 【化12】 【0050】すなわち本発明は、有用な物質をコードし
ているDNA配列および真核生物性プロモーターの両者
を含有している組換えDNAベクターで形質転換した真
核宿主細胞において、該有用な物質を産生させるための
方法(該プロモーターから発現するように該配列を配置
し、該有用な物質の発現に適した条件下で該ベクターを
含有する該細胞を培養する)の改良法であって、mRNA
がアデノウイルスの完全な3分節リーダーを含有しない
という限定のもと、改良点が、(a)アデノウイルスの3
分節リーダーの最初の部分をコードしているDNAを該
ベクター中に導入して、転写に際して、生成したmRN
Aが該有用な産物をコードし、そしてその5'末端にお
いて該3分節リーダーの最初の部分を含有しているよう
にすること、(b)工程a)のベクターを含有している該細
胞に、該アデノウイルスのVA遺伝子産物の発現をコー
ドしているDNA配列を付与すること、および(c)該V
A遺伝子産物の発現および該mRNAの翻訳の刺激に適
した条件下で工程b)の細胞を培養すること、からなる方
法を含有するものである。 【0051】VAをコードしているプラスミドは、アデ
ノウイルスDNAから構築した。アデノウイルス−2
DNAから、ヌクレオチド9833のSalI部位および
ヌクレオチド11556のHindIII部位を境界とす
る〜1723bpの制限フラグメントを単離し、HindI
II−SalI消化したプラスミドpBR322中にクロ
ーンし、こうしてpBR322の〜622bp SalI−H
indIIIフラグメントを置換してプラスミドpVAを構
築した。プラスミドpVAから〜1826bp NruIフラ
グメントを単離し、このフラグメントをクレノウ処理し
たBamHI消化プラスミドpSVNeo(BRLから入手可
能)中に挿入することによって、ネオマイシン耐性およ
びVAをコードしているプラスミドを構築した。得られ
たプラスミド(pVA−Neoと命名した)を用い、形質転
換後のネオマイシン(G418)耐性選択によって、すべ
てのセルラインにVA遺伝子を挿入することができる。 【0052】SV40、BKウイルス、またはその他の
すべてのポリオーマウイルスのT−抗原を本発明のベク
ターとともに用いて、複製を刺激することによりプラス
ミドのコピー数を増加させ、そして/またはプロモータ
ー活性を増加させることができる。SV40 T−抗原
はアデノウイルスおよびBK後期プロモーターの両者か
らの転写を刺激する。本発明の発現ベクターにT−抗原
コード化配列を含有させること、またはこのベクターを
T−抗原コード化配列を有するプラスミドと同時トラン
スフェクションすることにより、実施例19に概説した
ように選択圧の応用に先だって、コピー数の増幅を得る
ことができる。これは、発現ベクターの高コピー数組み
込みを可能にする。 【0053】従って、本発明の好ましい態様において
は、組換えDNA発現ベクターは、アデノウイルス後期
プロモーター(それ自身は、少なくとも3分節リーダー
の最初の部分および有用な物質をコードしている遺伝子
を発現させるように配置されている)の上流側300ヌ
クレオチド以内に配置した原型菌株のBKエンハンサー
を含有する。この好ましいベクターを用い、修飾を加え
て(発現ベクターで形質転換する前または後に)アデノウ
イルスのVA遺伝子産物を発現させるようにしたヒト胎
児腎293細胞を形質転換する。 【0054】以下に実施例を挙げて、本発明の方法、化
合物および組換え微生物をさらに詳しく説明するが、実
施例中に記載した特定の試薬、装置および方法は単に説
明のために挙げたものであって、本発明を限定するもの
ではない。 【0055】実施例1 BKウイルスDNAの調製 BKウイルスを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(ATCC)から取得番号ATCC VR−8
37のもとで入手する。このウイルスは凍結乾燥品とし
て得られ、これをハンク(Hank)のバランス塩[ギブコ
(Gibco,3175Staley Road,Grand Island,NY
14072)]に再懸濁して約105プラーク生成単位(pf
u)/mlの力価にする。BKウイルスDNA調製用に選択
した宿主は1次(プライマリー)ヒト胎児腎(PHEK)細
胞であり、この細胞はフロウ・ラボラトリーズ社(Flow
Laboratories,Inc.,7655 Old Springhouse R
oad,McLean,VA 22101)からカタログ番号0−
100のもとで、またはM.A.バイオプロダクツ(M.
A.Bioproducts)からカタログ番号70−151のもと
で入手することができる。 【0056】全面単層の約106PHEK細胞を含有す
る75mm2ポリスチレンフラスコ約5個を用いてウイル
スを調製する。力価105pfu/mlのBKウイルス約1ml
を各フラスコに加え、これを37℃で1時間インキュベ
ートし、次いで新鮮な培養培地[10%ウシ胎児血清を
追加したデルベッコの改良イーグル培地(Delbecco's
Modified Eagle's Medium,Gibco)]を加え、感染細
胞を37℃で10−14日間またはウイルスの完全な細
胞病原性効果が認められるまでインキュベートする。こ
の細胞病原性効果はセルラインの種類およびウイルスの
種類によって変わるが、通常、丸くなり、凝集し、そし
て培養盤から剥がれる細胞からなる。 【0057】凍結−解凍を3回繰り返すことによってこ
の細胞からウイルスを放出させ、5000Xgで遠心し
て細胞破片を除去する。PEG−6000(100g)を
加え、この溶液を4℃で24時間インキュベートし、そ
して5000Xgで20分間遠心することによって、上
清液1l中のウイルスを沈澱させ、集める。このペレッ
トを、最初の容積の1/100となるように0.1X S
SC緩衝液[1X SSC=0.15M NaClおよび0.
015Mクエン酸Na(pH=7)]に溶解する。このウイ
ルス懸濁液を、試験管中の飽和KBr溶液15mlに層状
に加え、これを75,000Xgで3時間遠心する。遠心
後、このKBr溶液中に2つのバンドが現れる。完全な
ビリオンを含有する低い方のバンドを集め、TE[10m
Mトリス−HCl(pH=7.8)および1mM EDTA]を
溶離緩衝液として用いてセファデックス(Sephadex)G
−50カラムで脱塩する。 【0058】このカラムから得た精製ビリオン溶液に、
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1%濃度となるよう
に加え、プロナーゼを100μg/ml濃度となるように
加え、そしてこの溶液を37℃で2時間インキュベート
する。次いで、この溶液に塩化セシウムを1.56g/ml
濃度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度10
0μg/mlとなるように加える。この溶液を、ソーバル
(Sorval)865ローターまたは同様の垂直ローター
中、260,000Xgで24時間遠心する。遠心後、ウ
イルスDNAのバンドを単離し、100mMトリス−H
Cl(pH=7.8)で飽和したイソアミルアルコールで5
回抽出する。次いでこのBKウイルスDNAの溶液を、
DNAの260nm/280nm吸収比が1.75と1.90
の間に入るまで、TE緩衝液に対して透析する。NaCl
濃度を0.15Mに調整し、2倍量のエタノールを加
え、この溶液を−70℃で少なくとも2時間インキュベ
ートし、そして12,000Xgで10分間遠心すること
によってDNAを沈澱させる。得られたBKウイルスD
NAのペレットを、1mg/mlの濃度でTE緩衝液に懸濁
させる。 【0059】実施例2 プラスミドpBKE1およびpB
KE2の構築 TE緩衝液1μl中のBKウイルスDNA(実施例1で調
製した)約1μgを、10×EcoRI緩衝液[1.0Mトリ
ス−HCl(pH=7.5)、0.5M NaCl、50mM M
gCl2および1mg/ml BSA]2μlおよび水15μlに
溶解した。このDNA溶液に、制限酵素EcoRI約2μ
l[〜10単位:酵素の実際の供給源は異なることもある
が、本明細書中で用いるすべての酵素単位は、他に記載
がなければ、ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ne
w England Biolabs,32 Tozer Road,Beverly,M
A 01915−9990)定義の単位を意味する]を加
え、得られた反応溶液を37℃で2時間インキュベート
した。 【0060】実質的に、EcoRI消化したBKウイルス
DNAを調製するための方法に従って、TE緩衝液1μ
l中のプラスミドpUC8[ファーマシア P−L バイオ
ケミカルズ(Pharmacia P−L Biochemicals,800
Centennial Ave.,Piscataway,N.J.08854)か
ら入手可能]約1μgをEcoRIで消化した。このEcoR
I消化したプラスミドpUC8 DNAをTE緩衝液で1
00μlに希釈し、この溶液にウシ腸アルカリホスファ
ターゼ〜0.06単位を加え、得られた反応溶液を37
℃で30分間インキュベートした。1×SET[5mMト
リス−HCl(pH=7.8)、5mM EDTAおよび15
0mM NaCl]、0.3M NaOAc、および0.5%SD
Sを含有するようにこの溶液を調整し、次いで65℃で
45分間インキュベートした。このホスファターゼ処理
はpUC8 DNAが自己ライゲートするのを防止する。 【0061】このEcoRI消化したBKウイルスおよび
プラスミドpUC8 DNAを、始め緩衝フェノールで、
次いでクロロホルムで抽出した。各DNA溶液のNaCl
濃度を0.25Mに調整し、2倍量のエタノールを加
え、得られた混合物をドライアイス−エタノール浴で5
分間インキュベートし、そして遠心してDNAをペレッ
ト化することによってDNAを集めた。上清を除去し、
DNAペレットを70%エタノールですすぎ、乾燥し、
そしてBKおよびプラスミドpUC8試料用のTE緩衝
液それぞれ10μlおよび30μlに再懸濁した。 【0062】水約3μlおよび10×リガーゼ緩衝液
[0.5Mトリス−HCl(pH=7.8)、100mM MgC
l2、200mM DTT、10mM ATP、および0.5m
g/mlBSA]1μlを、EcoRI消化したBKウイルス
2μlおよびEcoRI消化したプラスミドpUC8 DN
A1μlの混合物に加えた。このDNA溶液にT4 DN
Aリガーゼ1μl(〜1000単位)を加え、得られた反
応液を16℃で一晩インキュベートした。このライゲー
ト化DNAは所望のプラスミドpBKE1およびpBKE
2からなり、これらは挿入したBKウイルスDNAの配
向だけが異なっている。プラスミドpBKE1の制限部
位および機能地図を添付の図2に示す。 【0063】L−ブロス中のE.コリ(E.coli)K12
JM103(ファーマシア P−L バイオケミカルズか
ら入手可能)培養物50mlを、650ナノメーターにお
ける光学密度(O.D.650)が約0.4吸収単位になるまで
増殖させた。この培養物を氷上で10分間冷却し、遠心
して細胞を集めた。この細胞ペレットを100mMの冷
MgCl225mlに再懸濁し、氷上で25分間インキュベ
ートした。この細胞を遠心してもう一度ペレット化し、
ペレットを100mMの冷CaCl22.5mlに再懸濁し、
氷上で30分間インキュベートした。インキュベート
後、この細胞は形質転換するDNAの取り込みに対して
コンピテントである。 【0064】この細胞懸濁液200μlを、上記のよう
にして調製したライゲート化DNAと混合し、氷上で3
0分間インキュベートした。この時間が経過した後、細
胞を42℃の水浴に2分間入れ、次いで氷上に戻してさ
らに10分間インキュベートした。遠心して細胞を集
め、L−ブロス1mlに再懸濁し、37℃で1時間インキ
ュベートした。 【0065】この細胞混合物の一部を、100μgアン
ピシリン/ml、40μg X−gal/mlおよび40μgIP
TG/ml含有のL−寒天(1lあたり寒天15g含有する
L−ブロス)プレート上にプレートした。このプレート
を37℃で一晩インキュベートした。挿入体を含まない
プラスミドを含有するコロニー(E.コリK12 JM1
03/pUC8など)はプレート上で青色を呈し、挿入体
を含むプラスミドを含有するコロニー(E.コリK12
JM103/pBKE1)は白色を呈する。白色コロニー
数個を選び、それらのプラスミドDNAの制限酵素分析
によって、BKウイルスの〜5.2kb EcoRI制限フラ
グメントの存在についてスクリーニングした。実質的
に、後記実施例記載のプラスミドDNAの単離方法に従
って(制限酵素分析のためだけにプラスミドDNAを単
離するときには、CsCl勾配の工程を省略し、比較的小
さいスケールで行う)、E.コリK12 JM103/pB
KE1およびE.コリK12 JM103/pBKE2細
胞からプラスミドDNAを得た。 【0066】実施例3 プラスミドpBKneo1およびp
BKneo2の構築 E.コリK12 HB101/pdBPV−MMTneo細胞
を、ATCCから取得番号ATCC 37224のも
と、凍結乾燥品として入手する。この凍結乾燥細胞を、
100μg/mlのアンピシリンを含有するL−寒天プレ
ート上にプレートし、37℃でインキュベートして単一
のコロニー単離体を得る。 【0067】50μg/mlのアンピシリンを含有するL
−ブロス(1lあたりトリプトン10g、NaCl 10g、
および酵母抽出物5g)1lにE.コリK12 HB101
/pdBPV−MMTneoのコロニーを接種し、空気振盪
器中、37℃で、O.D.590が〜1吸収単位になるまで
インキュベートし、この時点でクロラムフェニコール1
50mgを培養物に加えた。インキュベートを約16時間
継続した。クロラムフェニコールの添加によりタンパク
質の合成が阻害され、従って細胞***が阻害されるが、
プラスミドの複製は継続して起こり得る。 【0068】この培養物を、ソーバル(Sorvall)GSA
ローター(DuPont Co.,Instrument Products,Biom
edical Division,Newtown,CN 06470)中、60
00rpm、4℃で5分間遠心した。得られた上清を除去
し、細胞ペレットをTES緩衝液[10mMトリス−HC
l(pH=7.5)、10mM NaCl、および1mM EDT
A]40mlで洗浄し、次いで再ペレット化した。上清を
除去し、細胞ペレットをドライアイス−エタノール浴で
凍結させ、次いで解凍した。解凍した細胞ペレットを、
25%ショ糖および50mM EDTAの溶液10mlに再
懸濁した。この溶液に5mg/mlリソチーム溶液約1ml、
0.25MのEDTA(pH=8.0)3ml、および10mg
/mlのRNアーゼA 100μlを加え、次いで氷上で1
5分間インキュベートした。このリソチーム処理した細
胞に、溶解溶液[10%トリトン−X100(3ml)、0.
25M EDTA(pH=8.0)75ml、1Mトリス−H
Cl(pH=8.0)15ml、および水7mlを混合して調製
する]3mlを加え、混合し、得られた溶液を氷上でさら
に15分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴で凍結させ、ついで解凍した。 【0069】SW27ローター(Beckman,7360N.
Lincoln Ave.,Lincolnwood,IL60646)中、2
5,000rpmで40分間遠心し、緩衝フェノールで抽出
することによって、溶液から細胞の残骸を除去した。こ
の細胞抽出物に、CsCl約30.44gおよび5mg/ml臭
化エチジウム溶液〜1mlを加え、次いでこの溶液の容量
をTES緩衝液で40mlに調整した。この溶液をVTi
50超遠心管(Beckman)中にデカンテーションし、次い
で封をし、VTi50ローター中、42,000rpmで〜
16時間遠心した。紫外線で目に見えるようにしたプラ
スミドのバンドを単離し、Ti75遠心管およびロータ
ー(Beckman)に入れ、50,000rpmで16時間遠心し
た。必要な容量調整はすべて0.761g/mlのCsClを
含有するTESを用いて行った。このプラスミドバンド
をもう一度単離し、塩で飽和させたイソプロパノールで
抽出して臭化エチジウムを除去し、そしてTES緩衝液
で1:3に希釈した。次いでこの溶液に2倍量のエタノ
ールを加え、−20℃で一晩インキュベートした。この
溶液を、SS34ローター(Sorvall)中、10,000r
pmで15分間遠心することによって、プラスミドDNA
をペレット化した。 【0070】この方法によって得たプラスミドpdBPV
−MMTneoDNA〜1mgをTE緩衝液1mlに懸濁さ
せ、−20℃で保存した。通常、前記のプラスミド単離
法は、大量の極めて純粋なプラスミドDNAが必要なと
きに用いられる。この方法を若干変え、培養細胞を約5
mlだけ用い、適宜減少させた溶解緩衝液中で細胞を溶解
し、そして遠心工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に置き換えることによって、比較的少量の、やや純度
の劣るDNA(あるプラスミドの存在について形質転換
体をスクリーニングする場合に必要となるようなDN
A)を早く得ることができる。 【0071】10×BamHI緩衝液[1.5M NaCl、
60mMトリス−HCl(pH=7.9)、60mM MgC
l2、および1mg/mlBSA]2μl、制限酵素BamHI
1μlおよび水7μlを含有する溶液中、37℃で2時
間、上記で調製したプラスミドpdBPV−MMTneoD
NA約5μg(5μl)および実施例1で調製したBKウイ
ルスDNA5μg(5μl)それぞれを消化した。等容量の
フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで2回抽出す
ることによって反応を呈しさせた。BamHI消化したD
NAそれぞれを沈澱させ、遠心して集め、水5μlに再
懸濁した。 【0072】BamHI消化したプラスミドpdBPV−M
MTneo(1μl)およびBamHI消化したBKウイルスD
NA(1μl)の混合物に、10×リガーゼ緩衝液約1μl
を加えた。このDNA混合物に、T−4 DNAリガー
ゼ1μl(〜1000単位)および水6μlを加え、得られ
た反応溶液を16℃で一晩インキュベートした。このラ
イゲート化DNAは所望のプラスミドpBKneo1および
pBKneo2からなり、これらはBKウイルスDNAの配
向だけが異なっている。プラスミドpBKneo1の制限部
位および機能地図を添付の図3に示す。 【0073】E.コリK12 HB101細胞は、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー(NRRL)
から取得番号NRRL B−15626のもと、凍結乾
燥品として入手可能である。実質的に、実施例2の方法
に従って、E.コリK12 HB101細胞を培養し、形
質転換用にコンピテントにし、上記で調製したライゲー
ト化DNAで形質転換した。この形質転換細胞を、10
0μg/mlアンピシリンを含有するL−寒天プレート上
にプレートした。E.コリK12 HB101/pBKneo
1およびE.コリK12/pBKneo2形質転換体を、そ
のアンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドDN
Aの制限酵素分析によって同定した。 【0074】実施例4 プラスミドpBLcatの構築 A.中間体プラスミドpLPcatの構築 アデノウイルス2(Ad2)のビリオンDNAは、約35.
94kbの大きさの、2本鎖の直線状分子である。このA
d2の後期プロモーターは、Ad2ゲノムの〜0.316k
b AccI−PvuII制限フラグメントとして単離するこ
とができ、この〜0.32kb制限フラグメントは、Ad2
ゲノムのヌクレオチド位置5755と6071の間の配
列に対応している。所望の〜0.32kb AccI−PvuI
I制限フラグメントを単離するため、始めにAd2 DN
Aを制限酵素BalIで消化し、〜0.32kb AccI−P
vuII制限フラグメントの完全な配列を含有する〜2.
4kb BalI制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜2.4kb BalI制限フラグメントをAccIおよびP
vuIIで消化して所望のフラグメントを得る。 【0075】Ad2 DNA(BRLから入手可能)約50
μgを、水80μlおよび10×BalI緩衝液[100mM
トリス−HCl(pH=7.6)、120mM MgCl2、10
0mM DTT、および1mg/mlBSA]10μlに溶解す
る。このAd2 DNAの溶液に、制限酵素BalI約10
μl(〜20単位)を加え、得られた反応液を37℃で4
時間インキュベートする。 【0076】制限フラグメントが十分に分離するまで、
BalI消化したDNAをアガロースゲル電気泳動にかけ
る。電気泳動したDNAの可視化は、臭化エチジウムの
希釈溶液(0.5μg/ml)中でゲルを染色し、染色したゲ
ルに長波長紫外光(UV)をあてることによって行う。ア
ガロースからDNAを単離する方法の1つは以下のよう
である。所望のフラグメントの前方のゲルに小さい切れ
目を入れ、各切れ目にNA−45 DEAEメンブラン
[シュライヒャー・アンド・シュエル(Schleicher and
Schuell,Keene,NH 03431)]の小片を差し込
む。さらに電気泳動を続けると、DNAがDEAEメン
ブランに非共有結合的に結合する。所望のフラグメント
がDEAEメンブランに結合した後、メンブランを取り
上げ、低塩の緩衝液[100mM KCl、0.1mM ED
TA、および20mMトリス−HCl(pH=8)]ですす
ぐ。次いで、メンブランを小さい試験管に入れ、高塩の
緩衝液[1M NaCl、0.1mM EDTA、および20m
M トリス−HCl(pH=8)]中に浸漬し、そして65℃
で1時間インキュベートしてDEAE紙からDNAを取
り出す。65℃のインキュベーションの後、インキュベ
ート緩衝液を集め、メンブランを高塩緩衝液ですすぐ。
この高塩緩衝液ですすいだ溶液を、高塩インキュベート
緩衝液といっしょにプールする。 【0077】NaCl濃度が0.25Mとなるように、高
塩−DNA溶液の容積を調整し、次いでこの溶液に3倍
量の無水の冷エタノールを加える。得られた溶液を混合
し、10−20分間、−70℃に保つ。次いでこの溶液
を15,000rpmで15分間遠心する。残留する塩を除
去するため、もう一度この沈澱操作を行った後、DNA
ペレットをエタノールですすぎ、乾燥し、TE緩衝液2
0μl中に再懸濁する。このペレットはAd2の所望の制
限フラグメント約3μgからなる。得られた精製フラグ
メントをTE緩衝液10μlに溶解する。 【0078】水約6μlおよび10×AccI緩衝液[60
mM NaCl、60mMトリス−HCl(pH=7.5)、60
mM MgCl2、60mM DTT、および1mg/ml BS
A]2μlを、Ad2の〜2.4kb BalI制限フラグメン
トの溶液に加える。このDNA溶液に制限酵素AccI約
2μl(〜10単位)を加えた後、反応液を37℃で2時
間インキュベートする。このAccI消化の後、DNAを
エタノール沈澱で集め、水16μlおよび10×PvuI
I緩衝液[600mM NaCl、60mMトリス−HCl(p
H=7.5)、60mM MgCl2、60mM DTT、およ
び1mg/ml BSA]2μl中に再懸濁する。このDNA
溶液に制限酵素PvuII約2μl(約10単位)を加えた
後、反応液を37℃で2時間インキュベートする。 【0079】Ad2の後期プロモーターを含有する〜0.
32kb AccI−PvuII制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、AccI−PvuII消化した、A
d2の〜2.4kb BalI制限フラグメントを〜6%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかける。このゲルを臭化
エチジウムで染色し、UV光を用いて観察し、〜0.3
2kb AccI−PvuII制限フラグメントを含有するゲ
ルセグメントをゲルから切り出し、つぶし、抽出緩衝液
[500mM NH4OAc、10mM MgOAc、1mM E
DTA、および0.1%SDS]〜250μl中に、室温
で一晩浸漬する。翌朝、この混合物を遠心し、ペレット
を除去する。上清中のDNAをエタノールで沈澱させ、
tRNA約2μgを加えて所望のフラグメントの沈澱を完
全なものにする。〜0.32kb AccI−PvuII制限フ
ラグメント約0.2μgが得られ、これを水7μlに懸濁
させる。 【0080】実質的に、後記実施例10Aに記載した方
法に従って、キナーゼ処理しておいたBclIリンカー
[5'−CTGATCAG−3';ニュー・イングランド・
バイオラブズ(New England Biolabs)から入手可能]
約0.25μg(0.5μl中)を、〜0.32kb AccI−P
vuII制限フラグメントの溶液に加え、次いでこのDN
A溶液にT4 DNAリガーゼ1μl(〜1000単位)お
よび10×リガーゼ緩衝液1μlを加え、得られた反応
液を16℃で一晩インキュベートした。このBclIリン
カーは、AccI−PvuII制限フラグメントのPvuII
末端にだけライゲートすることもある。後に行ったDN
A配列決定により、AccI−PvuII制限フラグメント
のPvuII末端には4個のBclIリンカーが結合してい
ることがわかった。これら余分のBclIリンカーをBcl
I消化および再ライゲートによって除去することができ
るが、これらのリンカーは余分のリンカーを含有するベ
クターの正しい機能を妨害しないので、これら余分のB
clIリンカーを除去しなかった。 【0081】E.コリK12 HB101/pSV2cat細
胞をATCCから取得番号ATCC37155のもと、
凍結乾燥品として入手し、実質的に実施例3の方法に従
ってこの細胞からプラスミドpSV2cat DNAを単離
した。プラスミドpSV2catの制限部位および機能地図
を添付の図4に示す。プラスミドpSV2cat DNA約
1mgが得られ、これをTE緩衝液1mlに溶解する。プラ
スミドpSV2cat DNA約3μg(3μl)を10×Acc
I緩衝液2μlおよび水16μlに加え、次いで制限酵素
AccI3μl(約9単位)をこのpSV2cat DNA溶液に
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。次いで、10×StuI緩衝液[1.0M NaCl、
100mMトリス−HCl(pH=8.0)、100mM Mg
Cl2、60mM DTT、および1mg/ml BSA]3μ
l、水5μl、および制限酵素StuI約2μl(約10単
位)を加えることにより、このAccI消化したプラスミ
ドpSV2cat DNAを制限酵素StuIで消化した。得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。こ
の反応混合物をフェノールで1回、次いでクロロホルム
で2回抽出することによって反応を停止させた。所望の
フラグメント約0.5μgが得られ、これをTE緩衝液2
0μlに溶解した。 【0082】AccI−StuI消化したプラスミドpSV
2cat DNA約4μlを、Ad2の〜0.32kb AccI−
PvuII(BclIリンカーが結合している)制限フラグメ
ント約7μlと混合し、10×リガーゼ緩衝液3μl、水
15μl、およびT4 DNAリガーゼ2μl(約1000
単位)を加えた後、このライゲーション混合物を16℃
で一晩インキュベートした。このライゲートしたDNA
は所望のプラスミドpLPcat、すなわち、Ad2後期プ
ロモーター(クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を転写し、これを発現させるように配置
されている)を含有するプラスミドからなっていた。プ
ラスミドpLPcatの制限部位および機能地図を添付の図
5に示す。 【0083】実質的に実施例3の方法に従い、このライ
ゲート化DNAを用いてE.コリK12 HB101細胞
を形質転換した。形質転換細胞を、50μg/mlアンピ
シリンを含有するL−寒天で平板培養した。プラスミド
DNAの制限酵素分析を用いてE.コリK12 HB10
1/pLPcat形質転換体を同定した。実施例3に記載し
たプラスミド単離法に実質的に従って、後の構築に用い
るためにプラスミドpLPcat DNAを形質転換体から
単離した。 【0084】B.プラスミドpBLcatの最終的な構築 10×AccI緩衝液7.5μl、水30μl、および制限
酵素AccI15μl(約75単位)に、TE緩衝液50μl
中のプラスミドpBKneo1DNA約88μgを加え、得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。A
ccI消化したBKウイルスDNAをアガロースゲルにか
け、BKエンハンサーを含有する〜1.4kbフラグメン
トを他の消化産物から分離した。次いで、実施例4A記
載の方法に実質的に従って、〜1.4kb AccI制限フラ
グメントを単離した。このフラグメント約5μgを、1
0×PvuII緩衝液5μl、水45μl、および制限酵素
PvuII 5μl(約25単位)中に再懸濁し、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。次いで、実
質的に実施例4Aの方法に従って、PvuII消化したD
NAをライゲーション用に単離し、調製した。所望の〜
1.28kb AccI−PvuIIフラグメントが約2μg得
られ、これをTE緩衝液5μlに溶解した。 【0085】プラスミドpLPcat DNA約1μgを、1
0×AccI緩衝液5μlおよび水40μlに溶解した。制
限酵素AccI約5μl(〜25単位)をプラスミドpLPc
atDNAの溶液に加え、得られた反応液を37℃でイ
ンキュベートした。AccI消化したプラスミドpLPc
at DNAをエタノールで沈澱させ、10×StuI緩衝
液5μl、水40μl、および制限酵素StuI 5μl(約
25単位)中に再懸濁し、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。AccI−StuI消化したプラ
スミドpLPcat DNAをエタノールで数回沈澱させ
て、他の消化産物(大きさが16bpの制限フラグメント)
を含まない、E.コリの複製期限およびAd2後期プロモ
ーターを含有する〜4.81kb AccI−StuI制限フラ
グメントを精製した。所望の〜4.81kb制限フラグメ
ントが約1μg得られ、これをTE緩衝液20μlに溶解
した。 【0086】プラスミドpLPcatの〜4.81kb AccI
−StuI制限フラグメント5μlを、BKウイルスの
1.28kb AccI−PvuII制限フラグメント5μlに
加えた。このDNA混合物に、10×リガーゼ緩衝液3
μl、水15μl、およびT4DNAリガーゼ2μl(約1
000単位)を加えた後、このライゲーション反応液を
16℃で一晩インキュベートした。このライゲート化D
NAは所望のプラスミドpBLcatからなっていた。プラ
スミドpBLcatの制限部位および機能地図を添付の図6
に示す。 【0087】実施例3記載の方法に実質的に従い、この
ライゲート化DNAを用いてE.コリK12 HB101
細胞を形質転換した。プラスミドDNAの制限酵素分析
によって、E.コリK12 HB101/pBLcat形質転
換体を同定した。実質的に実施例3の方法に従って、後
の構築に用いるためにプラスミドpBLcat DNAを調
製した。 【0088】実施例5 プラスミドpSBLcatの構築 プラスミドpBLcat DNA約100μgを、10×Hin
dIII緩衝液[0.5M NaCl、0.1Mトリス−HCl
(pH=8.0)、0.1M MgCl2、および1mg/ml BS
A]10μlおよび水80μlに溶解した。このプラスミ
ドpBLcatDNAの溶液に、制限酵素HindIII約1
0μl(約100単位)を加え、得られた反応液を37℃
で2時間インキュベートした。BKエンハンサーおよび
Ad2後期プロモーターを含有する〜0.87kb HindI
II制限フラグメントが他の消化産物から十分に分離す
るまで、HindIII消化したプラスミドpBLcat DN
Aをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、この〜0.87kbフラグ
メントをライゲーション用に単離し、調製した。目的の
フラグメントが約10μg得られ、これをTE緩衝液5
0μlに溶解した。 【0089】TE緩衝液1μl中のプラスミドpSV2ca
t DNA約1μgを、10×HindIII緩衝液2μlお
よび水16μlに溶解した。このDNA溶液に制限酵素
HindIII約1μl(約10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。この反応混合
物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで2回抽
出することによって、反応を停止させた。HindIII
消化したプラスミドpSV2cat DNAをエタノールで
沈澱させ、TE緩衝液100μlに再懸濁した。このHi
ndIII消化したプラスミドpSV2cat DNAを、実
質的に実施例2の方法に従って、ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼで処理し、次いでTE緩衝液10μlに再懸濁
した。 【0090】プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind
III制限フラグメント約5μlを、HindIII消化し
たプラスミドpSV2cat 10μlに加え、次いでこのD
NA溶液に、10×リガーゼ緩衝液3μl、T4 DNA
リガーゼ2μl(約1000単位)、および水13μlを加
え、この反応液を16℃で2時間インキュベートした。
このライゲート化DNAは目的のプラスミドpSBLcat
からなっていた。このライゲート化DNAを用い、実質
的に実施例3の方法に従って、E.コリK12HB10
1を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有の
L−寒天で平板培養し、制限酵素分析によってアンピシ
リン耐性形質転換体のプラスミドDNAを試験して、
E.コリK12 HB101/pSBLcat形質転換体を同
定した。BKエンハンサーおよびAd2後期プロモータ
ーをコードしている〜0.87kb HindIII制限フラ
グメントは、HindIII消化したプラスミドpSBLca
t中に、2つの配向のうちのいずれかで挿入される(その
うちの1つだけがプラスミドpSBLcatを与える)。プラス
ミドpSBLcatの制限部位および機能地図を添付の図8
に示す。 【0091】実施例6 プラスミドpL133の構築 A.中間体プラスミドpSV2−HPC8の構築 プラスミドpHC7はヒトタンパク質Cをコードしてい
るDNA配列を含有している。15μg/mlのテトラサ
イクリンを含有するL−ブロス1lにE.コリK12 R
R1/pHC7(NRRL B−15926)の培養物を接
種し、実質的に実施例3の方法に従ってプラスミドpH
C7 DNAを単離し、精製した。この操作により約1m
gのプラスミドpHC7 DNAが得られ、これをTE緩
衝液1mlに懸濁し、−20℃で保存した。プラスミドp
HC7の制限部位および機能地図を添付の図9に示す。 【0092】プラスミドpHC7 DNA50μlを、制
限酵素BanI 5μl(〜50単位)、10×BanI反応緩
衝液[1.5M NaCl、60mMトリス−HCl(pH=7.
9)、60mM MgCl2、および1mg/ml BSA]10μ
lおよび水35μlと混合し、消化が完結するまでインキ
ュベートした。次いで、〜1.25kb BanI制限フラグ
メントが他の消化産物から分離するまで、このBanI消
化したプラスミドpHC7 DNAを3.5%ポリアクリ
ルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=2
9:1)電気泳動にかけた。 【0093】この〜1.25kb BanI制限フラグメント
を含有するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入
れ、細かくつぶした。このフラグメントを含有する試験
管に抽出緩衝液(500mM NH4OAc、10mM MgO
Ac、1mM EDTA、1%SDS、および10mg/ml
tRNA)1mlを加え、一晩試験管を37℃に保った。遠
心して残骸をペレット化し、上清を新しい試験管に移し
た。残骸を抽出緩衝液200μlで1回洗浄し、洗浄液
の上清を、最初の、一晩抽出物からの上清といっしょに
した。この上清を、ガラスウールを詰めたところに通し
た後、2倍量のエタノールを加え、混合した。得られた
溶液を〜10分間ドライアイス−エタノール浴に入れ、
次いで遠心してDNAをペレット化した。 【0094】この操作により約8μgの〜1.25kb Ba
nI制限フラグメントが得られた。この精製フラグメン
トをTE緩衝液10μlに懸濁し、−20℃で保存し
た。プラスミドpSV2−HPC8を構築するために
は、リンカーを付加することによってBanI制限フラグ
メントを修飾しなければならない。このリンカーの構築
に用いるDNAフラグメントを、システック 1450
A DNA合成機(Systec1450A DNA Synthesi
zer;Systec Inc.,3816 Chandler Drive,Minne
apolis,MN)またはABS 380A DNA合成機(Ap
plied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Centre D
rive,Foster City,CA 94404)のどちらかを用
いることによって合成した。当分野においては多数のD
NA合成装置が知られており、これらを用いてフラグメ
ントを調製することができる。さらに、実質的にイタク
ラ等[Itakura et al.,Science,198:1056(19
77)]およびクレア等[Crea et al.,Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA,75:5765(1978)]の方法に従っ
て、常法によりフラグメントを調製することもできる。 【0095】T4ポリヌクレオチドキナーゼ15単位
(〜0.5μl)、10×リガーゼ緩衝液2μl、500μ
M ATP10μl、および水7.5μlを含有する反応緩
衝液20μl中で、1本鎖リンカーそれぞれ500ピコ
モルをキナーゼ処理した。このキナーゼ反応液を37℃
で30分間インキュベートし、次いで100℃で10分
間インキュベートすることによって反応を止めた。キナ
ーゼ化を完全にするため、反応液を氷で冷却し、反応混
合物に0.2Mジチオトレイトール2μl、5mMATP
2.5μl、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ15単
位を加えて混合し、この反応混合物を37℃でさらに3
0分間インキュベートした。100℃でさらに10分間
インキュベートすることによって反応を止め、次いで氷
で冷却した。 【0096】キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ
反応後、2種類の1本鎖DNAリンカーをいっしょにし
て混合した。これらの鎖をアニールするため、キナーゼ
反応混合物を、〜150mlの水を入れた水浴中、100
℃で10分間インキュベートした。インキュベート後、
水浴の栓を止め、室温まで冷却した。この過程に約3時
間かかった。次いで、キナーゼ処理したDNAの試験管
がまだ入っている水浴を4℃で一晩インキュベートし
た。この操作により1本鎖がアニールされた。作成した
リンカーは以下の構造を有していた: 【化13】 このリンカーを使用時まで−20℃で保存した。〜1.
25kb BanIフラグメント〜8μgを、リンカー〜50
μl(〜500ピコモル)、T4 DNAリガーゼ1μl(約
500単位)、10×リガーゼ緩衝液10μl、および水
29μlに加えて混合し、このライゲーション反応液を
4℃で一晩インキュベートした。65℃で10分間イン
キュベートすることによってライゲーション反応を止め
た。最終濃度0.3MとなるようにNaOAcを加え、2
倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴
で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによってDN
Aをペレット化した。 【0097】このDNAペレットを、10×ApaI反応
緩衝液[60mM NaCl、60mMトリス−HCl(pH=
7.4)、60mM MgCl2、および60mM 2−メルカ
プトエタノール]10μl、制限酵素ApaI 5μl(〜5
0単位)および水85μlに溶解し、反応液を2時間37
℃に保った。次いで上記のようにして反応を止め、DN
Aをペレット化した。このDNAペレットを、10×H
indIII反応緩衝液10μl、制限酵素HindIII 5
μl(〜50単位)および水85μlに溶解し、反応液を2
時間37℃に保った。HindIII消化の後、実質的に
実施例4A記載の方法に従って、反応混合物を3.5%
ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜1.23kb H
indIII−ApaI制限フラグメントを単離した。目的
のフラグメントが約5μg得られ、これをTE緩衝液1
0μlに懸濁し、−20℃で保存した。 【0098】プラスミドpHC7 DNA50μlを、制
限酵素PstI 5μl(〜50単位)、10×PstI反応緩
衝液[1.0M NaCl、100mMトリス−HCl(pH=
7.5)、100mM MgCl2、および1mg/ml BSA]
10μlおよび水35μlと混合し、37℃で2時間イン
キュベートした。次いで、実質的に上記記載の方法に従
って、PstI消化したプラスミドpHC7 DNAを、
3.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目的
の〜0.88kbフラグメントを精製した。目的のフラグ
メント約5μgが得られ、これをTE緩衝液10μlに懸
濁し、−20℃で保存した。 【0099】この〜0.88kb PstIフラグメント〜5
μgを、自動DNA合成機で作成した以下のリンカー〜
50μlに加えて混合した: 【化14】 このDNA混合物に、T4 DNAリガーゼ約1μl(〜
10単位)、10×リガーゼ緩衝液10μl、および水2
9μlを加え、得られたライゲーション反応液を4℃で
一晩インキュベートした。 【0100】このライゲーション反応を、65℃で10
分間インキュベートすることによって止めた。ライゲー
ト化DNAを沈澱させた後、DNAペレットを10×A
paI反応緩衝液10μl、制限酵素ApaI 5μl(〜50
単位)および水85μlに溶解し、反応液を2時間37℃
に保った。次いでもう一度反応を止め、DNAをペレッ
ト化した。このDNAペレットを、10×BglII反応
緩衝液[1M NaCl、100mMトリス−HCl(pH=
7.4)、100mM MgCl2、100mM 2−メルカプ
トエタノール、および1mg/ml BSA]10μl、制限
酵素BglII 5μl(〜50単位)および水85μlに溶
解し、反応液を2時間37℃に保った。BglII消化
の後、実質的に上記記載の方法に従って、反応混合物を
3.5%ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜0.
19kb ApaI−BglII制限フラグメントを単離し
た。目的のフラグメントが約1μg得られ、これをTE
緩衝液10μlに懸濁し、−20℃で保存した。 【0101】プラスミドpSV2gpt DNA(ATCC
37145)約10μgを、10×HindIII反応緩衝
液10μl、制限酵素HindIII 5μl(〜50単位)お
よび水85μlに溶解し、反応液を2時間37℃に保っ
た。次いでこの反応混合物を、NaOAcが0.25Mと
なるようにし、2倍量のエタノールを加えてドライアイ
ス−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してD
NAをペレット化した。このDNAペレットを、10×
BglII緩衝液10μl、制限酵素BglII 5μl(〜5
0単位)および水85μlと混合し、反応液を2時間37
℃に保った。BglII消化の後、反応混合物を1%アガ
ロースゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離し
た。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見
えるようにし、目的の〜5.1kb HindIII−BglI
Iフラグメントを含有するバンドをゲルから切り出し、
これを透析管に入れ、DNAがアガロースから溶出して
しまうまで電気泳動を続けた。透析管からのDNA含有
緩衝液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次い
でDNAを沈澱させた。このペレットは目的のプラスミ
ドpSV2gptの〜5.1kb HindIII−BglII制限
フラグメント〜5μgからなり、これをTE緩衝液10
μlに再懸濁した。 【0102】〜1.23kb HindIII−ApaI制限フ
ラグメント2μl、〜0.19kb ApaI−BglIIフラ
グメント3μl、および〜5.1kb HindIII−BglI
Iフラグメント2μlをいっしょにして混合し、次い
で、10×リガーゼ緩衝液10μl、T4 DNAリガー
ゼ1μl(〜500単位)、および水82μlとともに16
℃で一晩インキュベートした。このライゲートしたDN
Aは目的のプラスミドpSV2−HPC8からなってい
た。このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の
図9に示す。 【0103】E.コリK12 RR1(NRRL B−15
210)を、実質的に実施例2記載の方法に従って、形
質転換用にコンピテントにした。上記で調製したライゲ
ート化DNAを用いてこの細胞を形質転換した。形質転
換混合物の一部を、100μg/mlアンピシリン含有の
L−寒天プレートにプレートし、このプレートを37℃
でインキュベートした。プラスミドDNAの制限酵素分
析によってE.コリK12 RR1/pSV2−HPC8
形質転換体を確認した。 【0104】B.プラスミドpL133の最終的な構築 50μgのプラスミドpSV2−HPC8を、10×Hin
dIII反応緩衝液10μl、制限酵素HindIII 5μ
l(〜50単位)および水85μlに溶解し、反応液を37
℃で2時間インキュベートした。HindIII消化の
後、DNAを沈澱させ、そのDNAペレットを10×S
alI反応緩衝液[1.5M NaCl、60mMトリス−HC
l(pH=7.9)、60mM MgCl2、60mM 2−メルカ
プトエタノール、および1mg/ml BSA]10μl、制
限酵素SalI 5μl(〜50単位)および水85μlに溶
解した。得られたSalI反応混合物を37℃で2時間イ
ンキュベートした。次いで、目的の〜0.29kb Hind
III−SalI制限フラグメントが他の反応生成物から
分離するまで、このHindIII−SalI消化したプラ
スミドpSV2−HPC8を3.5%ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけた。目的のフラグメントをゲルから
単離して約2μgのフラグメントを得、これをTE緩衝
液10μlに懸濁させた。 【0105】50μgのプラスミドpSV2−HPC8
を、10×BglII反応緩衝液10μl、制限酵素Bgl
II 5μl(〜50単位)および水85μlに溶解し、反
応液を37℃で2時間インキュベートした。BglII消
化の後、DNAを沈澱させ、そのDNAペレットを10
×SalI反応緩衝液10μl、制限酵素SalI 5μl(〜
50単位)および水85μlに溶解した。得られたSalI
反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。次い
で、目的の〜1.15kb SalI−BglII制限フラグメ
ントが他の反応生成物から分離するまで、このSalI−
BglII消化したプラスミドpSV2−HPC8を3.5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この〜
1.15kb SalI−BglII制限フラグメントをゲルか
ら単離して約8μgのフラグメントを得、これをTE緩
衝液10μlに懸濁させた。 【0106】約10μgのプラスミドpSV2−β−グロ
ビンDNA(NRRL B−15928)を、10×Hind
III反応緩衝液10μl、制限酵素HindIII 5μl
(〜50単位)および水85μlに溶解し、反応液を2時
間37℃に保った。次いでこの反応混合物を、NaOAc
が0.25Mとなるようにし、2倍量のエタノールを加
えてドライアイス−エタノール浴でインキュベートした
後、遠心してDNAをペレット化した。このHindII
I消化したプラスミドpSV2−β−グロビンを、10
×BglII緩衝液10μl、制限酵素BglII 5μl(〜
50単位)および水85μlと混合し、反応液を2時間3
7℃に保った。BglII消化の後、反応混合物を1%ア
ガロースゲル電気泳動にかけてフラグメントを分離し
た。目的の〜4.2kb HindIII−BglII制限フラ
グメントをゲルから単離して約5μgのフラグメントを
得、これをTE緩衝液10μlに懸濁させた。 【0107】プラスミドpSV2−HPC8の〜0.29
kb HindIII−SalIフラグメント2μl、プラスミ
ドpSV2−HPC8の〜1.15kb SalI−BglII
フラグメント2μl、およびプラスミドpSV2−β−グ
ロビンの〜4.2kb HindIII−BglIIフラグメン
ト2μlをいっしょにして混合し、実質的に実施例6A
の方法に従ってライゲートした。このライゲートしたD
NAは目的のプラスミドpL133からなっていた。こ
のプラスミドpL133の制限部位および機能地図を添
付の図9に示す。形質転換するDNAとして、プラスミ
ドpSV2−HPC8のかわりにプラスミドpL133を
用いること以外は、実質的に実施例6Aの教示に従っ
て、目的のE.コリK12 RR1/pL133形質転換
体を作成した。 【0108】実施例7 プラスミドpLPCの構築 プラスミドpBLcatDNA約20μgを、10×HindI
II緩衝液10μlおよび水80μlに溶解した。得られ
たプラスミドpBLcatDNAの溶液に制限酵素HindI
II約10μl(〜100単位)を加え、この反応液を3
7℃で2時間インキュベートした。次いで、BKエンハ
ンサーおよびAd2後期プロモーターを含有する〜0.8
7kb HindIII制限フラグメントが他の消化生成物か
ら分離するまで、このHindIII消化したプラスミドp
BLcatDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。次
いで、実質的に実施例4Aの方法に従って、〜0.87k
bフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約2μg得られ、これをTE
緩衝液5μlに溶解した。 【0109】プラスミドpL133 DNA約1.5μg
を、10×HindIII緩衝液2μlおよび水16μlに
溶解した。このDNA溶液に制限酵素HindIII約1
μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。次いで、このDNAをTE緩
衝液で100μlまで希釈し、実質的に実施例2の方法
に従って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。
このHindIII消化したプラスミドpL133 DNA
をフェノールで2回、クロロホルムで1回抽出し、エタ
ノールで沈澱させ、そしてTE緩衝液10μlに再懸濁
した。 【0110】プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind
III制限フラグメント約5μlを、HindIII消化し
たプラスミドpL133 1.5μlに加え、次いでこの
DNA溶液に、10×リガーゼ緩衝液1μl、T4 DN
Aリガーゼ1μl(〜1000単位)、および水1.5μl
を加え、得られた反応液を16℃で一晩インキュベート
した。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpL
PCからなっていた。プラスミドpLPCの制限部位お
よび機能地図を添付の図10に示す。 【0111】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例3の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、制限酵素分析によってアンピシリン
耐性形質転換体のプラスミドDNAを試験して、E.コ
リK12 HB101/pLPC形質転換体を同定した。
BKエンハンサーおよびAd2後期プロモーターをコー
ドしている〜0.87kb HindIII制限フラグメント
は、HindIII消化したプラスミドpSBLcat中に、
2つの配向のうちのどちらかで挿入されている(そのう
ちの1つだけがプラスミドpLPCを生じる)。 【0112】実施例8 プラスミドpLPC4およびpL
PC5の構築 実施例1で調製したBKウイルスDNA約1μg(1μl)
およびプラスミドpLPC1μg(1μl)を、10×Eco
RI緩衝液2μlおよび水14μlに溶解した。このDN
A溶液に制限酵素EcoRI約2μl(〜10単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このEcoRI消化したBKウイルスおよびプラスミ
ドpLPC DNAの混合物を緩衝フェノールで1回、ク
ロロホルムで1回抽出した。次いで、NaCl濃度を0.
25Mに調整し、2倍量のエタノールを加え、この溶液
をドライアイス−エタノール浴で2分間インキュベート
し、そして溶液を遠心してDNAをペレット化すること
によってDNAを集めた。上清を除去し、DNAペレッ
トを70%エタノールですすぎ、乾燥し、TE緩衝液1
2μlに再懸濁した。 【0113】EcoRI消化したBKウイルスおよびプラ
スミドpLPC DNAの混合物に、水約13μlおよび
10×リガーゼ緩衝液3μlを加えた。このDNA溶液
にT4DNAリガーゼ2μl(〜1000単位)を加え、
得られた反応液を16℃で2時間インキュベートした。
このライゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPC
4およびpLPC5からなり、両者は挿入したBKウイ
ルスDNAの配向だけが異なっていた。プラスミドpL
PC4の制限部位および機能地図を添付の図11に示
す。 【0114】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例3の方法に従って、E.コリK12 HB101コ
ンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を100
μg/mlアンピシリン含有のL−寒天で平板培養した。
アンピシリン耐性の表現型およびプラスミドDNAの制
限酵素分析によって、E.コリK12 HB101/pL
PC4およびE.コリK12 HB101/pLPC5形
質転換体を同定した。 【0115】実施例9 プラスミドpLPChyg1および
pLPChyg2の構築 E.コリK12 RR1/pSV2hyg細胞を、NRRLか
ら取得番号NRRLB−18039のもとで入手する。
実質的に実施例3の方法に従って、この細胞からプラス
ミドpSV2hyg DNAを得る。プラスミドpSV2hyg
の制限部位および機能地図を添付の図12に示す。 【0116】プラスミドpSV2hyg約10μg(TE緩衝
液10μl中)を、10×BamHI緩衝液2μlおよび水
6μlに加えた。このDNA溶液に、制限酵素BamHI
約2μl(約20単位)を加え、得られた反応液を37℃
で2時間インキュベートした。この反応液を始めフェノ
ールで抽出し、次いでクロロホルムで2回抽出した。実
質的に実施例4A記載の方法に従って、このBamHI消
化したプラスミドpSV2hyg DNAをアガロースゲル
にかけ、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する〜2.
5kbの制限フラグメントを単離した。 【0117】10×クレノウ緩衝液[4種類のdNTPそ
れぞれが0.2mM、0.5Mトリス−HCl(pH=7.
8)、50mM MgCl2、0.1M 2−メルカプトエタ
ノール、および100μg/ml BSA]約5μlおよび水
35μlを、BamHI消化したプラスミドpSV2hyg D
NAの溶液に加え、次いでこのDNA混合物にクレノウ
酵素(BRLから市販されている)約25単位(約5μl)
を加え、得られた反応液を16℃で30分間インキュベ
ートした。このクレノウ処理し、BamHI消化したプラ
スミドpSV2hyg DNAをフェノールで1回、クロロ
ホルムで1回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。
目的のフラグメントが約2μg得られ、これをTE緩衝
液5μlに懸濁させた。 【0118】プラスミドpLPC DNA約10μg(10
μl)を、10×StuI緩衝液2μlおよび水6μlに加え
た。このDNA溶液に、制限酵素StuI約2μl(〜10
単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。このStuI消化したプラスミドpLPC
DNAをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、10×
NdeI緩衝液[1.5M NaCl、0.1Mトリス−HCl
(pH=7.8)、70mM MgCl2、60mM 2−メルカ
プトエタノール、および1mg/ml BSA]2μlおよび
水16μlに再懸濁した。このStuI消化したDNAの
溶液に、制限酵素NdeI約2μl(〜10単位)を加え、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。 【0119】NdeI−StuI消化したプラスミドpLP
C DNAをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、1
0×クレノウ緩衝液5μlおよび水40μlに再懸濁し
た。このDNA溶液に、クレノウ酵素約5μl(〜25単
位)を加え、得られた反応液を16℃で30分間インキ
ュベートした。クレノウ反応の後、反応混合物をアガロ
ースゲルにかけ、〜5.82kb NdeI−StuI制限フラ
グメントをゲルから単離した。目的のフラグメントが約
5μg得られ、これをTE緩衝液5μlに懸濁させた。 【0120】プラスミドpSV2hygの〜2.5kbのクレ
ノウ処理したBamHI制限フラグメント約2μlを、プ
ラスミドpLPCの〜5.82kbのクレノウ処理したNde
I−StuI制限フラグメント約1μlと混合し、このD
NA溶液に、10×リガーゼ緩衝液約3μl、T4 DN
Aリガーゼ2μl(〜1000単位)、T4 RNAリガー
ゼ1μl(〜1単位)、および水14μlを加えた。得られ
た反応液を16℃で一晩インキュベートした。このライ
ゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPChyg1およ
びpLPChyg2からなり、それらはプラスミドpSV2h
ygの〜2.5kbのクレノウ処理したBamHI制限フラグ
メントの配向だけが異なっていた。プラスミドpLPCh
yg1の制限部位および機能地図を添付の図13に示す。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3の方
法に従って、E.コリK12 HB101を形質転換し
た。目的のE.コリK12 HB101/pLPChyg1お
よびE.コリK12 HB101/pLPChyg2形質転換
体を、アンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プラ
スミドDNAの制限酵素分析によって同定した。 【0121】実施例10 プラスミドpBW32の構築 A.中間体プラスミドpTPA103の構築 プラスミドpTPA102はヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子(TPA)のコード化配列を含有している。プ
ラスミドpTPA102はE.コリK12 MM294/p
TPA102(この菌株はNRRLから取得番号NRR
L B−15834のもとで入手可能である)から単離す
ることができる。プラスミドpTPA102の制限部位
および機能地図を添付の図14、図15、図16および
図17に示す。プラスミドpTPA102 DNAを、実
質的に実施例2の方法に従って、E.コリK12 MM2
94/pTPA102から単離する。 【0122】プラスミドpTPA102約50μg(TE
緩衝液約50μl中)を、10×Tth111I緩衝液[0.5
M NaCl、80mMトリス−HCl(pH=7.4)、80m
M MgCl2、80mM 2−メルカプトエタノール、およ
び1mg/ml BSA]10μlおよび水80μlに加えた。
このDNA溶液に制限酵素Tth111I約10μl(〜50
単位)を加え、得られた反応液を65℃で2時間インキ
ュベートした。この反応混合物をアガロースゲルにか
け、TPAコード化配列を含有する〜4.4kb Tth111
I制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化
産物、すなわち3.1kbおよび0.5kb制限フラグメント
は廃棄した。目的の〜4.4kb Tth111I制限フラグメ
ントが約10μg得られ、これをTE緩衝液10μlに懸
濁させた。 【0123】10×クレノウ緩衝液約5μlおよび水3
0μlに〜4.4kb Tth111I制限フラグメントを含有す
る溶液を加え、さらにクレノウ酵素約5μl(〜5単位)
を加えた後、この反応混合物を16℃で30分間インキ
ュベートした。クレノウ反応の後、DNAをエタノール
で沈澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水14
μlに再懸濁させた。 【0124】配列: 【化15】 で示されるBamHIリンカー(ニュー・イングランド
・バイオラブズ)を以下の方法によってキナーゼ処理
し、ライゲーション用に調製した。リンカー4μl(〜2
μg)を水20.15μlおよび10×キナーゼ緩衝液[5
00mM トリス−HCl(pH=7.6)および100mM
MgCl2]5μlに溶解し、90℃で2分間インキュベー
トし、次いで室温まで冷却した。この混合物に、γ−32
P−ATP 5μl(〜20μCi)、1M DTT 2.5μ
lおよびポリヌクレオチドキナーゼ5μl(〜10単位)を
加え、得られた反応液を37℃で30分間インキュベー
トした。次いで、0.01M ATP3.35μlおよびキ
ナーゼ5μlを加え、反応液をさらに30分間37℃に
保った。この放射活性ATPは、リンカーが標的DNA
にライゲートしたかどうかを決定するのに役立つ。 【0125】キナーゼ処理したBamHIリンカー約10
μlを〜4.4kb Tth111I制限フラグメントの溶液に加
え、さらにT4 DNAリガーゼ2μl(〜1000単位)
およびT4 RNAリガーゼ1μl(〜2単位)を加えた
後、このライゲーション反応液を4℃で一晩インキュベ
ートした。このライゲートしたDNAをエタノールで沈
澱させ、10×HindIII緩衝液5μlおよび水40μ
lに再懸濁させた。このDNA溶液に制限酵素HindII
I約5μl(〜50単位)を加え、得られた反応液を37
℃で2時間インキュベートした。 【0126】このHindIII消化したDNAをエタノ
ールで沈澱させ、10×BamHI緩衝液10μlおよび
水90μlに再懸濁させた。このDNA溶液に制限酵素
BamHI約10μl(〜100単位)を加え、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。BamHI消
化の後、反応混合物をアガロースゲルにかけ、〜2.0k
b BamHI−HindIII制限フラグメントをゲルから
単離した。目的のフラグメントが約4μg得られ、これ
をTE緩衝液約5μlに懸濁させた。 【0127】プラスミドpTPA103を構築するた
め、プラスミドpTPA102由来の〜2.0kb BamH
I−HindIII制限フラグメントを、BamHI−Hind
III消化したプラスミドpRCに挿入した。プラスミ
ドpRCは、E.コリtrpオペロンのプロモーターおよび
オペレーター(trpPO)配列を含有する〜288bp Eco
RI−ClaI制限フラグメントを、EcoRI−ClaI消
化したプラスミドpKC7に挿入することによって構築
した。プラスミドpKC7は、E.コリ K12 N100
/pKC7として、ATCCから取得番号ATCC37
084のもとで入手することができる。trpPOを含有
する〜288bp EcoRI−ClaI制限フラグメントは
プラスミドpTPA102[このプラスミドはE.コリ K
12 MM294/pTPA102(NRRL B−158
34)から単離することができる]から単離することがで
きる。プラスミドpKC7およびプラスミドpTPA10
2DNAは、実質的に実施例3の方法に従って、上記セ
ルラインから得ることができる。このプラスミドpTP
A102の〜0.29kb EcoRI−ClaI制限フラグメ
ントは、E.コリ trp遺伝子の翻訳活性化配列の大部分
および転写活性化配列を含有し、以下の配列を有してい
る: 【0128】 【化16】 【化17】【0129】すなわち、プラスミドpRCを構築するた
めに、TE緩衝液10μl中のプラスミドpKC7約2μ
gを、10×ClaI緩衝液[0.5M NaCl、60mMト
リス−HCl(pH=7.9)、60mM MgCl2、および
1mg/ml BSA]2μlおよび水6μlに加えた。このプ
ラスミドpKC7 DNAの溶液に制限酵素ClaI約2μ
l(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時
間インキュベートした。このClaI消化したプラスミド
pKC7 DNAをエタノールで沈澱させ、10×EcoR
I緩衝液2μlおよび水16μlに再懸濁させた。このC
laI消化したプラスミドpKC7 DNAの溶液に制限酵
素EcoRI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。 【0130】このEcoRI−ClaI消化したプラスミド
pKC7 DNAを、フェノールで1回、次いでクロロホ
ルムで2回抽出した。次いで、DNAをエタノールで沈
澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水20μlに
再懸濁した。プラスミドpKC7の制限部位および機能
地図は、マニアティス等[Maniatis et al.]のMolecul
ar Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,8頁
(1982)から入手することができる。 【0131】TE緩衝液約20μl中のプラスミドpTP
A102約20μgを、10×ClaI緩衝液10μlおよ
び水60μlに加えた。このプラスミドpTPA102
DNAの溶液に、制限酵素ClaI約10μl(〜50単
位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュ
ベートした。このClaI消化したプラスミドpTPA1
02 DNAをエタノールで沈澱させ、10×EcoRI
緩衝液10μlおよび水80μlに再懸濁した。このCla
I消化したプラスミドpTPA102 DNAの溶液に制
限酵素EcoRI約10μl(〜50単位)を加え、得られ
た反応液を37℃で2時間インキュベートした。 【0132】このEcoRI−ClaI消化したプラスミド
pTPA102 DNAをフェノールで1回抽出し、trp
POを含有する〜288bp EcoRI−ClaI制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで、7%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いでこの〜288
bp EcoRI−ClaI制限フラグメントをゲルから単離
した。目的のフラグメントが約1μg得られ、これをT
E緩衝液5μlに懸濁し、上記のようにして調製したEc
oRI−ClaI消化のプラスミドpKC7 DNAの溶液
に加えた。次いでこのDNA混合物に、T4 DNAリ
ガーゼ約2μl(〜1000単位)を加え、得られたライ
ゲーション反応液を16℃で2時間インキュベートし
た。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpRC
DNAからなっていた。 【0133】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101コ
ンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を100
μg/mlアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プ
ラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐
性形質転換体をスクリーニングして目的のE.コリK1
2 HB101/pRCコロニーを同定した。実質的に実
施例3の方法に従って、E.コリK12 HB101/p
RC形質転換体からプラスミドpRC DNAを得た。 【0134】TE緩衝液約2μl中のプラスミドpRC
DNA約2μgを、10×HindIII緩衝液2μlおよ
び水16μlに加えた。このプラスミドpRC DNAの
溶液に、制限酵素HindIII約2μl(〜10単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このHindIII消化したプラスミドpRC DNA
をエタノールで沈澱させ、10×BamHI緩衝液2μl
および水16μlに再懸濁した。このHindIII消化し
たプラスミドpRC DNAの溶液に制限酵素BamHI約
2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で
2時間インキュベートした。 【0135】このBamHI−HindIII消化したプラ
スミドpRC DNAをフェノールで1回、次いでクロロ
ホルムで2回抽出した。このDNAをエタノールで沈澱
させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水20μlに再
懸濁した。このBamHI−HindIII消化したプラス
ミドpRC DNAの溶液に、プラスミドpTPA102
の〜2.0kb HindIII−BamHI制限フラグメント
〜4μg(TE緩衝液〜5μl中)を加えた。このDNA混
合物に、T4 DNAリガーゼ約2μl(〜1000単位)
を加え、得られた反応液を16℃で2時間インキュベー
トした。このライゲート化DNAは目的のプラスミドp
TPA103 DNAからなっていた。 【0136】目的ではない形質転換体を減少させるた
め、このライゲート化DNAを制限酵素NcoI(この酵
素はプラスミドpRCを切断するがプラスミドpTPA1
03を切断しない)で消化した。すなわち、直線化した
DNAは閉環した環状DNAに比べてE.コリを形質転
換することが少ないので、NcoIによってライゲート化
DNAを消化すると目的ではない形質転換体が減少す
る。ライゲート化DNAを消化するため、始めにDNA
をエタノールで沈澱させ、次いで10×NcoI緩衝液
[1.5M NaCl、60mMトリス−HCl(pH=7.
8)、60mM MgCl2、および1mg/ml BSA]2μl
および水16μlに再懸濁した。このDNA溶液に制限
酵素NcoI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。 【0137】ライゲートし、次いでNcoI消化したこの
DNAを用いてE.コリK12 RV308(NRRL B
−15624)を形質転換した。実質的に実施例3の方
法に従って、E.コリK12 RV308細胞をコンピテ
ントにし、そして形質転換した。形質転換混合物を10
0μg/mlアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し
た。アンピシリン耐性形質転換体をカナマイシン感受性
について試験した(プラスミドpRCはカナマイシン耐性
を与えるがプラスミドpTPA103は与えない)。次い
でアンピシリン耐性かつカナマイシン感受性の形質転換
体からプラスミドDNAを調製し、このプラスミドDN
Aを制限酵素分析することによってE.コリK12 RV
308/pTPA103形質転換体を同定した。プラス
ミドpTPA103の制限部位および機能地図を添付の
図14、図15、図16および図17に示す。実質的に
実施例3の方法に従って、E.コリK12 RV308
/pTPA103細胞からプラスミドpTPA103 D
NAを単離した。 【0138】B.中間体プラスミドpBW25の構築 TE緩衝液1μl中のプラスミドpTPA103 DNA
約1μgを、10×BglII緩衝液2μlおよび水16μ
lに加えた。このプラスミドpTPA103 DNAの溶
液に、制限酵素BglII約1μl(〜5単位)を加え、得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。こ
のBglII消化したプラスミドpTPA103 DNAを
エタノールで沈澱させ、10×クレノウ緩衝液5μlお
よび水44μlに再懸濁した。このBglII消化したプ
ラスミドpTPA103 DNAの溶液に、クレノウ酵素
約1μl(〜1単位)を加え、得られた反応液を16℃で
2時間インキュベートした。このクレノウ処理し、Bgl
II消化したプラスミドpTPA103 DNAをエタノ
ールで沈澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水
22μlに再懸濁した。 【0139】このクレノウ処理し、BglII消化したプ
ラスミドpTPA103 DNAの溶液に、配列: 【化18】 で示されるキナーゼ処理していないNdeIリンカー(ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ)約2μl(0.2μg)
を、T4 DNAリガーゼ2μl(〜1000単位)および
T4 RNAリガーゼ1μl(〜2単位)とともに加え、得
られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。こ
のライゲート化DNAはプラスミドpTPA103derN
deIからなっていた(このプラスミドは、プラスミドpT
PA103が有するBglII認識配列のところにNdeI
認識配列を有していること以外は、実質的にプラスミド
pTPA103と同じである)。 【0140】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2記載の方法に従って、E.コリK12 RV30
8コンピテント細胞を形質転換した。この形質転換細胞
をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プラスミ
ドDNAの制限酵素分析によって、E.コリK12 RV
308/pTPA103derNdeI形質転換体を同定し
た。後の構築にもちいるため、プラスミドpTPA10
3derNdeI DNAを、実質的に実施例3の方法に従っ
て、形質転換体から単離した。 【0141】TE緩衝液10μl中のプラスミドpTPA
103derNdeI DNA約10μgを、10AvaII緩
衝液[0.6M NaCl、60mMトリス−HCl(pH=8.
0)、0.1M MgCl2、60mM 2−メルカプトエタノ
ール、および1mg/ml BSA]2μlおよび水6μlに加
えた。このDNA溶液に、制限酵素AvaII約2μl(〜
10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間イ
ンキュベートした。〜1.4kb制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このAvaII消化したDN
Aをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いでこのプラ
スミドpTPA103derNdeIの〜1.4kb AvaII制
限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント
約2μgを得、これをTE緩衝液5μlに懸濁した。 【0142】この〜1.4kb AvaII制限フラグメント
の溶液に、10×クレノウ緩衝液約5μl、水35μl、
およびクレノウ酵素5μl(〜5単位)を加え、得られた
反応液を16℃で30分間インキュベートした。このク
レノウ処理したDNAをエタノールで沈澱させ、10×
リガーゼ緩衝液3μlおよび水14μlに再懸濁した。 【0143】実質的に実施例10Aの方法に従って、配
列: 【化19】 で示されるHpaIリンカー約2μgをキナーゼ処理し
た。クレノウ処理した、プラスミドpTPA103derN
deIの〜1.4kb AvaII制限フラグメントの溶液に、
このキナーゼ処理したリンカー約10μlを、T4 DN
Aリガーゼ2μl(〜1000単位)およびT4 RNAリ
ガーゼ1μl(〜1単位)とともに加え、得られた反応液
を16℃で一晩インキュベートした。 【0144】このライゲート化DNAをフェノールで1
回、クロロホルムで2回抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、10×EcoRI緩衝液2μlおよび水16μlに再懸
濁した。このDNA溶液に、制限酵素EcoRI約2μl
(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。このEcoRI消化したDNAをフ
ェノールで1回、クロロホルムで2回抽出し、エタノー
ルで沈澱させ、10×リガーゼ緩衝液3μlおよび水2
0μlに再懸濁した。このようにして調製した、約77
0bpの大きさの、trpPOおよびTPAのアミノ末端を
コードしているフラグメントは、EcoRI適合末端を1
つおよび平滑末端を1つ有しており、これをEcoRI−
SmaI消化したプラスミドpUC19にライゲートして
プラスミドpUC19TPAFEを得た。 【0145】プラスミドpUC19[ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ(BRL)から入手可能]約2μlを、1
0×SmaI緩衝液[0.2M KCl、60mMトリス−H
Cl(pH=8.0)、60mM MgCl2、60mM 2−メル
カプトエタノール、および1mg/ml BSA]2μlおよ
び水16μlに溶解した。このDNA溶液に、制限酵素
SmaI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を
25℃で2時間インキュベートした。このSmaI消化し
たプラスミドpUC19 DNAをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、10×EcoRI緩衝液2μlおよび
水16μlに再懸濁した。このSmaI消化したプラスミ
ドpUC19 DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約2μ
l(〜10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時
間インキュベートした。このEcoRI−SmaI消化した
プラスミドpUC19 DNAをフェノールで1回、クロ
ロホルムで2回抽出し、TE緩衝液5μlに再懸濁し
た。 【0146】EcoRI−SmaI消化したプラスミドpU
C19 DNAを、プラスミドpTPA103derNdeI
由来の〜770bp EcoRI−平滑末端制限フラグメン
トを含有する容器に加えた。このDNA混合物に、T4
DNAリガーゼ約2μl(〜1000単位)を加え、得ら
れた反応液を16℃で一晩インキュベートした。このラ
イゲート化DNAは目的のプラスミドpUC19TPA
FEからなっていた。プラスミドpUC19TPAFE
の制限部位および機能地図を添付の図14、図15、図
16および図17に示す。 【0147】プラスミドpUC19TPAFEの構築に
用いるEcoRIおよびSmaI認識配列を含有する、プラ
スミドpUC19の多重クローニング部位は、lacZ α
フラグメントのコード化配列内に位置している。lacZ
ΔM15突然変異(βガラクトシダーゼをコードしてい
るlacZ遺伝子における突然変異)を含有する細胞におい
てこのlacZ αフラグメントを発現させると、これらの
細胞は機能的なβガラクトシダーゼ分子を発現し、従っ
てこれらの細胞はX−ガル(5−ブロモ−4−クロロ−
3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;無色の
化合物)をそのインジゴ色の加水分解産物に加水分解す
る。プラスミドpUC19の多重クローニング部位にD
NAを挿入すると、lacZ αフラグメントのコード化配
列が乱され、lacZ ΔM15突然変異を有する(そのよ
うなプラスミドを有する)細胞はX−ガルを加水分解す
ることができない(プラスミドpUC8にクローニングす
るときに同じ原理を用いる;実施例2参照)。プラスミド
pUC19TPAFEからなるこのライゲート化DNA
を用い、実質的に実施例2の方法に従って、形質転換用
にコンピテントにしたE.コリK12 RR1ΔM15
(NRRL B−15440)細胞を形質転換した。 【0148】形質転換細胞を、100μg/mlアンピシ
リン、40μg/ml X−ガル、および1mM IPTGを
含有するL−寒天で平板培養した。インジゴ色を呈しな
いコロニーを継代培養し、これを用いてプラスミドDN
Aを調製し、プラスミドDNAの制限酵素分析によって
E.コリK12 RR1ΔM15/pUC19TPAFE
形質転換体を同定した。後の構築にもちいるため、プラ
スミドpUC19TPAFE DNAを、実質的に実施例
3の方法に従って、E.コリK12 RR1ΔM15/p
UC19TPAFE細胞から単離した。 【0149】TE鑑賞液20μl中のプラスミドpUC1
9TPAFE約7μgを、10×HpaI緩衝液[0.2M
KCl、0.1Mトリス−HCl(pH=7.4)、および
0.1M MgCl2]10μlおよび水70μlに加えた。こ
のプラスミドpUC19TPAFE DNAの溶液に、制
限酵素HpaI約3μl(〜6単位)を加え、得られた反応
液を37℃で20分間インキュベートした(この短い反
応時間は部分的にHpaI消化するために設定した)。こ
の反応液を、1×BamHI緩衝液[150mM NaCl、
10mMトリス−HCl(pH=8.0)、および10mM M
gCl2;塩濃度を高くするとHpaIを不活性化する]15
0μlに調整した。この部分的にHpaI消化したDNA
の溶液に、制限酵素BamHI約1μl(〜16単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。 【0150】このBamHI−HpaI部分消化プラスミド
pUC19TPAFE DNAをエタノール沈澱で濃縮
し、1.5%アガロースゲルにかけた。次いで、目的の
フラグメントを含有するゲルセグメントを切り出し、セ
グメントを凍結させ、次いでセグメントから液体を圧搾
することによって、プラスミドpUCATPAFEのレ
プリコン、βラクタマーゼ遺伝子、およびTPAコード
化DNAのすべてを含有する〜3.42kb HpaI−Bam
HI制限フラグメントをゲルから単離した。エタノール
沈澱によって液体からDNAを沈澱させた。目的のフラ
グメントが約1μg得られ、これをTE緩衝液20μlに
懸濁した。 【0151】TE緩衝液10μl中のプラスミドpTPA
103約10μgを、10×ScaI緩衝液[1.0M Na
Cl、60mMトリス−HCl(pH=7.4)、60mM Mg
Cl2、10mM DTT、および1mg/ml BSA]10μ
lおよび水80μlに加えた。このプラスミドpTPA1
03 DNAの溶液に、制限酵素ScaI約3μl(〜18
単位)を加え、得られた反応液を37℃で90分間イン
キュベートした。この反応液の容積を、1×BamHI緩
衝液で150μlに調整し、この混合物に制限酵素Bam
HI約1μl(〜16単位)を加え、得られた反応液を3
7℃で90分間インキュベートした。このDNAをエタ
ノールで沈澱させ、遠心して集め、電気泳動用の調製物
に再懸濁した。このScaI−BamHI消化したプラスミ
ドpTPA103 DNAを、〜1.015kb ScaI−B
amHI制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。プラス
ミドpTPA103のTPAカルボキシ末端コード化D
NAを含有する〜1.015kb ScaI−BamHI制限フ
ラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント約
0.5μgを得、これをガラス蒸留した水20μlに溶解
した。 【0152】プラスミドpTPA103の〜1.015kb
ScaI−BamHI制限フラグメント2μlに、プラスミ
ドpUC19TPAFEの〜3.42kb BamHI−Hpa
I制限フラグメント約2μlを、10×リガーゼ緩衝液
2μlおよびT4 DNAリガーゼ1μl[〜1バイス(We
iss)単位;このリガーゼはプロメガ・バイオテック(Pro
mege Biotec,2800 S.Fish Hatchery Road,Ma
dison,WI 53711)から入手した]とともに加え、
得られた反応液を16℃で一晩インキュベートした。こ
のライゲート化DNAは目的のプラスミドpBW25か
らなっていた。このプラスミドpBW25の制限部位お
よび機能地図を添付の図14、図15、図16および図
17に示す。 【0153】50mM CaCl2を用いること以外は実質
的に実施例2の方法に従い、このライゲート化DNAを
用いて形質転換用にコンピテントにしておいたE.コリ
K12 JM105(BRLから入手できる)を形質転換
した。形質転換細胞を1000μg/mlアンピシリン含
有のBHI[ディフコ・ラボラトリーズ(Difco Labora
tories,Detroit,MI)]で平板培養し、プラスミドDN
Aの制限酵素分析によってE.コリK12 JM105/
pBW25形質転換体を同定した。プラスミドpBW25
を制限酵素EcoRIで消化すると、〜3.38kbおよび
〜1.08kb制限フラグメントが得られる。後の構築に
もちいるため、実質的に実施例3の方法に従って、プラ
スミドpBW25を調製した。 【0154】C.TPAコード化領域の部位特異的な突
然変異誘発およびプラスミドpBW28の構築 ガラス蒸留した水10μl中のプラスミドpBW25約5
μgを、10×HindIII反応緩衝液約10μlおよび
水80μlに加えた。このプラスミドpBW25DNAの
溶液に、制限酵素HindIII約1μl(〜20単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。このHindIII消化したプラスミドpBW25
DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約3μl(〜24単
位)および1M トリス−HCl(pH=7.6)10μlを加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。このEcoRI−HindIII消化したプラスミドp
BW25 DNAをエタノール沈澱で濃縮し、〜810b
p EcoRI−HindIII制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、1.5%アガロースゲル電気泳
動にかけた。〜810bp EcoRI−HindIII制限フ
ラグメント約0.5μgをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製し、これをガラス蒸留した水20μlに再懸
濁した。 【0155】ガラス蒸留した水35μl中の複製型(R
F)のM13mp8 DNA(ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手できる)約4.5μgを、10×HindI
II緩衝液10μlおよび水55μlに加えた。このM1
3mp8 DNAの溶液に、制限酵素HindIII約1μl
(〜20単位)を加え、得られた反応液を37℃で1時間
インキュベートした。このHindIII消化したM13m
p8 DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約3μl(〜24
単位)および1M トリス−HCl(pH=7.6)約10μl
を加え、得られた反応液を37℃で1時間インキュベー
トした。このHindIII−EcoRI消化したM13mp
8 DNAをエタノール沈澱で集め、アガロースゲル電
気泳動用の調製物に再懸濁し、ゲル電気泳動によって大
きい制限フラグメントをゲルから単離した。M13mp8
の大きいEcoRI−HindIII制限フラグメント約1
μgが得られ、これをガラス蒸留した水20μlに懸濁し
た。M13mp8の大きいEcoRI−HindIII制限フ
ラグメント約2μl、10×リガーゼ緩衝液2μl、水1
2μl、およびT4 DNAリガーゼ〜1μl(〜1バイス
単位)を、プラスミドpBW25の〜810bp EcoRI
−HindIII制限フラグメント3μlに加え、得られた
ライゲーション反応液を16℃で一晩インキュベートし
た。 【0156】トランスフェクションに用いるDNAの量
を変えること以外は、実質的にBRL M13 クローニ
ング/'ジデオキシ'シークエンシング・インストラクシ
ョン・マニュアル(BRL M13 Cloning/'Dideox
y'Sequencing InstructionManual)記載の方法に従っ
て、E.コリJM103細胞(BRLから入手可能)をコ
ンピテントにし、ライゲーション混合物でトランスフェ
クションした。挿入によるβガラクトシダーゼ αフラ
グメントをコードしている遺伝子の不活性化(これによ
り、X−ガルをそのインジゴ色の切断産物に切断する能
力が失われる)によって組換え体プラークを同定した。
スクリーニングするため、白いプラーク6個をLブロス
2.5mlに入れ、これに、最小培地ストックで培養してp
roABを有するFエピソームの保持を確実なものにし
た、E.コリK12 JM103(0.4ml)を、対数増殖
期において加えた。このプラークを含有する溶液を、エ
アー振盪器中、37℃で8時間インキュベートした。こ
の溶液1.5mlから得た細胞をペレット化し、実質的に
バーンボイムおよびドーリィ[Birnboim and Doly,Nu
c.Acids Res.,7:1513(1979)]のアルカリ・
ミニスクリーン法に従って、RF DNAを単離した。
各培養物の残りは4℃で保存した。目的のファージ(pM
8BW26と命名した)は、M13mp8の〜7.2kb Ec
oRI−HindIII制限フラグメントにライゲートした
プラスミドpBW25の〜810bp EcoRI−HindI
II制限フラグメントを含有していた。 【0157】対数期のE.コリ JM103約50mlをp
M8BW26で感染させ、エアー振盪器中、37℃で1
8時間インキュベートした。低速遠心することによって
感染細胞をペレット化し、上記インストラクション・マ
ニュアルの方法をスケールアップすることによって培養
物上清から1本鎖pM8BW26 DNAを調製した。ク
レノウ反応を、室温で30分間、次いで37℃で60分
間、次いで10℃で18時間行うこと以外は、実質的に
アデルマン等[Adelman et al.,DNA 2(3):183
−193(1983)]の教示に従って、1本鎖pM8BW
26を突然変異誘発にかけた。さらに、S1処理を20
℃で行ない、緩衝液の塩濃度を製造元推奨の半分にし、
そしてM13配列決定(シークエンシング)プライマー
(BRL)を用いた。天然TPAのアミノ酸残基87から
261に対応するコード化配列を削除するために用いた
合成オリゴデオキシリボヌクレオチド・プライマーは以
下の配列で示される: 5'−GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA−3' 【0158】得られた突然変異誘発混合物を用い、実質
的に上記の感染方法に従って、E.コリK12 JM10
3をトランスフェクションした。RF DNAの制限酵
素分析、およびマクサムおよびギルバート(Maxam and
Gilbert)のDNA配列決定によって目的の突然変異体
を同定した。天然TPAのアミノ酸残基87から261
に対応するコード化配列が削除された目的の突然変異体
をpM8BW27と命名した。 【0159】プラスミドpBW28を構築するために
は、多種のDNAフラグメントが必要である。それらフ
ラグメントの最初のものを以下のようにして得た。ガラ
ス蒸留した水20μl中のRF pM8BW27 DNA〜
20μgを、10×NdeI緩衝液10μlおよび水60μ
lに加えた。このプラスミドpM8BW27 DNAの混
合物に、制限酵素NdeI約10μl(〜50単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このNdeI消化したプラスミドpM8BW27DN
Aをエタノールで沈澱させ、遠心した集め、10×Eco
RI緩衝液10μlおよび水90μlに再懸濁した。この
NdeI消化したプラスミドpM8BW27DNAの溶液
に、制限酵素EcoRI約10μl(〜50単位)を加え、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
欠失部位を含むTPAコード化配列の一部を含有する〜
560bp NdeI−EcoRI制限フラグメントが他の消
化産物から分離するまで、このEcoRI−NdeI消化し
たプラスミドpM8BW27DNAをアガロースゲル電
気泳動にかけた。この〜560bp NdeI−EcoRI制
限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント
約0.5μgを得、これをガラス蒸留した水20μlに再
懸濁した。 【0160】プラスミドpBW28の構築に必要な第2
のフラグメントは、鎖1本ずつ自動DNA合成機で合成
する。実質的に実施例6Aの方法に従って、2本の相補
的な鎖(これらは、ハイブリダイズしてXbaIおよびNd
eIの重なり部分を有する2本鎖DNAセグメントを形
成する)をキナーゼ処理し、アニーリングする。このリ
ンカーは以下の構造を有している: 【化20】 【0161】プラスミドpBW28の構築に必要な第3
のフラグメントは以下のようにして調製した。TE緩衝
液20μl中のプラスミドpTPA103(〜20μg)
を、10×BamHI緩衝液10μlおよび水60μlに加
えた。このプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、
制限酵素BamHI約10μl(〜50単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpTPA103 DNAをエ
タノールで沈澱させ、遠心して集め、10×EcoRI緩
衝液10μlおよび水80μlに再懸濁した。このBamH
I消化したプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、
制限酵素EcoRI約10μl(〜50単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。TP
Aのカルボキシ末端のコード化配列を含有する〜689
bp EcoRI−BamHI制限フラグメントが他の消化産
物から分離するまで、このBamHI−EcoRI消化した
プラスミドpTPA103 DNAをアガロースゲル電気
泳動にかけた。この〜689bpフラグメント約0.5μg
をゲルから単離し、次いでガラス蒸留した水10μlに
再懸濁した。 【0162】プラスミドpBW28の構築に必要な最後
のフラグメントはプラスミドpL110から単離した。
プラスミドpL110の制限部位および機能地図を添付
の図14、図15、図16および図17に示し、プラス
ミドpL110の構築を実施例10D(本実施例の次節)
に記載する。 【0163】TE緩衝液25μl中のプラスミドpL11
0約25μgを、10×XbaI緩衝液[0.5M NaCl、
60mM トリス−HCl(pH=7.9)、60mM MgC
l2、および1mg/ml BSA]10μlおよび水55μlに
加えた。このプラスミドpL110 DNAの溶液に、制
限酵素XbaI約10μl(〜50単位)を加え、得られた
反応液を37℃で2時間インキュベートした。このXba
I消化したプラスミドpL110 DNAをエタノールで
沈澱させ、遠心して集め、10×BamHI緩衝液10μ
lおよび水89μlに再懸濁した。このXbaI消化したプ
ラスミドpL110 DNAの溶液に、制限酵素BamHI
約1μl(〜5単位)を加え、得られた反応液を37℃で
30分間インキュベートして、BamHI部分消化物を得
た。〜6.0kb XbaI−BamHIフラグメントが他の消
化産物から明確に分離するまで、このXbaI消化−Bam
HI部分消化したプラスミドpL110 DNAをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。この〜6.0kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、約0.5μgの〜6.0kb Xba
I−BamHI制限フラグメントを得、これをガラス蒸留
した水約40μlに懸濁した。この〜6.0kb XbaI−
BamHI制限フラグメントは、EK−BGHをコードし
ているDNAを除き、プラスミドpL110のすべてを
含有している。 【0164】プラスミドpBW28を構築するため、次
のフラグメント、すなわち、プラスミドpL110の〜
6.0kb BamHI−XbaI制限フラグメント約0.1μg
(〜8μl)、プラスミドpM8BW27の〜560bp Nd
eI−EcoRI制限フラグメント約0.05μg(〜2μ
l)、プラスミドpTPA103の〜689bp EcoRI−
BamHI制限フラグメント約0.1μg(〜2μl)、およ
び〜45bp XbaI−NdeI合成リンカー約0.02μg
(〜1μl)をいっしょにして混合した。このDNA混合
物に、10×リガーゼ緩衝液約2μlおよびT4 DNA
リガーゼ1μl(〜1バイス単位)を加え、得られたライ
ゲーション反応液を4℃で一晩2時間インキュベートし
た。ライゲート化DNAは目的のプラスミドpBW28
からなっていた。このプラスミドpBW28の制限部位
および機能地図を添付の図14、図15、図16および
図17に示す。 【0165】このライゲート化DNAを用い、50mM
CaCl2を用いること以外は実質的に実施例2の方法に
従って、コンピテントにしておいたE.コリK12 MM
294(NRRL B−15625)を形質転換した。プ
ラスミドpBW28上にラムダpLプロモーターおよび感
温性ラムダpLリプレッサーをコードしている遺伝子が
存在しているため、形質転換方法および形質転換体の培
養方法を若干変えた。形質転換および次いで行う培養に
おいて、細胞を32℃以上の温度にしなかった。本実施
例の次節は、ラムダpLプロモーターおよびその感温性
リプレッサーをコードしているプロモーターの取り扱い
方法をより詳細に説明している。目的のE.コリK12
MM294/pBW28形質転換体を、そのテトラサイ
クリン耐性かつアンピシリン感受性の表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。 【0166】D.プラスミドpL110の構築 プラスミドpKC283を出発原料として用いてプラス
ミドpL110を構築した。E.コリK12 BE120
1/pKC283の凍結乾燥品を、NRRLから取得番
号NRRL B−15830のもとで入手する。この凍
結乾燥品をLブロス10ml含有の試験管に移し、32℃
で2時間インキュベートし、この時点で培養物を50μ
g/mlアンピシリンの濃度にし、次いで32℃で一晩イ
ンキュベートする。プラスミドpKC283がpLプロモ
ーターを含有し、E.コリK12 BE1201細胞が細
胞DNA内に組み込まれた感温性cIリプレッサー遺伝
子を含有するので、このE.コリK12 BE1201/
pKC283細胞を32℃で培養した。野性型ラムダpL
リプレッサー遺伝子を含有する細胞、またはラムダpL
プロモーターを含有しない細胞を、このプラスミド単離
方法に用いるときには、本明細書中の後の実施例に記載
したように、インキュベーション温度は37℃である。 【0167】一晩培養物の少量を、E.コリK12 BE
1201/pKC283の単一コロニー単離体が得られ
るような方法で、50μg/mlアンピシリン含有のL寒
天プレートで平板培養する。得られた単一コロニーを、
50μg/mlアンピシリン含有のLブロス10mlに接種
し、激しく振盪しながら32℃で一晩インキュベートし
た。この一晩培養物10mlをLブロス500mlに接種
し、培養物が定常期に到達するまで、激しく振盪しなが
ら32℃でインキュベートした。次いで、実質的に実施
例3の方法に従って、細胞からプラスミドpKC283
DNAを調製した。プラスミドpKC283が約1mg得
られ、これをTE緩衝液中、約1μg/μlの濃度で、4
℃で保存した。プラスミドpKC283の制限部位およ
び機能地図を添付の図14、図15、図16および図1
7に示す。 【0168】プラスミドpKC283 DNA約10μl
(〜10μg)を、10×中濃度塩制限緩衝液[500mM
NaCl、100mM トリス−HCl(pH=7.5)、10
0mMMgCl2、および10mM DTT]20μl、1mg/
ml BSA20μl、制限酵素PvuII 5μl(〜25単
位)、および水145μlと混合し、得られた反応液を3
7℃で2時間インキュベートした。ここに記載する制限
酵素反応は、常法により、フェノール抽出、次いでクロ
ロホルム抽出によって停止させ、DNAを沈澱させ、エ
タノールで洗浄し、そしてDNAをTE緩衝液に再懸濁
した。上記のようにしてPvuII消化を停止させた後、
PvuII消化したプラスミドpKC283 DNAを沈澱
させ、これをTE緩衝液5μlに再懸濁した。 【0169】XhoIリンカー(5'−CCTCGAGG−
3')約600ピコモル(pM)を、5×キナーゼ緩衝液[3
00mM トリス−HCl(pH=7.8)、50mM MgC
l2、および25mM DTT]10μl、5mM ATP5μ
l、水24μl、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ0.5μ
l[P−L バイオケミカルズ(P−L Biochemicals)定
義の約2.5単位]、1mg/mlBSA5μl、および10m
Mスペルミジン5μlを含有する混合物中、混合物を3
7℃で30分間インキュベートすることによってキナー
ゼ処理した。このキナーゼ処理したXbaIリンカー約1
2.5μlを、PvuII消化したプラスミドpKC283
DNA 5μlに加え、次いでこのDNA溶液に、10×
リガーゼ緩衝液2.5μl、T4 DNAリガーゼ2.5μ
l(P−Lバイオケミカルズ定義の約2.5単位)、10m
Mスペルミジン2.5μl、および水12.5μlを加え、
得られたライゲーション反応液を4℃で一晩インキュベ
ートした。ライゲーション反応の後、反応混合物を高塩
緩衝液[0.1M NaCl、0.05M トリス−HCl(pH
=7.5)、10.0mM MgCl2、および1mM DTT]
の組成に調整した。この混合物に制限酵素XhoI約10
μl(100単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。 【0170】反応を止め、XhoI消化したDNAを沈澱
させ、再懸濁し、ライゲーション混合物にXhoIリンカ
ーを加えないこと以外は上記と同様にして、ライゲート
した。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpK
C283PXからなっていた。このプラスミドpKC2
83PXの制限部位および機能地図を添付の図14、図
15、図16および図17に示す。 【0171】E.コリK12 MO(λ+)[NRRLから取
得番号NRRL B−15993のもとで入手可能]は野
性型ラムダpL cIリプレッサー遺伝子を含有している
ので、E.コリK12 MO(λ+)細胞においてはラムダp
Lプロモーターからの転写は起こらない。E.コリK1
2 MO(λ+)の単一コロニーを単離し、細胞の一晩培養
物10mlを調製する(増殖培地にアンピシリンを用いな
い)。この一晩培養物50μlを、10mM MgSO4およ
び10mM MgCl2含有のLブロス5mlに接種した。こ
の培養物を、激しく振盪しながら37℃で一晩インキュ
ベートした。翌朝、この培養物を10mM MgSO4およ
び10mM MgCl2含有のLブロスで200mlに希釈し
た。この希釈培養物を、O.D.590が約0.5(これは、
約1×108細胞/mlの細胞密度を示す)になるまで、激
しく振盪しながら37℃でインキュベートした。氷水浴
で培養物を10分間冷却し、次いで4℃、4000Xg
で10分間遠心して細胞を集めた。この細胞ペレットを
冷10mM NaCl 100mlに再懸濁し、そして直ちに
遠心して再ペレット化した。この細胞ペレットを30m
M CaCl2 100mlに再懸濁し、氷上で20分間イン
キュベートした。 【0172】もう一度遠心して細胞を集め、これを30
mM CaCl2 10mlに再懸濁した。この細胞のうち0.
5mlを上記のようにして調製したライゲート化DNA
(このDNAは30mM CaCl2にしておいた)に加え
た。この細胞−DNA混合物を氷上で1時間インキュベ
ートし、42℃で90秒間熱ショックを加え、次いで氷
上で約2分間冷却した。この細胞−DNA混合物を、1
25mlフラスコ中、LB培地で10mlに希釈し、37℃
で1時間インキュベートした。この100μlをアンピ
シリン含有のL寒天プレートにプレートし、コロニーが
現れるまで37℃でインキュベートした。 【0173】このコロニーを別々に培養し、個々のコロ
ニーのプラスミドDNAを制限酵素分析およびゲル電気
泳動で試験した。プラスミドDNAの単離は、実施例3
の方法に従って、比較的小さいスケールで行なったが、
目的のE.コリK12 MO(λ+)/pKC283PX形質
転換体が同定されるまでCsCl勾配工程は割愛した。プ
ラスミドpKC283PXの制限部位および機能地図を
添付の図14、図15、図16および図17に示す。 【0174】プラスミドpKC283PX DNA10μ
gを、10×高塩緩衝液20μl、1mg/ml BSA20
μl、制限酵素BglII 5μl(〜50単位)、制限酵素
XhoI5μl(〜50単位)、および水150μlに溶解
し、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。反応を止め、BglII−XhoI消化したDNAを沈
澱させ、このDNAをTE緩衝液5μlに再懸濁した。 【0175】BglIIおよびXhoI制限酵素切断の特徴
を示す1本鎖DNA末端を有するDNAリンカーを、自
動DNA合成機を用いて合成し、実施例6Aの記載と同
様にしてキナーゼ処理した。このDNAリンカーは次の
構造を有していた: 【化21】このリンカーおよびBglII−XhoI消化したプラス
ミドpKC283PXを、実質的に上記ライゲーション
法に従ってライゲートした。このライゲート化DNAは
目的のプラスミドpKC283−Lからなっていた。こ
のプラスミドpKC283−Lの制限部位および機能地
図を添付の図14、図15、図16および図17に示
す。このプラスミドpKC283−L DNAを用いて
E.コリK12 MO(λ+)を形質転換し、得られたE.コ
リK12 MO(λ+)/pKC283−L形質転換体を、
そのアンピシリン耐性の表現型およびプラスミドDNA
の制限酵素分析によって同定した。 【0176】プラスミドpKC283−L DNA約10
μgを、10×高塩緩衝液20μl、1mg/ml BSA2
0μl、制限酵素XhoI 5μl(〜50単位)、および水
155μlに溶解し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。次いで、XhoI消化したプラスミ
ドpKC283−L DNAを沈澱させ、これを10×ニ
ックトランスレーション緩衝液[0.5M トリス−HCl
(pH=7.2)、0.1MMgSO4、および1mM DTT]
2μl、デオキシヌクレオチド三リン酸それぞれが2mM
である溶液1μl、水15μl、クレノウ1μl(P−L
バイオケミカルズ定義の〜6単位)、および1mg/mlB
SA1μlに再懸濁した。得られた反応液を25℃で3
0分間インキュベートし、この溶液を70℃で5分間イ
ンキュベートすることによって反応を止めた。 【0177】実質的に、上記のリンカーライゲーション
法に従って、BamHIリンカー(5'−CGGGATCC
CG−3')をキナーゼ処理し、これを、XhoI消化し、
クレノウ処理したプラスミドpKC283−L DNAに
ライゲートした。ライゲーション反応の後、このDNA
を高塩緩衝液中、37℃で約2時間、BamHI約100
単位で消化した。BamHI消化の後、実質的に上記の方
法に従って、DNAをライゲーション用に調製し、〜
5.9kb BamHI制限フラグメントをライゲートして環
化し、E.コリK12 MO(λ+)に導入して形質転換し
た。実質的に実施例3の方法に従って、E.コリK12
MO(λ+)/pKC283−LB形質転換体を同定し、
次いでプラスミドpKC283−LB DNAを形質転換
体から調製した。このプラスミドpKC283−LBの
制限部位および機能地図を添付の図14、図15、図1
6および図17に示す。 【0178】実質的に上記方法に従って、プラスミドp
KC283PX約10μgを、高塩緩衝液中、制限酵素
SalIで消化し、クレノウで処理し、EcoRIリンカー
(5'−GAGGAATTCCTC−3')にライゲートし
た。制限酵素EcoRIによる消化(これにより〜2.1kb
DNAが削除される)の後、〜4.0kb EcoRI制限フ
ラグメントをライゲーションにより環化してプラスミド
pKC283PRSを得た。実質的に実施例3の方法に
従って、このライゲート化DNAを用いてE.コリK1
2 MO(λ+)を形質転換し、E.コリK12 MO(λ+)
/pKC283PRS形質転換体を同定した後、形質転
換体からプラスミドpKC283PRS DNAを調製し
た。このプラスミドpKC283PRSの制限部位およ
び機能地図を添付の図14、図15、図16および図1
7に示す。 【0179】プラスミドpKC283PRS約10μg
を、高塩緩衝液200μl中、制限酵素PstIおよびSp
hIそれぞれ約50単位で消化した。この反応液を37
℃で約2時間インキュベートした後、反応混合物を、ト
リス−アセテート緩衝液中、0.6%低ゲル化温度アガ
ロース[FMC社(FMC Corporation,Marine Collo
ids Division,Rockland,Maine 04841)ゲルで、
2〜3時間、〜130Vおよび〜75mAで電気泳動し
た。 【0180】ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液で染色
し、〜0.85kb PstI−SphI制限フラグメントを含
有するDNAバンド(長波長UV光で目に見えるように
した)をゲルから小さいセグメントとして切り出した。
セグメントの重量および密度からセグメントの体積を測
定し、等容量の10mM トリス−HCl(pH=7.6)を
セグメントを含む試験管に加えた。次いで72℃でイン
キュベートしてセグメントを溶融した。約100μl容
量中に、プラスミドpKC283PRSの〜0.85kb
PstI−SphI制限フラグメントが約1μg得られた。
同様の方法により、プラスミドpKC283−LBを制
限酵素PstIおよびSphIで消化し、得られた〜3.0k
b 制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって
単離し、ライゲーション用に調製した。 【0181】プラスミドpKC283PRSの〜0.85
kb PstI−SphI制限フラグメントをプラスミドpKC
283−LBの〜3.0kb PstI−SphI制限フラグメ
ントにライゲートした。このライゲート化DNAは目的
のプラスミドpL32からなっていた。プラスミドpL3
2の制限部位および機能地図を添付の図14、図15、
図16および図17に示す。プラスミドpL32をE.コ
リK12 MO(λ+)細胞に導入して形質転換し、実質的
に実施例3の方法に従って、E.コリK12 MO(λ+)
/pL32形質転換体からプラスミドpL32 DNAを
調製した。プラスミドpL32 DNAの分析により、プ
ラスミドpKC283PXのクレノウ処理したSalI末
端に1以上のEcoRIリンカーが結合していることがわ
かった。1以上のEcoRIリンカーの存在は、プラスミ
ドpL32またはプラスミドpL32誘導体の有用性に影
響せず、これをXhoI制限部位(この部位は2個のEco
RIリンカーがライゲートしたときに生成する)の存在
によって検出することができる。 【0182】プラスミドpCC101はショーナー等[S
choner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,
5403−5407(1984)]が開示している。ショ
ーナー等はプラスミドpCC101をプラスミドpCZ1
01と称している。プラスミドpCC101の制限部位
および機能地図を添付の図14、図15、図16および
図17に示す。EK−BGHをコードしているDNAを
単離するため、プラスミドpCC101約10μgを、制
限酵素XbaIおよびBamHIそれぞれを約50単位含有
する高塩緩衝液200μl中で消化した。この消化産物
をアガロースゲル電気泳動によって分離し、EK−BG
Hをコードしている〜0.6kb XbaI−BamHI制限フ
ラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製
した。 【0183】また、プラスミドpL32も制限酵素Xba
IおよびBamHIで消化し、〜3.9kb制限フラグメン
トを単離し、ライゲーション用に調製した。このプラス
ミドpL32の〜3.9kb XbaI−BamHI制限フラグ
メントを、プラスミドpCC101の〜0.6kb XbaI
−BamHI制限フラグメントにライゲートしてプラスミ
ドpL47を得た。プラスミドpL47の制限部位および
機能地図を添付の図14、図15、図16および図17
に示す。プラスミドpL47をE.コリK12 MO(λ+)
に導入して形質転換し、E.コリK12 MO(λ+)/pL
47形質転換体を同定した。実質的に実施例3の方法に
従って、形質転換体からプラスミドpL47 DNAを調
製した。 【0184】プラスミドpPR12は、感温性pLリプレ
ッサー遺伝子cI857およびプラスミドpBR322の
テトラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。プラ
スミドpPR12は、1984年3月13日発行の米国
特許No.4,436,815に記載され、特許請求されて
いる。プラスミドpPR12の制限部位および機能地図
を添付の図14、図15、図16および図17に示す。 【0185】プラスミドpPR12約10μgを、高塩緩
衝液200μl中、37℃で2時間、制限酵素EcoRI
約50単位で消化した。実質的に上記方法に従って、こ
のEcoRI消化したプラスミドpPR12DNAを沈澱
させ、次いでクレノウで処理した。クレノウ反応の後、
このEcoRI消化し、クレノウ処理したプラスミドpP
R12 DNAをライゲートして再環化し、目的のプラ
スミドpPR12ΔR1からなるこのライゲート化DN
Aを用いてE.コリK12 RV308(NRRLB−1
5624)を形質転換した。形質転換体はテトラサイク
リン(10μg/ml)耐性に基いて選択した。実質的に実
施例3の方法に従って、E.コリK12RV308/pP
R12ΔR1形質転換体を同定した後、プラスミドpP
R12ΔR1DNAを形質転換体から調製した。 【0186】プラスミドpPR12ΔR1約10μgを、
中塩緩衝液200μl中、37℃で2時間、制限酵素Av
aI約50単位で消化した。このAvaI消化したプラス
ミドpPR12ΔR1 DNAを沈澱させ、次いでクレノ
ウで処理した。クレノウ反応の後、このAvaI消化し、
クレノウ処理したプラスミドpPR12ΔR1 DNAを
EcoRIリンカー(5'−GAGGAATTCCTC−
3')にライゲートし、沈澱させ、制限酵素EcoRIを約
50単位含有する高塩緩衝液約200μlに再懸濁し、
37℃で約2時間インキュベートした。このEcoRI消
化の後、反応混合物を低溶融アガロースゲルにかけ、〜
5.1kb EcoRI制限フラグメントをゲルから精製し、
ライゲーションによって再環化して目的のプラスミドp
PR12AR1を得た。このプラスミドpPR12AR
1 DNAをE.コリK12 RV308に導入して形質
転換した。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐性に
基いて行った。実質的に実施例3の方法に従って、プラ
スミドpPR12AR1 DNAを形質転換体から調製し
た。プラスミドpPR12AR1の制限部位および機能
地図を添付の図14、図15、図16および図17に示
す。 【0187】プラスミドpPR12AR1 DNA約10
μgを、制限酵素PstIおよびEcoRIそれぞれを約5
0単位含有する高塩緩衝液約200mlに懸濁し、この消
化反応液を37℃で約2時間インキュベートした。次い
で、反応混合物をアガロースゲルにかけ、プラスミドp
PR12AR1の〜2.9kb PstI−EcoRI制限フラ
グメントを単離し、ライゲーション用に調製した。 【0188】プラスミドpL47約10μgを、高塩緩衝
液200μl中、37℃で2時間、制限酵素PstIおよ
びBamHIで消化した。このPstI−BamHI消化した
DNAをアガロースゲルにかけ、複製起源およびアンピ
シリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜2.7kb Pst
I−BamHI制限フラグメントを単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。別の反応液において、プラスミドpL
47 DNA約10μgを、高塩緩衝液200μl中、
37℃で2時間、制限酵素EcoRIおよびBamHIで消
化し、ラムダpL転写活性化配列、E.コリ lpp翻訳活性
化配列、およびEK−BGHをコードしているDNAを
含有する〜1.03kb EcoRI−BamHI制限フラグメ
ントを単離し、ライゲーション用に調製した。 【0189】プラスミドpL47の〜2.7kb PstI−
BamHIおよび〜1.03kb EcoRI−BamHI制限フ
ラグメントを、プラスミドpPR12AR1の〜2.9kb
PstI−EcoRI制限フラグメントにライゲートして
プラスミドpL110を構築し、このライゲート化DN
Aを用いてE.コリK12RV308を形質転換した。
テトラサイクリン耐性に基いて形質転換体を選択した。 【0190】2つのPstI制限酵素認識部位が、EK−
BGHコード化領域に存在する(添付図の制限部位およ
び機能地図には記載されていない)。プラスミドpL11
0の制限部位および機能地図を添付の図14、図15、
図16および図17に示す。 【0191】E.最終的なプラスミドpBW32の構築 プラスミドpSV2−β−グロビンDNA(NRRL B
−15928)約10μgを10×HindIII反応緩衝
液10μl、制限酵素HindIII 5μl(〜50単位)、
および水85μlに溶解し、この反応液を2時間37℃
に保った。次いでこの反応混合物を0.15M LiClと
し、2.5倍量のエタノール加え、ドライアイス−エタ
ノール浴でインキュベートした後、遠心してDNAをペ
レット化した。 【0192】このDNAペレットを、10×BglII緩
衝液10μl、制限酵素BglII5μl(〜50単位)、お
よび水85μlに溶解し、この反応液を2時間37℃に
保った。このBglII消化の後、反応混合物を0.85
%アガロースゲル電気泳動にかけ、フラグメントを分離
した。前記と同様にして、臭化エチジウムおよび紫外光
を用いてゲルを可視化し、目的の〜4.2kb HindII
I−BglIIフラグメントを含有するバンドをゲルから
切り出した。ペレットを水10μlに再懸濁した。この
ペレットは目的のプラスミドpSV2−β−グロビンの
〜4.2kb HindIII−BglII制限フラグメント〜
5μgからなっていた。実質的に上記教示に従って、T
PAをコードしているプラスミドpTPA103の〜2.
0kb HindIII−BamHI制限フラグメントをプラス
ミドpTPA103から単離した。プラスミドpTPA1
03の〜2.0kb HindIII−BamHI制限フラグメ
ント約5μgが得られ、水10μlに懸濁し、−20℃で
保存した。 【0193】プラスミドpSV2−β−グロビンの〜4.
2kb BglII−HindIII制限フラグメント2μlお
よびプラスミドpTPA103の〜2.0kb HindIII
−BamHIフラグメント4μlをいっしょにして混合
し、次いで10×リガーゼ緩衝液2μl、水11μl、お
よびT4 DNAリガーゼ1μl(〜500単位)とともに
4℃で一晩インキュベートした。このライゲート化DN
Aは目的のプラスミドpTPA301からなっていた。
このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の図1
4、図15、図16および図17に示す。実質的に実施
例3の教示に従い、このライゲート化DNAを用いて、
形質転換用にコンピテントにしたE.コリK12 RR1
細胞(NRRL B−15210)を形質転換した。実質
的に実施例3の方法に従って、E.コリK12 RR1/
pTPA301形質転換体からプラスミドDNAを得
た。 【0194】プラスミドpSV2−dhfrは、ジヒドロ葉
酸還元酵素(dhfr)遺伝子に共有結合したDNAの増幅お
よび形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるdhfr
遺伝子を含有している。プラスミドpSV−dhfr[E.コ
リK12 HB101/pSV2−dhfr(ATCC 371
46)から単離した]10μgを、10×PvuII緩衝液
10μl、PvuII制限酵素2μl(〜20単位)、および
水88μlと混合し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。フェノールおよびクロロホルム抽
出によって反応を止め、次いでこのPvuII消化したプ
ラスミドpSV2−dhfr DNAを沈澱させ、遠心して集
めた。 【0195】以下の方法により、BamHIリンカー(5'
−CGGATCCCG−3')をキナーゼ処理しライゲー
ション用に調製した。水5μl中のリンカー1μgに、5
×キナーゼ塩[300mM トリス−HCl(pH=7.8)、
50mM MgCl2、および25mM DTT]10μl、5m
M ATP 5μl、1mg/ml BSA 5μl、10mMス
ペルミジン5μl、水19μl、および10単位/μlポ
リヌクレオチドキナーゼ1μlを加えた。次いでこの反
応液を37℃で60分間インキュベートし、−20℃で
保存した。PvuII消化したプラスミドpSV2−dhfr
5μl(〜5μg)およびキナーゼ処理したBamHIリンカ
ー12μl(〜.25μl)を混合し、水11μl、10×リ
ガーゼ緩衝液2μlおよびT4 DNAリガーゼ1μl(〜
1000単位)とともに16℃で一晩インキュベートし
た。 【0196】このライゲーション反応混合物に、10×
BamHI反応緩衝液10μl、BamHI制限酵素10μl
(〜50単位)、および水48μlを加え、次いでこの溶
液を37℃で3時間インキュベートした。この反応液を
1%アガロースゲルにかけ、dhfr遺伝子を含有する目的
の〜1.9kbフラグメントをゲルから単離した。これら
の実施例で行なったリンカー付加のすべては、常法によ
りアガロースゲルで精製して最終ベクターにおける多重
リンカー配列の可能性を減少させた。得られたフラグメ
ント〜3μgをTE緩衝液10μlに懸濁した。 【0197】次に、プラスミドpTPA301約15μl
(〜1μg)を、上記のようにしてBamHI制限酵素で消
化した。プラスミドpTPA301にはBamHI部位が
1つしか存在しないので、このBamHI消化により直線
状のプラスミドpTPA301DNAが生成する。この
BamHI消化したプラスミドpTPA301をエタノー
ルで沈澱させ、水94μlに再懸濁し、ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ[コラボレーティブ・リサーチ社(Colla
borative Research,Inc.,128 Spring Street,L
exington,MA 02173)]1μlおよび1Mトリス−
HCl(pH=9.0)5μlを用いて65℃で45分間ホス
ファターゼ処理した。このDNAをフェノール:クロロ
ホルムで抽出し、次いでクロロホルム:イソアミルアル
コールで抽出し、エタノール沈澱し、水20μlに再懸
濁した。ホスファターゼ処理したプラスミドpTPA3
01(10μl:〜0.25μg)を、BamHI 5μl、dhfr
遺伝子を含有する制限フラグメント(〜1.5μg)、10
×リガーゼ緩衝液3μl、T4DNAリガーゼ3μl(〜
1500単位)、および水9μlに加えた。このライゲー
ション反応液を15℃で一晩インキュベートした。この
ライゲート化DNAは目的のプラスミドpTPA303
DNAからなっていた。 【0198】プラスミドpTPA303を用いてE.コリ
K12 RR1(NRRL B−15210)を形質転換
し、得られたE.コリK12 RR1/pTPA303形
質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。実
質的に実施例3の方法に従って、プラスミドpTPA3
03を形質転換体から単離した。 【0199】pBR322レプリコンおよびプラスミドp
TPA301由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードし
ている〜2.7kb EcoRI−BglII制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpTPA301約10μg
を、全反応液容量400μl中、37℃で、1×BglI
I緩衝液中のBglII制限酵素20単位で完全に消化し
た。このBglII消化の後、トリス−HCl濃度を11
0mMに調整し、BglII消化したDNAにEcoRI制
限酵素20単位を加えた。〜2.7kb EcoRI−BglI
I制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、
このEcoRI−BglII消化したDNAをアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、次いで〜2.7kbフラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。 【0200】dhfr遺伝子を含有する制限フラグメントを
単離するため、プラスミドpTPA303をHindIII
およびEcoRI制限酵素で2重に消化し、dhfr遺伝子を
含有する〜2340bp EcoRI−HindIII制限フラ
グメントを単離し、回収した。 【0201】TPAのカルボキシ末端コード化領域およ
びSV40プロモーターを含有するプラスミドpTPA
303の〜2kb HindIII−SstI制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpTPA303を、1×Hi
ndIII緩衝液中、HindIIIおよびSstI制限酵素
で2重に消化した。〜1.7kbフラグメントをゲルから
単離し、ライゲーション用に調製した。 【0202】改良型TPAのアミノ末端コード化領域を
含有するプラスミドpBW28の〜680bp XhoII
(ライゲーションに対してはBglII重なり部分と適合
しうる)−SstI制限フラグメントを単離するため、プ
ラスミドpBW28約10μgを、1×XhoII緩衝液
[0.1M トリス−HCl(pH=8.0)、0.1M MgCl
2、0.1%トリトンX−100、および1mg/ml BS
A]中、XhoII酵素で完全に消化した。このXhoII
消化したDNAをエタノール沈澱で回収し、次いでSst
I酵素で完全に消化した。このXhoII−SstI消化し
たDNAをアクリルアミドゲルにかけ、目的のフラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。 【0203】上記のフラグメント、すなわちプラスミド
pTPA301の〜2.7kb EcoRI−BglII制限フ
ラグメント、プラスミドpTPA303の〜2.34kb
EcoRI−HindIII制限フラグメント、プラスミドp
TPA303の〜1.7kb SstI−HindIII制限フ
ラグメント、およびプラスミドpBW28の〜0.68kb
SstI−XhoII制限フラグメントそれぞれ約0.1μ
gをいっしょにしてライゲートし、プラスミドpBW32
を得た。このライゲーション混合物を用い、50mM C
aCl2を用いること以外は実施例2の教示のようにし
て、E.コリK12MM294を形質転換した。形質転
換体をそのアンピシリン耐性の表現型およびそのプラス
ミドDNAの制限分析によって同定した。実質的に実施
例3の方法に従って、E.コリK12 MM294/pB
W32形質転換体からプラスミドpBW32 DNAを得
た。このプラスミドpBW32の制限部位および機能地
図を添付の図14、図15、図16および図17に示
す。 【0204】実施例11 プラスミドpLPChd1、pL
PChd2、pLPCdhfr1およびpLPCdhfr2の構築 A.プラスミドpLPChd1およびpLPChd2の構築 TE緩衝液20μl中のプラスミドpBW32約20μg
を、10×BamHI緩衝液10μlおよび水60μlに加
えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、制限
酵素BamHI約10μl(〜50単位)を加え、得られた
反応液を37℃で2時間インキュベートした。このBam
HI消化したプラスミドpBW32 DNAをエタノール
で沈澱させ、遠心して集め、10×クレノウ緩衝液5μ
l、水45μlおよびクレノウ酵素2μl(〜100単位)
に再懸濁した。この反応液を16℃で30分間インキュ
ベートし、次いで消化産物が明確に分離するまでこの反
応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に
実施例4Aの方法に従って、dhfr遺伝子を含有する、プ
ラスミドpBW32の〜1.9kb クレノウ処理化BamH
I制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。目的のフラグメントが約4μg得られ、
これをTE緩衝液5μlに懸濁した。 【0205】TE緩衝液100μl中のプラスミドpLP
Chyg1約200μgを、10×EcoRI緩衝液15μl
および水30μlに加えた。このプラスミドpLPChyg
1 DNAの溶液に、制限酵素EcoRI約5μl(〜50
単位)を加え、得られた反応液を37℃で10分間イン
キュベートした。この短い反応時間は、部分的なEcoR
I消化物が得られるように算出したものである。プラス
ミドpLPChyg1はEcoRI制限部位を2箇所有してお
り、そのうちの1箇所は、ハイグロマイシン耐性付与
(HmR)遺伝子のコード化配列内に存在している。この
HmR遺伝子内ではないプラスミドpLPChyg1のEco
RI部位に、dhfr遺伝子を含有している制限フラグメン
トを挿入することが望ましい。1箇所だけ切断したプラ
スミドpLPChyg1 DNAが未切断プラスミドDNA
およびその他の消化産物から分離するまで、この部分に
EcoRI消化したプラスミドpLPChyg1 DNAをア
ガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例4Aの
方法に従って、この1箇所だけ切断したDNAをゲルか
ら単離し、ライゲーション用に調製した。1箇所だけE
coRI切断したプラスミドpLPChyg1が約2μg得ら
れ、これをTE緩衝液25μlに懸濁した。この試料
に、クレノウ酵素約5μl(〜25単位)、10×クレノ
ウ緩衝液5μl、および水40μlを加え、得られた反応
液を16℃で60分間インキュベートした。このクレノ
ウ処理し、部分的にEcoRI消化したDNAを、フェノ
ールで2回、次いでクロロホルムで1回抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、TE緩衝液25μlに再懸濁した。 【0206】プラスミドpBW32の〜1.9kbのクレノ
ウ処理したBamHI制限フラグメント約5μl、および
1箇所だけEcoRI切断したプラスミドpLPChyg1
DNA約5μlをいっしょにして混合し、このDNA混
合物に、10×リガーゼ緩衝液1μl、水5μl、T4
DNAリガーゼ1μl(〜500単位)、およびT4 RN
Aリガーゼ1μl(〜2単位)を加え、得られた反応液を
16℃で一晩インキュベートした。このライゲート化D
NAは目的のプラスミドpLPChd1およびpLPChd2
(これらは、dhfr遺伝子を含有している〜1.9kbフラグ
メントの配向だけが異なっている)からなっていた。 【0207】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、形質転換用にコンピテントに
しておいたE.コリK12 HB101細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を100μg/mlアンピシリン含有の
L−寒天で平板培養し、アンピシリン耐性の形質転換体
をプラスミドDNAの制限酵素分析によって分析して、
E.コリK12 HB101/pLPChd1およびE.コリ
K12 HB101/pLPChd2形質転換体を同定し
た。プラスミドpLPChd1の制限部位および機能地図
を添付の図18に示す。プラスミドpLPChd1および
プラスミドpLPChd2 DNAを、実質的に実施例3の
方法に従って、適切な形質転換体から単離した。 【0208】プラスミドpLPChd3およびpLPChd4
は、その構造がプラスミドpLPChd1およびpLPChd
2に類似している。プラスミドpLPChyg1のかわりに
プラスミドpLPChyg2を出発原料として用いること以
外は、実質的にプラスミドpLPChd1およびpLPChd
2の構築に用いた方法に従って、プラスミドpLPChd
3およびpLPChd4を構築する。 【0209】B.プラスミドpLPCdhfr1およびpLP
Cdhfr2の構築 TE緩衝液100μl中のプラスミドpBW32約100
μgを、10×BamHI緩衝液15μlおよび水25μl
に加えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、
制限酵素BamHI約10μl(〜25単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpBW32DNAを、実質
的に実施例11Aの方法に従って、クレノウで処理し
た。この平滑末端にしたフラグメントをエタノールで沈
澱させ、TE緩衝液10μlに再懸濁し、次いでジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜1.9kb BamHI制
限フラグメントがその他の消化産物から分離するまで、
アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実
施例4Aの方法に従って、この〜1.9kb制限フラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
目的のフラグメントが約10μg得られ、これをTE緩
衝液50μlに懸濁した。 【0210】NdeI−StuI消化したプラスミドpLP
C DNA(実施例9で調製した)約5μlを、クレノウ処
理した、プラスミドpBW32の〜1.9kb BamHI制
限フラグメント5μl、10×リガーゼ緩衝液1.5μ
l、T4 DNAリガーゼ1μl(〜1000単位)、T4
RNAリガーゼ1μl(〜2単位)、および水1.5μlに
加えた。得られたライゲーション反応液を16℃で一晩
インキュベートした。このライゲート化DNAは目的の
プラスミドpLPCdhfr1およびpLPCdhfr2(これら
は、dhfr遺伝子を含有している〜1.9kbフラグメント
の配向だけが異なっている)からなっていた。このライ
ゲート化DNAを用い、実質的に実施例2の方法に従っ
て、E.コリK12 HB101を形質転換した。形質転
換細胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プ
ラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐
性のE.コリK12 HB101/pLPCdhfr1および
E.コリK12 HB101/pLPCdhfr2形質転換体
を同定した。 【0211】実施例12 プラスミドphdの構築 プラスミドphdを構築するためには、アデニンメチラー
ゼ(たとえばこれをdam遺伝子がコードしており、その遺
伝子産物は配列:5'−GATC−3'中のアデニン残基
をメチル化する)を欠くE.コリ宿主細胞から、プラスミ
ドpLPChd1DNA(これをプラスミドphd構築の出発原料
として用いる)を調製することが必要であった。E.コリ
K12 GM48(NRRL B−15725)は機能的な
damメチラーゼを欠いており、従って、プラスミドphd構
築の出発原料として用いるプラスミドpLPChd1 DN
Aを調製する目的で使用するのに適した宿主である。 【0212】実質的に実施例2の方法に従って、E.コ
リK12 GM48細胞を培養し、形質転換用にコンピ
テントにし、プラスミドpLPChyg1を用いてこのE.
コリK12 GM48細胞を形質転換した。実質的に実
施例3の方法に従って、この形質転換細胞をアンピシリ
ン含有のL寒天にプレートし、アンピシリン耐性のE.
コリK12 GM48/pLPChd1形質転換体がコロニ
ーを形成したら、そのコロニーの1つを用いてプラスミ
ドpLPChd1 DNAを調製した。約1mgのプラスミド
pLPChd1 DNAが得られ、これをTE緩衝液約1ml
に懸濁した。 【0213】TE緩衝液2μl中のプラスミドpLPChd
1 DNA約2μgを、10×BclI緩衝液[750mM
KCl、60mM トリス−HCl(pH=7.4)、100m
M MgCl2、10mM DTT、および1mg/ml BSA]
2μlおよび水14μlに加えた。このプラスミドpLP
Chd1 DNAの溶液に、制限酵素BclI約2μl(〜1
0単位)を加え、得られた反応液を50℃で2時間イン
キュベートした。この混合物をフェノールで1回、クロ
ロホルムで2回抽出することによって反応を止めた。 【0214】BclI消化したプラスミドpLPChd1 D
NA約1μlを、10×リガーゼ緩衝液1μl、水8μ
l、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜500単位)に
加えた。このライゲーション反応液を16℃で一晩イン
キュベートした。このライゲート化DNAは目的のプラ
スミドphdからなっていた。プラスミドphdは、プラスミ
ドpLPChd1から全大きさが約1.45kbの2個の近接
BclI制限フラグメントおよびプラスミドpLPcat構築
の際に結合した余分のBclIリンカー削除することによ
って得られる。プラスミドphdの制限部位および機能地
図を添付の図19に示す。発現させようとするDNA
を、プラスミドphdの唯一のBclI部位に、発現のため
の正しい位置で、容易に挿入することができるので、プ
ラスミドphdは、本発明のBKウイルスエンハンサー−
アデノウイルス後期プロモーターからのすべてのDNA
配列の発現を容易にする。 【0215】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 GM48を形
質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−寒
天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析によ
ってアンピシリン耐性のE.コリK12 GM48/phd
形質転換体を同定した。 【0216】プラスミドpLPChd1の代わりにプラス
ミドpLPChd2、pLPChd3またはpLPChd4のい
ずれかを出発原料として用い、実質的に上記のプラスミ
ドphd構築法に従って、プラスミドphdに類似するプラス
ミドを構築することができる。これらの類似プラスミド
は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子および/またはdh
fr遺伝子の配向だけがプラスミドphdと異なっている。 【0217】実施例13 プラスミドpLPCE1Aの
構築 アデノウイルス2 DNAのE1A遺伝子を単離するた
め、アデノウイルス2DNA(BRLから入手)約20μ
gを、10×BalI緩衝液[100mM トリス−HCl(p
H=7.6)、120mM MgCl2、100mM 2−メル
カプトエタノール、および1mg/ml BSA]10μlお
よび水80μlに溶解した。このアデノウイルス2 DN
Aの溶液に、制限酵素BalI約10μl(約20単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。E1A遺伝子を含有する〜1.8kb制限フラグメ
ントがその他の消化産物から分離するまで、このBalI
消化したDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。実
質的に実施例4Aの方法に従って、この〜1.8kbフラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約3μg得られ、これをTE
緩衝液20μlに懸濁した。 【0218】TE緩衝液5μl中のプラスミドpLPC約
5μgを、10×StuI緩衝液2μlおよび水11μlに
加えた。このプラスミドpLPCの溶液に、制限酵素St
uI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液を37
℃で2時間インキュベートした。このStuI消化したプ
ラスミドpLPC DNAをエタノールで沈澱させ、10
×NdeI緩衝液2μlおよび水16μlに再懸濁した。こ
のStuI消化したプラスミドpLPC DNAの溶液に制
限酵素NdeI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。 【0219】このNdeI−StuI消化したプラスミドp
LPC DNAをエタノールで沈澱させ、10×クレノ
ウ緩衝液5μlおよび水42μlに再懸濁した。このDN
A溶液にクレノウ酵素約3μl(〜6単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で30分間インキュベートした。〜
5.82kbの、クレノウ処理したNdeI−StuI制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から明確に分離するま
で、この反応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ
た。実質的に実施例4Aの方法に従って、このフラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドpLPCの〜5.82kbの、クレノウ処理した
NdeI−StuI制限フラグメントが約2μg得られ、T
E緩衝液25μlに懸濁した。 【0220】E1A遺伝子をコードしているアデノウイ
ルス2の〜1.8kb BamHI制限フラグメント約9μ
l、およびプラスミドpLPCの〜5.82kb クレノウ処
理化NdeI−StuI制限フラグメント3μlを、10×
リガーゼ緩衝液2μlおよび水4μlに加えた。このDN
A溶液に、T4 DNAリガーゼ約1μl(〜500単位)
およびT4 RNAリガーゼ1μl(〜2単位)を加え、得
られた反応液を16℃で一晩インキュベートした。 【0221】このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドpLPCE1AおよびpLPCE1A1からなっていた
(これらは、E1A遺伝子の配向が異なり、またおそら
くは、BKエンハンサーがプラスミド上のE1A遺伝子
に対して有している発現促進効果が異なる)。プラスミ
ドpLPCE1A1よりプラスミドpLPCE1Aのほう
が、BKエンハンサーにより近接してE1Aプロモータ
ーが位置しているので、プラスミドpLPCE1A1を
用いるよりプラスミドpLPCE1Aを用いるときのほ
うがE1A発現が高くなるであろう。プラスミドpLP
CE1Aの制限部位および機能地図を添付の図20に示
す。 【0222】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性形質転換体をスクリーニングし
て、E.コリK12 HB101/pLPCE1Aおよび
E.コリK12 HB101/pLPCE1A1形質転換
体を同定した。後の実験にもちいるため、実質的に実施
例3の方法に従って、形質転換体からプラスミドDNA
を得た。 【0223】実施例14 プラスミドpBLTの構築 TE緩衝液1μl中のプラスミドpBW32 DNA(図1
4、図15、図16および図17、実施例10)約1μg
を、10×BamHI緩衝液2μlおよび水15μlに加え
た。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、制限酵
素BamHI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応
液を37℃で2時間インキュベートした。この反応混合
物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで2回抽
出することによって反応を止めた。このBamHI消化し
たプラスミドpBW32 DNA約1μlを、10×リガ
ーゼ緩衝液1μlおよび水8μlに加え、このDNA溶液
にT4 DNAリガーゼ約1μl(〜500単位)を加えた
後、得られた反応液を16℃で一晩インキュベートし
た。 【0224】このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドpBW32delからなっていた(このプラスミドは大き
さが約5.6kbであり、HindIII制限部位を1つだけ
含有している)。このライゲート化DNAを用い、実質
的に実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB10
1を形質転換した。目的のE.コリK12 HB101/
pBW32del形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表
現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て同定した。後の構築にもちいるため、実質的に実施例
3の方法に従って、形質転換体からプラスミドpBW3
2del DNAを得た。 【0225】TE緩衝液1μl中のプラスミドpBW32
del約1μgを、10×HindIII緩衝液2μlおよび水
15μlに加えた。このプラスミドpBW32del DNA
の溶液に、制限酵素HindIII約2μl(〜10単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。実質的に実施例2記載の方法に従って、この試料
をTE緩衝液で100μlに希釈し、ウシ腸アルカリホ
スファターゼで処理した。この反応液をフェノールで2
回、次いでクロロホルムで1回抽出した。次いで、この
HindIII消化したプラスミドpBW32del DNAを
エタノールで沈澱させ、水10μlに再懸濁した。 【0226】実質的に実施例5の方法に従って、プラス
ミドpBal8cat(実施例17)を制限酵素HindIIIで
消化し、改良型BKエンハンサー−アデノウイルス2後
期プロモーターカセットを含有する〜0.65kb Hind
III制限フラグメントを単離し、これをライゲーショ
ン用に調製した。TE緩衝液5μl中のプラスミドpBal
8catの〜0.65kb HindIII制限フラグメント約
0.1μgを、HindIII消化したプラスミドpBW32
delの溶液3μlに加えた。このDNA混合物に、T4
DNAリガーゼ約1μl(〜500単位)および10×リ
ガーゼ緩衝液1μlを加え、得られた反応液を16℃で
一晩インキュベートした。 【0227】このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドpBLTからなっていた。プラスミドpBLTの制限部
位および機能地図を添付の図21に示す。このライゲー
ト化DNAを用い、実質的に実施例2の方法に従って、
E.コリK12 HB101を形質転換した。形質転換細
胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、プラス
ミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐性の
E.コリK12 HB101/pBLT形質転換体を同定
した。〜0.65kb HindIII制限フラグメントは、
2つの配向(そのうちの1つだけがプラスミドpBLTを
与える)のうちのどちらででもHindIII消化したプラ
スミドpBW32delに挿入することができるので、この
〜0.65kb HindIII制限フラグメントの配向を決
定してE.コリK12 HB101/pBLT形質転換体
を同定した。後の構築にもちいるため、実質的に実施例
3の方法に従って、形質転換体からプラスミドpBLT
DNAを調製した。 【0228】実施例15 プラスミドpBLThyg1、p
BLThyg2、pBLTdhfr1、およびpBLTdhfr2の
構築 A.プラスミドpBLThyg1およびpBLThyg2の構築 TE緩衝液4μl中のプラスミドpBLT DNA約4μg
を、10×BamHI緩衝液2μlおよび水12μlに加え
た。このプラスミドpBLT DNAの溶液に、制限酵素
BamHI約2μl(〜10単位)を加え、得られた反応液
を37℃で2時間インキュベートした。この反応混合物
を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで抽出する
ことによって反応を止めた。次いで、このBamHI消化
したプラスミドpBLT DNAをエタノールで沈澱さ
せ、TE緩衝液2μlに再懸濁した。 【0229】TE緩衝液10μl中のプラスミドpSV2
hyg約10μgを、10×BamHI緩衝液10μlおよび
水75μlに加えた。このプラスミドpSV2hyg DNA
の溶液に、制限酵素BamHI約5μl(〜25単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。このBamHI消化したプラスミドpSV2hyg DN
Aをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液10μlに再懸
濁し、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有する〜
2.5kb BamHI制限フラグメントがその他の消化産物
から分離するまで、アガロースゲル電気泳動にかけた。
次いで、実質的に実施例4Aの方法に従って、この〜
2.5kb制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメント約2μgが得
られ、これをTE緩衝液10μlに懸濁した。 【0230】BamHI消化したプラスミドpBLT DN
A約2μlおよびプラスミドpSV2hygの〜2.5kb Ba
mHI制限フラグメント1μlを、10×リガーゼ緩衝液
1μl、水5μl、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜
500単位)に加え、得られた反応液を16℃で一晩イ
ンキュベートした。このライゲート化DNAは目的のプ
ラスミドpBLTThyg1およびpBLThyg2からなって
いた。プラスミドpBLThyg1の制限部位および機能地
図を添付の図22に示す。プラスミドpBLThyg1とp
BLThyg2は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコ
ードしている〜2.5kb BamHI制限フラグメントの配
向だけが異なっている。 【0231】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB101/
pBLThyg1およびE.コリK12 HB101/pBL
Thyg2形質転換体を同定した。 【0232】B.プラスミドpBLTdhfr1およびpBL
Tdhfr2の構築 TE緩衝液100μl中のプラスミドpBW32約100
μgを、10×BamHI緩衝液15μlおよび水25μl
に加えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に、
制限酵素BamHI約10μl(〜50単位)を加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpBW32DNAをエタノ
ールで沈澱させ、TE緩衝液10μlに再懸濁し、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜1.9kb BamHI
制限フラグメントがその他の消化産物から分離するま
で、アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、この〜1.9kb制限フラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメント約10μgが得られ、これをT
E緩衝液50μlに懸濁した。 【0233】実施例15Aで調製したBamHI消化のプ
ラスミドpBLT DNA約2μlおよびプラスミドpBW
32の〜1.9kb BamHI制限フラグメント1μlを、
10×リガーゼ緩衝液1μl、水5μl、およびT4 D
NAリガーゼ1μl(〜500単位)に加え、得られた反
応液を16℃で一晩インキュベートした。このライゲー
ト化DNAは目的のプラスミドpBLTdhfr1およびpB
LTdhfr2からなっていた。プラスミドpBLTdhfr1
の制限部位および機能地図を添付の図23に示す。プラ
スミドpBLTdhfr1とpBLTdhfr2は、dhfr遺伝子を
コードしている〜1.9kb BamHI制限フラグメントの
配向だけが異なっている。 【0234】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のL−
寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB101/
pBLTdhfr1およびE.コリK12 HB101/pBL
Tdhfr2形質転換体を同定した。 【0235】実施例16 プラスミドphdTPAおよびp
hdMTPAの構築 A.中間体プラスミドpTPA602の構築 ガラス蒸留水45μl中のプラスミドpTPA103(実
施例10、図14、図15、図16および図17)約5
0μgを、10×EcoRI緩衝液30μlおよび水225
μlに加えた。このプラスミドpTPA103 DNAの
溶液に、制限酵素EcoRI約10μl(〜80単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。このEcoRI消化したプラスミドpTPA103
DNAをエタノールで沈澱させ、1×ローディング緩衝
液(10%グリセリンおよび0.02%ブロモフェノール
ブルー)50μlに再懸濁し、〜1.1kb EcoRI制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から分離するまで、ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。フラグメントを透析袋
に電気泳動させることによって、TPAのアミノ末端を
コードしているDNAを含有する〜1.1kb EcoRI制
限フラグメントをゲルから単離した。次いで、このフラ
グメントをエタノールで沈澱させ、水160μlに再懸
濁した。 【0236】10×HgaI緩衝液[0.5M NaCl、6
0mM トリス−HCl(pH=7.4)、および0.1M
MgCl2]約40μl、ガラス蒸留水200μl、および制
限酵素HgaI 20μl(約10単位)を、〜1.1kb Eco
RI制限フラグメントの溶液に加え、得られた反応液を
37℃で4時間インキュベートした。このHgaI消化し
たDNAをエタノールで沈澱させ、次いで5%アクリル
アミドゲルで電気泳動し、TPAのアミノ末端をコード
している〜520bp制限フラグメントをDE81紙に単
離し、回収した。〜520bp HgaIフラグメント約5
μgが得られ、これを水50μlに懸濁した。 【0237】10×クレノウ緩衝液[0.5M トリス−
HCl(pH=7.4)、および0.1MMgCl2]約12.5
μl、4種類のデオキシヌクレオチド三リン酸それぞれ
が6.25mMである溶液2μl、0.2M DTT 2μ
l、7μg/ml BSA 1μl、ガラス蒸留水57.5μ
l、およびクレノウ酵素[ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ(Boehringer−Mannheim Biochemical
s,7941 CastlewayDr.,P.O.Box 50816,I
ndianapolis,IN 46250)]2μl(〜10単位)を、
〜520bp HgaI制限フラグメントの溶液に加え、得
られた反応液を20℃で30分間インキュベートした。
このクレノウ処理したDNAを70℃で15分間インキ
ュベートし、エタノールで沈澱させた。 【0238】BamHIリンカー(5'−CGGGATCC
CG−3';2本鎖であり、ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手した)約500ピコモルを、合計反応
容量25μl中、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホ
スホリル化した。この反応は、実質的に実施例6A記載
の方法に従って行った。クレノウ処理した〜520bpH
gaI制限フラグメントの溶液に、このキナーゼ処理した
BamHIリンカーを、10×リガーゼ緩衝液15μl、
T4 DNAリガーゼ7μl(〜7バイス単位)、および反
応液容量を150μlとするに十分なガラス蒸留水とと
もに加えた。得られた反応液を16℃で一晩インキュベ
ートした。 【0239】このライゲーション反応液を加熱して不活
性化し、DNAをエタノールで沈澱させ、10×BamH
I緩衝液5μlおよび水45μlに再懸濁した。このDN
A溶液に制限酵素BamHI約1μl(〜16単位)を加
え、得られた反応液を37℃で90分間インキュベート
した。次いで、この反応混合物にBamHI酵素16単位
をさらに加え、反応液を37℃でさらに90分間インキ
ュベートした。次いで、実質的に実施例6Aの方法に従
って、反応混合物を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、BamHI末端を有する〜530bp HgaI制
限フラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメン
トが約2μg得られ、これを水20μlに懸濁した。 【0240】BamHI消化し、脱ホスホリル化したプラ
スミドpBR322 DNAは、ニュー・イングランド・
バイオラブズから入手することができる。水2μl中
の、BamHI消化し、脱ホスホリル化したプラスミドp
BR322約0.1μgを、プラスミドpTPA103
の、BamHI末端を有する〜530bp HgaI制限フラ
グメント1μl、水14μl、およびT4 DNAリガー
ゼ1μl(〜1バイス単位)に加え、得られた反応液を1
6℃で一晩インキュベートした。このライゲート化DN
Aは、目的のプラスミドpTPA602およびプラスミ
ドpTPA601と命名したその等価物(このプラスミド
は、挿入した〜530bp制限フラグメントの配向だけが
プラスミドpTPA602と異なる)からなっていた。こ
のプラスミドpTPA602の制限部位および機能地図
を添付の図24に示す。 【0241】このライゲート化DNAを用い、50mM
CaCl2を用いること以外は実質的に実施例2の方法に
従って、E.コリK12 MM294を形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養
し、プラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシ
リン耐性のE.コリK12 MM294/pTPA602
およびE.コリK12 MM294/pTPA601細胞
を同定した。〜530bpBamHI制限フラグメントの存
在は、プラスミドがpTPA602またはpTPA601
のどちらかであることを示す。 【0242】B.中間体プラスミドpTPA603の構築 プラスミドpTPA602約5μgを、10×BglII緩
衝液20μlおよび水180μlに加えた。このプラスミ
ドpTPA602 DNAの溶液に、制限酵素BglII約
3μl(〜24単位)を加え、得られた反応液を37℃で
90分間インキュベートした。次いで、この反応混合物
に10×BamHI緩衝液〜13μlを加えて、反応混合
物の塩濃度をSalI消化に推奨される濃度にし、この反
応液に制限酵素SalI 2μl(〜20単位)を加えた。こ
の反応液を37℃でさらに2時間インキュベートし、次
いでDNAをエタノールで沈澱させ、ローディング緩衝
液75μlに再懸濁し、〜4.2kb BglII−SalI制
限フラグメントがその他の消化産物から分離するまで、
アガロースゲル電気泳動にかけた。この〜4.2kb Bgl
II−SalI制限フラグメントを含有するゲル領域をゲ
ルから切り出し、凍結させ、この凍結セグメントをプラ
スチックで包み、そして圧搾して〜4.2kbフラグメン
トを取り出した。このDNAを沈澱させ、水20μlに
再懸濁した(目的のフラグメントが約200ナノグラム
得られた)。 【0243】プラスミドpTPA103約12μgを、1
0×BglII緩衝液15μlおよび水135μlに加え
た。このプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、制
限酵素BglII約2μl(〜16単位)を加え、得られた
反応液を37℃で90分間インキュベートした。このB
glII消化したプラスミドpTPA103 DNAの溶液
に10×BamHI緩衝液約10μlを加えて、反応混合
物の塩濃度をSalI消化に必要とされる濃度にした。次
いで、このBglII消化したプラスミドpTPA103
DNAの溶液に制限酵素SalI約2μl(〜20単位)を
加え、この反応液を37℃でさらに90分間インキュベ
ートした。このBglII−SalI消化したプラスミドp
TPA103 DNAをエタノール沈澱によって濃縮
し、次いでアガロースゲルにかけ、TPAのアミノ末端
以外のすべてをコードしている〜2.05kb BglII−
SalI制限フラグメントをゲルから単離し、エタノール
で沈澱させ、水20μlに再懸濁した。目的のフラグメ
ントが約2μg得られた。 【0244】プラスミドpTPA602の〜4.2kb Bg
lII−SalI制限フラグメント約5μlおよびプラスミ
ドpTPA103の〜2.05kb BglII−SalI制限
フラグメント2μlを、10×リガーゼ緩衝液2μl、水
10μl、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜1バイス
単位)に加え、得られたライゲーション反応液を16℃
で一晩インキュベートした。このライゲート化DNAは
目的のプラスミドpTPA603からなっていた。プラ
スミドpTPA603の制限部位および機能地図を添付
の図25に示す。 【0245】このライゲート化DNAを用い、50mM
CaCl2を用いること以外は実質的に実施例2の方法に
従って、E.コリK12 MM294を形質転換した。こ
の形質転換細胞をアンピシリン含有のL−寒天で平板培
養し、プラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピ
シリン耐性のE.コリK12 MM294/pTPA60
3形質転換体を同定した。 【0246】C.プラスミドpMTPA603の構築 TE緩衝液100μl中のプラスミドpBLT(実施例1
4、図21)約100μgを、10×SstI(SstIは制
限酵素SacIと等価である)緩衝液[60mM トリス−H
Cl(pH=7.4)、60mM MgCl2、60mM 2−メル
カプトエタノール、および1mg/ml BSA]10μlお
よび水25μlに加えた。このプラスミドpBLT DN
Aの溶液に、制限酵素SstI約10μl(〜50単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。このSstI消化したプラスミドpBLT DNAを
エタノールで沈澱させ、10×BglII緩衝液10μl
および水85μlに再懸濁した。このSstI消化したプ
ラスミドpBLT DNAの溶液に、制限酵素BglII約
5μl(〜50単位)を加え、得られた反応液を37℃で
2時間インキュベートした。 【0247】実質的に実施例4Aの方法に従って、この
BglII−SstI消化したプラスミドpBLT DNAを
エタノールで沈澱させ、水10μlに再懸濁し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、改良型TPAのコード化配列
部分(改良型TPAをコードしている配列が得られるよ
うな欠失が生じている)を含有するプラスミドpBLTの
〜690bp BglII−SstI制限フラグメントをゲル
から単離した。目的の、プラスミドpBLTの〜690b
p BglII−SstI制限フラグメントが約5μg得ら
れ、これを水100μlに懸濁した。 【0248】TE緩衝液5μl中のプラスミドpTPA6
03(実施例16B、図25)約5μgを、10×SstI
緩衝液10μlおよび水95μlに加えた。このプラスミ
ドpTPA603 DNAの溶液に、制限酵素SstI約5
μl(〜50単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。このSstI消化したプラスミ
ドpTPA603 DNAをエタノールで沈澱させ、10
×BglII緩衝液10μlおよび水85μlに再懸濁し
た。このSstI消化したプラスミドpTPA603DN
Aの溶液に、制限酵素BglII約5μl(〜50単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。実質的に実施例2の方法に従って、このBglII
−SstI消化したプラスミドpTPA603 DNAをT
E緩衝液100μlに希釈し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼで処理した。次いで、このDNAをエタノールで
沈澱させ、水10μlに再懸濁した。 【0249】BglII−SstI消化したプラスミドpT
PA603約5μlおよびプラスミドpBLTの〜690
bp BglII−SstI制限フラグメント2μlを、10×
リガーゼ緩衝液2μl、水10μl、およびT4 DNA
リガーゼ1μl(〜1000単位)に加え、得られたライ
ゲーション反応液を16℃で一晩インキュベートした。
このライゲート化DNAは目的のプラスミドpMTPA
603からなっていた。従って、プラスミドpMTPA
603が改良型TPAをコードし、プラスミドpTPA
603がTPAをコードしていること以外は、プラスミ
ドpMTPA603はその構造がプラスミドpTPA60
3(図25)と類似している。 【0250】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。この形質転換細胞をアンピシリン含有の
L−寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分
析によってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB10
1/pMTPA603形質転換体を同定した。 【0251】D.プラスミドphdTPAの構築 TE緩衝液10μl中のプラスミドpTPA603(実施
例16B、図25)約10μgを、10×BamHI緩衝液
10μlおよび水85μlに加えた。このプラスミドpT
PA603 DNAの溶液に、制限酵素BamHI約5μl
(〜50単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。このBamHI消化したプラスミド
pTPA603 DNAをエタノールで沈澱させ、水10
μlに再懸濁し、TPAをコードしている〜1.90kb
BamHI制限フラグメントがその他の消化産物から分離
するまでアガロースゲル電気泳動にかけた。この〜1.
90kb BamHI制限フラグメントをゲルから単離し、
TE緩衝液50μlに再懸濁した。目的のフラグメント
が約4μg得られた。 【0252】TE緩衝液2μl中のプラスミドphd(実施
例12、図19)約2μgを、10×BclI緩衝液2μl
および水14μlに加えた。このプラスミドphd DNA
の溶液に、制限酵素BclI約2μl(〜10単位)を加
え、得られた反応液を50℃で2時間インキュベートし
た。この反応混合物を始めにフェノールで、次いでクロ
ロホルムで2回抽出することによって、反応を停止させ
た。次いで、このBclI消化したプラスミドphd DNA
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液20μlに再懸濁
した。 【0253】BclI消化したプラスミドphd約1μlおよ
びプラスミドpTPA603の〜1.90kb BamHI制
限フラグメント2μlを、10×リガーゼ緩衝液1μl、
水5μl、およびT4 DNAリガーゼ1μl(〜500単
位)に加え、得られたライゲーション反応液を16℃で
一晩インキュベートした。このライゲート化DNAは目
的のプラスミドphdTPAからなっていた。このプラス
ミドphdTPAの制限部位および機能地図を添付の図2
6に示す。 【0254】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101
(NRRL B−15626)を形質転換した。この形質
転換混合物をアンピシリン含有のL−寒天で平板培養
し、制限酵素分析によってアンピシリン耐性のE.コリ
K12 HB101/phdTPA細胞を同定した。〜1.
90kb BamHI制限フラグメントは、BclI消化した
プラスミドphdに2種類の配向のうちどちらかで挿入す
ることができるが、そのうちの1つだけが、BKエンハ
ンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセットの制
御下に発現させるのに適した位置に、TPAコード化配
列を配置している。すなわち、これが目的のプラスミド
phdTPAである。 【0255】E.プラスミドphdMTPAの構築 TE緩衝液10μl中のプラスミドpMTPA603(実
施例16C)約10μgを、10×BamHI緩衝液10μ
lおよび水85μlに加えた。このプラスミドpMTPA
603 DNAの溶液に、制限酵素BamHI約5μl(〜
50単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間イ
ンキュベートした。このBamHI消化したプラスミドp
MTPA603 DNAをエタノールで沈澱させ、水1
0μlに再懸濁し、改良型TPAをコードしている〜1.
35kb BamHI制限フラグメントがその他の消化産物
から分離するまでアガロースゲル電気泳動にかけた。こ
の〜1.35kb BamHI制限フラグメントをゲルから単
離し、TE緩衝液20μlに再懸濁した。目的のフラグ
メントが約4μg得られた。 【0256】実施例16Dで調製したBclI消化のプラ
スミドphd約1μlおよびプラスミドpMTPA603の
〜1.35kb BamHI制限フラグメント2μlを、10
×リガーゼ緩衝液1μl、水5μl、およびT4 DNA
リガーゼ1μl(〜500単位)に加え、得られたライゲ
ーション反応液を16℃で一晩インキュベートした。こ
のライゲート化DNAは目的のプラスミドphdMTPA
からなっていた。プラスミドphdMTPAの制限部位お
よび機能地図を添付の図27に示す。 【0257】このライゲート化DNAを用い、実質的に
実施例2の方法に従って、E.コリK12 HB101を
形質転換した。この形質転換混合物をアンピシリン含有
のL−寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素
分析によってアンピシリン耐性のE.コリK12 HB1
01/phdMTPA細胞を同定した。〜1.35kbBamH
I制限フラグメントは、BclI消化したプラスミドphd
に2種類の配向のうちのどちらかで挿入することができ
るが、そのうちの1つだけが、BKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターの制御下に発現させるのに
適した位置に、TPAコード化配列を配置している。す
なわち、これが目的のプラスミドphdMTPAである。 【0258】実施例17 改良型BKエンハンサー−ア
デノウイルス後期プロモーターカセットの構築 近接する真核生物性プロモーターのCAAT領域の5'
末端の上流側0〜300ヌクレオチドにBKエンハンサ
ーを配置することによって、該エンハンサーの転写促進
効果を著しく増加させることができる。修飾を加えてよ
り大きい促進活性を達成する前の、本発明のBKエンハ
ンサー−アデノウイルス2後期プロモーターカセットの
配列および機能成分を以下に示す: 【0259】 【化22】 【化23】【化24】 【化25】[配列中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニ
ル、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルであ
る]。 【0260】BKエンハンサーは、上記配列中に示した
3つの繰り返し配列で定義され、近接する配列に対し
て、どちらの配向であっても同様に機能する。このエン
ハンサー、すなわちBKエンハンサーの3番目の繰り返
しの3'末端(これは配向に依存する)を、アデノウイル
ス−2 後期プロモーターのCAAT領域の5'末端のよ
り近くに持ってくるため、TE緩衝液170μl中のSs
tI消化したプラスミドpBLcat DNA約82μgを、
5×Bal31ヌクレアーゼ緩衝液[0.1M トリス−H
Cl(pH=8.1)、0.5M NaCl、0.06M CaC
l2、および5mM Na2EDTA]20μlおよびBal31
ヌクレアーゼ[これは、「早い」Bal31酵素6μl(〜6
単位)および「遅い」Bal31酵素3μl(〜3単位)からな
り、これらはインターナショナル・バイオテクノロジー
ズ社(International Biotechnologies,Inc.,P.O.
Box 1565,New Haven,CT 06506)から市販
されている]9μlに加えた。この反応液を30℃で約3
分間インキュベートし、次いで0.1M EGTA約10
μlを加えて反応を止めた後、このBal31消化したD
NAをエタノール沈澱および遠心することによって集め
た。実質的に上記記載の方法に従って、このDNAペレ
ットを1×クレノウ緩衝液に再懸濁し、クレノウ酵素で
処理した。 【0261】このクレノウ処理したDNAをTE緩衝液
10μlに再懸濁し、次いで前記のようにして、このD
NA約1μlを、1×リガーゼ緩衝液10μl中、T4
DNAおよびRNAリガーゼを用いて自己ライゲートさ
せた。このライゲート化DNAを用いてE.コリK12
HB101を形質転換し、次いでこの形質転換体をアン
ピシリン含有のL寒天にプレートした。制限酵素分析を
用いて、どの形質転換体が適当な大きさのBKエンハン
サー−アデノウイルス2後期プロモーターカセット含有
のプラスミドを含んでいるかを測定し、DNA配列決定
を用いてこのカセットのヌクレオチド配列を確認した。
上記の方法は、アデノウイルス後期プロモーターのCA
AT領域の上流側0〜300ヌクレオチド以内にBKエ
ンハンサーが配置された多数のプラスミドを生じる。上
記方法から得られたプラスミドの1つをプラスミドpBa
l8catと命名した。このプラスミドpBal8catのBKエ
ンハンサー−アデノウイルス2後期プロモーターの配列
を以下に示す: 【0262】 【化26】 【化27】【化28】 [配列中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニ
ル、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルであ
る]。 【0263】プラスミドpBal8catについて説明した
が、上記方法によって多数の別種プラスミドが得られる
ことは当業者の理解するところであろう。一群のこれら
プラスミドは、Ad2後期プロモーターのCAAT領域
から300ヌクレオチド以内の様々な距離のところにB
Kエンハンサーを配置したものであり、従って本発明の
重要な態様である。上述の方法または当分野で既知のそ
の他の方法を用いておこなうことができるこのBKエン
ハンサー活性を改良する方法は、すべてのBKエンハン
サーおよびすべての真核生物性プロモーターを用いて行
うことができる。 【0264】実施例18 本発明の発現ベクターの真核
宿主細胞形質転換体の作成およびこれら形質転換体にお
ける組換え遺伝子発現レベルの測定 本発明の態様のうち重要なものは、BKエンハンサーを
用いて、E1A遺伝子産物の存在下に遺伝子の発現を刺
激することに関する。293細胞は構成的にE1A遺伝
子産物を発現するので、293細胞が本発明の真核生物
性発現ベクターの宿主として好ましい。293細胞はア
デノウイルスタイプ5(本発明方法においては、アデノ
ウイルスの特定タイプのいずれかを用いてE1A遺伝子
産物を供給することができることに注意)で形質転換し
たヒト胎児腎細胞であり、ATCCから取得番号CRL
1573のもとで入手できる。しかし本発明の発現ベ
クターは、たとえE1A遺伝子産物が存在しない場合で
あっても、多種多様の宿主細胞において機能する。さら
に、E1A遺伝子を含有する本発明のベクター(たとえ
ば、プラスミドpLPCE1AおよびpLPCE1A1)
あるいは完全なアデノウイルスDNAで形質転換する
か、またはアデノウイルスに感染させることによって、
E1A−非産生セルラインにE1A遺伝子産物を導入す
ることができる。 【0265】以下に記載する形質転換法は、宿主細胞セ
ルラインとして293細胞を挙げて言及するが、この方
法は、ほとんどの真核生物セルラインに一般的に応用す
ることができる。本発明のベクターで多数のセルライン
を形質転換し、実際に作成した形質転換体のいくつか、
およびその関連情報を本実施例中、後記の表に示す。本
発明の発現ベクターは極めて多数にのぼるので、形質転
換法は一般的に記載し、実際に作成した形質転換体を表
中に示す。 【0266】293細胞を、ATCCから取得番号CR
L1573のもと、10%の加熱不活性化したウマ血清
を含有するイーグル(Eagle)の最小必須培地中の、約
5.5×106の全面単層細胞を含有する25mm2フラス
コとして入手する。このフラスコを37℃でインキュベ
ートし、培地を週2回交換する。培地を除去し、ハンク
(Hank)のバランス塩溶液(Gibco)ですすぎ、0.25%
トリプシンを1〜2分間加え、新鮮な培地ですすぎ、そ
して1:5または1:10の継代培養比で新しいフラスコ
に吸引、分取することによって細胞を継代培養する。 【0267】形質転換の1日前に0.7×106細胞/皿
で細胞を植え付ける。形質転換の4時間前に培地を交換
する。滅菌し、エタノール沈澱させたプラスミドDNA
(TE緩衝液に溶解した)を用いて、40μg/ml DNA
および250mM CaCl2を含有する2×DNA−CaC
l2溶液を調製する。280mM NaCl、50mMヘペス
および1.5mMリン酸ナトリウムを含有し、pHを7.0
5〜7.15に調整した2×HBSを調製する。2×D
NA−CaCl2溶液を等容量の滅菌2×HBSに滴下す
る。綿栓をつけた1mlの滅菌プラスチックピペットを、
2×HBSを含有する混合管に挿入し、DNAを添加す
る間、吹き込むことによって気泡を導入する。室温で3
0〜45分間、撹拌することなくカルシウム−リン酸塩
−DNA沈澱物を析出させる。 【0268】次いで、プラスチックピペットで穏やかに
ピペット操作を行って沈澱物を混合し、受容細胞を覆う
増殖培地10mlに沈澱物1ml(プレートあたり)を直接加
える。37℃で4時間インキュベートした後、培地を1
0%ウシ胎児血清含有のDMEMに置き換え、選択圧を
与える前にこの細胞をさらに72時間インキュベートす
る。組換えヒトタンパク質Cを発現する形質転換体に対
しては、このタンパク質のγカルボキシル化に必要な補
助因子であるビタミンK(1〜10μg/ml)を増殖培地
に含有させた。真核生物細胞中で機能する選択マーカー
を含有していないプラスミドに対しては、プラスミド混
合物、すなわち選択マーカーを欠く本発明の発現ベクタ
ー、および真核生物細胞中で機能する選択マーカーを含
有している発現ベクターを用いて形質転換を行った。こ
の共形質転換法は、形質転換させるプラスミドの両者を
含有している細胞の同定を可能にする。 【0269】ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有す
るプラスミドでトランスフェクションした細胞に対して
は、増殖培地に最終濃度約200〜400μg/mlにな
るまでハイグロマイシンを加える。次いで、培地を3〜
4日間隔で交換しながら37℃で2〜4週間細胞をイン
キュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコロ
ニーを、その特徴を調べるために別々の培養フラスコに
移す。ネオマイシン(ネオマイシンの代わりにG418
を用いることもできる)耐性コロニーの選択は、ハイグ
ロマイシンの代わりにネオマイシンを最終濃度400μ
g/mlになるまで加えること以外は、実質的にハイグロ
マイシン耐性細胞の選択方法に従って行う。293細胞
はdhfr陽性であるので、dhfr遺伝子を有するプラスミド
含有の293形質転換体はdhfr陽性の表現型(ヒポキサ
ンチンおよびチミンを欠く培地で増殖する能力)に基づ
いてのみでは選択されない。機能的なdhfr遺伝子を欠
き、そしてdhfrを含有するプラスミドで形質転換された
セルラインは、dhfr+表現型に基づいて選択することが
できる。 【0270】dhfr欠失セルラインに遺伝子またはプラス
ミドを導入するための選択マーカーとしてジヒドロ葉酸
還元酵素(dhfr)遺伝子を用いること、および後にメトト
レキセイトを用いてプラスミドのコピー数を増幅するこ
とは文献上よく認められている。dhfr産生細胞において
選択および増幅マーカーとしてdhfrを用いることについ
ては十分に研究が為されていないが、文献に挙げられて
いる証拠は、遺伝子増幅のためおよびdhfr産生細胞にお
ける選択マーカーとしてdhfrを用いることができること
を示唆している。本発明は用いる選択マーカーによって
は限定されない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、ア
デノシンデアミナーゼ遺伝子、またはP−糖タンパク質
で例示される多重遺伝子耐性族の一員などの増幅しうる
マーカーを用いることができる。 【0271】 【表3】【表4】 【0272】 【表5】* それぞれのセルラインにおいて産生したCATの相
対レベル値は、プラスミドpSV2catからのCATレベ
ルを基礎とした(それぞれのセルラインにおいて1であ
るとして)。結果は別個に測定した2〜6測定値の平均
である。ND=検出されず。NT=試験せず。プラスミ
ドpSLcatはプラスミドpBLcatに類似しているが、B
Kエンハンサーの代わりにSV40エンハンサーを有し
ている。293セルラインだけがE1Aを産生する。C
OSおよびk816−4セルラインはT抗原を産生す
る。 ** k816−4細胞は、複製起源に欠失を有するS
V40ゲノムを含有している。pMK16,8−16と命
名されたプラスミド[グルズマン(Y.Gluzman,Cold S
pring Harbor)から入手]で1次ヒト腎細胞を形質転換
することによって調製した。このセルラインはSV40
のT抗原を構成的に産生する。このk816−4セルラ
インは本質的にセルラインSV1[SV40で形質転換
したヒト腎細胞セルラインであり、メジャー(E.O.Ma
jor,Polyomaviruses and HumanNeurological Disea
se,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.1983,eds D.Ma
dden,and J.Sever)が開示している]と同じである。 【0273】 【表6】 * それぞれのセルラインにおいて産生したCATの相
対レベル値は、細胞溶解物中のCATレベルを、ハイブ
リダイゼーション分析で測定した同細胞溶解物中のプラ
スミドDNA量で割ることによって補正した。293細
胞におけるプラスミドpSV2catの補正値を1とした。
【図面の簡単な説明】
【図1】 BKウイルスの制限部位および機能地図を表
す模式図である。 【図2】 プラスミドpBKE1の制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図3】 プラスミドpBKneo1の制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図4】 プラスミドpSV2catの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図5】 プラスミドpLPcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。 【図6】 プラスミドpBLcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。 【図7】 プラスミドpBKcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。 【図8】 プラスミドpSBLcatの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図9】 プラスミドpL133の構築を示す工程図(プ
ラスミドpL133の制限部位および機能地図も合わせ
て記す)である。 【図10】 プラスミドpLPCの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図11】 プラスミドpLPC4の制限部位および機
能地図を表す模式図である。 【図12】 プラスミドpSV2hygの制限部位および機
能地図を表す模式図である。 【図13】 プラスミドpLPChyg1の制限部位および
機能地図を表す模式図である。 【図14】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図15】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図16】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図17】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図18】 プラスミドpLPChd1の制限部位および
機能地図を表す模式図である。 【図19】 プラスミドphd制限部位および機能地図を
表す模式図である。 【図20】 プラスミドpLPCE1Aの制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図21】 プラスミドpBLTの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図22】 プラスミドpBLThyg1の制限部位および
機能地図を表す模式図である。 【図23】 プラスミドpBLTdhfr1の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図24】 プラスミドpTPA602の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図25】 プラスミドpTPA603の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図26】 プラスミドphdTPAの制限部位および機
能地図を表す模式図である。 【図27】 プラスミドphdMTPAの制限部位および
機能地図を表す模式図である。
す模式図である。 【図2】 プラスミドpBKE1の制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図3】 プラスミドpBKneo1の制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図4】 プラスミドpSV2catの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図5】 プラスミドpLPcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。 【図6】 プラスミドpBLcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。 【図7】 プラスミドpBKcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。 【図8】 プラスミドpSBLcatの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図9】 プラスミドpL133の構築を示す工程図(プ
ラスミドpL133の制限部位および機能地図も合わせ
て記す)である。 【図10】 プラスミドpLPCの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図11】 プラスミドpLPC4の制限部位および機
能地図を表す模式図である。 【図12】 プラスミドpSV2hygの制限部位および機
能地図を表す模式図である。 【図13】 プラスミドpLPChyg1の制限部位および
機能地図を表す模式図である。 【図14】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図15】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図16】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図17】 プラスミドpBW32の構築を示す工程図
(プラスミドpBW32の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。 【図18】 プラスミドpLPChd1の制限部位および
機能地図を表す模式図である。 【図19】 プラスミドphd制限部位および機能地図を
表す模式図である。 【図20】 プラスミドpLPCE1Aの制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図21】 プラスミドpBLTの制限部位および機能
地図を表す模式図である。 【図22】 プラスミドpBLThyg1の制限部位および
機能地図を表す模式図である。 【図23】 プラスミドpBLTdhfr1の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図24】 プラスミドpTPA602の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図25】 プラスミドpTPA603の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。 【図26】 プラスミドphdTPAの制限部位および機
能地図を表す模式図である。 【図27】 プラスミドphdMTPAの制限部位および
機能地図を表す模式図である。
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フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
C12P 21/00 - 21/02
C12N 15/00 - 15/90
BIOSIS(DIALOG)
WPI(DIALOG)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.γカルボキシル化され、正しく折りたたまれ、そし
てプロセッシングされているタンパク質を産生する方法
であって、 適当な発現条件下で組換えDNAベクターを含有する真
核宿主細胞を培養したときに該タンパク質が発現される
ように、該タンパク質が該ベクター中にコードされてお
り、 該方法は、 (a)該ベクターを、アデノウイルスで形質転換したヒト
胎児腎細胞に導入し、そして (b)工程(a)の宿主細胞を、カルボキシル化のためのビタ
ミンKを十分に含有する培地において、増殖条件下で培
養することからなる方法。 2.アデノウイルスで形質転換したヒト胎児腎細胞セル
ラインが293セルラインである請求項1記載の方法。
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2000
- 2000-10-10 JP JP2000309380A patent/JP2001145496A/ja active Pending
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