JPH0789930B2 - ウイルス性転写促進配列 - Google Patents
ウイルス性転写促進配列Info
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- JPH0789930B2 JPH0789930B2 JP59044437A JP4443784A JPH0789930B2 JP H0789930 B2 JPH0789930 B2 JP H0789930B2 JP 59044437 A JP59044437 A JP 59044437A JP 4443784 A JP4443784 A JP 4443784A JP H0789930 B2 JPH0789930 B2 JP H0789930B2
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- dna
- gene
- hind iii
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- transcription promoting
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトを起源とする野生株ウイルスおよびその
各種変異型ウイルスより得られるウイルスDNA初期遺伝
子上流に存在する塩基配列に関する。すなわち、本発明
は、動物細胞内において目的遺伝子の転写を促進増強
し、遺伝子産生量を増加させる活性を有するDNA断片に
関する。
各種変異型ウイルスより得られるウイルスDNA初期遺伝
子上流に存在する塩基配列に関する。すなわち、本発明
は、動物細胞内において目的遺伝子の転写を促進増強
し、遺伝子産生量を増加させる活性を有するDNA断片に
関する。
更に詳しくは、ヒトのBKウイルスの野生株およびその変
異株（国立予防衛生研究所より分与されたもの）より単
離された、それぞれ固有の塩基配列であり、更にこれを
目的遺伝子に連結させ、動物細胞内において、その遺伝
子の転写活性を数10倍に促進増強し、遺伝子産生量を増
加せしめる転写促進配列に関する。
異株（国立予防衛生研究所より分与されたもの）より単
離された、それぞれ固有の塩基配列であり、更にこれを
目的遺伝子に連結させ、動物細胞内において、その遺伝
子の転写活性を数10倍に促進増強し、遺伝子産生量を増
加せしめる転写促進配列に関する。
（発明の背景および従来技術） 最近、遺伝子発現における研究過程において、転写に必
要なDNA領域が注目を集めている。これは転写促進配列
（エンハンサー;enhancer）と名付けられ、報告されて
いるものであるChambonら，（Nature,290,304,1981;Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,77,3898,1980）,Schaffnerら，
（Cell,27,299,1981;Nucl.Acid.Res.,9,6251,1981）。
要なDNA領域が注目を集めている。これは転写促進配列
（エンハンサー;enhancer）と名付けられ、報告されて
いるものであるChambonら，（Nature,290,304,1981;Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,77,3898,1980）,Schaffnerら，
（Cell,27,299,1981;Nucl.Acid.Res.,9,6251,1981）。
それぞれサルのSV40ウイルスやマウスポリオーマウイル
スより分離された、ウイルスDNAのプロモーター近傍の
ある種のDNA断片につき、それらの作用を解析し、この
ようなDNA断片を他の遺伝子と連結してやると、その遺
伝子の転写活性が著しく増強されることが明らかにされ
ている。このDNA配列は、その効果が連結する方向性や
連結遺伝子との距離及び遺伝子の種類とは比較的無関係
に現れる。このように転写促進配列は、その近傍のシス
（cis）に存在する遺伝子の転写を促進する作用を有
し、しかもこの作用はその転写促進配列DNA配列とその
作用を受ける遺伝子との距離、両者の相対位置、方向に
比較的依存せずに発揮される点で、通常の転写調節配列
であるプロモーターとは大きく性質を異にしている。上
記のようにこれまで知られている転写促進配列（エンハ
ンサー）としては、サルSV40ウイルス由来エンハンサ
ー、マウスポリオーマウイルス由来エンハンサー等が挙
げられる。
スより分離された、ウイルスDNAのプロモーター近傍の
ある種のDNA断片につき、それらの作用を解析し、この
ようなDNA断片を他の遺伝子と連結してやると、その遺
伝子の転写活性が著しく増強されることが明らかにされ
ている。このDNA配列は、その効果が連結する方向性や
連結遺伝子との距離及び遺伝子の種類とは比較的無関係
に現れる。このように転写促進配列は、その近傍のシス
（cis）に存在する遺伝子の転写を促進する作用を有
し、しかもこの作用はその転写促進配列DNA配列とその
作用を受ける遺伝子との距離、両者の相対位置、方向に
比較的依存せずに発揮される点で、通常の転写調節配列
であるプロモーターとは大きく性質を異にしている。上
記のようにこれまで知られている転写促進配列（エンハ
ンサー）としては、サルSV40ウイルス由来エンハンサ
ー、マウスポリオーマウイルス由来エンハンサー等が挙
げられる。
（解決すべき課題） 今日まで、組換えDNA技術の進歩にも拘らず、多くの場
合、修飾された蛋白質、例えばグリコシル化されたγ−
インターフェロン、インターロイキンIIによって代表さ
れる各種リンフォカイン等の蛋白質性生理活性物質の如
き真核細胞性蛋白質の製造は原核細胞性宿主中で行なわ
ざるを得なかった。原核細胞は真核細胞性蛋白質糖質部
分を正しく結合できない。従って組み換えDNA技術によ
り修飾された蛋白を製造するためには、真核細胞性宿主
が不可欠である。しかし真核細胞は培養時において世代
の交代時間が長く目的物質の商業的生産には不適であ
る。
合、修飾された蛋白質、例えばグリコシル化されたγ−
インターフェロン、インターロイキンIIによって代表さ
れる各種リンフォカイン等の蛋白質性生理活性物質の如
き真核細胞性蛋白質の製造は原核細胞性宿主中で行なわ
ざるを得なかった。原核細胞は真核細胞性蛋白質糖質部
分を正しく結合できない。従って組み換えDNA技術によ
り修飾された蛋白を製造するためには、真核細胞性宿主
が不可欠である。しかし真核細胞は培養時において世代
の交代時間が長く目的物質の商業的生産には不適であ
る。
（課題の解決） 本発明の転写促進配列は、上記の問題を解決するもので
ある。本発明者らは、Papovavirus科に属するヒトBKウ
イルスDNAから、真核細胞により目的物質を生産させる
際に、適当なベクターに目的物質産生遺伝子と共に本発
明の転写促進配列を組み込んだものを使用すると、目的
物質産生遺伝子のみを組込んだベクターを使用するのに
比して数10倍の生産増加を示すといった、高い転写促進
活性を有する新規なDNA断片を得、本発明を完成した。
本発明は、Papovavirus科に属するヒトBKウイルスDNAを
制限酵素Hind IIIにより開裂して得られるＣ断片に認め
られる転写促進配列に関連する。
ある。本発明者らは、Papovavirus科に属するヒトBKウ
イルスDNAから、真核細胞により目的物質を生産させる
際に、適当なベクターに目的物質産生遺伝子と共に本発
明の転写促進配列を組み込んだものを使用すると、目的
物質産生遺伝子のみを組込んだベクターを使用するのに
比して数10倍の生産増加を示すといった、高い転写促進
活性を有する新規なDNA断片を得、本発明を完成した。
本発明は、Papovavirus科に属するヒトBKウイルスDNAを
制限酵素Hind IIIにより開裂して得られるＣ断片に認め
られる転写促進配列に関連する。
すなわち、本発明は、下記の核酸配列：（１） （２） （３） 及び（４） からなる群から選ばれた配列を含むことを特徴とする転
写促進活性を示すDNA断片に関するものである。
写促進活性を示すDNA断片に関するものである。
本発明の転写促進配列は、現在知られているSV40ウイル
ス、ポリオーマウイルス等のDNAより単離された転写促
進配列とは全く異なった性質、塩基配列を有する新規な
ものである。
ス、ポリオーマウイルス等のDNAより単離された転写促
進配列とは全く異なった性質、塩基配列を有する新規な
ものである。
本発明の転写促進配列は、修飾された蛋白質、例えばグ
リコシル化されたγ−インターフェロン、インターロイ
キンIIによって代表される各種リンフォカイン等の蛋白
質性生理活性物質を真核細胞を利用して発現または産生
させる際に特に重要である。
リコシル化されたγ−インターフェロン、インターロイ
キンIIによって代表される各種リンフォカイン等の蛋白
質性生理活性物質を真核細胞を利用して発現または産生
させる際に特に重要である。
すなわち真核細胞により目的物質を生産させる際に、適
当なベクターに目的物質産生遺伝子と共に本発明の転写
促進配列を組み込んだものを使用すると、目的物質産生
遺伝子のみを組み込んだベクターを使用するのに比して
数10倍の生産増加を示す。
当なベクターに目的物質産生遺伝子と共に本発明の転写
促進配列を組み込んだものを使用すると、目的物質産生
遺伝子のみを組み込んだベクターを使用するのに比して
数10倍の生産増加を示す。
本発明の転写促進配列は、更に以下に記す特徴を有して
いる。
いる。
遺伝子操作技術に適した比較的短い塩基配列であ
る。
る。
目的遺伝子に対する連結方向はどちら向きでも転写
促進活性を発揮する。
促進活性を発揮する。
遠く離れた遺伝子にも働き、組み込まれる位置はそ
の上流でも下流でもよい。
の上流でも下流でもよい。
活性化する遺伝子は何でもよい。
宿主真核細胞の種類は問わず転写促進活性を発揮す
る。
る。
本発明の転写促進配列は、ヒトのBKウイルスより得られ
る。
る。
本発明の転写促進配列は、ヒトのBKウイルス（例えば、
野生株WT501,変異株Pm411、Pm522、Pm525等）より得ら
れ、例えば制限酵素Hind IIIによりウイルスDNAを切断
することにより得られる。
野生株WT501,変異株Pm411、Pm522、Pm525等）より得ら
れ、例えば制限酵素Hind IIIによりウイルスDNAを切断
することにより得られる。
具体的に説明すると、ヒトのBKウイルス、例えば、変異
株Pm525よりウイルスDNAを抽出分離し、制限酵素Hind I
IIによって切断し、各断片を単離後、TK遺伝子と連結
し、複合プラスミドDNA（ヘルペスシンプレックスＩ型
ウイルスDNAのTK遺伝子をpBR322に挿入したものを使
用）としてリン酸カルシウム法によりTK遺伝子を真核細
胞（ラット由来のF2408TK-及びマウス由来のLTK-細胞）
に導入して発現量をHAT培地存在下で形成されるコロニ
ー数を測定することにより、転写促進活性を持つ本発明
の転写促進配列が得られる。
株Pm525よりウイルスDNAを抽出分離し、制限酵素Hind I
IIによって切断し、各断片を単離後、TK遺伝子と連結
し、複合プラスミドDNA（ヘルペスシンプレックスＩ型
ウイルスDNAのTK遺伝子をpBR322に挿入したものを使
用）としてリン酸カルシウム法によりTK遺伝子を真核細
胞（ラット由来のF2408TK-及びマウス由来のLTK-細胞）
に導入して発現量をHAT培地存在下で形成されるコロニ
ー数を測定することにより、転写促進活性を持つ本発明
の転写促進配列が得られる。
上記の場合、転写促進活性はPm525ウイルスDNAのHind I
II切断断片のＡ断片（2.3Kb）、Ｂ断片（1.9Kb）、Ｃ断
片（0.51Kb）及びＤ断片（0.42Kb）のうち、Ｃ断片に認
められた。
II切断断片のＡ断片（2.3Kb）、Ｂ断片（1.9Kb）、Ｃ断
片（0.51Kb）及びＤ断片（0.42Kb）のうち、Ｃ断片に認
められた。
変異株Pm411,Pm522及び野生株WT501について上記と同様
に転写促進活性を調べると、全てHind III切断断片のＣ
断片に認められた。
に転写促進活性を調べると、全てHind III切断断片のＣ
断片に認められた。
また同様にWT501 Hind III−Ｃ、Pm411 Hind III−Ｃ
及びPm522 Hind III−Ｃについて、前記ラット由来のF
2408TK-及びマウス由来のLTK-細胞を用い転写促進活性
を調べたところ、約８〜20倍の転写促進活性であった。
及びPm522 Hind III−Ｃについて、前記ラット由来のF
2408TK-及びマウス由来のLTK-細胞を用い転写促進活性
を調べたところ、約８〜20倍の転写促進活性であった。
前記Pm525 Hind III−Ｃの場合も約20倍の転写促進活
性を示した。
性を示した。
そこで本発明の転写促進配列を仮にHind III−Ｃと呼ぶ
ことにする。
ことにする。
Hind III−ＣのDNA断片をmp8ファージDNAに組み込み、
大腸菌JM101に感染させて鋳型１本鎖DNAを作成し、ジデ
オキシ法（Sanger,F.,Nicklen,S.＆ Coulson,A.R.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977）によって塩基配列
を決定した。
大腸菌JM101に感染させて鋳型１本鎖DNAを作成し、ジデ
オキシ法（Sanger,F.,Nicklen,S.＆ Coulson,A.R.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977）によって塩基配列
を決定した。
その結果、野生株WT501、変異株Pm411、Pm522及びPm525
のHind III−Ｃ（仮に各々WT501 Hind III−Ｃ、Pm411
Hind III−Ｃ、Pm522 Hind III−Ｃ及びPm525 Hind
III−Ｃと名付ける）について各塩基配列が、第３図、
第４図、第５図、及び第２図に示されるような配列のも
のであることが判明し、その塩基配列は、全て互いに異
なった塩基配列を示しており、また従来より知られてい
るサルSV40やマウスポリオーマウイルスDNAの転写促進
配列とも塩基配列を異にし、各々全く新規な転写促進配
列であることがわかった。
のHind III−Ｃ（仮に各々WT501 Hind III−Ｃ、Pm411
Hind III−Ｃ、Pm522 Hind III−Ｃ及びPm525 Hind
III−Ｃと名付ける）について各塩基配列が、第３図、
第４図、第５図、及び第２図に示されるような配列のも
のであることが判明し、その塩基配列は、全て互いに異
なった塩基配列を示しており、また従来より知られてい
るサルSV40やマウスポリオーマウイルスDNAの転写促進
配列とも塩基配列を異にし、各々全く新規な転写促進配
列であることがわかった。
第２図、第３図、第４図、及び第５図に示された各塩基
配列より、Pm525 Hind III−Ｃの塩基配列と比較し
て、Pm522 Hind III−Ｃ、Pm411 Hind III−Ｃ、及び
WT501 Hind III−Ｃの各塩基配列は、それぞれ88％（P
m522 Hind III−C:Pm525 Hind III−Ｃ）、79％（Pm4
11 Hind III−C:Pm525 Hind III−Ｃ）、及び74％（W
T501 Hind III−C:Pm525 Hind III−Ｃ）の相同性を
示している。
配列より、Pm525 Hind III−Ｃの塩基配列と比較し
て、Pm522 Hind III−Ｃ、Pm411 Hind III−Ｃ、及び
WT501 Hind III−Ｃの各塩基配列は、それぞれ88％（P
m522 Hind III−C:Pm525 Hind III−Ｃ）、79％（Pm4
11 Hind III−C:Pm525 Hind III−Ｃ）、及び74％（W
T501 Hind III−C:Pm525 Hind III−Ｃ）の相同性を
示している。
またWT501 Hind III−Ｃ、Pm411 Hind III−Ｃ及びPm
522 Hind III−Ｃについて、前記ラット由来のF2408TK
-及びマウス由来のLTK-細胞を用い転写促進活性を調べ
たところ、約８〜20倍の転写促進活性であった。
522 Hind III−Ｃについて、前記ラット由来のF2408TK
-及びマウス由来のLTK-細胞を用い転写促進活性を調べ
たところ、約８〜20倍の転写促進活性であった。
前記Pm525 Hind III−Ｃの場合も約20倍の転写促進活
性を示した。
性を示した。
更に上記実験結果より各Hind III−Ｃは、各々塩基配列
が異なると共に宿主細胞に対する親和性が異なる（すな
わち、導入する宿主細胞の種により転写促進活性が異な
る）ことが確認された。このことは目的遺伝子の発現に
適した真核性宿主細胞毎に、本発明の転写促進配列が選
べることを示唆している。
が異なると共に宿主細胞に対する親和性が異なる（すな
わち、導入する宿主細胞の種により転写促進活性が異な
る）ことが確認された。このことは目的遺伝子の発現に
適した真核性宿主細胞毎に、本発明の転写促進配列が選
べることを示唆している。
一方、従来より得られているサルSV40やマウスポリオー
マウイルスの転写促進配列は、それぞれの起源宿主であ
るサル及びマウス細胞において特に高い転写促進活性を
示す（Nucl.Acid.Res.,10,7965,1982）。このことは本
発明のヒトBKウイルスより作製した本転写促進配列が、
ヒト細胞において最も強力にその活性を発揮することを
充分示唆している。
マウイルスの転写促進配列は、それぞれの起源宿主であ
るサル及びマウス細胞において特に高い転写促進活性を
示す（Nucl.Acid.Res.,10,7965,1982）。このことは本
発明のヒトBKウイルスより作製した本転写促進配列が、
ヒト細胞において最も強力にその活性を発揮することを
充分示唆している。
以上述べてきたことより、本発明の転写促進配列は、比
較的短い、遺伝子操作に適した塩基配列であり、目的遺
伝子と連結した時のみ作用し、目的遺伝子に対する連結
位置及び方向には無関係にその転写促進活性を発揮し、
目的遺伝子の発現に適した真核宿主細胞に対して最適の
転写促進配列が選べる有用な配列である。
較的短い、遺伝子操作に適した塩基配列であり、目的遺
伝子と連結した時のみ作用し、目的遺伝子に対する連結
位置及び方向には無関係にその転写促進活性を発揮し、
目的遺伝子の発現に適した真核宿主細胞に対して最適の
転写促進配列が選べる有用な配列である。
（本発明の効果） 本発明の転写促進配列は、修飾された蛋白質、例えばグ
リコシル化されたγ−インターフェロン、インターロイ
キンIIによって代表される各種リンフォカイン等の蛋白
質性生理活性物質を真核細胞を利用して発現または産生
させる際に特に重要である。
リコシル化されたγ−インターフェロン、インターロイ
キンIIによって代表される各種リンフォカイン等の蛋白
質性生理活性物質を真核細胞を利用して発現または産生
させる際に特に重要である。
真核細胞により目的物質を生産させる際に、適当なベク
ターに目的物質産生遺伝子と共に本発明の転写促進配列
を組み込んだものを使用すると、目的物質産生遺伝子の
みを組み込んだベクターを使用するのに比して数10倍の
生産増加を示す。
ターに目的物質産生遺伝子と共に本発明の転写促進配列
を組み込んだものを使用すると、目的物質産生遺伝子の
みを組み込んだベクターを使用するのに比して数10倍の
生産増加を示す。
また、以上述べてきたことより明らかなごとく、本発明
の転写促進配列は以下の実施例及び参考例に拘束される
ものではない。
の転写促進配列は以下の実施例及び参考例に拘束される
ものではない。
（実施例） ＜Pm525 Hind III−Ｃの調製＞ （１）Pm525ウイルスからのDNAの抽出 ヒト胎児腎細胞HEKで増殖させたPm525ウイルス粒子８×
1012個にプロナーゼとEDTAを最終濃度0.1mg/ml及び10mM
になるように各々加えた（最終液量0.4ml）。36℃にて
１夜放置後、フェノールを0.4ml加えてよく混合し、12,
000回転で３分間遠心し、上澄液を別のチューブに移し
取った。この上澄液にクロロホルムを0.4ml加え、フェ
ノールと同様に処理した。再び上澄み液を別のチューブ
に移し取り、3M酢酸ナトリウムを40μ加え、さらに冷
エタノールを0.8ml加えて混合し、−20℃に４時間放置
後12,000回転で５分間遠心し、上澄液を完全に除去し
た。
1012個にプロナーゼとEDTAを最終濃度0.1mg/ml及び10mM
になるように各々加えた（最終液量0.4ml）。36℃にて
１夜放置後、フェノールを0.4ml加えてよく混合し、12,
000回転で３分間遠心し、上澄液を別のチューブに移し
取った。この上澄液にクロロホルムを0.4ml加え、フェ
ノールと同様に処理した。再び上澄み液を別のチューブ
に移し取り、3M酢酸ナトリウムを40μ加え、さらに冷
エタノールを0.8ml加えて混合し、−20℃に４時間放置
後12,000回転で５分間遠心し、上澄液を完全に除去し
た。
以上の操作により、Pm525ウイルスDNAが約40μｇ得られ
た（第１図、（イ））。以後の実験はこれを蒸留水また
はTE緩衝液（10mMトリス・HCl,pH8.0、1mM EDTA）に溶
解させて使用した。
た（第１図、（イ））。以後の実験はこれを蒸留水また
はTE緩衝液（10mMトリス・HCl,pH8.0、1mM EDTA）に溶
解させて使用した。
同様の方法によりWT501、Pm411ウイルス、及びPm522ウ
イルスの各ウイルスからDNAを抽出した。
イルスの各ウイルスからDNAを抽出した。
（２）Pm525ウイルスDNAからHind III−Ｃ DNAの単離 Pm525ウイルスから抽出したDNA5μｇを反応用緩衝液（1
0mMトリス・HCl,pH7.5、60mM NaCl、6mM MgCl2、1mM
ジチオスレイトール）100μ中で制限酵素Hind III
（宝酒造（株）製）５ユニット（5units）と37℃、２時
間反応させ、続いて低融点の１％寒天ゲル（0.5μg/ml
のエチジウムブロマイドを含む）で50mA、約３時間電気
泳動した。
0mMトリス・HCl,pH7.5、60mM NaCl、6mM MgCl2、1mM
ジチオスレイトール）100μ中で制限酵素Hind III
（宝酒造（株）製）５ユニット（5units）と37℃、２時
間反応させ、続いて低融点の１％寒天ゲル（0.5μg/ml
のエチジウムブロマイドを含む）で50mA、約３時間電気
泳動した。
暗室でUV照射することにより４本のバンドを確認し、陰
極側から分子サイズの大きい順にHind III−Ａ、Hind I
II−Ｂ、Hind III−Ｃ、及びHind III−Ｄと名付けた
（前述）。
極側から分子サイズの大きい順にHind III−Ａ、Hind I
II−Ｂ、Hind III−Ｃ、及びHind III−Ｄと名付けた
（前述）。
Hind III−Ｃ DNA断片のみを含むゲル画分を切り出
し、65℃で加熱して寒天を溶かした後、TE緩衝液100μ
を加え、更に等量のTE緩衝液飽和フェノールで充分混
合し、12,000回転で５分間遠心した。上層の水溶液層を
別のチューブに移し取り、フェノール処理をさらに２回
繰り返した。別のチューブに移し取った水溶液層に1/10
容量の3M酢酸ナトリウムを加え、更に２倍量のエタノー
ルを加えて混合し、−20℃に４時間放置した。次いで1
2,000回転で５分間遠心し、上澄液を取り除いた後80％
冷エタノール100μを静かに加え、12,000回転３分間
遠心した。上澄液をできるだけ除去し、沈澱物（DNA）
を蒸留水10μに溶かした。
し、65℃で加熱して寒天を溶かした後、TE緩衝液100μ
を加え、更に等量のTE緩衝液飽和フェノールで充分混
合し、12,000回転で５分間遠心した。上層の水溶液層を
別のチューブに移し取り、フェノール処理をさらに２回
繰り返した。別のチューブに移し取った水溶液層に1/10
容量の3M酢酸ナトリウムを加え、更に２倍量のエタノー
ルを加えて混合し、−20℃に４時間放置した。次いで1
2,000回転で５分間遠心し、上澄液を取り除いた後80％
冷エタノール100μを静かに加え、12,000回転３分間
遠心した。上澄液をできるだけ除去し、沈澱物（DNA）
を蒸留水10μに溶かした。
以上の方法により約0.4μｇのPm525ウイルスのHind III
−Ｃ DNA断片、即ちPm525HindIII−Ｃを得た（第１
図、（ロ））。
−Ｃ DNA断片、即ちPm525HindIII−Ｃを得た（第１
図、（ロ））。
全く同様の方法により、WT501ウイルス、Pm411ウイル
ス、及びPm522ウイルスの各ウイルスDNAより各Hind III
−Ｃ DNA断片を得た（それぞれWT501Hind III−Ｃ、Pm
411Hind III−Ｃ及びPm522Hind III−Ｃ）。
ス、及びPm522ウイルスの各ウイルスDNAより各Hind III
−Ｃ DNA断片を得た（それぞれWT501Hind III−Ｃ、Pm
411Hind III−Ｃ及びPm522Hind III−Ｃ）。
（３）Pm525Hind III−Ｃ DNA断片の塩基配列の決定 ３）−Pm525hindIII−Ｃ DNA断片のPm8ファージDNA
への取り込みと鋳型１本鎖DNAの作成 （２）により得たPm525Hind III−Ｃ DNA断片50ngを、
反応用緩衝液（10mMトリス・HCl,pH7.5、20mM MgCl2、
1mM ATP、5mMジチオスレイトール）10μ中で制限酵
素Hind IIIで開裂した２本鎖mp8ファージDNA（アマーシ
ャム社のクローニング用キット）2ngと共に、T4 DNAリ
ガーゼ（宝酒造（株）製）１ユニットを用いて14℃３時
間反応させた。この反応によりPm525Hind III−Ｃ DNA
断片をmp8ファージDNAのHind III部位に挿入した組換え
DNAを得た。続いてCaCl2法（T.Maniatis,E.F.Fritsch,
J.Shambrook;Molecular cloning,p250,Cold Spring Har
bour Lab.,1982）により得た大腸菌JM101を上記組換えD
NAを用いて形質転換させた。このようにして調製した形
質転換株に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−ガラクトシド（20mg/mlの濃度でジメチルホルム
アミドに溶解）25μ、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−
ガラクトピロノシド（25mg/ml）25μ、及び対数増殖
期の大腸菌JM101 200μを混合し、50℃に保温したＨ
上層寒天（トリプトン10g、NaCl 8g、寒天6g/）3ml
を加えよく混合した後、Ｈ寒天プレート（トリプトン10
g、NaCl 8g、寒天12g/）にまいた。１夜培養すると
青色プラークと無色プラークが生じた。
への取り込みと鋳型１本鎖DNAの作成 （２）により得たPm525Hind III−Ｃ DNA断片50ngを、
反応用緩衝液（10mMトリス・HCl,pH7.5、20mM MgCl2、
1mM ATP、5mMジチオスレイトール）10μ中で制限酵
素Hind IIIで開裂した２本鎖mp8ファージDNA（アマーシ
ャム社のクローニング用キット）2ngと共に、T4 DNAリ
ガーゼ（宝酒造（株）製）１ユニットを用いて14℃３時
間反応させた。この反応によりPm525Hind III−Ｃ DNA
断片をmp8ファージDNAのHind III部位に挿入した組換え
DNAを得た。続いてCaCl2法（T.Maniatis,E.F.Fritsch,
J.Shambrook;Molecular cloning,p250,Cold Spring Har
bour Lab.,1982）により得た大腸菌JM101を上記組換えD
NAを用いて形質転換させた。このようにして調製した形
質転換株に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−ガラクトシド（20mg/mlの濃度でジメチルホルム
アミドに溶解）25μ、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−
ガラクトピロノシド（25mg/ml）25μ、及び対数増殖
期の大腸菌JM101 200μを混合し、50℃に保温したＨ
上層寒天（トリプトン10g、NaCl 8g、寒天6g/）3ml
を加えよく混合した後、Ｈ寒天プレート（トリプトン10
g、NaCl 8g、寒天12g/）にまいた。１夜培養すると
青色プラークと無色プラークが生じた。
Pm525Hind III−Ｃ DNA断片が組み込まれたDNAを持つ
ファージの存在する無色プラークを滅菌ピペットで吸い
取り、培養液1.5ml〔１夜培養したJM101を２倍のTY（バ
クトトリプトン8g、イーストエキストラクト6g、NaCl
2.5g/）で100倍に希釈したもの〕に接種した。37℃で
４〜５時間振とう培養し、この培養液を微量遠心チュー
ブに移り取り12,000回転で３分間遠心した。次いでピペ
ットで上澄液のみを新しい微量遠心チューブに取りPEG/
NaCl溶液（ポリエチレングリコール6000を20％とNaClを
2.5M含む水溶液）200μを加えて混合し、室温に15分
間静置した。
ファージの存在する無色プラークを滅菌ピペットで吸い
取り、培養液1.5ml〔１夜培養したJM101を２倍のTY（バ
クトトリプトン8g、イーストエキストラクト6g、NaCl
2.5g/）で100倍に希釈したもの〕に接種した。37℃で
４〜５時間振とう培養し、この培養液を微量遠心チュー
ブに移り取り12,000回転で３分間遠心した。次いでピペ
ットで上澄液のみを新しい微量遠心チューブに取りPEG/
NaCl溶液（ポリエチレングリコール6000を20％とNaClを
2.5M含む水溶液）200μを加えて混合し、室温に15分
間静置した。
12,000回転で５分間遠心し目的とするDNAを沈澱させ、
上澄液をできるだけ除去した。得られたDNAを実施例の
（１）と同様にフェノール処理しエタノール沈澱により
精製し、50μのTE緩衝液に溶解した。上記の方法で調
製した鋳型１本鎖DNA中に目的とするPm525Hind III−Ｃ
DNA断片が挿入されている。
上澄液をできるだけ除去した。得られたDNAを実施例の
（１）と同様にフェノール処理しエタノール沈澱により
精製し、50μのTE緩衝液に溶解した。上記の方法で調
製した鋳型１本鎖DNA中に目的とするPm525Hind III−Ｃ
DNA断片が挿入されている。
３）−塩基配列の決定 ３）−によって調製した１本鎖鋳型DNAを用いジデオ
キシ法によりPm525Hind III−Ｃ DNAの塩基配列を決定
した。同配列決定法はアマーシャム社の塩基配列決定用
のキットを用い、キットに添付のハンドブック（M13 C
loning and sequencing handbook,Amersham Intern
ational Plc.）に従って行った。
キシ法によりPm525Hind III−Ｃ DNAの塩基配列を決定
した。同配列決定法はアマーシャム社の塩基配列決定用
のキットを用い、キットに添付のハンドブック（M13 C
loning and sequencing handbook,Amersham Intern
ational Plc.）に従って行った。
まず、調製した鋳型１本鎖DNA5μとM13プライマー１
μをクレノー緩衝液（0.1Mトリス・HCl,pH8.5、50mM
MgCl2）1.5μ、水2.5μ中で60℃、１時間反応さ
せた。この後の反応は添付ハンドブックに従った。DNA
ポリメラーゼ反応終了後、ホルムアミド色素液（ホルム
アミド100ml、キシレンシアノール0.1g、ブロムフェノ
ールブルー0.1g、0.5M EDTA2ml）３μを加えて反応
を停止させた。次いで沸騰水中で５分間熱処理し、６％
ポリアクリルアミドゲルにのせて２時間電気泳動を行っ
た。泳動条件は1500V、30mA、泳動緩衝液はTBE緩衝液
（トリスベース10.8g、ホウ酸5.5g、EDTA2Na 0.93g/
）を用いた。
μをクレノー緩衝液（0.1Mトリス・HCl,pH8.5、50mM
MgCl2）1.5μ、水2.5μ中で60℃、１時間反応さ
せた。この後の反応は添付ハンドブックに従った。DNA
ポリメラーゼ反応終了後、ホルムアミド色素液（ホルム
アミド100ml、キシレンシアノール0.1g、ブロムフェノ
ールブルー0.1g、0.5M EDTA2ml）３μを加えて反応
を停止させた。次いで沸騰水中で５分間熱処理し、６％
ポリアクリルアミドゲルにのせて２時間電気泳動を行っ
た。泳動条件は1500V、30mA、泳動緩衝液はTBE緩衝液
（トリスベース10.8g、ホウ酸5.5g、EDTA2Na 0.93g/
）を用いた。
電気泳動終了後、ゲルをはがしてゲル固定液（メタノー
ル：酢酸：水＝1:1:8v/v）に15分間浸した。固定後、ゲ
ルをろ紙に付着させて乾燥し、Ｘ線フィルムに−20℃、
約20時間感光させた。このＸ線フィルムを現像後解読し
て塩基配列を決定した。このようにして図２に示すよう
に転写促進配列Pm525の塩基配列を決定した。本DNA断片
の鎖長は510ベース・ペア（bp）であった。
ル：酢酸：水＝1:1:8v/v）に15分間浸した。固定後、ゲ
ルをろ紙に付着させて乾燥し、Ｘ線フィルムに−20℃、
約20時間感光させた。このＸ線フィルムを現像後解読し
て塩基配列を決定した。このようにして図２に示すよう
に転写促進配列Pm525の塩基配列を決定した。本DNA断片
の鎖長は510ベース・ペア（bp）であった。
上記と全く同様な方法でWT501 Hind III−Ｃ（鎖長550
bp）、Pm411 Hind III−Ｃ（鎖長512bp）、Pm522 Hin
d III−Ｃ（鎖長451bp）の塩基配列をそれぞれ決定し
た。その結果を第３図、第４図、及び第５図に示す。変
異株のPm525、Pm411及びPm522のHind III処理のＣ断片
から誘導された各Hind III−Ｃは、野生株WT501から得
られたWT501 Hind III−Ｃと比べ塩基が脱落している
箇所があり、塩基数が数10bp減少したものであった。
bp）、Pm411 Hind III−Ｃ（鎖長512bp）、Pm522 Hin
d III−Ｃ（鎖長451bp）の塩基配列をそれぞれ決定し
た。その結果を第３図、第４図、及び第５図に示す。変
異株のPm525、Pm411及びPm522のHind III処理のＣ断片
から誘導された各Hind III−Ｃは、野生株WT501から得
られたWT501 Hind III−Ｃと比べ塩基が脱落している
箇所があり、塩基数が数10bp減少したものであった。
＜実験例＞ Pm525の転写促進配列のTK遺伝子発現に対する転写促進
活性 （１）Pm525Hind III−Ｃ DNA断片を含む複合プラスミ
ドDNAの作成 １）−pTKプラスミドDNAのHind IIIによる切断と脱リ
ン酸化処理 ここで使用するプラスミドpTKは、ヘルペスシンプレッ
クスＩ型ウイルスDNAから制限酵素BamHIにより切り出し
たTK遺伝子（チミジンキナーゼ遺伝子）を大腸菌プラス
ミドpBR322のBamHI切断部位に挿入してクローニングし
たものであり、挿入される方向性により２種類ある このTK遺伝子には制限酵素Saclによる切断部位が存在し
ない（このpTKプラスミドは大阪大学の羽倉助教授より
分与された）。
活性 （１）Pm525Hind III−Ｃ DNA断片を含む複合プラスミ
ドDNAの作成 １）−pTKプラスミドDNAのHind IIIによる切断と脱リ
ン酸化処理 ここで使用するプラスミドpTKは、ヘルペスシンプレッ
クスＩ型ウイルスDNAから制限酵素BamHIにより切り出し
たTK遺伝子（チミジンキナーゼ遺伝子）を大腸菌プラス
ミドpBR322のBamHI切断部位に挿入してクローニングし
たものであり、挿入される方向性により２種類ある このTK遺伝子には制限酵素Saclによる切断部位が存在し
ない（このpTKプラスミドは大阪大学の羽倉助教授より
分与された）。
まず、pTKプラスミドDNA2μｇを実施例と同様の条件でH
ind IIIを用いて開裂し、順次フェノール処理、エタノ
ール沈澱を行った。得られたDNAを50mMトリス緩衝液pH
8.4に溶解し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）
製）を１ユニット加えて65℃で１時間反応させ脱リン酸
化を行った。次いで実施例と同様の方法でフェノール処
理２回、エタノール沈澱を行い約1.2μｇのDNAを得、30
μの蒸留水に溶解した。
ind IIIを用いて開裂し、順次フェノール処理、エタノ
ール沈澱を行った。得られたDNAを50mMトリス緩衝液pH
8.4に溶解し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）
製）を１ユニット加えて65℃で１時間反応させ脱リン酸
化を行った。次いで実施例と同様の方法でフェノール処
理２回、エタノール沈澱を行い約1.2μｇのDNAを得、30
μの蒸留水に溶解した。
１）−Pm525Hind III−Ｃ DNA断片のpTKプラスミドD
NAへの組み入れ １）−で調製したPm525Hind III−Ｃ DNA断片とHind
IIIにより開裂させたpTKプラスミドDNAをそれぞれ10μ
（0.4μｇ）及び５μ（0.2μｇ）混合し、T4DNAリ
ガーゼ２ユニットを用い、反応用緩衝液（30mMトリス・
HCl,pH7.8、10mM MgCl2、0.5mM ATP、10mMジチオスレ
イトール）20μ中で15℃、６時間反応させて複合プラ
スミドを作成した（第１図、（ホ））。
NAへの組み入れ １）−で調製したPm525Hind III−Ｃ DNA断片とHind
IIIにより開裂させたpTKプラスミドDNAをそれぞれ10μ
（0.4μｇ）及び５μ（0.2μｇ）混合し、T4DNAリ
ガーゼ２ユニットを用い、反応用緩衝液（30mMトリス・
HCl,pH7.8、10mM MgCl2、0.5mM ATP、10mMジチオスレ
イトール）20μ中で15℃、６時間反応させて複合プラ
スミドを作成した（第１図、（ホ））。
得られた複合プラスミドpBK525Hind III−Ｃ中のTK遺伝
子の方向は２通りあるので、それぞれの方向に組み込ま
れた複合プラスミドを各々選別し、転写促進活性に及ぼ
す影響を調べる実験に使用した。
子の方向は２通りあるので、それぞれの方向に組み込ま
れた複合プラスミドを各々選別し、転写促進活性に及ぼ
す影響を調べる実験に使用した。
つまり、BKウイルスより得られるHind III−Ｃ DNA断
片には、もとのBKウイルスDNAに存在したVpとＴ−Ag
（Ｔ抗原）をコードする塩基配列の起点部位のごとく一
部が互いに逆向きに含まれており、TK遺伝子に向かって
Vp側又はＴ−Ag側が向くように挿入される場合の２通り
が存在する（第６図、（イ）（ロ））。第６図中の遺伝
子の脇の矢印は遺伝子が読まれる向きを、図の下の名前
についている矢印はＣの上の矢印がVpが読まれる向き
を、TKの上の矢印はTK遺伝子が読まれる向きをそれぞれ
表している。例えば、pBK525Hind III−・▲▼
は、Pm525Hind III−Ｃ DNA断片のVp側が、TK遺伝子が
読まれていく方向にプラスミドpBR322に挿入されている
ことを示す。逆に ならＴ−Ag側がTK遺伝子側に向いていることになる。
片には、もとのBKウイルスDNAに存在したVpとＴ−Ag
（Ｔ抗原）をコードする塩基配列の起点部位のごとく一
部が互いに逆向きに含まれており、TK遺伝子に向かって
Vp側又はＴ−Ag側が向くように挿入される場合の２通り
が存在する（第６図、（イ）（ロ））。第６図中の遺伝
子の脇の矢印は遺伝子が読まれる向きを、図の下の名前
についている矢印はＣの上の矢印がVpが読まれる向き
を、TKの上の矢印はTK遺伝子が読まれる向きをそれぞれ
表している。例えば、pBK525Hind III−・▲▼
は、Pm525Hind III−Ｃ DNA断片のVp側が、TK遺伝子が
読まれていく方向にプラスミドpBR322に挿入されている
ことを示す。逆に ならＴ−Ag側がTK遺伝子側に向いていることになる。
１）−複合プラスミドDNAの大腸菌HB101への感染を目
的とする複合プラスミド保持菌の検出 １）−で作成した各種複合プラスミドDNAを用いて、C
aCl2法で実施例（１）と同様にして大腸菌HB101を形質
転換させ、1.4％寒天培地（アンピシリン25μg/mlをの
一部を取り、アンピシリン25μg/mlを含むＬ−培地（バ
クトトリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl5
g/、pH7.2）1.5mlに接種した。37℃で１夜振とう培養
後1mlを微量遠心チューブに写し、12,000回転で30秒間
遠心した。
的とする複合プラスミド保持菌の検出 １）−で作成した各種複合プラスミドDNAを用いて、C
aCl2法で実施例（１）と同様にして大腸菌HB101を形質
転換させ、1.4％寒天培地（アンピシリン25μg/mlをの
一部を取り、アンピシリン25μg/mlを含むＬ−培地（バ
クトトリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl5
g/、pH7.2）1.5mlに接種した。37℃で１夜振とう培養
後1mlを微量遠心チューブに写し、12,000回転で30秒間
遠心した。
菌体ペレットを菌体洗浄液（10mMトリス・HCl,pH8.0、1
mM EDTA、0.85％NaCl）500μに懸濁させ再び同様に
遠心した。菌体ペレットをSTET液（50mMトリス・HCl,pH
8.0、0.8％ショ糖、５％トライトンX100、50mM EDTA）
７μに完全に懸濁させ、30mMトリス緩衝液（pH8.0）
に溶かしたリゾチーム溶液（10mg/ml）を氷水中で７μ
加え混合し、沸騰水中に40秒間浸した後、素早く12,0
00回転、10分間遠心した後、ペレットを取り除いた。上
澄液に冷イソプロピルアルコールを75μ加え、混合し
て−20℃に10分間放置した。次いで12,000回転、７分間
遠心しDNAを沈殿させ上澄液をできるだけ除去し、減圧
下でDNAを乾燥させた。続いて制限酵素BamHI、Hind II
I、Pvu II（いずれも宝酒造（株）製）等で切断して、
寒天平板ゲル電気泳動にかけ、分離されるDNAバンド数
と泳動距離から目的の複合プラスミドをもった菌を選別
した。
mM EDTA、0.85％NaCl）500μに懸濁させ再び同様に
遠心した。菌体ペレットをSTET液（50mMトリス・HCl,pH
8.0、0.8％ショ糖、５％トライトンX100、50mM EDTA）
７μに完全に懸濁させ、30mMトリス緩衝液（pH8.0）
に溶かしたリゾチーム溶液（10mg/ml）を氷水中で７μ
加え混合し、沸騰水中に40秒間浸した後、素早く12,0
00回転、10分間遠心した後、ペレットを取り除いた。上
澄液に冷イソプロピルアルコールを75μ加え、混合し
て−20℃に10分間放置した。次いで12,000回転、７分間
遠心しDNAを沈殿させ上澄液をできるだけ除去し、減圧
下でDNAを乾燥させた。続いて制限酵素BamHI、Hind II
I、Pvu II（いずれも宝酒造（株）製）等で切断して、
寒天平板ゲル電気泳動にかけ、分離されるDNAバンド数
と泳動距離から目的の複合プラスミドをもった菌を選別
した。
制限酵素BamHIは、10mMトリス・HCl,pH7.5、10mM MgCl
2、50mM NaCl、1mMジチオスレイトール中で、Hind III
及びPvu IIは、10mMトリス・HCl,pH7.5、6mM MgCl2、6
0mM NaCl、1mMジチオスレイトール中で実施例と同様の
方法で行った。電気泳動の条件も実施例の方法に準じ
た。
2、50mM NaCl、1mMジチオスレイトール中で、Hind III
及びPvu IIは、10mMトリス・HCl,pH7.5、6mM MgCl2、6
0mM NaCl、1mMジチオスレイトール中で実施例と同様の
方法で行った。電気泳動の条件も実施例の方法に準じ
た。
目的とする複合プラスミドは、BamHIで切断すると3.6Kb
の位置にTK遺伝子に由来するバンドと、約4.9Kbの位置
にpBR322にウイルスDNAのＣ断片が挿入されたDNAに由来
するバンドが見られ（第10図、（ａ））、またHind III
で切断した場合は約0.5Kbの位置にウイルスDNA由来のバ
ンドが、7.9Kbの位置にTK遺伝子がpBR322プラスミドに
挿入されたDNA由来のバンドが見られる（第10図、
（ｂ））。
の位置にTK遺伝子に由来するバンドと、約4.9Kbの位置
にpBR322にウイルスDNAのＣ断片が挿入されたDNAに由来
するバンドが見られ（第10図、（ａ））、またHind III
で切断した場合は約0.5Kbの位置にウイルスDNA由来のバ
ンドが、7.9Kbの位置にTK遺伝子がpBR322プラスミドに
挿入されたDNA由来のバンドが見られる（第10図、
（ｂ））。
またPvu IIによる切断部位は、pBR322に１カ所、TK遺伝
子上に２カ所、Hind III−Ｃ DNA断片上に１カ所存在
するので、この制限酵素で複合プラスミドを切断する
と、挿入されたHind III−Ｃ断片DNAの方向の違いによ
り、切断されて生ずるDNA断片のサイズが異なる（第６
図、（イ）（ロ）（ハ））。従って、寒天ゲル電気泳動
にかけてPvu II切断で生じるDNAのサイズを調べること
により、挿入されたHind III−Ｃ DNA断片の方向を決
定することができる。
子上に２カ所、Hind III−Ｃ DNA断片上に１カ所存在
するので、この制限酵素で複合プラスミドを切断する
と、挿入されたHind III−Ｃ断片DNAの方向の違いによ
り、切断されて生ずるDNA断片のサイズが異なる（第６
図、（イ）（ロ）（ハ））。従って、寒天ゲル電気泳動
にかけてPvu II切断で生じるDNAのサイズを調べること
により、挿入されたHind III−Ｃ DNA断片の方向を決
定することができる。
以上の如く、BamHI、Hind III、Pvu IIで切断して生じ
るDNA断片数とサイズから目的とする３種類の複合プラ
スミド（第６図（イ）（ロ）（ハ）における をそれぞれ保持する形質転換株を識別単離した。
るDNA断片数とサイズから目的とする３種類の複合プラ
スミド（第６図（イ）（ロ）（ハ）における をそれぞれ保持する形質転換株を識別単離した。
上記の〜と同様の方法により、 pBK411Hind III−・▲▼、 pBK522Hind III−・▲▼、 及び （第７図（イ）（ロ）（ハ）、第８図（イ）（ロ）
（ハ）、第９図（イ）（ロ）（ハ））を、それぞれ得
た。
（ハ）、第９図（イ）（ロ）（ハ））を、それぞれ得
た。
１）− 培養細胞へのDNA導入実験に用いる複合プラ
スミドDNAの精製 各複合プラスミドを、エチジウムブロマイドを含むセシ
ウムクロライド密度勾配遠心法に従って調製した（T.Ma
niatis,E.F.Fritsch,J.Shambrook;Molecular cloning,p
250,Cold Spring Harbour Lab.,1982） （２）ラットF2480TK-及びマウスＬ TK-細胞への複合
プラスミドDNAの導入と機能発現 受容細胞はラット繊維芽細胞であるF2408TK-とマウス繊
維芽細胞であるＬ TK-を用いた。両細胞ともチミジン
キナーゼ欠損株（TK-）であり、アミノプテリンによ
り、チミジル酸合成酵素を阻害すると増殖不能な細胞で
あるが、外部からTK遺伝子を取り込むと、サルベージ回
路により、培養液中のチミジンからチミジン−１−リン
酸→チミジン−３−リン酸を合成し、アミノプテリン存
在下でも増殖可能となる。従って、アミノプテリンを含
むHAT培地（ヒポキサンチン15μg/mlアミノプテリン0.1
9μg/ml、チミジン５μg/mlを含む10％仔牛血清添加イ
ーグルMEM培地）で培養することにより、外部DNAである
TK遺伝子を含むプラスミドDNAを取り込んだ細胞を識別
できる。具体的には次のようにおこなった。
スミドDNAの精製 各複合プラスミドを、エチジウムブロマイドを含むセシ
ウムクロライド密度勾配遠心法に従って調製した（T.Ma
niatis,E.F.Fritsch,J.Shambrook;Molecular cloning,p
250,Cold Spring Harbour Lab.,1982） （２）ラットF2480TK-及びマウスＬ TK-細胞への複合
プラスミドDNAの導入と機能発現 受容細胞はラット繊維芽細胞であるF2408TK-とマウス繊
維芽細胞であるＬ TK-を用いた。両細胞ともチミジン
キナーゼ欠損株（TK-）であり、アミノプテリンによ
り、チミジル酸合成酵素を阻害すると増殖不能な細胞で
あるが、外部からTK遺伝子を取り込むと、サルベージ回
路により、培養液中のチミジンからチミジン−１−リン
酸→チミジン−３−リン酸を合成し、アミノプテリン存
在下でも増殖可能となる。従って、アミノプテリンを含
むHAT培地（ヒポキサンチン15μg/mlアミノプテリン0.1
9μg/ml、チミジン５μg/mlを含む10％仔牛血清添加イ
ーグルMEM培地）で培養することにより、外部DNAである
TK遺伝子を含むプラスミドDNAを取り込んだ細胞を識別
できる。具体的には次のようにおこなった。
細胞に導入するDNA量は培養皿当り１μｇとし、複合プ
ラスミドをTK遺伝子と転写促進配列の機能発現に影響を
与えない部位、即ち制限酵素Sac IまたはSal Iの認識部
位で切断開裂し、下記の〜の直鎖状DNAを調製し
た。
ラスミドをTK遺伝子と転写促進配列の機能発現に影響を
与えない部位、即ち制限酵素Sac IまたはSal Iの認識部
位で切断開裂し、下記の〜の直鎖状DNAを調製し
た。
ウイルスDNAのHind III−Ｃ DNA断片のみをpBR322に
組み込み、Sal Iで開裂したもの。これは、常にコロニ
ーを生じないネガティブコントロールである。
組み込み、Sal Iで開裂したもの。これは、常にコロニ
ーを生じないネガティブコントロールである。
TK遺伝子のみをpBR322に組み込み、Sal Iで開裂した
もの（コントロール）（第11図、（ａ）） TK遺伝子の上流に、Hind III−Ｃ DNA断片のVp側がT
K遺伝子に向かうように組み込み、Sal Iで開裂したもの
（第11図、（ｂ）） TK遺伝子の上流に、Hind III−Ｃ DNA断片のＴ−Ag
側がTK遺伝子に向かうように組み込み、Sal Iで開裂し
たもの（第11図、（ｃ）） TK遺伝子の4Kb上流に、Hind III−Ｃ DNA断片のVp側
がTK遺伝子に向かうように組み込み、sac Iで開裂した
もの（第11図、（ｄ）） TK遺伝子の下流に、Hind III−Ｃ DNA断片を組み込
み、Sal Iで開裂したもの（第11図、（ｅ）） ラットF2408TK-細胞に対しては上記〜の直鎖状DNA
を、マウスＬ TK-細胞については〜の直鎖状DNAを
それぞれ導入した。
もの（コントロール）（第11図、（ａ）） TK遺伝子の上流に、Hind III−Ｃ DNA断片のVp側がT
K遺伝子に向かうように組み込み、Sal Iで開裂したもの
（第11図、（ｂ）） TK遺伝子の上流に、Hind III−Ｃ DNA断片のＴ−Ag
側がTK遺伝子に向かうように組み込み、Sal Iで開裂し
たもの（第11図、（ｃ）） TK遺伝子の4Kb上流に、Hind III−Ｃ DNA断片のVp側
がTK遺伝子に向かうように組み込み、sac Iで開裂した
もの（第11図、（ｄ）） TK遺伝子の下流に、Hind III−Ｃ DNA断片を組み込
み、Sal Iで開裂したもの（第11図、（ｅ）） ラットF2408TK-細胞に対しては上記〜の直鎖状DNA
を、マウスＬ TK-細胞については〜の直鎖状DNAを
それぞれ導入した。
培養細胞への導入はWiegleらの方法（Wiegler,M.,Silve
rstein S.,Lee L.S.,Pellicer A.,Cheng T.C.,Axel R.,
Cell,ll,p223,1977）に準じた。導入を実施する24時間
前に、直径60mmの培養皿当り2.5〜5.0X105個の割合で細
胞を調製した（培養液組成：仔牛血清10％イーグルME
M）。さらに導入を実施する３〜５時間前に新鮮な同培
養液に置換した。一方、250μの蒸留水に溶かした直
鎖状DNA1μｇに2M CaCl2を31μ加えて混合し、これ
に２倍のHBS液（NaCl1.636g,Hepes 1.19g、Na2HPO40.0
4g/100ml、1NのNaOH液でpH7.1にして用いる）250μを
徐々に滴下して加え、導入用直鎖DNAを用意した。これ
を室温に15分間放置した後、前述のように調製した培養
細胞の上一面に振りかけて37℃で培養した。４時間後培
養液を除去し、イーグルのMEM培地で洗浄後、15％グリ
セリン溶液（グリセリン15ml、２倍のHBS液50ml、水35m
l）1.5mlを加えて１〜1.5分間処理した。ついでできる
だけ液を除いて再び洗浄し10％仔牛血清を含むイーグル
MEM培養液に置換して培養した。導入２日後、トリプシ
ンで細胞を剥し、各培養皿１枚を３枚の培養皿に再培養
した。同時に培養液はHAT培地に置換した。１〜２日毎
にHAT培地を交換して培養を続け、５日目頃からTK-細胞
のコロニーを認めた。導入２週間後にギムザ染色し、コ
ロニー数を数えた。転写促進配列の活性は、pTKに対す
る比活性で表示した（第１表）。その結果、WT501、Pm4
11、Pm522、Pm525から誘導された転写促進配列はラット
F2408TK-細胞で転写促進活性をコントロール（第１表、
ａ）に対して7.9〜23.9倍の活性を示した（第１表）。
rstein S.,Lee L.S.,Pellicer A.,Cheng T.C.,Axel R.,
Cell,ll,p223,1977）に準じた。導入を実施する24時間
前に、直径60mmの培養皿当り2.5〜5.0X105個の割合で細
胞を調製した（培養液組成：仔牛血清10％イーグルME
M）。さらに導入を実施する３〜５時間前に新鮮な同培
養液に置換した。一方、250μの蒸留水に溶かした直
鎖状DNA1μｇに2M CaCl2を31μ加えて混合し、これ
に２倍のHBS液（NaCl1.636g,Hepes 1.19g、Na2HPO40.0
4g/100ml、1NのNaOH液でpH7.1にして用いる）250μを
徐々に滴下して加え、導入用直鎖DNAを用意した。これ
を室温に15分間放置した後、前述のように調製した培養
細胞の上一面に振りかけて37℃で培養した。４時間後培
養液を除去し、イーグルのMEM培地で洗浄後、15％グリ
セリン溶液（グリセリン15ml、２倍のHBS液50ml、水35m
l）1.5mlを加えて１〜1.5分間処理した。ついでできる
だけ液を除いて再び洗浄し10％仔牛血清を含むイーグル
MEM培養液に置換して培養した。導入２日後、トリプシ
ンで細胞を剥し、各培養皿１枚を３枚の培養皿に再培養
した。同時に培養液はHAT培地に置換した。１〜２日毎
にHAT培地を交換して培養を続け、５日目頃からTK-細胞
のコロニーを認めた。導入２週間後にギムザ染色し、コ
ロニー数を数えた。転写促進配列の活性は、pTKに対す
る比活性で表示した（第１表）。その結果、WT501、Pm4
11、Pm522、Pm525から誘導された転写促進配列はラット
F2408TK-細胞で転写促進活性をコントロール（第１表、
ａ）に対して7.9〜23.9倍の活性を示した（第１表）。
尚、の直鎖状DNAは、ネガティブコントロールであ
り、常にコロニーを生じないので、その結果は表中には
示していない。
り、常にコロニーを生じないので、その結果は表中には
示していない。
更にこの転写促進活性は、目的遺伝子と促進配列との向
きに関係なく発現された（第１表、ｂ、ｃ）。
きに関係なく発現された（第１表、ｂ、ｃ）。
またこの転写促進配列は目的遺伝子から4Kb離れても近
傍にある場合の約70％の活性を示し（第１表ｄ）かつ目
的遺伝子の反対側（即ち下流側）に組み込まれてもコン
トロールの1.8から4.8倍の活性を示した（第１表、
ｅ）。
傍にある場合の約70％の活性を示し（第１表ｄ）かつ目
的遺伝子の反対側（即ち下流側）に組み込まれてもコン
トロールの1.8から4.8倍の活性を示した（第１表、
ｅ）。
上記のような転写促進活性はマウスＬ TK-細胞でも同
様に発現された。その結果は第２表に示す。
様に発現された。その結果は第２表に示す。
また以上の実験から、図２〜図５に示した転写促進配列
を有用物質生産遺伝子と連結させ真核細胞内で発現させ
ることにより、目的遺伝子産物の産生量を数十倍に増加
できることが立証された。
を有用物質生産遺伝子と連結させ真核細胞内で発現させ
ることにより、目的遺伝子産物の産生量を数十倍に増加
できることが立証された。
第１図はPm525Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込む
手順を示す。 第２図は転写促進配列Pm525の塩基配列図を示す。 第３図は転写促進配列WT501の塩基配列図を示す。 第４図は転写促進配列Pm411の塩基配列図を示す。 第５図は転写促進配列PM522の塩基配列図を示す。 第６図はPm525Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK525Hind III−Ｃを示す。 第７図はWT501Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK501Hind III−Ｃを示す。 第８図はPm411Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK411Hind III−Ｃを示す。 第９図はPm522Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK522Hind III−Ｃを示す。 第10図は複合プラスミドpBK525Hind III−Ｃの制限酵素
切断後の電気泳動図を示す。 第11図は真核細胞の形質導入に用いる直鎖状複合プラス
ミドの模式図を示す。
手順を示す。 第２図は転写促進配列Pm525の塩基配列図を示す。 第３図は転写促進配列WT501の塩基配列図を示す。 第４図は転写促進配列Pm411の塩基配列図を示す。 第５図は転写促進配列PM522の塩基配列図を示す。 第６図はPm525Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK525Hind III−Ｃを示す。 第７図はWT501Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK501Hind III−Ｃを示す。 第８図はPm411Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK411Hind III−Ｃを示す。 第９図はPm522Hind III−ＣをプラスミドpTKに組み込ん
だ複合プラスミドpBK522Hind III−Ｃを示す。 第10図は複合プラスミドpBK525Hind III−Ｃの制限酵素
切断後の電気泳動図を示す。 第11図は真核細胞の形質導入に用いる直鎖状複合プラス
ミドの模式図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】（１） 下記の核酸配列： （２） 下記の核酸配列： （３） 下記の核酸配列： 及び （４） 下記の核酸配列： からなる群から選ばれた配列を含むことを特徴とする転
写促進活性を示すDNA断片。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044437A JPH0789930B2 (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | ウイルス性転写促進配列 |
| US06/709,281 US4722897A (en) | 1984-03-08 | 1985-03-07 | Viral enhancer DNA segments |
| EP85301617A EP0154566B1 (en) | 1984-03-08 | 1985-03-08 | Viral enhancer dna segments |
| DE8585301617T DE3577994D1 (de) | 1984-03-08 | 1985-03-08 | Vergroessernde virale dna-segmente. |
| AT85301617T ATE53237T1 (de) | 1984-03-08 | 1985-03-08 | Vergroessernde virale dna-segmente. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044437A JPH0789930B2 (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | ウイルス性転写促進配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188075A JPS60188075A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH0789930B2 true JPH0789930B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=12691462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044437A Expired - Lifetime JPH0789930B2 (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | ウイルス性転写促進配列 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4722897A (ja) |
| EP (1) | EP0154566B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0789930B2 (ja) |
| AT (1) | ATE53237T1 (ja) |
| DE (1) | DE3577994D1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5017477A (en) * | 1985-10-25 | 1991-05-21 | Biotechnica International, Inc. | Enhancing DNA sequencies derived from the sacQ gene |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| EP0237913A1 (en) * | 1986-03-21 | 1987-09-23 | Miles Inc. | Transcription effector sequences |
| US5550036A (en) * | 1986-04-09 | 1996-08-27 | Eli Lilly And Company | Method for co-amplification of human protein C genes in human cells |
| EP0245949B1 (en) * | 1986-04-09 | 1997-10-29 | Eli Lilly And Company | A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer |
| CA1340384C (fr) * | 1986-04-09 | 1999-02-09 | Eli Lilly And Company | Method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer |
| DE3853886T2 (de) * | 1987-09-17 | 1995-10-05 | Massachusetts Inst Technology | Menschliche, erythroid-spezifische transkriptionsenhancer. |
| US5698390A (en) * | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
| CA1332049C (en) * | 1988-10-07 | 1994-09-20 | Eli Lilly And Company | Eukaryotic expression |
-
1984
- 1984-03-08 JP JP59044437A patent/JPH0789930B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-07 US US06/709,281 patent/US4722897A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-03-08 DE DE8585301617T patent/DE3577994D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-08 AT AT85301617T patent/ATE53237T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-08 EP EP85301617A patent/EP0154566B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4722897A (en) | 1988-02-02 |
| DE3577994D1 (de) | 1990-07-05 |
| ATE53237T1 (de) | 1990-06-15 |
| JPS60188075A (ja) | 1985-09-25 |
| EP0154566A3 (en) | 1985-10-30 |
| EP0154566B1 (en) | 1990-05-30 |
| EP0154566A2 (en) | 1985-09-11 |
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