JP3014475B2 - 修飾転写調節単位とその用途 - Google Patents
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Description
の主要後期プロモーター(MLP)を利用するものであ
る。MLPは、転写を開始するためのユニーク開始部位
(キャップ部位)を含有しており、これは、2つの調節要
素、すなわちキャップ部位に対してほぼ−25〜−31
の位置のTATA領域と、ほぼ−52〜−64の位置の
主要後期転写因子に対する結合部位、とによる指令を受
ける。さらにこの発明は、エンハンサー配列を利用し
て、アデノウイルスの主要後期プロモーターからの発現
を増大するものである。多くのエンハンサー配列が知ら
れており、遺伝子の発現を促進するそれらの性能は文献
によく記載されている。この発明で好ましいエンハンサ
ーはヒトポリオーマウイルスBK、P2株(Bergら、N
ucl.Acids Res.16巻、9057頁、1988年)
由来のものである。このエンハンサーは、多くの細胞系
列(セルライン)で、後期プロモーター由来の発現を刺激
するが、アデノウイルスのE1a遺伝子産物のような大
きなDNAウイルスの即時型(前初期)遺伝子産物を発
現する細胞に於いて最も有用である。これらの条件下
で、E1aタンパク質は、予想外のことであるが、BK
Vエンハンサーの活性を刺激する(Grinnellら、Mol,
Cell.Biol.、8巻、3448頁、1988年)。
dT)・ポリ(dA−dC)すなわち“GT要素"が重要であ
る。この要素は、真核細胞のゲノム中に広く分布してお
り、いくつかの公知の遺伝子の非翻訳領域とイントロン
中に見出されている。この要素は、左回転(left−hande
d)のDNAを形成することができ、組換えと遺伝子変換
の場合に役割を演ずることが示唆されている。この要素
は、SV40初期プロモーターに対して弱いエンハンサ
ー活性をもっていることは示唆されているが、MLPと
一緒に用いた場合はエンハンサー活性をもっていない
(Bergら、Mol.Cell.Biol.、9巻、5248頁、
1989年)。全く予想外のことであるが、エンハンサ
ー活性が、アデノウイルスのE1aタンパク質のよう
な、大きなDNAウイルスの即時型遺伝子産物の存在
下、GT要素から引出すことができる。
アデノウイルス2型由来の3分節系(tripartite)リー
ダー(TPL)配列を示す、合成により誘導されたDNA
配列である。この配列は、後期ウイルスmRNAに見ら
れるもので、このようなウイルスの伝達暗号の翻訳を、
ウイルスの感染サイクルの後期には促進するが、感染に
続く初期には促進しないと考えられている(Zhangら、
J.Biol.Chem.、264巻、10679頁、198
9年;Dolphら、J.Virol.、62巻、2059頁1
988年)。しかし、効率的な転写(翻訳ではない)が、
感染後の後期に、アデノウイルスTPL配列に依存して
いるということ(Alonso−Caplen、J.Virol.、6
2巻、1606頁、1988年)と、転写を促進するに
は隣接イントロンの149個のヌクレオチドに加えて、
第1リーダー(nt41まで)全体が必要であったというこ
とも報告されている。TPLが、感染サイクルの後期
に、アデノウイルス感染細胞の環境内でのみ非アデノウ
イルスmRNAを安定化したと報告されている(Mooreと
Shenk、Nucl.Acids Res.、16巻、2247
頁、1988年)。したがって、TPLが、ウイルス発
現に続く後期を除いて、遺伝子の発現を劇的に促進する
ことは、既刊の文献からは予想されないであろう。この
発明の合成配列は、後期感染条件下アデノウイルス感染
細胞には用いられない。対照的に、ベクターは初期ウイ
ルス機能を発現する形質転換細胞に用いられる。さら
に、合成TPLは、転写刺激を行うのに必要であると報
告されたイントロン配列を含有していない。予想外のこ
とであるが、この発明の合成TPLは、この発明のベク
ターからの発現を刺激するのみなず、後期ウイルス感染
細胞内で最適の転写を行うのに必要な配列を含有してい
る、従来から開示されている非スプライスTPL配列よ
りもほぼ2倍効率が良い。
ロモーターの上流調節要素(MLTF)の近くに位置する
BKウイルスのP2エンハンサー、アデノウイルス2型
の主要後期プロモーター、前記プロモーターを刺激する
位置にあるポリ−GT要素、およびアデノウイルスのス
プライスされた3分節系リーダー配列を含有するDNA
配列、を含有する修飾型転写調節単位に関する。この修
飾型転写単位は、有用な物質をコードする遺伝子の発現
を駆動する位置にあるとき、転写を大きく増大しそれ故
有用物質の発現レベルを大きく増大させるのに有用であ
る。この発明のその外の重要な態様は、宿主の真核細胞
内で組換え遺伝子の転写と発現を増大させるために、ア
デノウイルスのE1A遺伝子産物のような、大きなDN
Aウイルスの即時型遺伝子産物の存在下で修飾転写調節
単位を用いる方法に関する。この発明の発現ベクターの
多様性は、クロラムフエニコールアセチルトランスフエ
ラーゼ、ヒトプロテインCおよび活性ヒトプロテインC
のような多様なタンパク質の、当該修飾転写調節単位に
より駆動される高レベルの発現によって証明される。
質転換された細胞内でヒトプロテインCの発現が増大す
る。かような細胞は、ヒトプロテインCまたは活性ヒト
プロテインCのような、充分にγ−カルボキシル化され
たタンパク質を産生するのに特に好ましい宿主である。
従って、この発明には別の態様として、γ−カルボキシ
ル化タンパク質の改良製造方法が含まれる。この発明の
さらに他の重要な態様は、有用な遺伝子産物の発現をさ
らに増大する方法に関する。この方法は以下のようにし
て実施される。すなわち(a)有用な物質を発現し分泌す
るが、この発明の修飾転写調節単位を含有するベクター
を含有していない細胞クローンの安定な形質転換細胞を
得て、次いで(b)かような安定に形質転換されたクロー
ンを、同じ有用な物質をコードする遺伝子であってその
発現がこの発明の修飾転写調節単位で駆動される遺伝子
を含有するベクターで形質転換することによって実施さ
れる。上記の二重に形質転換された細胞をサブクローン
し、遺伝子発現に適した条件下で培養すると、第2のベ
クターで形質転換されなかったクローンと比較して、発
現レベルの劇的な増大が観察された。
定義する。 抗生物質:天然のまゝまたはわずかな化学的修飾によっ
て、他の微生物質もしくは真核細胞の増殖を阻害するか
または殺す、微生物によって産生される物質。 抗生物質耐性を供与する遺伝子:抗生物質に対する耐性
を供与する活性をコードするDNAセグメント。 ApR:アンピシリン耐性表現型もしくは同表現型を供与
する遺伝子。 クローニング:組換えDNAクローニングベクターにD
NAのセグメントを組込むプロセス。 CmR:クロラムフエニコール耐性表現型または同表現型
を供与する遺伝子。 E1A:ポリ−GT要素を活性化してエンハンサー活性
を発現し、かつBKウイルスエンハンサーを活性化でき
るアデノウイルスの即時初期遺伝子産物。 ep:T抗原遺伝子のSV40初期プロモーター、T抗原
結合部位、およびSV40の複製起点を含有するDNA
セグメント。 真核プロモーター:真核細胞内でプロモーターとして機
能するDNA配列。
主要後期プロモーターの上流調節要素(MLTF)の近く
に位置するBKウイルスのエンハンサー要素、アデノウ
イルス2型の主要後期プロモーター、前記プロモーター
を刺激する位置にあるポリ−GT要素、およびアデノウ
イルス2型のスプライスされた3分節系リーダーをコー
ドするDNA配列を含有する修飾転写調節単位。このG
MBT転写調節単位として最もよい例は、イー・コリ
(E.coli)K−12 AG1/pGTC(NRRLB−1
8593)内に見られるプラスミドpGTC中に見出され
る、約900塩基対のHindIIIカセットである。 GTエンハンサーシステム:MLPのようなプロモータ
ーに連結されたポリ−GT要素であり、このMLP内で
は、ポリ−GT要素は、それ自体エンハンサー活性をも
っていないが、E1A遺伝子産物のような大きなDNA
ウイルスの即時型遺伝子の産物、または同様に活性化す
るウイルス遺伝子産物によって、エンハンサーとして活
性化される。 HmR:ハイグロマイシン耐性表現型または同表現型を供
与する遺伝子。 IVS:イントロンをコードするDNAであるが、介在
配列とも呼ばれる。
きさが約10kbより大きいゲノムをもっているウイルス
であり、すなわちポックスウイルス、アデノウイルスお
よびヘルペスウイルスのいずれかである。 MLP:アデノウイルスの主要後期プロモーターであ
り、本明細書では、アデノウイルス後期プロモーター、
アデノウイルス2型後期プロモーター、またはAd2後
期プロモーターとも呼ばれている。 MLTF結合部位:アデノウイルスDNA内の、主要後
期転写因子(MLTF)が結合する部位。MLTFはML
Pの活性を得るために必要である。 NeoR:ネオマイシン耐性を供与する遺伝子であり、ま
た真核細胞の宿主にG418耐性を供与するのに使用す
ることができる。 ori:プラスミドの複製起点。 pA:ポリアデニル化信号をコードするDNA配列。
A配列であって、本願では、nが21の場合の配列を例
示しているが、nが21より大きいかもしくは小さい、
長さが変化した配列も意味し、さらに化学的に合成され
た(GT)n−(CA)n配列;または(GT)n−(CA)nトラ
クトを含有するヒトゲノムDNA断片を意味する。 プロモーター:DNAのRNAへの転写を指令するDN
A配列。 組換えDNAクローニングベクター:自己複製因子もし
くは自己組込み因子であり、1つ以上の追加のDNAセ
グメントを加えることができるか、もしくは加えられて
いるDNA分子からなる。 組換えDNA発現ベクター:プロモーターおよび関連す
る挿入部位を含有する組換えDNAクローニングベクタ
ーであり、その挿入部位には、有用な産物をコードする
DNA配列を挿入して発現することができる。 組換えDNAベクター:組換えDNAクローニングベク
ターもしくは組換えDNA発現ベクター。 レプリコン:組換えDNAベクターの複製を調節するD
NA配列。
成する線状DNA。 rRNA:リポソームリボ核酸 感受性宿主細胞:所定の抗体などの毒性化合物の存在下
では、これらに対する耐性を供与するDNAセグメント
なしで増殖することができない宿主細胞。 構造遺伝子:ひとつのポリペプチドをコードし、かつ開
始コドンと終止コドンをコードするDNAを含有するD
NA配列。 TcR:テトラサイクリン耐性表現型または同表現型を供
与する遺伝子。 形質転換細胞:形質転換を受けた受容体宿主細胞。 形質転換:受容体宿主細胞へのDNAの導入。 tRNA:転移リボ核酸。
である。これらの地図の開示では、各図は正確な大きさ
の比率で画かれていない。図2はプラスミドpBKE1
の制限部位と機能地図である。図3はプラスミドpBKn
eo1の制限部位と機能地図である。図4はプラスミドp
SV2catの制限部位と機能地図である。図5はプラス
ミドpLPcatの制限部位と機能地図である。図6はプラ
スミドpBLcatの制限部位と機能地図である。図7はプ
ラスミドpBKcatの制限部位と機能地図である。図8は
プラスミドpSBLcatの制限部位と機能地図である。図
9はプラスミドpL133の制限部位と機能地図であ
る。図10はプラスミドpLPCの制限部位と機能地図
である。図11はプラスミドpLPC4の制限部位と機
能地図である。図12はプラスミドpSV2hygの制限部
位と機能地図である。図13はプラスミドpLPChyg1
の制限部位と機能地図である。図14はプラスミドpB
W32の制限部位と機能地図である。図15はプラスミ
ドpLPChd1の制限部位と機能地図である。図16は
プラスミドpGTCの制限部位と機能地図である。図1
7はプラスミドpGT−dの制限部位と機能地図である。
図18はプラスミドpGT−hの制限部位と機能地図であ
る。
規な修飾型転写調節単位に関し、この単位は、アデノウ
イルスの主要後期プロモーターの上流調節要素の近くに
位置するBKウイルスのP2エンハンサー(MLTF)、
アデノウイルス2型の主要後期プロモーター、前記プロ
モーターを刺激する位置にあるポリ−GT要素、および
アデノウイルスのスプライスされた3分節系のリーダー
配列をコードするDNA配列を含有している。このGM
BT単位は、有用な物質をコードする遺伝子が発現する
のに適正な位置にあるとき、真核細胞内でその有用な物
質を高レベルで発現させる。またこの発明は、GBMT
調節単位で転写を調節できる位置に有用な物質をコード
している組換えDNAベクターを用いて、宿主細胞を形
質転換することによって、真核細胞の宿主中で有用な物
質を発現する方法に関する。形質転換された宿主細胞が
大DNAウイルスの即時型遺伝子産物を発現する場合、
予想外に高レベルの発現を得ることができる。このよう
な即時型遺伝子産物の例には、アデノウイルスE1Aタ
ンパク質、アデノウイルスE1Bタンパク質、仮性狂犬
病ウイルスIEタンパク質、および単純ヘルペスウイル
スICP4タンパク質が含まれる。このような即時型遺
伝子産物をコードする遺伝子は、GBMT単位とは別の
ベクター上で、宿主細胞内に同時形質転換することがで
きるか、またはGBMT単位と同じベクター上で、宿主
細胞に形質転換できる。あるいは最も好ましいのは、宿
主細胞が、即時型遺伝子産物をすでに発現している樹立
細胞の場合である。当業者には、多くの樹立細胞系が即
時型遺伝子産物を発現すること、および、かような細胞
系(セルライン)が本発明の方法に特に有用なことは理解
されよう。
に形質転換された細胞系内で、有用な物質の発現レベル
を大きく増大させる方法に関する。宿主細胞は、第1に
GBMT単位を含有していない発現ベクターで安定に形
質転換され、次いで最高の発現レベルを示すサブクロー
ンを選択する。次にこれらのサブクローンは、その発現
がGBMT単位によって駆動される有用な物質をコード
する遺伝子を含有するベクターで2回目の形質転換が行
われる。次いで、予想外に高いレベルの有用物質を分泌
するクローンとサブクローンを選択する。この発明の発
現ベクターは、有用物質をコードするDNA分子が、発
現するために正しい位置でベクターに容易に挿入できる
か、もしくは挿入されるように構築した。さらにGBM
T転写単位は、“カセット"を形成するように構築した
が、そのカセットは、発現ベクターから、比較的小さな
制限断片上に単離することができる。このカセットは、
各種の発現ベクター間で容易にシャトルすることができ
る。本明細書に具体的に例示した発現ベクターは、この
発明の方法において、転写を駆動するGBMT単位を利
用している。
は、ヒトプロテインCをコードする遺伝子の転写と発現
を駆動する位置にあるGBMT単位を含有するプラスミ
ドpGTCである。ヒトプロテインCをコードする遺伝
子は、1988年10月4日に付与されたBangらの米
国特許第4,775,621号に開示され特許請求されて
おり、この特許の全教示事項は本明細書に援用する。プ
ラスミドpGTCは、エシエリキア・コリ(Escherichia
coli)(大腸菌)K12 AG1/pGTCから常法で
単離することができる。この菌株の培養物は1990年
1月18日に米国、イリノイ州、ペオリアにあるNorth
ern Regional Research Loboratoriesに寄託され
その永久貯蔵培養収集物になった。イー・コリK12
AG1/pGTCは、受託番号NRRL B−1859
3号で入手することができる。プラスミドpGTCの制
限部位と機能地図を添付図面の図16に示す。この発明
の他のプラスミドもGBMT単位を含有している。プラ
スミドpGT−dはGBMT単位を含有しているが、この
GBMT単位は、有用物質をコードする遺伝子の挿入
が、GBMTカセットの下流のユニーク(単一の)BclI
部位を利用してイー・コリのdam-菌株内でDNAを調製
することによって達成されるような位置にある。またプ
ラスミドpGT−dは、メトトレキサートに対する耐性を
供与するので選択可能なマーカーとして有用なマウスdh
fr遺伝子を含有している。プラスミドpGT−dは、イー
・コリK12AG1/pGT−dから単離することができ
る。この菌株は、1990年1月18日にNRRLへ寄
託されたので受託番号NRRL B−18591号で入
手できる。プラスミドpGT−dの制限部位と機能地図を
添付図面の図17に示す。
し、そのGBMT単位は、有用産物をコードする遺伝子
の挿入が、GBMTカセットの下流のユニーク(単一の)
BclI部位を利用してイー・コリのdam-菌株内でDNA
を調製することによって達成できるような位置にある。
しかしプラスミドpGT−hはハイグロマイシン耐性決定
基をコードする遺伝子を含有している。プラスミドpG
T−hはイー・コリK12AG1/pGT−hから単離す
ることができる。この菌株も、1990年1月18日に
NRRLに寄託された。その培養物は受入れ番号NRR
L B−18592号で入手できる。プラスミドpGT
−hの制限部位と機能地図は添付図面の図18に示す。
プラスミドpGTC、pGT−dおよびpGT−hの約90
0塩基対のHindIIIカセット中に見られるGBMT
単位は次のような配列を含有している。
ノウイルス2型の主要後期プロモーターとを最適間隔を
おいて含有しており、そのBKエンハンサーの上流にポ
リGT要素を含有している。このBKエンハンサーは、
主要後期プロモーターから200塩基対離れていてもよ
く、ポリGT要素はプラスミドのどこに位置してもよ
い。さらにこのカセットは、ヨーロッパ特許願8730
3083.7号でGrinnellらが先に開示したスプライ
スされていない変形よりも約2倍有効な合成の3分節系
リーダー配列を利用する。なお上記ヨーロッパ特許願の
全教示事項は本願に援用する。具体的に述べると、GB
MTHindIIIカセットのヌクレオチド62〜104
はポリGT(AC)要素を含有し、この要素は、大DNA
ウイルスの即時型遺伝子産物のようなトランス作用遺伝
子産物の存在下で遺伝子発現を増大させるのに有用であ
る。真核発現にかようなGT要素を使用することは、1
990年4月11日に公告されたBergらのヨーロッパ
特許公告0363127号に開示されている。なおこの
特許公告の全教示事項は本願に援用する。
チド306〜507は、アデノウイルスの主要後期プロ
モーターからの転写を増大するシス作用要素であるBK
ウイルスP2エンハンサーを含有している。このBKエ
ンハンサーは、多種類の変異体が知られているが、3つ
の反復配列(原型)で構成された、DNAの明確なセグメ
ントである。この発明のGBMTカセット中に見られる
BKエンハンサーは、塩基306から塩基376までと
さらに塩基409から塩基475まで反復して延びる6
8塩基対を含有している。32塩基対が、塩基377か
ら塩基408までとさらに塩基476から塩基507ま
で反復して延びている。GBMTカセットのMLTF結
合部位は塩基581で始まり配列5'−GGCCACG
TGACC−3'を含有することが分かっている。アデ
ノウイルス主要後期プロモーターのMLTF結合部位が
BKウイルスのP2エンハンサーの近くに位置している
ことがGBMT単位を使用することから生じる転写レベ
ルを増大させるのに役立つ。MLPの“TATA"領域
がカセットの塩基612と620の間に見られ、一方ア
デノウイルスの合成の3分節系リーダー配列は塩基64
3と844の間に位置している。
る各種のベクターを用いて宿主細胞を形質転換して、こ
の発明のGBMT転写単位の強度を例示した。プラスミ
ドpLPC−hd、pLPC−hyg、pLPC−dhfrおよびp
BL2−CATはすべてBLプロモーター系を含有して
いる。これらの各プラスミドの構築プロトコールは、後
記の実施例で詳細に開示する。BLプロモーター系はア
デノウイルス2型の主要後期プロモーターと連結したB
Kウイルスエンハンサーを利用する。プラスミドpLA
PC−IRSとpSBL−CATはSBLプロモーター
系を含有している。プラスミドpLAPC−IRSは活
性ヒトプロテインCをコードする遺伝子を含有している
が、このプラスミドの構築については、1989年6月
7日に公告されたBangらのヨーロッパ特許公告031
9312号に記載されており、その教示事項は本明細書
に援用する。SBLプロモーター系は、アデノウイルス
主要後期プロモーターと連結したタンデムSV40エン
ハンサーBKエンハンサーを含有している。
ルス後期プロモーターを含有し、エンハンサー配列を含
有していない。プラスミドpGTCはGBMT単位を含
有し、この単位はヒトプロテインCをコードする遺伝子
の発現を駆動する位置にあるが、一方プラスミドpGT
AC−hはGBMT転写単位を含有し、この単位は活性
ヒトプロテインCをコードする遺伝子の発現を駆動する
位置にある。前記の各プラスミドを用いてヒトの293
細胞を形質転換したが、これはアデノウイルスE1A遺
伝子産物を発現する安定した形質転換細胞系である。シ
リアンハムスターAV12−664細胞のような、E1
A遺伝子産物も発現する他の細胞系がこの発明の方法で
利用できかつ有用であることは当業者ならば分かるであ
ろう。
形質転換細胞を得るために、遺伝子産物の即時発現(3
日間の過渡的発現)をチェックするか、または選択薬剤
とともに培養した。各ベクターからの遺伝子産物の分析
法は、当該技術分野ではよく知られており、Grinnell
ら、Biotechnology、5巻、1189〜1192頁、1
987年;およびGrinnelら、Mol.Cell.Biol.、
6巻、3596〜3605頁、1986年に開示されて
いるが、その教示事項は本明細書に援用する。表1は過
渡(一時的)発現検定の結果を示し、一方表2は、安定に
組込まれたプラスミドからのチモーゲンと活性ヒトプロ
テインCの発現の分析結果を示す。
相対的レベルは、インジケーター遺伝子としてのCAT
遺伝子と、クロラムフエニコールアセチルトランスフエ
ラーゼ(CAT)酵素とを用いて測定した。BLとGBM
T間の相対的プロモーター強度は、インジケーター遺伝
子としてヒトプロテインC遺伝子を用い、標準ELIS
A検定法で測定した。
12に示す。この実施例では、ヒトプロテインCを産生
する安定に形質転換された細胞系が、pGTCベクター
による形質転換によって増強された。まずプラスミドp
LPCを用いて293細胞を安定に形質転換し、一般の
バックグランド細胞集団の2〜3倍のヒトプロテインC
を分泌するサブクローンを選択した。これらの安定にト
ランスフエクトされた細胞を、次にプラスミドpGTC
で再形質転換を行った。このプラスミドはGBMT転写
単位で駆動される、ヒトプロテインCをコードする遺伝
子を含有している。全く予想外のことであるが、293
細胞をpGTCで1回形質転換した場合よりもはるかに
多いクローンが産生されることが発見された。さらに、
この2重に形質転換された細胞は、ベクターpLPCで
のみ形質転換し、次に生産性が最高のクローンを選択し
た親細胞系の3.5〜6.3倍のヒトプロテインCを分
泌した。以下の実施例で、この発明の、ベクター、方
法、化合物、および組換え生物をより詳細に述べる。当
業者ならば、以下の実施例に記載されている特定の試
薬、装置および手法は単に例示されているだけであり、
この発明を限定するものでないことが分かるであろう。
American Type Culture Collectionから得られ
る。このウイルスは凍結乾燥された形態で供給され、こ
れをハンクスの平衡塩類溶液(米国、ニユーヨーク州1
4072、グランド・アイランド、スタンレイ・ロード
3175、Gibco社)に、約105のプラーク形成単位(p
fu)/mlの力価となる様に再懸濁させる。BKウイルス
DNAを調製するのによい宿主は一次ヒト胎児腎臓(P
HEK)細胞であり、米国、ヴァージニア州2210
1、マクリーン、オールド・スプリングハウス・ロード
7655のFlow Laboratories Inc.からカタログ
番号0−100で、またはM.A.Bioproduets社から
カタログ番号70−151で入手できる。あるいは、B
KウイルスはVero細胞(ATCCカタログ番号CCL8
1)中で増殖させることができる。約106のPHEK細
胞の全面生長単層の入った約5つの75mm2ポリスチレ
ンフラスコを用いてウイルスを調製する。105pfu/ml
の力価のBKウイルス約1mlを各フラスコに添加し、次
に37℃で1時間インキュベートし、次に新たに調製し
た培地[ダルベッコの修飾イーグル培地(Gibco社)に1
%ウシ胎仔血清を補充したもの]を添加し、生成した感
染細胞を、37℃で、10〜14日間インキュベートす
るか、またはウイルスの充分な細胞変性効果が観察され
るまでインキュベートする。この細胞変性効果は、細胞
系毎およびウイルス毎に変動するが、通常、細胞の、ラ
ウンディングアップ(rounding up)、クランピング(clu
mping)および培地ディスクからのはがれおちで構成され
ている。
って細胞から放出され次に細胞の破片を5000×gで
遠心分離することによって除去する。上澄み液1l中の
ウイルスを100gのPEG−6000を添加すること
によって沈澱させて集め、溶液を4℃で24時間インキ
ュベートし、5000×gで20分間遠心分離する。生
成したペレットを、0.1×SSC緩衝液(1×SSC
=0.15M NaClおよび0.015Mクエン酸ナト
リウム、pH=7)に、元の体積の1/100になる様溶
解する。ウイルスの懸濁液を、試験管内の飽和KBr溶
液15mlの上に加層し、次に75,000×gで3時間遠
心分離する。遠心分離後、KBr溶液中に2つのバンド
が現れれる。下方のバンドは、完全ビリオンを含有して
いるが、これを集め、溶離緩衝液としてTE(10mMト
リス−HCl、pH=7.8および1mM EDTA)を用
いるセファデックスG−50カラム(Sigma Chemical
Co.、米国、ミズーリ州63178、セントルイス、
私書箱14508)で脱塩する。
カラムから得た精製ビリオンの溶液に、1%の濃度にな
る様添加する。プロナーゼを100μg/mlの濃度まで
添加し、生成した溶液を37℃で2時間インキュベート
する。得られた溶液に塩化セシウムを1.56g/mlの
濃度まで添加し、次に臭化エチジウムを最終濃度100
μg/mlまで添加する。得られた溶液を、Sorvall(Dup
ont Inst.Products社、Biomedical Division、米
国、コネチカット州06470、ニュートン)865ロ
ーターもしくは類似の垂直ローターで、260,000
×gにて24時間遠心分離する。遠心分離した後、ウイ
ルスDNAのバンドを単離し、100mMトリス−HCl
(pH=7.8)で飽和したイソアミールアルコールで5
回抽出する。得られたBKウイルスDNAの溶液を、D
NAの260nm/280nm吸光率比が1.75〜1.9
0の値になるまでTE緩衝液に対して透柝する。DNA
を、NaCl濃度を0.15Mに調節することによって沈
澱させ、2倍体積のエタノールを添加し、生成した溶液
を−70℃で少なくとも2時間インキュベートし、1
2,000×gで10分間遠心分離する。得られたBKウ
イルスDNAのペレットを1mg/mlの濃度となる様、T
E緩衝液中に懸濁する。
するTE緩衝液1μlを、10×EcoRI緩衝液(1.0
Mトリス−HCl、pH=7.5;0.5M NaCl;50
mM MgCl2;および1mg/ml BSA)と15μlの水と
に溶解した。約2μlの制限酵素EcoRI(約10単位;
本明細書では、全酵素の単位は、酵素の実際の起源は異
なっているが、特にことわりがない限り、米国、マサチ
ューセッツ州01915−9990、ビバーリー、トツ
ァー・ロード、32、New England Biolabsの単位
の定義によっている)をDNAの溶液に添加し、得られ
た反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。約
1μgのプラスミドpUC8(米国、ニュージャージー
州、ピスカタウエイ、センテニアル・アベニュー80
0、Pharmacia P−L Biochemicals社から入手で
きる)を含有する1μlのTE緩衝液を、EcoRIで消化
したBKウイルスDNAを製造するのに利用したのとほ
ぼ同じ方法によってEcoRIで消化した。EcoRIで消
化したプラスミドpUC8DNAをTE緩衝液で100
μlまで希釈した。生成した溶液に約0.06単位の仔
ウシ腸アルカリホスファターゼを添加し、得られた反応
混合物を37℃で30分間インキュベートした。得られ
た溶液を、1×SET(5mMトリス−HCl、pH=7.
8;5mM EDTA;および150mM NaCl)、0.
3MNaOAc、および0.5%SDSを含有するように
調節し、次いで65℃で45分間インキュベートした。
ホスファターゼ処理によってpUC8DNAの自己連結
が防止される。
ミドpUC8DNAをまず緩衝フェノールで抽出し次に
クロロホルムで抽出した。各DNA溶液のNaClの濃度
を0.25Mに調節し、2倍体積のエタノールを添加
し、生成した混合物をドライアイス−エタノール浴中で
5分間インキュベートし、次いで遠心分離してDNAを
ペレットにすることによって、DNAを集めた。上澄液
は排棄し、DNAペレットを70%エタノールですす
ぎ、乾燥し、BKウイルスとプラスミドpUC8の試料
それぞれを10μlと30μlのTE緩衝液に再懸濁させ
た。約3μlの水と1μlの10×リガーゼ緩衝液(0.
5Mトリス−HCl、pH=7.8;100mM MgCl2;
200mM DTT;10mM ATP;および0.5mg/
ml BSA)とを、2μlのEcoRIで消化したBKウイ
ルスと1μlのEcoRIで消化したプラスミドpUC8D
NAの混合物中に添加した。1μl(約1000単位)の
T4DNAリガーゼを、上記のDNA溶液に添加し、得
られた反応混合物を16℃で一夜インキュベートした。
連結させたDNAは、所望のプラスミドpBKE1とpB
KE2を含有していたが、これらのプラスミドは、挿入
されたBKウイルスDNAの配向だけが異なっている。
プラスミドpBKE1の制限部位と機能地図を添付図面
の図2に示す。
P−L Biochemicals社から入手できる)含有のL−
ブロスの培養物50mlを、650ナノメーターの光学濃
度(O.D.650)、が約0.4吸光単位になるまで増
殖させた。得られた培養物を氷上で10分間冷却し、次
に遠心分離によって細胞を集めた。生成した細胞ペレッ
トを25mlの冷100mM MgCl2に再懸濁させ、氷上
で25分間インキュベートした。細胞を遠心分離して再
度ペレット化し、ペレットを2.5mlの冷100mM C
aCl2中に再懸濁させ、氷上で30分間インキュベート
した。インキュベートした後、得られた細胞は、形質転
換DNAを取り込むのに充分な(コンピテント)細胞であ
る。この細胞懸濁液200μlを、先に調製した連結D
NAと混合し、氷上で30分間インキュベートした。こ
の期間の最後に、細胞を水浴内に42℃で2分間おき、
次いで氷中に戻してさらに10分間おいた。細胞を遠心
分離で集め、Lブロス1ml中に再懸濁させ、37℃で1
時間インキュベートした。
ンピシリン1ml、40μgX−gal/ml、および40μg
IPIG/mlを含有するL寒天(1l当り15gの寒天を
含有するLブロス)のプレート上にプレートした。これ
らのプレートを37℃で一夜インキュベートした。イー
・コリK12JM103/pUC8のような挿入断片な
しのプラスミドを含有するコロニーは、これらのプレー
ト上で青色を呈している。イー・コリK12JM103
/pBKE1のような挿入断片を有するプラスミドを含
有するコロニーは白色である。いくつかの白色コロニー
を選択し、BKウイルスの約5.2kbのEcoRI制限断
片の存在について、コロニーのプラスミドDNAを制限
酵素分析することによってスクリーニングした。プラス
ミドDNAは、以下の実施例に記載されているプラスミ
ドDNAの単離方法にしたがって、イー・コリK12J
M103/pBKE1とイー・コリK12JM103/p
BKE2の細胞から得た。ただしプラスミドDNAを制
限酵素分析用として単離する際は上記方法は小規模で行
いCsCl勾配工程は省略される。
胞は、凍結乾燥の形態で、American Type Culture
Collectionから受託番号ATCC37224号で得
られる。凍結乾燥された細胞を、100μg/mlのアン
ピシリンを含有するL寒天プレート上にプレートし、3
7℃でインキュベートし、単独コロニーの脱離物を得
る。50μg/mlのアンピシリンを含有する1lのLブロ
ス(10gのトリプトファン、10g NaClおよび5gの
酵母エキスを1l当り含有)に、イー・コリK12HB1
01/pdBPV−MMTneoのコロニーを接種し、O.
D.590が約1吸光単位になるまで37℃でエアシエ
ーカー中でインキュベートし、次に150mgのクロラム
フエニコールを培養物に添加した。インキュベーション
を約16時間続けた。クロラムフエニコールを添加する
とタンパク質合成が阻害されるので、さらに細胞が***
するのを阻害するが、プラスミドの複製は続けることが
できる。
ont Co.Instrument Products、Biomedical Di
vision、米国コネチカット州06470、ニュートン)
を用いて6000rpmで、4℃にて5分間遠心分離し
た。得られた上澄液を排棄し、細胞のペレットを40ml
のTES緩衝液(10mMトリス−HCl、pH=7.5;
10mM NaCl;および1mM EDTA)中で洗浄し、
次に再度ペレット化した。上澄液を排棄し、細胞のペレ
ットをドライアイス−エタノール浴中で凍結させ次いで
解凍した。解凍した細胞ペレットを、25%スクロース
と50mM EDTAの溶液10ml内に再懸濁させた。約
1mlの5mg/mlリゾチーム溶液;3mlの0.25M E
DTA(pH=8.0);および100μlの10mg/ml R
NアーゼAを上記溶液に添加し、次に氷上で15分間イ
ンキュベートした。3mlの溶菌溶液[3mlの10%トリ
トン−X100;75mlの0.25M EDTA(pH=
8.0);15mlの1Mトリス−HCl(pH=8.0);お
よび7mlの水を混合して調製]を、リゾチームで処理し
た細胞に添加し、混合し、得られた溶液をさらに15分
間、氷上でインキュベートした。溶解された細胞を、ド
ライアイス−エタノール浴中で凍結して解凍した。
man社、米国イリノイ州60646、リンカーンウッ
ド、リンカーン・アベニュー、7360N)を用いて、
25,000rpmで40分間遠心分離し、次に緩衝フエノ
ールで抽出して細胞の破片を除去した。約30.44g
のCsClと、約1mlの5mg/ml臭化エチジウム溶液とを
上記細胞抽出液に添加し、次に溶液の体積を、TES緩
衝液によって40mlに調節した。得られた溶液を、VT
i50超遠心分離管(Beckman)にデカントし、次にこれ
を密封し、VTi50ローターで、42,000rpmにて
約16時間遠心分離した。得られたプラスミドのバンド
を、紫外線で目視可能にし、単離し、次にTi75管中
に入れ、ローター(Beckman)を用いて50,000rpmで
16時間遠心分離した。0.761g/ml CsClを含
有するTESを用いて、必要な体積の調節を行った。プ
ラスミドのバンドを再び単離し、塩で飽和したイソプロ
パノールで抽出して臭化エチジウムを除き、TES緩衝
液で1:3に希釈した。次に2倍体積のエタノールを溶
液に加え、一夜−20℃でインキュベートした。得られ
た溶液をSS34ローター(Sorvall)を用いて1,00
0rpmで15分間遠心分離することによってプラスミド
DNAをペレット化した。
V−MMTneoDNAを1mlのTE緩衝液に懸濁させて
−20℃で貯蔵した。上記のプラスミド単離法は、一般
に、非常に純粋なプラスミドDNAを大量に得たい時に
利用される。この方法は、例えば、所定のプラスミドの
存在について形質転換細胞をスクリーニングするときに
必要な少量の低純度のDNAを速やかに得るために、培
養細胞を約5mlだけ用い、適切にスケールダウンした量
の溶解緩衝液に細胞を溶解し、次いで遠心分離工程の代
わりにフエノールとクロロホルムで抽出することによっ
て改変することができる。上記のようにして製造したプ
ラスミドpdBPV−MMTneoDNAの約5μg(5μl)
と、実施例1で作ったBKウイルスDNAの5μg(5μ
l)を各々、2μlの10×BamHI緩衝液(1.5M N
aCl;60mMトリス−HCl、pH=7.9;60mM M
gCl2;および1mg/ml BSA)、1μlの制限酵素Bam
HI、ならびに7μlの水を含有する溶液中で、37℃
にて2時間消化した。反応を同体積のフエノールで抽出
して停止させ、次いでクロロホルムで2回抽出した。次
にBamHIで消化した各DNAを沈澱させ、遠心分離し
て集めて5μlの水に再懸濁させた。
HIで消化したプラスミドpdBPV−MMTneo(1μl)
とBamHIで消化したBKウイルスDNA(1μl)の混
合物に添加した。1μl(約1000単位)のT4DNA
リガーゼと6μlの水を上記DNA混合物に添加した
後、得られた反応混合物を16℃で一夜インキュベート
した。連結したDNAは、所望のプラスミドpBKneo1
とpBKneo2を構成していた。これらのプラスミドはB
KウイルスDNAの配向だけが異なっている。プラスミ
ドpBKneo1の制限部位と機能地図を添付図面の図3に
示す。イー・コリK12HB101細胞は、Northern
Regional Research Laboratoryから受託番号NR
RL B−15626の下、凍結乾燥された形態で入手
できる。イー・コリK12HB101細胞を培養し、形
質転換を行えるようにし、上記のようにして調製した連
結DNAを用い、実質的に実施例2の方法によって形質
転換した。形質転換された細胞を、100μg/mlのア
ンピシリンを含有するL寒天プレート上にプレートし
た。イー・コリK12HB101/pBKneo1とイー・
コリK12/pBKneo2の形質転換細胞は、そのアンピ
シリン耐性表現型と、そのプラスミドDNAの制限酵素
分析によって同定した。
が約35.94kbの二重鎖線状分子である。Ad2の後
期プロモーターは、Ad2ゲノムの約0.316kbのAc
cI−PvuII制限断片上に単離することができるが、
この約0.32kbの制限断片はAd2ゲノムのヌクレオ
チド位置5755〜6071の配列に相当する。所望の
約0.32kbAccI−PvuII制限断片を単離するため
に、Ad2DNAをまず制限酵素BalIで消化して約
0.32kbのAccI−PvuII制限断片の全配列を含有
する約2.4kbのBalI制限断片を単離する。次に、こ
の約2.4kbのBalI制限断片をAccI−PvuIIで消
化すれば、所望の断片が得られる。約50μgのAd2D
NA(BRLから入手できる)を80μlの水と10μlの
10×BalI緩衝液(100mMトリス−HCl、pH=
7.6;120mM MgCl2;100mM DTT;および
1mg/ml BSA)に溶解する。得られたAd2DNAの
溶液に約10μl(約20単位)の制限酵素BalIを添加
し、生成した反応混合物を37℃で4時間インキュベー
トする。
に負荷し、電気泳動法に付して制限断片を充分に分離さ
せる。得られたゲルを臭化エチジウムの希薄溶液(0.
5μg/ml)で染色し、染色したゲルを長波長の紫外線
(UV)に暴露することによって、電気泳動に付したDN
Aを目視可能にする。DNAをアガロースゲルから単離
する一方法は次のとおりである。所望の断片の前のゲル
に小さなスリットを作り、NA−45DEAE膜(Schl
eicher and Schuell、米国、ニューハンプシャー州
03431、キーン)の小片を各スリット内に置く。さ
らに電気泳動を行うと、DNAは非共有結合的にDEA
E膜に結合する。所望の断片をDEAE膜に結合させた
後、膜を取出し、低塩緩衝液(100mM KCl;0.1
mM EDTA;および20mMトリス−HCl、pH=8)
ですすぐ。次に膜を小さな試験管に入れて高塩緩衝液
(1M NaCl;0.1mM EDTA;および20mMトリ
ス−HCl、pH=8)に浸漬し、次いで65℃で1時間
インキュベートしてDNAをDEAE紙から取り出す。
65℃でインキュベートした後、インキュベーション緩
衝液を集め、膜を高塩緩衝液ですすぐ。このすすぎに用
いた高塩溶液を、高塩インキュベーション緩衝液ととも
にプールする。
度が0.25Mになるように調節し、次に3倍体積の冷
無水エタノールを上記溶液に添加する。得られた溶液を
混合し、−70℃で10〜20分間静置する。次にこの
溶液を15,000rpmで15分間遠心分離する。残留塩
を除くためにさらに沈澱法に付した後、DNAペレット
をエタノールですすぎ、乾燥し、20μlのTE緩衝液
に再懸濁させて、Ad2の所望の制限断片約3μgを調製
する。得られた精製断片を10μlのTE緩衝液に溶解
する。約6μlのH2Oと2μlの10×AccI緩衝液(6
0mM NaCl;60mMトリス−HCl、pH=7.5;6
0mM MgCl2;60mM DTT;および1mg/mlBS
A)をAd2のBalI制限断片(約2.4kb)の溶液に添加
する。このDNA溶液に、約2μl(約10単位)の制限
酵素AccIを添加した後、反応混合物を37℃で2時間
インキュベートする。AccIで消化した後、エタノール
沈澱法でDNAを集め、これを、16μlの水と2μlの
10×PvuII緩衝液(600mM NaCl;60mMトリ
ス−HCl、pH=7.5;60mM MgCl2;60mM D
TT;および1mg/ml BSA)に再懸濁させる。DNA
の溶液に約2μl(約10単位)の制限酵素PvuIIを添
加した後、得られた反応混合物を37℃で2時間インキ
ュベートする。
の、Ad2のBalI制限断片を約6%のポリアクリルア
ミドゲルに負荷し電気泳動に付して、Ad2後期プロモ
ーターを含有する約0.32kbのAccI−PvuII制限
断片を他の消化産物から分離する。得られたゲルを臭化
エチジウムで染色し、紫外線を用いて目視し、約0.3
2kbのAccI−PvuII制限断片を含有するゲルのセグ
メントをゲルから切取り、砕いて、一夜、室温で、約2
50μlの抽出緩衝液(500mM NH4OAc;10mM
MgOAc;1mM EDTA;および0.1%SDS)に浸
漬する。翌朝、混合物を遠心分離し、ペレットを排棄す
る。上澄み液中のDNAをエタノールで沈澱させる。次
に約2μlのtRNAを添加して所望の断片を完全に沈澱
させる。約0.32kbのAccI−PvuII制限断片約
0.2μgが得られ、これを7μlの水に懸濁させる。
カー(5'−CTGATCAG−3'、New England
Biolabs社から入手できる)を、下記実施例10Aの方
法に実質的にしたがってキナーゼ処理をしたものを、約
0.32kbのAccI−PvuII制限断片の溶液に添加
し、次いでこのDNA溶液に1μl(約1000単位)の
T4DNAリガーゼと1μlの10×リガーゼ緩衝液を
添加し、得られた反応混合物を16℃で一夜インキュベ
ートした。BclIリンカーは、AccI−PvuII制限断
片のPvuII末端にのみ連結できた。DNAの配列を決
定した結果、4つのBclIリンカーがAccI−PvuII
制限断片のPvuII末端に連結していることが判明し
た。これらのエキストラBclIリンカーは、BclIによ
る消化と再連結によって除去することができる。しか
し、エキストラBclIリンカーは、このエキストラリン
カーを含有するベクターが適正に機能するのを妨げない
場合には除去しない。
細胞を、凍結乾燥の形態にて、受託番号ATCC371
55の下でATCCから入手し、この細胞から、実施例
3の方法にほぼしたがってプラスミドpSV2catDNA
を単離した。プラスミドpSV2catの制限部位と機能地
図を添付図面の図4に示す。約1mgのプラスミドpSV
2catDNAが得られ、これを1mlのTE緩衝液に溶解
する。約3μg(3μl)のプラスミドpSV2catDNA
を、2μlの10×AccI緩衝液と16μlの水に添加
し、得られたpSV2catDNA溶液に3μl(約9単位)
の制限酵素AccIを添加し、得られた反応混合物を37
℃で2時間インキュベートした。次に、AccIで消化さ
れたプラスミドpSV2catDNAに対して、3μlの1
0×StuI緩衝液(1.0M NaCl;100mMトリス−
HCl、pH=8.0;100mM MgCl2;60mM DT
T;および1mg/mlBSA)、5μlの水、ならびに約2
μl(約10単位)の制限酵素StuIを添加することによ
って、このプラスミドを制限酵素StuIで消化した。得
られた反応混合物を37℃で2時間インキュベートし
た。反応混合物をフエノールで1回次いでクロロホルム
で2回抽出することによって反応を終了させた。約0.
5μgの所望の断片が得られ、20μlのTE緩衝液に溶
解した。
SV2catDNAを、前記の、Ad2のAccI−PvuII
制限断片(約0.32kb)(BclI断片が連結している)の
約7μlと混合し、3μlの10×リガーゼ緩衝液、15
μlの水および2μl(約1000単位)のT4DNAリガ
ーゼを添加した後、得られた連結反応混合物を一夜16
℃でインキュベートした。連結されたDNAは、所望の
プラスミドpLPcat、すなわちクロラムフエニコールア
セチルトランスフエラーゼ遺伝子の転写と発現を駆動す
るように配置されたAd2後期プロモーターを含有する
プラスミドを形成していた。プラスミドpLPcatの制限
部位と機能地図を、添付図面の図5に示す。連結したD
NAを、実施例2の方法にほぼしたがってイー・コリK
12HB101細胞を形質転換するのに用いた。形質転
換された細胞を50μg/mlのアンピシリンを含有する
L寒天上にプレートし、プラスミドDNAの制限酵素分
析を利用してイー・コリK12HB101/pLPcat形
質転換細胞を同定した。プラスミドpLPcatDNAは、
次の構築に使用するため、実施例3に記載されたプラス
ミド分離法に実質的にしたがって、その形質転換細胞か
ら単離した。
0μlのTE緩衝液を、7.5μlの10×AccI緩衝
液、30μlの水および15μl(約75単位)の制限酵素
AccIに添加し、得られた反応液を37℃で2時間イン
キュベートした。AccIで消化したBKウイルスDNA
をアガローカゲルに負荷し、BKエンハンサーを含有す
る約1.4kbの断片を別の消化産物から分離した。次
に、実施例4Aに記載の方法に実質的にしたがって、約
1.4kbのAccI制限断片を単離した。約5μgの上記
断片を、5μlの10×PvuII緩衝液、45μlの水お
よび5μl(約25単位)の制限酵素PvuIIに再懸濁
し、得られた反応混合物を37℃で2時間インキュベー
トした。次に実施例4Aの方法に実質的にしたがって、
PvuIIで消化したDNAを、単離し連結用に調製し
た。所望の約1.28kbのAccI−PvuII断片約2μ
gが得られ、5μlのTE緩衝液に溶解した。
5μlの10×AccI緩衝液と40μlの水に溶解した。
約5μl(約25単位)の制限酵素AccIをプラスミドpL
PcatDNAの溶液に添加し、得られた反応液を37℃
でインキュベートした。AccI消化プラスミドpLPcat
DNAをエタノールで沈澱させ、5μlの10×StuI
緩衝液、40μlの水および5μl(約25単位)の制限酵
素StuIに再懸濁し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。AccI−StuI消化プラスミドp
LPcatDNAをエタノールで数回沈澱させて、イー・
コリの複製起点とAd2の後期プロモーターを含有する
約4.81kbのAccI−StuI制限断片を、その外の制
限産物すなわち大きさが約16bpの制限断片から精製し
た。所望の約4.81kbの制限断片の約1μgが得ら
れ、20μlのTE緩衝液に溶解した。
I−StuI制限断片の5μlを、BKウイルスの約1.
28kbのAccI−PvuII制限断片の5μlに添加し
た。上記のDNA混合物に、3μlの10×リガーゼ緩
衝液、15μlの水および2μl(約1000単位)のT4
DNAリガーゼを添加した後、生成した連結反応液を1
6℃で一夜インキュベートした。連結DNAは所望のプ
ラスミドpBLcatを形成していた。プラスミドpBLcat
の制限部位と機能地図を添付図面の図6に示す。連結さ
れたDNAは、実施例3に記載された方法に実質的にし
たがって、イー・コリK12HB101細胞を形質転換
するのに使用した。イー・コリK12HB101/pB
Lcat形質転換細胞は、そのプラスミドDNAを制限酵
素分析することによって同定した。プラスミドpBLcat
のDNAを、次の構築に使用するために、実施例3の方
法にほぼしたがって調製した。
10×HindIII緩衝液(0.5M NaCl;0.1Mト
リス−HCl、pH=8.0;0.1M MgCl2;および1
mg/ml BSA)と80μlの水に溶解した。プラスミドp
BLcatDNAの上記溶液に、約10μl(約100単位)
の制限酵素HindIIIを添加し、得られた反応液を3
7℃で2時間インキュベートした。HindIII消化プ
ラスミドpBLcatDNAをアガロースゲルに負荷し電気
泳動に付して、BKエンハンサーとAd2後期プロモー
ターを含有する約0.87kbのHindIII制限断片
を、その外の消化産物から充分に分離し、次にこの約
0.87kbの断片を、実施例4Aの方法に実質的にした
がって、単離し連結用に調製した。所望の断片約10μ
gが得られ、50μlのTE緩衝液に溶解した。約1μg
のプラスミドpSV2catDNAを含有する1μlのTE
緩衝液を、2μlの10×HindIII緩衝液と16μl
の水に溶解した。約1μl(約10単位)の制限酵素Hind
IIIをDNAの溶液に添加し、得られた反応液を37
℃で2時間インキュベートした。反応混合物をまずフエ
ノールで抽出し次いでクロロホルムで2回抽出すること
によって反応を停止させた。HindIII消化プラスミ
ドpSV2catDNAをエタノールで沈澱させ、100μ
lのTE緩衝液に再懸濁させた。HindIII消化プラス
ミドpSV2catDNAを、実施例2の方法に実質的にし
たがって、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、
10μlのTE緩衝液に再懸濁させた。
dIII制限断片約5μlを、10μlのHindIII消化
プラスミドpSV2catに添加し、次いでそのDNA溶液
に、3μlの10×リガーゼ緩衝液、2μl(約1000
単位)のT4DNAリガーゼおよび13μlの水を添加
し、得られた反応液を16℃で2時間インキュベートし
た。連結させたDNAは所望のプラスミドpSBLcatを
形成していた。連結させたDNAを、実施例2の方法に
実質的にしたがってイー・コリK12HB101を形質
転換するのに使用した。形質転換させた細胞をアンピシ
リンを含有するL寒天上にプレートし、アンピシリン耐
性形質転換細胞のプラスミドDNAを、制限酵素分析法
によって試験してイー・コリK12HB101/pSB
Lcat形質転換細胞を同定した。BKエンハンサーとAd
2後期プロモーターをコードする約0.87kbのHind
III制限断片は、2つの配向のうち1つの配向のHin
dIII消化pSBLcatに挿入することができたが、そ
の1つの配向のものだけがプラスミドpSBLcatを形成
する。プラスミドpSBLcatの制限部位と機能地図を添
付図面の図8に示す。
×HindIII緩衝液と80μlの水に溶解した。このプ
ラスミドpBLcatDNA溶液に、約10μl(約100単
位)の制限酵素HindIIIを添加し、得られた反応液を
37℃で2時間インキュベートした。HindIII消化
プラスミドpBLcatDNAをアガロースゲルに負荷し電
気泳動に付して、BKエンハンサーとAd2後期プロモ
ーターを含有する約0.87kbHindIII制限断片を
他の消化産物から分離し、次いでその約0.87kbの断
片を、実施例4Aの方法に実質的にしたがって、単離し
連結用に調製した。約2μgの所望の断片が得られ、こ
れを5μlのTE緩衝液に溶解した。プラスミドpL13
3は、チモーゲン型のヒトプロテインCに対する全cD
NA暗号配列を含有している。プラスミドpL133
は、1988年10月4日に発行されたBangらの米国
特許第4,775,624号に開示され特許請求されてお
り、その全教示事項を本明細書に援用する。プラスミド
pL133の制限部位と機能地図は添付図面の図9に示
す。
を2μlの10×HindIII緩衝液と16μlの水に溶
解した。このDNA溶液に約1μl(約10単位)の制限
酵素HindIIIを添加し、得られた反応液を37℃で
2時間インキュベートした。次にこのDNAをTE緩衝
液で100μlにまで希釈し、実施例2の方法に実質的
にしたがって仔ウシ腸アルカリフォスファターゼで処理
した。HindIII消化プラスミドpL133DNAをフ
エノールで2回クロロホルムで1回抽出し、エタノール
で沈澱させ、10μlのTE緩衝液に再懸濁させた。プ
ラスミドpBLcatの約0.87kbのHindIII制限断
片約5μlを、1.5μlのHindIII消化プラスミドp
L133に添加し、次にそのDNA溶液に、1μlの1
0×リガーゼ緩衝液、1μl(約1000単位)のT4D
NAリガーゼおよび1.5μlの水を添加し、得られた
反応液を16℃で一夜インキュベートした。連結させた
DNAは所望のプラスミドpLPCを形成していた。プ
ラスミドpLPCの制限部位と機能地図を添付図面の図
10に示す。得られた連結DNAを、実施例3の方法に
実質的にしたがって、イー・コリK12HB101を形
質転換するの使用した。形質転換細胞をアンピシリン含
有のL寒天上にプレートし、アンピシリン耐性形質転換
細胞のプラスミドDNAを、制限酵素分析法によって試
験してイー・コリK12HB101/pLPC形質転換
細胞を同定した。BKエンハンサーとAd2後期プロモ
ーターをコードする約0.87kbのHindIII制限断
片を、2つの配向のうち1つの配向のHindIII消化
プラスミドpL133に挿入することができたが、この
1つの配向のものだけがプラスミドpLPCを形成す
る。
と、1μgのプラスミドpLPC(1μl)とを、2μlの1
0×EcoRI緩衝液と14μlの水に溶解した。そのD
NA溶液に約2μl(約10単位)の制限酵素EcoRIを
添加し、得られた反応液を37℃で2時間インキュベー
トした。BKウイルスとプラスミドpLPCのDNAの
EcoRI消化混合物を緩衝化フエノールで1回およびク
ロロホルムで1回抽出した。次に、以下のようにしてD
NAを集めた。すなわちNaClの濃度を0.25Mに調
節し、2倍体積のエタノールを添加し、得られた溶液を
ドライアイス−エタノール浴中で2分間インキュベート
し、生成した溶液を遠心分離してDNAをペレット化し
た。上澄み液を排棄し、DNAペレットを70%エタノ
ールですすぎ、乾燥し、12μlのTE緩衝液に再懸濁
させた。
衝液を、BKウイルスとプラスミドpLPCのDNAの
EcoRI消化混合物に添加した。このDNA溶液に2μ
l(約1000単位)のT4DNAリガーゼを添加し、得
られた反応液を16℃で2時間インキュベートした。連
結させたDNAは所望のプラスミドpLPC4とpLPC
5を形成していた。これらのプラスミドは挿入されたB
KウイルスのDNAの配向だけが異なっている。プラス
ミドpLPC4の制限部位と機能地図を添付図面の図1
1に示す。連結されたDNAは所望のプラスミドpLP
C4とpLPC5を形成しており、実施例2の方法に実
質的にしたがって、イー・コリK12HB101のコン
ピテント細胞を形質転換するのに使用した。形質転換さ
れた細胞を100μg/mlのアンピシリンを含有するL
寒天上にプレートした。イー・コリK12HB101/
pLPC4とイー・コリK12HB101/pLPC5の
形質転換細胞を、それらのアンピシリン耐性表現型と、
それらのプラスミドDNAの制限酵素分析とによって同
定した。
NRRL B−18039の下で、Northern Region
al Research Laboratoryから得られる。プラスミド
pSV2hygDNAは、実施例3の方法に実質的にしたが
って、上記の細胞から得られる。プラスミドpSV2hyg
の制限部位と機能地図を添付図面の図12に示す。約1
0μg(10μlのTE緩衝液中)のプラスミドpSV2hyg
を2μlの10×BamHI緩衝液と6μlのH2Oに添加
した。このDNA溶液に約2μl(約20単位)の制限酵
素BamHIを添加し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。反応液をまずフエノールで抽出し
次にクロロホルムで2回抽出した。BamHI消化プラス
ミドpSV2hygDNAをアガロースゲルに負荷し、ハイ
グロマイシン耐性遺伝子を含有する約2.5kbの制限断
片を、実施例4Aに記載の方法に実質的にしたがって単
離した。約5μlの10×クレノウ緩衝液(4種のdNT
Pの各々が0.2mM;0.5Mトリス−HCl、pH=
7.8;50mM MgCl2;0.1M2−メルカプトエタ
ノール;および100μg/ml BSA)と35μlの水を
BamHI消化プラスミドpSV2hygDNAの溶液に添加
し、次にそのDNA混合物に約25単位のクレノウ酵素
(約5μl、BRLが市販している)を添加し、得られた
反応液を16℃で30分間インキュベートした。クレノ
ウ酵素で処理されたBamHI消化プラスミドpSV2hyg
DNAをフエノールで1回抽出しクロロホルムで1回抽
出し、次いでエタノールで沈澱させた。約2μgの所望
の断片が得られ、5μlのTE緩衝液に懸濁させた。
DNAを2μlの10×StuI緩衝液と6μlの水に添加
した。得られたDNA溶液に約2μl(約10単位)の制
限酵素StuIを添加し、生成した反応液を37℃で2時
間インキュベートした。StuI消化プラスミドpLPC
DNAをエタノールで沈澱させ、遠心分離で集め、2μ
lの10×NdeI緩衝液(1.5M NaCl;0.1Mトリ
ス−HCl、pH=7.8;70mM MgCl2;60mM2−
メルカプトエタノール;および1mg/ml BSA)と16
μlの水に再懸濁させた。得られたStuI消化DNAの
溶液に約2μl(約10単位)の制限酵素NdeIを添加
し、生成した反応混合物を37℃で2時間インキュベー
トした。生成したNdeI−StuI消化プラスミドpLP
CDNAをエタノールで沈澱させ、遠心分離で集め、5
μlの10×クレノウ緩衝液と40μlのH2Oに再懸濁
させた。得られたDNA溶液に約5μl(約25単位)の
クレノウ酵素を添加し、生じた反応液を16℃で30分
間インキュベートした。クレノウ反応の後、反応混合物
をアガロースゲルに負荷し、ゲルから、約5.82kbN
deI−StuI制限断片を単離した。約5μgの所望の断
片が得られ、それを5μlのTE緩衝液に懸濁させた。
HI制限断片(約2.5kb)の約2μlを、プラスミドpL
PCのクレノウ処理NdeI−StuI制限断片(約5.8
2kb)の約1μlと混合し、そのDNA溶液に、約3μl
の10×リガーゼ緩衝液、2μlのT4DNAリガーゼ
(約1000単位)、1μlのT4RNAリガーゼ(約1単
位)および14μlの水を添加した。生成した反応液を1
6℃で一夜インキュベートした。連結されたDNAは、
所望のプラスミドpLPChyg1とpLPChyg2を形成し
ていたが、これらのプラスミドは、プラスミドpSV2h
ygのクレノウ処理BamHI制限断片(約2.5kb)の配向
についてのみ異なっている。プラスミドpLPChyg1の
制限部位と機能地図を添付図面の第13図に示す。連結
されたDNAを、実施例3の方法に実質的にしたがって
イー・コリK12HB101の形質転換に用いた。所望
のイー・コリK12HB101/pLPChyg1とイー・
コリK12HB101/pLPChyg2の形質転換細胞
を、アンピシリンを含有するL寒天上にプレートし、こ
れらプラスミドDNAの制限酵素で同定した。
ン活性化因子(TPA)の暗号配列を含有している。プラ
スミドpTPA102はイー・コリK12MM294/p
TPA102から単離することができる。この菌株は受
託番号NRRL B−15834の下で、Northern
Regional Researchから入手できる。プラスミドpT
PA102DNAは、実施例3の方法に実質的にしたが
ってイー・コリK12MM294/pTPA102から
単離される。約50μgのプラスミドpTPA102(約
50μlのTE緩衝液中)を、10μlの10×Tth11
1I緩衝液(0.5M NaCl;80mMトリス−HCl、p
H=7.4;80mM MgCl2;80mM2−メルカプトエ
タノール;および1mg/ml BSA);および80μlの水
に添加した。生成したDNA溶液に、約10μl(約50
単位)の制限酵素Tth111Iを添加し、得られた反応
液を65℃で2時間インキュベートした。生じた反応混
合物をアガロースゲルに負荷し、TPA暗号配列を含有
する約4.4kbのTth111I制限断片をゲルから単離
した。その外の消化産物すなわち3.1kbと0.5kbの
制限断片は排棄した。約10μgの所望の約4.4kbの
Tth111I制限断片が得られ、10μlのTE緩衝液
に懸濁させた。
の水を、約4.4kbのTth111I制限断片を含有する
溶液に添加し、さらに約5μlのクレノウ酵素(約5単
位)を添加した後、反応混合物を16℃で30分間イン
キュベートした。クレノウ反応の後、DNAをエタノー
ルで沈澱させ、3μlの10×リガーゼ緩衝液と14μl
の水に再懸濁させた。 BamHIリンカー(New England Biolabs)は、下記
配列:
る連結用に調製した。4μlのリンカー(約2μg)を2
0.15μlの水と5μlの10×キナーゼ緩衝液(50
0mMトリス−HCl、pH=7.6および100mM Mg
Cl2)に溶解し、90℃で2分間インキュベートし、次
に室温まで放冷した。生成した反応混合物に、5μlの
γ−32P−ATP(約20μCi)、2.5μlの1M D
TTおよび5μlのポリヌクレオチドキナーゼ(約10単
位)を添加し、次いで37℃で30分間インキュベート
した。次に3.35μlの0.01M ATPと5μlの
キナーゼを添加し、反応をさらに37℃で30分間続け
た。リンカーが標的DNAに連結したかどうかを決定す
るために放射性ATPを利用する。
リンカーを、約4.4kbTth111I制限断片の溶液に
添加し、2μlのT4DNAリガーゼ(約1000単位)
と1μlのT4RNAリガーゼ(約2単位)を添加した
後、生成し連結反応液を4℃で一夜インキュベートし
た。連結DNAをエタノールで沈澱させ、5μlの10
×HindIII緩衝液と40μlの水に再懸濁させた。約
5μl(約50単位)の制限酵素HindIIIを上記DNA
溶液に添加し、生成した反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。HindIII消化DNAをエタノールで
沈澱させ、10μlの10×BamHI緩衝液と90μlの
水に再懸濁させた。約10μl(約100単位)の制限酵
素BamHIをDNA溶液に添加し、生成反応液を37℃
で2時間インキュベートした。BamHIで消化した後、
反応混合物をアガロースゲルに負荷し、約2.0kbのB
amHI−HindIII制限断片をゲルから単離した。所
望の断片約4μgが得られ、約5μlのTE緩衝液に懸濁
させた。
に、プラスミドpTPA102由来の約2.0kbのBam
HI−HindIII制限断片を、BamHI−HindIII
消化プラスミドpRCに挿入した。プラスミドpRCは、
イー・コリtrpオペロンのプロモーターとオペレーター
(trpPO)の配列を含有する約288bpのEcoRI−Cl
aI制限断片を、EcoRI−ClaI消化プラスミドpKC
7に挿入することによって構築した。プラスミドpKC
7は、American Type Culture Collectionに受
託番号ATCC37084で寄託されているイー・コリ
K12N100/pKC7から得ることができる。trpP
Oを含有する約288bpのEcoRI−ClaI制限断片は
プラスミドpTPA102から単離することができる
が、このpTPA102はイー・コリK12MM294
/pTPA102(NRRL B−15834)から単離
できる。プラスミドpKC7とプラスミドpTPA102
のDNAは、実施例3の方法に実質的にしたがって前記
細胞系から得ることができる。プラスミドpTPA10
2の、約0.29kbの上記EcoRI−ClaI制限断片
は、イー・コリtrp遺伝子の転写活性化配列とほとんど
の翻訳活性化配列を含有し、下記の配列をもっている。
ために、約2μgのプラスミドpKC7を含有する10μ
lのTE緩衝液を、2μlの10×ClaI緩衝液(0.5
M NaCl;60mMトリス−HCl、pH=7.9;60m
M MgCl2;および1mg/ml BSA)と6μlの水に添加
した。得られたプラスミドpKC7DNAの溶液に、約
2μl(約10単位)の制限酵素ClaIを添加し、生成し
た反応液を37℃で2時間インキュベートした。ClaI
消化プラスミドpKC 7DNAをエタノールで沈澱さ
せ、2μlの10×EcoRI緩衝液と16μlの水に再懸
濁させた。約2μl(約10単位)の制限酵素EcoRIを
ClaI消化プラスミドpKC7DNAの溶液に添加し、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
EcoRI−ClaI消化プラスミドpKC7 DNAをフエ
ノールで1回次いでクロロホルムで2回抽出した。DN
Aをエタノールで沈澱させ、3μlの10×リガーゼ緩
衝液と20μlの水とに再懸濁させた。プラスミドpKC
7の制限部位と機能地図は、Maniatisら、Molecular
Cloning(Cold Spring HarborLaboratory、19
82年)、8頁から入手できる。
有する約20μlのTE緩衝液を10μlの10×ClaI
緩衝液と60μlの水に添加した。約10μl(約50単
位)の制限酵素ClaIを、プラスミドpTPA102 D
NAの溶液に添加し、得られた反応液を37℃で2時間
インキュベートした。ClaI消化プラスミドpTPA1
02 DNAをエタノールで沈澱させ、10μlの10×
EcoRI緩衝液と80μlの水に再懸濁させた。得られ
たClaI消化プラスミドpTPA102 DNAの溶液
に、約10μl(約50単位)の制限酵素EcoRIを添加
し、生成した反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。EcoRI−ClaI消化プラスミドpTPA102 D
NAを、フエノールで1回抽出し、7%ポリアクリルア
ミドゲルに負荷して電気泳動に付し、trpPOを含有す
る約288bpのEcoRI−ClaI制限断片を他の消化産
物から分離した。約288kpのEcoRI−ClaI制限断
片をゲルから単離した。所望の断片約1μgが得られ、
これを5μlのTE緩衝液に懸濁させ、前記のようにし
て調製したEcoRI−ClaI消化プラスミドpKC7 D
NAの溶液に添加した。次にT4DNAリガーゼの約2
μl(約1000単位)をDNAの混合物に添加し、生成
した連結反応液を16℃で2時間インキュベートした。
連結させたDNAは所望のプラスミドpRC DNAを形
成していた。
に実質的にしたがってイー・コリK12HB101コン
ピテント細胞を形質転換した。形質転換された細胞を1
00μg/mlのアンピシリンを含有するL寒天上にプレ
ートし、アンピシリン耐性形質転換細胞を、そのプラス
ミドDNAを制限酵素分析して所望のイー・コリK12
HB101/pRCコロニーを同定することによってス
クリーニングした。実質的に実施例3の方法にしたがっ
て、イー・コリK12HB101/pRC形質転換細胞
から、プラスミドpRC DNAを得た。約2μgのプラ
スミドpRC DNAを含有する2μlのTE緩衝液を、
2μlの10×HindIII緩衝液と16μlの水に添加
した。このプラスミドpRC DNAの溶液に約2μl(約
10単位)の制限酵素HindIIIを添加し、生成した反
応液を37℃で2時間インキュベートした。HindII
I消化プラスミドpRC DNAをエタノールで沈澱さ
せ、2μlの10×BamHI緩衝液と16μlの水に再懸
濁させた。このHindIII−消化プラスミドpRCDN
Aの溶液に約2μl(約10単位)の制限酵素BamHIを
添加し、生成した反応液を37℃で2時間インキュベー
トした。
スミドpRC DNAをフエノールで1回抽出し、次いで
クロロホルムで2回抽出した。DNAをエタノールで沈
澱させ、3μlの10×リガーゼ緩衝液と20μlの水に
再懸濁させた。得られたBamHI−HindIII消化プ
ラスミドpRC DNAの溶液に、プラスミドpTPA1
02の約2.0kbのHindIII−BamHI制限断片約
4μg(約5μlのTE緩衝液中)を添加した。このDNA
混合物に約2μl(約1000単位)のT4DNAリガー
ゼを添加し、得られた反応液を16℃で2時間インキュ
ベートした。連結したDNAは所望のプラスミドpTP
A103DNAを形成していた。望ましくない形質転換
細胞を減らすために、連結したDNAを制限酵素NcoI
で消化した。この酵素はプラスミドpRCを切断する
が、プラスミドpTPA103を切断しない。したがっ
て連結DNAをNcoIで消化すると望ましくない形質転
換細胞が減少する。というのは、線状化されたDNA
は、閉じた環状DNAよりも低頻度でイー・コリを形質
転換するからである。連結させたDNAを消化するため
に、DNAをまずエタノールで沈澱させ、次いで2μl
の10×NcoI緩衝液(1.5M NaCl;60mMトリス
−HCl、pH=7.8;60mM MgCl2;および1mg/m
l BSA)と16μlの水に再懸濁させた。このDNA溶
液に約2μl(約10単位)の制限酵素NcoIを添加し、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
用いてイー・コリK12RV308(NRRL B−1
5624)を形質転換した。このイー・コリK12RV
308細胞をコンピテント細胞にし、実施例3の方法に
実質的にしたがって形質転換した。その形質転換混合物
を、100μg/mlのアンピシリンを含有するL寒天上
にプレートした。得られたアンピシリン耐性形質転換細
胞をカナマイシンに対する感受性について試験した。と
いうのは、プラスミドpRCはカナマイシン耐性を与え
るがプラスミドpTPA103は与えないからである。
このアンピシリン耐性カナマイシン感受性形質転換細胞
を用いてプラスミドDNAを調製し、得られたプラスミ
ドDNAを制限酵素分析法で試験してイー・コリK12
RV308/pTPA103形質転換細胞を同定した。
実施例3の方法に実質的にしたがって、プラスミドpT
PA103DNAを、イー・コリK12RV308/p
TPA103細胞から単離した。
1μlのTE緩衝液を、2μlの10×BglII緩衝液と
16μlの水に添加した。得られたプラスミドpTPA1
03 DNAの溶液に約1μl(約5単位)の制限酵素Bgl
IIを添加し、生成した反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。BglII消化プラスミドpTPA103
DNAをエタノールで沈澱させ、5μlの10×クレノ
ウ緩衝液と44μlの水に再懸濁させた。得られたBgl
II消化プラスミドpTPA103DNAの溶液に、約
1μlのクレノウ酵素(約1単位)を添加し、生成した反
応液を16℃で2時間インキュベートした。クレノウ酵
素で処理したBglII消化プラスミドpTPA103 D
NAをエタノールで沈澱させ、3μlの10×リガーゼ
緩衝液と22μlの水に懸濁させた。 下記配列:
w England Biolabs)の約2μl(0.2μg)を、2μ
l(約1000単位)のT4DNAリガーゼと1μl(約2
単位)のT4 RNAリガーゼとともに、クレノウ酵素で
処理したBglII消化プラスミドpTPA103 DNA
の溶液に添加し、得られた連結反応液を4℃で一夜イン
キュベートした。連結したDNAはプラスミドpTPA
103derNdeIを形成していたが、これは、プラスミ
ドpTPA103がBglII認識配列をもっている位置
にNdeI認識配列をもっていること以外、プラスミドp
TPA103と実質的に同じである。
の方法に実質的にしたがって、イー・コリK12RV3
08コンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を
アンピシリン含有のL寒天上にプレートし、イー・コリ
K12RV308/pTPA103derNdeI形質転換細
胞を、そのプラスミドDNAを制限酵素分析することに
よって同定した。プラスミドpTPA103derNdeI
DNAを、実施例3の方法に実質的にしたがって、次の
構築に使うために、形質転換細胞から単離した。約10
μgのプラスミドpTPA103derNdeI DNAを含有
する10μlのTE緩衝液を、2μlの10×AvaII緩
衝液(0.6M NaCl;60mMトリス−HCl、pH=
8.0;0.1M MgCl2;60mM2−メルカプトエタ
ノール;および1mg/ml BSA)と6μlの水に添加し
た。上記のDNAに約2μl(約10単位)の制限酵素Av
aIIを添加し、生成した反応液を37℃で2時間イン
キュベートした。AvaIIで消化したDNAをアガロー
スゲルに負荷し電気泳動を行わせて、約1.4kbの制限
断片を他の消化産物から分離した。そのゲルから、プラ
スミドpTPA103derNdeIの約1.4kbのAvaII
制限断片を単離した。約2μgの所望の断片が得られ、
これを5μlのTE緩衝液に懸濁させた。
の水および5μl(約5単位)のクレノウ酵素を、約1.
4kbのAvaII制限断片の溶液に添加し、得られた反応
液を16℃で30分間インキュベートした。クレノウ酵
素で処理をしたDNAをエタノールで沈澱させ、3μl
の10×リガーゼ緩衝液と14μlの水に再懸濁させ
た。 下記配列:
法に実質的にしたがってキナーゼ処理をした。キナーゼ
処理をしたリンカー約10μlを、2μl(約1000単
位)のT4DNAリガーゼと1μl(約1単位)のT4RN
Aリガーゼとともに、プラスミドpTPA103derNde
Iのクレノウ酵素で処理をした約1.4kbのAvaII制
限断片に加え、得られた反応液を一夜16℃でインキュ
ベートした。連結したDNAをフエノールで一回抽出し
クロロホルムで2回抽出し、エタノールで沈澱させ、2
μlの10×EcoRI緩衝液と16μlの水に再懸濁させ
た。上記のDNA溶液に、約2μl(約10単位)の制限
酵素EcoRIを添加し、得られた反応液を37℃で2時
間インキュベートした。EcoRIで消化されたDNAを
フエノールで1回、クロロホルムで2回抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、3μlの10×リガーゼ緩衝液と20
μlの水に再懸濁させた。このようにして調製された断
片は、大きさが約770bpでtrpPOとTPAのアミノ
末端をコードするが、1つのEcoRI適合性末端と1つ
の平滑末端とをもっており、それをEcoRI−SmaI消
化プラスミドpUC19に連結させてプラスミドpUC1
9TPAFEを形成させた。
Research Laboratories社より入手可能)を、2μl
の10×SamI緩衝液(0.2M KCl:60mMトリス
−HCl、pH=8.0;60mM MgCl2;60mM2−メ
ルカプトエタノール;および1mg/ml BSA)と16μl
の水に溶解した。このDNA溶液に約2μl(約10単
位)の制限酵素SamIを添加し、得られた反応液を25
℃で2時間インキュベートした。SamI消化プラスミド
pUC19DNAをエタノールで沈澱させ、遠心分離し
て集め、2μlの10×EcoI緩衝液と16μlの水に再
懸濁させた。生成したSamI消化プラスミドpUC19
DNAの溶液に、約2μl(約10単位)の制限酵素Eco
RIを添加し、得られた反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。生成したEcoRI−SamI消化プラスミ
ドpUC19DNAをフエノールで1回、クロロホルム
で2回抽出し、5μlのTE緩衝液に再懸濁させた。Ec
oRI−SamI消化プラスミドpUC19DNAを、プラ
スミドpTPA103derNdeI由来の約770bpのEco
RI−平滑末端制限断片を含有する溶液に添加した。こ
のDNA混合物に、約2μl(約1000単位)のT4D
NAリガーゼを添加し、生成した反応液を16℃で一夜
インキュベートした。連結させたDNAは所望のプラス
ミドpUC19TPAFEを形成していた。
位は、プラスミドpUC19TPAFEの構築に利用さ
れるEcoRIとSamIの認識配列を含有しているが、L
acZα断片の暗号配列内に位置している。β−ガラクト
シダーゼをコードするlacZ遺伝子の変異体であるlacZ
△M15変異体を含有する細胞内でlacZα断片を発現
させれば、これらの細胞から機能的β−ガラクトシダー
ゼ分子を発現させることができ、したがってこれらの細
胞は、無色の化合物であるX−Gal(5−ブロモ−4−
クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシ
ド)を加水分解して、そのインジゴで着色される加水分
解生成物にすることができる。プラスミドpUC19の
多クローニング部位にDNAを挿入すると、lacZα断
片の暗号配列を中断するので、かようなプラスミドの宿
主である、lacZ△M15変異体を有する細胞は、X−
Galを加水分解できない(この同じ原理はプラスミドpU
C8にクローン化するときに利用されている。実施例2
参照)。プラスミドpUC19TPAFEを形成した連結
DNAは、実施例2の方法に実質的にしたがって形質転
換されうるよう、コンピテントにしたイー・コリK12
RR1△M15(NRRL B−15440)の細胞を形
質転換するのに用いた。
ンピシリン、40μg/mlのX−Galおよび1mMIPT
Gを含有するL寒天上にプレートした。インジゴ色を示
すことができなかったコロニーを継代培養し、プラスミ
ドDNAを作るのに用い、イー・コリK12RR1△M
15/pUC19TPAFE形質転換細胞を、そのプラ
スミドDNAを制限酵素分析することによって同定し
た。プラスミドpUC19TPAFE DNAを、次の構
築に使うために、実施例3の方法に実質的にしたがっ
て、イー・コリK12RR1△M15/pUC19TP
AFE細胞から単離した。約7μgのプラスミドpUC1
9TPAFEを含有する20μlのTE緩衝液を、10
μlの10×HpaI緩衝液(0.2M KCl;0.1Mト
リス−HCl、pH=7.4;および0.1M MgCl2)と
70μlの水に添加した。約3μl(約6単位)の制限酵素
HpaIをプラスミドpUC19TPAFE DNAの溶液
に添加し、得られた反応液を37℃で20分間インキュ
ベートし、HpaIで部分的に消化するように反応時間を
短かく設計した。反応液を、1×BamHI緩衝液(15
0mM NaCl;10mMトリス−HCl、pH=8.0;お
よび10mM MgCl2;塩の濃度を上げるとHpaIを不活
性化する)で150μlに調節した。約1μl(約16単
位)の制限酵素BamHIを部分的にHpaIで消化したD
NAの上記溶液に添加し、得られた反応液を37℃で9
0分間インキュベートした。
19TPAFE DNAを、エタノールで沈澱させて濃
縮し、1.5%のアガロースゲルに負荷し、レプリコ
ン、β−ラクタマーゼ遺伝子、およびプラスミドpUC
ATPAFEのTPAをコードするDNA全部を含有す
る約3.42kbのHpaI−BamHI制限断片を、所望の
断片を含有するゲルのセグメントから切取り、これを凍
結し、次いでセグメントから液体をしぼりだすことによ
って、ゲルから単離した。エタノールで沈澱させて、D
NAを上記の液体から沈澱させた。約1μgの所望の断
片が得られ、これを20μlのTE緩衝液に懸濁させ
た。約10μgのプラスミドpTPA103を含有する1
0μlのTE緩衝液を、10μlの10×ScaI緩衝液
(1.0M NaCl;60mMトリス−HCl、pH=7.
4;60mMのMgCl2;10mM DTT;および1mg/ml
BSA)と80μlの水に溶解した。得られたプラスミド
pTPA103DNAの溶液に、約3μl(約18単位)の
制限酵素ScaIを添加し、得られた反応液を37℃で9
0分間インキュベートした。反応液の体積を、1×Bam
HI緩衝液で150μlに調節し、その混合物に約μl
(約16単位)の制限酵素BamHIを添加し、37℃で9
0分間インキュベートした。得られたDNAをエタノー
ルで沈澱させ、遠心分離によって集め、電気泳動に付す
ために再懸濁を行った。ScaI−BamHI消化プラスミ
ドpTPA103DNAを、1.5%のアガロースゲル
に負荷して電気泳動を行い、約1.015kbのScaI−
BamHI制限断片を、他の制限産物から分離した。プラ
スミドpTPA103のTPAカルボキシル末端をコー
ドするDNAを含有する約1.015kbのScaI−Bam
HI制限断片をゲルから単離し、約0.5μgの所望の
断片が得られ、これをガラス容器で蒸留した水20μl
に溶解した。
42kbBamHI−HpaI制限断片約2μlと、2μlの1
0×リガーゼ緩衝液と1μlのT4DNAリガーゼ(約1
ワイス単位;このリガーゼは、米国、ウィズコンシン州
53711、マディソン、フィッシュ・ハッチエリー・
ロード、2800S.のPromega Biotec社から入手
した)とともに、プラスミドpTPA103の約1.01
5kbのScaI−BamHI制限断片約2μlに添加し、得
られた反応液を16℃で一夜インキュベートした。連結
させたDNAは所望のプラスミドpBW25を形成して
いた。
うことを除いて実施例2の方法に実質的にしたがって、
形質転換されうるようにコンピテントにしたイー・コリ
K12JM105(BRL社から入手)を形質転換するの
に用いた。形質転換された細胞を100μg/mlのアン
ピシリンを含有するBHI(Difco Laboratories社、
米国、ミシガン州、デトロイト)上にプレートし、イー
・コリK12JM105/pBW25形質転換細胞を、
そのプラスミドDNAを制限酵素分析することによって
同定した。プラスミドpBW25を制限酵素EcoRIで
消化することによって約3.38kbと約1.08kbの制
限断片が得られる。プラスミドpBW25は、次の構築
に用いるために、実施例3の方法にしたがって製造され
る。
誘発とプラスミドpBW28の構築 約5μgのプラスミドpBW25を含有する10μlのガ
ラス容器蒸留水を、約10μlの10×HindIII反応
緩衝液と80μlの水に添加した。得られたプラスミドp
BW25のDNAの溶液に、約1μl(約20単位)の制
限酵素HindIIIを添加し、生成した反応液を37℃
で90分間インキュベートした。得られたHindIII
消化プラスミドpBW25DNAの溶液に、約3μl(約
25単位)の制限酵素EcoRIと10μlの1Mトリス−
HCl、pH=7.6を添加し、生成した反応液を37℃
で90分間インキュベートした。生成したEcoRI−H
indIII消化プラスミドpBW25DNAをエタノール
で沈澱させて濃縮し、1.5%のアガロースゲルに負荷
し、電気泳動に付して約810bpのEcoRI−HindI
II制限断片を他の消化産物から分離した。上記の約8
10bpのEcoRI−HindIII制限断片の約0.5μg
をゲルから単離し、連結用に調製し、ガラス容器で蒸留
した水20μlに再懸濁した。
England Biolabsから入手できる)約4.5μgを含有
するガラス容器で蒸留した水35μlを、10μlの10
×HindIII緩衝液と55μlの水に添加した。得られ
たM13mp8DNAの溶液に約1μl(約20単位)の制
限酵素HindIIIを添加し、生成した反応液を37℃
で1時間インキュベートした。得られたHindIII消
化M13mp8DNAの溶液に、約3μl(約24単位)の
制限酵素RcaRIと約10μlの1Mトリス−HCl、p
H=7.6を添加し、生成反応液を37℃で1時間イン
キュベートした。HindIII−EcoRI消化M13mp
8DNAをエタノールで沈澱させて集め、アガロースゲ
ル電気泳動に付すために再懸濁を行い、大きな制限断片
をゲル電気泳動法で単離した。M13mp8の大きなEco
RI−HindIII制限断片約1μgが得られ、20μl
のガラス容器蒸留水に懸濁させた。M13mp8の大きな
EcoRI−HindIII制限断片約2μl、2μlの10
×リガーゼ緩衝液、12μlの水、および約1μl(約1
ワイス単位)のT4DNAリガーゼを、プラスミドpBW
25の約810bpのEcoRI−HindIII制限断片3
μlに添加し、生成した連結反応液を16℃で一夜イン
キュベートした。
手できる)を、トランスフエクションに使用されるDN
Aの量を変えることを除いて、BRL社のM13Cloni
ng/■Dideoxy'Sequencing Instruction Mannual
に記載の方法に実質的にしたがって、前記連結混合物で
トランスフエクトした。組換えプラークを、β−ガラク
トシダーゼα−断片をコードする遺伝子の挿入失活(こ
れによって、X−ガルが切断され、そのインジゴで着色
される切断産物になる性質が失われる)によって、同定
した。スクリーニングするために、6個の白色のプラー
クを、2.5mlのLブロスに採取し、これに0.4mlの
イー・コリK12JM103を添加し、proABを保持
するFエピソームを確実に保持するように、対数増殖期
で最少培地中で培養した。プラーク含有溶液を空気振盪
器中、37℃で8時間インキュベートした。1.5mlづ
つの液から細胞をペレット化し、Birnboim and Dol
y、Nuc.Acids Res.、7巻、1513頁1979
年のアルカリミニスクリーン法に実質的にしたがって、
RFDNAを単離した。残りの各培養物を4℃で貯蔵し
た。pM8BW26と呼称される所望のファージは、M
13mp8の約7.2kbEcoRI−HindIII制限断片
に連結された、プラスミドpBW25の約810bpのEc
oRI−HindIII制限断片を含有していた。対数増殖
期のイー・コリJM103の約50mlをpM8BW26
に感染させて空気振盪器を用いて37℃で18時間イン
キュベートした。感染した細胞を低速遠心分離によって
ペレット化し、前記Instruction Mannualの方法をス
ケールアップすることによって、培養上澄み液から一本
鎖pM8BW26DNAを調製した。クレノウ反応を室
温で30分間行い、次に37℃で60分間、次に10℃
で18時間行うことを除いて、Adelmanら、DNA2
(3)、183〜193頁、1983年の教示事項に実質
的にしたがって一本鎖pM8BW26に突然変異を誘発
させた。さらに、S1処理を20℃で行い、緩衝液の塩
濃度をメーカーが推奨する濃度の1/2にし、M13配
列決定プライマー(BRL)を使用した。未変性TPAの
アミノ酸残基87〜261の暗号配列を欠失させるのに
使用される合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライ
マーは次のとおりである。
法に実質的にしたがってイー・コリK12JM103を
トランスフエクトするのに用いた。所望の突然変異体
を、RFDNAの制限酵素分析法と、MaxamとGilbert
のDNA配列決定法とで同定した。所望の突然変異体
は、未変性のTPAから失欠させた、アミノ酸残基87
〜261の暗号配列をもっていたが、これをpM8BW
27と命名した。プラスミドpBW28を構築するに
は、各種のDNA断片が必要である。これらの断片の第
1のものは、約20μgのRFpBW27DNAを含有す
る20μlのガラス容器蒸留水を、10μlの10×Nde
I緩衝液と60μlの水に添加することによって得た。
約10μl(約50単位)の制限酵素NdeIをプラスミドp
BW27DNAの混合物に添加し、得られた反応液を3
7℃で2時間インキュベートした。上記のNdeI消化プ
ラスミドpBW27DNAをエタノールで沈澱させ、遠
心分離で集め、10μlの10×EcoRI緩衝液と90
μlの水に再懸濁させた。このNdeI消化プラスミドpM
8BW27DNAの溶液に約10μl(約50単位)の制
限酵素EcoRIを添加し、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。EcoRI−NdeI消化プラス
ミドpM8BW27DNAを、アガロースゲルによる電
気泳動に付して、約560bpのNdeI−EcoRI制限断
片を他の消化産物から分離したが、この断片は欠失部位
にのびるTPA暗号配列の部分を含有している。約56
0bpのNdeI−EcoRI制限断片をゲルから単離し、約
0.5μgの所望の断片が得られ、20μlのガラス容器
蒸留水に懸濁させた。
な第2の断片は、自動DNA合成機で一度に合成される
一本鎖である。その2つの相補的連鎖は、ハイブリッド
を形成して、XbaIとNdeIのオーバーラップを有する
二本鎖DNAセグメントを生成するが、実施例9Aの方
法に実質的にしたがってキナーゼ処理を行いアニールさ
れる。そのリンカーの構造は次のとおりである。
は、約20μgのプラスミドpTPA103を含有する2
0μlのTE緩衝液を、10μlの10×BamHI緩衝液
と60μlの水に添加することによって調製した。約1
0μl(約50単位)の制限酵素BamHIを上記のプラス
ミドpTPA103DNAの溶液に加え、生成した反応
混合物を37℃で2時間インキュベートした。生成した
BamHI消化プラスミドpTPA103DNAをエタノ
ールで沈澱させ、遠心分離により集め、10μlの10
×EcoRI緩衝液と80μlの水に再懸濁させた。得ら
れたBamHI消化プラスミドpTPA103DNAの溶
液に約10μl(約50単位)の制限酵素EcoRIを添加
し、生成した反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。BamHI−EcoRI消化プラスミドpTPA103
DNAをアガロースゲルに負荷し、電気泳動に付して、
約689bpのEcoRI−BamHI制限断片(TPAのカ
ルボキシル末端の暗号配列を含有している)を他の消化
産物から分離した。約0.5μgの約689bpの断片を
ゲルから単離し、次に10μlのガラス容器蒸留水に再
懸濁させた。
な最後の断片はプラスミドpL110から単離した。プ
ラスミドpL110の構築は実施例9d、すなわちこの実
施例の次の節に開示されている。約25μgのプラスミ
ドpL110を含有する25μlのTE緩衝液を、10μ
lの10×XbaI緩衝液(0.5M NaCl;60mMトリ
ス−HCl、pH=7.9;60mM MgCl2;および1mg
/ml BSA)と55μlの水に添加した。生成したプラ
スミドpL110DNAの溶液に約10μl(約50単位)
の制限酵素XbaIを添加し、得られた反応液を37℃で
2時間インキュベートした。XbaI消化プラスミドpL
110DNAをエタノールで沈澱させ、遠心分離により
集め、10μlの10×BamHI緩衝液と89μlのH2
Oに再懸濁させた。得られたXbaI消化プラスミドpL
110DNAの溶液に約1μl(約5単位)の制限酵素Ba
mHIを添加し、生成した反応液を37℃で30分間イ
ンキュベートして部分的にBamHIで消化した。XbaI
で消化しBamHIで部分的に消化したプラスミドpL1
10DNAをアガロースゲルに負荷し電気泳動に付して
約6.0kbのXbaI−BamHI断片を他の消化産物から
明確に分離した。ゲルから約6.0kbの制限断片を単離
したが、約6.0kbのXbaI−BamHI制限断片約0.
5μgが得られ、約40μlのガラス容器蒸留水に懸濁さ
せた。この約6.0kbのXbaI−BamHI制限断片は、
EK−BGHをコードするDNAを除いてプラスミドp
L110全体を含有している。
下の断片をともに混合する。すなわち、プラスミドpL
110の約6.0kbBamHI−XbaI制限断片の約0.
1μg(約8μl);プラスミドpM8BW27の約560bp
のNdeI−EcoRI制限断片の約0.05μg(約2μ
l);プラスミドpTPA103の約689bpのEcoRI−
BamHI制限断片の約0.1μg(約2μl);および約4
5bpのXbaI−NdeI合成リンカーの約0.02μg(約
1μl)である。このDNA混合物に約2μlの10×リ
ガーゼ緩衝液と1μl(約1ワイス単位)のT4DNAリ
ガーゼを添加し、得られた連結液を4℃で一夜2時間イ
ンキュベートした。連結されたDNAは所望のプラスミ
ドpBW28を形成していた。連結されたDNAは、コ
ンピテント細胞にされたイー・コリK12MM294
(NRRL B−15625)を、50mM CaCl2を使
用することを除いて実施例2の方法に実質的にしたがっ
て形質転換するのに使用した。プラスミドpBW28上
にλpLプロモーターと温度感受性λpLレプレッサーを
コードする遺伝子が存在するので、形質転換法と形質転
換体の培養をいくぶん変更した。細胞は、形質転換とこ
れに続く培養中32℃を超える温度には暴露しなかっ
た。この実施例の次の節で、λpLプロモーターとその
温度感受性レプレッサーをコードするプラスミドを扱う
方法についてより詳細に述べる。所望のイー・コリK1
2MM294/pBW28形質転換体を、そのテトラサ
イクリン耐性のアンピシリン感受性表現型およびそのプ
ラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。
ドpL110を構築した。イー・コリK12BE120
1/pKC283の凍結乾燥品がNRRLから受入れ番
号NRRL B−15830で得られる。この凍結乾燥
品を、Lブロスが10mlづつ入った試験管にデカントし
て32℃で2時間インキュベートし、次いで培養物にア
ンピシリンを添加して50μg/mlの濃度とし、次に3
2℃で一夜インキュベートした。イー・コリK12BE
1201/pKC283細胞を32℃で培養した理由
は、プラスミドpKC283がpLプロモーターを含有
し、イー・コリK12BE1201細胞が細胞DNAに
組込まれた温度感受性cIレプレッサー遺伝子を含有し
ているからである。このプラスミド単離法で利用される
細胞が、野生型λpLレプレッサー遺伝子を含有してい
るか、またはλpLプロモーターを含有していない場合
は、以下の実施例で述べるように、インキュベーション
温度は37℃である。
2BE1201/pKC283の単コロニー単離物を得
る方法で、50μg/mlアンピシリンを含有するL寒天
プレート上に置いた。得られた単コロニーを、50μg
/mlのアンピシリンを含有するLブロス10mlに接種
し、はげしく振盪しながら32℃で一夜インキュベート
した。この一夜培養物10mlを500mlのLブロスに接
種し、培養物が定常期に到達するまではげしく振盪しな
がら32℃でインキュベートした。この細胞から、実施
例3の方法に実質的にしたがってプラスミドpKC28
3DNAを調製した。約1mgのプラスミドpKC283
が得られ、TE緩衝液中、約1μg/μlの濃度で、4℃
にて貯蔵した。約10μl(約10μg)のプラスミドpK
C283DNAを、20μlの10×培地塩制限緩衝液
(500mM NaCl;100mMトリス−HCl、pH=
7.5;100mM MgCl2;および10mM DTT)、2
0μlの1mg/ml BSA、5μlの制限酵素PvuII(約
25単位)、ならびに145μlの水と混合し、得られた
反応液を37℃で2時間インキュベートした。本願に記
載されている制限酵素反応は、通常、フエノールによる
抽出とこれに続くクロロホルムによる抽出で終止させ、
次いでDNAを沈澱させ、エタノールで洗浄し、生成し
たDNAをTE緩衝液に再懸濁させる。上記のようにP
vuII消化を終止させた後、生成したPvuII消化プラ
スミドpKC283DNAを沈澱させ、次に5μlのTE
緩衝液に再懸濁させた。
(5'−CCTCGAGG−3')を、10μlの5×キナ
ーゼ緩衝液(300mMトリス−HCl、pH=7.8;5
0mMMgCl2;および25mM DTT)、5μlの5mM
ATP、24μlの水、0.5μlのT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(P−L Biochemicals社によって定義され
ている約2.5単位)、5μlの1mg/ml BSA、およ
び5μlの10mMスペルミジンを含有する混合物中で、
37℃で30分間インキュベートすることによってキナ
ーゼ処理を行った。約12.5μlのキナーゼ処理をし
たXhoIリンカーを、5μlのPvuII消化プラスミドp
KC283DNAに添加し、次いで2.5μlの10×
リガーゼ緩衝液、2.5μlのT4DNAリガーゼ(P−
L Biochemicals社によって定義されている約2.5
単位)、2.5μlの10mMスペルミジン、および1
2.5μlの水を上記のDNAに添加した。得られた連
結反応液を4℃で一夜インキュベートした。連結反応の
後、反応混合物を、高塩緩衝液(0.1M NaCl;0.
05Mトリス−HCl、pH=7.5;10.0mM MgC
l2;および1mM DTT)の組成に調節した。この混合物
に約10μl(100単位)の制限酵素XhoIを添加し、
得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
反応を終止させ、XhoI消化DNAを沈澱させて、再懸
濁させ、XhoIリンカーを連結混合物に添加しないこと
を除いて上記のように連結した。連結させたDNAは所
望のプラスミドpKC283PXを形成していた。
から受入れ番号NRRL B−15993で入手できる
が、野生型λpLcIレプレッサー遺伝子を含有するの
で、λpLプロモーター由来の転写はイー・コリK12
MO(λ+)細胞では起こらない。イー・コリK12MO
(λ+)の単コロニーが単離され、その細胞の10mlの一
夜培養物を作製するが、増殖培地にアンピシリンは使用
されていない。50μlの一夜培養物を用いて、5mlの
Lブロスに接種したが、このLブロスは10mMMgSO
4と10mM MgCl2を含有している。培養物をはげしく
振盪しながら37℃で一夜インキュベートした。翌朝、
培養物を、10mM MgSO4と10mMMgCl2を含有す
るLブロスで200mlまで希釈した。この希釈培養物
を、O.D.590が約0.5になるまで、はげしく振盪
しながら37℃でインキュベートした。O.D.590の
上記の値は細胞密度が約1×108細胞/mlであること
を示している。培養物を氷水浴中で10分間冷却し、4
℃で10分間4000×gで遠心分離して細胞を集め
た。得られた細胞をペレットを100mlの10mM冷Na
Clに再懸濁させ、次いで直ちに遠心分離によって再ペ
レット化した。細胞ペレットを100mlの30mM Ca
Cl2に再懸濁させて、氷上で20分間インキュベートし
た。
の30mM CaCl2に再懸濁させた。この細胞の0.5m
lをさきに調製した連結DNAに添加し、そのDNAの
CaCl2濃度を30mMにした。得られた細胞−DNA混
合物を、氷上で1時間インキュベートし、90秒間42
℃で熱ショックを与え、次いで氷上で約2分間冷却し
た。得られた細胞−DNA混合物を、125mlのフラス
コに入れた10mlのLB培地に入れて希釈し、37℃で
1時間インキュベートした。100μlづつを、アンピ
シリンを含有するL寒天プレート上にプレートし、コロ
ニーが現われるまで37℃でインキュベートした。生成
した各コロニーを別個に培養し、個々のコロニーのプラ
スミドDNAを制限酵素分析法とゲル電気泳動法によっ
て試験した。プラスミドDNAの単離は実施例3の方法
にしたがって小規模に実施したが、CsClの勾配段階は
所望のイー・コリK12MO(λ+)/pKC283PX
形質転換細胞が同定されるまで省略した。
NAを、20μlの10×高塩緩衝液、20μlの1mg/
ml BSA、5μl(約50単位)の制限酵素BglII、5
μl(約50単位)の制限酵素XhoIおよび150μlの水
に溶解し、得られた反応液を37℃で2時間インキュベ
ートした。反応を停止させ、BglII−XhoI消化DN
Aを沈澱させ、そのDNAを5μlのTE緩衝液に再懸
濁させた。BglIIとXhoIの制限酵素による切断に特
徴的な一本鎖DNAの断端を有するDNAリンカーを自
動DNA合成器を用いて合成し、実施例9Aに記載して
いるようにしてキナーゼ処理をした。そのDNAリンカ
ーは以下の構造を有する。
スミドpKC283PXを、上記の連結法に実質的にし
たがって連結した。連結したDNAは所望のプラスミド
pKC283−Lを形成していた。プラスミドpKC28
3−L DNAを、イー・コリK12MO(λ+)の形質
転換に用い、得られたイー・コリK12MO(λ+)/p
KC283−L形質転換細胞を、そのアンピシリン耐性
表現型と、そのプラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て同定した。約10μgのプラスミドpKC283−Lの
DNAを、20μl10×高塩緩衝液、20μlの1mg/
ml BSA、5μl(約50単位)の制限酵素XhoI、およ
び155μlの水に溶解し、生成した反応液を37℃で
2時間インキュベートした。XhoIで消化したプラスミ
ドpKC283−L DNAを沈澱させ、2μl−10×
ニックトランスレーション緩衝液(0.5Mトリス−H
Cl、pH=7.2;0.1M MgSO4;および1mM D
TT)、各デオキシヌクレオチド三リン酸が2mMの溶液
1μl、15μlの水、1μlのクレノウ酵素(P−L B
iochemicals社が定義している約6単位)、ならびに1μ
lの1mg/mlBSAに再懸濁させた。得られた反応液を
25℃で30分間インキュベートし、次いで溶液を70
℃で5分間インキュベートすることによって反応を停止
させた。
CG−3')をキナーゼ処理し、XhoIで消化してクレノ
ウ酵素で処理したプラスミドpKC283−L DNA
に、上記のリンカー連結法に実質的にしたがって連結し
た。連結反応の後、DNAを、高塩緩衝液中37℃で約
2時間約100単位のBamHIで消化した。BamHIに
よる消化の後、DNAを連結用に調製し、次いで約5.
9kbのBamHI制限断片を連結によって環状にし、この
環状DNAを用い、上記方法に実質的にしたがってイー
・コリK12MO(λ+)を形質転換した。イー・コリK
12MO(λ+)/pKC283−LB形質転換細胞を同
定し、次に、実施例3の方法に実質的にしたがって上記
形質転換細胞からプラスミドpKC283−LB DNA
を製造した。約10μgのプラスミドpKC283PX
を、高塩緩衝液中、制限酵素SalIで消化し、クレノウ
酵素で処理し、上記の方法に実質的にしたがってEcoR
Iリンカー(5'−GAGGAATTCCTC−3')に連
結した。制限酵素EcoRIで消化(約2.1kbのDNA
を切除することになる)した後、約4.0kbのEcoRI
制限断片を連結して環状にしてプラスミドpKC283
PRSを得た。連結したDNAを用いてイー・コリK1
2MO(λ+)を形質転換し、イー・コリK12MO(λ
+)/pKC283PRS形質転換細胞に同定した後、実
施例3の方法に実質的にしたがって、プラスミドpKC
283PRS DNAを上記形質転換細胞から製造し
た。
を、200μlの高塩緩衝液中、制限酵素PstIとSph
Iの各々約50単位で消化した。反応液を37℃で約2
時間インキュベートした後、生成した反応混合物を、
0.6%低ゲル化温度アガロース(米国、メイン州04
841、ロックランド、FMC Corporation、Marin
eColloids Division)のゲル上で、トリス−アセテー
ト緩衝液中約130Vおよび約75mAで2〜3時間電
気泳動に付した。そのゲルを臭化エチジウムの希薄溶液
で染色して、約0.84kbのPstI−SphI制限断片を
構成するDNAのバンドを長波長の紫外線によって目視
可能し、小さなセグメントのゲルから切取った。セグメ
ントの体積を、セグメントの重量と密度によって測定
し、同じ体積の10mMトリス−HCl、pH7.6を、
該セグメントの入っている試験管に添加した。次にその
セグメントを72℃でインキュベートすることによって
溶融させた。プラスミドpKC283PRSの約0.8
5kbのPstI−SphI制限断片約1μgが約100μlの
体積で得られた。類似の方法で、プラスミドpKC28
3−LBを制限酵素PstIとSphIで消化し、得られた
約3.0kbの制限断片を、アガロースゲル電気泳動法で
単離し、連結用に調製した。
5kbのPstI−SphI制限断片を、プラスミドpKC2
83−LBの約3.0kbのPstI−SphI制限断片に連
結した。連結させたDNAは所望のプラスミドpL32
を形成していた。プラスミドpL32を用いてイー・コ
リK12MO(λ+)細胞を形質転換させ、そのイー・コ
リK12(λ+)/pL32形質転換細胞から、実質的に
実施例3の方法にしたがってプラスミドpL32DNA
を製造した。プラスミドpL32のDNAを分析した結
果、1つ以上のEcoRIリンカーが、プラスミドpKC
283PXのクレノウ酵素で処理されたSalI断端に連
結していることが分かった。1つ以上のEcoRIリンカ
ーが存在しても、プラスミドpL32、もしくはプラス
ミドpL32の誘導体の有用性には影響せず、XhoI制
限部位の存在によって検出でき、このXhoI制限部位
は、2つのEcoRIリンカーがともに連結されている場
合はいつでも生成している。プラスミドpCC101
は、1984年3月6日に出願された米国特許願第58
6,581号(代理人整理番号X−5872A)の実施例
3に開示されている。この出願は本願に援用する。EK
−BGHをコードするDNAを単離するために、約10
μgのプラスミドpCC101を、制限酵素XbaIとBam
HIを各々約50単位含有する高塩緩衝液200μl中
で消化した。消化産物をアガロースゲル電気泳動法で分
離し、EK−BGHをコードする約0.6kbのXbaI−
BamHI制限断片をゲルから単離し、連結用に調製し
た。
mHIで消化し約3.9kbの制限断片を単離し、連結用
に調製した。プラスミドpL32の約3.9kbXbaI−
BamHI制限断片を、プラスミドpCC101の約0.
6kbのXbaI−BamHI制限断片に連結してプラスミド
pL47を得た。プラスミドpL47を用いて、イー・コ
リK12MO(λ+)を形質転換し、イー・コリK12M
O(λ+)/pL47形質転換細胞を同定した。この形質
転換細胞から実施例3の方法に実質的にしたがって、プ
ラスミドpL47DNAを製造した。プラスミドpPR1
2は、温度感受性pLレプレッサー遺伝子cI857と、
プラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性を供与
する遺伝子を含有している。プラスミドpPR12は、
1984年3月13日に特許を付与された米国特許第
4,436,815号に開示され特許請求がなされてい
る。
0μlの高塩緩衝液中、約50単位の制限酵素EcoRI
で、37℃にて2時間消化した。EcoRI消化プラスミ
ドpPR12DNAを沈澱させ、次いで上記の方法に実
質的にしたがってクレノウ酵素で処理した。クレノウ反
応の後、EcoRIで消化されクレノウ酵素で処理された
プラスミドpPR12のDNAを連結によって再度環状
化し、その連結DNAは、所望のプラスミドpPR12
△R1を形成していたが、このプラスミドを用いてイー
・コリK12RV308(NRRL B−15624)を
形質転換した。形質転換細胞は、テトラサイクリン(1
0μg/ml)耐性に基づいて選択した。イー・コリK12
RV308/pPR12△R1形質転換細胞を同定した
後、プラスミドpPR12△R1を、実施例3の方法に
実質的にしたがって形質転換細胞から製造した。
を、200μlの培地塩緩衝液中、約50単位の制限酵
素AvaIで、37℃にて2時間消化した。AvaI消化プ
ラスミドpPR12△21DNAを沈澱させ、クレノウ
酵素で処理した。クレノウ反応の後、AvaIで消化して
クレノウ酵素で処理したプラスミドpPR12△R1D
NAをEcoRIリンカー(5'−GAGGAATTCCT
C−3')に連結し、沈澱させ、約50単位の制限酵素E
coRIを含有する約200μlの高塩緩衝液に再懸濁さ
せ、37℃で約2時間インキュベートした。EcoRIに
よる消化の後、得られた反応混合物を低温溶融性アガロ
ースゲルに負荷し、約5.1kbのEcoRI制限断片をゲ
ルから精製し、連結して再び環状化して所望のプラスミ
ドpPR12AR1を得た。プラスミドpPR12AR1
のDNAを用いてイー・コリK12RV308を形質転
換したが、形質転換細胞の選択はテトラサイクリン耐性
に基づいて行った。この形質転換体から、実施例3の方
法に実質的にしたがってプラスミドpPR12AR1D
NAを製造した。約10μgのプラスミドpPR12AR
1のDNAを、制限酵素PstIのEcoRIを各々約50
単位づつ含有する約200mlの高塩緩衝液に懸濁させ、
得られた消化反応液を37℃で約2時間インキュベート
した。次に反応混合物をアガロースゲルに負荷し、プラ
スミドpPR12AR1の約2.9kbのPstI−EcoR
I制限断片を単離し、連結用に調製した。
μlの高塩緩衝液中、制限酵素PstIとBamHIで、3
7℃にて2時間消化した。PstI−BamHI消化DNA
をアガロースゲルに負荷し、複製起点と、アンピシリン
耐性を供与する遺伝子の部分を含有する約2.7kbのP
stI−BamHI制限断片を単離し連結用に調製した。別
の反応で、約10μgのプラスミドpL47DNAを、2
00μlの高塩緩衝液中、制限酵素EcoRIとBamHI
とで37℃にて2時間消化して、λpL転写活性化配
列、イー・コリlpp翻訳活性化配列、およびEK−BG
HをコードするDNAを含有する約1.03kbのEcoR
I−BamHI制限断片を単離して連結用に調製した。プ
ラスミドpL47の、約2.7kbのPstI−BamHI制
限断片と約1.03kbのEcoRI−BamHI制限断片
を、プラスミドpPR12AR1の約2.9kbのPstI
−EcoRI制限断片に連結してプラスミドpL110を
構築し、この連結させたDNAを用いてイー・コリK1
2RV308を形質転換させた。テトラサイクリン耐性
を、形質転換細胞を選択する基準として利用した。2つ
のPstI制限酵素認識部位がEK−BGHのコドン領域
に存在するが添付図面の制限部位と機能地図には示して
いない。
(NRRL B−15928)を、10μlの10×Hind
III反応緩衝液、5μl(約50単位)の制限酵素Hind
III、および85μlの水に溶解し、この反応液を3
7℃で2時間放置した。次に反応混合物のLiClを0.
15Mにし、2.5倍体積のエタノールを添加してドラ
イアイス−エタノール浴でインキュベートした後、DN
Aを遠心分離でペレット化した。得られたDNAペレッ
トを、10μlの10×BglII緩衝液、5μl(約50
単位)の制限酵素BglIIおよび85μlの水に溶解し、
得られた反応液を37℃で2時間放置した。BglIIで
消化の後、反応混合物を0.85%のアガロースゲルに
負荷し、断片を電気泳動法で分離した。臭化エチジウム
と紫外線を用いてゲルを目視可能にし、所望の約4.2
kbのHindIII−BglII断片を含むバンドを、前記
のようにしてゲルから切取った。ペレットを10μlの
水に再懸濁させたが、このペレットは、プラスミドpS
V2−β−グロビンの所望の約4.2kbのHindIII
−BglII制限断片約5μgを形成していた。TPAを
コードする、プラスミドpTPA103の約2.0kbの
HindIII−BamHI制限断片を、前記教示事項に実
質的にしたがってプラスミドpTPA103から単離し
た。プラスミドpTPA103の約2.0kbのHindII
I−BamHI制限断片の約5μgが得られ、10μlの水
に懸濁し、−20℃で貯蔵した。
4.2kbのBglII−HindIII制限断片2μlと、プ
ラスミドpTPA103の約2.0kbのHindIII−B
glII断片4μlを混合し、次いで、2μlの10×リガ
ーゼ緩衝液、11μlの水、および1μlのT4リガーゼ
(約500単位)とともに、4℃で一夜インキュベートし
た。形質転換されうるようにコンピテント細胞にされた
イー・コリK12RR1細胞(NRRL B−1521
0)を、上記の連結させたDNAを使用し、実施例2の
教示事項に実質的にしたがって形質転換した。プラスミ
ドDNAを、イー・コリK12RR1/pTPA301
形質転換細胞から、実施例3の方法に実質的にしたがっ
て得た。プラスミドpSV2−dhfrは、形質転換された
真核細胞の選択と、dhfr遺伝子に共有結合で連結された
DNAの増幅とに有用なデヒドロ葉酸レダクターゼ(dhf
r)を含有している。10μgのプラスミドpSV2−dhfr
(イー・コリK12HB101/pSV2−dhfr、ATC
C37146から単離されたもの)を、10μlの10×
PvuII緩衝液、2μl(約20単位)のPvuII制限酵
素および88μlの水と混合し、得られた反応液を37
℃で2時間インキュベートした。反応を、フエノールと
クロロホルムの抽出によって終止させ、次にPvuII消
化プラスミドpSV2−dhfrDNAを沈澱させ遠心分離
によって集めた。
G−3')をキナーゼ処理し、以下の方法で連結用に調製
した。1μgのリンカー含有の5μlの水に、10μlの
5×キナーゼ塩(300mMトリス−HCl、pH=7.
8;50mM MgCl2;および25mM DTT)、5μlの
5mM ATP、5μlのBSA(1mg/ml)、5μlの10
mMスペルミジン、19μlの水、ならびに1μlのポリ
ヌクレオチドキナーゼ(10単位/μl)を添加した。こ
の反応液を37℃で60分間インキュベートして−20
℃で貯蔵した。5μl(約5μg)のPvuII消化プラスミ
ドpSV2−dhfrと、12μl(約0.25μg)のキナー
ゼ処理をしたBamHIリンカーとを混合し、11μlの
水、2μlの10×リガーゼとともに、16℃で一夜イ
ンキュベートした。上記の連結反応混合物に、10μl
の10×BamHI反応緩衝液、10μl(約50単位)の
BamHI制限酵素および48μlの水を添加し、次いで
37℃で3時間インキュベートした。反応液を1%アガ
ロースゲルに負荷し、所望の約1.9kbの断片(dhfr遺
伝子を含有)をゲルから単離した。これらの実施例で製
造したリンカー付加物は、アガロースゲルで通常どおり
に精製して、最終ベクター中に多くのリンカー配列が入
る可能性を少なくした。得られた約3μgの断片を10
μlのTE緩衝液に懸濁させた。
TPA301を上記のようにBamHI制限酵素によって
消化した。プラスミドpTPA301中には非反復Bam
HI部位があるので、このBamHI消化によって線状の
プラスミドpTPA301DNAが生成する。BamHI
消化プラスミドpTPA301をエタノールで沈澱さ
せ、94μlの水に再懸濁させ、1μlの仔ウシ腸アルカ
リフォスファターゼ(米国、マサチューセッツ州021
73、レキシントン、スプリング・ストリート128、
Collaboratine Research社)と5μlの1Mトリス−
HCl、pH=9.0を用いて65℃にて45分間ホスフ
ァターゼ処理を行った。上記DNAをフエノール:クロ
ロホルムで抽出し次にクロロホルム:イソアミルアルコ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させ、20μlの水に
再懸濁させた。10μl(約0.25μg)のホスファター
ゼ処理をしたプラスミドpTPA301を、5μlのBam
HI、dhfr遺伝子を含有する制限断片(約1.5μg)、
3μlの10×リガーゼ緩衝液、3μl(約1500単位)
のT4DNAリガーゼおよび9μlの水に加えた。この
連結反応を、15℃で一夜インキュベートしたが、連結
されたDNAは所望のプラスミドpTPA303DNA
を形成していた。
K12RR1(NRRL B−15210)の形質転換に
用い、得られたイー・コリK12RR1/pTPA30
3形質転換細胞を、そのアンピシリン耐性表現型と、そ
のプラスミドDNAの制限酵素分析とによって同定し
た。プラスミドpTPA303を、実施例3の方法に実
質的にしたがって上記の形質転換細胞から単離した。p
BR322レプリコンとプラスミドpTPA301由来
のβ−ラクタマーゼ遺伝子とをコードする約2.7kbの
EcoRI−BglII制限断片を単離するために、約10
μgのプラスミドpTPA301を、1×BglII緩衝液
中に20単位のBglII制限酵素を含有する400μl
の全反応体積中37℃で完全に消化する。このBglII
消化の後、トリス−HClの濃度を110mMに調節し、
20単位のEcoRI制限酵素をBglII消化DNAに添
加した。生成したEcoRI−BglII消化DNAをアガ
ロースゲルに負荷し電気泳動に付して、約2.7kbEco
RI−BglII制限断片を他の消化産物から分離し、次
にこの約2.7kbの断片を単離し、連結用に調製した。
ために、プラスミドpTPA303を、HindIIIとE
coRIの制限酵素で2重消化を行って、dhfr遺伝子を含
有する約2340bpのEcoRI−HindIII制限断片
を単離して回収した。TPAのカルボキシル末端のコド
ン領域とSV40プロモーターとを含有する、プラスミ
ドpTPA303の約2kbのHindIII−SstI制限断
片を単離するために、プラスミドpTPA303を、1
×HindIII緩衝液中で、HindIIIとSstIの制限
酵素で2重消化した。約1.7kb断片をゲルから単離
し、連結用に調製した。
oII(BglIIオーバーラップによる連結に対して適合
性である)−SstI制限断片であって、修飾TPAのア
ミノ末端に対するコドン領域を含有する断片を単離する
ために、約10μgのプラスミドpBW28を、1×Xho
II緩衝液(0.1Mトリス−HCl、pH=8.0;0.
1M MgCl2;0.1%トリトンX−100;および1mg
/ml BSA)中で、XhoII酵素で完全に消化した。得
られたXhoII消化DNAを、エタノールで沈澱させて
回収し、次いでこれをSstI酵素で完全に消化した。生
成したXhoII−SstI消化DNAをアクリルアミドゲ
ルに負荷し、所望の断片をゲルから単離して連結用に調
製した。上記の各断片:すなわち、プラスミドpTPA3
01の約2.7kbEcoRI−BglII制限断片;プラス
ミドpTPA303の約2.34kbのEcoRI−HindI
II制限断片;プラスミドpTPA303の約1.7kbの
SstI−HindIII制限断片;およびプラスミドpBW
28の約0.68kbのSstI−XhoII制限断片の約
0.1μgづつを、連結してプラスミドpBW32を作製
した。この連結混合物を用い、50mM CaCl2を使う
ことを除いて実施例2に教示されているようにして、イ
ー・コリK12MM294を形質転換した。形質転換細
胞は、そのアンピシリン耐性表現型と、そのプラスミド
DNAの制限分析によって同定した。プラスミドpBW
32のDNAは、実施例3の方法に実質的にしたがっ
て、イー・コリK12 MM294/pBW32形質転換
細胞から得た。プラスミドpBW32の制限部位と機能
地図を添付図面の第14図に示す。
およびpLPCdhfr2の構築 A.プラスミドpLPChd1とpLPChd2の構築 約20μgのプラスミドpBW32を含有する20μlの
TE緩衝液を、10μlの10×BamHI緩衝液と60
μlの水に添加した。このプラスミドpBW32DNAの
溶液に、約10μl(約50単位)の制限酵素BamHIを
添加し、得られた反応液を37℃で2時間インキュベー
トした。生成したBamHI消化プラスミドpBW32の
DNAをエタノールで沈澱させ、遠心分離によって集
め、5μlの10×クレノウ緩衝液、45mlの水および
2μl(約100単位)のクレノウ酵素に再懸濁させた。
得られた反応液を16℃で30分間インキュベートし
た。次に反応混合物をアガロースゲルに負荷し、電気泳
動に付して、消化産物を明確に分離した。プラスミドp
BW32の約1.9kbのクレノウ処理BamHI制限断片
であってdhfr遺伝子を含有する断片をゲルから単離し、
実施例4Aの方法に実質的にしたがって連結用に調製し
た。約4μgの所望の断片が得られ、5μlのTE緩衝液
に懸濁させた。
含有する100μlのTE緩衝液を、15μlの10×E
coRI緩衝液と30μlの水に添加した。得られたプラ
スミドpLPChyg1DNAの溶液に、約5μl(約50単
位)の制限酵素EcoRIを添加し、生成した反応液を3
7℃で約10分間インキュベートした。短かい反応時間
を算出して、EcoRIによる部分消化を行わせた。プラ
スミドpLPChyg1は、2つのEcoRI制限部位をもっ
ているが、そのうちの1つはハイグロマイシン耐性を付
与する(HmR)遺伝子の暗号配列内に存在しているの
で、dhfr遺伝子を含有する制限断片を、上記HmR遺伝
子には存在しない。プラスミドpLPChyg1のEcoRI
部位に挿入することが望ましい。EcoRIによって部分
的に消化したプラスミドpLPChyg1のDNAをアガロ
ースゲルに負荷し、電気泳動に付して、別個に切断した
プラスミドpLPChyg1DNAを未切断のプラスミドD
NAおよび他の消化産物から分離した。別個に切断した
DNAをゲルから単離し、実施例4Aの方法に実質的に
したがって連結用に調製した。RcoRIで別個に切断し
たプラスミドpLPChyg1約2μgが得られ、25μlの
TE緩衝液に懸濁させた。この試料に、約5μl(約25
単位)のクレノウ酵素、5μlの10×クレノウ緩衝液、
および40μlの水を添加し、生成した反応液を16℃
で60分間インキュベートした。クレノウ処理をしたE
coRI部分消化DNAをフエノールで2回抽出し次にク
ロロホルムで1回抽出し、エタノールで沈澱させ、次に
25μlのTE緩衝液に再懸濁させた。
ノウ処理BamHI制限断片約5μlと、別個にEcoRI
で切断したプラスミドpLPChyg1DNA約5μlとを
混合し、このDNA混合物に、1μlの10×リガーゼ
緩衝液、5μlの水、1μl(約500単位)のT4DNA
リガーゼおよび1μl(約2単位)のT4RNAリガーゼ
を添加し、生成した反応液を16℃で一夜インキュベー
トした。連結させたDNAは所望のプラスミドpLPCh
d1とpLPChd2を形成していたが、これらのプラスミ
ドは、dhfr遺伝子を含有する約1.9kbの断片の配向だ
けが異なっている。形質転換を受けうるようコンピテン
ト細胞にされたイー・コリK12HB101細胞を、上
記連結DNAを用いて、実施例2の方法に実質的にした
がって形質転換した。形質転換細胞を100μg/mlの
アンピシリンを含有するL寒天上にプレートし、アンピ
シリン耐性形質転換細胞を、そのプラスミドDNAの制
限酵素分析法で分析して、イー・コリK12HB101
/pLPChd1とイー・コリK12HB101/pLPC
hd2の形質転換細胞を同定した。プラスミドpLPChd
1の制限部位と機能地図を添付図面の第15図に示す。
プラスミドpLPChd1とプラスミドpLPChd2のDN
Aを、実施例3の方法に実質的にしたがって適切な形質
転換細胞から単離した。プラスミドpLPChd3とpLP
Chd4は、構造がプラスミドpLPChd1とpLPChd2
に類似している。プラスミドpLPChd3とpLPChd4
は、出発物質としてプラスミドpLPChyg1ではなくて
プラスミドpLPChyg2を使うことを除いて、プラスミ
ドpLPChd1とpLPChd2を構築するのに使う方法に
実質的にしたがって構築される。
fr2の構築 約100μgのプラスミドpBW32を含有する100μ
lのTE緩衝液を、15μlの10×BamHI緩衝液と2
5μlの水に添加した。このプラスミドpBW32DNA
の溶液に約10μl(約25単位)の制限酵素BamHIを
添加し、得られた反応液を37℃で2時間インキュベー
トした。BamHI消化プラスミドpBW32DNAを、
実施例10Aの方法に実質的にしたがってクレノウ酵素
で処理した。平滑断端の断片をエタノールで沈澱させ、
10μlのTE緩衝液に再懸濁させ、アガロースゲルに
負荷し、電気泳動に付し、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺
伝子を含有する約1.9kbのBamHI制限断片を他の消
化産物から分離した。この約1.9kbの制限断片をゲル
から単離し、実施例4Aの方法に実質的にしたがって連
結用に調製した。約10μgの所望の断片が得られ、こ
れを5μlのTE緩衝液に懸濁させた。実施例8で作製
した。約5μlのNdeI−StuI消化プラスミドpLPC
DNAを、プラスミドpBW32の約1.9kbのBamH
I制限断片をクレノウ処理したもの5μl、1.5μlの
10×リガーゼ緩衝液、1μl(約1000単位)のT4
DNAリガーゼ、1μl(約2単位)のT4RNAリガー
ゼ、および1.5μlの水に添加した。得られた連結反
応液を16℃で一夜インキュベートした。連結させたD
NAは所望のプラスミドのpLPCdhfr1とpLPCdhfr
2を形成していたが、これらのプラスミドは、dhfr遺伝
子を含有する約1.9kbの断片の配向だけが異なってい
る。この連結させたDNAを用いて、実施例2の方法に
実質的にしたがつてイー・コリK12HB101を形質
転換した。形質転換された細胞を、アンピシリンを含有
するL寒天にプレートし、アンピシリン耐性のイー・コ
リK12HB101/pLPCdhfr1とイー・コリK1
2HB101/pLPCdhfr2形質転換細胞を、そのプ
ラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。
胞の構築と、これらの形質転換細胞における組換え遺伝
子発現レベルの測定。 この発明の重要な態様は、E1A遺伝子の産物の存在下
で遺伝子の発現を刺激するためのBKエンハンサーとG
Tエンハンサーの使用に関する。293細胞は本来的に
E1A遺伝子産物を発現するので、293細胞がこの発
明の真核発現ベクターの好ましい宿主である。293細
胞は、アデノウイルス5型(いずれの特定の型のアデノ
ウイルスもこの発明の方法においてE1A遺伝子産物を
供給するのに使用できることに留意のこと)で形質転換
されたヒト胎児(胚)腎臓細胞であり、受託番号CRL
1573でATCCから入手できる。しかし、この発明
の発現ベクターは、E1A遺伝子産物が存在していなく
ても、広範囲の宿主細胞内で機能する。さらに、E1A
遺伝子(Grinnellら、Mol.Cell.Biol.、6巻、3
596〜3605頁、1986年)を含有するベクタ
ー、例えばプラスミドpLPCE1AとpLPCE1A
1、もしくはせん断された(sheered)アデノウイルスD
NAで形質転換するか、またはアデノウイルスによる感
染によって、E1A遺伝子産物を非E1A産生細胞系に
導入することができる。
細胞細胞系と呼んでいるが、この方法は、一般に、ほと
んどの真核細胞系に適用できる。293細胞は、受託番
号CRL1573でATCCから得られ、25mm2のフ
ラスコに入っており、このフラスコ中には、熱で不活性
化したウマ血清を10%含有するイーグルの最少必須培
地に存在する約5.5×106の細胞の全面成長単層が
入っている。このフラスコを37℃でインキュベート
し、培地は1週間に2回取替える。培地を取出し、ハン
スクの平衡塩類溶液(Gibco)ですすぎ、1〜2分間の間
に0.25%のトリプシンを添加し、新鮮培地ですす
ぎ、吸引し、新しいフラスコに、1:5もしくは1:10
の継代培養比で入れることによって、細胞の継代培養を
行う。
×106細胞/皿の量で接種する。培地は形質転換を行
う4時間前に変える。エタノールで沈澱させ滅菌したプ
ラスミドDNAの水溶液を用いて、40μg/mlDNA
と250mM CaCl2を含有する2×DNA−CaCl2溶
液を調製する。280mM NaCl、50mM Hepesおよ
び1.5mMリン酸ナトリウムを含有し、pHを7.05
〜7.15に調節した2×HBSを調製する。上記の2
×DNA−CaCl2溶液を、同体積の滅菌2×HBSに
滴下する。木綿のプラグを備えた1mlの滅菌プラスチッ
クピペットを、2×HBSの入った混合管に挿入し、D
NAを添加しながら吹込みによって泡を導入する。リン
酸カルシウム−DNAの沈澱を、撹拌せずに室温で30
〜45分間生成させる。次に沈澱を、プラスチックピペ
ットでゆるやかにピペッテイングすることによって混合
し、1mlの沈澱(1プレート当り)を、受容体細胞を被覆
する10mlの増殖培地に直接添加する。37℃で4時間
インキュベートした後、培地を、10%のウシ胎仔血清
を含有するDMEMと取替えて、選択圧を与える前に、
細胞をさらに72時間インキュベートさせる。組換えヒ
トプロテインCを発現する形質転換細胞用の増殖培地
は、1〜10μg/mlのビタミンKすなわち前記タンパ
ク質のγ−カルボキシル化に必要な補助因子を含有して
いる。真核細胞内で機能する選択マーカーを含有してい
ないプラスミドについては、形質転換するのに次のプラ
スミドの混合物を利用する。すなわち、そのプラスミド
の混合物とは、選択マーカーを欠いているこの発明の発
現ベクター;および真核細胞内で機能する選択マーカー
を含有する発現ベクターの混合物である。この同時形質
転換法によれば、両方の形質転換プラスミドを含有する
細胞を同定することができる。
含有するプラスミドでトランスフェクトした細胞につい
ては、ハイグロマイシンを、増殖培地に、約200〜4
00μg/mlの最終濃度まで添加する。次に細胞を、培
地を3〜4日間隔で変えながら37℃で2〜4週間イン
キュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコロ
ニーを、別個の培養フラスコに移して特性決定を行う。
ネオマイシン(G418もネオマイシンの代わりに使用
される)耐性コロニーの選択は、G418をハイグロマ
イシンの代わりに300μg/mlの最終濃度まで添加す
ることを除いて、ハイグロマイシン耐性細胞の選択法に
実質的にしたがって行われる。293細胞はdhfr陽性で
あるので、dhfr遺伝子を含有するプラスミドをもってい
る293形質転換細胞は、dhfr陽性表現型に基づいて単
独で選択されない。そしてこの表現型は、ヒポキサンチ
ンとチミンを欠く培地で増殖できる。機能性dhfr遺伝子
を欠き、dhfrを含有するプラスミドで形質転換される細
胞系は、dhfr+表現型に基づいて選択できる。
系に導入するために選択マーカーとして、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ(dhfr)を使用し、次にメトトレキセート
を、プラスミドのコピー数を増幅するために用いること
は、文献によく発表されている。dhfrを、dhfr産生細胞
中で選択マーカーおよび増幅マーカーとして用いること
は充分には研究されていないが、霊長類の細胞内で有効
な同時増幅を行うには、メトトレキセートを用いて同時
増幅を行う前に直接に選択できるマーカーを用いて初期
の選択を行う必要がある。この発明の使用は、使用され
る選択マーカーによって限定されない。さらに、メタロ
チオネイン遺伝子のような増幅マーカー、アデノシンデ
アミナーゼ遺伝子、またはP−糖タンパク質が例として
挙げられる多重遺伝子抵抗族のメンバーが利用できる。
293細胞では、ハイグロマイシンB耐性を供与する遺
伝子のような選択マーカーを含有するベクターで形質転
換し、次いでメトトレキセートを用いて増幅することが
有利であるが、メトトレキセートは、293細胞中のマ
ウスのdhfr含有プラスミドを直接選択するのに使用する
ことはできない。同時増幅のレベルは、サザーンハイブ
リッド形成法などの当該技術分野で公知の方法で測定す
ることができる。
gを用いて293細胞を形質転換して培養すると最高レ
ベルのプロテインCの産生量(24ウエルの微量滴定プ
レートで約0.2μg/ml)が得られた。その形質転換細
胞をサブクローン化し、約2〜3倍のプロテインCを産
生することができるクローンを選択した。このサブクロ
ーンを安定な形質転換細胞CC311と呼称する。
/pGTC細胞は、凍結乾燥品の形態で、米国、イリノ
イ州、ペオリアのNational Regional Research
Laboratoriesから得られる。イー・コリK12AG1
/pGTCは、1990年1月18日にNRRLに寄託
され、そこの永久貯蔵培養品になり、受託番号NRRL
B−18593で公けに入手できる。この培養物を再
構成させ、実施例3の教示事項に実質的にしたがって、
プラスミドを培養物から精製する。プラスミドpLPC
は、この発明のGBMT修飾転写単位の後に発現する位
置にある、ヒトプロテインCのcDNA配列を含有して
いる。プラスミドpGTCの制限部位と機能地図を添付
図面の図16に示す。プラスミドpGTCを用い、実施
例11の教示事項に実質的にしたがってCC311クロ
ーンを形質転換した。同様にして、プラスミドpLPC
−hd、pLPC−hygおよびpLPC−dhfrをすべて用い
て293細胞を形質転換した。安定な形質転換とサブク
ローニングを確認した後、各形質転換細胞が産生するヒ
トプロテインCの相対的なレベルを、Grinnelら、Bio
technology、5巻、1189−1192頁、1987年
に記載されている標準のELISA検定法を用いて試験
した。またその全教示事項は本明細書に援用する。上記
検定法から得た結果は、プラスミドpLPC−hd、pLP
C−hygもしくはpLPC−dhfrで形質転換された細胞
は、平均して120ng/mlのプロテインCを分泌し、一
方プラスミドpGTCで形質転換されたCC311細胞
は平均して2930ng/mlのプロテインCを分泌するこ
とを示した。これらの実験結果は、前記第2表に示して
ある。Grinnelらの上記のBiotechnology誌の報告、ま
たは1990年4月11日に公告されたyanのヨーロッ
パ特許公告第0363126号の教示事項にしたがっ
て、上澄み液からプロテインCを回収することができ、
これらの全教示事項は本明細書に援用する。
の構築 プラスミドpLAPC−IRSは、BKエンサーおよび
SV40T抗原と連結したアデノウイルス後期プロモー
ターで駆動される、活性型(チモーゲンではない)プロテ
インCの遺伝子配列を含有している。プラスミドpLA
PC−IRSの構築は、1989年6月7日に公告され
たBangらのヨーロッパ特許公告第0319312号に
開示されている。その全教示事項は本明細書に援用す
る。活性化プロテインCをコードする遺伝子を含有する
DNA断片は、制限酵素BclIで消化することによっ
て、プラスミドpLAPC−IRSから容易に取出すこ
とができる。エシエリキア・コリK12AG1/pGT
−d細胞は、この細胞が1990年1月18日に寄託さ
れその永久保存培養品になったNRRLから得られる。
イー・コリK12AG1/pGT−d細胞は、NRRL
B−18591の受託番号で入手できる。プラスミドp
GT−dは、マウスdhfr遺伝子とともにこの発明のGB
MT修飾転写単位を含有している。プラスミドpGT−d
はGBMT単位からの発現を行う位置にある遺伝子を含
有していないが、かような遺伝子をプラスミドに容易に
挿入する位置にあるBclI部位を含有している。プラス
ミドpGT−dの制限部位と機能地図を添付図面の図17
に示す。
−h細胞もNRRLから入手できるが、この細胞も19
90年2月18日にNRRLに寄託されそこの永久貯蔵
培養品になった。イー・コリK12AG1/pGT−h細
胞は受託番号NRRL B−18592号で入手でき
る。プラスミドpGT−dは、ハイグロマイシン耐性を供
与する遺伝子とともにこの発明のGBMT単位を含有し
ている。プラスミドpGT−dは、プラスミドpGT−dと
同様に、GBMT単位からの発現を行う位置にある遺伝
子を含有していないが、いずれの遺伝子も挿入する位置
にあるBclI部位をもっている。プラスミドpGT−hの
制限部位と機能地図を添付図面の図18に示す。プラス
ミドpLAPC−IRSを制限酵素BclIで消化し、活
性化プロテインCをコードする遺伝子を含有する制限断
片を精製した。プラスミドDNAのBclIによる消化
は、配列5'−GATC−3'中のアデニンをメチル化す
ると阻害される。それ故、プラスミドpGT−hは、dam
遺伝子(その産物は配列5'−GATC−3'内のアデニ
ン残基をメチル化する)によってコードされるようなア
デニンメチラーゼを欠いたイー・コリ宿主細胞から作製
した。イー・コリK12GM48(NRRL B−15
725)は、機能性damメチラーゼを欠いているので、プ
ラスミドpGTAC−h構築の出発物質として用いるプラ
スミドpGT−hDNAを調製するのに用いる適切な宿主
である。
形質転換されうるようにコンピテント細胞にし、プラス
ミドpGT−hを用い、実施例2の方法に実質的にしたが
ってイー・コリK12GM48細胞を形質転換した。得
られた形質転換細胞をアンピシリンを含有するL寒天上
にプレートし、次いでアンピシリン耐性のイー・コリK
12GM48/pGT−h形質転換細胞がコロニーを生成
したならば、このコロニーの1つを用い、実質的に実施
例2の方法にしたがってプラスミドpGT−hDNAを作
製した。約1mgのプラスミドpGT−hDNAが得られ、
これを約1mlのTE緩衝液に懸濁させた。次にプラスミ
ドpGT−hを制限酵素BclIで消化し、このベクターを
精製し、最初の方の実施例に実質的にしたがって、この
ベクターを活性化プロテインC遺伝子を含有する断片に
連結した。この反応によってプラスミドpGTAC−hが
生成し、このプラスミドは、GBMT修飾転写単位によ
って発現される位置にある、活性化プロテインCをコー
ドする遺伝子を含有している。次に、プラスミドpLA
PC−IRSとpGTAC−hを用い、実質的に実施例1
1の教示事項にしたがって、293細胞を形質転換し
た。個々のクローンを0.9cm2の表面積に全面成長増
殖させた後、細胞の平均発現レベルを、標準プロテイン
CのELISA検定法を用いて比較した。pLAPC−
IRSの培養物は、平均して、約33ng/mlの活性化プ
ロテインCを産生し、一方pGTAC−hの培養物は、平
均して約1460ng/mlの活性化プロテインCを産生し
た。これらの実験の結果を表2に示す。
ことによって測定できる。これらのシステムはクロラム
フエニコールアセチルトランスフエラーゼ(CAT)の発
現に基づいたものが多い。CATを検定するかような方
法の1つは、Grinnelら、Mol.Cell.Biol.、6
巻、3596−3605頁、1986年に開示されてい
る。実施例13の方法に実質的にしたがってGM48内
で増殖させたプラスミドpGTC(1μg/ml)の5μl、
5μlの10×BclI緩衝液(1.5M KCl、100m
Mトリス−HCl、pH7.4および100mM MgCl2)
5μlの制限酵素BclIおよび35μlの水をまず混合す
ることによって、CATを発現する発現ベクターが構築
される。37℃で1時間後に、5303塩基対のベクタ
ー断片を、0.1%アガロースゲル上で単離し、BioR
ad Prep−A−Gene kitを用いて精製される。約4
0μlのTE緩衝液(pH8.0)を、0.05単位の仔ウ
シ腸アルカリホスファターゼ(BMB)とともに、50μ
lのベクターに添加する。反応を37℃で30分間続け
させ、次に温度が65℃に45分間シフトされたときに
10μlの5mM EGTAを添加する。ベクターをフエ
ノール/クロロホルムで抽出し、アルコールで沈澱さ
せ、20μlの水に再懸濁させる。
ock(PL Pharmacia HindIIICATベクター、カ
タログ番号27−4895−01)、各々0.2mMの4
種のdNTPの同体積混合物(500mMトリスpH7.
8、50mM MgCl2、100mM2−メルカプトエタノ
ールおよび100μg/mlのヌクレアーゼなしのBSA
中)の5μl、ならびに1μlのクレノウ(BRL)を混合
し、25℃で30分間放置する。得られた混合物を70
℃で5分間加熱し、エタノールで沈澱させた。得られた
DNAを、10μlの10mlトリス(pH7.6)と2μl
の連結緩衝液(0.5Mトリス、pH7.6、100mM
MgCl2、100mM DTTおよび500μg/ml BS
A)に再懸濁させ、2μl(0.2μg)リン酸化BclIリ
ンカー(NewEngland Biolabs社)、1μlのバクテリ
オファージT4DNAリガーゼおよび2μlの10mM
ATPを添加する。インキュベーションを16℃で12
時間続いて68℃で15分間行った。次に20μlの1
0×BclI緩衝液、150μlの水、および20μlの制
限酵素BclIを添加し、得られた混合物を37℃で2時
間インキュベートした。フエノール/クロロホルムによ
って抽出しエタノールで沈澱させた後、得られたDNA
を50μlの水に再懸濁し、次いでDNAをセファロー
ス(Sepharose)CL48スピンカラム(Spin column)
を通過させることによって過剰のリンカーを除去する。
ーゼ緩衝液、1μlのリガーゼおよび1μgの前記CAT
断片を16℃で12時間混合することによって、CAT
遺伝子をベクターのバックボーンに連結する。生成した
DNAを用い、前記実施例に実質的にしたがって、イー
・コリK12AG1コンピテント細胞(Stratagene)を
形質転換してプラスミドpGT−CATを作製した。次
に、プラスミドpGT−CATを用い、前記実施例の教
示事項に実質的にしたがって293細胞を形質転換す
る。また他のプロモーターおよび転写調節単位を含有す
る他のベクターを用いて、293細胞が形質転換される
が、過渡発現のレベルが測定される。Grinnelら、Bio
technology、5巻、1189−1192頁、1987
年;Grinnellら、Mol.Cell.Biol.、6巻3596
〜3605頁、1986年に開示されているとおりのク
ロラムフエニコールアセチルトランカフエラーゼ検定法
とヒトプロテインCELISA試験法が好ましい。試験
結果を表1に示す。
である。
である。
である。
ある。
ある。
ある。
である。
である。
である。
図である。
図である。
地図である。
図である。
地図である。
である。
である。
である。
Claims (8)
- 【請求項1】 大DNAウイルスの前初期遺伝子産物を
発現する真核宿主細胞内での有用物質の生産方法であっ
て、 (a)(i)(A)アデノウイルスの主要後期プロモーターの上
流調節要素(MLTF)の近くに位置するBKウイルスの
P2エンハンサー、 (B)アデノウイルス2型の主要後期プロモーター、 (C)前記プロモーターを刺激する位置にあるポリ−GT
要素、および (D)アデノウイルスのスプライスされた3分節系リーダ
ー配列を含有するDNA配列、 を含有する修飾転写調節単位、および (ii)有用物質が発現され得る位置にある、該有用物質を
コードしているDNA配列、を含有する組換えDNAベ
クターで該宿主細胞を形質転換し; (b)該有用物質をコードする該DNA配列を発現するの
に適切な条件下で(a)工程の宿主細胞を培養し;次いで (c)該有用物質を細胞培養物から回収する; ことからなる方法。 - 【請求項2】 該有用物質がヒトプロテインCである請
求項1記載の方法。 - 【請求項3】 該真核宿主細胞が293細胞である請求
項2記載の方法。 - 【請求項4】 該修飾転写調節単位が配列: 【化1】 からなる請求項1記載の方法。
- 【請求項5】 宿主細胞内での有用物質の産生レベルを
増大させる方法であって、 (a)該有用物質を発現し分泌するが、 (A)アデノウイルスの主要後期プロモーターの上流調節
要素(MLTF)の近くに位置するBKウイルスのP2エ
ンハンサー、 (B)アデノウイルス2型の主要後期プロモーター、 (C)前記プロモーターを刺激する位置にあるポリ−GT
要素、および (D)アデノウイルスのスプライスされた3分節系リーダ
ー配列を含有するDNA配列、 を含有する修飾転写調節単位を含有するベクターを含有
していない細胞クローンの安定な形質転換細胞を得、 (b)該安定な形質転換細胞を、異なるベクター、すなわ
ち転写が上記修飾転写調節転写単位で駆動されるような
位置にある、該有用物質をコードする遺伝子を含有する
ベクターで形質転換し、 (c)工程(b)で得た細胞を該有用物質をコードする該遺伝
子を発現するのに適切な条件下で培養し、次いで (d)該有用物質を細胞培養物から回収する; 工程からなる方法。 - 【請求項6】 該修飾転写調節単位が配列: 【化12】 からなる請求項5記載の方法。
- 【請求項7】 修飾転写調節単位を含有する組換えDN
Aベクターであって、 (i)(a)アデノウイルスの主要後期プロモーターの上
流調節要素(MLTF)の近くに位置するBKウイルスの
P2エンハンサー、 (b)アデノウイルス2型の主要後期プロモーター、 (c)前記プロモーターを刺激する位置にあるポリ−GT
要素、および (d)アデノウイルスのスプライスされた3分節系リーダ
ー配列を含有するDNA配列、 を含有する修飾転写調節単位、および (ii)有用物質が発現され得る位置にある、該有用物質
をコードするDNA配列、を含有するものである組換え
DNAベクター。 - 【請求項8】 該修飾転写調節単位が配列: 【化13】 からなる請求項7記載のベクター。
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