JP2729159B2 - ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 - Google Patents
ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトグリセンチンに対
するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞、およびヒトグリセンチンに対
する抗体を用いる定量法に関する。
するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞、およびヒトグリセンチンに対
する抗体を用いる定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】動物の膵臓中のランゲルハンス島Ａ細胞
から分泌され、肝臓などの細胞膜のアデニル酸シクラー
ゼ系を活性化することが知られている２９個のアミノ酸
残基から構成されるポリペプチドホルモンであるグルカ
ゴンの研究から、Sundby, F.らはブタ小腸抽出物よりグ
ルカゴン抗体に対する抗原性を有する大分子量のポリペ
プチドを単離し、これをグリセンチンと命名した〔Sund
by, F. et. al., Horm.Metab. Res., Vol. 8，366〜371
（1976)〕。続いて Thim, L. および Moody, A.J. はそ
の構造決定を行なってこのグリセンチンが６９個のアミ
ノ酸残基から構成され、その３３〜６１番のアミノ酸配
列はグルカゴンと同一の配列であることを解明した〔Re
gulatory Peptides, Vol. 2：139（1981)〕。また、グ
リセンチンのアミノ酸配列には種差が存在し、その後ヒ
トグリセンチンのアミノ酸配列はヒトプレプログルカゴ
ンのＤＮＡ配列より推定された。
から分泌され、肝臓などの細胞膜のアデニル酸シクラー
ゼ系を活性化することが知られている２９個のアミノ酸
残基から構成されるポリペプチドホルモンであるグルカ
ゴンの研究から、Sundby, F.らはブタ小腸抽出物よりグ
ルカゴン抗体に対する抗原性を有する大分子量のポリペ
プチドを単離し、これをグリセンチンと命名した〔Sund
by, F. et. al., Horm.Metab. Res., Vol. 8，366〜371
（1976)〕。続いて Thim, L. および Moody, A.J. はそ
の構造決定を行なってこのグリセンチンが６９個のアミ
ノ酸残基から構成され、その３３〜６１番のアミノ酸配
列はグルカゴンと同一の配列であることを解明した〔Re
gulatory Peptides, Vol. 2：139（1981)〕。また、グ
リセンチンのアミノ酸配列には種差が存在し、その後ヒ
トグリセンチンのアミノ酸配列はヒトプレプログルカゴ
ンのＤＮＡ配列より推定された。
【０００３】近年、本発明者らは遺伝子組換え技術を用
いてヒトグリセンチンの生産を行い（特願平５−３３４
１２６号等参照）、それを用いた研究から、インスリン
分泌を促進する作用を見いだした（特開平６−８０５８
４号参照）。また、さらにはヒトグリセンチンは小腸粘
膜の重量と絨毛長を増加させることも見い出している
（特願平５−３２６６９８号参照）。
いてヒトグリセンチンの生産を行い（特願平５−３３４
１２６号等参照）、それを用いた研究から、インスリン
分泌を促進する作用を見いだした（特開平６−８０５８
４号参照）。また、さらにはヒトグリセンチンは小腸粘
膜の重量と絨毛長を増加させることも見い出している
（特願平５−３２６６９８号参照）。
【０００４】そこで、ヒトグリセンチンと糖尿病または
消化器疾患との関連を解明、理解するために、またはそ
れら疾患の診断のためにヒトグリセンチンを良好な感度
で、かつ他のグルカゴン類縁物質と区別して特異的に定
量することは、医学上非常に重要である。そこで、ヒト
グリセンチンに対する抗原認識部位の異なる抗体を組み
合わせることにより、グリセンチンのみを特異的に定量
する事が試みられている。この試みの一つに本出願人の
出願に係る特開平５−２３１９６号に記載の方法が提案
されている。
消化器疾患との関連を解明、理解するために、またはそ
れら疾患の診断のためにヒトグリセンチンを良好な感度
で、かつ他のグルカゴン類縁物質と区別して特異的に定
量することは、医学上非常に重要である。そこで、ヒト
グリセンチンに対する抗原認識部位の異なる抗体を組み
合わせることにより、グリセンチンのみを特異的に定量
する事が試みられている。この試みの一つに本出願人の
出願に係る特開平５−２３１９６号に記載の方法が提案
されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述の特開平５−２３
１９６号に記載の発明においては、遺伝子組換え技術を
用いて得られたヒトグリセンチンをマレイミド法あるい
はグルタルアルデヒド法等の方法でキャリアー例えば K
eyhole Limpet ヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」とい
う）との結合体にし、フロイントアジュバントと混合
し、そしてこのようにして得られた免疫原を用いてヒト
グリセンチンのＣ末端領域を認識する抗体が開示されて
いる。この場合のキャリアーとしてアルブミンのような
タンパク質も用いられる。しかしながら、得られた抗体
はヒトグリセンチンに対する結合反応性が、必ずしも満
足のいくものではなかった。
１９６号に記載の発明においては、遺伝子組換え技術を
用いて得られたヒトグリセンチンをマレイミド法あるい
はグルタルアルデヒド法等の方法でキャリアー例えば K
eyhole Limpet ヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」とい
う）との結合体にし、フロイントアジュバントと混合
し、そしてこのようにして得られた免疫原を用いてヒト
グリセンチンのＣ末端領域を認識する抗体が開示されて
いる。この場合のキャリアーとしてアルブミンのような
タンパク質も用いられる。しかしながら、得られた抗体
はヒトグリセンチンに対する結合反応性が、必ずしも満
足のいくものではなかった。
【０００６】さらには、特開平５−２３１９６号におい
てはペプチド合成機を用いてアミノ酸７残基のヒトグリ
センチンＣ末端断片（６３−６９）を合成し、この合成
断片に、グルタルアルデヒドを用いてキャリアーとして
のＫＬＨを結合させて免疫原に用いている。この断片は
次のアミノ酸配列を有する。
てはペプチド合成機を用いてアミノ酸７残基のヒトグリ
センチンＣ末端断片（６３−６９）を合成し、この合成
断片に、グルタルアルデヒドを用いてキャリアーとして
のＫＬＨを結合させて免疫原に用いている。この断片は
次のアミノ酸配列を有する。
【０００７】Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala
【０００８】しかしながらこの場合、免疫感作に用いた
抗原の構造が天然型のそれとは異なったものとなること
からか、特開平５−２３１９６号に記載のヒトグリセン
チンＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体ＧＣ−１
５は、ヒトグリセンチンを測定し得るものの、さらにヒ
トグリセンチンに対する結合反応性の高いものが求めら
れていたのである。
抗原の構造が天然型のそれとは異なったものとなること
からか、特開平５−２３１９６号に記載のヒトグリセン
チンＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体ＧＣ−１
５は、ヒトグリセンチンを測定し得るものの、さらにヒ
トグリセンチンに対する結合反応性の高いものが求めら
れていたのである。
【０００９】また、同じ特開平５−２３１９６号にはＮ
末端にメチオニンが付加されたヒトグリセンチンを免疫
感作に用いて得られたモノクローナル抗体ＧＷ１７が述
べられているが、このモノクローナル抗体ＧＷ１７は、
その抗体のクラスはＩｇＭであり、サンドイッチ法を用
いた免疫定量法によるヒトグリセンチンの特異的な測定
には不向きであった。
末端にメチオニンが付加されたヒトグリセンチンを免疫
感作に用いて得られたモノクローナル抗体ＧＷ１７が述
べられているが、このモノクローナル抗体ＧＷ１７は、
その抗体のクラスはＩｇＭであり、サンドイッチ法を用
いた免疫定量法によるヒトグリセンチンの特異的な測定
には不向きであった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
課題を解決するために鋭意研究した結果、ヒトグリセン
チンのＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体を作成
し、Ｎ末端領域を認識する抗体と組み合わせることによ
って、より低濃度のヒトグリセンチンを特異的に定量し
うる方法を見出して本発明を完成した。すなわち、本発
明は、ヒトグリセンチンのＣ末端領域、特にＮ末端より
５１番目から６９番目のアミノ酸の全部または一部を認
識部位とするヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識する
モノクローナル抗体に関する。
課題を解決するために鋭意研究した結果、ヒトグリセン
チンのＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体を作成
し、Ｎ末端領域を認識する抗体と組み合わせることによ
って、より低濃度のヒトグリセンチンを特異的に定量し
うる方法を見出して本発明を完成した。すなわち、本発
明は、ヒトグリセンチンのＣ末端領域、特にＮ末端より
５１番目から６９番目のアミノ酸の全部または一部を認
識部位とするヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識する
モノクローナル抗体に関する。
【００１１】さらには、ヒトグリセンチンのＮ末端より
５１番目から６２番目のアミノ酸の全部または一部を認
識部位とするヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識する
モノクローナル抗体に関する。また本発明はヒトグリセ
ンチンのＮ末端より５１番目から６９番目のアミノ酸の
全部または一部を認識部位とするヒトグリセンチンのＣ
末端領域を認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ３Ｄ５Ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７５）にも
関する。
５１番目から６２番目のアミノ酸の全部または一部を認
識部位とするヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識する
モノクローナル抗体に関する。また本発明はヒトグリセ
ンチンのＮ末端より５１番目から６９番目のアミノ酸の
全部または一部を認識部位とするヒトグリセンチンのＣ
末端領域を認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ３Ｄ５Ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７５）にも
関する。
【００１２】さらにまた本発明は抗ヒトグリセンチン抗
体（第１抗体）を固相化し、これにヒトグリセンチン含
有の検体を反応させて第１抗体とヒトグリセンチンとの
複合体（第１複合体）を形成せしめ、次に上記第１抗体
とはヒトグリセンチンアミノ酸配列の認識部位を異にす
る標識化された抗ヒトグリセンチン抗体（第２抗体）を
第１複合体に反応させて第１抗体、ヒトグリセンチンお
よび第２抗体からなる複合体（第２複合体）を形成せし
め、第２複合体中の第２抗体の量を測定することからな
るヒトグリセンチンの定量法において、上記第１抗体と
第２抗体のいずれか一方が請求項２記載のモノクローナ
ル抗体であることを特徴とするヒトグリセンチンの定量
法に関する。上記ヒトグリセンチンの定量法において、
標識化された抗ヒトグリセンチン抗体として、酵素で標
識化された抗ヒトグリセンチン抗体または、放射性同位
元素で標識化された抗体ヒトグリセンチン抗体が用いら
れる。
体（第１抗体）を固相化し、これにヒトグリセンチン含
有の検体を反応させて第１抗体とヒトグリセンチンとの
複合体（第１複合体）を形成せしめ、次に上記第１抗体
とはヒトグリセンチンアミノ酸配列の認識部位を異にす
る標識化された抗ヒトグリセンチン抗体（第２抗体）を
第１複合体に反応させて第１抗体、ヒトグリセンチンお
よび第２抗体からなる複合体（第２複合体）を形成せし
め、第２複合体中の第２抗体の量を測定することからな
るヒトグリセンチンの定量法において、上記第１抗体と
第２抗体のいずれか一方が請求項２記載のモノクローナ
ル抗体であることを特徴とするヒトグリセンチンの定量
法に関する。上記ヒトグリセンチンの定量法において、
標識化された抗ヒトグリセンチン抗体として、酵素で標
識化された抗ヒトグリセンチン抗体または、放射性同位
元素で標識化された抗体ヒトグリセンチン抗体が用いら
れる。
【００１３】すなわち、本発明のヒトグリセンチンの定
量法において、固相化した抗ヒトグリセンチン抗体と標
識化された抗体のいずれか１つがヒトグリセンチンのＮ
末端より５１番目から６９番目、または５１番目から６
２番目のアミノ酸の全部または一部を認識部位とするヒ
トグリセンチンのＣ末端領域を認識するモノクローナル
抗体に由来するものであり、標識化された抗ヒトグリセ
ンチン抗体として、酵素で標識化された抗ヒトグリセン
チン抗体、または、放射性同位元素で標識化された抗ヒ
トグリセンチン抗体を用いるものである。
量法において、固相化した抗ヒトグリセンチン抗体と標
識化された抗体のいずれか１つがヒトグリセンチンのＮ
末端より５１番目から６９番目、または５１番目から６
２番目のアミノ酸の全部または一部を認識部位とするヒ
トグリセンチンのＣ末端領域を認識するモノクローナル
抗体に由来するものであり、標識化された抗ヒトグリセ
ンチン抗体として、酵素で標識化された抗ヒトグリセン
チン抗体、または、放射性同位元素で標識化された抗ヒ
トグリセンチン抗体を用いるものである。
【００１４】本発明のヒトグリセンチンアミノ酸配列の
領域は、ヒトグリセンチンのＮ末端より１番目から３２
番目までのＮ末端領域と３３番目から６９番目のＣ末端
領域に分けられる。
領域は、ヒトグリセンチンのＮ末端より１番目から３２
番目までのＮ末端領域と３３番目から６９番目のＣ末端
領域に分けられる。
【００１５】本発明者らは、ヒトグリセンチンの特異的
な免疫測定法の過程において、ヒトグリセンチンのＣ末
端領域を認識するモノクローナル抗体を得た。これまで
Ｃ末端領域を認識する抗血清は偶然に任せる以外得るこ
とが出来なかった、あるいはその領域を認識するモノク
ローナル抗体の反応性の弱かったものが、その領域に対
するより反応性の強いモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞３Ｄ５Ａを得ることにより、反応性の
強い抗体が安定して得られるようになった。
な免疫測定法の過程において、ヒトグリセンチンのＣ末
端領域を認識するモノクローナル抗体を得た。これまで
Ｃ末端領域を認識する抗血清は偶然に任せる以外得るこ
とが出来なかった、あるいはその領域を認識するモノク
ローナル抗体の反応性の弱かったものが、その領域に対
するより反応性の強いモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞３Ｄ５Ａを得ることにより、反応性の
強い抗体が安定して得られるようになった。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる
細胞融合法によって得られたハイブリドーマを選択する
ことによって得られた細胞を用いて製造される。すなわ
ち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間に融合ハイブリド
ーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒ
トグリセンチンに対し特異性を示す抗体を産生するクロ
ーンを選択することによって製造される。ここで使用さ
れる抗体産生細胞には、例えばヒトグリセンチンによっ
て免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリン
パ球などがある。
細胞融合法によって得られたハイブリドーマを選択する
ことによって得られた細胞を用いて製造される。すなわ
ち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間に融合ハイブリド
ーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒ
トグリセンチンに対し特異性を示す抗体を産生するクロ
ーンを選択することによって製造される。ここで使用さ
れる抗体産生細胞には、例えばヒトグリセンチンによっ
て免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリン
パ球などがある。
【００１７】動物に免疫感作させるために用いる抗原に
は、ヒトの消化管から精製されたヒトグリセンチンを用
いてもよいが、遺伝子操作技術または化学合成により製
造されたヒトグリセンチンを用いることが可能である。
は、ヒトの消化管から精製されたヒトグリセンチンを用
いてもよいが、遺伝子操作技術または化学合成により製
造されたヒトグリセンチンを用いることが可能である。
【００１８】本発明者らは、抗原が天然型ヒトグリセン
チンに近い状態で呈示されるように、ヒトグリセンチン
のアミノ酸配列の全構造を抗原として利用する際にキャ
リアーを使用しないで吸着剤、例えばセルロース、ポリ
フッ化ビニリデン、ビニルポリマー、アガロース、イオ
ン交換樹脂等に吸着させて用いることが出来ることを利
用した。そして、ポリビニルピロリドンに吸着された遺
伝子操作により得られたヒトグリセンチンを免疫原とし
て抗体産生細胞の免疫感作に使用することによりヒトグ
リセンチンに対して強い結合性を持つ抗体を作製するこ
とが出来たのである。
チンに近い状態で呈示されるように、ヒトグリセンチン
のアミノ酸配列の全構造を抗原として利用する際にキャ
リアーを使用しないで吸着剤、例えばセルロース、ポリ
フッ化ビニリデン、ビニルポリマー、アガロース、イオ
ン交換樹脂等に吸着させて用いることが出来ることを利
用した。そして、ポリビニルピロリドンに吸着された遺
伝子操作により得られたヒトグリセンチンを免疫原とし
て抗体産生細胞の免疫感作に使用することによりヒトグ
リセンチンに対して強い結合性を持つ抗体を作製するこ
とが出来たのである。
【００１９】抗体産生細胞すなわち上記の抗原により免
疫感作された動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞は、一般的な
方法、例えばポリエチレングリコール、センダイウイル
ス、電気パルス等によって細胞融合することが出来る
〔Nature, Vol.256, 495〜497(1975）等参照〕。得られ
たハイブリドーマは、酵素抗体法等によってスクリーニ
ングを行い、限界希釈法によってクローン化される。
疫感作された動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞は、一般的な
方法、例えばポリエチレングリコール、センダイウイル
ス、電気パルス等によって細胞融合することが出来る
〔Nature, Vol.256, 495〜497(1975）等参照〕。得られ
たハイブリドーマは、酵素抗体法等によってスクリーニ
ングを行い、限界希釈法によってクローン化される。
【００２０】本発明においては、以上のようにして、ヒ
トグリセンチンに対するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ３Ｄ５Ａを得た。得られたハイブリドー
マ３Ｄ５Ａは工業技術院生命工学研究所に寄託申請し、
平成６年１０月６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７
５号として受託された。
トグリセンチンに対するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ３Ｄ５Ａを得た。得られたハイブリドー
マ３Ｄ５Ａは工業技術院生命工学研究所に寄託申請し、
平成６年１０月６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７
５号として受託された。
【００２１】得られたクローンは、生育に適した培地中
で培養される。あるいは、例えばプリスタンを予め投与
したマウスの腹腔内に移植して、モノクローナル抗体を
高濃度に含む腹水を採取する。このようにして製造され
た培養液またはマウス腹水からのモノクローナル抗体
は、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、プロテインＡを用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー等によって精製される。
で培養される。あるいは、例えばプリスタンを予め投与
したマウスの腹腔内に移植して、モノクローナル抗体を
高濃度に含む腹水を採取する。このようにして製造され
た培養液またはマウス腹水からのモノクローナル抗体
は、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、プロテインＡを用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー等によって精製される。
【００２２】このようにして得られた抗ヒトグリセンチ
ンモノクローナル抗体は、生体中のヒトグリセンチン、
または抗原として認識される領域を含む他のグルカゴン
類縁物質を特異的に測定するために極めて適している。
ンモノクローナル抗体は、生体中のヒトグリセンチン、
または抗原として認識される領域を含む他のグルカゴン
類縁物質を特異的に測定するために極めて適している。
【００２３】この抗ヒトグリセンチンモノクローナル抗
体が得られたことにより、別途作成した、このモノクロ
ーナル抗体とヒトグリセンチンアミノ酸配列の領域認識
部位を異にするポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体とを組み合わせることによって本発明のヒトグリ
センチンの特異的な定量法が完成された。またこの場
合、モノクローナル抗体と抗血清を組み合わせることに
よっても特異的測定が行えるのである。
体が得られたことにより、別途作成した、このモノクロ
ーナル抗体とヒトグリセンチンアミノ酸配列の領域認識
部位を異にするポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体とを組み合わせることによって本発明のヒトグリ
センチンの特異的な定量法が完成された。またこの場
合、モノクローナル抗体と抗血清を組み合わせることに
よっても特異的測定が行えるのである。
【００２４】すなわち、本発明のヒトグリセンチンの定
量では、二種以上の抗体を組み合わせるエライザ法（Ｅ
ＬＩＳＡ法）およびイムノラジオメトリックアッセイ
（ＩＲＭＡ法）などのサンドイッチ法を用いた定量法に
よりヒトグリセンチンを特異的に測定することによって
行うことができる。
量では、二種以上の抗体を組み合わせるエライザ法（Ｅ
ＬＩＳＡ法）およびイムノラジオメトリックアッセイ
（ＩＲＭＡ法）などのサンドイッチ法を用いた定量法に
よりヒトグリセンチンを特異的に測定することによって
行うことができる。
【００２５】この方法において、マイクロプレート、ビ
ーズ等に固相化した抗体に被検液を反応させ、固相に結
合したヒトグリセンチンを、別の抗体を用いた酵素免疫
法で測定する。例えば、本発明の抗ヒトグリセンチンモ
ノクローナル抗体を固相化したマイクロプレートに、一
定の量のヒトグリセンチンまたは未知量の水性試料（例
えば血清、血漿、組織抽出液等）を反応させ、標識した
第２の抗体を用いて発色反応、蛍光反応、生物発光およ
び化学発光等の発光反応または放射活性の測定にて定量
を行う。また、固相化したヒトグリセンチン抗体として
本発明の抗ヒトグリセンチンモノクローナル抗体以外の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体由来のも
のを用い、そして標識した第２の抗体に本発明の抗ヒト
グリセンチンモノクローナル抗体由来のものを用いるこ
ともできる。
ーズ等に固相化した抗体に被検液を反応させ、固相に結
合したヒトグリセンチンを、別の抗体を用いた酵素免疫
法で測定する。例えば、本発明の抗ヒトグリセンチンモ
ノクローナル抗体を固相化したマイクロプレートに、一
定の量のヒトグリセンチンまたは未知量の水性試料（例
えば血清、血漿、組織抽出液等）を反応させ、標識した
第２の抗体を用いて発色反応、蛍光反応、生物発光およ
び化学発光等の発光反応または放射活性の測定にて定量
を行う。また、固相化したヒトグリセンチン抗体として
本発明の抗ヒトグリセンチンモノクローナル抗体以外の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体由来のも
のを用い、そして標識した第２の抗体に本発明の抗ヒト
グリセンチンモノクローナル抗体由来のものを用いるこ
ともできる。
【００２６】抗体の固相化は、公知の化学結合法または
物理的吸着法等を用いて行う。化学的結合法としては例
えばグルタルアルデヒドを用いる方法、またはＮ−スク
シニイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレートやＮ−スクシニイミジル
−２−マレイミドアセテート等を用いるマレイミド法、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩等を用いるカルボジイミド法等の２架
橋試薬を用いる方法等があげられる。あるいは、先に被
検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させ
て形成された複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記
の方法で固相化させておいて捕捉することも可能であ
る。
物理的吸着法等を用いて行う。化学的結合法としては例
えばグルタルアルデヒドを用いる方法、またはＮ−スク
シニイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレートやＮ−スクシニイミジル
−２−マレイミドアセテート等を用いるマレイミド法、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩等を用いるカルボジイミド法等の２架
橋試薬を用いる方法等があげられる。あるいは、先に被
検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させ
て形成された複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記
の方法で固相化させておいて捕捉することも可能であ
る。
【００２７】抗体の標識は、抗体にβガラクトシダー
ゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素を直接結合す
る方法がある。あるいは、抗体をビチオンで標識してお
いて、次にアビジンまたはストレプトアビジンの結合し
た酵素を用いることが可能である。または酵素標識した
抗体、例えばモノクローナル抗体に対して抗マウスＩｇ
Ｇ標識抗体を使用することが可能である。さらに、125
Ｉ、131Ｉまたは3Ｈ等の放射性同位元素で標識した抗体
を使用しうる。
ゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素を直接結合す
る方法がある。あるいは、抗体をビチオンで標識してお
いて、次にアビジンまたはストレプトアビジンの結合し
た酵素を用いることが可能である。または酵素標識した
抗体、例えばモノクローナル抗体に対して抗マウスＩｇ
Ｇ標識抗体を使用することが可能である。さらに、125
Ｉ、131Ｉまたは3Ｈ等の放射性同位元素で標識した抗体
を使用しうる。
【００２８】次に実施例によって本発明を具体的に説明
することにするが、この実施例は単に説明のためのもの
で、これによって本発明が限定されるものと解してはな
らない。
することにするが、この実施例は単に説明のためのもの
で、これによって本発明が限定されるものと解してはな
らない。
【００２９】
〔実施例１〕 モノクローナル抗体の作成と特異性の検討 １) 免疫原の調製 大腸菌を用いて生産した組換えヒトグリセンチンを用い
た。この組換えヒトグリセンチンは次のアミノ酸配列を
有する。 Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn Glu Asp Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala
た。この組換えヒトグリセンチンは次のアミノ酸配列を
有する。 Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn Glu Asp Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala
【００３０】本発明者らは、抗原が天然型ヒトグリセン
チンに近い状態で呈示されるように、ヒトグリセンチン
をポリビニルピロリドンに吸着させて用いた。すなわ
ち、ヒトグリセンチン３.９mgを１００μlの生理食塩水
に溶解した後、５０％ポリビニルピロリドン（Merck
社、Darmstadt，Germany）の生理食塩水溶液３mlを加
え、室温にて２時間撹拌してヒトグリセンチンをポリビ
ニルピロリドンに吸着させた。次にフロイントコンプリ
ートアシュバント（Carbiochem Behring Diagnostics，
La Jolla，CA，U.S.A）３mlを加え、氷浴上で１５分間
オムニミキサー（Sorvall，Du Pont，France）により撹
拌し、マウス４匹に対する免疫用注射液とした。
チンに近い状態で呈示されるように、ヒトグリセンチン
をポリビニルピロリドンに吸着させて用いた。すなわ
ち、ヒトグリセンチン３.９mgを１００μlの生理食塩水
に溶解した後、５０％ポリビニルピロリドン（Merck
社、Darmstadt，Germany）の生理食塩水溶液３mlを加
え、室温にて２時間撹拌してヒトグリセンチンをポリビ
ニルピロリドンに吸着させた。次にフロイントコンプリ
ートアシュバント（Carbiochem Behring Diagnostics，
La Jolla，CA，U.S.A）３mlを加え、氷浴上で１５分間
オムニミキサー（Sorvall，Du Pont，France）により撹
拌し、マウス４匹に対する免疫用注射液とした。
【００３１】２) 免疫方法 ６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス雌をエーテル麻酔後、全身
をアルコール消毒し、免疫用注射液０.５ml（ヒトグリ
センチンとして１２０μｇ）を皮下の十数箇所に注射し
た。
をアルコール消毒し、免疫用注射液０.５ml（ヒトグリ
センチンとして１２０μｇ）を皮下の十数箇所に注射し
た。
【００３２】初回免疫の３週間後に、免疫用注射液０.
２５ml（ヒトグリセンチンとして６０μｇ）を皮下注射
して１回目の追加免疫を行った。さらにその３週間後に
２回目の追加免疫を行った。２回目の追加免疫の１週間
後に、マウスの尾の先端より採血し、血清中の抗体価の
測定をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により行っ
た。以後の免疫スケジュールも同様として、追加免疫を
４回行った。ＲＩＡ法は以下に述べる方法で行った。
０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２５Ｍエチレンジアミ
ン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という）、０.５％ウシ
血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）、０.０２
％アジ化ナトリウムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH
７.４）を標準希釈液として用いた。培養上清５０μlに
標準希釈液０.５mlを加えた後、125Ｉ−ヒトグリセンチ
ン０.１ml（放射活性として５,０００cpm）を加えて混
和し、４℃で１晩反応させた。次に標準希釈液でそれぞ
れ調製した正常マウス血清（２００倍希釈）０.１mlと
ヤギ抗マウスＩｇＧ血清（１０倍希釈）０.１ml、およ
び０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２％アジ化ナトリウ
ムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH７.４）にて溶解し
た５％ ポリエチレングリコール６０００ ０.５mlを順
次加え混和し、４℃で２時間反応させた。遠心分離
（３,０００rpm、３０分間、４℃）を行い上清を吸引除
去後、沈渣の放射活性をγ線カウンター（アロカ社、Ａ
ＲＣ−１０００）にて測定した。最終免疫は、ヒトグリ
センチンを滅菌生理食塩水にて０.２μg／μlの濃度に
調製し、この溶液１００μl（ヒトグリセンチンとして
２０μｇ）を尾静脈より投与した。
２５ml（ヒトグリセンチンとして６０μｇ）を皮下注射
して１回目の追加免疫を行った。さらにその３週間後に
２回目の追加免疫を行った。２回目の追加免疫の１週間
後に、マウスの尾の先端より採血し、血清中の抗体価の
測定をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により行っ
た。以後の免疫スケジュールも同様として、追加免疫を
４回行った。ＲＩＡ法は以下に述べる方法で行った。
０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２５Ｍエチレンジアミ
ン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という）、０.５％ウシ
血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）、０.０２
％アジ化ナトリウムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH
７.４）を標準希釈液として用いた。培養上清５０μlに
標準希釈液０.５mlを加えた後、125Ｉ−ヒトグリセンチ
ン０.１ml（放射活性として５,０００cpm）を加えて混
和し、４℃で１晩反応させた。次に標準希釈液でそれぞ
れ調製した正常マウス血清（２００倍希釈）０.１mlと
ヤギ抗マウスＩｇＧ血清（１０倍希釈）０.１ml、およ
び０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２％アジ化ナトリウ
ムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH７.４）にて溶解し
た５％ ポリエチレングリコール６０００ ０.５mlを順
次加え混和し、４℃で２時間反応させた。遠心分離
（３,０００rpm、３０分間、４℃）を行い上清を吸引除
去後、沈渣の放射活性をγ線カウンター（アロカ社、Ａ
ＲＣ−１０００）にて測定した。最終免疫は、ヒトグリ
センチンを滅菌生理食塩水にて０.２μg／μlの濃度に
調製し、この溶液１００μl（ヒトグリセンチンとして
２０μｇ）を尾静脈より投与した。
【００３３】３) 培地の調製 ＲＰＭＩ１６４０培地４５０mlにピルビン酸ナトリウム
溶液５５mg、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペ
ニシリン10,000単位／ml、ストレプトマイシン10,000μ
g／ml）５ml、０.２Ｍ Ｌ−グルタミン５ml、０.２５Ｍ
２−メルカプトエタノール０.２５ml、および５６℃、
３０分の処理により補体の不活性化を行ったウシ胎児血
清５０mlを加えたものを完全培地として使用した。また
この完全培地９８mlに５０倍濃度のヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（以下、「ＨＡＴ」という）溶
液２mlを加えたものをＨＡＴ培地として使用した。また
完全培地９８mlに５０倍濃度のヒポキサンチン−チミジ
ン（以下、「ＨＴ」という）溶液２mlを加えたものをＨ
Ｔ培地として使用した。
溶液５５mg、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペ
ニシリン10,000単位／ml、ストレプトマイシン10,000μ
g／ml）５ml、０.２Ｍ Ｌ−グルタミン５ml、０.２５Ｍ
２−メルカプトエタノール０.２５ml、および５６℃、
３０分の処理により補体の不活性化を行ったウシ胎児血
清５０mlを加えたものを完全培地として使用した。また
この完全培地９８mlに５０倍濃度のヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（以下、「ＨＡＴ」という）溶
液２mlを加えたものをＨＡＴ培地として使用した。また
完全培地９８mlに５０倍濃度のヒポキサンチン−チミジ
ン（以下、「ＨＴ」という）溶液２mlを加えたものをＨ
Ｔ培地として使用した。
【００３４】ＰＥＧ溶液は、１.５ｇのポリエチレング
リコール４０００に血清無添加のＲＰＭＩ１６４０培地
１.５mlを加え、８０℃の水浴上で溶解し、６０℃の恒
温槽に入れて冷ました後、クリーンベンチ内で０.２２
μｍのフィルターを用いて濾過滅菌したものを用いた。
リコール４０００に血清無添加のＲＰＭＩ１６４０培地
１.５mlを加え、８０℃の水浴上で溶解し、６０℃の恒
温槽に入れて冷ました後、クリーンベンチ内で０.２２
μｍのフィルターを用いて濾過滅菌したものを用いた。
【００３５】４) 脾細胞の調製 最終免疫の３日後に無麻酔下、マウスから無菌的に脾臓
を取り出した。摘出した脾臓を５mlの完全培地に移し、
結合組織を除いた後に新しい培地に移した。ハサミで脾
臓に切れ目を入れた後、６０メッシュのステンレス製ネ
ットを用いて脾細胞を押し出した。この細胞を濾過し、
細胞塊等を除いて細胞浮遊液を得た。これを５０mlのプ
ラスチックチューブに移して遠心分離（１,０００rpm、
３分間）した。遠心分離後、上清を吸引して血清無添加
のＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを加え、遠心分離した後
に細胞数が１×１０8個／mlになるように血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地にて調製した。
を取り出した。摘出した脾臓を５mlの完全培地に移し、
結合組織を除いた後に新しい培地に移した。ハサミで脾
臓に切れ目を入れた後、６０メッシュのステンレス製ネ
ットを用いて脾細胞を押し出した。この細胞を濾過し、
細胞塊等を除いて細胞浮遊液を得た。これを５０mlのプ
ラスチックチューブに移して遠心分離（１,０００rpm、
３分間）した。遠心分離後、上清を吸引して血清無添加
のＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを加え、遠心分離した後
に細胞数が１×１０8個／mlになるように血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地にて調製した。
【００３６】５) ミエローマ細胞の調製 マウス由来のミエローマＰ３Ｕ１細胞は、血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して遠心分離（１,０００r
pm、３分間）で集めた後、細胞数が１×１０7個／mlに
なるように血清無添加のＲＰＭＩ１６４０培地にて調製
した。
ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して遠心分離（１,０００r
pm、３分間）で集めた後、細胞数が１×１０7個／mlに
なるように血清無添加のＲＰＭＩ１６４０培地にて調製
した。
【００３７】６) 細胞融合 ミエローマ細胞および脾細胞を５０mlのプラスチックチ
ューブに細胞数で１：１０になるように１mlずつ取り混
合した後、遠心分離（１,０００rpm、３分間）した。上
清を完全に吸引除去し沈殿を軽く弛めた後、３７℃に加
温したＰＥＧ溶液１mlを約２分間かけてゆっくり加え
た。次に完全培地２mlを約５分かけてゆっくり加えた。
さらにＨＡＴ培地１５mlを加えたのち、遠心分離（１,
０００rpm、５分間）して上清を除き、沈殿をＨＡＴ培
地２０mlで洗った後、脾細胞換算で１×１０6個／mlと
なるように希釈し２４ウェルプレートに１.５ml／ウェ
ルで分注し、５％ＣＯ2、３７℃の炭酸ガス培養器にて
培養した。
ューブに細胞数で１：１０になるように１mlずつ取り混
合した後、遠心分離（１,０００rpm、３分間）した。上
清を完全に吸引除去し沈殿を軽く弛めた後、３７℃に加
温したＰＥＧ溶液１mlを約２分間かけてゆっくり加え
た。次に完全培地２mlを約５分かけてゆっくり加えた。
さらにＨＡＴ培地１５mlを加えたのち、遠心分離（１,
０００rpm、５分間）して上清を除き、沈殿をＨＡＴ培
地２０mlで洗った後、脾細胞換算で１×１０6個／mlと
なるように希釈し２４ウェルプレートに１.５ml／ウェ
ルで分注し、５％ＣＯ2、３７℃の炭酸ガス培養器にて
培養した。
【００３８】７) スクリーニング プレートにまいた細胞は、培養開始後７日目にＨＡＴ培
地を半量交換した。１５日目にＨＴ培地にて半量交換し
た。１７日目にも同様にＨＴ培地にて半量交換した。２
０日目に完全培地にて半量交換を行い、以後完全培地に
て培養した。各ウェルより培養上清を採取し、上記した
ＲＩＡ法により培養上清中の抗体産生の有無を確認し
た。抗体の産生が認められたプレート中の細胞は、以下
に述べる限界希釈法により選別を繰り返した。
地を半量交換した。１５日目にＨＴ培地にて半量交換し
た。１７日目にも同様にＨＴ培地にて半量交換した。２
０日目に完全培地にて半量交換を行い、以後完全培地に
て培養した。各ウェルより培養上清を採取し、上記した
ＲＩＡ法により培養上清中の抗体産生の有無を確認し
た。抗体の産生が認められたプレート中の細胞は、以下
に述べる限界希釈法により選別を繰り返した。
【００３９】細胞をピペッティングにより浮遊させた
後、細胞数が１×１０3個／mlになるように完全培地で
希釈し、さらに１０個／mlおよび５０個／mlになるよう
に完全培地で希釈した。これを予めラット胸腺細胞を加
えた９６ウェルプレートに０.１ml／ウェルずつ加え、
炭酸ガス培養器にて培養した。培養上清中の抗体を上記
したＲＩＡ法にて確認し、各ウェルの培養上清中の抗体
の力価がほとんど均一になるまでクローニングを繰り返
し、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３Ｄ
５Ａを得た。
後、細胞数が１×１０3個／mlになるように完全培地で
希釈し、さらに１０個／mlおよび５０個／mlになるよう
に完全培地で希釈した。これを予めラット胸腺細胞を加
えた９６ウェルプレートに０.１ml／ウェルずつ加え、
炭酸ガス培養器にて培養した。培養上清中の抗体を上記
したＲＩＡ法にて確認し、各ウェルの培養上清中の抗体
の力価がほとんど均一になるまでクローニングを繰り返
し、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３Ｄ
５Ａを得た。
【００４０】８) サブクラスの決定 ハイブリドーマ３Ｄ５Ａにより産生されるモノクローナ
ル抗体のサブイソタイプの決定は、クローニング後のハ
イブリドーマ培養上清より、ザイメット社の抗マウスＩ
ｇＧサブクラスセット（ＭＯＮＯＡｂ−ＩＤTM ＥＩＡ
ＫＩＴ）を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。その結
果は、以下の表１に示す。
ル抗体のサブイソタイプの決定は、クローニング後のハ
イブリドーマ培養上清より、ザイメット社の抗マウスＩ
ｇＧサブクラスセット（ＭＯＮＯＡｂ−ＩＤTM ＥＩＡ
ＫＩＴ）を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。その結
果は、以下の表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】９) 本発明モノクローナル抗体の調製 得られたハイブリドーマ３Ｄ５Ａを培養して、１×１０
7の細胞を１mlの生理食塩水に懸濁し、７〜３０日前に
プリスタン０.５mlを腹腔内に投与した雌性ＢＡＬＢ／
ｃマウスに腹腔内投与した。マウスの腹部が十分に膨ら
み、マウスの活動が低下してきた時点で腹水を採取し
た。採取した腹水は滅菌したプラスチックチューブに移
し、遠心分離（１,０００rpm、３分間）を行い細胞を回
収した。上清を別のチューブに移し遠心分離（３,００
０rpm、１０分間）を行い、上に浮かんだ脂肪成分を取
り除いた。
7の細胞を１mlの生理食塩水に懸濁し、７〜３０日前に
プリスタン０.５mlを腹腔内に投与した雌性ＢＡＬＢ／
ｃマウスに腹腔内投与した。マウスの腹部が十分に膨ら
み、マウスの活動が低下してきた時点で腹水を採取し
た。採取した腹水は滅菌したプラスチックチューブに移
し、遠心分離（１,０００rpm、３分間）を行い細胞を回
収した。上清を別のチューブに移し遠心分離（３,００
０rpm、１０分間）を行い、上に浮かんだ脂肪成分を取
り除いた。
【００４３】抗体を含む腹水に１mlの結合緩衝液（１.
５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、pH８.９）を加
え、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のプロテインＡエコノパックカ
ートリッジに吸着させた。未吸着画分を再度カートリッ
ジに吸着させたのち、結合緩衝液３０mlで洗浄した。次
に溶出緩衝液（０.１Ｍクエン酸、pH６）２０mlで溶出
した。この際溶出液は、１Ｍトリス緩衝液（pH８.０）
１mlにて直ちに中和した。得られた抗ヒトグリセンチン
モノクローナル抗体をモノクローナル抗体３Ｄ５Ａとし
た。
５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、pH８.９）を加
え、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のプロテインＡエコノパックカ
ートリッジに吸着させた。未吸着画分を再度カートリッ
ジに吸着させたのち、結合緩衝液３０mlで洗浄した。次
に溶出緩衝液（０.１Ｍクエン酸、pH６）２０mlで溶出
した。この際溶出液は、１Ｍトリス緩衝液（pH８.０）
１mlにて直ちに中和した。得られた抗ヒトグリセンチン
モノクローナル抗体をモノクローナル抗体３Ｄ５Ａとし
た。
【００４４】１０) 標準曲線の作成 標準曲線の作成は、ＲＩＡ法を用いて測定した。標準抗
原として特願平５−３３４１２６号に記載の遺伝子組換
えヒトグリセンチンを用い、標識抗原として125Ｉ−ヒ
トグリセンチンを、ならびにモノクローン抗体３Ｄ５Ａ
を最終希釈倍率５６,０００倍で使用した。標準希釈液
としては、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、０.５％ＢＳＡ、０.０２％アジ化ナトリウムを
含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH７.４）を用いた。遊離
12 5Ｉ−ヒトグリセンチンの分離（Ｂ／Ｆ分離）はポリ
エチレングリコール存在下の二抗体法により行った。ま
た検体の測定は一点につき２回ずつ行い、平均をとっ
た。
原として特願平５−３３４１２６号に記載の遺伝子組換
えヒトグリセンチンを用い、標識抗原として125Ｉ−ヒ
トグリセンチンを、ならびにモノクローン抗体３Ｄ５Ａ
を最終希釈倍率５６,０００倍で使用した。標準希釈液
としては、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、０.５％ＢＳＡ、０.０２％アジ化ナトリウムを
含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH７.４）を用いた。遊離
12 5Ｉ−ヒトグリセンチンの分離（Ｂ／Ｆ分離）はポリ
エチレングリコール存在下の二抗体法により行った。ま
た検体の測定は一点につき２回ずつ行い、平均をとっ
た。
【００４５】すなわち、ガラス製チューブに標準希釈液
０.４ml、標準希釈液で希釈した標準抗原または試料溶
液０.１ml、希釈抗グリセンチン抗体溶液０.１ml、標識
抗原 125Ｉ−ヒトグリセンチン０.１ml（５,０００cpm）
を加え混和し、４℃で１晩反応させた。ついで標準希釈
液でそれぞれ調製した正常マウス血清（２００倍希釈）
０．１mlとヤギ抗マウスＩｇＧ血清（１０倍希釈）０.
１mlおよび、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２％アジ
化ナトリウムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH７.４）
にて溶解した５％（w／v）ポリエチレングリコール６０
００ ０.５mlを順次加え混和し、４℃、２時間反応さ
せた。遠心分離（３,０００rpm、３０分間、４℃）を行
い上清を吸引除去後、沈渣の放射活性をγ線カウンター
（アロカ社、ＡＲＣ−１０００）にて測定し、結合カウ
ント(Ｂ)とした。別に標準希釈液０.５ml、希釈抗体溶
液０.１ml、希釈標識抗原溶液０.１mlを混和したもの、
および標準希釈液０.６ml、希釈標識抗原０.１ml混和し
たものを用意し、同様の操作にて反応し、Ｂ／Ｆ分離を
おこない、各々の放射活性を最大結合カウント
（Ｂ0）、非特異結合カウント（Ｎ）とした。標準曲線
は、Ｙ軸に（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ0−Ｎ）を、Ｘ軸に標準抗
原濃度をとった。logit−logスケール上に直線回帰した
標準曲線は、良好な直線性を示した。結果は図１に示
す。
０.４ml、標準希釈液で希釈した標準抗原または試料溶
液０.１ml、希釈抗グリセンチン抗体溶液０.１ml、標識
抗原 125Ｉ−ヒトグリセンチン０.１ml（５,０００cpm）
を加え混和し、４℃で１晩反応させた。ついで標準希釈
液でそれぞれ調製した正常マウス血清（２００倍希釈）
０．１mlとヤギ抗マウスＩｇＧ血清（１０倍希釈）０.
１mlおよび、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２％アジ
化ナトリウムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液（pH７.４）
にて溶解した５％（w／v）ポリエチレングリコール６０
００ ０.５mlを順次加え混和し、４℃、２時間反応さ
せた。遠心分離（３,０００rpm、３０分間、４℃）を行
い上清を吸引除去後、沈渣の放射活性をγ線カウンター
（アロカ社、ＡＲＣ−１０００）にて測定し、結合カウ
ント(Ｂ)とした。別に標準希釈液０.５ml、希釈抗体溶
液０.１ml、希釈標識抗原溶液０.１mlを混和したもの、
および標準希釈液０.６ml、希釈標識抗原０.１ml混和し
たものを用意し、同様の操作にて反応し、Ｂ／Ｆ分離を
おこない、各々の放射活性を最大結合カウント
（Ｂ0）、非特異結合カウント（Ｎ）とした。標準曲線
は、Ｙ軸に（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ0−Ｎ）を、Ｘ軸に標準抗
原濃度をとった。logit−logスケール上に直線回帰した
標準曲線は、良好な直線性を示した。結果は図１に示
す。
【００４６】１１) 特異性の検討 本発明により得られたモノクローナル抗体の特異性をグ
リセンチン関連ペプチドを用いて検討した。グリセンチ
ン関連ペプチドは、ヒトグルカゴン、ヒトグルカゴン
（１−１８）、ヒトグルカゴン様ペプタイド〔ＧＬＰ−
１（７−３６）−ＮＨ2〕、ヒトグリセンチン（６３−
６９）を用い、いずれも標準希釈液で適当な濃度に希釈
し、上記のＲＩＡ法にて測定した。これから、用量反応
曲線を作成し、５０％阻害活性を示す標準ペプチド濃度
を５０％阻害活性を示すペプチド濃度で除したものをそ
のペプチドの交差反応性とした。結果は以下の表２に示
す。
リセンチン関連ペプチドを用いて検討した。グリセンチ
ン関連ペプチドは、ヒトグルカゴン、ヒトグルカゴン
（１−１８）、ヒトグルカゴン様ペプタイド〔ＧＬＰ−
１（７−３６）−ＮＨ2〕、ヒトグリセンチン（６３−
６９）を用い、いずれも標準希釈液で適当な濃度に希釈
し、上記のＲＩＡ法にて測定した。これから、用量反応
曲線を作成し、５０％阻害活性を示す標準ペプチド濃度
を５０％阻害活性を示すペプチド濃度で除したものをそ
のペプチドの交差反応性とした。結果は以下の表２に示
す。
【００４７】
【表２】
【００４８】以上の結果よりモノクローナル抗体３Ｄ５
ＡはグリセンチンのＮ末端より５１番目より６２番目の
アミノ酸の一部または全部を認識部位とすること、さら
にはＧＬＰ−１には殆どあるいは全く反応しないことが
分かる。
ＡはグリセンチンのＮ末端より５１番目より６２番目の
アミノ酸の一部または全部を認識部位とすること、さら
にはＧＬＰ−１には殆どあるいは全く反応しないことが
分かる。
【００４９】〔実施例２〕 ＥＬＩＳＡ法による測定 １) モノクローナル抗体固相化プレートの調製 ヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識するモノクローナ
ル抗体ＧＣ−１５または３Ｄ５ＡのＩｇＧ分画を５０mM
リン酸緩衝液（pH７.０）を用いてタンパク質あたり１
０μg／mlの濃度にする。９６穴プレート（ヌンク社
製）の各ウェルあたりこの溶液を５０μlずつ分注し、
４℃に一晩放置して抗体をプレートに固相化した。ＰＢ
Ｓ（０.０１Ｍリン酸緩衝液、pH７.４、０.１５Ｍ塩化
ナトリウム）でウェルを３回洗浄した後、蒸留水で４倍
に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）を各ウェ
ルに３００μl加え、３７℃に２時間放置してブロッキ
ングを行った。
ル抗体ＧＣ−１５または３Ｄ５ＡのＩｇＧ分画を５０mM
リン酸緩衝液（pH７.０）を用いてタンパク質あたり１
０μg／mlの濃度にする。９６穴プレート（ヌンク社
製）の各ウェルあたりこの溶液を５０μlずつ分注し、
４℃に一晩放置して抗体をプレートに固相化した。ＰＢ
Ｓ（０.０１Ｍリン酸緩衝液、pH７.４、０.１５Ｍ塩化
ナトリウム）でウェルを３回洗浄した後、蒸留水で４倍
に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）を各ウェ
ルに３００μl加え、３７℃に２時間放置してブロッキ
ングを行った。
【００５０】２) 抗体のビオチン化 ヒトグリセンチンのＮ末端領域を認識するモノクローナ
ル抗体ＧＮ４−１ＩｇＧ分画を５０mM ホウ酸ナトリウ
ム水溶液ｐＨ８.６に対して平衡化し、タンパク質あた
り１mg／mlの濃度に調製した。この抗体溶液１.５mlを
用いてアマーシャム社製ビオチン化キットにより供給者
の指示にしたがってビオチン化を行った。反応終了後、
反応液を０.１％ＢＳＡを含むＰＢＳで平衡化したナッ
プカラム（ファルマシア社製）に通して、抗体を未反応
のビオチン化試薬と分離した。調製したビオチン化抗体
は、溶液に最終０.０１％となるようにチメロサールを
加え４℃で保存した。
ル抗体ＧＮ４−１ＩｇＧ分画を５０mM ホウ酸ナトリウ
ム水溶液ｐＨ８.６に対して平衡化し、タンパク質あた
り１mg／mlの濃度に調製した。この抗体溶液１.５mlを
用いてアマーシャム社製ビオチン化キットにより供給者
の指示にしたがってビオチン化を行った。反応終了後、
反応液を０.１％ＢＳＡを含むＰＢＳで平衡化したナッ
プカラム（ファルマシア社製）に通して、抗体を未反応
のビオチン化試薬と分離した。調製したビオチン化抗体
は、溶液に最終０.０１％となるようにチメロサールを
加え４℃で保存した。
【００５１】３) 測定 上記の方法にしたがって調製したプレートをＰＢＳ洗浄
を３回繰り返した後、０.１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで精
製ヒトグリセンチン標品を６０ng／mlから０.０２ng／m
lまで段階希釈して各ウェルに５０μlのせて、室温で２
時間反応した。再びＰＢＳでよく洗浄した後、ＢＳＡを
含むＰＢＳで１,２００倍に希釈したビオチン化抗体を
各ウェルに５０μlのせて室温で２時間反応させた。次
に０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでプレートを
よく洗浄した後、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で４,０００倍に希釈したストレプトアビジン・ペルオ
キシダーゼ（ベクター社製）液を５０μl加えて室温に
１時間放置した。次に、オルトフェニレンジアミンを
０.１Ｍクエン酸・水酸化カリウム緩衝液（pH４.５）に
１mg／mlの濃度に溶解し、最終０.０１２％となるよう
に過酸化水素水を加えて発色試薬を調製し、プレートを
０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでよく洗浄した
後に発色試薬を１００μl加え、室温で発色させた。等
量の２規定硫酸を加えて反応を停止させて、波長４９０
nmの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
を３回繰り返した後、０.１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで精
製ヒトグリセンチン標品を６０ng／mlから０.０２ng／m
lまで段階希釈して各ウェルに５０μlのせて、室温で２
時間反応した。再びＰＢＳでよく洗浄した後、ＢＳＡを
含むＰＢＳで１,２００倍に希釈したビオチン化抗体を
各ウェルに５０μlのせて室温で２時間反応させた。次
に０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでプレートを
よく洗浄した後、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で４,０００倍に希釈したストレプトアビジン・ペルオ
キシダーゼ（ベクター社製）液を５０μl加えて室温に
１時間放置した。次に、オルトフェニレンジアミンを
０.１Ｍクエン酸・水酸化カリウム緩衝液（pH４.５）に
１mg／mlの濃度に溶解し、最終０.０１２％となるよう
に過酸化水素水を加えて発色試薬を調製し、プレートを
０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでよく洗浄した
後に発色試薬を１００μl加え、室温で発色させた。等
量の２規定硫酸を加えて反応を停止させて、波長４９０
nmの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００５２】〔実施例３〕 ＩＲＭＡ法による測定 １) モノクローナル抗体固相化プレートの調製 実施例１に記載の操作により得られたヒトグリセンチン
のＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体３Ｄ５Ａの
ＩｇＧ分画を５０mMリン酸緩衝液pH７.０を用いてタン
パク質当たり１０μｇ／mlの濃度にする。９６穴プレー
ト（ヌンク社製）の各ウェル当たりこの溶液を２００μ
lずつ分注し、４℃に一晩放置して抗体をプレートに固
相化した。精製水にてウェルを３回洗浄した後、蒸留水
で４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）を
各ウェルに３００μl加え、３７℃に２時間放置してブ
ロッキングを行った。
のＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体３Ｄ５Ａの
ＩｇＧ分画を５０mMリン酸緩衝液pH７.０を用いてタン
パク質当たり１０μｇ／mlの濃度にする。９６穴プレー
ト（ヌンク社製）の各ウェル当たりこの溶液を２００μ
lずつ分注し、４℃に一晩放置して抗体をプレートに固
相化した。精製水にてウェルを３回洗浄した後、蒸留水
で４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）を
各ウェルに３００μl加え、３７℃に２時間放置してブ
ロッキングを行った。
【００５３】２) 抗体のヨード化 ヒトグリセンチンのＮ末端領域を認識するポリクローナ
ル抗血清ＮＲ２をヒトグリセンチンを結合したセファロ
ース４Ｂカラムを用いて精製し、得られたＩｇＧ分画を
５０mMリン酸ナトリウム水溶液pH７.３に対して平衡化
し、８０μｇ／０.１mlの濃度に調製した。この抗体溶
液にＮａ〔125Ｉ〕４μl（１４.４MBq）、クロラミンＴ
（１mg／ml）５μlを順次加え室温で１０分間反応させ
た。反応終了は、アスコルビン酸（１０mg／ml）５μl
および１０％ヨウ化カリウム５μlを加えることにより
行った。精製は、反応液を０.５％ＢＳＡを含む０.１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（pH８.５）で平衡化したSephadexR G
-25（ファルマシア社製）カラム（０.８×２５cm）に通
して、抗体を未反応のＮａ〔125Ｉ〕と分離した。調製
した標識抗体は、４℃で保存した。
ル抗血清ＮＲ２をヒトグリセンチンを結合したセファロ
ース４Ｂカラムを用いて精製し、得られたＩｇＧ分画を
５０mMリン酸ナトリウム水溶液pH７.３に対して平衡化
し、８０μｇ／０.１mlの濃度に調製した。この抗体溶
液にＮａ〔125Ｉ〕４μl（１４.４MBq）、クロラミンＴ
（１mg／ml）５μlを順次加え室温で１０分間反応させ
た。反応終了は、アスコルビン酸（１０mg／ml）５μl
および１０％ヨウ化カリウム５μlを加えることにより
行った。精製は、反応液を０.５％ＢＳＡを含む０.１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（pH８.５）で平衡化したSephadexR G
-25（ファルマシア社製）カラム（０.８×２５cm）に通
して、抗体を未反応のＮａ〔125Ｉ〕と分離した。調製
した標識抗体は、４℃で保存した。
【００５４】３) 測定 上記の方法にしたがって調製したプレートを精製水にて
洗浄を３回繰り返した後、１０％馬血清、０.１４Ｍ塩
化ナトリウム、０.０２％アジ化ナトリウムを含む５０m
Mクエン酸緩衝液（pH５.０）で精製ヒトグリセンチン標
品を５pMから６４０pMまで段階希釈したものまたは検体
を各ウェルに２００μl入れて４℃で８時間以上反応し
た。再び精製水でよく洗浄した後、１０％馬血清、０.
０２％アジ化ナトリウムを含む５０mMクエン酸緩衝液
（pH５.０）で１００,０００cpm／０.２mlに希釈した標
識抗体を各ウェルに２００μl入れて４℃で１６時間以
上反応させた。次に精製水でプレートをよく洗浄した
後、プレートを乾燥し、固相に結合した放射活性をウェ
ル型γカウンターにて測定した。結果を図３に示す。標
準曲線はｌｏｇ−ｌｏｇスケール上において、５〜６４
０pMの範囲において良好な直線性を示し、最低検出感度
は５pMであった。健常人の血漿中のヒトグリセンチン濃
度は、従来の測定法から推定により求められているが、
３０〜５０pMであると考えられており、本測定系は健常
人の血漿中のヒトグリセンチン濃度を検出できる良好な
感度をもつ系である。
洗浄を３回繰り返した後、１０％馬血清、０.１４Ｍ塩
化ナトリウム、０.０２％アジ化ナトリウムを含む５０m
Mクエン酸緩衝液（pH５.０）で精製ヒトグリセンチン標
品を５pMから６４０pMまで段階希釈したものまたは検体
を各ウェルに２００μl入れて４℃で８時間以上反応し
た。再び精製水でよく洗浄した後、１０％馬血清、０.
０２％アジ化ナトリウムを含む５０mMクエン酸緩衝液
（pH５.０）で１００,０００cpm／０.２mlに希釈した標
識抗体を各ウェルに２００μl入れて４℃で１６時間以
上反応させた。次に精製水でプレートをよく洗浄した
後、プレートを乾燥し、固相に結合した放射活性をウェ
ル型γカウンターにて測定した。結果を図３に示す。標
準曲線はｌｏｇ−ｌｏｇスケール上において、５〜６４
０pMの範囲において良好な直線性を示し、最低検出感度
は５pMであった。健常人の血漿中のヒトグリセンチン濃
度は、従来の測定法から推定により求められているが、
３０〜５０pMであると考えられており、本測定系は健常
人の血漿中のヒトグリセンチン濃度を検出できる良好な
感度をもつ系である。
【００５５】４) 再現性試験 上記測定系の安定性を調べるために、測定内変動係数お
よび測定間変動係数を調べた。結果を以下の表３に示
す。
よび測定間変動係数を調べた。結果を以下の表３に示
す。
【表３】 測定内変動係数および測定間変動係数ともに５％以内で
あり本測定系が安定であることを示した。
あり本測定系が安定であることを示した。
【００５６】５) 特異性の検討 上記測定系において標準品であるヒトグリセンチンの代
わりにヒトオキシントモジュリン、ヒトグルカゴン、ヒ
トＧＬＰ−１(７−３６)−アミドを用いて測定を行っ
た。その結果を以下の表４に示す。
わりにヒトオキシントモジュリン、ヒトグルカゴン、ヒ
トＧＬＰ−１(７−３６)−アミドを用いて測定を行っ
た。その結果を以下の表４に示す。
【表４】 表４から見られるように、グリセンチン関連ペプチドは
全く検出されなかったことより、本測定系がヒトグリセ
ンチンに特異的であることが示された。
全く検出されなかったことより、本測定系がヒトグリセ
ンチンに特異的であることが示された。
【００５７】６) ヒト血漿を用いた添加回収試験 ヒト血漿にヒトグリセンチン５、１０、４０、１６０pM
となるように添加し、上記方法により測定を行った。そ
の結果を表５に示す。
となるように添加し、上記方法により測定を行った。そ
の結果を表５に示す。
【表５】 検討した濃度範囲において添加回収試験の結果が良好で
あることを示した。
あることを示した。
【００５８】７) 希釈試験 ヒト血漿にヒトグリセンチン１６０pMとなるように添加
し、１０％馬血清、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２
％アジ化ナトリウムを含む５０mMクエン酸緩衝液（pH
５.０）で２倍、４倍と段階希釈したものを、上記３）
の測定法により測定を行った。結果を図４に示す。ヒト
グリセンチン添加血漿の希釈曲線は、標準曲線と平行性
を示し、本測定系が血漿中のヒトグリセンチンを測定し
ていることが示された。添加回収、希釈試験の結果より
本発明のヒトグリセンチンの定量法は、ヒト血漿中のヒ
トグリセンチンを特異的に直接測定できることが証明さ
れた。
し、１０％馬血清、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０２
％アジ化ナトリウムを含む５０mMクエン酸緩衝液（pH
５.０）で２倍、４倍と段階希釈したものを、上記３）
の測定法により測定を行った。結果を図４に示す。ヒト
グリセンチン添加血漿の希釈曲線は、標準曲線と平行性
を示し、本測定系が血漿中のヒトグリセンチンを測定し
ていることが示された。添加回収、希釈試験の結果より
本発明のヒトグリセンチンの定量法は、ヒト血漿中のヒ
トグリセンチンを特異的に直接測定できることが証明さ
れた。
【００５９】
【発明の効果】本発明によるハイブリドーマ３Ｄ５Ａを
適当な生産用培地を用いて培養して得られた培養液よ
り、または動物の腹腔内に移植して得られた腹水よりモ
ノクローナル抗体を精製する事によって、ヒトグリセン
チンに対する抗体が安定して得られるようになった。
適当な生産用培地を用いて培養して得られた培養液よ
り、または動物の腹腔内に移植して得られた腹水よりモ
ノクローナル抗体を精製する事によって、ヒトグリセン
チンに対する抗体が安定して得られるようになった。
【００６０】さらに本発明によるモノクローナル抗体を
組み合わせ、あるいは抗血清と組み合わせることによ
り、ヒトグリセンチンを特異的に、より感度良く検出、
定量する事が可能になった。
組み合わせ、あるいは抗血清と組み合わせることによ
り、ヒトグリセンチンを特異的に、より感度良く検出、
定量する事が可能になった。
【図１】Ｘ軸に標準抗原濃度をとり、 Ｙ軸に（Ｂ−Ｎ）
／（Ｂ0-Ｎ）をとって得られた、本発明の抗ヒトグリセ
ンチン抗体を用いる標準抗原としての遺伝子組換えヒト
グリセンチンについての標準曲線を示す図である。
／（Ｂ0-Ｎ）をとって得られた、本発明の抗ヒトグリセ
ンチン抗体を用いる標準抗原としての遺伝子組換えヒト
グリセンチンについての標準曲線を示す図である。
【図２】ヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識するモノ
クローナル抗体を固相化し、これにヒトグリセンチン標
本を反応させ、更にヒトグリセンチンのＮ末端領域を認
識する標識化されたモノクローナル抗体（ビオチン化抗
体）を反応させ、反応物を発色させた場合のヒトグリセ
ンチン量と吸光度の関係を示す図である。
クローナル抗体を固相化し、これにヒトグリセンチン標
本を反応させ、更にヒトグリセンチンのＮ末端領域を認
識する標識化されたモノクローナル抗体（ビオチン化抗
体）を反応させ、反応物を発色させた場合のヒトグリセ
ンチン量と吸光度の関係を示す図である。
【図３】ヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識するモノ
クローナル抗体を固相化し、これにヒトグリセンチン標
本を反応させ、さらにヒトグリセンチンのＮ末端領域を
認識する放射性ヨードで標識化されたポリクローナル抗
体を反応させ、固相に結合した放射活性を測定した結果
を示す。
クローナル抗体を固相化し、これにヒトグリセンチン標
本を反応させ、さらにヒトグリセンチンのＮ末端領域を
認識する放射性ヨードで標識化されたポリクローナル抗
体を反応させ、固相に結合した放射活性を測定した結果
を示す。
【図４】ヒトグリセンチンのＣ末端領域を認識するモノ
クローナル抗体を固相化し、これにヒト血漿にヒトグリ
センチンを加えたものを段階希釈して反応させ、さらに
ヒトグリセンチンのＮ末端領域を認識する放射性ヨード
で標識化されたポリクローナル抗体を反応させ、固相に
結合した放射活性を測定した結果を示す。
クローナル抗体を固相化し、これにヒト血漿にヒトグリ
センチンを加えたものを段階希釈して反応させ、さらに
ヒトグリセンチンのＮ末端領域を認識する放射性ヨード
で標識化されたポリクローナル抗体を反応させ、固相に
結合した放射活性を測定した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７５号を
有するハイブリドーマ３Ｄ５Ａ。 - 【請求項２】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７５号を
有するハイブリドーマ３Ｄ５Ａにより産生されるヒトグ
リセンチンに対するモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 抗ヒトグリセンチン抗体（第１抗体）を
固相化し、これにヒトグリセンチン含有の検体を反応さ
せて第１抗体とヒトグリセンチンとの複合体（第１複合
体）を形成せしめ、次に上記第１抗体とはヒトグリセン
チンアミノ酸配列の認識部位を異にする標識化された抗
ヒトグリセンチン抗体（第２抗体）を第１複合体に反応
させて第１抗体、ヒトグリセンチンおよび第２抗体から
なる複合体（第２複合体）を形成せしめ、第２複合体中
の第２抗体の量を測定することからなるヒトグリセンチ
ンの定量法において、上記第１抗体と第２抗体のいずれ
か一方が請求項２記載のモノクローナル抗体であること
を特徴とするヒトグリセンチンの定量法。 - 【請求項４】 第２抗体として、酵素で標識化された抗
ヒトグリセンチン抗体を用いる請求項３に記載されたヒ
トグリセンチンの定量法。 - 【請求項５】 第２抗体として、ビオチン標識化抗ヒト
グリセンチン抗体を使用し、第１抗体、ヒトグリセンチ
ンおよびビオチン標識化抗ヒトグリセンチン抗体からな
る第２複合体にアビジンまたはストレプトアビジンを反
応させることを特徴とする請求項４に記載されたヒトグ
リセンチンの定量法。 - 【請求項６】 標識化された抗ヒトグリセンチン抗体と
して、放射性同位元素で標識化された抗ヒトグリセンチ
ン抗体を用いる請求項３に記載されたヒトグリセンチン
の定量法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7185272A JP2729159B2 (ja) | 1994-10-31 | 1995-07-21 | ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 |
| US08/548,152 US5712105A (en) | 1994-10-31 | 1995-10-25 | Monoclonal antibody to human glicentin, hybridoma for producing said antibody and assay method for human glicentin using said antibody |
| CA002161480A CA2161480A1 (en) | 1994-10-31 | 1995-10-26 | Monoclonal antibody to human glicentin, hybridoma for producing said antibody and assay method for human glicentin using said antibody |
| DE69504620T DE69504620T2 (de) | 1994-10-31 | 1995-10-31 | Monoklonaler Antikörper gegen menschliches Glicentin, Hybridoma zur Herstellung dieses Antikörpers und Testverfahren für menschliches Glicentin unter Verwendung dieses Antikörpers |
| EP95307748A EP0709455B1 (en) | 1994-10-31 | 1995-10-31 | Monoclonal antibody to human glicentin, hybridoma for producing said antibody and assay method for human glicentin using said antibody |
| KR1019950038363A KR960014336A (ko) | 1994-10-31 | 1995-10-31 | 사람 글리센틴에 대한 모노클로날 항체, 이러한 항체를 생성하기 위한 하이브리도마 및 상기 항체를 사용한 사람 글리센틴의 검정방법 |
| DK95307748T DK0709455T3 (da) | 1994-10-31 | 1995-10-31 | Monoklonalt antistof med humanglicentin, hybridoma til fremstilling af antistoffet og assaymetode for humanglicentin ved an |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-266567 | 1994-10-31 | ||
| JP26656794 | 1994-10-31 | ||
| JP7185272A JP2729159B2 (ja) | 1994-10-31 | 1995-07-21 | ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08183799A JPH08183799A (ja) | 1996-07-16 |
| JP2729159B2 true JP2729159B2 (ja) | 1998-03-18 |
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ID=26503007
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7185272A Expired - Fee Related JP2729159B2 (ja) | 1994-10-31 | 1995-07-21 | ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5712105A (ja) |
| EP (1) | EP0709455B1 (ja) |
| JP (1) | JP2729159B2 (ja) |
| KR (1) | KR960014336A (ja) |
| CA (1) | CA2161480A1 (ja) |
| DE (1) | DE69504620T2 (ja) |
| DK (1) | DK0709455T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030082179A1 (en) * | 2001-07-03 | 2003-05-01 | Hutchison James Scott | Parathyroid hormone antibodies and related methods |
| US20050191665A1 (en) * | 2003-12-29 | 2005-09-01 | Xing Su | Composite organic-inorganic nanoclusters |
| US20080076119A9 (en) * | 2003-12-29 | 2008-03-27 | Lei Sun | Composite organic inorganic nanoclusters |
| US20050147963A1 (en) * | 2003-12-29 | 2005-07-07 | Intel Corporation | Composite organic-inorganic nanoparticles and methods for use thereof |
| US7361410B2 (en) * | 2003-12-29 | 2008-04-22 | Intel Corporation | External modification of composite organic inorganic nanoclusters comprising raman active organic compound |
| US20070048797A1 (en) * | 2004-08-11 | 2007-03-01 | Xing Su | Composite organic inorganic nanoclusters as carriers and identifiers of tester molecules |
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