JP2913026B1 - Clam floating larva specific monoclonal antibody - Google Patents

Abstract

【要約】 【解決手段】 アサリのベリジャー期幼生で免疫化した
マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞から、アサリ浮遊幼
生特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を得、更に該ハイブリドーマによる該モノクローナル抗
体の製造方法、および該モノクローナル抗体を用いる幼
生の同定方法。 【効果】 アサリ浮遊幼生特異的モノクローナル抗体を
用いることで、従来熟練を要した浮遊幼生の同定を誰で
も簡単に行うことができる。また、発育段階により反応
特異性が異なる複数のモノクローナル抗体を組合わせる
ことで、アサリの発育段階を推定することができる。Kind Code: A1 Abstract: A hybridoma producing a clam floating larva-specific monoclonal antibody is obtained from a mouse spleen cell and a mouse myeloma cell immunized with a larval stage larva of a clam, and a method for producing the monoclonal antibody by the hybridoma And a method for identifying larvae using the monoclonal antibody. [Effect] Anyone can easily identify a floating larva that has conventionally required skill by using a clam floating larva specific monoclonal antibody. Also, by combining a plurality of monoclonal antibodies having different reaction specificities depending on the development stage, the development stage of the clam can be estimated.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、アサリ浮遊幼生の
同定に有効なアサリ浮遊幼生特異的モノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
該モノクローナル抗体の製造方法、ならびに該モノクロ
ーナル抗体を用いるアサリ浮遊幼生の同定方法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a clam floating larva-specific monoclonal antibody effective for identifying clam floating larvae, a hybridoma producing the monoclonal antibody,
The present invention relates to a method for producing the monoclonal antibody, and a method for identifying a clam floating larva using the monoclonal antibody.

【０００２】[0002]

【従来の技術】現在、アサリの浮遊幼生の同定は殻の交
装等の形態学的特徴を観察することによって行われてい
る。しかし、二枚貝の浮遊幼生は形態学的な特徴の差が
小さいので、その違いを識別するには熟練が必要とな
る。したがって、アサリの浮遊幼生の同定は一部の研究
者によってのみ可能であり、誰もができるものではな
い。さらに、野外試料では、多種のプランクトンの中か
らごくわずかな形態の差異を見極めて、アサリであるこ
とを同定しなくてはならないので多大な時間を要し、多
数の試料を調べることが困難である。そこで、誰もが短
時間で判定できる新たな方法の開発が望まれている。2. Description of the Related Art At present, floating larvae of clams are identified by observing morphological characteristics such as shell crossing. However, the differences in morphological characteristics of bivalve larvae are small, so skill is required to identify the differences. Therefore, the identification of suspended larvae of clams is only possible by some researchers, not everyone. Furthermore, in the case of field samples, it is necessary to identify very small morphological differences among various types of plankton and identify them as clams, so it takes a lot of time, and it is difficult to examine many samples. is there. Therefore, development of a new method that allows anyone to make a determination in a short time is desired.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アサリ浮遊
幼生特異的モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイ
ブリドーマ、該モノクローナル抗体の製造方法、該モノ
クローナル抗体を用いるアサリ浮遊幼生の同定方法を提
供することを目的とする。The object of the present invention is to provide a clam floating larva-specific monoclonal antibody, a hybridoma producing the antibody, a method for producing the monoclonal antibody, and a method for identifying a clam floating larva using the monoclonal antibody. With the goal.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、アサリのベリジャー期
幼生で免疫化したマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを
融合し、得られたハイブリドーマからアサリ浮遊幼生と
特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることに成功
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
アサリのベリジャー期幼生で免疫化したマウス脾細胞と
マウス骨髄腫細胞とを融合させて得られたハイブリドー
マが生産するアサリ浮遊幼生特異的モノクローナル抗体
である。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies based on the above-mentioned problems, and as a result, obtained by fusing mouse spleen cells and mouse myeloma cells immunized with the larval stage larvae of clams. The present inventors succeeded in obtaining a monoclonal antibody that specifically reacts with the clam floating larvae from the hybridoma, and completed the present invention. That is, the present invention
It is a clam suspension larva-specific monoclonal antibody produced by a hybridoma obtained by fusing mouse spleen cells and mouse myeloma cells immunized with clam verger stage larvae.

【０００５】本発明のモノクローナル抗体は、下記の性
質を有する。 アサリ浮遊幼生のベラム（浮遊幼生が有する遊泳お
よび摂餌のための器官）にのみ反応する。 ムラサキイガイ、ホトトギスガイ、マガキ、ハマグ
リ、バカガイのベリジャー期幼生または着底期幼生には
反応しない。 浮遊幼生採取時に出現する浮遊性植物や動物に対し
て交差反応性がない。 本発明はまた、アサリのベリジャー期幼生で免疫化した
マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて得ら
れ、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
である。[0005] The monoclonal antibody of the present invention has the following properties. It reacts only to the clam floating larva velum (the swimming and feeding organ of the floating larva). It does not respond to the larval or settle larvae of mussels, scallops, oysters, clams, and mussels. No cross-reactivity to planktonic plants and animals that appear when collecting planktonic larvae. The present invention is also a hybridoma that is obtained by fusing mouse spleen cells and mouse myeloma cells immunized with the larval stage larvae of clams and produces the above monoclonal antibody.

【０００６】さらに、本発明は、上記ハイブリドーマを
培地に培養し、培養物よりアサリ浮遊幼生特異的モノク
ローナルを採取することを特徴とする、アサリ浮遊幼生
特異的モノクローナル抗体の製造方法である。さらにま
た、本発明は、上記モノクローナル抗体を用いるアサリ
浮遊幼生の同定方法である。以下、本発明を詳細に説明
する。Further, the present invention is a method for producing a clam floating larva-specific monoclonal antibody, which comprises culturing the above hybridoma in a medium and collecting a clam floating larva specific monoclonal from the culture. Furthermore, the present invention is a method for identifying clam floating larvae using the above monoclonal antibody. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】１．モノクローナル抗体の製造 本発明のアサリ浮遊幼生特異的モノクローナル抗体は、
次の各工程を経て製造される。 (1) 抗原の調製 アサリのベリジャー期浮遊幼生を氷冷下で超音波処理し
た後、遠心分離によって採取した上清をフィルターでろ
過したものを抗原とする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Manufacture of monoclonal antibody Clam floating larva specific monoclonal antibody of the present invention,
It is manufactured through the following steps. (1) Preparation of Antigen After the larvae of the clams in the verger stage are sonicated under ice-cooling, the supernatant collected by centrifugation is filtered with a filter to obtain the antigen.

【０００８】(2) 動物の免疫および抗体産生細胞の採取 上記のようにして得られた抗原を、３〜10週齢、好まし
くは４週齢のマウスに投与する。免疫は、既存の方法で
あれば何れの方法をも用いることができるが、主として
静脈内、皮下、腹腔内に適当なアジュバンド、例えば市
販のフロイント完全アジュバンド、フロイントの不完全
アジュバンド、ＢＣＧ、水酸化アルミニウムゲル、百日
咳菌ワクチン等とともに注入するのが好ましい。免疫の
間隔は特に限定されないが、例えば１〜２週間おきに、
２〜５回免疫すればよい。抗原の免疫量は例えば１回に
マウス１匹当たり、10〜500μg 用いればよい。最終の
免疫日から３〜10日後に、抗体産生細胞を採集する。抗
体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細
胞、末梢血細胞が挙げられるが、脾臓細胞を用いるのが
一般的である。かかる抗体産生細胞は、マウスから脾
臓、リンパ節、胸腺、末梢血等を摘出または採取し、こ
れら組織を破砕する。得られる破砕物をPBS 、DMEM、RP
MI1640、E-RDF 等の培地または緩衝液に懸濁し、 200〜
250μm のステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を
行うこと等により目的とする抗体産生細胞を調製する。(2) Immunization of animals and collection of antibody-producing cells The antigens obtained as described above are administered to mice 3 to 10 weeks old, preferably 4 weeks old. Immunization can be performed by any of the existing methods, and an appropriate adjuvant is mainly used intravenously, subcutaneously, or intraperitoneally, such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, or BCG. , Aluminum hydroxide gel, pertussis vaccine and the like. The interval between immunizations is not particularly limited. For example, every 1 to 2 weeks,
What is necessary is just to immunize 2 to 5 times. The amount of antigen immunization may be, for example, 10 to 500 μg per mouse at a time. Three to ten days after the last immunization, the antibody-producing cells are harvested. Examples of the antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells, and spleen cells are generally used. Such antibody-producing cells are obtained by extracting or collecting spleen, lymph node, thymus, peripheral blood and the like from a mouse, and crushing these tissues. The obtained crushed material is PBS, DMEM, RP
Suspend in medium or buffer such as MI1640, E-RDF, etc.
After filtration through a 250 μm stainless mesh or the like, the target antibody-producing cells are prepared by centrifugation or the like.

【０００９】(3) 細胞融合 上記の抗体産生細胞と融合させる骨髄腫（ミエローマ）
細胞としては、マウスから得られた当業者が一般に入手
可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、
薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば
ＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞として融合し
た状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞
株は、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトラ
ンスフェラーゼを欠損し（HGPRT-) 、ヒポキサンチン・
アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できな
い。骨髄腫細胞の具体例としては、Sp2/0-Ag14 [ATCC C
RL-1581 ; Nature, 276, 271 (1978)]、P3X63Ag8［ATCC
TIB-9; Nature, 256, 495-497(1978)］、P3 X63 Ag8U.
1(P3U1) ［ATCC CRL-1580; Current Topics in Microbi
ology and Immunology, 81, 1-7(1978) ］、P3X63Ag8.6
53［ATCC TIB-18; Europian J. Immunology,6, 511-519
(1976) ］、P2/NSI/1-Ag4-1［ATCC CRL-1581; Nature,
276, 269-270(1978) ］等のマウス骨髄腫細胞株等が挙
げられる。(3) Cell fusion Myeloma (myeloma) fused with the above antibody-producing cells
As cells, cell lines obtained from mice and generally available to those skilled in the art are used. Cell lines used include:
Those that have drug resistance and cannot survive in a selection medium (for example, HAT medium) in an unfused state, but can survive only in a fused state as antibody-producing cells are preferable.
Generally, an 8-azaguanine-resistant strain is used, which is deficient in hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT-),
Unable to grow on aminopterin thymidine (HAT) medium. Specific examples of myeloma cells include Sp2 / 0-Ag14 [ATCC C
RL-1581; Nature, 276, 271 (1978)], P3X63Ag8 [ATCC
TIB-9; Nature, 256, 495-497 (1978)], P3 X63 Ag8U.
1 (P3U1) [ATCC CRL-1580; Current Topics in Microbi
ology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3X63Ag8.6
53 [ATCC TIB-18; Europian J. Immunology, 6, 511-519
(1976)], P2 / NSI / 1-Ag4-1 [ATCC CRL-1581; Nature,
276, 269-270 (1978)] and the like.

【００１０】(2) で免疫した抗体産生細胞と上記で得ら
れた骨髄腫細胞とを細胞融合させる。細胞融合はMEM 、
DMEM、RPMI-1640 、E-RDF 等の動物細胞培養用培地中で
10⁷〜10⁸ 細胞／mlの骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを、
混合比１：１〜１：10で、例えば約１：５の割合で、融
合促進剤存在下、30〜37℃で１〜３分間細胞同士を接触
させることによって効率的に融合反応を進めることがで
きる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量 1,0
00〜6,000 のポリエチレングリコール、ポリビニールア
ルコール、またはセンダイウイルス等の融合促進剤や融
合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激
（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細
胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合
させてもよい。[0010] The antibody-producing cells immunized in (2) are fused with the myeloma cells obtained above. Cell fusion is MEM,
In animal cell culture media such as DMEM, RPMI-1640 and E-RDF
10 ⁷ to 10 ⁸ cells / ml myeloma cells and antibody-producing cells
Advancing the fusion reaction efficiently by contacting the cells with each other at a mixing ratio of 1: 1 to 1:10, for example, at a ratio of about 1: 5 at 30 to 37 ° C. for 1 to 3 minutes in the presence of a fusion promoter. Can be. To promote cell fusion, an average molecular weight of 1,0
A fusion promoter or fusion virus such as polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, or Sendai virus of 00 to 6,000 can be used. Alternatively, the antibody-producing cells and the myeloma cells may be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (eg, electroporation).

【００１１】(4) ハイブリドーマの選択およびクローニ
ング 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、選択培地における細胞の選
択的増殖を利用する方法を用いることができる。細胞懸
濁液を例えばＨＡＴサプリメント（Gibco BRL)およびイ
ンターロイキン−６（1unit/ml) を添加したイスコフ培
地(IMDM)に10³ 〜10⁷ 細胞/ml となるよう希釈後、96ウ
ェルの細胞培養用マイクロプレートに10² 〜10⁶ 細胞/
ウェルまき、各ウェルに選択培地、例えば HAT培地等を
加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。(4) Selection and Cloning of Hybridomas A desired hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment. As the method, a method utilizing selective growth of cells in a selective medium can be used. After diluting the cell suspension to, for example, Iscove's medium (IMDM) supplemented with HAT supplement (Gibco BRL) and interleukin-6 (1 unit / ml) so that the cell suspension becomes 10 ³ to 10 ⁷ cells / ml, cell culture in 96 wells 10 ² to 10 ⁶ cells /
The wells are seeded, and a selective medium, for example, a HAT medium, is added to each well, and then the selective medium is replaced as appropriate for culturing.

【００１２】骨髄腫細胞として８−アザグアニン耐性
株、選択培地として HAT培地を用いた場合は、未融合の
骨髄腫細胞は培養約７〜10日目には死滅し、正常細胞で
ある抗体産生細胞もインビトロでは長く生存できず、培
養約７〜10日目には死滅する。その結果、培養６〜10日
前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得る
ことができる。When an 8-azaguanine-resistant strain is used as myeloma cells and a HAT medium is used as a selection medium, unfused myeloma cells die on about 7 to 10 days of culture, and antibody-producing cells which are normal cells Cannot survive long in vitro and die on about 7-10 days of culture. As a result, cells growing from around 6 to 10 days of culture can be obtained as hybridomas.

【００１３】増殖してきた細胞の培養上清につき、目的
とするアサリ浮遊幼生抗体の産生があるか否かをスクリ
ーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは通常
の方法によれば良く、特に限定はされない。例えば、ハ
イブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清
の一部を採集し、固相化したアサリ浮遊幼生可溶性抗原
に該上清を添加した後、標識した第二抗体を加えてイン
キュベートし、その結合能を酵素免疫測定法（EIA, ELI
SA) 、放射線免疫測定法（RIA)によって測定することが
できる。The culture supernatant of the grown cells is screened for the production of the desired clam floating larval antibody. Hybridoma screening may be performed by a conventional method, and is not particularly limited. For example, after collecting a part of the culture supernatant contained in the wells grown as hybridomas, adding the supernatant to the immobilized clam floating larva soluble antigen, adding a labeled second antibody and incubating, Enzyme immunoassay (EIA, ELI
SA) can be measured by radioimmunoassay (RIA).

【００１４】具体的には、まず、免疫源として使用した
アサリベリジャー期浮遊幼生可溶性抗原を吸着させた96
ウェルマイクロプレートにモノクローナル抗体を含む培
養上清を添加して抗原と反応させる。次いで、結合した
特異的抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させ
るか、または結合した特異的抗体にビオチン標識抗免疫
グロブリン抗体を反応させた後にさらにアビジン−酵素
標識体を反応させる。最後に、各ウェルに酵素基質を加
えて発色させる。免疫源として使用したアサリベリジャ
ー期浮遊幼生可溶性抗原を固相化したウェルでのみ発色
する培養上清を選別することにより、アセリ浮遊幼生に
対して結合性を有する抗体を産生するハイブリドーマを
検索することができる。ハイブリドーマのクローニング
は、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励
起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマを取得できる。Specifically, first, the soluble larval soluble antigen of the Asariberger stage used as an immunogen was adsorbed.
The culture supernatant containing the monoclonal antibody is added to the well microplate and reacted with the antigen. Next, the bound specific antibody is reacted with an enzyme-labeled anti-immunoglobulin antibody, or the bound specific antibody is reacted with a biotin-labeled anti-immunoglobulin antibody, and then further reacted with an avidin-enzyme label. Finally, an enzyme substrate is added to each well to develop color. To search for hybridomas that produce an antibody that binds to Asari floating larvae by selecting a culture supernatant that develops color only in the wells on which the soluble antigen of Asariberger stage floating larvae used as the immunogen is immobilized. Can be. Cloning of the hybridoma is performed by a limiting dilution method, a soft agar method, a fibrin gel method, a fluorescence excitation cell sorter method or the like, and finally a monoclonal antibody-producing hybridoma can be obtained.

【００１５】(5) モノクローナル抗体の採取 取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取
する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等を
用いる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10〜
20％仔ウシ血清含有IMDM、RPMI-1640 、MEM 、E-RDF ま
たは無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養
条件（例えば37℃，５％CO₂ 濃度）で２〜14日間培養
し、その培養上清から抗体を取得することができる。(5) Collection of Monoclonal Antibody As a method for collecting a monoclonal antibody from the obtained hybridoma, a usual cell culture method, ascites formation method, or the like is used. In cell culture methods, hybridomas
In animal cell culture medium such as IMDM, RPMI-1640, MEM, E-RDF or serum-free medium containing 20% calf serum, under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO ₂ concentration) for 2 to 14 days After culturing, an antibody can be obtained from the culture supernatant.

【００１６】腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の
哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン（2,6,10,1
4-テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を投与し、そ
の後ハイブリドーマ１×10⁷ 〜１×10⁹ 個、好ましくは
５×10⁷ 〜１×10⁸ 個を腹腔内に投与し、ハイブリドー
マを大量に増殖させる。そして、１〜４週間、好適には
２〜３週間後に腹水または血清を採集する。In the ascites formation method, pristane (2,6,10,1) is intraperitoneally injected into a mammal of the same species as a mammal derived from myeloma cells.
4-tetramethylpentadecane), and then 1 × 10 ⁷ to 1 × 10 ⁹ hybridomas, preferably 5 × 10 ⁷ to 1 × 10 ⁸ hybridomas, are administered intraperitoneally. Proliferate. Then, ascites or serum is collected after 1-4 weeks, preferably 2-3 weeks.

【００１７】上記抗体の採取方法において、抗体の精製
が必要とされる場合は、硫安塩析法、DEAEセルロース等
の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフ
ィー、プロテインＡセファロース等を用いるアフィニテ
ィークロマトグラフィー、分子量や構造によってふるい
分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の公知の方法を
適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることによ
り精製することが可能である。In the above-mentioned method for collecting antibodies, when purification of the antibodies is required, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography using an anion exchanger such as DEAE cellulose, affinity chromatography using protein A sepharose, etc. It is possible to purify by appropriately selecting a known method such as chromatography, molecular sieving chromatography for sieving according to molecular weight or structure, or combining these methods.

【００１８】かくして、本発明のアサリ浮遊幼生特異的
モノクローナル抗体を得ることができる。本発明におい
て、アサリ浮遊幼生とは、トコロフォア期から、ベリジ
ャー期、アンボ期、フルグロウン期、着底期に至るまで
の全発育段階、またはそのいずれかの段階の幼生を言
う。[0018] Thus, the clam floating larva-specific monoclonal antibody of the present invention can be obtained. In the present invention, the clam floating larva refers to a larva in all stages of development from the tocophore stage to the verger stage, the ambo stage, the full-grown stage, and the settlement stage, or any stage thereof.

【００１９】２．本発明のモノクローナル抗体の精度検
定 本発明のモノクローナル抗体が雑多な生物が混入する野
外試料を用いてアサリ浮遊幼生の同定に実際に使用でき
るかどうかを調べるには、次のようにして行うことがで
きる。野外試料、例えばプランクトンネットで海水を濾
過して採集したプランクトン試料にフルオレッセントイ
ソチアネート(FITC)等の蛍光色素で標識した該モノクロ
ーナル抗体を反応させ、標識した蛍光色素の励起光に設
定した蛍光顕微鏡下で該モノクローナル抗体と反応した
個体を取り出す。取り出した個体からフェノールクロロ
ホルム等で抽出したＤＮＡまたは浮遊幼生をそのままテ
ンプレートとしてＰＣＲ反応液に入れて、アサリのカル
モジュリンの第３イントロンあるいはミトコンドリアの
ＣＯＩ領域にあるアサリ種特異的領域を増幅するための
ＰＣＲプライマーによってＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応
後、アガロース電気泳動を行い、アサリのＤＮＡの種特
異的領域が増幅されているかを確認することによって種
の同定を行う。2. Accuracy Assay of Monoclonal Antibody of the Present Invention To examine whether the monoclonal antibody of the present invention can be actually used for identification of floating clam larvae using a field sample contaminated with various organisms, the following procedure is performed. it can. An outdoor sample, for example, a plankton sample collected by filtering seawater through a plankton net was reacted with the monoclonal antibody labeled with a fluorescent dye such as fluorescein isothiocyanate (FITC), and the excitation light of the labeled fluorescent dye was set. An individual that has reacted with the monoclonal antibody is removed under a fluorescence microscope. The DNA extracted with phenol chloroform or the like from the taken out individual or the floating larva is directly used as a template in a PCR reaction solution, and PCR is performed to amplify the third intron of calmodulin of clams or a clam species-specific region in the COI region of mitochondria. Perform PCR with primers. After the PCR reaction, agarose electrophoresis is performed to identify the species by confirming whether the species-specific region of the clam DNA has been amplified.

【００２０】３．本発明のモノクローナル抗体を用いた
アサリ浮遊幼生の検出 本発明のアサリ浮遊幼生の検出は、上記モノクローナル
抗体を用いて酵素抗体法または蛍光抗体法により以下の
通り行うことができる。酵素抗体法によるときは、プラ
ンクトンネットで海水を濾過して採集したプランクトン
試料を−20℃以下、好適には−80℃で凍結し、解凍した
後、TBS で 5,000×g 程度の遠心操作によって洗浄す
る。これをプラスチック試験管等に入れ、氷冷下で超音
波処理を行い、続いて遠心操作によって得られた上清を
試料とする。この試料を予めアフィニティークロマトグ
ラフィー等で精製したアサリ浮遊幼生特異的モノクロー
ナル抗体を吸着させた酵素抗体法(ELISA) 用96ウェルマ
イクロプレートに添加して一定時間インキュベートす
る。その後、プレートを洗浄し、ビオチンで標識した精
製抗体を各ウェルに添加して一定時間インキュベートし
た後、プレートを洗浄し、酵素標識アビジンを添加して
さらにインキュベートする。インキュベート後、プレー
トを洗浄し、発色基質としてオルトフェルレンジアミン
等を添加して発色させ、比色法によって測定する。3. Detection of floating clam larvae using the monoclonal antibody of the present invention Detection of floating clam larvae of the present invention can be performed using the above monoclonal antibody by an enzyme antibody method or a fluorescent antibody method as follows. When using the enzyme antibody method, plankton samples collected by filtering seawater through a plankton net are frozen at -20 ° C or lower, preferably at -80 ° C, thawed, and washed with TBS by centrifugation at about 5,000 × g. I do. This is put into a plastic test tube or the like, subjected to ultrasonic treatment under ice cooling, and then the supernatant obtained by centrifugation is used as a sample. This sample is added to a 96-well microplate for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), to which a monoclonal antibody specific to clam suspension larvae, which has been previously purified by affinity chromatography or the like, is adsorbed and incubated for a certain period of time. Thereafter, the plate is washed, and a purified antibody labeled with biotin is added to each well and incubated for a certain period of time. Then, the plate is washed, and enzyme-labeled avidin is added and further incubated. After the incubation, the plate is washed, and color is developed by adding orthoferrendiamine or the like as a color-developing substrate, and the color is measured by a colorimetric method.

【００２１】酵素抗体法においては、アサリの全発育段
階の浮遊幼生に反応する抗体を用いてまずアサリ浮遊幼
生を検出し、その後、発育段階の前期に反応する抗体、
または発育後期に反応する抗体を用いてその反応性を調
べることにより、試料中のアサリ浮遊幼生の発育段階を
推定することもできる。In the enzyme antibody method, first, a clam floating larva is detected using an antibody that reacts with floating larvae at all stages of development of a clam, and thereafter, an antibody that reacts during the early stage of the development stage,
Alternatively, the development stage of the clam suspension larvae in the sample can be estimated by examining the reactivity using an antibody that reacts in the late stage of development.

【００２２】また、蛍光抗体法によるときは、プランク
トンネットで海水を濾過して採集したプランクトン試料
を−20℃以下、好適には−80℃で凍結し、解凍した後、
自然沈降法またはTBS で 5,000×g 程度の遠心操作によ
って洗浄する。これに精製したアサリ浮遊幼生特異的モ
ノクローナル抗体を添加して反応させ、さらに蛍光色素
で標識した抗免疫グロブリン抗体を加えて反応させ、蛍
光顕微鏡にて発色を観察する。蛍光色素としては、FIT
C、TRITC 、TEXAS Red 等が挙げられ、これらを単独ま
たは多重で用い、種の同定を行う。また、同時に蛍光発
色が認められる幼生の殻長をサイトメーター等で計測す
ることによって幼生の発育段階を調べることができる。When the fluorescent antibody method is used, a plankton sample collected by filtering seawater through a plankton net is frozen at -20 ° C or lower, preferably at -80 ° C, and thawed.
Wash by gravity sedimentation or centrifugation at about 5,000 xg with TBS. A purified clam floating larva-specific monoclonal antibody is added thereto for reaction, and an anti-immunoglobulin antibody labeled with a fluorescent dye is added for reaction. The color development is observed with a fluorescence microscope. FIT is a fluorescent dye
C, TRITC, TEXAS Red and the like are used, and these are used alone or in combination to identify species. At the same time, the development stage of the larva can be examined by measuring the shell length of the larva where fluorescence is observed with a cytometer or the like.

【００２３】[0023]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。 〔実施例１〕 モノクローナル抗体の製造 (1) 抗原の調製 受精後27時間または受精後21日のアサリのベリジャー期
浮遊幼生を氷冷下で90秒間超音波処理した後、 5,000×
g で遠心分離によって採取した上清を0.45μmのフィル
ターでろ過したものを抗原とした。The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples. Example 1 Production of Monoclonal Antibody (1) Preparation of Antigen The larvae floating larvae of clams 27 hours after fertilization or 21 days after fertilization were sonicated for 90 seconds under ice-cooling, and then 5,000 ×
The supernatant obtained by centrifugation at g was filtered through a 0.45 μm filter to obtain an antigen.

【００２４】(2) 動物の免疫および抗体産生細胞の採取 フロイントの完全アジュバンド0.5ml に、(1) で調製し
た抗原1,000 〜1,500μg 相当を含む500 μl の溶液を
混合し、３〜５分間エマルジョン化を行った。このエマ
ルジョン100 μl を４週齢のマウス（BALB/c) の腹腔内
に注入した。更に、初回免疫から２週間後に同様にして
フロイントの不完全アジュバントとのエマルジョンとし
て調製した抗原溶液100 μl を、腹腔内に注入して追加
免疫を行った。更に、追加免疫から２週間後に、1 〜5
μg/μl となるよう PBSに溶解した抗原をマウス一匹あ
たり50〜250 μg になるように尾静脈に注入した。最終
免疫３〜５日後にマウスから脾臓を摘出し、ＭＥＭ中で
破砕することにより浮遊細胞を得た。(2) Animal immunization and collection of antibody-producing cells To 0.5 ml of Freund's complete adjuvant, 500 μl of a solution containing 1,000 to 1,500 μg of the antigen prepared in (1) was mixed and mixed for 3 to 5 minutes. Emulsification was performed. 100 μl of this emulsion was injected intraperitoneally into 4-week old mice (BALB / c). Further, two weeks after the initial immunization, 100 μl of the antigen solution similarly prepared as an emulsion with Freund's incomplete adjuvant was injected intraperitoneally for booster immunization. Two weeks after the boost, 1-5
Antigen dissolved in PBS at a concentration of μg / μl was injected into the tail vein at 50-250 μg per mouse. Three to five days after the final immunization, spleens were excised from the mice and disrupted in MEM to obtain floating cells.

【００２５】(3) 細胞融合 マウスミエローマSp2/0-Ag14 [ATCC CRL-1581 ; Natur
e, 276, 271 (1978)]を、８−アザグアニジン培地［IMD
Mにペニシリン(100unit/ml)、ストレプトマイシン(100u
nit/ml)、アンホテリシンＢ(2.5μg/ml) 、２−メルカ
プトエタノール(5×10^-5M)、Ｌ−グルタミン（1.5mM)、
インスリン(80μg/ml) 、トランスフェリン(50μg/m
l)、ウシ胎児血清(15%) 、８−アザグアニン(1.5μg/m
l) ］で継代した後、細胞融合の３〜４日前に正常培地
に継代し、融合当日２×10⁷ 以上の細胞数を確保した。
このマウスミエローマ２×10⁷ 個と、(2) で得た脾臓浮
遊細胞１×10⁸ 個とを50％ (W/V) PEG (分子量1,500 ;
Sigma 社製）中で融合した。(3) Cell fusion mouse myeloma Sp2 / 0-Ag14 [ATCC CRL-1581; Natur
e, 276, 271 (1978)] in an 8-azaguanidine medium [IMD
M to penicillin (100unit / ml), streptomycin (100u
nit / ml), amphotericin B (2.5 μg / ml), 2-mercaptoethanol (5 × 10 ⁻⁵ M), L-glutamine (1.5 mM),
Insulin (80 μg / ml), transferrin (50 μg / m
l), fetal bovine serum (15%), 8-azaguanine (1.5 μg / m
l)], the cells were passaged to a normal medium 3 to 4 days before the cell fusion, and a cell number of 2 × 10 ⁷ or more was secured on the day of the fusion.
2 × 10 ⁷ mouse myeloma cells and 1 × 10 ⁸ spleen suspension cells obtained in (2) were combined with 50% (W / V) PEG (molecular weight 1,500;
Sigma).

【００２６】(4) ハイブリドーマの選択およびクローニ
ング 細胞懸濁液を HATサプリメント(Gibco BRL) およびイン
ターロイキン−６（1unit/ml) を添加したIMDMに10³ 〜
10⁷ 細胞/ml となるよう希釈後、96ウェルの細胞培養用
マイクロプレートに10² 〜10⁶ 細胞/ ウェルまき、各ウ
ェルに選択培地としてHAT 培地［ヒポキサンチン0.01m
M、アミノプリテン0.4 μM 、チミジン0.016mM 、およ
びIL-6を含むIMDM］を加え、培養約６〜10日前後から生
育してくる細胞をハイブリドーマとして得た。(4) Selection and Cloning of Hybridoma The cell suspension was added to IMDM supplemented with HAT supplement (Gibco BRL) and interleukin-6 (1 unit / ml) for 10 ³ to 10 ³ .
After dilution to 10 ⁷ cells / ml, spread 10 ² to 10 ⁶ cells / well in a 96-well cell culture microplate, and add HAT medium [hypoxanthine 0.01 m
IM, 0.4 μM of aminopriten, 0.016 mM of thymidine, and IL-6 containing IL-6], and cells growing from about 6 to 10 days of culture were obtained as hybridomas.

【００２７】次に、ハイブリドーマとして生育したウェ
ルに含まれる培養上清の一部を採集し、アサリベリジャ
ー期浮遊幼生可溶性抗原を吸着させた96ウェルマイクロ
プレートに添加した後、標識した酵素標識抗免疫グロブ
リン抗体を加えてインキュベートした。得られた全ての
抗体陽性ウェルを限界希釈法を最低３回繰り返すことに
よりクローン化した。得られた１個のクローンをIMDMで
37℃で10日間培養することにより、アサリ浮遊幼生に特
異的に反応するモノクローナル抗体を著量生産する株を
得た。Next, a part of the culture supernatant contained in the wells grown as hybridomas was collected and added to a 96-well microplate on which the soluble larvae soluble in the Asariberger stage had been adsorbed. Globulin antibodies were added and incubated. All the antibody-positive wells obtained were cloned by repeating the limiting dilution method at least three times. One obtained clone is IMDM
By culturing at 37 ° C. for 10 days, a strain that produced a significant amount of a monoclonal antibody specifically reacting with the clam floating larvae was obtained.

【００２８】(5) モノクローナル抗体の採取 取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を以下
の方法で採取した。 細胞用培地による方法 10〜20％ FCS添加IMDMあるいは無血清培地で上記モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を10〜14日培養し
た後、1000×g 以上の遠心操作によって固形分を除去し
た。得られた上清を33〜50％飽和硫酸アンモニウムによ
って２〜３回塩析し、ＰＢＳ等に溶解後、同液で透析し
た。これをプロテインＧ等の固相カラムによってＩｇＧ
もしくはＩｇ画分を回収し、アフィニティー精製抗体と
した。(5) Collection of Monoclonal Antibody A monoclonal antibody was collected from the obtained hybridoma by the following method. Method using cell culture medium The above-mentioned monoclonal antibody-producing hybridoma cells were cultured for 10 to 14 days in IMDM or serum-free medium supplemented with 10 to 20% FCS, and then the solid content was removed by centrifugation at 1000 xg or more. The resulting supernatant was salted out 2 to 3 times with 33 to 50% saturated ammonium sulfate, dissolved in PBS or the like, and dialyzed with the same solution. This was purified by IgG using a solid phase column such as protein G.
Alternatively, the Ig fraction was collected and used as an affinity-purified antibody.

【００２９】 腹水からの製造 ハイブリドーマ作成に用いたマウス(BALB/c)と同系の４
〜８週齢のヌードマウス、または２週間前に用いた腹腔
にブリスタン0.５mlを接種した８〜10週齢の同系マウス
に上記モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜
４×10⁶ 細胞／匹を腹腔内接種した。接種後、10〜21日
でハイブリドーマが腹水癌化した。このマウスから腹水
を採集し、1000×g 以上の遠心操作によって固形分を除
去した。得られた上清を33〜50％飽和硫酸アンモニウム
によって２〜３回塩析し、ＰＢＳ等に溶解後、同液で透
析した。これをプロテインＧ等の固相カラムによってＩ
ｇＧもしくはＩｇ画分を回収し、アフィニティー精製抗
体とした。Production from Ascites Fluid Syngeneic with the mouse (BALB / c) used for hybridoma production
The above-mentioned monoclonal antibody-producing hybridoma cells were cultured in nude mice of 8 weeks old or inbred mice of 8 to 10 weeks inoculated with 0.5 ml of bristane in the abdominal cavity used 2 weeks ago.
4 × 10 ⁶ cells / animal were inoculated intraperitoneally. 10 to 21 days after the inoculation, the hybridomas became ascites cancer. Ascites was collected from the mouse, and the solid content was removed by centrifugation at 1000 × g or more. The resulting supernatant was salted out 2 to 3 times with 33 to 50% saturated ammonium sulfate, dissolved in PBS or the like, and dialyzed with the same solution. This is purified by a solid phase column such as protein G.
The gG or Ig fraction was collected and used as an affinity purified antibody.

【００３０】かくして、本発明のアサリ浮遊幼生特異的
モノクローナル抗体を得ることができた。本発明におい
て得られたアサリ浮遊幼生特異的モノクローナル抗体Y2
-44、Y4-12 、S3-33 のうち、Y2-44 は全発育段階のア
サリ浮遊幼生に、Y4-12 は発育初期（トロコフォア期〜
アンボ期）のアサリ浮遊幼生に、S3-33 はアンボ期以降
の浮遊幼生にそれぞれ反応する。Thus, a monoclonal antibody specific to the clam suspension larvae of the present invention was obtained. Clam floating larva specific monoclonal antibody Y2 obtained in the present invention
Of the -44, Y4-12 and S3-33, Y2-44 is a floating larva of clams at all stages of development, and Y4-12 is in the early stage of development (trochophore stage ~
S3-33 reacts to floating larvae during the Ambo period, and S3-33 reacts to floating larvae after the Ambo period.

【００３１】なお、モノクローナル抗体Y2-44 、Y4-12
、S3-33 を産生するハイブリドーマ株をそれぞれY2-44
、Y4-12 、S3-33 と同様の名称とした。これらのハイ
ブリドーマ株Y2-44 、Y4-12 、S3-33 は、平成10年１月
14日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、Y2-4
4 についてはFERM P-16583、Y4-12 についてはFERM P-1
6582 、S3-33 についてはFERM P-16581として寄託され
ている。The monoclonal antibodies Y2-44, Y4-12
, S3-33 producing hybridoma strains
, Y4-12 and S3-33. These hybridoma strains Y2-44, Y4-12 and S3-33 were produced in January 1998.
The Institute of Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology, Japan
FERM P-16583 for 4 and FERM P-1 for Y4-12
6582 and S3-33 have been deposited as FERM P-16581.

【００３２】〔実施例２〕（モノクローナル抗体の精度
検定） 目合い 100μm のプランクトンネットで海水500Lを濾過
して採集したプランクトン試料にフルオレッセントイソ
チアネート(FITC)等の蛍光色素で標識した精製抗体Y2-4
4 を反応させた。標識した蛍光色素の励起光に設定した
蛍光顕微鏡下で反応した個体を取り出し、その個体より
フェノールクロロホルムでＤＮＡまたは浮遊幼生を抽出
し、これをテンプレートとしてＰＣＲ反応液に入れ、ア
サリのゲノムＤＮＡ特異的プライマーであるカルモジュ
リンの第３イントロンを標的とした種特異的プライマー
(AS-1: 5'-CGAGGTGGATGCCGATGGTAAGT-3'/AS-2: 5'-TCG
ATTGTTCCATTTCCTGCATTCAA-3') 、またはミトコンドリア
のＣＯＩ領域を標的とした種特異的プライマー (RP-1:
5'-CCTAAACACCAAGCTAACATACTACTAACGC-3''/ RP-2:5'-TG
CCGGGGAAAATGTTAGATGATGGTC-3')を用い、ＰＣＲ（ＰＣ
Ｒの反応サイクル：94℃60秒→94℃30秒, 58℃30秒, 72
℃45秒を30〜35サイクル→72℃600 秒) を行った。蛍光
標識抗体との反応が認められた浮遊幼生は、ＰＣＲ反応
後、アガロース電気泳動を行うと、アサリのＤＮＡの種
特異的領域が増幅されていることが確認された（図１
左；レーン２〜４、図１右；レーン２〜３）。Example 2 (Accuracy Assay of Monoclonal Antibody) Purification in which a plankton sample collected by filtering 500 L of seawater through a plankton net of 100 μm in size was labeled with a fluorescent dye such as fluorescein isocyanate (FITC). Antibody Y2-4
4 was reacted. An individual who reacted under a fluorescence microscope set to the excitation light of the labeled fluorescent dye was taken out, DNA or suspended larva was extracted from the individual with phenol chloroform, and this was used as a template in a PCR reaction solution, and the clam genomic DNA specific Species-specific primer targeting the third intron of the calmodulin primer
(AS-1: 5'-CGAGGTGGATGCCGATGGTAAGT-3 '/ AS-2: 5'-TCG
ATTGTTCCATTTCCTGCATTCAA-3 '), or species-specific primers targeting the mitochondrial COI region (RP-1:
5'-CCTAAACACCAAGCTAACATACTACTAACGC-3 '' / RP-2: 5'-TG
PCR (PC) using CCGGGGAAAATGTTAGATGATGGTC-3 ')
R reaction cycle: 94 ° C for 60 seconds → 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72
30 seconds of 35 seconds at 45 ° C. → 600 seconds at 72 ° C.). The agarose electrophoresis of the floating larva in which the reaction with the fluorescently labeled antibody was observed after the PCR reaction confirmed that the species-specific region of the clam DNA was amplified (FIG. 1).
Left; lanes 2 to 4, FIG. 1 right; lanes 2 to 3).

【００３３】〔実施例３〕（酵素抗体法によるアサリ浮
遊幼生の検出・定量） (1) 検量線作成用標準試料の調製 受精後27時間の幼生および受精後25日の幼生を5ml の滅
菌海水にそれぞれ20、50、100 、150 、200 、300 、50
0 、1000個となるように懸濁して-80 ℃に凍結した。解
凍後、幼生をTBS で 5,000×g の遠心操作によって洗浄
した。これを５〜10mlとって50mlプラスチック試験管に
入れ、氷冷しながら超音波処理を1/2 間隔で90秒間行っ
た。４℃、 5,000×g で10分間遠心分離を行って上清を
採取し、これを試料とした。[Example 3] (Detection and quantification of floating larvae of clams by the enzyme antibody method) (1) Preparation of a standard sample for preparing a calibration curve Larvae 27 hours after fertilization and larvae 25 days after fertilization were sterilized in 5 ml of sterile seawater. 20, 50, 100, 150, 200, 300, 50 respectively
The suspension was suspended at 0, 1000 cells and frozen at -80 ° C. After thawing, the larvae were washed with TBS by centrifugation at 5,000 × g. 5 to 10 ml of the solution was placed in a 50 ml plastic test tube, and sonication was performed for 90 seconds at 1/2 intervals while cooling on ice. The supernatant was collected by centrifugation at 5,000 xg for 10 minutes at 4 ° C, and this was used as a sample.

【００３４】(2) 抗体感作プレート作成 精製抗体Y2-44, Y4-12, S3-33 を５μg/mlの濃度となる
ように溶解した TBS溶液50μl を酵素抗体法(ELISA) 用
96ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加し、４℃で
一晩置いた。0.05％ Tween20添加 TBSで２回洗浄した
後、TBS に２％濃度となるように溶解したスキムミルク
溶液で25〜37℃で30分間ブロッキングし、0.05％ Tween
20添加 TBSで２回洗浄し、各抗体の感作プレートを作成
した。(2) Preparation of antibody-sensitized plate 50 μl of a TBS solution in which purified antibodies Y2-44, Y4-12 and S3-33 were dissolved at a concentration of 5 μg / ml was used for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Added to each well of a 96-well microplate and left overnight at 4 ° C. After washing twice with TBS supplemented with 0.05% Tween 20, blocking with a skim milk solution dissolved in TBS to a concentration of 2% at 25 to 37 ° C. for 30 minutes, and 0.05% Tween 20
After washing twice with 20-added TBS, a sensitized plate for each antibody was prepared.

【００３５】(3) 反応 (1) で採取した各試料の上清を TBSで２倍希釈した希釈
液50μl を(2) で作成した抗体感作プレートに添加し
た。37℃で１〜２時間反応させたのち、0.05％ Tween 2
0 添加 TBSで３回洗浄し、５μg/mlの濃度となるように
TBSに溶解したマウス IgG溶液50μl を各ウェルに分注
し、37℃で１時間反応させ、0.05％ Tween20 添加 TBS
で３回洗浄した。次に、５μg/mlの濃度となるように T
BSに溶解したビオチン標識精製抗体Y2-44 、Y4-12 、あ
るいはS3-33 抗体50μl をそれぞれの感作プレートのウ
ェルに添加し、37℃で１〜２時間反応させたのち、0.05
％ Tween 20 添加 TBSで３回洗浄した。至適温度のパー
オキシダーゼ標識アビジンを各ウェルに添加し、37℃で
１〜２時間反応させたのち、0.５％ Tween 20 添加 TBS
で５回洗浄した。オルトフェニレンジアミンを基質とし
た発色剤により発色し、マイクロプレートリーダーで各
ウェルの吸光度を測定し、検量線を作成した（図２）。(3) Reaction The supernatant of each sample collected in (1) was diluted 2-fold with TBS, and 50 μl of a diluted solution was added to the antibody-sensitized plate prepared in (2). After reacting at 37 ° C for 1-2 hours, 0.05% Tween 2
0 Addition Wash three times with TBS and adjust to a concentration of 5 μg / ml.
50 μl of a mouse IgG solution dissolved in TBS was dispensed to each well, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and added with 0.05% Tween20-added TBS.
And washed three times. Next, T was adjusted to a concentration of 5 μg / ml.
50 μl of a biotin-labeled purified antibody Y2-44, Y4-12, or S3-33 antibody dissolved in BS was added to each well of the sensitized plate, and reacted at 37 ° C. for 1 to 2 hours.
The plate was washed three times with TBS containing% Tween 20. After adding peroxidase-labeled avidin at the optimum temperature to each well and reacting at 37 ° C. for 1 to 2 hours, 0.5% Tween 20 added TBS
And washed 5 times. Color was developed with a color former using orthophenylenediamine as a substrate, and the absorbance of each well was measured with a microplate reader to prepare a calibration curve (FIG. 2).

【００３６】(4) 酵素抗体法と形態学的手法による同定
の相関 三河湾および広島湾西部の海域より 500L の海水延べ10
0 余点をポンプで揚水し、100 μm の目合いのプランク
トンネットで濾過した。濾液を 100μm のプランクトン
ネットで５〜10mlに濃縮し、２等分して一方を−80℃で
凍結し、もう一方は70% エタノールで固定した。凍結さ
せた試料は(1) と同様に処理した後、(3) の方法に従っ
て酵素抗体反応を行った。(3) で予め作成しておいた検
量線からアサリ浮遊幼生の個数を算出した。一方、エタ
ノール固定した試料は従来行われてきた形態学的手法に
よって同定を行った。アサリ浮遊幼生の酵素抗体法によ
る定量結果と形態学的手法による同定結果の相関(r=0.9
61) を図３に示す。(4) Correlation between identification by enzyme antibody method and morphological method A total of 500 L of seawater from Mikawa Bay and the western part of Hiroshima Bay
The remaining points were pumped up with a pump and filtered through a plankton net with a mesh size of 100 μm. The filtrate was concentrated to 5 to 10 ml with a 100 μm plankton net, divided into two equal parts, frozen at −80 ° C., and fixed with 70% ethanol. After treating the frozen sample in the same manner as in (1), an enzyme-antibody reaction was performed according to the method of (3). From the calibration curve prepared in advance in (3), the number of clam floating larvae was calculated. On the other hand, the ethanol-fixed sample was identified by a conventional morphological method. Correlation between the results of quantification of floating clam larvae by the enzyme antibody method and the results of identification by morphological techniques (r = 0.9
61) is shown in FIG.

【００３７】〔実施例４〕（蛍光抗体法によるアサリ浮
遊幼生の同定試験） 500Lの海水をポンプで揚水し、 100μm の目合いのプラ
ンクトンネットで濾過し、濾液を−80℃で凍結した。解
凍後、自然沈降法またはTBS で 5,000×g の遠心操作に
よって洗浄した。これに、予め求めておいた至適濃度の
Y2-44 産生細胞培養液または精製抗体Y2-44 、Y4-12 、
S3-33 TBS 溶液を当量加え、25〜37℃で0.１〜１時間反
応させたのち、TBS で 5,000×g の遠心操作によって洗
浄した。次に、至適濃度の蛍光(FITC)標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を当量加え、25〜37℃で0.５〜１時間反応させ
た。自然沈降法またはTBS で 5,000×g の遠心操作によ
って洗浄し、蛍光顕微鏡で発色を観察した（図４〜
６）。[Example 4] (Identification test of floating clam larvae by the fluorescent antibody method) [0038] 500 L of seawater was pumped with a pump, filtered through a plankton net having a mesh size of 100 µm, and the filtrate was frozen at -80 ° C. After thawing, the cells were washed by gravity sedimentation or centrifugation at 5,000 xg with TBS. In addition to this, the optimum concentration
Y2-44 producing cell culture or purified antibodies Y2-44, Y4-12,
After adding an equivalent amount of S3-33 TBS solution and reacting at 25 to 37 ° C. for 0.1 to 1 hour, it was washed with TBS by centrifugation at 5,000 × g. Next, an optimal concentration of fluorescent (FITC) -labeled anti-mouse Ig
An equivalent amount of G antibody was added and reacted at 25-37 ° C for 0.5-1 hour. After washing by spontaneous sedimentation or centrifugation at 5,000 xg with TBS, color development was observed with a fluorescence microscope (Fig. 4-
6).

【００３８】蛍光顕微鏡による観察で蛍光発色が認めら
れる試料はアサリ浮遊幼生と判定され（図４）、蛍光発
色が認められない試料はアサリ以外の貝類の浮遊幼生と
判定される（図６）。また、スライドガラス上ではアサ
リ浮遊幼生は必ずしも一定の方向ではなく、角度が異な
ることがあるが、本法によれば蛍光の反応性が強いので
判定可能である（図５）。A sample that shows fluorescence emission by observation with a fluorescence microscope is determined to be a floating clam larva (FIG. 4), and a sample that does not show fluorescence emission is determined to be a floating larva of shellfish other than clams (FIG. 6). In addition, the clam floating larva is not necessarily in a fixed direction on the slide glass, and may have a different angle. However, according to the present method, the determination can be made because the reactivity of the fluorescence is strong (FIG. 5).

【００３９】〔実施例５〕（アサリ浮遊幼生の発育段階
の推定） 精製抗体Y2-44 を用いて酵素抗体反応を行ってアサリ浮
遊幼生を検出し（第１反応）、その後、発育段階判定用
抗体（Y4-12 、S3-33)を用いて同様にしてその反応性を
調べると、表１に示すようにアサリ浮遊幼生の発育段階
を推定できた。[Example 5] (Estimation of development stage of clam floating larva) Using a purified antibody Y2-44, an enzyme-antibody reaction was performed to detect clam floating larvae (first reaction). When the reactivity was examined in the same manner using the antibodies (Y4-12, S3-33), the development stage of the clam floating larva could be estimated as shown in Table 1.

【００４０】[0040]

【表１】 [Table 1]

【００４１】[0041]

【発明の効果】本発明によれば、アサリ浮遊幼生に特異
的なモノクローナル抗体が提供される。本発明のアサリ
浮遊幼生特異的モノクローナル抗体によれば、従来熟練
を要したアサリ浮遊同定の同定を誰でもが簡便に行うこ
とができ、しかもこれまで同定することが不可能であっ
た１２０μｍ以下のサイズの浮遊幼生の同定も可能とな
った。さらに、発育段階により反応特異性が異なる複数
のモノクローナル抗体の組み合わせることより、アサリ
の発育段階を推定することもできる。According to the present invention, there is provided a monoclonal antibody specific to clam suspension larvae. According to the clam floating larva-specific monoclonal antibody of the present invention, anyone can conventionally easily identify the clam floating identification that required skill, and 120 μm or less that could not be identified until now It became possible to identify floating larvae of different sizes. Furthermore, the development stage of clams can be estimated by combining a plurality of monoclonal antibodies having different reaction specificities depending on the development stage.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ＰＣＲによるアサリ浮遊幼生の同定結果を示
す、アガロース電気泳動写真である。FIG. 1 is an agarose electrophoresis photograph showing the results of identification of floating clam larvae by PCR.

【図２】 本発明のモノクローナル抗体を用いた酵素抗
体法における、アサリ浮遊幼生個数と吸光度との関係
（検量線）を示す。FIG. 2 shows the relationship (calibration curve) between the number of floating larvae of clams and the absorbance in the enzyme antibody method using the monoclonal antibody of the present invention.

【図３】 本発明のモノクローナル抗体を用いた酵素抗
体法によるアサリ浮遊幼生の定量結果と形態学的手法に
よる同定結果との相関を示す。FIG. 3 shows a correlation between the results of quantification of floating clam larvae by the enzyme antibody method using the monoclonal antibody of the present invention and the results of identification by morphological techniques.

【図４】 本発明のモノクローナル抗体を用いた蛍光抗
体法によるアサリ浮遊幼生の同定試験で、陽性と認めら
れる浮遊幼生の蛍光顕微鏡写真（蛍光発色は白くぼんや
りと顕れている部分）を示す。FIG. 4 shows a fluorescence micrograph of a floating larva that is recognized to be positive in a clam floating larva identification test by a fluorescent antibody method using the monoclonal antibody of the present invention (a portion where the fluorescent color appears white and vague).

【図５】 本発明のモノクローナル抗体を用いた蛍光抗
体法によるアサリ浮遊幼生の同定試験で、陽性と認めら
れる浮遊幼生の蛍光顕微鏡写真（蛍光発色は白くぼんや
りと顕れている部分）を示す。FIG. 5 shows a fluorescence micrograph of a floating larva that is found to be positive in an identification test of the floating clam larva by the fluorescent antibody method using the monoclonal antibody of the present invention (a portion where the fluorescent color appears white and dark).

【図６】 本発明のモノクローナル抗体を用いた蛍光抗
体法によるアサリ浮遊幼生の同定試験で、陰性と認めら
れる浮遊幼生の蛍光顕微鏡写真を示す。FIG. 6 shows a fluorescence micrograph of a floating larva that is found to be negative in an identification test of the floating clam larva by the fluorescent antibody method using the monoclonal antibody of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/18 C12P 21/08 G01N 33/48 G01N 33/53 - 33/577 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI G01N 33/53 C12N 15/00 C 33/577 5/00 B // (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21 / 08 C12R 1:91) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) C07K 16/18 C12P 21/08 G01N 33/48 G01N 33/53-33/577 C12N 15/00-15/90 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG) JICST file (JOIS)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 アサリのベリジャー期幼生で免疫化した
マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて得られ
たハイブリドーマが生産するアサリ浮遊幼生特異的モノ
クローナル抗体。1. A clam floating larva-specific monoclonal antibody produced by a hybridoma obtained by fusing mouse spleen cells and mouse myeloma cells immunized with a clam verger larva. 【請求項２】 アサリ浮遊幼生が、トロコフォア期か
ら、ベリジャー期、アンボ期、フルグロウン期、着底期
に至るまでの全発育段階の幼生である請求項１記載のモ
ノクローナル抗体。2. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the clam floating larva is a larva of all developmental stages from a trochophore stage to a verger stage, an ambo stage, a full-grown stage and a settlement stage. 【請求項３】 アサリ浮遊幼生が、発育初期（トロコフ
ォア期〜アンボ期）のアサリ浮遊幼生である請求項１記
載のモノクローナル抗体。3. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the floating clam larva is a clam floating larva at an early stage of development (trochophore stage to ambo stage). 【請求項４】 アサリ浮遊幼生が、アンボ期以降の浮遊
幼生である請求項１記載のモノクローナル抗体。4. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the clam floating larva is a floating larva after the Ambo stage. 【請求項５】 アサリのベリジャー期幼生で免疫化した
マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて得ら
れ、請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ。5. A hybridoma producing the monoclonal antibody according to claim 1, which is obtained by fusing mouse spleen cells and mouse myeloma cells immunized with a larval stage larva of clams. 【請求項６】 請求項５に記載のハイブリドーマを培地
に培養し、培養物よりアサリ浮遊幼生特異的モノクロー
ナルを採取することを特徴とする、アサリ浮遊幼生特異
的モノクローナル抗体の製造方法。6. A method for producing a clam floating larva-specific monoclonal antibody, which comprises culturing the hybridoma according to claim 5 in a medium, and collecting a clam floating larva-specific monoclonal antibody from the culture. 【請求項７】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
用いるアサリ浮遊幼生の同定方法。7. A method for identifying floating clam larvae using the monoclonal antibody according to claim 1.