JP2007145775A - Method for detecting norovirus gi in high sensitivity - Google Patents
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Description
特定の配列からなる合成ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、この抗体を用いるノロウイルスＧＩ(Norovirus ＧＩ)感染の検出試薬、検出方法および検出キットに関する。 The present invention relates to a monoclonal or polyclonal antibody against a synthetic peptide having a specific sequence, a detection reagent, detection method and detection kit for Norovirus GI infection using this antibody.
ノロウイルスは従来ＳＲＳＶ(Small Round Structured Virus:小型球形ウイルス)と呼ばれており、また、ＮＬＶ(Norwalk-like virus:ノーウォーク関連ウイルス)ともいわれるウイルスであり、その遺伝子型によりＧＩ(genogroupI)とＧII(genogroup II)に分類される。ノロウイルスは直径３０ナノメートル(１ナノは１０億分の１)ほどの微小なウイルスでヒトの腸内でしか増殖しない。下痢、嘔吐、腹痛、吐き気、発熱などの症状を伴う食中毒の原因となるウイルスである。汚水の流れ出る河口付近に生息するカキ・二枚貝の内臓に付着している。７０℃で１分間加熱すれば予防できるが、これらのものを加熱不十分や生での摂食で食中毒が起きる。最近はウイルス保菌者の***物などによるヒトからヒトへの感染も多くなっている。 Norovirus is conventionally referred to as SRSV (Small Round Structured Virus) and also referred to as NLV (Norwalk-like virus), and depending on its genotype, GI (genogroup I) and GII Classified as (genogroup II). Norovirus is a small virus with a diameter of about 30 nanometers (one nano is one billionth) and grows only in the human intestine. A virus that causes food poisoning with symptoms such as diarrhea, vomiting, abdominal pain, nausea, and fever. It adheres to the internal organs of oysters and bivalves that live near the river mouth where sewage flows. It can be prevented by heating at 70 ° C. for 1 minute, but food poisoning occurs due to inadequate heating or raw consumption. Recently, human-to-human infection due to the excrement of virus carriers has increased.
食中毒が発生した場合、被害を最小限にとどめるために、原因究明の検査を患者の糞便や疑われる食品などの検体について行う。細菌の場合はそれぞれ特徴があるのでその細菌にあった培地を用いて目的の菌をみつけることができるが、一般にウイルスは細菌のように合成培地では増殖しないので、生きた細胞を用いることになる。しかしながら、ノロウイルスＧＩは培養細胞中で増殖させることができない。そこで検査の方法としてはウイルス粒子を電子顕微鏡によって直接見つける方法か、検体から採取したノロウイルスＧＩの遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅し、該増幅産物を、電気泳動、分光蛍光光度計を用いて検出する方法が用いられている。 In the event of food poisoning, in order to keep the damage to a minimum, the cause is examined for specimens such as the feces of patients and suspected foods. Each bacterium has its own characteristics, so it is possible to find the target bacterium using a medium suitable for the bacterium, but in general, viruses do not grow on a synthetic medium like bacteria, so live cells will be used. . However, norovirus GI cannot be grown in cultured cells. Therefore, as a method of examination, a method of directly finding virus particles by an electron microscope, or amplifying a DNA or RNA fragment of a Norovirus GI gene collected from a specimen, and then amplifying the amplified product using electrophoresis or a spectrofluorometer A detection method is used.
最近、モノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によるノロウイルスＧＩの検出方法が報告されているが、用いられるモノクローナル抗体は、ＮＶカプシドタンパクをコードするＯＲＦ２を用いたバキュロウイルス発現システムで発現されたウイルス様中空粒子(Ｖirus-like particles：ＶＬＰs)を抗原として作製されたモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体を用いた検出キットは、ジェノグループＩ(Ｇenogroup Ｉ、ＧＩ)とジェノグループII(Ｇenogroup II、ＧII)をそれぞれ検出することがわかっている(非特許文献１)。
電子顕微鏡による方法や、遺伝子断片を用いる方法は、検体の処理などの検出可能な試料とするのに熟練した技術と時間がかかる、さらに検出過程にも時間がかかる、そして大量の検体を処理できないなどの欠点がある。しかしながら、被害の拡大や社会的不安の解消のためには早期原因究明が必要であり、ノロウイルスＧＩに汚染されたカキによる食中毒は微量のウイルスで発症するために、簡便で短時間にかつ高感度のノロウイルスＧＩの検出方法が待たれていた。これにこたえてモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡによる方法が開発されつつある。本発明者らは、さらに短時間で処理でき、操作が簡便で多検体を同時に処理できる方法を求めて鋭意検討を重ね本発明を完成させた。 The electron microscope method and the method using gene fragments are skilled and time consuming to make a detectable sample such as sample processing, and the detection process also takes time, and a large amount of samples cannot be processed. There are disadvantages such as. However, early investigation of the cause is necessary for the expansion of damage and the resolution of social anxiety, and food poisoning caused by oysters contaminated with norovirus GI develops with a trace amount of virus. The norovirus GI detection method has been awaited. In response, an ELISA method using a monoclonal antibody is being developed. The present inventors have intensively studied for a method capable of processing in a shorter time, simple operation and capable of simultaneously processing multiple specimens, and completed the present invention.
本発明の第１は、抗原に用いる適当な領域として、ノロウイルスＧＩのジェノタイプ(Genotype)1〜14までのカプシド領域において共通する66番目から78番目のアミノ酸配列を含む下記のアミノ酸配列：
Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp (配列番号１)
を選択し、そのアミノ酸配列のＮ末端にCys残基を付加し、更にそのCys残基にキャリアーとしてＫＬＨを付加し、これを免疫原として作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。この抗体は、ノロウイルスＧＩ、ノロウイルスＧＩの抗原または抗原性フラグメントを認識またはこれらに結合することができる。ノロウイルスＧＩとしてはノーウォーク(Norwalk)株、チバ(Chiba)株、サイタマ(Saitama)株等の１４のジェノタイプが知られているが、本願発明の抗体はこれらのジェノタイプに関係なくノロウイルスＧＩを認識し結合し得る。
The first of the present invention is the following amino acid sequence comprising the 66th to 78th amino acid sequences common in the capsid region of genotype 1-14 of Norovirus GI as a suitable region used for the antigen:
Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp (SEQ ID NO: 1)
Is a monoclonal or polyclonal antibody prepared by adding a Cys residue to the N-terminus of the amino acid sequence, further adding KLH as a carrier to the Cys residue, and using this as an immunogen. The antibody can recognize or bind to Norovirus GI, Norovirus GI antigen or antigenic fragment. As the norovirus GI, 14 genotypes such as Norwalk strain, Chiba strain, Saitama strain and the like are known, but the antibody of the present invention does not affect the norovirus GI regardless of these genotypes. Can recognize and combine.
本発明の第２は、上記のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む、ノロウイルスＧＩ検出試薬である。 The second of the present invention is a norovirus GI detection reagent containing the above monoclonal or polyclonal antibody.
本発明の検出試薬にはノロウイルスＧＩに感染している疑いのある患者を診断するための診断薬およびノロウイルスＧＩに汚染されている疑いのある食材を検査する検査薬が含まれる。 The detection reagent of the present invention includes a diagnostic agent for diagnosing a patient suspected of being infected with Norovirus GI and a test agent for examining foods suspected of being contaminated with Norovirus GI.
本発明の第３は、検体を上記のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体または上記の検出試薬と接触させ、ＥＬＩＳＡにより検出することを特徴とするノロウイルスＧＩ検出方法である。 A third aspect of the present invention is a method for detecting norovirus GI, wherein a specimen is brought into contact with the above monoclonal or polyclonal antibody or the above detection reagent and detected by ELISA.
検体にはノロウイルスＧＩに感染している疑いのある患者から採取される検体、例えば、便など、またはノロウイルスＧＩに汚染されている疑いのある食材の一部である検体が含まれる。 Specimens include specimens collected from patients suspected of being infected with Norovirus GI, such as stool, or specimens that are part of foodstuffs suspected of being contaminated with Norovirus GI.
本発明に用いられるＥＬＩＳＡには蛍光ＥＬＩＳＡが含まれる。 The ELISA used in the present invention includes a fluorescent ELISA.
本発明の第４は、上記のノロウイルスＧＩ検出方法の実施に用いられるキットである。特に、ブロッキング剤として１％スキムミルク含み、上記の抗体と連結する酵素およびその酵素の基質としてそれぞれ(１)ペルオキシダーゼおよびo−フェニレンジアミンまたは(２)β-ガラクトシダーゼ-アビジンおよび4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシドを含むキットである。 The 4th of this invention is a kit used for implementation of said norovirus GI detection method. In particular, the enzyme containing 1% skim milk as a blocking agent, and the enzyme linked to the above antibody and the substrate of the enzyme are (1) peroxidase and o-phenylenediamine or (2) β-galactosidase-avidin and 4-methylumbelliferyl- A kit containing β-D-galactoside.
本発明の第５は、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、このハイブリドーマは、平成１７年３月１６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０４６１のもとに寄託された。 A fifth aspect of the present invention is a hybridoma that produces the above monoclonal antibody, and this hybridoma is assigned to the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on March 16, 2005, and has the accession number FERM P-20461. And was deposited.
本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体は非常に感度が高い。従ってこれを用いるＥＬＩＳＡ法によれば、迅速、簡便かつ高感度で食品中、例えばカキ等からノロウイルスＧＩの早期検出が可能であり、被害を最小限にとどめることができる。また、本発明の抗体はジェノタイプに関係なく、ノロウイルスＧＩを認識し結合し得ることから漏れのない検査が可能である。本発明の検出システムでは、ノロウイルスＧＩが魚介類に含まれている場合が多いことから、生鮮食品の微生物検査を行う機関などの活用が期待される。また、食品検査だけでなく検便検査としても使用可能である。 The monoclonal or polyclonal antibody of the present invention is very sensitive. Therefore, according to the ELISA method using this, it is possible to detect Norovirus GI early in food, for example, oysters, etc., quickly, simply and with high sensitivity, and damage can be minimized. Further, since the antibody of the present invention can recognize and bind to Norovirus GI regardless of genotype, it can be tested without omission. In the detection system of the present invention, since norovirus GI is often contained in fish and shellfish, it is expected to be utilized by an organization that performs microbial inspection of fresh food. Moreover, it can be used not only for food inspection but also for stool inspection.
高感度で正確性の高いイムノアッセイ系を構築するには、質の高い抗体を用いることが必要である。そこで様々なデータベース上で公開されているノロウイルスＧＩの生物情報より抗体のエピトープとして最適であると考えられるアミノ酸領域を選定し、この領域に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。 To construct a highly sensitive and accurate immunoassay system, it is necessary to use high-quality antibodies. Therefore, an amino acid region considered to be optimal as an antibody epitope was selected from the biological information of Norovirus GI published on various databases, and a hybridoma producing a monoclonal antibody against this region was prepared.
合成ペプチドの設計
ノロウイルスのカプシドはＮ蛋白という１種類の蛋白が集合しており、Ｎ蛋白はＰ2、Ｐ1、Ｓという３つの領域に分かれる。Ｐ1およびＰ2領域はウイルス粒子表面に露出した領域で抗体と最も反応しやすい領域と考えられるが、この領域は株間で血清学的多様性に富んでいる。一方、S領域はウイルス粒子表面の内側に位置しているが、アミノ酸配列において株間での保存性が比較的高い。できるだけ多くの株と反応できる抗体を作成するため、S領域に存在する株間で最も保存性の高い領域のアミノ酸配列を基に合成ペプチドを作製した。
Design of Synthetic Peptide Norovirus capsid is a collection of one protein called N protein, and N protein is divided into three regions, P2, P1, and S. The P1 and P2 regions are the regions exposed on the surface of the virus particles and are considered to be the regions that are most likely to react with the antibody. On the other hand, the S region is located inside the virus particle surface, but the amino acid sequence is relatively highly conserved among strains. In order to create an antibody capable of reacting with as many strains as possible, a synthetic peptide was prepared based on the amino acid sequence of the most conserved region among strains existing in the S region.
その結果６６番目から７８番目のアミノ酸配列が、ノロウイルスＧ１の多数の株に保存されており、また、モノクローナル抗体の作製による確認でも、モノクローナル抗体の反応性が最も高かった。そこでその箇所について合成ペプチドを作製し、その作製した合成ペプチドのＮ末端にCys残基を付加し、更にそのCys残基にキャリアーとしてＫＬＨを付加し、これを免疫原に用いた。合成ペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp 配列番号１
そして、Cys残基およびキャリアーＫＬＨを付加したアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＬＨ−Cys Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp 配列番号２
As a result, the 66th to 78th amino acid sequences were conserved in many strains of Norovirus G1, and the reactivity of the monoclonal antibody was the highest in the confirmation by production of the monoclonal antibody. Therefore, a synthetic peptide was prepared for the site, a Cys residue was added to the N-terminus of the prepared synthetic peptide, and KLH was added as a carrier to the Cys residue, which was used as an immunogen. The amino acid sequence of the synthetic peptide is as follows.
Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp SEQ ID NO: 1
The amino acid sequence to which Cys residue and carrier KLH are added is as follows.
KLH-Cys Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp SEQ ID NO: 2
免疫スケジュール
上記で作製した合成ペプチドを生理食塩水で希釈し、アジュバントと混和する。この抗原液をマウスに腹腔内投与する。さらに追加免疫し、ＥＬＩＳＡ法にてマウス血清中抗体価の測定し、血中抗体価が６４０００倍になるまでこの操作を繰り返す。細胞融合の３日前にも合成ペプチドを腹腔内に投与する。
Immunization schedule The synthetic peptide prepared above is diluted with physiological saline and mixed with an adjuvant. This antigen solution is administered intraperitoneally to mice. Further immunization is carried out, the antibody titer in the mouse serum is measured by ELISA, and this operation is repeated until the blood antibody titer becomes 64000 times. Synthetic peptides are also administered intraperitoneally 3 days before cell fusion.
細胞融合
最終免疫後、脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地に個々の細胞に分散させる。遠心後、ＤＭＥＭ培地を加え、脾細胞を浮遊させ、融解緩衝液を添加して赤血球を溶血させる。再度遠心洗浄後ＤＭＥＭ培地中に浮遊させ、細胞数を計測した後、この脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１株を遠心管内で混合する。遠心分離後、上清を除去し、ＤＭＥＭ培地で洗浄する。再度遠心し上清を完全に除去した後、ポリエチレングリコール(PEG)６０００およびＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ培地を加える。遠心洗浄を行い、上清を除いた後マウス骨髄腫細胞の数を調整し、ウシ胎児血清(FCS)を含むＤＭＥＭ培地を加える。３７℃１日間培養し、翌日、細胞を回収し洗浄後、マウス骨髄腫細胞数を調整し、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン(ＨＡＴ)を含む１５％ＦＣＳ・ＤＭＥＭ培地を加える。９６ウェルプレートに分注し３７℃で１０〜１４日培養してハイブリドーマのみを増殖させる。ＥＬＩＳＡ法により目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング後、４８ウェルプレートに陽性クローンを移しアミノプテリンを含まない１５％ＦＣＳ／ＨＴ／ＤＭＥＭ培地を加え培養を続ける。
Cell fusion After final immunization, the spleen is removed and dispersed into individual cells in DMEM medium. After centrifugation, DMEM medium is added to suspend splenocytes, and lysis buffer is added to lyse the red blood cells. After centrifugal washing again, the suspension is suspended in DMEM medium and the number of cells is counted. Then, the spleen cells and mouse myeloma cell P3U1 strain are mixed in a centrifuge tube. After centrifugation, the supernatant is removed and washed with DMEM medium. After centrifugation again to remove the supernatant completely, a DMEM medium containing polyethylene glycol (PEG) 6000 and DMSO is added. After centrifugal washing and removing the supernatant, the number of mouse myeloma cells is adjusted, and DMEM medium containing fetal calf serum (FCS) is added. After culturing at 37 ° C. for 1 day, the cells are collected and washed the next day, the number of mouse myeloma cells is adjusted, and 15% FCS / DMEM medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT) is added. Dispense into 96-well plates and incubate at 37 ° C. for 10-14 days to grow only hybridomas. After screening for a hybridoma producing the desired antibody by ELISA, positive clones are transferred to a 48-well plate, and 15% FCS / HT / DMEM medium containing no aminopterin is added to continue the culture.
細胞が十分発育した後、再度ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行い、陽性クローンについて限界希釈法を用いたクローニングを行う。このスクリーニングとクローニングを２〜３回行い、単一クローン化する。その結果、ノロウイルスＧＩに共通のアミノ酸配列に対する抗体を産生するハイブリドーマを得る。 After the cells are sufficiently grown, screening by ELISA is performed again, and positive clones are cloned using the limiting dilution method. This screening and cloning is performed 2-3 times to make a single clone. As a result, a hybridoma that produces an antibody against an amino acid sequence common to Norovirus GI is obtained.
モノクローナル抗体の作製法
得られたハイブリドーマを約１週間培養を行う。培養後、培地を遠心し上清を分離後、硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度となるように加え、塩析を行う。一晩静置後、遠心し、上清を捨て、沈殿をＰＢＳで溶解しＰＢＳで透析する。これをアフィニティークロマトグラフィーで精製しノロウイルスＧＩ株共通のアミノ酸配列に対する精製抗体を得る。
Method for producing monoclonal antibody The obtained hybridoma is cultured for about 1 week. After culturing, the medium is centrifuged to separate the supernatant, and then ammonium sulfate is added to a 50% saturation concentration to carry out salting out. After standing overnight, the mixture is centrifuged, the supernatant is discarded, and the precipitate is dissolved in PBS and dialyzed against PBS. This is purified by affinity chromatography to obtain a purified antibody against the amino acid sequence common to the Norovirus GI strain.
上記のモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡに用いる。通常のＥＬＩＳＡ(エンザイムイムノアッセイ：酵素免疫測定法、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ)および蛍光ＥＬＩＳＡ(ＦＥＬＩＳＡ)であってもよい。好ましくは、蛍光ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡの標識、基質、酵素なとの組合せは適宜決定する。 The above monoclonal antibody is used for ELISA. Normal ELISA (enzyme immunoassay: enzyme immunoassay, EIA or ELISA) and fluorescent ELISA (FELISA) may be used. A fluorescence ELISA is preferable. The combination of ELISA label, substrate, and enzyme is appropriately determined.
例えば、サンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステムの検出系として、まずプレートにモノクローナル抗体を固相化する。ブロッキング後、検体を反応させる。その後ビオチン標識をしたマウスモノクローナル抗体又はウサギポリクローナル抗体を反応させ、アビジン標識したガラクトシダーゼまたはペルオキシダーゼを反応させ、最後に基質溶液(例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドまたはo−フェニレンジアミン)を加える。これを蛍光ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで各ウェルの蛍光強度を測定する(図１参照)。ブロッキング剤としては、例えばウシ血清アルブミンやスキムミルクを用いる。また、アビジン−ビオチン結合を介さずにペルオキシダーゼ標識をした抗体を用いることもできる。 For example, as a detection system of a sandwich fluorescence ELISA system, a monoclonal antibody is first immobilized on a plate. After blocking, the sample is reacted. Thereafter, a mouse monoclonal antibody or rabbit polyclonal antibody labeled with biotin is reacted, avidin-labeled galactosidase or peroxidase is reacted, and finally a substrate solution (for example, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside or o-phenylenediamine is reacted). ) Is added. The fluorescence intensity of each well is measured with a fluorescence ELISA microplate reader (see FIG. 1). As the blocking agent, for example, bovine serum albumin or skim milk is used. Alternatively, an antibody labeled with peroxidase without using an avidin-biotin bond can be used.
上記の蛍光ＥＬＩＳＡシステムの検出系を適当なキットのパーツとし、キットとして調製する。 Prepare the detection system of the above-mentioned fluorescence ELISA system as a part of an appropriate kit.
以下、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、単に説明のためであって、本発明を制限するものではない。
実施例１
抗ＮＶカプシド蛋白モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製
Ａ−１．マウスモノクローナル抗体の作製
合成ペプチドＫＬＨ−Cys Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp(配列番号２)を免疫原とし、抗原量をマウス1匹あたり20μg、アジュバントはRIBI Adjuvant System R‐700を用いて腹腔接種により約3週間隔で免疫を行った。抗体価が上昇したマウスの脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールを用いて常法により細胞融合を行った。ＥＬＩＳＡによる陽性抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング後、限界希釈法により2〜3回クローニングを行った。クローニングを行った抗体産生ハイブリドーマを無血清培地で大量培養し、アフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体を精製した。一部はビオチン標識を行った。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, it is only for description and it does not restrict | limit this invention.
Example 1
Preparation of anti-NV capsid protein monoclonal and polyclonal antibodies A-1. Preparation of mouse monoclonal antibody Synthetic peptide KLH-Cys Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp (SEQ ID NO: 2) is used as an immunogen, the antigen amount is 20 μg per mouse, and the adjuvant is RIBI Adjuvant System R-700 Immunization was performed at intervals of about 3 weeks by intraperitoneal inoculation using Spleen cells and myeloma cells of mice with increased antibody titers were fused with polyethylene glycol by a conventional method. After screening positive antibody-producing hybridomas by ELISA, cloning was performed 2-3 times by the limiting dilution method. The cloned antibody-producing hybridoma was cultured in a large amount in a serum-free medium, and the monoclonal antibody was purified by affinity chromatography. Some were labeled with biotin.
ノロウイルスＧＩ株のエピトープとなりうるアミノ酸配列のうち株特異的領域より設計した合成ペプチドを用いて免疫したマウスにおいては、3回目の免疫後、抗体価が十分上昇したマウスを用いて細胞融合を行った(表１)。
その結果複数のハイブリドーマを得た。それぞれのハイブリドーマから産生される抗体を合成ペプチドと反応させたところ、認識するクローン1株で最も良好な反応を示した。このクローンを大量培養後、抗体を精製しサンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステム構築の検討を行うことにした。
As a result, a plurality of hybridomas were obtained. When the antibody produced from each hybridoma was reacted with a synthetic peptide, the
Ａ−２．ウサギポリクローナル抗体の作製
合成ペプチドを免疫原とし、抗原量をウサギ1羽あたり50μg、アジュバントはRIBI Adjuvant System R−730を用いて皮下接種により約4週間隔で免疫を行った。抗体価が上昇したウサギから全採血を行った。採血後、血清を分離し、カプリル酸法でIgG精製を行い、その一部は下記の実施例２ Ｂ−２．に記載のようにビオチン標識を行った。
A-2. Preparation of Rabbit Polyclonal Antibody Immunization was performed at intervals of about 4 weeks by subcutaneous inoculation using a synthetic peptide as an immunogen, an antigen amount of 50 μg per rabbit, and an adjuvant using RIBI Adjuvant System R-730. Whole blood was collected from rabbits with increased antibody titers. After blood collection, serum is separated and IgG is purified by the caprylic acid method, a part of which is described in Example 2 B-2. Biotin labeling was performed as described in.
ノロウイルスＧＩ株の共通配列より設計した合成ペプチドを用いて免疫したウサギは4回目の免疫後ブースターを行い、全採血した(表２)。
実施例２
二次抗体のペルオキシダーゼ標識
Ｂ−１．マウスモノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識
実施例１のＡ−１で作製したマウスモノクローナル抗体0.2ml（1.14mg/ml）をPeroxidase labeling kit-SHを使用してペルオキシダーゼ標識した。
Example 2
Peroxidase labeling of secondary antibody B-1. Peroxidase labeling of mouse monoclonal antibody 0.2 ml (1.14 mg / ml) of mouse monoclonal antibody prepared in A-1 of Example 1 was labeled with peroxidase using Peroxidase labeling kit-SH.
ペルオキシダーゼ標識したマウスモノクローナル抗体を約0.2ml（1.3mg/ml）作製した。 About 0.2 ml (1.3 mg / ml) of peroxidase-labeled mouse monoclonal antibody was prepared.
Ｂ−２．ウサギポリクローナル抗体のビオチン標識
実施例１のＡ−２で作製したウサギポリクローナル抗体1ml（1.39mg/ml）を炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.5)で一晩透析し、Bradford法でタンパク定量を行った。その後、超純水で溶解したEZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotinを抗体1ml（1.28mg/ml）に128μl（64μg）（50μg ビオチン：１mg 抗体）混和した。氷上で2時間放置後、PBS（pH7.4）で4℃一晩透析した。
B-2. Biotin labeling of rabbit
約60mlの血清よりビオチン標識したウサギポリクローナル抗体を約1ml（0.98mg/ml）作製した。 About 1 ml (0.98 mg / ml) of a rabbit polyclonal antibody labeled with biotin was prepared from about 60 ml of serum.
実施例３
抗NV GＩマウスモノクローナル抗体、抗NV GＩウサギポリクローナル抗体のペプチドとの反応確認
ELISAプレートにPBSで1μg/mLに調製した合成ペプチドを37℃2時間固相化した。ブロッキング剤として1%スキムミルクを用いて4℃で一晩ブロッキングした。ノロウイルス患者便からのウイルス抽出液をサンプルとして用いた。ペルオキシダーゼ標識抗NV GＩマウスモノクローナル抗体及び、ビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体をPBSで5μg/mLから2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01となるように希釈し37℃で2時間反応させた。ビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を反応させたプレートにはアビジン標識ペルオキシダーゼを37℃1時間反応させた。基質(o−フェニレンジアミン)を37℃30分反応させ、マイクロプレートリーダーで測定した。
Example 3
Confirmation of reaction of anti-NV GI mouse monoclonal antibody and anti-NV GI rabbit polyclonal antibody with peptide
A synthetic peptide prepared to 1 μg / mL with PBS was immobilized on an ELISA plate at 37 ° C. for 2 hours. Blocking was performed overnight at 4 ° C. using 1% skim milk as a blocking agent. A virus extract from Norovirus patient stool was used as a sample. Peroxidase-labeled anti-NV GI mouse monoclonal antibody and biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody were diluted with PBS from 5 μg / mL to 2.5, 1.25, 0.63, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01. For 2 hours. The plate reacted with the biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody was reacted with avidin-labeled peroxidase at 37 ° C. for 1 hour. The substrate (o-phenylenediamine) was reacted at 37 ° C. for 30 minutes and measured with a microplate reader.
結果
ペルオキシダーゼ標識抗NV GＩマウスモノクローナル抗体は、0.01μg/mLまで良好な結果が得られた。ビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体は0.32μg/mLまで反応が見られた(図２)。
Results The peroxidase-labeled anti-NV GI mouse monoclonal antibody gave good results up to 0.01 μg / mL. Biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody showed a reaction up to 0.32 μg / mL (FIG. 2).
ノロウイルスGＩ検出ELISA
ＥＬＩＳＡプレートに抗NV GＩマウスモノクローナル抗体をPBSで5μg/mlに調製し、4℃で一晩固相化した。ブロッキング剤として1%スキムミルクを用いて、37℃2時間で反応を行った。サンプルとして、ノロウイルス患者便からのウイルス抽出液をPBSでウイルス量が10、102、103、104、105/wellとなるように調製したものを用いた。37℃で2時間反応させた。PBSで500ng/mLに調製したペルオキシダーゼ標識抗NV GＩマウスモノクローナル抗体、又はビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を37℃2時間反応させた。ビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を反応させたプレートにはアビジン標識ペルオキシダーゼを37℃1時間反応させた。基質(o−フェニレンジアミン)を37℃30分反応させた後、プレートリーダーで測定した。
Norovirus GI detection ELISA
Anti-NV GI mouse monoclonal antibody was prepared at 5 μg / ml in PBS on an ELISA plate and immobilized at 4 ° C. overnight. The reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours using 1% skim milk as a blocking agent. As a sample, a viral extract from Norovirus patients flights use was prepared as viral load in PBS is 10,10 2, 10 3, 10 4 , 10 5 / well. The reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. Peroxidase-labeled anti-NV GI mouse monoclonal antibody or biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody prepared at 500 ng / mL in PBS was reacted at 37 ° C. for 2 hours. The plate reacted with the biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody was reacted with avidin-labeled peroxidase at 37 ° C. for 1 hour. Substrate (o-phenylenediamine) was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then measured with a plate reader.
結果
検出抗体に抗NV GＩマウスモノクローナル抗体、抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を使用した場合、共に105粒子/wellで吸光度の値が高く検出された(図３)。
Results Detection antibody anti NV GI mouse monoclonal antibody, when using anti-NV GI rabbit polyclonal antibody, the absorbance value was detected high at both 10 5 particles / well (Figure 3).
抗NV GＩマウスモノクローナル抗体、抗NV GＩウサギポリクローナル抗体とジェノタイプとの反応確認
ELISAプレートに5μg/mLに調製した抗NV GＩマウスモノクローナル抗体を4℃一晩固相化した。1%スキムミルクを37℃1時間反応させブロッキングした。ノロウイルスGＩのジェノタイプが判っている患者便抽出ウイルス液をサンプルとしてGＩ/1、GＩ/9、GＩ/12の３種を105粒子/wellに調製し、37℃2時間反応させた。対照としてGII患者便抽出ウイルス液を同様に反応させた。次に500ng/mLに調製したペルオキシダーゼ標識抗NV GＩマウスモノクローナル抗体又はビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を37℃2時間反応させた。ビオチン標識抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を反応させたプレートにはアビジン標識ペルオキシダーゼを37℃1時間反応させた。基質(o−フェニレンジアミン)を反応させた後マイクロプレートリーダーで測定した。
Confirmation of anti-NV GI mouse monoclonal antibody, anti-NV GI rabbit polyclonal antibody and genotype
Anti-NV GI mouse monoclonal antibody prepared at 5 μg / mL was immobilized on an ELISA plate at 4 ° C. overnight. 1% skim milk was reacted at 37 ° C. for 1 hour for blocking. Three types of GI / 1, GI / 9, and GI / 12 were prepared at 10 5 particles / well using a patient stool extract virus solution with known genotype of Norovirus GI, and reacted at 37 ° C. for 2 hours. As a control, GII patient fecal extract virus solution was reacted in the same manner. Next, peroxidase-labeled anti-NV GI mouse monoclonal antibody or biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody prepared at 500 ng / mL was reacted at 37 ° C. for 2 hours. The plate reacted with the biotin-labeled anti-NV GI rabbit polyclonal antibody was reacted with avidin-labeled peroxidase at 37 ° C. for 1 hour. The substrate (o-phenylenediamine) was reacted and then measured with a microplate reader.
結果
検出抗体に抗NV GＩマウスモノクローナル抗体、抗NV GＩウサギポリクローナル抗体を反応させた場合共に対照として反応させたGIIの吸光度は低く検出された。サンプルとして反応させたノロウイルスGＩの各ジェノタイプは発色も見られ、明らかに反応しているのが確認された(図４)。この抗体はノロウイルスGＩカプシド領域のアミノ酸配列で共通部分を合成ペプチドとして作製し、それを免疫原として作製した抗体であるため、ジェノタイプに関係なくノロウイルスGＩと反応することを確認することができた(図４)。
Results When anti-NV GI mouse monoclonal antibody and anti-NV GI rabbit polyclonal antibody were reacted with the detection antibody, the absorbance of GII reacted as a control was detected low. Each norovirus GI genotype reacted as a sample also showed color development, confirming that it was clearly reacting (FIG. 4). Since this antibody is an antibody produced by using the amino acid sequence of the Norovirus GI capsid region as a synthetic peptide and the common part as a synthetic peptide, it was confirmed that it reacted with Norovirus GI regardless of genotype. (Figure 4).
ノロウイルスGＩ検出ＥＬＩＳＡと蛍光ＥＬＩＳＡの比較
ＥＬＩＳＡプレートに抗NV GＩマウスモノクローナル抗体をPBSで5μg/mlに調製し、4℃で一晩固相化した。ブロッキング剤は1%スキムミルクを用いて、1時間37℃で行い、サンプルは患者便ウイルス抽出液をPBSでウイルス量が10、102、103、104、105/wellとなるように調製し、37℃で2時間反応させた。対照としてGII患者便抽出ウイルス液を同様に反応させた。ビオチン標識抗体はマウスモノクローナル抗体を500ng/mlに調製し37℃で2時間反応させた。酵素はβ-ガラクトシダーゼ-アビジン、基質は4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシドを用いて検討を行った。
Comparison of Norovirus GI Detection ELISA and Fluorescence ELISA Anti-NV GI mouse monoclonal antibody was prepared at 5 μg / ml in PBS on an ELISA plate and immobilized at 4 ° C. overnight. The blocking agent is 1% skim milk for 1 hour at 37 ° C. Samples of patient stool virus extract are prepared with PBS so that the viral load is 10, 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 / well And allowed to react at 37 ° C. for 2 hours. As a control, GII patient fecal extract virus solution was reacted in the same manner. As a biotin-labeled antibody, a mouse monoclonal antibody was prepared at 500 ng / ml and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The examination was performed using β-galactosidase-avidin as the enzyme and 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside as the substrate.
結果
蛍光ＥＬＩＳＡでは対照として反応させたGIIの蛍光強度は若干高く測定されたが、患者便抽出ウイルス液を反応させたwellでは104粒子/wellから対照と差が見られた(図５)。
Results In fluorescence ELISA, the fluorescence intensity of GII reacted as a control was measured to be slightly higher, but in the well reacted with the patient fecal extract virus solution, a difference from the control was observed from 10 4 particles / well (FIG. 5).
考察
サンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステムの検出系として、まずプレートにモノクローナル抗体を固相化する。ブロッキング後、サンプルとなるウイルス抽出液を反応させる。その後ビオチン標識をしたマウスモノクローナル抗体又はウサギポリクローナル抗体を反応させ、アビジン標識ガラクトシダーゼを反応させる。最後に基質溶液である4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトシドを加える。これを蛍光ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで各wellの蛍光強度を測定する。通常のＥＬＩＳＡと蛍光ＥＬＩＳＡを比較してわかるように、蛍光ＥＬＩＳＡの方が感度がよく、ウイルスが低濃度でも検出が可能ということがわかった。
Discussion As a detection system of the sandwich fluorescence ELISA system, first, a monoclonal antibody is immobilized on a plate. After blocking, the sample virus extract is reacted. Thereafter, mouse monoclonal antibody or rabbit polyclonal antibody labeled with biotin is reacted, and avidin-labeled galactosidase is reacted. Finally, the substrate solution 4-methylumbelliferyl β-D-galactoside is added. The fluorescence intensity of each well is measured with a fluorescence ELISA microplate reader. As can be seen by comparing a normal ELISA and a fluorescence ELISA, it was found that the fluorescence ELISA is more sensitive and can be detected even at a low concentration of virus.
本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によれば、迅速、簡便かつ高感度で食品からノロウイルスＧＩを検出することができ、食中毒の被害を最小限にとどめることができる。本発明の検出システムは、ノロウイルスＧＩが魚介類に含まれている場合が多いことから、生鮮食品の微生物検査を行う機関などでの活用でき、また、食品検査だけでなく検便検査としても使用可能である。 According to the ELISA method using the monoclonal or polyclonal antibody of the present invention, norovirus GI can be detected from foods quickly, conveniently and with high sensitivity, and the damage of food poisoning can be minimized. Since the detection system of the present invention often contains norovirus GI in fish and shellfish, it can be used in institutions that perform microbial testing of fresh foods, and can be used not only for food testing but also for stool testing. It is.
Claims (9)
Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Aspを含むペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体。 The following sequence:
A monoclonal or polyclonal antibody against a peptide containing Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp.
A monoclonal antibody produced by the hybridoma of claim 9.
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