JP2896605B2 - 新しいペプチド基質,調整法及びプロティンc定量における用途 - Google Patents
新しいペプチド基質,調整法及びプロティンc定量における用途Info
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は新工業製品として、下記の式Iのペプチド基
質及びそれらの付加塩に関するものである。
質及びそれらの付加塩に関するものである。
これは更に、これら新製品の調整法ならびに、プロテ
ィンCの定量の分野でのそれらの用途に関するものであ
る。
ィンCの定量の分野でのそれらの用途に関するものであ
る。
先行技術 公知の如く、多くのペプチド基質が、止血の継続機構
に含まれる多くの物質の識別と分析のため既に過去にお
いて提言されている。
に含まれる多くの物質の識別と分析のため既に過去にお
いて提言されている。
特に公知の如く、下記の基質 〔ここにPryはピログルタミニル残基(すなわち5−オ
キソプロリルまたはピロリジン−2−1−5−カルボニ
ル)でありpNAはp−ニトロアニリン基である〕はヨー
ロッパ公開特許公報0004256に、セリンプロテアーゼやS
Hプロテアーゼの定量用のクロモゲン基質として記述さ
れていて、最近、プロティンCの定量に効果があること
が立証された。
キソプロリルまたはピロリジン−2−1−5−カルボニ
ル)でありpNAはp−ニトロアニリン基である〕はヨー
ロッパ公開特許公報0004256に、セリンプロテアーゼやS
Hプロテアーゼの定量用のクロモゲン基質として記述さ
れていて、最近、プロティンCの定量に効果があること
が立証された。
また、公知のように、下記の基質 は既にプロティンCの定量の分野で使用されているが、
その効果は前記の化合物II aの効果に劣る。
その効果は前記の化合物II aの効果に劣る。
発明の目的 従って、プロティンCの定量用としては、特定のペプ
チド基質が必要である。実際、前記の基質II aとII bを
除いて、市販で入手できるプロティンC用の他の特定基
質はない。
チド基質が必要である。実際、前記の基質II aとII bを
除いて、市販で入手できるプロティンC用の他の特定基
質はない。
この要求に応えるため、本発明によれば、先行技術で
公知の式II aとII bによる前記物質の構造とは異なる構
造を有するペプチド基質を用いる新しい技術的解決策が
提案されている。
公知の式II aとII bによる前記物質の構造とは異なる構
造を有するペプチド基質を用いる新しい技術的解決策が
提案されている。
発明の主題 本発明の第一の特徴によれば、下記からなる基から選
ぶペプチド基質が、新しい工業的製品として推奨され
る。
ぶペプチド基質が、新しい工業的製品として推奨され
る。
(i)次式によるトリペプチド ここに、YはHまたはN−末端基を保護する適当な基
であり、 A1は(2−オキソチアゾリジン−4−イル)カルボニ
ル〔THCと略す〕,(2−オキソテトラヒドロ−1,3−チ
アジン−5−イル)カルボニル〔TZCと略する〕,チア
ゾリジン−4−カルボニル〔ATCと略する〕,及び(テ
トラヒドロ−1,3−チアジン−5−イル)カルボニル〔A
ZCと略す〕残基からなる基から選定したアミノ酸残基で
あり、 A2は残基Pro,3Hyp及び4Hypからなる基から選んだアミ
ノ酸残基であり、ここに3Hypと4HypのOH側基がエーテル
またはエステル保護基で保護することができる。
であり、 A1は(2−オキソチアゾリジン−4−イル)カルボニ
ル〔THCと略す〕,(2−オキソテトラヒドロ−1,3−チ
アジン−5−イル)カルボニル〔TZCと略する〕,チア
ゾリジン−4−カルボニル〔ATCと略する〕,及び(テ
トラヒドロ−1,3−チアジン−5−イル)カルボニル〔A
ZCと略す〕残基からなる基から選定したアミノ酸残基で
あり、 A2は残基Pro,3Hyp及び4Hypからなる基から選んだアミ
ノ酸残基であり、ここに3Hypと4HypのOH側基がエーテル
またはエステル保護基で保護することができる。
A3はArgとLys残基からなる基から選んだアミノ酸残基
であり、また、 Rは標識手段であり、かつ、 (ii)これらの付加塩類。
であり、また、 Rは標識手段であり、かつ、 (ii)これらの付加塩類。
本発明の第二の特徴によれば、プロティンCの定量の
ため式Iのトリペプチド化合物及びそれらの付加塩類を
用いることが推奨される。この目的で、プロティンCの
分析すなわち確認のための一つの定量法が推奨される
が、これは、式Iのトリペプチドまたはその付加塩類の
一つを体液(特に、プラズマまたは血清、または尿)ま
たは、プロティンCを含むであろう天然または合成系
の、任意の別のサンプルと接触させることからなってい
る。
ため式Iのトリペプチド化合物及びそれらの付加塩類を
用いることが推奨される。この目的で、プロティンCの
分析すなわち確認のための一つの定量法が推奨される
が、これは、式Iのトリペプチドまたはその付加塩類の
一つを体液(特に、プラズマまたは血清、または尿)ま
たは、プロティンCを含むであろう天然または合成系
の、任意の別のサンプルと接触させることからなってい
る。
最後に、本発明の第三の特徴によれば、式Iのトリペ
プチド化合物、及びそれらの付加塩類の調整法が推奨さ
れる。
プチド化合物、及びそれらの付加塩類の調整法が推奨さ
れる。
略号 便利のために、本発明では下記の略号を使用してい
る。
る。
−アミノ酸残基: Arg=アルギニル ATC=チアゾリジン−4−カルボニル(またはチオプロ
リル) AZC=(テトラヒドロ−1,3−チアジン−5−イル)カル
ボニル 3Hyp=3−ヒドロキシプロリル(または3−ヒドロキシ
ピロリジン−2−カルボニル) 4Hyp=4−ヒドロキシプロリル(または4−ヒドロキシ
ピロリジン−2−カルボニル) Lys=リシル Pro=プロリル Pyr=ピログルタミニル(またはピロリジン−2−1−
カルボニル) THC=2−オキソチアゾリジン−4−イル)カルボニル TZC=(2−オキソテトラヒドロ−1,3−チアジン−5−
イル)カルボニル −他の略号としては: Ac=アセチル AcOH=醋酸 Adoc=アダマンチルオキソカルボニル Aoc=t−アミルオキシカルボニル Boc=t−ブトキンカルボニル Bop=(ベンゾトリアゾル−1−イル)オキシトリス
(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホス
フエート(別名:カストロ試薬)で式は下記の通りであ
る。
リル) AZC=(テトラヒドロ−1,3−チアジン−5−イル)カル
ボニル 3Hyp=3−ヒドロキシプロリル(または3−ヒドロキシ
ピロリジン−2−カルボニル) 4Hyp=4−ヒドロキシプロリル(または4−ヒドロキシ
ピロリジン−2−カルボニル) Lys=リシル Pro=プロリル Pyr=ピログルタミニル(またはピロリジン−2−1−
カルボニル) THC=2−オキソチアゾリジン−4−イル)カルボニル TZC=(2−オキソテトラヒドロ−1,3−チアジン−5−
イル)カルボニル −他の略号としては: Ac=アセチル AcOH=醋酸 Adoc=アダマンチルオキソカルボニル Aoc=t−アミルオキシカルボニル Boc=t−ブトキンカルボニル Bop=(ベンゾトリアゾル−1−イル)オキシトリス
(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホス
フエート(別名:カストロ試薬)で式は下記の通りであ
る。
Bu=n−ブチル Bz=ベンゾイル Bzl=ベンジル Cho=カルボベンゾキシ o−Cl−pNA=o−クロロ−p−ニトロアニリノ〔また
は(2−Cl)pNA〕 DCCI=シサイクロヘキシルカルボジイミド DIEA=ジイソプロピルエチルアミン DMF=ジメチルフオルムアミド Et=エチル Et3N=トリエチルアミン Eto=エトキシ Fmoc=フルオレン−9−イルメトキシカルボニル Foc=フルフリルオキシカルボニル HMPT=N,N,N′,N′,N″,N″−ヘキサメチルホスホロト
リアミド HOBT=1−ヒドロキシベンゾトリアゾル HPLC=高性能液体クロマトグラフィ H−TFA=三弗化醋酸(またはHTFA) Iboc=イソボルニルオキシカルボニル iPr=イソプロピル Me=メチル MW=分子量 OD=光学密度 Ph=フエニル pH=H+イオン濃度の余対数 pNA=p−ニトロアニリノ〔または(4−NO2)C6H4NH〕 Pr=n−プロピル RT=室温(15−20℃) tBu=t−ブチル THF=テトラヒドロフラン TLC=薄層クロマトグラフィー Tos=p−トルエンスルホニル(ないしトシル) Z=ベンジルオキシカルボニル Z(p−Cl)=p−クロロベンジルオキシカルボニル Z(p−OMe)=p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル 発明の詳細な説明 上記の式Iにおいて、アミノ酸残基A1は次の構造式で
代表することができる。すなわち ここに、Bは単結合ないしCH2基であり、 また、XはCH2ないしCOである。
は(2−Cl)pNA〕 DCCI=シサイクロヘキシルカルボジイミド DIEA=ジイソプロピルエチルアミン DMF=ジメチルフオルムアミド Et=エチル Et3N=トリエチルアミン Eto=エトキシ Fmoc=フルオレン−9−イルメトキシカルボニル Foc=フルフリルオキシカルボニル HMPT=N,N,N′,N′,N″,N″−ヘキサメチルホスホロト
リアミド HOBT=1−ヒドロキシベンゾトリアゾル HPLC=高性能液体クロマトグラフィ H−TFA=三弗化醋酸(またはHTFA) Iboc=イソボルニルオキシカルボニル iPr=イソプロピル Me=メチル MW=分子量 OD=光学密度 Ph=フエニル pH=H+イオン濃度の余対数 pNA=p−ニトロアニリノ〔または(4−NO2)C6H4NH〕 Pr=n−プロピル RT=室温(15−20℃) tBu=t−ブチル THF=テトラヒドロフラン TLC=薄層クロマトグラフィー Tos=p−トルエンスルホニル(ないしトシル) Z=ベンジルオキシカルボニル Z(p−Cl)=p−クロロベンジルオキシカルボニル Z(p−OMe)=p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル 発明の詳細な説明 上記の式Iにおいて、アミノ酸残基A1は次の構造式で
代表することができる。すなわち ここに、Bは単結合ないしCH2基であり、 また、XはCH2ないしCOである。
式IIIの対(B;X)が(−;CO),(CH2;CO),(−;CH
2)ないし(CH2;CH2)である場合、A1は夫々THC,TZC,AT
C、またはAZCである。
2)ないし(CH2;CH2)である場合、A1は夫々THC,TZC,AT
C、またはAZCである。
本発明によれば、アミノ酸残基A1はDまたはLの形態
を有するか、または、別途、これら2形態のラセミ混合
物(DL)であるだろう。A1は好ましくはD−THC,D−TZ
C,D−ATC及びD−AZCであるだろうし、更に好ましく
は、L−THC,L−TZC,L−ATC及びL−AZCであるだろう。
本発明によれば最も貴重と考えられるアミノ酸残基A1は
L−THCである。
を有するか、または、別途、これら2形態のラセミ混合
物(DL)であるだろう。A1は好ましくはD−THC,D−TZ
C,D−ATC及びD−AZCであるだろうし、更に好ましく
は、L−THC,L−TZC,L−ATC及びL−AZCであるだろう。
本発明によれば最も貴重と考えられるアミノ酸残基A1は
L−THCである。
水素原子と、ヨーロッパ公開特許公報0110306,米国特
許公開4480030,仏国公開特許公報2293439及び米国特許
公報4440678に記述されているもののようなペプチドの
N−末端基をブロックする基とは適当なY基に属すると
いえよう。下記のものは、特にH以外に、当該N−末端
基をブロックするY基に属するといえよう。すなわち、
C1−C4アルキル基(特に、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBu)、置
換または非置換アリル基(特に、Ph,トリル、キシリ
ル、クロロフェニル,トリフルオロメチルフェニル,メ
トキシフェニル)、置換または非置換アラルキル基(特
に、Bzl,クロロベンジル、ジクロロベンジル,トリフル
オロメチルベンジル,ジフルオロベンジル,メトキシベ
ンジル,エトキシベンジル,3,4−メチレンジオキシベン
ジル)及び従来のペプチドのN−末端基用の保護基〔特
に、Ac,Tos,Adoc,Aoc,Bz,Cbo,Fmoc,Foc,Iboc,Z,Z(p−
Cl)及びZ(p−OMe)〕。
許公開4480030,仏国公開特許公報2293439及び米国特許
公報4440678に記述されているもののようなペプチドの
N−末端基をブロックする基とは適当なY基に属すると
いえよう。下記のものは、特にH以外に、当該N−末端
基をブロックするY基に属するといえよう。すなわち、
C1−C4アルキル基(特に、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBu)、置
換または非置換アリル基(特に、Ph,トリル、キシリ
ル、クロロフェニル,トリフルオロメチルフェニル,メ
トキシフェニル)、置換または非置換アラルキル基(特
に、Bzl,クロロベンジル、ジクロロベンジル,トリフル
オロメチルベンジル,ジフルオロベンジル,メトキシベ
ンジル,エトキシベンジル,3,4−メチレンジオキシベン
ジル)及び従来のペプチドのN−末端基用の保護基〔特
に、Ac,Tos,Adoc,Aoc,Bz,Cbo,Fmoc,Foc,Iboc,Z,Z(p−
Cl)及びZ(p−OMe)〕。
H以外のY基は下記の2反応略図の一つに従って、式
Iのトリペプチド内に持込まれる。
Iのトリペプチド内に持込まれる。
図A ここにA1のCO末端基に結合されたOH基(カルボキシル
酸基の)はもし適当であれば、保護される。また、 図B 図Aを選ぶかBを選ぶかはブロッキンググループの性
質(i)ならびにA1の環の位置3にあるN−末端基の水
素原子の活性(ii)次第である。このことを念頭におい
て、A1がTHCまたはTZCである場合は、図Aを用いる方が
好ましいだろう。
酸基の)はもし適当であれば、保護される。また、 図B 図Aを選ぶかBを選ぶかはブロッキンググループの性
質(i)ならびにA1の環の位置3にあるN−末端基の水
素原子の活性(ii)次第である。このことを念頭におい
て、A1がTHCまたはTZCである場合は、図Aを用いる方が
好ましいだろう。
更に、THCとAZCの環は一般には高温での環化によって
求められるので、環化はH以外の基Yの存在によって摂
動されるしかつ/または収率が低下するし、特に、熱分
解反応機構においては、Y=アルキル,アリルまたはア
ラルキルである。すなわち したがって有利なのは、熱分解によって、酸H−THC
−OHとH−AZC−OHを調整し、次に前記の図Aに従って
N−末端基のH原子を置換してYがH以外である式Iの
化合物を得るようにすることである。
求められるので、環化はH以外の基Yの存在によって摂
動されるしかつ/または収率が低下するし、特に、熱分
解反応機構においては、Y=アルキル,アリルまたはア
ラルキルである。すなわち したがって有利なのは、熱分解によって、酸H−THC
−OHとH−AZC−OHを調整し、次に前記の図Aに従って
N−末端基のH原子を置換してYがH以外である式Iの
化合物を得るようにすることである。
本発明による好ましい基Yはである。早い話が、基Y
=Hはもし、プロティンCに対する基質Y−A1−A2−A3
−Rの特異性がこのような置換によって本質的に強化さ
れるなら、かつ、そうしさえすれば、H以外のY基で置
換されるだろう。
=Hはもし、プロティンCに対する基質Y−A1−A2−A3
−Rの特異性がこのような置換によって本質的に強化さ
れるなら、かつ、そうしさえすれば、H以外のY基で置
換されるだろう。
上に示したように、3Hyp及び4HypのOH側基はエーテル
またはエステルの形で保護することができる。当該OH基
のH原子を置換する保護基は特にC1−C4アルキル基(特
に、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBu)または置換または非置換ア
リル基(特に、Ph,トリル,キシリル,クロロフェニ
ル,トリフルオロメチルフェニル,メトキシフェニル)
または置換または非置換アラルキル基(特にBzl,クロロ
ベンジル,ジフルオロベンジル,トリフルオロメチルベ
ンジル,ジクロロベンジル,メトキシベンジル,エトキ
シベンジル,3,4−メチレンジオキシベンジル)であり、
これはエーテル状の保護という面ではYの定義上考えら
れることであり、あるいは、エステル状の保護という面
では、C2−C5脂肪族アシル基(特にAc,プロピオニル,
ブタノイル,ペンタノイル)または芳香族基(特にBz,
トルオイル,クロロベンゾイル,メトキシベンゾイル,
3,4−メチレンジオキシベンゾイル)であってもよろし
い。もし適当なら、当該H原子も、Tosまたはトリアル
キルシリル基(特に、トリメチルシリルまたはトリエチ
ルシリル)といったようなもので置換してもよい。
またはエステルの形で保護することができる。当該OH基
のH原子を置換する保護基は特にC1−C4アルキル基(特
に、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBu)または置換または非置換ア
リル基(特に、Ph,トリル,キシリル,クロロフェニ
ル,トリフルオロメチルフェニル,メトキシフェニル)
または置換または非置換アラルキル基(特にBzl,クロロ
ベンジル,ジフルオロベンジル,トリフルオロメチルベ
ンジル,ジクロロベンジル,メトキシベンジル,エトキ
シベンジル,3,4−メチレンジオキシベンジル)であり、
これはエーテル状の保護という面ではYの定義上考えら
れることであり、あるいは、エステル状の保護という面
では、C2−C5脂肪族アシル基(特にAc,プロピオニル,
ブタノイル,ペンタノイル)または芳香族基(特にBz,
トルオイル,クロロベンゾイル,メトキシベンゾイル,
3,4−メチレンジオキシベンゾイル)であってもよろし
い。もし適当なら、当該H原子も、Tosまたはトリアル
キルシリル基(特に、トリメチルシリルまたはトリエチ
ルシリル)といったようなもので置換してもよい。
有利には、アミノ酸残基A2とA3の形態はLであろう
し、また、本発明によるA2とA3用の好ましい基はL−Pr
o,L−3Hyp及びL−4Hypで、夫々、L−ArgとL−Lysで
あろう。
し、また、本発明によるA2とA3用の好ましい基はL−Pr
o,L−3Hyp及びL−4Hypで、夫々、L−ArgとL−Lysで
あろう。
標識手段Rは生物学的分析及び微生物学的分析の技術
において公知であり、これに関しては上に引用された先
行技術及び特に、文献米国特許公報4448715が参考にな
る。当該標識手段は、アミノ化基NH−R′からなる基か
ら選定するのが好ましく、これらの基は(i)変色を起
こし、(ii)蛍光変化を起こし、あるいは(iii)少な
くとも1種の放射性元素(例えば、14Cまたは3Hラジオ
アイソトープで標識したアニリン基またはベンジルアミ
ノ基)を含んでいる。酵素反応中または後、検出のため
増幅可能な(例えば、与えられた波長における光学密度
の測定によってまたは放射能の測定によって)信号を与
える任意のアミノ基NH−R′は、本発明の目的にかなっ
ている。高速加水分解における開裂によって得られる物
質H−Rの量は使用酵素の量に比例する。当該H−Rの
量は高度測定、分光測光法、蛍光分光測光法または電気
化学法によって定量可能である。
において公知であり、これに関しては上に引用された先
行技術及び特に、文献米国特許公報4448715が参考にな
る。当該標識手段は、アミノ化基NH−R′からなる基か
ら選定するのが好ましく、これらの基は(i)変色を起
こし、(ii)蛍光変化を起こし、あるいは(iii)少な
くとも1種の放射性元素(例えば、14Cまたは3Hラジオ
アイソトープで標識したアニリン基またはベンジルアミ
ノ基)を含んでいる。酵素反応中または後、検出のため
増幅可能な(例えば、与えられた波長における光学密度
の測定によってまたは放射能の測定によって)信号を与
える任意のアミノ基NH−R′は、本発明の目的にかなっ
ている。高速加水分解における開裂によって得られる物
質H−Rの量は使用酵素の量に比例する。当該H−Rの
量は高度測定、分光測光法、蛍光分光測光法または電気
化学法によって定量可能である。
本発明による、好ましい基Rは発色性の基で、代表的
にはニトロフェニルアミノ基(このフェニル基はCOOH,
H,Cl,Br,CH3,OCH3,CN,CF3及び/またはSO3Hといった基
で置換することができる)あるいは、蛍光発生性の基、
代表的には、ナフチルアミノ基(このナフチル基は、OC
H3,COOH,SO3HまたはCH3基で置換することができる)
や、4−メチルクマリル−7−アミノ,4−トリフルオロ
メチルクマリル−7−アミノ及び類似の基である。
にはニトロフェニルアミノ基(このフェニル基はCOOH,
H,Cl,Br,CH3,OCH3,CN,CF3及び/またはSO3Hといった基
で置換することができる)あるいは、蛍光発生性の基、
代表的には、ナフチルアミノ基(このナフチル基は、OC
H3,COOH,SO3HまたはCH3基で置換することができる)
や、4−メチルクマリル−7−アミノ,4−トリフルオロ
メチルクマリル−7−アミノ及び類似の基である。
本発明により適当な発色性ならびに蛍光発生性のアミ
ノ化基の中から特に下記のものを挙げることができる。
すなわち、p−ニトロアニリン(pNAと略す),2−カル
ボキン−4−ニトロアニリン及び3−カルボキシ−4−
ニトロアニリン,2−ハロゲン−4−ニトロアニリン及び
3−ハロゲン−4−ニトロアニリン(このハロゲンはF,
ClまたはBr),2−メトキシ−5−メチル−4−ニトロア
ニリン,2−ヒドロキシスルホニル−4−ニトロアニリ
ン,4−トリフルオロメチル−2−ニトロアニリン,4−ト
リフルオロメチル−3−ニトロアニリン,4−シアン−2
−ニトロアニリン,メフチル−2−アミノ,4−ヒドロキ
シスルホニルメフチル−1−アミノ,キノリルアミノ,
ニトロキノリルアミノ等である。
ノ化基の中から特に下記のものを挙げることができる。
すなわち、p−ニトロアニリン(pNAと略す),2−カル
ボキン−4−ニトロアニリン及び3−カルボキシ−4−
ニトロアニリン,2−ハロゲン−4−ニトロアニリン及び
3−ハロゲン−4−ニトロアニリン(このハロゲンはF,
ClまたはBr),2−メトキシ−5−メチル−4−ニトロア
ニリン,2−ヒドロキシスルホニル−4−ニトロアニリ
ン,4−トリフルオロメチル−2−ニトロアニリン,4−ト
リフルオロメチル−3−ニトロアニリン,4−シアン−2
−ニトロアニリン,メフチル−2−アミノ,4−ヒドロキ
シスルホニルメフチル−1−アミノ,キノリルアミノ,
ニトロキノリルアミノ等である。
本発明によれば好ましいR基は発色性の基すなわち、
一方ではpNAであり、他方ではpNAのフェニル環が、2ま
たは3の位置において置換され、当該基の式が下記のよ
うなものである類似の基であり、 ここにY′はBr,Cl,F,CF3,COOH,COOW,CONH2,CONHW,CONW
2,CONH(CH2)mNMe2,OHまたはOWである。ここにWはC3
−C6アルキル,C6−C10アリル,C7−C11アラルキル,また
はC3−C6脂環式の基であり、mは値が1から10までの整
数である。
一方ではpNAであり、他方ではpNAのフェニル環が、2ま
たは3の位置において置換され、当該基の式が下記のよ
うなものである類似の基であり、 ここにY′はBr,Cl,F,CF3,COOH,COOW,CONH2,CONHW,CONW
2,CONH(CH2)mNMe2,OHまたはOWである。ここにWはC3
−C6アルキル,C6−C10アリル,C7−C11アラルキル,また
はC3−C6脂環式の基であり、mは値が1から10までの整
数である。
pNA基のフェニル環が置換されている式VIのかような
基は特に、文献ヨーロッパ公開特許公報0110306に記載
されている。
基は特に、文献ヨーロッパ公開特許公報0110306に記載
されている。
本発明による付加塩類は本質的に式Iの化合物を無機
または有機酸と反応させて求めた酸付加塩類である。
または有機酸と反応させて求めた酸付加塩類である。
ここでは推奨されている、本発明実施の最良の態様
は、下記からなる基から選定した基質を使用することに
ある。すなわち、 (a) 下式のトリペプチド化合物、すなわち ここに A1はD−THC,D−TZC,D−ATC,D−AZC,L−THC,L−TZC,L
−ATC,またはL−AZCであり、 A2はL−Pro,L−3HypまたはL−4Hypで A3はL−ArgまたはL−Lysで、また (b) それらの付加塩類 本発明の最良の実施態様においては、更に詳しくは、
アミノ塩残基A1としてL−TZC,L−ATCまたは好ましくは
L−THCを用いることが推奨される。
は、下記からなる基から選定した基質を使用することに
ある。すなわち、 (a) 下式のトリペプチド化合物、すなわち ここに A1はD−THC,D−TZC,D−ATC,D−AZC,L−THC,L−TZC,L
−ATC,またはL−AZCであり、 A2はL−Pro,L−3HypまたはL−4Hypで A3はL−ArgまたはL−Lysで、また (b) それらの付加塩類 本発明の最良の実施態様においては、更に詳しくは、
アミノ塩残基A1としてL−TZC,L−ATCまたは好ましくは
L−THCを用いることが推奨される。
便利のため、下記の記述においては、無形態で言及さ
れているアミノ酸残基(例えばPro)は、別途指示ない
限り、当該アミノ酸残基がL形態(すなわち、問題の例
のL−Pro)を有していることを表わす。
れているアミノ酸残基(例えばPro)は、別途指示ない
限り、当該アミノ酸残基がL形態(すなわち、問題の例
のL−Pro)を有していることを表わす。
全く制限の意味ではなく本発明による幾つかのペプチ
ド化合物を下記の表Iに対照した。
ド化合物を下記の表Iに対照した。
式Iのトリペプチド化合物と、本発明によるそれらの
付加塩類はペプチド合成の従来の反応機構の応用によっ
てそれ自体公知の方法に従って調整することができる。
ここに推奨される調整方法は下式のジペプチド1モルを
反応させることにある。
付加塩類はペプチド合成の従来の反応機構の応用によっ
てそれ自体公知の方法に従って調整することができる。
ここに推奨される調整方法は下式のジペプチド1モルを
反応させることにある。
ここにA2,A3及びRの定義は上に示した通りであり、
下式のアミノ酸1.0ないし1.3モルを含んでおり、 ここにYとA3の定義は上に示した通りでありかつ、T
はOH,F,ClまたはBrである。
下式のアミノ酸1.0ないし1.3モルを含んでおり、 ここにYとA3の定義は上に示した通りでありかつ、T
はOH,F,ClまたはBrである。
有利には、反応VI+V=Iは、0ないし50℃の温度、
特に室温において、不活性溶媒、特にDMFまたはTHF中で
実施される。また、有利な方法は、反応媒体が、共存溶
媒として、かつプロトン受容体として作用するEt3Nまた
はDIEAのような過剰の塩基からなることであろう。当該
反応が行われる際、カプリング剤、特にBopまたはHOBT
も、当該反応媒体に混入されるだろうし、特にTがOHで
ある場合そうであろう。HOBTをカプリング剤として用い
る場合、適量のDCCIを当該剤と結合するのは有利であろ
う。
特に室温において、不活性溶媒、特にDMFまたはTHF中で
実施される。また、有利な方法は、反応媒体が、共存溶
媒として、かつプロトン受容体として作用するEt3Nまた
はDIEAのような過剰の塩基からなることであろう。当該
反応が行われる際、カプリング剤、特にBopまたはHOBT
も、当該反応媒体に混入されるだろうし、特にTがOHで
ある場合そうであろう。HOBTをカプリング剤として用い
る場合、適量のDCCIを当該剤と結合するのは有利であろ
う。
実際上、IV/Et3NまたはIV/DIEAのモル比として1/2な
いし1/4が採用されるだろうし、T=OHの場合、IV/HOBT
またはIV/Bopのモル比として1/1ないし1/5が採用される
だろう。DCCIを使用する場合、IV/DCCIのモル比のオー
ダは1/1.5〜1/2となろう。カプリング剤HOBTとBopの目
的はCO末端基(T=OHの場合)のカルボキシル基COOHを
活性化することであり、また、これらの特長はラセミ化
を起こさないことである。薬剤BopはpH7〜8で使用され
るだろうし、薬剤HOBTはpH5ないし8で使用されるだろ
う。そのカプリング特性に関しては、Bopの方がHOBTよ
りも好まれるだろう。式Iのトリペプチドは、下記の段
階に応じて、反応IV+V=Iの反応媒体から単離され
る。すなわち −真空下で、不活性溶媒を蒸発乾固する。
いし1/4が採用されるだろうし、T=OHの場合、IV/HOBT
またはIV/Bopのモル比として1/1ないし1/5が採用される
だろう。DCCIを使用する場合、IV/DCCIのモル比のオー
ダは1/1.5〜1/2となろう。カプリング剤HOBTとBopの目
的はCO末端基(T=OHの場合)のカルボキシル基COOHを
活性化することであり、また、これらの特長はラセミ化
を起こさないことである。薬剤BopはpH7〜8で使用され
るだろうし、薬剤HOBTはpH5ないし8で使用されるだろ
う。そのカプリング特性に関しては、Bopの方がHOBTよ
りも好まれるだろう。式Iのトリペプチドは、下記の段
階に応じて、反応IV+V=Iの反応媒体から単離され
る。すなわち −真空下で、不活性溶媒を蒸発乾固する。
−エーテル(MeOMeまたはEtoEt)で、出来た蒸発残渣を
沈澱させ、次に濾過によって沈澱物を回収する。
沈澱させ、次に濾過によって沈澱物を回収する。
−最小量のCHCl3/MeOH/Acoh混合物中に濾過した沈澱を
溶解させる。
溶解させる。
−当該溶媒CHCl3/MeOH/Acohを用いて、できた混合物を
クロマトグラフィーにかける。
クロマトグラフィーにかける。
−当該クロマトグラフィーから得られた均質部分をプー
ルし、当該溶媒を蒸発する。
ルし、当該溶媒を蒸発する。
式Iのトリペプチド化合物とそれらの付加塩類はプロ
ティンC用の特定の基質を構成する。プロティンCの推
奨される定量法においては、式Iのトリペプチドの一定
量、またはその付加塩類の一つの一定量(濃度のオーダ
が10mg/mlの場合)を、緩衝した等張液のような適当な
水性液体媒体中で、プロティンCを含んでいるかもしれ
ないテストサンプル(適当であれば希釈する)と、少な
くとも0.5時間、室温ないし40℃の温度で、特に37℃で
接触させる。
ティンC用の特定の基質を構成する。プロティンCの推
奨される定量法においては、式Iのトリペプチドの一定
量、またはその付加塩類の一つの一定量(濃度のオーダ
が10mg/mlの場合)を、緩衝した等張液のような適当な
水性液体媒体中で、プロティンCを含んでいるかもしれ
ないテストサンプル(適当であれば希釈する)と、少な
くとも0.5時間、室温ないし40℃の温度で、特に37℃で
接触させる。
本発明によるトリペプチドのプロティンCに対する活
性は、従来の方法、例えば特許公報ヨーロッパ公開特許
公報0280160(14頁参照)、によって測定したし、加水
分解率を光学密度の経時変化で評価した(ΔOD/分)。
等モル投薬で求めた結果を下記の表IIで対照したがこの
場合、式II aの参考物質の活性は便利の面から100%に
等しいと指定している。
性は、従来の方法、例えば特許公報ヨーロッパ公開特許
公報0280160(14頁参照)、によって測定したし、加水
分解率を光学密度の経時変化で評価した(ΔOD/分)。
等モル投薬で求めた結果を下記の表IIで対照したがこの
場合、式II aの参考物質の活性は便利の面から100%に
等しいと指定している。
表IIの比較結果の示すところでは、本発明によるトリ
ペプチドは少なくとも参考物質CP1と同じ活性である。
ペプチドは少なくとも参考物質CP1と同じ活性である。
式Iのトリペプチドまたはその付加塩類の一つ及びも
し適当ならプロティンCの標準サンプル(人間または牛
の)及び緩衝希釈媒体の標準サンプルのはいったプロテ
ィンC定量用の分析装備一式も本発明の推奨するところ
である。
し適当ならプロティンCの標準サンプル(人間または牛
の)及び緩衝希釈媒体の標準サンプルのはいったプロテ
ィンC定量用の分析装備一式も本発明の推奨するところ
である。
本発明のこの他の特長と特徴は下記の調整実施例の記
述から更に明確に理解されることになろう。これらのデ
ータには制限の意味は全くなく、例示として示すもので
ある。
述から更に明確に理解されることになろう。これらのデ
ータには制限の意味は全くなく、例示として示すもので
ある。
調整1 L−THC−L−Pro−L−Arg−pNA.H−TFAの調整(実施
例1) a)Z−L−Arg−pNA.HCl 3.44g(0.01モル)のZ−L−Arg−OH.HClを室温で20
mlの無水HMPTに溶解し、1.39ml(0.01モル)のEt3Nを、
次に、室温で、撹拌しながら添加する。2.46g(0.015モ
ル)のイソシアン酸p−ニトロフェニルを出来た溶液に
添加する。出来た反応媒体を室温で24時間撹拌し、次
に、真空蒸発を行い、残渣は最小限の量のAcOHで溶解
し、次にAcOEtで希釈する。出来た溶液は、その後、3
回、連続して、少量の0.5モルのNaHCO3で、次に3回50g
/lのKHSO4溶液で、そして次にNaClで半飽和したH2Oで、
数回抽出する。次に有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させる。濾過(Na2SO4の除去)した後、溶媒は蒸発し
てしまい蒸発残渣はAcOEt/MeOMe混合液(3/7v/v)から
再結晶させて、白粉状の予定の物質3.5gを得る。融点=
128〜130℃ 分析(シリカゲル上のTLC)すなわち Rf=AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O(20/4.5/3/1v/v)中0.5 Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(5/3/1v/v)中0.69 b)H−L−Arg−pNA.2HBr 1g(2.15ミリモル)のZ−L−Arg−pNA.HClをガラス
/テフロン装置に装入する。8mlの氷醋酸、2mlのアニゾ
ル及び10mlのHBr溶液(w/vが33%の)を、次々にフェニ
ル活性雰囲気において添加する(窒素流)。反応は放置
して、窒素雰囲気中で、室温で、1時間進行させる。こ
の時間が経過したら、脱保護の間、均質になった反応混
合物をエーテル中で沈澱させる(MeOMeまたはEtOEt)。
傾瀉の後、上澄み液は放棄し、沈澱又は数回エーテルで
洗滌する。沈澱は濾過捕集し、24時間、KOH上で真空乾
燥すると0.95グラムの初期の物質が得られる。
例1) a)Z−L−Arg−pNA.HCl 3.44g(0.01モル)のZ−L−Arg−OH.HClを室温で20
mlの無水HMPTに溶解し、1.39ml(0.01モル)のEt3Nを、
次に、室温で、撹拌しながら添加する。2.46g(0.015モ
ル)のイソシアン酸p−ニトロフェニルを出来た溶液に
添加する。出来た反応媒体を室温で24時間撹拌し、次
に、真空蒸発を行い、残渣は最小限の量のAcOHで溶解
し、次にAcOEtで希釈する。出来た溶液は、その後、3
回、連続して、少量の0.5モルのNaHCO3で、次に3回50g
/lのKHSO4溶液で、そして次にNaClで半飽和したH2Oで、
数回抽出する。次に有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させる。濾過(Na2SO4の除去)した後、溶媒は蒸発し
てしまい蒸発残渣はAcOEt/MeOMe混合液(3/7v/v)から
再結晶させて、白粉状の予定の物質3.5gを得る。融点=
128〜130℃ 分析(シリカゲル上のTLC)すなわち Rf=AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O(20/4.5/3/1v/v)中0.5 Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(5/3/1v/v)中0.69 b)H−L−Arg−pNA.2HBr 1g(2.15ミリモル)のZ−L−Arg−pNA.HClをガラス
/テフロン装置に装入する。8mlの氷醋酸、2mlのアニゾ
ル及び10mlのHBr溶液(w/vが33%の)を、次々にフェニ
ル活性雰囲気において添加する(窒素流)。反応は放置
して、窒素雰囲気中で、室温で、1時間進行させる。こ
の時間が経過したら、脱保護の間、均質になった反応混
合物をエーテル中で沈澱させる(MeOMeまたはEtOEt)。
傾瀉の後、上澄み液は放棄し、沈澱又は数回エーテルで
洗滌する。沈澱は濾過捕集し、24時間、KOH上で真空乾
燥すると0.95グラムの初期の物質が得られる。
分析(シリカゲル上のTLC)、すなわち Rf=AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O(20/4.5/3/1.5v/v)中0.
04 Rf=BuOH/AcOH/H2O(3/1/1v/v)中0.38 c)Boc−L−Pro−L−Arg−pNA.HBr 1g(2.19ミリモル)のH−L−Arg−pNA.2HBrを10ml
のDMFに溶解し、次に0.854ml(6.57ミリモル)のDIEAを
添加するQ別の容器中で50mlのDMF中の4.71mg(2.19ミ
リモル)のBoc−L−Pro−OH溶液を0.285mlのDIEAで中
和する。両溶液を混合し、次に970mgのBopを添加し、そ
の間、できる混合物は撹拌して室温に保ち、pHは小量の
DIEAを添加して、反応中7.0ないし8.0に維持する。1時
間後、反応は完結し、反応混合物は真空中で蒸発乾燥
し、蒸発残渣はAcOEt/MeOH混合物で溶解し、NaHCO3の0.
5モル水溶液で抽出する。有機相は硫酸ナトリウム上で
乾燥し、濃縮しエーテル(MeOMeまたはEtOEt)中で沈澱
させて、877mg(収率:70%)の初期の物質を得る。
04 Rf=BuOH/AcOH/H2O(3/1/1v/v)中0.38 c)Boc−L−Pro−L−Arg−pNA.HBr 1g(2.19ミリモル)のH−L−Arg−pNA.2HBrを10ml
のDMFに溶解し、次に0.854ml(6.57ミリモル)のDIEAを
添加するQ別の容器中で50mlのDMF中の4.71mg(2.19ミ
リモル)のBoc−L−Pro−OH溶液を0.285mlのDIEAで中
和する。両溶液を混合し、次に970mgのBopを添加し、そ
の間、できる混合物は撹拌して室温に保ち、pHは小量の
DIEAを添加して、反応中7.0ないし8.0に維持する。1時
間後、反応は完結し、反応混合物は真空中で蒸発乾燥
し、蒸発残渣はAcOEt/MeOH混合物で溶解し、NaHCO3の0.
5モル水溶液で抽出する。有機相は硫酸ナトリウム上で
乾燥し、濃縮しエーテル(MeOMeまたはEtOEt)中で沈澱
させて、877mg(収率:70%)の初期の物質を得る。
分析(シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー) Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(20/3/1v/v)中の0.27 Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(10/3/1v/v)中の0.71 d)H−L−Pro−L−Arg−pNA.2H−TFA 850mg(1.485ミリモル)のBoc−L−Pro−L−Arg−p
NA.HBrを、次に6mlのCH2Cl2及び6mlのH−TFAを次々と
反応器に装入する。0.25時間の反応時間後、反応混合物
を直接、エーテル中に沈澱させる。できた沈澱を乾燥し
た後837mgの初期の物質が得られる。
NA.HBrを、次に6mlのCH2Cl2及び6mlのH−TFAを次々と
反応器に装入する。0.25時間の反応時間後、反応混合物
を直接、エーテル中に沈澱させる。できた沈澱を乾燥し
た後837mgの初期の物質が得られる。
分析(シリカゲル上のTLC) Rf=BuOH/AcOH/H2O(3/1/1v/v)中0.56 Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(5/3/1v/v)中0.13 e)L−THC−L−Pro−L−Arg−pNA.H−TFA 上記のc)項で述べた操作プロトコールに従って
(i)800mg(1.3ミリモル)のH−L−Pro−L−Arg−
pNA.2H−TFAと(ii)(90mg(1.3ミリモル)H−THC−O
Hと(iii)1mlのDIEAと(iv)5.75mg(1.3ミリモル)の
Bopからなる反応混合物を、撹拌しつつ室温で、1.5時間
DMF中で反応させる。反応混合物はその後、真空蒸発
し、残渣を、次にEtOEt中で沈澱させる。得られる白色
沈澱は最小量の溶媒系CHCl3/MeOH/AcOH(5/3/1v/v)に
溶解させ、そして同じ溶媒系を用いてシリカゲル上でク
ロマトグラフィーにかける。均質な部分を回収し、プー
ルし蒸発すると、410mg(収率:54%)の初期の物質が得
られる。
(i)800mg(1.3ミリモル)のH−L−Pro−L−Arg−
pNA.2H−TFAと(ii)(90mg(1.3ミリモル)H−THC−O
Hと(iii)1mlのDIEAと(iv)5.75mg(1.3ミリモル)の
Bopからなる反応混合物を、撹拌しつつ室温で、1.5時間
DMF中で反応させる。反応混合物はその後、真空蒸発
し、残渣を、次にEtOEt中で沈澱させる。得られる白色
沈澱は最小量の溶媒系CHCl3/MeOH/AcOH(5/3/1v/v)に
溶解させ、そして同じ溶媒系を用いてシリカゲル上でク
ロマトグラフィーにかける。均質な部分を回収し、プー
ルし蒸発すると、410mg(収率:54%)の初期の物質が得
られる。
分析(シリカゲル上のTLC) Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(10/3/1v/v)中0.28 Rf=CHCl3/MeOH/AcOH(5/3/1v/v)中0.33 調整II L−THC−L−Pro−L−Arg−pNA.AcOHの調整(実施例
2) 調整Iに従って求めたL−THC−L−Pro−L−Arg−p
NA.H−TFAから出発して、実施例2の物質、すなわちL
−THC−L−Pro−L−Arg−pNA.AcOHをAMBERLITE(登録
面積)IRA 401S樹脂上で(予めアセチル化した)イオン
交換により調整し、溶離剤はMeOH/H2O混合物(3/2v/v)
である。
2) 調整Iに従って求めたL−THC−L−Pro−L−Arg−p
NA.H−TFAから出発して、実施例2の物質、すなわちL
−THC−L−Pro−L−Arg−pNA.AcOHをAMBERLITE(登録
面積)IRA 401S樹脂上で(予めアセチル化した)イオン
交換により調整し、溶離剤はMeOH/H2O混合物(3/2v/v)
である。
調整III 実施例1の物質を調整するがIe段階のシリカゲル上ク
ロマトグラフィーはHDLC(粒子の大きさ3ミクロンのハ
イパーシルC18カラム)で代行する。求めた物質の純
度は調整Iで求めたものより高い。
ロマトグラフィーはHDLC(粒子の大きさ3ミクロンのハ
イパーシルC18カラム)で代行する。求めた物質の純
度は調整Iで求めたものより高い。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C07K 5/097 C12Q 1/37 CA(STN) CAOLD(STN) REGISTRY(STN)
Claims (11)
- 【請求項1】下記で構成する基から選定されるペプチド
化合物、すなわち (i)式が のトリペプチド ここにYはHまたはN−末端基をブロックする適当な基
であり、 A1は(2−オキソチアゾリジン−4−イル)カルボニル
〔THCと略す〕、(2−オキソテトラヒドロ−1,3−チア
ジン−5−イル)カルボニル〔TZCと略す〕、チアゾリ
ジン−4−カルボニル〔ATCと略す〕及び(テトラヒド
ロ−1,3−チアジン−5−イル)カルボニル〔AZCと略
す〕残基からなる基から選定したアミノ酸残基で、 A2はPro,3Hyp及び4Hyp残基からなる基から選んだアミノ
酸残基で、ここに3Hypと4HypのOH側基がエーテルまたは
エステル保護基で保護できるもので A3はArgとLys残基からなる基から選んだアミノ酸残基で
あり、かつ、 Rは発色性の基または蛍光発生性の基であり、かつ、 (ii)これらの付加塩類。 - 【請求項2】請求項1記載のペプチド化合物においてア
ミノ酸残基A1の形態がDまたはLでありかつ、アミノ酸
残基A2とA3の形態がLである化合物。 - 【請求項3】請求項1記載のペプチド化合物において、
YがHであるもの。 - 【請求項4】請求項1記載のペプチド化合物において、
A1がL−THCであるもの。 - 【請求項5】下記からなる基から選定される請求項1記
載のペプチド化合物、すなわち (a) 下記の式のトリペプチド化合物 ここに A1はD−THC,D−TZC,D−ATC,D−AZC,L−THC,L−TZC,L−
ATCまたはL−AZCであり、 A2はL−Pro,L−3HypまたはL−4Hyp A3はL−ArgまたはL−Lysである。 (b) それらの付加塩類。 - 【請求項6】請求項5記載のペプチド化合物において H−L−THC−L−Pro−L−Arg−pNAからなる基から選
定する化合物とその付加塩類。 - 【請求項7】プロティンCの定量法において、請求項1
記載のペプチド化合物のある一定の量を、水性生物学媒
体中で、プロティンCを含むテストサンプルと接触させ
る方法。 - 【請求項8】請求項7記載の方法において、請求項1記
載のペプチド化合物の一定量を水性生物学媒体中で、プ
ロティンCを含むテストサンプルと、少なくとも0.25時
間、15ないし40℃の温度で接触せしめる方法。 - 【請求項9】式Iのペプチド化合物またはその付加塩類
の一つの調整法において、ペプチド合成の機構を採用す
る当該方法が、次式のジペプチド1モルを反応させるこ
とからなり、 ここにA2,A3及びRが、上記の請求項1に示すように定
義され、次式のアミノ酸1.0ないし1.3モルを有し ここにYとA3は上記請求項1に示すように定義され、か
つ、 TはOH,F,ClまたはBrである。 - 【請求項10】プロティンCの定量用装備一式におい
て、請求項1記載の式Iのトリペプチドから選定する少
なくとも一種の化合物及びそれらの付加塩類を有するも
の。 - 【請求項11】請求項10記載のプロティンCの定量用装
備一式において、プロティンCの標準サンプルと緩衝し
た希釈媒体とを更に有するもの。
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